PT1947118E - Bloqueadores de fcev e as suas utilizações tereapêuticas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

BLOQUEADORES DE FCEV E AS SUAS UTILIZAÇÕES

TERE APÊUTICAS

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Domínio da invenção A presente invenção tem por objecto polipéptidos de fusão capazes de se ligarem ao factor de crescimento endotelial vascular (FCEV), elementos da familia do FCEV e variantes combinadas com características especificamente desej áveis.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto uma molécula isolada de ácido nucleico que codifica um polipéptido de fusão que se liga e inibe o factor de crescimento endotelial vascular (FCEV), que consiste na fusão de um domínio R1R2 com um segundo domínio R1R2 ((R1R2)2), em que a fusão é dirigida ou se faz por via de um espaçador de aminoácido e em que RI representa um domínio 2 da Ig do componente do receptor de FCEV de Flt-1 e R2 representa o domínio 3 de Flk-1. A presente invenção também tem por objecto um bloqueador monomérico de FCEV ou um polipéptido de fusão compreendendo as componentes do receptor de FCEV (R1R2)X em que X representa 2 e RI e R2 têm o significado definido antes. Os componentes do receptor de FCEV RI e R2 podem ligar-se directamente um ao outro ou ligar-se por via de uma ou mais sequências espaçadoras. Num enquadramento mais 1 específico, o bloqueador monomérico de FECV é a SEQ ID NO: 24 ou uma sua variante de aminoácidos funcionalmente equivalentes. A presente invenção também tem por objecto um polipéptido de fusão codificado por uma molécula de ácido nucleico da presente invenção. A presente invenção também tem por objecto um vector de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico da presente invenção, ligada operacionalmente a uma sequência de controlo da expressão. A presente invenção também tem por objecto um processo de produção de um polipéptido de fusão de FCEV, compreendendo as etapas de introdução de um vector de expressão num sistema de expressão apropriado e efectivaçâo da expressão do polipéptido de fusão. A presente invenção tem por objecto uma composição farmacêutica que compreende um polipéptido de fusão da presente invenção e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A presente invenção ainda tem por objecto um polipéptido de fusão capaz de se se ligar e de inibir o FECV da presente invenção para ser utilizado no tratamento de uma doença ou de um estado clínico que seja melhorado ou inibido pela eliminação ou inibição do FCEV, em que a referida doença ou o estado clínico é uma doença da retina; ou uma doença ocular, seleccionada entre neovascularização coroidal, edema macular diabético, retinopatia diabética proliferativa, neo-vascularização da córnea/rejeição de transplante e degeneração macular relacionada com a idade. 2 A presente invenção também tem por objecto um polipéptido de fusão capaz de se se ligar e de inibir o FECV da presente invenção para ser utilizado como adjuvante na cirurgia de glaucoma, para tratar ou prevenir hem- e linfangiogenése precoce e recrutamento de macrófagos para a bolha de filtração depois de cirurgia do glaucoma.

Em todos os enquadramentos do bloqueador de FCEV da presente invenção, pode-se incluir uma sequência de sinal (S) no inicio (ou na terminação N) do polipéptido de fusão da presente invenção. A sequência de sinal pode ser natural para a célula, recombinante ou sintética. Quando uma sequência de sinal está ligada ao terminal N de um primeiro componente do receptor, então pode-se conceber o polipéptido de fusão por exemplo, como S-(R1R2)2.

Os componentes do polipéptido de fusão podem estar ligados directamente uns aos outros por via de espaçadores. Em enquadramentos específicos, um ou mais receptores e/ou componentes de parceiros de fusão do polipéptido de fusão estão ligados directamente uns aos outros sem espaçadores. Noutros enquadramentos, um ou mais receptores e/ou componentes de parceiros de fusão estão ligados com espaçadores. A presente invenção engloba os vectores que compreendem as moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção, incluindo os vectores de expressão que compreendem a molécula de ácido nucleico ligada operacionalmente a uma sequência de controlo da expressão. A presente invenção ainda engloba os sistemas de hospedeiro-vector para a produção de um polipéptido de fusão que compreende o vector de expressão numa célula hospedeira apropriada; sistemas de hospedeiro-vector em que 3 a célula hospedeira apropriada é uma célula bacteriana, de levedura de insecto, uma célula de mamífero, uma célula de E. coli ou uma célula de COS ou OHC (ovário de hamster chinês). Adicionalmente estão englobados os bloqueadores de FCEV da presente invenção modificados por acetilação ou por tratamento com polietileno-glicol. Os processos de acetilação ou de tratamento com polietileno-glicol de uma proteína são bem conhecidos na técnica. A presente invenção também tem por objecto um processo para a produção de um bloqueador de FCEV da presente invenção, que compreende a cultura de uma célula hospedeira transfectada com um vector que compreende uma sequência de ácidos nucleicos da presente invenção, em condições apropriadas para a expressão da proteína da célula hospedeira e a recuperação dos polipéptidos de fusão assim produzidos.

Os bloqueadores do FECV da presente invenção são úteis sob o ponto de vista terapêutico para o tratamento de qualquer doença ou estado clínico que seja melhorado ou inibido por eliminação, inibição ou redução do FCEV. Uma lista não exaustiva das condições específicas melhoradas pela inibição ou pela redução do FCEV incluem, por exemplo, perda indesejável de plasma ou permeabilidade vascular, crescimento indesejável de vasos sanguíneos, por exemplo, tal como em tumores, edemas associados com distúrbios inflamatórios tais como psoríase ou artrite, incluindo artrite reumatóide; asma; edema generalizado associado com queimaduras; ascites e derramamento pleural associado com tumores, inflamação ou trauma; inflamação crónica das vias aéreas; asma; síndroma de derrames capilares; sépsia; doenças dos rins associadas com o aumento da perda de proteína; adenocarcinoma pancreático ductal (ACPD) e 4 distúrbios dos olhos tal como degeneração macular relacionada com a idade e retinopatia diabética. 0 mini-bloqueador de FCEV da presente invenção é particularmente útil no tratamento de distúrbios dos olhos e como adjuvante para as cirurgias dos olhos, incluindo cirurgia do glaucoma; e o tratamento de tumores intra-oculares, tais como, por exemplo, melanoma uveal, retinoblastoma, por via da libertação intravitrea.

De acordo com isto, a presente invenção pode ser utilizada num processo terapêutico para o tratamento de uma doença ou um estado clinico relacionada com o FCEV, compreendendo a administração de um bloqueador de FCEV da presente invenção a um indivíduo que sofra de uma doença ou de um estado clínico relacionada com o FCEV. 0 indivíduo é preferencialmente um paciente humano. A presente invenção pode ainda ser utilizada em processos de diagnóstico e de prognóstico, assim como estojos para a detecção, quantificação e/ou a monitorização de FCEV com os mini-bloqueadores da presente invenção.

As composições farmacêuticas compreendem um bloqueador de FCEV da presente invenção com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico podem compreender um bloqueador de polipéptido de fusão dimérico ou ácidos nucleicos que codificam o polipéptido de fusão. Os mini-bloqueadores da presente invenção encontram utilizações específicas nos estados clínicos em que é desejável um bloqueador de FCEV com um semi-período de vida no soro é reduzido (por exemplo, um acelerador da purificação) e/ou uma penetração aumentada nos tecidos devido à menor dimensão. Aplicações específicas para o mini-bloqueador de FCEV incluem, por exemplo, doenças em que seja desejável a administração 5 local a um tecido ou célula específicos. Exemplos desses estados clínicos ou doenças são doenças oculares dos olhos.

Outros objectos e vantagens tornar-se-ão evidentes a partir de uma revisão da descrição detalhada que se segue.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Antes dos presentes processos serem descritos, deve entender-se que a presente invenção não está limitada a processos particulares e às condições experimentais descritas, assim como os processos e as condições podem variar. Deve também entender-se que a terminologia utilizada aqui é dada com a finalidade de descrever apenas enquadramentos particulares e não pretende ser limitativa, dado que o âmbito da presente invenção está apenas limitado pelas reivindicações em anexo.

Tal como se utiliza nesta memória descritiva e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma", "o", "a" incluem as referências plurais, a menos que o contexto dite claramente doutra forma. Assim, por exemplo, uma referência a "um processo" inclui um ou mais processos e/ou as etapas do tipo aqui descrito e/ou que se tornará evidente para os especialistas na material após a leitura desta memória descritiva, etc. A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é normalmente entendido por um especialista na técnica a que pertence a presente invenção. Embora se possam utilizar quaisquer processos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos aqui na prática ou nos 6 ensaios da presente invenção, a seguir vão descrever-se agora os processos e materiais preferidos.

Descrição geral A presente invenção engloba um bloqueador de FCEV capaz de se ligar e de inibir a actividade de FCEV que é um monómero ou um multimero de um ou mais polipéptidos de fusão. As moléculas da presente invenção ligam-se e inibem a acção biológica do FCEV e/ou a reacção ou a resposta fisiológica. Para uma descrição dos bloqueadores de FCEV antagonistas à base de receptores de FCEV FltlD2.FlklD3.FchCl (a) (SEQ ID NOs:7-8) e R1R2 de FCEV-FcACl(a) (SEQ ID NOs:9-10), ver PCT WO/0075319.

Estruturas e expressão de ácidos nucleicos A presente invenção tem por objecto a estrutura de moléculas de ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos de fusão da presente invenção. As variantes das sequências de aminoácidos das componentes do receptor de Rl e R2 dos bloqueadores da presente invenção podem também ser preparadas por meio da criação de mutações na codificação de moléculas de ácidos nucleicos. Essas variantes incluem, por exemplo, eliminações ou inserções ou substituições dos resíduos de aminoácidos dentro da sequência de aminoácidos de Rl ou de R2. Pode-se fazer qualquer combinação de eliminações ou inserções ou substituições para se chegar a uma estrutura final, desde que a estrutura final possua a capacidade de se ligar e de inibir FCEV.

Inserem-se estas moléculas de ácidos nucleicos num vector que é capaz de expressar os polipéptidos de fusão quando introduzidas numa células hospedeira apropriada. As 7 células hospedeiras apropriadas incluem, mas não se limitam a células bacterianas, de leveduras, de insectos e de mamíferos. Qualquer um dos processos conhecidos pelos especialistas na matéria para a inserção de fragmentos de AND num vector pode ser utilizado para preparar vectores de expressão que codificam os polipéptidos de fusão da presente invenção sob o controlo de sinais de controlo de transcrição/tradução. A expressão das moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção pode ser regulada por uma segunda sequência de ácidos nucleicos de modo que a molécula é expressa num hospedeiro transformado com a molécula do ADN recombinante. Por exemplo, a expressão pode ser controlada por qualquer elemento promotor/melhorador conhecido na técnica. Os promotores que podem ser utilizados para o controlo da expressão das moléculas quiméricas de polipéptido incluem, mas não se limitam a repetições terminais longas (Squinto et al. (1991) Cell 65: 1-20); região promotora precoce de SV40, CMV (citomegalovírus), M-MuLV, promotor de timidina-cinase, sequências reguladoras do gene da metalotionina; vectores de expressão procariótica tal como o promotor de b-lactamase ou o promotor de tac (ver também Scientific American (1980) 242: 74-94); elementos promotores com origem em leveduras ou outros fungos tal como promotor de Gal 4, ADH, PGK, fosfatase alcalina e regiões de controlo da transcrição específicas dos tecidos derivadas genes tal como elastase I.

Os vectores de expressão capazes de serem replicados numa bactéria ou em hospedeiros eucarióticos compreendendo as moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção são utilizados para transfectar o hospedeiro e assim dirigirem a expressão desses ácidos nucleicos para produzir os polipéptidos de fusão da presente invenção, que formam bloqueadores capazes de se ligarem ao FCEV. As células transfectadas podem expressar temporariamente, constitutivamente e permanentemente os bloqueadores de FCEV da presente invenção.

