CN118076894A - pH建模和控制的***及方法 - Google Patents

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Abstract

本公开是关于用于控制样品pH之***及方法，其包含测量初始pH、添加一定量之滴定剂及测量第二pH，且使用无因次化建模将滴定剂归一化且确定达到最终pH所需之滴定剂之量。所述***及方法可用于在蛋白质样品之病毒失活或滴定期间控制pH。

Description

pH建模和控制的***及方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年10月7日提交的美国临时申请第63/253,281号的优先权和利益，其内容的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
在涉及改变样品pH之过程期间，测量及控制pH之惯常方法可能有问题。消毒pH探针且将探针***样品的方法通常与pH探针校准不兼容。因此本技艺中对控制样品pH之***及方法存在需求。
发明内容
本公开提供在包括改变样品(诸如蛋白质样品)之pH的过程中测量及控制pH之***及方法。
在本公开的方法之一些实施例中，所述方法包含：(a)测量样品之初始pH(pH初始)；(b)将至少第一量之滴定剂(滴定剂n)添加至该样品且测量至少第一额外pH值(pHn)，滴定剂n为添加至该样品以达到pHn之滴定剂之量，其中pHn不同于pH初始；(c)应用模型来确定归一化之滴定剂初始量(滴定剂初始)及归一化之滴定剂n，其中该模型将添加至该样品之归一化之滴定剂与该样品之pH相关联；及(d)确定待添加至样品以达到目标pH(pHn+1)之滴定剂之另一额外量，pHn+1为藉由将全部量之滴定剂添加至样品而达到的pH。
在本公开的方法之一些实施例中，所述方法包含将第二量之滴定剂(滴定剂n+2)添加至样品且测量第二额外pH(滴定剂n+2)，且重复步骤(c)及(d)。在一些实施例中，方法包含将第三量之滴定剂添加至样品及测量第三额外pH，且重复步骤(c)及(d)。在一些实施例中，将第三量之滴定剂添加至样品中引起pH在最终目标pH(pH最终)之0.05至0.10pH单位内。在一些实施例中，方法包含将第四量之滴定剂添加至样品且测量第四额外pH。在一些实施例中，方法包含不超过3或4次添加滴定剂以将样品pH变为pH最终。
在本公开的方法之一些实施例中，所述方法包含生成模型。在一些实施例中，方法包含：(i)自至少一个参考样品生成至少一个参考滴定曲线，将添加至参考样品之滴定剂之量与参考样品之pH相关；(ii)将该至少一个参考滴定曲线归一化；及(iii)生成模型以拟合至少一个参考滴定曲线。在一些实施例中，模型包含将归一化之滴定剂与pH相关联之多项式。
在本公开的方法之一些实施例中，所测量之样品pH与模型之间的差值鉴别用于测量样品pH之pH计之校准中的误差。在一些实施例中，方法包含：重新校准pH计；(a)将额外量之滴定剂添加至样品且测量额外pH；(b)应用模型且将归一化之滴定剂及pH与模型进行比较；及(c)当pH与模型相对应时，将剩余量之滴定剂添加至样品以达到pH最终；从而防止添加过多滴定剂至样品对样品造成损伤。在一些实施例中，样品包含蛋白质，且方法防止对蛋白质造成损伤。