Os bloqueadores da presente invenção podem ser purificados por qualquer técnica que permita a formação subsequente de um bloqueador estável activo sob o ponto de vista biológico. Por exemplo e sem ser a titulo limitativo, os factores podem ser recuperados de células quer como proteínas solúveis ou como corpos de inclusão, a partir dos quais se podem extrair quantitativamente por meio de cloridrato de guanidinio 8M e diálise (ver, por exemplo, a patente US No. 5.663.304). Para purificar os factores, pode-se utilizar técnicas convencionais de cromatografia de permuta iónica, cromatografia de interacção hidrofóbica, cromatografia de fase inversa ou filtração em gel.

Componentes do receptor de FCEV

Os componentes do receptor do mini-bloqueador de FCEV da presente invenção consistem no domínio 2 de IgG de Flt-1, (Fltl D2) (Rl) e no domínio 3 de Ig de Flk-1 (Flkl D3) (R2) (em conjunto, R1R2) . A expressão "domínio de Ig" de Flt-1, Flt-4, ou Flk-1 deve ser entendida como englobando não apenas o domínio completo de tipo selvagem, mas também as suas variantes de inserção, de eliminação e/ou de substituição que basicamente retêm as características funcionais do domínio intacto. Será rapidamente evidente para um especialista na matéria, que se podem obter numerosas variantes dos domínios de Ig anteriores, que 9 retêm praticamente as mesmas características funcionais que o domínio de tipo selvagem ou natural. A expressão "equivalentes funcionais" quando usada em referência a RI ou a R2, deve entender-se como englobando um domínio de Rl ou de R2 com pelo menos uma alteração, por exemplo, uma eliminação e/ou uma substituição, que retém praticamente as mesmas características funcionais que o domínio de Rl, R2, ou R3 de tipo selvagem ou natural, isto é, uma ligação a FCEV praticamente equivalente. Poderá ser verificado que as substituições de aminoácidos podem ser feitas em Rl ou R2 sem sair do espírito da presente invenção no que respeita à capacidade destas componentes do receptor para se ligarem e inactivarem o FCEV. As características funcionais dos bloqueadores da presente invenção podem ser determinadas por meio de qualquer ensaio de rastreio conhecido na técnica apropriado para a medição das características desejadas. Exemplos desses ensaios estão descritos na secção experimental que se segue que permite a determinação das características de ligação dos bloqueadores para FCEV (Kd), assim como o seu semi-período de vida de dissociação do complexo bloqueador-ligando (T1/2) . Outros ensaios, por exemplo, uma alteração na capacidade para se ligar especificamente a FCEV podem ser medidos por meio de um ensaio de ligação a FCEV do tipo comparativo. Podem medir-se as modificações das propriedades da proteína, tal como a estabilidade térmica, a hidrofobicidade, a susceptibilidade para a degradação proteolítica ou a tendência para agregação, por meio de processos conhecidos dos especialistas na matéria.

Os componentes do polipéptido de fusão podem ligar-se directamente uns aos outros ou podem ser ligados por via de espaçadores. Geralmente, o termo "espaçador" (ou ligante) 10 significa uma ou mais moléculas, por exemplo, ácidos nucleicos ou aminoácidos ou partes não especificas, tais como polietileno-glicol, que podem ser inseridos entre um ou mais domínios dos componentes. Por exemplo, podem utilizar-se sequências de espaçadores para providenciar um sítio de interesse desejável entre componentes para uma fácil manipulação. Também se pode providenciar um espaçador para aumentar a expressão dos polipéptidos de fusão a partir de uma célula hospedeira, para diminuir a articulação estérica que o componente pode assumir de tal modo que o componente pode assumir a sua estrutura terciária óptima e/ou interagir apropriadamente com a sua molécula-alvo. A respeito de espaçadores e processos para a identificação dos espaçadores desejáveis, ver, por exemplo, George et al. (2003) Protein Engineering 15: 871-879. Uma sequência de espaçadores pode incluir um ou mais aminoácidos ligados naturalmente a uma componente do receptor ou pode ser uma sequência adicionada utilizada para aumentar a expressão dos polipéptidos de fusão, providenciando especificamente os sítios de interesse desejados, permitem que os domínios dos componentes formem estruturas terciárias óptimas e/ou um aumento da interacção de um componente com a sua molécula alvo. Num enquadramento, o espaçador compreende uma ou mais sequências de péptidos entre um ou mais componentes que estão entre 1-100 aminoácidos, preferencialmente 1-25.

Nos enquadramentos mais específicos, RI representa os aminoácidos 27-126 da SEQ ID NO: 8, ou 1-126 da SEQ ID NO: 8 (incluindo a sequência de sinal 1-26) ; ou ao aminoácidos 27-129 da SEQ ID NO: 10, ou 1-129 da SEQ ID NO: 10 (incluindo a sequência de sinal 1-26) . Nos enquadramentos mais específicos, R2 representa os aminoácidos 127-228 da SEQ ID NO: 8, ou os aminoácidos 130-231 da SEQ ID NO: 10. 11

Quando, por exemplo, se coloca R2entre o terminal N do polipéptido de fusão, a sequência de sinal pode desejavelmente preceder o componente do receptor. Os componentes do receptor ligados ao componente de multimerização podem ainda compreender um componente espaçador, por exemplo, a sequência GPG dos aminoácidos 229-231 da SEQ ID NO: 7.

Geração de mini-bloqueadores de FCEV A presente invenção tem por objecto mini-bloqueadores de FCEV com um ou mais dominios dos componentes do receptor (R1R2)X, em que X representa 2 e RI e R2 têm os significados definidos antes.

Utilizações terapêuticas

Os mini-bloqueadores do FECV da presente invenção são úteis sob o ponto de vista terapêutico para o tratamento de qualquer doença ou estado clinico que seja melhorado ou inibido pela eliminação ou inibição do FCEV. Uma lista não exaustiva dos estados clínicos específicos melhorados pela inibição ou pela redução do FCEV incluem, por exemplo, estados clínicos que se caracterizam por excessiva proliferação de células endoteliais vasculares, permeabilidade vascular, edema ou inflamação tal como edema cerebral associado a traumas, acidentes vasculares ou tumores; edemas associados com distúrbios inflamatórios tais como psoríase ou artrite, incluindo artrite reumatóide; asma; edema generalizado associado com queimaduras; ascites e derramamento pleural associado com tumores, inflamação ou trauma; inflamação crónica das vias aéreas; síndroma de derrames capilares; sépsia; doenças dos rins associadas com o aumento da perda de proteína; e 12 distúrbios dos olhos tal como degeneração macular relacionada com a idade e retinopatia diabética.

As composições da presente invenção são úteis sob o ponto de vista terapêutico para o tratamento de uma ampla variedade de doenças associadas com níveis aumentados de FCEV. Uma inflamação exagerada por Th2 e uma reconstrução das vias aéreas são características na patogénese da asma (ver, por exemplo, Elias et al. (1999) J. Clin. Invest. 104: 1001-6). Detectaram-se níveis elevados de FCEV em tecidos e amostras biológicas de pacientes com asma, o que se correlaciona directamente com a actividade da doença (Lee et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol. 107: 1106-1108) e inversamente com o diâmetro interno das vias aéresas e a sensibilidade das vias aéreas. Além disso, supões que FCEV contribua para o edema de tecido asmático.

Uma outra doença associada com um FCEV acrescido é o adenocarcinoma ductal pancreático (ACDP). Esta malignidade muitas vezes exibe um aumento de focos de proliferação de células endoteliais e, frequentemente, sobre-expressa FCEV (Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77: 527-543). O ACDP é responsável por mais do que 20 % das mortes devidas a malignidades gastrointestinais, fazendo dele a quarta causa mais comum de mortalidade relacionada com o cancro nos E.U.A. e noutros países industrializados. Evidências experimentais suportam um importante papel para FCEV no cancro pancreático, assim um inibidor de FCEV é promissor como um agente terapêutico para atenuar o crescimento do tumor intrapancreático e as metástases regionais e distais.

Um mini-bloqueador mais pequeno, não glicosilado, expresso em E. coli (exemplo 4), um mini-bloqueador glicosilado, expresso em células de OHC (exemplo 5), ou um 13 bloqueador monomérico à base do receptor (exemplo 6) têm características optimizadas para a libertação local/ intravitrea, isto é com um semi-período de vida mais curto no soro para uma purificação mais rápida e minimizando uma exposição sistémica indesejada. Além disso, devido à sua menor dimensão, o mini-bloqueador tem a capacidade para penetrar através da membrana que limita a parte mais interna (MLI) no olho e difunde-se através da camada vítrea para a camada epitelial da retina/pigmento da retina (EPR) que ajudará a tratar doenças da retina. Adicionalmente, pode-se utilizar o mini-bloqueador para a administração local para o tratamento de doenças oculares tais como neovascularização coroidal, edema macular diabético, retinopatia diabética proliferativa, neovascularização da córnea/rejeição de transplante. Ainda se pode utilizar o mini-bloqueador em qualquer situação em que é necessário bloquear temporariamente (curto prazo) o FCEV, por exemplo, para evitar a exposição crónica ao bloqueio do FCEV, tal como, por exemplo, no tratamento da psoriase.

Um sério problema que conduz a uma insuficiência no seguimento de uma cirurgia a um glaucoma é a inflamação precoce e a angiogénse, assim como o tratamento de feridas demasiado agressivo. De acordo com isto, os bloqueadores de FCEV da presente invenção podem ser utilizados de uma forma útil como adjuvantes na cirurgia do glaucoma para prevenir hemangiogénese precoce e linfangiogénese e no recrutamento de macrófagos para as bolhas filtrantes depois de uma cirurgia a um glaucoma e melhora o resultado cirúrgico.

Terapias de combinação

Pode-se administrar um bloqueador de FCEV em combinação com um ou mais de outros compostos ou terapias, 14 incluindo uma segunda molécula bloqueadora de FCEV, um agente quimioterapêutico, dispositivos cirúrgicos, cateteres e radiação. A terapia de combinação inclui a administração de uma única formulação em dosagem farmacêutica que contém um bloqueador de FCEV e um ou mais agentes adicionais; assim como a administração de um bloqueador de FCEV e um ou mais agentes adicionais na sua própria formulação separada de dosagem farmacêutica. Por exemplo, um bloqueador de FCEV e um agente citotóxico, um agente quimioterapêutico ou um agente inibidor do crescimento, podem ser administrados a um paciente em conjunto numa composição de dosagem única tal como uma formulação combinada ou cada agente pode ser administrado numa formulação numa dose separada. Quando se utilizam formulações com dosagens separadas, o polipéptido de fusão da presente invenção, especifico do FCEV e um ou mais agentes adicionais podem ser administrados ao mesmo tempo ou em momentos separados, isto é, sequencialmente. A expressão "agente citotóxico", tal como se utiliza aqui, refere-se a uma substância que inibe ou previne a função das células e/ou causa a destruição das células. Entenda-se que a expressão inclui isótopos radioactivos (por exemplo, I131, I125, Y90 e Re186) , agentes quimioterapêuticos e toxinas, tal como toxinas activas sob o ponto de vista enzimático de origem em bactérias, fungos, plantas ou animais ou os seus fragmentos.

Um "agente quimioterapêutico" é um composto quimico útil no tratamento do cancro. Exemplos de agente quimioterapêutico incluem agentes de alquilação tal como tiotepa (trietilenotiofosforamida) e ciclofosfamida (Cytoxan®); sulfonatos de alquilo tal como busulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como 15 benzodopa, carbazilquinona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotio-fosforamida e tri-metilolomelamina; mustardas de azoto tal como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo; clorozotocina, ranimustina; actinomicina, cactinomicina, nitrosureias tais como carmustina, fotemustina, lomustina, nimustina, antibióticos tais como aclacinomisinas, autramicina, azaserina, bleomicinas, caliceamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos tais como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifiuridina, enocitabina, floxuridina; androgénios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitioslanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenérgicos tais como aminoglutetimida, mitotano, trirostano; reforços de ácido fólico tais como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de eliptinio; 16 etoglucid; nitrato de gálio; hidroxi-ureia; lentinana; ionidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilinico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por exemplo, paclitaxel (Taxol®, Bristol-Miers Squibb Oncologi, Princeton, N.J.) e docetaxel (Taxotere®; Aventis Antoni, França); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platínia; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina, novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; esperamicians; capecitabina; e os sais, ácidos ou derivados de qualquer um dos agentes anteriores, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Também estão incluídos nesta definição os agentes anti-hormonais que actuam para regular ou inibir a acção da hormona em tumores tais como anti-estrogénios incluindo, por exemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles que inibem aromatase, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY 117018, onapristona e toremifeno (Fareston); e anti-androgénios tais como flutamida, nifutamida, bicalutamida, leuprolide e goserelina; e os sais, ácidos ou derivados de qualquer um dos agentes anteriores, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Um "agente inibidor do crescimento", quando utilizado aqui, refere-se a um composto ou a uma composição que inibe 17 o crescimento de uma célula, especialmente uma célula de cancro quer in vitro ou in vivo. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo das células (num local diferente da fase S), tal como agentes que induzem a interrupção de G1 e a interrupção da fase M. Os bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina), Taxol® e inibidores de topo II tais como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido e bleomicina. Esses agentes que interrompem G1 também se estendem à interrupção da fase S, por exemplo, agentes de alquilação de ADN tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo e ara-C.

Processos de administração A presente invenção pode ser utilizada em processos de tratamento que compreendem a administração a um indivíduo de uma quantidade efectiva de um bloqueador de FCEV da presente invenção. Num aspecto preferido, o bloqueador é praticamente puro (por exemplo, praticamente isento de substâncias que limitam o seu efeito ou produzem efeitos secundários indesejáveis) . 0 indivíduo é preferencialmente um mamífero e, mais preferencialmente, um ser humano.

Conhecem-se vários sistemas de libertação que podem ser utilizado para administrar um agente da presente invenção, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartícuias, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o composto, endocitose mediada pelo receptor (ver, por exemplo, Wu e Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262-4429-4432) , construção de um ácido nucleico como parte de um vector retroviral ou outro vector, etc. Os processos de introdução podem ser entéricos ou parentéricos e 18 incluem, mas não se limitam às vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, intraocular e oral. As composições da presente invenção podem ser administradas por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injecção de bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, rectal e intestinal, etc.) e podem ser administradas em conjunto com outros agentes activos sob o ponto de vista biológico. A administração pode ser sistémica ou local. A administração pode ser aguda ou crónica (por exemplo, diária, semanal, mensal, etc.) ou em combinação com outros agentes. Também se pode utilizar uma administração pulmonar, por exemplo, por meio da utilização de um inalador ou de um nebulizador e uma formulação com um agente de aerossolização. 0 agente activo pode ser administrado numa vesícula, em particular um lipossoma, num sistema de libertação controlada ou numa bomba. Quando o agente activo da presente invenção é um ácido nucleico que codifica uma proteína, o ácido nucleico pode ser administrado in vivo para promover a expressão da sua proteína codificada, por meio da sua produção como parte de um vector de expressão de um ácido nucleico apropriado e administrando-o de modo a que torne intracelular, por exemplo, por meio da utilização de um vector retroviral (ver, por exemplo, a patente U.S. No. 4.980.286), por injecção directa ou por meio da utilização de um bombardeamento de micropartículas ou revestindo com lípidos ou receptores das superfícies das células ou agentes de transfecção ou administrando-o em ligação com um péptido semelhante a uma "homeobox" (segmento de sequência de ADN que se encontra em genes que controlam o desenvolvimento) que é conhecido por entrar no núcleo (ver, por exemplo, Joliet et al., 1991, Proc. Natl. 19

Acad. Sei. EUA 88: 1864-1868), etc. Alternativamente, pode-se introduzir um ácido nucleico intracelularmente e incorporá-lo dentro do AND da célula hospedeira para expressão, por recombinação homóloga.

Pode ser desejável administrar as composições farmacêuticas da presente invenção localmente na área que necessita do tratamento o que se pode conseguir, por exemplo, e não a titulo de limitação, por infusão local durante uma cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, por injecção, por meio de um cateter ou por meio de um implante, sendo o referido implante de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas sialásticas, fibra ou substitutos comerciais de pele.

Uma composição útil na prática dos processos da presente invenção pode ser um liquido que contenha um agente da presente invenção em solução, em suspensão ou ambas. A expressão "solução/suspensão" refere-se a uma composição liquida em que uma primeira porção do agente activo em solução e uma segunda porção do agente activo está presente sob a forma de partículas, em suspensão numa matriz líquida. Uma composição líquida também inclui um gel. A composição líquida pose ser aquosa ou estar sob a forma de uma pomada. Além disso, a composição pode ter a forma de um artigo sólido que pode ser inserido no olho, tal como, por exemplo, entre o olho e a pálpebra ou no saco da conjuntiva, onde se liberta o bloqueador do FCEV. A libertação desse artigo é usualmente feita para a córnea, quer por via do fluido lacrimal ou directamente na própria córnea, com a qual o artigo sólido está geralmente em contacto directo. Os artigos sólidos para a implantação no olho são geralmente compostos principalmente por polímeros 20 bioerodíveis e não bioerodíveis. Uma solução ou uma suspensão aquosas podem estar sob a forma de gotas para os olhos. Uma dose desejada do agente activo pode ser medida por administração de um número conhecido de gotas no olho. Por exemplo, para um volume de gota de 25 μΐ, a administração de 1-6 gotas libertará 25-150 μΐ da composição.

Uma suspensão aquosa ou uma solução/suspensão úteis na prática dos processos da presente invenção podem conter um ou mais polímeros como agentes de suspensão. Os polímeros úteis incluem polímeros solúveis em água tais como polímeros celulósicos e polímeros insolúveis em água tal como polímeros contendo carboxilo reticulado. Uma suspensão aquosa ou uma solução/suspensão da presente invenção é preferencialmente viscosa ou muco-adesiva ou ainda mais preferencialmente, simultaneamente viscosa e muco-adesiva.

Uma composição útil na prática dos processos da presente invenção é uma composição aquosa gelificável in situ. Uma tal composição compreende um agente de gelificação numa concentração efectiva para promover a gelificação após contacto com o olho ou com o fluido lacrimal. Agentes de gelificação apropriados incluem, mas não se limitam a polímeros que endurecem após aquecimento. A expressão "gelificável in situ" tal como se utiliza aqui, inclui não apenas líquidos de baixa viscosidade que formam géis após contacto com o olho ou com o fluido lacrimal, mas também inclui líquidos mais viscosos tal como géis semi-fluidos e tixotrópicos que exibem uma viscosidade substancialmente maior ou rigidez do gel após administração ao olho. 21

Processos de diagnóstico e de rastreio

Os bloqueadores de FCEV da presente invenção podem ser utilizados em processos de diagnóstico e/ou de rastreio. Por exemplo, o bloqueador pode ser utilizado para monitorar os níveis de FCEV durante um estudo clínico para avaliar a eficácia do tratamento. Noutro enquadramento, os processos e composições da presente invenção são utilizados para rastrear indivíduos para entrarem num estudo clínico para identificar indivíduos que tenham o nível de FCEV, por exemplo, demasiado alto ou demasiado baixo. Os bloqueadores podem ser utilizados em processos conhecidos na técnica relacionados com a localização e a actividade de FCEV por exemplo, visualização de imagem, medição dos seus níveis em amostras apropriadas sob o ponto de vista fisiológico, em processos de diagnóstico, etc.

Os bloqueadores da presente invenção podem ser utilizados em ensaios de rastreio in vivo e in nitro para quantificar a quantidade de FCEV não ligado presente, por exemplo, num processo de rastreio para identificar agentes de ensaio capazes de diminuir a expressão de FCEV. Mais geralmente, os bloqueadores da presente invenção podem ser utilizados em qualquer ensaio ou processo em que se deseje fazer a quantificação e/ou o isolamento de FCEV.

Composições farmacêuticas A presente invenção também tem por objecto composições farmacêuticas que compreendem os mini-inibidores de FCEV da presente invenção. Essas composições compreendem uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de um ou mais mini-bloqueadores e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A expressão "aceitável sob o 22 ponto de vista farmacêutico" significa aprovado por uma entidade reguladora do governo federal ou de um estado ou listada na U.S. Pharmacopeia ou outras farmacopeias geralmente reconhecidas para serem utilizadas em animais e mais particularmente, em seres humanos. 0 termo "veiculo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veiculo com o qual se administra o produto terapêutico. Esses excipientes farmacêuticos podem ser liquidos esterilizados, tais como água e óleos, incluindo os de petróleo, de animal, vegetal ou de origem sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e similares. Os excipientes farmacêuticos apropriados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado, glicerol, propileno- glicol, água, etanol e similares. A composição, se desejado, pode também conter quantidades menores de agentes de molhagem e emulsionantes ou agentes de tamponamento do pH. Estas composições podem ter a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação sustentada e similares. Exemplos de veículos farmacêuticos apropriados estão descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin.

Os mini-bloqueadores de FCEV da presente invenção podem ser formulados sob formas neutras ou de sal. Os sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico incluem os formados com grupos amina livres tal como os derivados dos ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., e os formados com grupos carboxilo livres tal como os derivados de sódio, potássio, amónio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc. 23

Além disso, as composições aquosas úteis na prática dos processos da presente invenção têm um pH e uma osmolalidade compatíveis sob o ponto de vista oftalmológico. Um ou mais agentes de ajustamento do pH aceitáveis sob o ponto de vista oftalmológico e/ou agentes de tamponamento podem ser incluídos numa composição da presente invenção, incluindo ácidos tais como ácidos acético, bórico, cítrico, láctico, fosfórico e clorídrico; bases tais como hidróxido de sódio, fosfato de sódio, borato de sódio, citrato de sódio, acetato de sódio e lactato de sódio; e tampões tais como citrato/dextrose, bicarbonato de sódio e cloreto de amónio. Esses ácidos, bases, e tampões estão incluídos numa quantidade requerida para manter o pH da composição num intervalo aceitável sob o ponto de vista oftalmológico. Um ou mais sais aceitáveis sob o ponto de vista oftalmológico podem ser incluídos na composição, numa quantidade suficiente para levar a osmolalidade da composição para um intervalo aceitável sob o ponto de vista oftalmológico. Esses sais incluem os que têm catiões de sódio, potássio ou amónio e aniões de cloreto, citrato, ascorbato, borato, fosfato, bicarbonato, sulfato, tio-sulfato ou bissulfito. A quantidade de bloqueador que será efectiva para a utilização terapêutica pretendida pode ser determinada por técnicas à base da presente descrição. Além disso, podem utilizar-se eventualmente ensaios in vitro para ajudar a identificar os intervalos de dosagem optimizados. Geralmente, os intervalos de doses apropriadas para administração intravenosa são geralmente próximos de 50-5000 microgramas de composto activo por quilograma de peso do corpo. Os intervalos de doses apropriadas para administração intranasal são geralmente próximos de 0,01 pg/kg de peso do corpo até 1 mg/kg de peso do corpo. As 24 doses efectivas podem ser extrapoladas das curvas de resposta à dose derivadas de sistemas de ensaio em modelos in vitro ou em modelos de animais.