本公开提供使样品中之病毒失活的方法，其包含：(a)提供在4.0或更大之初始pH(pH初始)下的样品；(b)将第一量之酸滴定剂(滴定剂n_酸)添加至样品且测量第一额外酸pH值(pHn_酸)，滴定剂n_酸为添加至样品以达到pHn_酸之滴定剂之量，其中pHn_酸不同于pH初始；(c)应用模型以确定归一化之滴定剂，其中该模型将归一化之添加至样品之滴定剂与样品pH相关联；(d)基于归一化之滴定剂、pH及模型，确定添加至样品以达到目标酸pH(pH酸_目标)之滴定剂之量；(e)将该量之滴定剂添加至样品中以达到pH酸_目标；(f)重复步骤(d)及(e)直至达到最终酸pH(pH酸_最终)为止；(g)将样品保持在pH最终_酸下足以使病毒失活之时段；(h)将第一量之碱性滴定剂(滴定剂n_碱)添加至样品且测量第一额外碱pH值(pHn_碱)，滴定剂n_碱为添加至样品以达到pHn_碱之滴定剂之量，其中pHn_碱不同于pH酸_最终；(i)藉由应用第二模型将滴定剂n_碱归一化；(j)基于归一化之滴定剂、pH及模型，确定添加至样品以将样品pH变为目标碱性pH(pH目标_碱)之碱性滴定剂之量；(k)将该量之碱性滴定剂添加至样品中以达到pH目标_碱；及(l)重复步骤(j)及(k)直至达到最终碱性pH(pH最终_碱)为止。在一些实施例中，方法包含至少一次重复步骤(b)及(c)以确认样品之行为与模型相对应。在一些实施例中，方法包含重复步骤(d)及(e)1、2或3次。在一些实施例中，方法包含重复步骤(d)及(e)2或3次，且重复步骤(d)及(e)2或3次引起目标酸pH在pH酸_最终之0.05至0.10pH单位内。在一些实施例中，方法包含再一次重复步骤(d)及(e)以达到pH酸_最终。在一些实施例中，方法包含总共不超过3或4次添加酸滴定剂。在一些实施例中，方法包含重复步骤(h)及(i)至少一次，以确认样品之行为与模型相对应。在一些实施例中，方法包含重复步骤(j)及(k)1、2或3次。在一些实施例中，方法包含重复步骤(j)及(k)2或3次，且重复步骤(j)及(k)2或3次引起pH在pH最终_碱之0.05至0.10pH单位内。在一些实施例中，方法包含再一次重复步骤(j)及(k)以达到pH最终_碱。在一些实施例中，方法包含总共不超过3或4次添加碱性滴定剂。在一些实施例中，pH酸_最终介于约3.0与4.0之间、介于约3.1与3.9之间、介于约3.2与3.8之间、介于约3.3与3.7之间、介于约3.4与3.7之间或介于约3.5与3.7之间。在一些实施例中，pH最终_碱介于约5.3与8.5之间、介于约5.1与8.1之间、介于约5.5-8.0之间或介于约7.0与8.5之间。
本公开提供配置成用于本发明的方法的设备。
本公开提供用于在蛋白质纯化中控制pH的设备。在一些实施例中，设备可包括反应器及pH流通槽，其包含安置于其中之pH探针，该pH流通槽流体联通至反应器。pH流通槽可接收来自反应器的取样滑流且含有安置于其中之pH探针，该pH探针测量滑流之pH。该设备包括流体联通至反应器之酸滴定剂供应装置。酸滴定剂供应装置向反应器提供酸滴定剂，以降低反应器中之pH。该设备进一步包括流体联通至反应器之碱滴定剂供应装置。碱滴定剂供应装置向反应器提供碱滴定剂，以增加反应器中之pH。在一些实施例中，该设备可进一步包括取样棒，其将滑流自反应器递送至pH流通槽。在一些实施例中，该设备可包括接收来自pH流通槽的流出物之废物接收器。
附图说明
图1为显示使用5种不同蛋白质生成之11条滴定曲线的图。pH经由添加酸溶液来降低以达到3.6之目标pH。pH在Y轴中展示，而X轴指示以每公斤洗脱剂之泵旋转数为单位的所添加之酸滴定剂之量(rot/kg)。向泵速度数据施加时间迁移(偏移)以考虑在酸添加与pH响应之间的延迟。
图2是显示使用等式1(Y轴)及等式2(X轴)对X轴及Y轴进行线性变换后图1滴定曲线之图。
图3是显示本公开一实施例中pH建模之应用的图。
图4为显示使用7种不同蛋白质生成之12条滴定曲线的图。pH经由添加碱溶液来提高以达到7.5与8.0之间的目标pH，视蛋白质而定。pH在Y轴中展示，而X轴指示以每公斤洗脱剂之泵旋转数为单位的所添加之酸滴定剂之量(rot/kg)。向泵速度数据施加时间迁移(偏移)以考虑在酸添加与pH响应之间的延迟。
图5是显示使用等式5(Y轴)及等式6(X轴)对X轴及Y轴进行线性变换后图4滴定曲线之图。
图6是显示使用等式7(Y轴)及等式8(X轴)对X轴及Y轴进行线性变换后图4滴定曲线之图。