Para administração sistémica, pode-se estimar inicialmente uma dose efectiva sob o ponto de vista terapêutico a partir de ensaios in vitro. Por exemplo, pode-se formular uma dose em modelos de animais, para se conseguir um intervalo de concentração em circulação que inclui a CI5o conforme determinado na cultura de células. Essa informação pode ser utilizada para determinar de forma mais precisa as doses úteis em seres humanos. Também se podem estimar as doses iniciais a partir de dados in vivo, por exemplo, modelos de animais, utilizando técnicas que são bem conhecidas na especialidade. Um especialista na matéria pode facilmente optimizar a administração a seres humanos com base nos dados dos animais. A quantidade e o intervalo da dose podem ser ajustados individualmente para providenciar niveis dos compostos no plasma que são suficientes para manter o efeito terapêutico em casos de administração local ou absorção selectiva, sendo que a concentração efectiva local dos compostos pode não estar relacionada com a concentração no plasma. Um especialista na matéria pode facilmente optimizar as doses locais efectivas sob o ponto de vista terapêutico sem fazer experimentação desnecessária. A quantidade de composto administrada será obviamente dependente do indivíduo a ser tratado, do peso do indivíduo, da severidade da aflição, da forma de administração e da decisão do médico prescritor. Pode-se repetir a terapia intermitentemente enquanto de mantiverem sintomas detectáveis ou mesmo quando eles já não 25 detectáveis. A terapia pode ser realizada de forma isolada ou em combinação com outros fármacos.

Transfecção celular e terapia de genes A presente invenção tem por objecto a utilização de ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos de fusão da presente invenção para a transfecção das células in vitro. Estes ácidos nucleicos podem ser inseridos em qualquer um de um certo número de vectores bem conhecidos para a transfecção de células-alvo. Os ácidos nucleicos são transfectadas em células ex vivo, através da interacção do vector e da célula-alvo. As composições podem ser administradas (por exemplo, por injecção num músculo) a um indivíduo numa quantidade suficiente para provocar uma resposta terapêutica. Uma quantidade adequada para conseguir isto é definida como "uma dose ou uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico".

Noutro aspecto, a presente invenção pode ser utilizada num processo de redução dos níveis de FCEV num ser humano ou em outro animal, compreendendo a transfecção de uma células com um ácido nucleico que codifica um polipéptido de fusão da presente invenção, em que o ácido nucleico compreende um promotor indutível ligado operacionalmente a um ácido nucleico que codifica o polipéptido de fusão ou o mini-bloqueador. Para os processos da terapia dos genes no tratamento ou na prevenção de doenças humanas, ver, por exemplo, Van Brunt (1998) Biotechnology 6: 1149-1154.

Estojos A presente invenção também tem por objecto um artigo que compreende um material de embalagem e um o agente 26 farmacêutico contido dentro desse material de embalagem, em que agente farmacêutico compreende pelo menos um bloqueador de FCEV composto por dois ou mais polipéptidos de fusão da presente invenção e em que o material de embalagem compreende um rótulo ou uma inserção na embalagem que indica que o polipéptido de fusão especifico de FCEV pode ser utilizado para o tratamento de uma doença ou de um estado clinico mediado por FCEV.

Animais transgénicos A presente invenção tem por objecto animais transgénicos não humanos que expressam um bloqueador da presente invenção. Pode-se produzir um animal transgénico por meio da introdução do ácido nucleico no pró-núcleo masculino de um oócito fertilizado, por exemplo, por micro-injecção, infecção retroviral e que permite que o oócito se desenvolva numa fêmea adoptiva pseudo-grávida. Qualquer uma das sequências reguladoras ou outras sequências úteis nos vectores de expressão podem fazer parte da sequência transgénica. Uma sequência reguladora especifica de tecidos pode ser ligada operacionalmente ao transgene para dirigir a expressão do transgene para células particulares. Um animal transgénico não humano que expressa um polipéptido de fusão ou um mini-bloqueador da presente invenção é útil numa variedade de aplicações, incluindo como meio de produção desses polipéptido de fusão. Além disso, o transgene pode ser colocado sob o controlo de um promotor indutível de tal modo que a expressão do polipéptido de fusão ou o mini-bloqueador pode ser controlado, por exemplo, por administração de uma molécula pequena. 27

Enquadramentos específicos

Nas experiências que se descrevem a seguir, geraram-se bloqueadores mais pequenos de FCEVe investigou-se a sua capacidade para se ligarem a FCEV. Esses mini-bloqueadores são preferencialmente utilizados em aplicações especificas. Por exemplo, alguns estados clínicos ou doenças podem ser tratados, preferencialmente por administração local de um bloqueador de FCEV para um órgão, tecido ou célula específicos, em vez da administração sistémica. Numa experiência, gerou-se um bloqueador de FCEV mais pequeno por clivagem dirigida de um bloqueador de FCEV dimerizado com uma região de clivagem (região C) gerado num dos domínios de Fc (Exemplo 2) . 0 bloqueador truncado exibiu uma afinidade comparável para FCEV e um semi-período de vida como o do bloqueador parental de dimensão completa. Os exemplos 3-5 descrevem a construção de polipéptidos de fusão com uma componente do receptor de FCEV e uma componente de multimerização que consiste em um ou dois resíduos de cisteína. As medições de afinidade mostraram que os polipéptidos de fusão não glicosilados expressos em E. coli ou os polipéptidos glicosilados expressos em células de OHC têm uma afinidade de ligação comparável para FCEV tal como o bloqueador original de comprimentos completo. 0 exemplo 6 ilustra ainda um bloqueador monomérico de FCEV que consiste em (R1R2)2 que é capaz de se ligar e de inibir FCEV. 0 exemplo 7 descreve a preparação de um mini-bloqueador de FCEV (SEQ ID NO: 26) exibindo uma elevada ligação de afinidade para FCEV comparável ao bloqueador de comprimento completo (SEQ ID NO: 10).

Outras características da presente invenção tornar-se-ão evidentes no decurso das descrições que se seguem dos 28 enquadramentos dos exemplos que são dados a título ilustrativo da presente invenção e não pretendem ser limitativos.

EXEMPLOS 0 exemplo que se segue pretende providenciar os especialistas na matéria com uma descrição completa da forma de realizar e utilizar os processos e as composições da presente invenção e não pretendem limitar o âmbito daquilo que os requerentes consideram como a sua invenção. Fizeram-se esforços para assegurar precisão no que respeita aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.) mas alguns erros experimentais e desvios devem ser tidos em conta. A menos que seja indicado de outra forma, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio, a temperatura está em graus centígrados e a pressão é a pressão atmosférica ou próxima dela.

Exemplo 1. Preparação de FltlD2.FlklD3.FcACl(a) A preparação de um bloqueador parental de FCEV, FItlD2.FlklD3.FcAAl(a) (SEQ ID NOs:7-8), FCEV R1R2.FcACl(a) (SEQ ID NOs:9-10) e FltlD2.FCEV R3D3.FcACl (a) (SEQ ID NOs:12-13) está descrita em detalhe na publicação PCT da W010075319, aqui especificamente incorporada integralmente como referência. Também na W010075319 também estão descritos processos de preparação e expressão de estruturas de ácidos nucleicos que codificam bloqueadores de FCEV, processos para a detecção e a medição da ligação de um bloqueador de FCEV a FCEV, processos para a determinação da estequeometria da ligação de FCEV por análise BIAcore e análises farmacocinéticas. 29

Exemplo 2: Mini-bloqueador dimérico de FCEV clivado com troníbina A estrutura de FCEV R1R2.FcACl(a) (SEQ ID NOs:9-10) foi modificada por inserção de uma clivagem de trombina no seguimento de CPPC (SEQ ID NO:l) do dominio Fc. Incubou-se p bloqueador de FCEV purificado (5 yg) com trombina (Novagen) em Tris-HCl 20 mM, a pH 8,4, NaCl 50 mM, CaCl2 2,5 mM durante 16 hrs a 37° C. Os controlos incluíram a proteína de controlo da clivagem (CCP) e a proteína do bloqueador parental de FCEV foi incubada sem trombina. A análise por EGPA-SDS (gel de Tris-Glicina a 4-20 %; 5 yg de proteína por coluna) verificou a clivagem correcta (resultados não mostrados).

Determinação da afinidade. O Kd de ligação de cada bloqueador de FCEV a FCEVh 165 foi determinado como está descrito na WO10075319, para o bloqueador pai do bloqueador não clivado de FCEV contendo um sítio de clivagem de trombina ("bloqueador de FCEV não clivado"), mini-bloqueador clivado de FCEV e RlR2-myc myc his monomérico recombinante. Mais especificamente, a capacidade dos bloqueadores para bloquear a fosforilação do receptor dependente do FCEVi65 foi determinada utilizando células endoteliais humanas primárias (HUVECs). Incubou-se FCEVi65 na presença de várias concentrações dos bloqueadores do ensaio e adicionou-se a mistura a HUVECs para estimular a fosforilação da tirosina de FCEV R2. No caso de concentrações sub-estequiométricas do bloqueador de FCEV, o FCEV não ligado induziu a fosforilação do receptor. Contudo, a uma relação molar 1:1 ou maior de um bloqueador de FCEV ao ligando, observou-se o bloqueio completo da sinalização do receptor, estabelecendo-se que uma única molécula de um dímero do bloqueador é capaz de bloquear uma 30 única molécula do FCEVi65 humano. Assim, a elevada afinidade de ligação do bloqueador de FCEV para FCEV resulta na formação de um complexo que evita que o FCEV interaja com os receptores da superfície das células. Obtiveram-se resultados equivalentes para experiências idênticas de inibição da fosforilação para o bloqueador parental de FCEV, bloqueador de FCEV não clivado e mini-bloqueador de FCEV clivado. Estes resultados estão ilustrados no quadro 1. QUADRO 1

Bloqueador Taxa de dissociação cinética (1/s) Ti/2 (hr) Bloqueador parental de FCEV 5,51 x 10'b ± 0,94% 3,5 Bloqueador de FCEV não clivado 4,93 x IO'5 ± 0,70% 3,9 Mini-bloqueador de FCEV clivado 5,46 x IO-5 ± 0,62% 3,53 Monómero de RlR2-mic mic his 6,74 x 10~5 ± 0,38% 0,028

Exemplo 3. Preparação de plasmidos que codificam os mini-bloqueadores de FCEV

Os mini-bloqueadores de FCEV foram preparados a partir de um precursor do bloqueador parental de FCEV, FCEV R1R2.FcACl(e) (SEQ ID NOs:9-10), em que os três aminoácidos glicina-alanina-proline serviram como ligante entre Flkl D3 e FcACl (a) . Este plasmido, pTE115 foi utilizado na construção dos mini-bloqueadores de FCEV por causa da sequência de AND do ligante incluir uma sequência de reconhecimento de endonuclease de restrição Srf I que facilita o tratamento por engenharia genética do bloqueador de FCEV. Em todos os outros aspectos, o bloqueador de FCEV codificado por pTE115 é idêntico ao do bloqueador de FCEV, 31 FCEV R1R2.FcACl(a) (SEQ ID NOs: 9-10) descrito em detalhe na publicação de PCT da WO/0075319.

Prepararam-se dois mini-bloqueadores de FCEV com domínios de multimerização consistindo num único resíduo de cisteína (R1R2C) (SEQ ID NO:2) ou os aminoácidos ACGC (SEQ ID NO: 4) (R1R2Acgc) (SEQ ID NO: 5) adicionados aos componentes do receptor do terminal C FltlD2.FlklD3. Ambas as estruturas são capazes de formar moléculas homo-diméricas estabilizadas por um disulfureto intermolecular (R1R2C) ou dois (R1R2Acgc) · O plasmido pTE517 foi preparado por eliminação de um fragmento de 690 pb gerado pela digestão do ADN de pTE115 com Srf I e Not I e inserindo o fragmento sintético de ADN formado por hibridação dos oligos R1R2NC (SEQ ID NO: 14) e Rl R2CC (SEQ ID NO: 15) . O plasmido resultante codifica R1R2C, ue consiste nos domínios FltlD2.FlklD3 seguidos de um resíduo de cisteína (SEQ ID NO: 23) . Do mesmo modo, o plasmido pTE518 foi preparado por eliminação de um fragmento de 690 pb gerado pela digestão do ADN de pTEH5 com Srf I e Not I seguido da ligação com o fragmento sintéticode ADN formado por hibridação dos oligos R1R2NACGC (SEQ ID NO: 16) e R1R2CACGC (SEQ ID NO: 17) . O plasmido resultante codifica R1R2ACGC, que consiste nos domínios de FltlD2.FlklD3 seguidos dos aminoácidos ACGC (SEQ ID NO: 25) .

Os plasmidos também foram preparados para dirigir a expressão destes mini-bloqueadores em E. coli. Utilizaram-se os iniciadores RlR2N-Ncol (SEQ ID NO: 18) e RlR2CNotl (SEQ ID NO: 19) para amplificar um fragmento de ADN a partir de pTE115 que codifica os aminoácidos G30 a K231, relativamente ao bloqueador parental de FCEV (SEQ ID NO: 32 10). A amplificação desta sequência resultou na fusão de um codão de iniciação de metionina na extremidade 5' e a fusão do codão para a cisteina, seguido de um codão de paragem na extremidade 3' (SEQ ID NO: 2). Este fragmento de AND foi então clonado nos sitios Ncol e Notl do plasmido de expressão pRG663 em E. coli, para se obter pRGH02 de tal modo que a expressão de R1R2C ficou dependente da transcrição a partir do promotor do fago T7 Φ1.1. A indução da expressão dos genes a partir de pRG1102 resulta na acumulação de RlR2cis no citoplasma da estirpe hospedeira RFJ238de E. coli. Do mesmo modo, os iniciadores RlR2N-NcoI (SEQ ID NO: 18) e RlR2ACGC-NotI (SEQ ID NO: 20) foram utilizados para amplificar um fragmento de ADN a partir de pTE115 que codifica os aminoácidos G30 a K231 (SEQ ID NO: 10) resultando na fusão de um codão de iniciação de metionina na extremidade 5' e na fusão dos codões para ACGC (SEQ ID NO: 4), seguido de um codão de paragem na extremidade 3' (SEQ ID NO: 5). Este fragmento foi então clonado nos sitios Ncol e Notl do plasmido de expressão pRG663 em E. coli para se obter pRG1103 de tal modo que a expressão de R1R2ACGC ficou dependente da transcrição a partir do promotor do fago T7 Φ1.1. A indução da expressão do gene, tanto a partir de pRG1102 como de pRG1103 resulta na acumulação de R1R2C ou de R1R2ACGC, respectivamente, no citoplasma da estirpe hospedeira RFJ238 de E. coli.

Exemplo 4. Purificação e caracterização dos mini-bloqueadores de FCEV a partir de E. coli

Tanto R1R2C como R1R2ACGG foram expressos, como proteínas citoplasmáticas, em E. coli e foram purificados pelo mesmo processo. A indução do promotor do fago T7 Φ1.1 quer em pRG1102 ou em pRG1103 na estirpe K12 de E. coli RFJ238 resultou na acumulação da proteína no citoplasma. 33

Depois da indução, recolheram-se as células por centrifugação, suspenderam-se novamente em Tris-HCl 50 mM, a pH 7,5, EDTA 20 mM e fez-se a lise por meio da passagem através de um homogeneizador de células Niro-Soavi. Recolheram-se os corpos de inclusão a partir das células da lise por meio de centrifugação, lavaram-se uma vez em H20 destilada, depois solubilizou-se em guanidínio-HCl 8 M, Tris-HCl 50 mM, a pH 8,5, sulfito de sódio 100 mM, tetrationato de sódio 10 mM e incubou-se à temperatura ambiente durante 16 horas. Fraccionou-se o sobrenadante purificado numa coluna S300 equilibrada com guanidinio-HCl 6 M, Tris-HCl 50 mM, a pH 7,5. Juntaram-se as fracções contendo R1R2C e fez-se a sua diálise com ureia 6M, Tris-HCl 50 mM, a pH 7,5. Diluiu-se a proteína dializada com ureia 2M, Tris-HCl 50 mM, a pH 8,5, cisteína 2 mM, depois agitou-se lentamente durante 7 dias a 4°C. Fez-se a diálise da proteína re-enovelada contra Tris-HCl 50 mM, a pH 7,5 e depois carregou-se numa coluna de SP-sefarose equilibrada com Tris-HCl 50 mM, a pH 7,5 e eluíu-se com um gradiente de NaCl desde 0 a 1 M em Tris-HCl 50 mM, a pH 7,5. Reuniram-se as fracções contendo R1R2C, concentraram-se e carregaram-se numa coluna Superdex 200 equilibrada com Tris-HCl 50 mM, a pH 7,5, NaCl 150 mM. As fracções que continham o dímero de mini-bloqueadores foram recolhidas e aglomeradas. O peso molecular do mini-bloqueador purificado foi estimado, por EGPA-SDS, como sendo de cerca de 46 kD.

Realizaram-se ensaios por BIAcore (tal como descrito em WO/0075319) para determinar a afinidade do bloqueador para FCEV e os resultados mostraram que os mini-bloqueadores de R1R2C e R1R2ACGC têm uma afinidade para FCEV comparável à do bloqueador de FCEV de comprimento completo (quadro 2). 34 QUADRO 2

Bloqueador Taxa cinética de dissociação Ti/2 (h) Bloqueador de 4,23 x 10'b 4,53 R1R2C 3,39 x 10'b 5, 68 R1R2acgc 3,41 x 10's 5, 65

Exemplo 5. Expressão de mini-bloqueadores em Kl de OHC A expressão dos mini-bloqueadores de FCEV codificados por pTB517 e pTE51 está dependente da transcrição do promotor de CMV-MIE humano e resulta na secreção de mini-bloqueadores no meio de cultura quando expresso em células de OHC. Quando expresso como proteínas segregadas em Kl de OHC, encontraram-se ambos os mini-bloqueadores no meio condicionado e a estimativa do seu peso molecular, avaliado por EGPA-SDS, conforme esperado, sugere que as proteínas estavam glicosiladas. A análise por EGPA-SDS também indicou que os mini-bloqueadores eram capazes de formar moléculas homo-diméricas estabilizadas por di-sulfuretos inter-moleculares entre as cisteínas do terminal C. Especifica-mente, o mini-bloqueador R1R2C formou eficientemente dímeros covalentes quando expresso como uma proteína segregada em células de OHC.

Exemplo 6. Construção e expressão de um mini-bloqueador de FCEV com uma única cadeia

Também se construiu um mini-bloqueador de FCEV, que não exigiu um domínio de multimerização (SEQ ID NO: 24) . Este mini-bloqueador foi construído por fusão directa de um domínios FltlD2.FlklD3 (R1R2) (aminoácidos 30-231 da SEQ ID NO: 24) com um segundo domínio FltlD2.FlklD3 (R1R2) (aminoácidos 234-435 de SEQ ID NO: 24) com um ligante de 35

Gli-Pro entre os domínios do receptor em tandem (aminoácidos 232-233 da SEQ ID NO: 24).

Para construir um gene que codifica os domínios Fltl D2.FlklD3 em tandem, sintetizou-se um fragmento de ADN (Blue Heron Biotechnology) que codificou um domínio de FltlD2. FlklD3 que minimizou a homologia de ADN com o ADN que codifica o domínio de FltlD2.FlklD3 encontrado em pTE115. Este fragmento sintético de ADN foi clonado como um fragmento de Srfl-Notl nos sítios Srfl-Notl de pTE115 para se obter pTE570, que expressa o mini-bloqueador de FCEV R1R2-R1R2 a partir do promotor de CMV-MIE. Quando este plasmido é transfectado em células Kl de OHC os mini-bloqueadores de FCEV R1R2-R1R2 acumulam-se no meio de cultura.

Exemplo 7. Construção e expressão de um mini-bloqueador de FCEV

Construiu-se um mini-bloqueador de FCEV, tal como foi descrito antes, por fusão directa de um domínio FltlD2.FlklD3 (R1R2) (aminoácidos 30-231 da SEQ ID NO: 26) com uma sequência de nove aminoácidos de terminal C terminando em CPPC. Quando este plasmido é transfectado em células Kl de OHC o mini-bloqueador de FCEV da SEQ ID NO: 2 6 é segregado no meio de cultura. A purificação subsequente por meio de electroforese por EGPA-SDS não redutora assim como a análise por varrimento da luz natural identificou uma molécula de bloqueador com um peso molecular de aproximadamente 64 kDa. Este peso molecular indica que se formou um dímero covalente entre dois polipéptidos de fusão da SEQ ID NO: 26. Realizaram-se experiências semelhantes com plasmidos que codificam os polipéptidos de fusão das SEQ ID NOS: 27 e 28, e do mesmo 36 modo mostraram que estas moléculas formaram bloqueadores homodiméricas. As determinações da afinidade para a ligação de FCEV-165 humano aos bloqueadores de EGF composto por dimeros das SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 26 estão ilustrados no quadro 3. QUADRO 3

Bloqueador de FCEV ka (1/Ms), kd(1/s) KD (M) SEQ ID NO: 10 2,73 x 10+/ 1,79 x 10"b 6,55 x 10-13 SEQ ID NO: 26 2,00 x 10+v 6,56 x 10"b 3,28 x 10"1" SEQ ID NO: 26 2,61 x 10+v 5,77 x 10"b 2,21 x 10~13

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Daly, Thomas J., Fandl, James P., Papadopoulos, Nicholas J.

<120> BLOQUEADORES DE FCEV E AS SUAS UTILIZAÇÕES

TERAPÊUTICAS <130> 710D2-WO <140> a ser atribuído <141> 2004-06-29 <150> 10/609,775 <151> 2003-06-30 <160> 29 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1 <211> 4 37

< 212 > PRT <213> homo sapiens < 4 0 0 > 1

Cis Pro Pro Cis 1

<210> 2 <211> 200 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2

Met Gli Arg Pro Fen Vai Glu Met Tir Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile 1 5 10 15 His Met Tre Glu Gli Arg Glu Leu Vai Ile Pro Cis Arg Vai Tre Ser 20 25 30 Pro Asn Ile Tre Vai Tre Leu Lis Lis Fen Pro Leu Asp Tre Leu Ile 35 40 45 Pro Asp Gli Lis Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lis Gli Fen Ile Ile 50 55 60 Ser Asn Ala Tre Tir Lis Glu Ile Gli Leu Leu Tre Cis Glu Ala Tre 65 70 75 80 Vai Asn Gli His Leu Tir Lis Tre Asn Tir Leu Tre Gin Tre Asn Tre 85 90 95 Ile Ile Asp Vai Vai Leu Ber Pro Ser His Gli Ile Glu Leu Ser Vai 100 105 110 Gli Glu Lis Leu Vai Leu Asn Cis Tre Ala Arg Tre Glu Leu Asn Vai 115 120 125 Gli Ile Asp Fen Asn Trp Glu Tir Pro Ser Ser Lis His Gin His Lis 130 135 140 Lis Leu Vai Asn Arg Asp Leu Lis Tre Gin Ser Gli Ser Glu Met Lis 145 150 155 160 Lis Fen Leu Ser Tre Leu Tre Ile Asp Gli Vai Tre Arg Ser Asp Gin 165 170 175 38

Gli Tre Cis Ala Ala Ser Ser Gli Leu Met Tre Lis Lis Asn Ser Tre 180 185 190

Fen Vai Arg Vai His Glu Lis Cis 195 200

<210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> VARIANTE < 2 2 2 > 1,3 <223> Xaa = qualquer aminoácido <400> 3