图7是显示藉由(通过)用于收集各滴定曲线之数据之pH探针的初始在线测量与离线(脱机)测量之间的差值进行颜色编码的图6归一化滴定曲线的图。与模型(黑线)偏差最大之曲线，在初始在线测量与离线测量上亦具有最大差异。
图8是显示使用等式9校正在线pH之后图6归一化滴定曲线的图。
图9是显示经过2个固定pH值(pH 3.70及pH 7.60)之强制收敛且使用等式10对X轴进行线性变换后图4滴定曲度的图。使用等式9校正在线pH值(Y轴)。
图10是显示经过2个固定pH值(pH 3.70及pH 7.60)之强制收敛且使用等式10对X轴进行线性变换后图4滴定曲度的图。使用等式9校正在线pH值(Y轴)。与数据拟合的6度多项式显示为实线。。
图11为在改变样品pH的同时控制pH之示例性***的部件列表。
图12是显示用于病毒失活之后降低蛋白质样品之pH的示例性控制策略之流程图。VI：病毒失活。
图13是显示用于病毒失活之后提高蛋白质样品之pH的示例性对照策略之流程图。VIP：病毒失活池(添加碱之后的样品)。
图14显示用于本公开之示例性方法中之pH计的示例性校准曲线。
图15是显示使用本公开之一实施例的设备及方法，降低及提高pH之五个测试操作之结果的表。
图16是显示滑流与离线pH之差异(ΔpH)(顶图)及给料误差给药(底图)的一对图。用于计算ΔpH及给料误差％之式展示于图15中。
图17是使用本公开之一实施例的设备及方法在病毒失活测试操作中比较pH探针条件的图。
图18显示样品病毒失活过程之实时过程监测。
图19是根据一实施例之用于pH控制的设备的方块图。
图20是根据一实施例之用于pH控制的设备的示意图。
图21是显示使用酸或碱3(圆形)次或4(十字形)次添加进行pH调整之后18批次蛋白质之实际pH(由离线参考探针测量)与目标pH之间的差值的图。在左侧x轴上，显示在为使病毒失活将pH降低至3.50与3.60(视蛋白质而定)之间的pH之后测量之pH与目标pH之间的差值。在右侧x轴上，显示在将pH提高至5.50与8.00之间(视蛋白质而定)后实际pH与目标pH之间的差值。短划线指示在添加之后最终pH之目标，其在目标pH之0.10pH单位内。
图22是显示使用酸或碱3次(圆形)或4次(十字形)添加进行pH调整之后18批次蛋白质之由在线控制探针测量之pH与目标pH之间的差值的图。在左侧x轴上，显示在为使病毒失活将pH降低至3.6之pH之后测量之pH与目标pH之间的差值。在右侧x轴上，显示在将pH提高至pH 7.7至8.0(视蛋白质而定)后实际pH与目标pH之间的差值。短划线指示在添加之后最终pH之目标，其在目标pH之0.05pH单位内。
图23是显示针对18批次蛋白质在各添加步骤处藉由离线参考探针测量之pH与安装于流通槽中之在线控制探针测量之pH的差异(ΔpH)的图。
图24是显示针对18批次蛋白质(总共添加133次)，各添加步骤之额外体积误差百分比(有时称为给料误差)的图。用于额外体积误差百分比之式展示于图15中。
具体实施方式
本公开是关于在涉及改变样品pH之过程期间控制pH的方法。涉及pH改变之过程的一个实例为诸如抗体或其他治疗性蛋白质之生物制剂的大规模制备。许多治疗性蛋白质之制备涉及培养表达治疗性蛋白质之细胞，接着从培养细胞及/或细胞培养基纯化蛋白质。在细胞培养期间控制细胞培养基之pH及在蛋白质纯化期间控制样品之pH对治疗性蛋白质生产而言均很重要。大多数哺乳动物细胞具有支持最佳细胞生长、代谢及蛋白质产生的特定pH范围。此外，用于制备治疗性蛋白质之细胞可能携带病毒，若病毒污染原料药或药品，则可能有害。一种使潜在有害病毒失活的方法是藉由在纯化治疗性蛋白质期间短暂降低pH值。许多病毒在约5.0至5.5之pH下发生不可逆变性且有效破坏。若干包膜病毒在约3.5至4.0之pH范围下有效失活。然而，降低蛋白质样品之pH有过大的使治疗性蛋白质变性之风险，此可能导致一批蛋白质被破坏及增加制备成本。因此，在制备治疗性蛋白质期间，在细胞培养期间与蛋白质纯化期间，存在测量及控制pH之需求。
在蛋白质纯化期间测量pH之惯常方法不可靠，且导致蛋白质产品之浪费。在一种方法中，在蛋白质纯化期间藉由将无菌pH探针直接***含有蛋白质溶液之反应容器中来测量pH。然而，使用此方法可能难以维持无菌性及探针准确性。pH探针通常经校准，密封在具有用于将探针***反应容器之波纹管连接器的袋中，且经由高压釜或γ照射灭菌。然而，此会导致校准与pH探针干燥时进行使用之间有一段时间，此会影响探针准确性。此外，pH探针由玻璃制成，且在***容器时可能破裂。在维持无菌性的同时***探针，可能存在困难。在间接测量蛋白质溶液之pH的另一种方法中，从主要蛋白质溶液取出“滑流”，且使用pH探针测量滑流之pH。然而，在不直接测量主要蛋白质溶液池的情况下，无法对滴定进行直接反馈控制来调整pH。此外，任何自主要池吸取滑流以测量pH的蛋白质均不会回到主要池，且最终浪费。虽然统计滴定模型可用于预测在制备过程期间对蛋白质溶液进行pH调整时添加之酸或碱之量，但此等模型需要用户手动输入蛋白质浓度，且各滴定类型(酸或碱)均需要大型历史数据集来生成模型。此外，此等模型对于蛋白质之所有过程及类型并不普遍准确。
因此，需要在蛋白质制备中测量及控制pH之额外方法，其不需要将pH探针直接***蛋白质溶液池中，或连续自蛋白质池吸取材料滑流。本公开提供用于在蛋白质制备期间建模及控制pH的方法及***。本公开的方法在广泛蛋白质上是准确的，不需要操作员输入或离线浓度测量，且不需要大量历史数据。本公开的方法亦可用于推断制备过程期间调整pH所需之酸或碱之量。此外，本文所揭示的方法及***能够在改变样品pH之过程期间可再现且准确地达成在所需目标pH之0.05至0.10pH单位内之pH值。滴定剂仅添加3至4次即可准确且可靠地达成最终目标pH，例如用于蛋白质样品之病毒失活之目标酸性pH，或在失活后之目标碱性pH。此外，本文所揭示的方法及***亦能够准确地确定及添加待添加至样品中之酸或碱滴定剂之量，且可以每次滴定剂添加10％体积误差或更少误差之准确性添加所需体积之滴定剂。
本公开提供以下方法，其包含测量蛋白质池之初始pH，添加保守量之滴定剂，诸如酸性或碱性溶液，测量中间pH，任选地，添加第二量之滴定剂且重复pH测量，及基于初始测量及模型确定达到目标pH所需之滴定剂的额外量，该模型基于参考样品将pH与归一化之滴定剂量相关联。本公开进一步提供用于进行本公开方法的设备。
因此，本公开提供方法，其包含：(a)测量样品之初始pH(pH初始)；(b)将至少第一量之滴定剂(滴定剂n)添加至该样品且测量至少第一额外pH值(pHn)，滴定剂n为添加至样品以达到pHn之滴定剂之量，其中pHn不同于pH初始；(c)应用模型来确定归一化之滴定剂n，其中该模型将添加至样品之归一化之滴定剂与样品之pH相关联；及(d)确定待添加至样品以达到最终pH(pH最终)之滴定剂的剩余量，pH最终藉由将全部量之滴定剂(滴定剂总)添加至样品而达到。
定义
如本文所用，术语“初始pH”是指在添加用于改变pH之滴定剂，亦即相对于样品初始pH为酸性或碱性之溶液之前样品的pH。
如本文所用，“最终pH”是指样品之所需pH。举例而言，样品可具有3.6之pH，但为适于特定目的，需要为7.5之pH，且本文中所用的方法用于经由控制添加碱性滴定剂将pH值由3.6改变为7.5。在此情况下，3.6为初始pH，且7.5为最终或目标pH。熟习此项技术者将了解，视样品、样品条件及应用而定，任何特定样品之初始及最终pH值可不同。本领域普通技术人员将了解，当进行改变pH的方法时，该方法可涵盖多个步骤，各步骤在达到样品之最终pH(或最终目标pH)之前具有相关联的目标pH。
如本文所用，“总滴定剂”(滴定剂总)是指添加至样品以将pH自初始pH改变为最终pH之滴定剂之量。