Xaa Cis Xaa Cis 1 <210> 4

<211> 4 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4

Ala Cis Gli Cis 1

<210> 5 <211> 203 <212> PRT <213> homo sapiens 39 < 4 Ο Ο > 5

Met Gli Arg Pro Fen Vai Glu Met Tir Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile 1 5 10 15 His Met Tre Glu Gli Arg Glu Leu Vai Ile Pro Cis Arg Vai Tre Ser 20 25 30 Pro Asn Ile Tre Vai Tre Leu Lis Lis Fen Pro Leu Asp Tre Leu Ile 35 40 45 Pro Asp Gli Lis Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lis Gli Fen Ile Ile 50 55 60 Ser Asn Ala Tre Tir Lis Glu Ile Gli Leu Leu Tre Cis Glu Ala Tre 65 70 75 80 Vai Asn Gli His Leu Tir Lis Tre Asn Tir Leu Tre Gin Tre Asn Tre 85 90 95 Ile Ile Asp Vai Vai Leu Ser Pro Ser His Gli Ile Glu Leu Ser Vai 100 105 110 Gli Glu Lis Leu Vai Leu Asn Cis Tre Ala Arg Tre Glu Leu Asn Vai 115 120 125 Gli Ile Asp Fen Asn Trp Glu Tir Pro Ser Ser Lis His Gin His Lis 130 135 140 Lis Leu Vai Asn Arg Asp Leu Lis Tre Gin Ser Gli Ser Glu Met Lis 145 150 155 160 Lis Fen Leu Ser Tre Leu Tre Ile Asp Gli Vai Tre Arg Ser Asp Gin 165 170 175 Gli Tre Cis Ala Ala Ser Ser Gli Leu Met Tre Lis Lis Asn Ser Tre 180 185 190 Fen Vai Arg Vai His Glu Lis Ala Cis Gli Cis 195 200

<210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 6 40

Leu Vai Pro Arg Gli Ser 1 5 <210> 7 <211> 1453

<212> ADN <213> homo sapiens <400> 7 aagcttgggc tgcaggtcga tcgactctag aggatcgatc cccgggcgag ctcgaattcg 60 caaccaccat ggtcagctac tgggacaccg gggtcctgct gtgcgcgctg ctcagctgtc 120 tgctcctcac aggatctagt tccggaggta gacctttcgt agagatgtac agtgaaatcc 180 ccgaaattat acacatgact gaaggaaggg agctogtcat tccctgccgg gttacgtcac 240 ctaacatcac tgttacttta aaaaagtttc cacttgacac tttgatccct gatggaaaac 300 gcataatctg ggacagtaga aagggattca tcatatcaaa tgcaacgtac aaagaaatag 360 ggcttctgac ctgtgaagca acagtcaatg ggcatttgta taagacaaac tatctcacac 420 atcgacaaac caatacaatc atagatgtgg ttctgagtcc gtctcatgga attgaactat 480 ctgttggaga aaagcttgtc ttaaattgta cagcaagaac tgaactaaat gtggggattg 540 acttcaactg ggaataccct tcttcgaagc atcagcataa gaaacttgta aaccgagacc 600 taaaaaocca gtctgggagt gagatgaaga aatttttgag caccttaact atagatggtg 660 taacccggag tgaccaagga ttgtacacct gtgcagcatc cagtgggctg atgaccaaga 720 agaacagcac atttgtcagg gtccatgaaa agggcccggg cgacaaaaàt cacacatgcc 780 caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac 840 ocaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga 900 gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg 960 ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 1020 ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag 1080 ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac 1140 aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct 1200 gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc 1260 cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 1320 atagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctacg 1380 tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctacgggta 1440 aatgagcggc cgc 1453 <210> 8 <211> 458 41

< 212 > PRT <213> homo sapiens <400> 8

Met Vai Ser Tir Trp Asp Tre Gli vai Leu Leu Cis Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cis Leu Leu Leu Tre Gli Ser Ser Ser Gli Gli Arg Pro Fen Vai Glu 20 25 30 Met Tir Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Tre Glu Gli Arg Glu 35 40 45 Leu Vai Ile Pro Cis Arg Vai Tre Ser Pro Asn Ile Tre Vai Tre Leu 50 55 60 Lis Lis Fen Pro Leu Asp Tre Leu Ile Pro Asp Gli Lis Arg Ile Ile 65 70 75 80 Trp Asp Ser Arg Lis Gli Fen Ile Ile Ser Asn Ala Tre Tir Lis Glu 85 90 95 Ile Gli Leu Leu Tre Cis Glu Ala Tre Vai Asn Gli Bis Leu Tir Lis 100 105 110 Tre Asn Tir Leu Tre His Arg Gin Tre Asn Tre Ile Ile Asp Vai Vai 115 120 125 Leu Ser Pro Ser His Gli Ile Glu Leu Ser Vai Gli Glu Lis Leu Vai 130 135 140 Leu Asn Cis Tre Ala Arg Tre Glu Leu Asn Vai Gli Ile Asp Fen Asn 145 150 155 160 Trp Glu Tir Pro Ser Ser Lis His Gin His Lis Lis Leu Vai Asn Arg 165 170 175 Asp Leu Lis Tre Gin Ser Gli Ser Glu Met Lis Lis Fen Leu Ser Tre 180 185 190 Leu Tre Ile Asp Gli Vai Tre Arg Ser Asp Gin Gli Leu Tir Tre Cis 195 200 205 Ala Ala Ser Ser Gli Leu Met Tre Lis Lis Asn Ser Tre Fen Vai Arg 210 215 220 Vai Ris Glu Lis Gli Pro Gli Asp Lis Tre His Tre Cis Pro Pro Cis 225 230 235 240 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gli Gli Pro Ser Vai Fen Leu Fen Pro Pro 245 250 255 Lis Pro Lis Asp Tre Leu Met Ile Ser Arg Tre Pro Glu Vai Tre Cis 42 260 265 270 1-1 fl3 > Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lis Fen Asn Trp 275 280 285 Tir Vai Asp Gli Vai Glu Vai His Asn Ala Lis Tre Lis Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gin Tir Asn Ser Tre Tir Arg Vai Vai Ser Vai Leu Tre Vai Leu 305 310 315 320 His Gin Asp Trp Leu Asn Gli Lis Glu Tir Lis Cis Lis Vai Ser Asn 325 330 335 Lis Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lis Tre Ile Ser Lis Ala Lis Gli 340 345 350 Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tir Tre Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 355 360 365 Leu Tre Lis Asn Gin Vai Ser Leu Tre Cis Leu Vai Lis Gli Fen Tir 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gli Gin Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tir Lis Tre Tre Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gli Ser Fen Fen 405 410 415 Leu Tir Ser Lis Leu Tre Vai Asp Lis Ser Arg Trp Gin Gin Gli Asn 420 425 430

Vai Fen Ser Cis Ser Vai. Met His Glu Ala Leu His Asn His Tir Tre 435 440 445

Gin Lis Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gli Lis 450 455 <210>9 <211> 1377 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 9 atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60 acaggatcta gttccggaag tgataccggt agacctttcg tagagatgta cagtgaaatc 120 cccgaaatta tacacatgac tgaaggaagg gagctcgtca ttccctgccg gattacgtca 180 cctaacatca ctgttacttt aaaaaagttt ccacttgaca ctttgatccc tgatggaaaa 240 43 cgcataatct gggacagtag aaagggcttc atcatatcaa atgcaacgta caaagaaata 300 gggcttctga cctgtgaagc aacagtcaat gggcatttgt ataagacaaa ctatctcaca 360 catcgacaaa ccaatacaat catagatgtg gttctgagtc cgtctcatgg aattgaacta 420 tctgttggag aaaagcttgt cttaaattgt acagcaagaa ctgaactaaa tgtggggatt 480 gacttcaact gggaataccc ttcttcgaag catcagcata agaaacttgt aaaccgagac 540 ctaaaaaccc agtctgggag tgagatgaag aaatttttga gcaccttaac tatagatggt 600 gtaacccgga gtgaccaagg attgtacacc tgtgcagcat ccagtgggct gatgaccaag 660 aagaacagca catttgtcag ggtccatgaa aaggacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 720 ccagcacctg aactcctggg gggaacgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 780 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 840 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gaaggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 900 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct catcgtcctg 960 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1020 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1080 accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1140 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1200 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1260 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1320 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 1377 < 210 > 10 <211> 458 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 10 Met Vai Ser Tir Trp Asp Tre Gli Vai Leu Leu Cis Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cis Leu Leu Leu Tre Gli Ser Ser Ser Gli Ser Asp Tre Gli Arg Pro 20 25 30 Fen Vai Glu Met Tir Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Tre Glu 35 40 45 Gli Arg Glu Leu Vai Ile Pro Cis Arg Vai Tre Ser Pro Asn Ile Tre 50 55 60 Vai Tre Leu lis Lis Fen Pro Leu Asp Tre Leu Ile Pro Asp Gli Lis 65 70 75 80 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lis Gli Fen Ile Ile Ser Asn Ala Tre 44 85 90 95

Tir Lis Glu Ile Gli Leu Leu Tre Cis Glu Ala Tre Vai Asn Gli His 100 105 110 Leu Tir Lis Tre Asn Tir Leu Tre His Arg Gin Tre Asn Tre Ile Ile 115 120 125 Asp Vai Vai Leu Ser Pro Ser His Gli Ile Glu Leu Ser Vai Gli Glu 130 135 140 Lis Leu Vai Leu Asn Cis Tre Ala Arg Tre Glu Leu Asn Vai Gli Ile 145 150 155 160 Asp Fen Asn Trp Glu Tir Pro Ser Ser Lis His Gin His Lis Lis Leu 165 170 175 Vai Asn Arg Asp Leu Lis Tre Gin Ser Gli Ser Glu Met Lis Lis Fen 180 185 190 Leu Ser Tre Leu Tre Ile Asp Gli Vai Tre Arg Ser Asp Gin Gli Leu 195 200 205 Tir Tre Cis Ala Ala Ser Ser Gli Leu Met Tre Lis Lis Asn Ser Tre 210 215 220 Fen Vai Arg Vai His Glu Lis Asp Lis Tre His Tre Cis Pro Pro Cis 225 230 235 240 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gli Gli Pro Ser Vai Fen Leu Fen Pro Pro 245 250 255 Lis Pro Lis Asp Tre Leu Met Ile Ser Arg Tre Pro Glu Vai Tre Cis 260 265 270 Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lis Fen Asn Trp 275 280 285 Tir Vai Asp Gli Vai Glu Vai His Asn Ala Lis Tre Lis Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gin Tir Asn Ser Tre Tir Arg Vai Vai Ser Vai Leu Tre Vai Leu 305 310 315 320 His Gin Asp Trp Leu Asn Gli Lis Glu Tir Lis Cis Lis Vai Ser Asn 325 330 335 Lis Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lis Tre Ile Ser Lis Ala Lis Gli 340 345 350 Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tir Tre Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 355 360 365 Leu Tre Lis Asn Gin Vai Ser Leu Tre Cis Leu Vai Lis Gli Fen Tir 370 375 380 45

Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gli Gin Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tir Lis Tre Tre Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gli Ser Fen Fen 405 410 415 Leu Tir Ser Lis Leu Tre Vai Asp Lis Ser Arg Trp Gin Gin Gli Asn 420 425 430 Vai Fen Ser Cis Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tir Tre 435 440 445 Gin Lis Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gli Lis 450 455 < 210 > 11 <211> 4

< 212 > PRT <213> homo sapiens < 2 2 0 >

<221> VARIANTE <222> 1, 2, 3, 4 <223> Xaa = qualquer aminoácido <400> 11

Xaa Xaa Xaa Xaa 1 < 210 > 12 <211> 1444 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 12 aagcttgggc tgcaggtcga tcgactctag aggatcgatc cccgggcgag ctcgaattcg 60 caaccaccat ggtcagctac tgggacaccg gggtcctgct gtgcgcgctg ctcagctgtc 120 tgcttctcac aggatctagt tccggaggta gacctttcgt agagatgtac agtgaaatcc 180 ccgaaattat acacatgact gaaggaaggg agctcgtcat tccctgccgg gttacgtcac 240 46 ctaacatcac tgttacttta aaaaagtttc cacttgacac tttgatccct gatggaaaac 300 gcataatctg ggacagtaga aagggcttca tcatatcaaa tgcaacgtac aaagaaatag 360 ggcttctgac ctgtgaagca acagtcaatg ggcatttgta taagacaaac tatctcacac 420 atcgacaaac caatacaatc atagatatcc agctgttgcc caggaagtcg ctggagctgc 480 tggtagggga gaagctggtc ctcaactgca ccgtgtgggc tgagtttaac tcaggtgtca 540 cctttgactg ggactaccca gggaagcagg cagagcgggg taagtgggtg cccgagcgac 600 gatccaaaca gacccacaca gaactctcca gcatcctgac catccacaac gtcagccagc 660 acgacctggg ctcgtatgtg tgcaaggcca acaacggcat ccagcgattt cgggagagca 720 ccgaggtcat tgtgcatgaa aatggcccgg gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc 780 cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca 840 ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag 900 accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa 960 agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc 1020 accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag 1080 cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca 1140 ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca 1200 aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca 1260 actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc 1320 tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctaa gtgatgcatg 1380 aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatgagcgg 1440 ccgc 1444

< 210 > 13 <211> 455 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 13

Met Vai Ser Tir Trp Asp Tre Gli Vai Leu Leu Cis Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cis Leu Leu Leu Tre Gli Ser Ser Ser Gli Gli Arg Pro Fen Vai Glu 20 25 30 Met Tir Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Tre Glu Gli Arg Glu 35 40 45 Leu Vai Ile Pro Cis Arg Vai Tre Ser Pro Asn Ile Tre Vai Tre Leu 50 55 60 Lis Lis Fen Pro Leu Asp Tre Leu Ile Pro Asp Gli Lis Arg Ile Ile 47 65 70 75 80

Trp Asp Ser Arg Lis Gli Fen Ile Ile Ser Asn Ala Tre Tir Lis Glu 85 90 95 Ile Gli Leu Leu Tre Cis Glu Ala Tre Vai Asn Gli His Leu Tir Lis 100 105 110 Tre Asn Tir Leu Tre His Arg Gin Tre Asn Tre Ile Ile Asp Ile Gin 115 120 125 Leu Leu Pro Arg Lis Ser Leu Glu Leu Leu Vai Gli Glu Lis Leu Vai 130 135 140 Leu Asn Cis Tre Vai Trp Ala Glu Fen Asn Ser Gli Vai Tre Fen Asp 145 150 155 160 Trp Asp Tir Pro Gli Lis Gin Ala Glu Arg Gli Lis Trp Vai Pro Glu 165 170 175 Arg Arg Ser Gin Gin Tre His Tre Glu Leu Ser Ser Ile Leu Tre Ile 180 185 190 His Asn Vai Ser Gin His Asp Leu Gli Ser Tir Vai Cis Lis Ala Asn 195 200 205 Asn Gli Ile Gin Arg Fen Arg Glu Ser Tre Glu Vai Ile Vai His Glu 210 215 220 Asn Gli Pro Gli Asp Lis Tre His Tre Cis Pro Pro Cis Pro Ala Pro 225 230 235 240 Glu Leu Leu Gli Gli Pro Ser Vai Fen Leu Fen Pro Pro Lis Pro Lis 245 250 255 Asp Tre Leu Met Ile Ser Arg Tre Pro Glu Vai Tre Cis Vai Vai Vai 260 265 270 Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lis Fen Asn Trp Tir Vai Asp 275 280 285 Gli Vai Glu Vai His Asn Ala Lis Tre Lis Pro Arg Glu Glu Gin Tir 290 295 300 Asn Ser Tre Tir Arg Vai Vai Ser Vai Leu Tre Vai Leu His Gin Asp 305 310 315 320 Trp Leu Asn Gli Lis Glu Tir Lis Cis Lis Vai Ser Asn Lis Ala Leu 325 330 335 Pro Ala Pro Ile Glu Lis Tre Ile Ser Lis Ala Lis Gli Gin Pro Arg 340 345 350 Glu Pro Gin Vai Tir Tre Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Tre Lis 355 360 365 48

Asn Gin Vai Ser Leu Tre Cis Leu Vai Lis Gli Fen Tir Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gli Gin Pro Glu Asn Asn Tir Lis 385 390 395 400 Tre Tre Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gli Ser Fen Fen Leu Tir Ser 405 410 415 Lis Leu Tre Vai Asp Lis Ser Arg Trp Gin Gin Gli Asn Vai Fen Ser 420 425 430 Cis Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tir Tre Gin Lis Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ser Pro Gli Lis 450 455 < 210 > 14 <211> 24

< 212 > ADN <213> homo sapiens < 4 0 0 > 14 gggctgttga gagagagaga gagc 24 <210> 15 <211> 28

<212> ADN <213> homo sapiens < 4 0 0 > 15 ggccgctctc tctctctctc aacagccc 28 <210> 16 <211> 23

<212> ADN <213> homo sapiens 49 < 4 Ο Ο > 16 gggcgcatgc ggttgttgag age 23 <210> 17 <211> 27 <212> ADN <213> homo sapiens < 4 0 0 > 17 ggccgctctc aacaaccgca tgcgccc 27 <210> 18 <211> 36 <212> ADN <213> homo sapiens < 4 0 0 > 18 gagagagacc atgggtagac ctttcgtaga gatgta 36 <210> 19 <211> 48 <212> ADN <213> homo < 4 0 0 > 19 sapiens agagaggcgg ccgctttatc aacacttttc atggaccctg acaaatgt 48

<210> 20 <211> 57 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 20 50 agagaggcgg ccgctttatc aacaaccgca tgccttttca tggaccctga caaatgt 57 < 210 > 21 <211> 39

<212> ADN <213> homo sapiens <400> 21 agttccggaa gtgccatggg tagacctttc gtagagatg 39 <210> 22 <211> 44

<212> ADN <213> homo sapiens <400> 22 agagaggcgg ccgctgttat cacttctcgt gcacgcgcac gaag 44

<210> 23 <211> 235 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 23

Met Vai Ser Tir Trp Asp Tre Gli Vai Leu Leu Cis Ale Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cis Leu Leu Leu Tre Gli Ser Ser Ser Gli Ser Asp Tre Gli Arg Pro 20 25 30 Fen Vai Glu Met Tir Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Tre Glu 35 40 45 Gli Arg Glu Leu Vai ile Pro Cis Arg Vai Tre Ser Pro Asn Ile Tre 50 55 60 Vai Tre Leu Lis Lis Fen Pro Leu Asp Tre Leu Ile Pro Asp Gli Lis 65 70 75 80 51

Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lis Gli Fen Ile Ile Ser Asn Ala Tre 85 90 95 Tir Lis Glu Ile Gli Leu Leu Tre Cis Glu Ala Tre Vai Asn Gli His 100 105 110 Leu Tir Lis Tre Asn Tir Leu Tre His Arg Gin Tre Asn Tre Ile Ile 115 120 125 Asp Vai Vai Leu Ser Pro Ser His Gli Ile Glu Leu Ser Vai Gli Glu 130 135 140 Lis Leu Vai Leu Asn Cis Tre Ala Arg Tre Glu Leu Asn Vai Gli Ile 145 150 155 160 Asp Fen Asn Trp Glu Tir Pro Ser Ser Lis His Gin His Lis Lis Leu 165 170 175 Vai Asn Tre Gin Ser Gli Ser Glu Met Lis Arg Asp Leu Lis Lis Fen 180 185 190 Leu Ser Tre Leu Tre Ile Asp Gli Vai Tre Arg Ser Asp Gin Gli Leu 195 200 205 Tir Tre Cis Ala Ala Ser Ser Gli Leu Met Tre Lis Lis Asn Ser Tre 210 215 220 Fen Vai Arg Vai His Glu Lis Gli Pro Gli Cis 225 230 235 <210> 24 <211> 435 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 24 Met Vai Ser Tir Trp Asp Tre Gli Vai Leu Leu Cis Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cis Leu Leu Leu Tre Gli Ser Ser Ser Gli Ser Asp Tre Gli Arg Pro 20 25 30 Fen Vai Glu Met Tir Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Tre Glu 35 40 45 Gli Arg Glu Leu Vai Ile Pro Cis Arg Vai Tre Ser Pro Asn Ile Tre 50 55 60 Vai Tre Leu Lis Lis Fen Pro Leu Asp Tre Leu Ile Pro Asp Gli Lis 52 65 70 75 80

Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lis Gli Fen Ile Ile Ser Asn Ala Tre 85 90 95 Tir Lis Glu Ile Gli Leu Leu Tre Cis Glu Ala Tre Vai Asn Gli His 100 105 110 Leu Tir Lis Tre Asn Tir Leu Tre His Arg Glu Tre Asn Tre Ile Ile 115 120 125 Asp Vai Vai Leu Ser Pro Ser His Gli Ile Glu Leu Ber Vai Gli Glu 130 135 140 Lis Leu Vai Leu Asn Cis Tre Ala Arg Tre Glu Leu Asn Vai Gli Ile 145 150 155 160 Asp Fen Asn Trp Glu Tir Pro Ser Ser Lis His Gin His Lis Lis Leu 165 170 175 Vai Asn Arg Asp Leu Lis Tre Gin Ser Gli Ser Glu Met Lis Lis Fen 180 185 190 Leu Ser Tre Leu Tre Ile Asp Gli Vai Tre Arg Ser Asp Gin Gli Leu 195 200 205 Tir Tre Cis Ala Ala Ser Ser Gli Leu Met Tre Lis Lis Asn Ser Tre 210 215 220 Fen Vai Arg Vai His Glu Lis Gli Pro Gli Arg Pro Fen Vai Glu Met 225 230 235 240 Tir Ser Glu ile Pro Glu ile Ile His Met Tre Glu Gli Arg Glu Leu 245 250 255 Vai Ile Pro Cis Arg Vai Tre Ser Pro Asn Ile Tre Vai Tre Leu Lis 260 265 270 Lis Fen Pro Leu Asp Tre Leu Ile Pro Asp Gli Lis Arg Ile Ile Trp 275 280 285 Asp Ser Arg Lis Gli Fen Ile Ile Ser Asn Ala Tre Tir Lis Glu Ile 290 295 300 Gli Leu Leu Tre Cis Glu Ala Tre Vai Asn Gli His Leu Tir Lis Tre 305 310 315 320 Asn Tir Leu Tre His Arg Gin Tre Asn Tre Ile Ile Asp Vai Vai Leu 325 330 335 Ser Pro Ser His Gli Ile Glu Leu Ser Vai Gli Glu Lis Leu Vai Leu 340 345 350 Asn Cis Tre Ala Arg Tre Glu Leu Asn Vai Gli Ile Asp Fen Asn Trp 53 355 360 365 Glu Tir Pro Ser Ser Lis His Gin His Lis Lis Leu Vai Asn Arg Asp 370 375 380 Leu Lis Tre Gin Ber Gli Ser Glu Met Lis Lis Fen Leu Ser Tre Leu 385 390 395 400 Tre Ile Asp Gli Vai Tre Arg Ser Asp Gin Gli Leu Tir Tre Cis Ala 405 410 415 Ala Ser Ser Gli Leu Met Tre Lis Lis Asn Ser Tre Fen Vai Arg Vai 420 425 430 His Glu Lis 435 <210> 25 <211> 238 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 25 Met Vai Ser Tir Trp Asp Tre Gli Vai Leu Leu Cis Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cis Leu Leu Leu Tre Gli Ser Ser Ser Gli Ser Asp Tre Gli Arg Pro 20 25 30 Fen Vai Glu Met Tir Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Tre Glu 35 40 45 Gli Arg Glu Leu Vai Ile Pro Cis Arg Vai Tre Ser Pro Asn Ile Tre 50 55 60 Vai Tre Leu Lis Lis Fen Pro Leu Asn Tre Leu Ile Pro Asn Gli Lis 65 70 75 80 Ala Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lis Gli Fen Ile Ile Ser Asn Ala Tre 85 90 95 Tir Lis Glu Ile Gli Leu Leu Tre Cis Glu Ala Tre Vai Asn Gli His 100 105 110 Leu Tir Lis Tre Asn Tir Leu Tre His Arg Gin Tre Asn Tre Ile Ile 115 120 125 Asp Vai Vai Leu Ser Pro Ser His Gli Ile Glu Leu Ser Vai Gli Glu 130 135 140 54

Lis Leu Vai Leu Asn Cis Tre Ala Arg Tre Glu Leu Asn Vai Gli Ile 145 150 155 160 Asp Fen Asn Trp Glu Tir Pro Ser Ser Lis His Gin His Lis Lis Leu 165 170 175 Vai Asn Arg Asp Leu Lis Tre Gin Ser Gli Ser Glu Met Lis Lis Fen 180 185 190 Leu Ser Tre Leu Tre Ile Asp Gli Vai Tre Arg Ser Asp Gin Gli Leu 195 200 205 Tir Tre Cis Ala Ala Ser Ser Gli Leu Met Tre Lis Lis Asn Ser Tre 210 215 220 Fen Vai Arg Vai His Glu Lis Gli Pro Gli Ala Cis Gli Cis 225 230 235 <210> 26 <211> 240 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 26 Met Vai Ser Tir Trp Asp Tre Gli Vai Leu Leu Cis Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cis Leu Leu Leu Tre Gli Ser Ser Ser Gli Ser Asp Tre Gli Arg Pro 20 25 30 Fen Vai Glu Met Tir Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Tre Glu 35 40 45 Gli Arg Glu Leu Vai Ile Pro Cis Arg Vai Tre Ser Pro Asn Ile Tre 50 55 60 Vai Tre Leu Lis Lis Fen Pro Leu Asp Tre Leu Ile Pro Asp Gli Lis 65 70 75 80 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lis Gli Fen Ile Ile Ser Asn Ala Tre 85 90 95 Tir Lis Glu Ile Gli Leu Leu Tre Cis Glu Ala Tre Vai Asn Gli His 100 105 110 Leu Tir Lis Tre Asn Tir Leu Tre His Arg Gin Tre Asn Tre Ile Ile 115 120 125 Asp Vai Vai Leu Ser Pro Ser His Gli Ile Glu Leu Ser Vai Gli Glu 55 130 135 140

Lis Leu Vai Leu Asn Cis Tre Ala Arg Tre Glu Leu Asn Vai Gli Ile 145 150 155 160 Asp Fen Asn Trp Glu Tir Pro Ser Ser Lis His Gin His Lis Lis Leu 165 170 175 Vai Asn Arg Asp Leu Lis Tre Gin Ser Gli Ser Glu Met Lis Lis Fen 180 185 190 Leu Ser Tre Leu Tre Ile Asp Gli Vai Tre Arg Ser Asp Gin Gli Leu 195 200 205 Tir Tre Cis Ala Ala Ser Ser Gli Leu met Tre Lis Lis Asn Ser Tre 210 215 220 Fen Vai Arg Vai His Glu Lis Asp Lis Tre His Tre Cis Pro Pro Cis 225 230 235 240 <210> 27 <211> 240 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 27 Met Vai Ser Tir Trp Asp Tre Gli Vai Leu Leu Cis Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cis Leu Leu Leu Tre Gli Ser Ser Ser Gli Ser Asp Tre Gli Arg Pro 20 25 30 Fen Vai Glu Met Tir Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Tre Glu 35 40 45 Gli Arg Glu Leu Vai Ile Pro Cis Arg Vai Tre Ser Pro Asn Ile Tre 50 55 60 Vai Tre Leu Lis Lis Fen Pro Leu Asp Tre Leu Ile Pro Asp Gli Lis 65 70 75 80 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lis Gli Fen Ile Ile Ser Asn Ala Tre 85 90 95 Tir Lis Glu Ile Gli Leu Leu Tre Cis Glu Ala Tre Vai Asn Gli His 100 105 110 Leu Tir Lis Tre Asn Tir Leu Tre Bis Arg Gin Tre Asn Tre Ile Ile 115 120 125 56

Asp Vai Vai Leu Set Pro Ser His Gli Ile Glu Leu Ser Vai Gli Glu 130 135 140 Lis Leu Vai Leu Asn Cis Tre Ala Arg Tre Glu Leu Asn Vai Gli Ile 145 150 155 160 Asp Fen Asn Trp Glu Tir Pro Ser Ser Lis His Gin His Lis Lis Leu 165 170 175 Vai Asn Arg Asp Leu Lis Tre Gin Ser Gli Ser Glu Met Lis Lis Fen 180 185 190 Leu Ser Tre Leu Tre Ile Asp Gli Vai Tre Arg Ser Asp Gin Gli Leu 195 200 205 Tir Tre Cis Ala Ala Ser Ser Gli Leu Met Tre Lis Lis Asn Ser Tre 210 215 220 Fen Vai Arg Vai His Glu Lis Asp Lis Tre His Tre Ser Pro Pro Cis 225 230 235 240 <210> 28 <211> 237 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 28 Met Vai Ser Tir Trp Asp Tre Gli Vai Leu Leu Cis Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cis Leu Leu Leu Tre Gli Ser Ser Ser Gli Ser Asp Tre Gli Arg Pro 20 25 30 Fen Vai Glu Met Tir Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Tre Glu 35 40 45 Gli Arg Glu Leu Vai Ile Pro Cis Arg Vai Tre Ser Pro Asn Ile Tre 50 55 60 Vai Tre Leu Lis Lis Fen Pro Leu Asp Tre Leu Ile Pro Asp Gli Lis 65 70 75 80 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lis Gli Fen Ile Ile Ser Asn Ala Tre 85 90 95 Tir Lis Glu Ile Gli Leu Leu Tre Cis Glu Ala Tre Vai Asn Gli His 100 105 110 Leu Tir Lis Tre Asn Tir Leu Tre His Arg Gin Tre Asn Tre Ile Ile 57 115 120 125

Asp Vai Vai Leu Ser Pro Ser His Gli ile Glu Leu Ser Vai Gli Glu 130 135 140 Lis Leu Vai Leu Asn Cis Tre Ala Arg Tre Glu Leu Asn Vai Gli Ile 145 150 155 160 Asp Fen Asn Trp Glu Tir Pro Ser Ser Lis His Gin Isis Lis Lis > Leu 165 170 175 Vai Asn Arg Asp Leu Lis Tre Gin Ser Gli Ser Glu Met Lis Lis Fen 180 185 190 Leu Ser Tre Leu Tre Ile Asp Gli Vai Tre Arg Ser Asp Gin Gli Leu 195 200 205 Tir Tre Cis Ala Ala Ser Ser Gli Leu Met Tre Lis Lis Asn, • Ser Tre 210 215 220 Fen Vai Arg Vai Bis Glu Lis Asp Lis Tre His Tre Cis 225 230 235 <210> 29 <211> 434 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 29 Ser Asp Tre Gli Arg Pro Fen Vai Glu Met Tir Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Tre Glu Gli Arg Glu Leu Vai Ile Pro Cis Arg Vai 20 25 30 Tre Ser Pro Asn Ile Tre Vai Tre Leu Lis Lis Fen Pro Leu Asp Tre 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gli Lis Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lis Gli Fen 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Tre Tir Lis Glu Ile Gli Leu Leu Tre Cis Glu 65 70 75 80 Aie Tre Vai Asn Gli His Leu Tir Lis Tre Asn Tir Leu Tre His Arg 85 90 95 Gin Tre Asn Tre Ile Ile Asp Vai Vai Leu Ser Pro Ser His Gli Ile 100 105 110 58

Glu Leu Ser i—1 > Gli Glu Lis Leu Vai Leu Asn Cis Tre Ala Arg Tre 115 120 125 Glu Leu Asn vai Gli Ile Asp Fen Asn Trp Glu Tir Pro Ser Ser Lis 130 135 140 His Gin His Lis Lis Leu Vai Asn Arg Asp Leu Lis Tre Gin Ser Gli 145 150 155 160 Ser Glu Met Lis Lis Fen Leu Ser Tre Leu Tre Ile Asp Gli Vai Tre 165 170 175 Arg Ser Asp Gin Gli Leu Tir Tre Cis Ala Ala Ser Ser Gli Leu Met 180 185 190 Tre Lis Lis Asn Ser Tre Fen Vai Arg Vai His Glu Lis Glu Ser Lis 195 200 205 Tir Gli Pro Pro Cis Pro Pro Cis Pro Ala Pro Glu Fen Leu Gli Gli 210 215 220 Pro Ser Vai Fen Leu Fen Pro Pro Lis Pro Lis Asp Tre Leu Met Ile 225 230 235 240 Ser Arg Tre Pro Glu Vai Tre Cis Vai Vai Vai Asp Vai Ser Gin Glu 245 250 255 Asp Pro Glu Vai Gin Fen Asn Trp Tir Vai Asp Gli Vai Glu Vai His 260 265 270 Asn Ala Lis Tre Lis Pro Arg Glu Glu Gin Fen Asn Ser Tre Tir Arg 275 280 285 Vai Vai Ser Vai Leu Tre Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gli Lis 290 295 300 Glu Tir Lis Cis Lis Vai Ser Asn Lis Gli Leu Pro Ser Ser Ile Glu 305 310 315 320 Lis Tre Ile Ser Lis Ala Lis Gli Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tir 325 330 335 Tre Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Tre Lis Asn Gin Vai Ser Leu 340 345 350 Tre Cis Leu Vai Lis Gli Fen Tir Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp 355 360 365 Glu Ser Asn Gli Gin Pro Glu Asn Asn Tir Lis Tre Tre Pro Pro Vai 370 375 380 Leu Asp Ser Asp Gli Ser Fen Fen Leu Tir Ser Arg Leu Tre Vai Asp 385 390 395 400 Lis Ser Arg Trp Gin Glu Gli Asn Vai Fen Ser Cis Ser Vai Met His 59 405 410 415

Glu Ala Leu His Asn His Tir Tre Gin Lis Ser Leu Ser Leu Ser Leu 420 425 430

Gli Lis

Lisboa, 24 de Novembro de 2010. 60

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Molécula isolada de ácido nucleico que codifica um polipéptido de fusão, caracterizada pelo facto de se ligar e inibir o factor de crescimento endotelial vascular (FCEV) consistindo na fusão de um domínio R1R2 com um segundo domínio R1R2 (R1R2)2) em que a fusão é dirigida ou é feita por via de um espaçador de aminoácido e em que RI representa o domínio 2 da Ig da componente do receptor de FCEV de Flt-1 e R2 representa o domínio 3 da Ig de Flk-1.
2. 2. Molécula isolada de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o espaçador ser um ligante de Gli-Pro.
3. 3. Polipéptido de fusão, caracterizado pelo facto de ser codificado pela molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2.
4. 4. Polipéptido de fusão, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácidos ser a da SEQ ID NO: 24.
5. 5. Vector de expressão, caracterizado pelo facto de compreender a molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ligada operacionalmente a uma sequência de controlo de expressão.
6. 6. Processo para a produção de um polipéptido de fusão que se liga e inibe FCEV, caracterizado pelo facto de compreender as etapas de introdução de um vector de expressão, de acordo com a reivindicação 5, num sistema 1 de expressão apropriado e de efectivação da expressão do polipéptido de fusão.
7. 7. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de compreender o polipéptido de fusão, de acordo com a reivindicação 3 ou 4 e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
8. 8. Polipéptido de fusão, capaz de se ligar e inibir o FCEV, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo facto de se utilizar no tratamento de uma doença que seja melhorada ou inibida pela eliminação ou inibição de FCEV em que a referida doença ou o referido estado clínico consiste em: doença da retina; ou uma doença ocular seleccionada entre neovascularização coroidal, edema vascular diabético, retinopatia diabética proliferativa, neovascularização da córnea/rejeição de transplante e degeneração macular relacionada com a idade.
9. 9. Polipéptido de fusão, capaz de se ligar e inibir o FCEV, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo facto de se utilizar como adjuvante na cirurgia de glaucoma, para tratar ou prevenir hem- ou linfangiogénse precoce e recrutamento de macrófagos para a bolha de filtração, após cirurgia de glaucoma. Lisboa, 24 de Novembro de 2010. 2