如本文所用，“pHn”是指添加一些量之滴定剂(将样品自先前pH(pHn-1)改变为pHn所需的)之后样品之pH。因此，将pH自例如初始pH改变为pHn所需的滴定剂之量在本文中称为滴定剂n。本领域普通技术人员将了解，测量之pH值及添加至样品中以改变样品pH至此等测量之pH值之滴定剂的对应量可为迭代的。亦即，另一量的滴定剂可添加至pHn之样品中，以将样品pH改变为pHn+1，且添加至样品以将pH自初始pH改变为pHn+1之滴定剂之量称为滴定剂n+1。类似地，将一定量之滴定剂添加至pHn+1之样品，以将样品pH改变至pHn+2，及其类似方式，直至达到目标pH。
术语“样品”是指进行本文所述的方法以改变其pH之样品。在一些情况下，样品包含蛋白质，例如液体溶液中之纯化或部分纯化蛋白质。然而，其他类型之样品考虑在本公开之范畴内，且包括DNA、RNA及药物。本领域普通技术人员将了解，如本文所用，样品是指液体溶液，例如包含复数个生物分子(DNA、RNA或蛋白质)或分析物(化合物、药物及其类似物)之液体溶液。样品可在任何适合浓度或初始pH下，且包括任何适合之缓冲剂或载剂。
术语“参考样品”是指具有与样品相似或相同性质之参考样品，其经受与样品之pH变化类似之变化，且已自其中收集有关pH及滴定剂添加数据及两者间之关系。参考样品可与样品相同，例如，自较大样品中取得之参考样品(亦即，子样品作为参考样品)。然而，若在添加滴定剂时行为与样品相似，则参考样品无需与样品相同。举例而言，样品及参考样品可为由相同或相似过程生产及纯化之相同蛋白质的不同批次。作为另一实例，样品及参考样品可为相似但不相同之蛋白质，诸如两种抗体，或具有相似糖基化模式之两种蛋白质，其在进行相似滴定过程时行为相似。
如本文所用，术语“滴定曲线”是指将作为自变量的添加至样品之滴定剂体积与作为因变量之溶液pH相关联的图形(或一系列测量(值))。滴定曲线可藉由连续测量，例如藉由直接将pH探针***样品中且取得连续测量来生成。或者，可从不连续测量来生成滴定曲线，接着将适当曲线拟合至所测量数据点。
如本文所用，“归一化”是指将在不同尺度上测量之值调整至共同尺度。
如本文所用，“滴定剂”是指具有已知pH且较佳地已知浓度之溶液，其添加(滴定)至另一溶液以改变该溶液之pH。
“酸滴定剂”是指具有比样品更酸性之pH之滴定剂。一般而言，酸滴定剂之pH将小于7.0。常用酸滴定剂包括磷酸(H3PO4)、甘胺酸盐酸盐(C2H6ClNO2或甘胺酸HCl)、乙酸(CH3COOH)、盐酸(HCl)、过氯酸(HClO4)及硫酸(H2SO4)。酸滴定剂溶液可藉由稀释市售浓缩储备溶液来制备，且藉由针对标准弱碱进行标准化来确定浓度。示例性酸滴定剂包括浓度在0.20M至2.0M之间、0.25M至1.5M之间或0.5M至1.0M之间的磷酸。举例而言，浓度为0.10M、0.20M、0.25M、0.30M、0.35M、0.40M、0.45M、0.50M、0.60M、0.70M、0.80M、0.90M、1.0M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M或2.0M的磷酸可用作酸滴定剂。其他示例性酸滴定剂包括浓度在0.1M与1.0M之间、0.2M与0.75M之间、0.25M与0.75M之间或0.25M与0.5M之间的甘胺酸HCl。举例而言，浓度为0.10M、0.20M、0.25M、0.30M、0.35M、0.40M、0.45M、0.50M、0.60M、0.70M、0.80M、0.90M或1.0M的甘胺酸HCl为酸滴定剂。其他示例性酸滴定剂包括浓度在0.5M至3.0M、1.0M至2.5M、1.0M至2.0M或1.5M至2.0M之间的乙酸。举例而言，浓度为0.50M、0.60M、0.70M、0.80M、0.90M、1.0M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M、2.0M、2.1M、2.2M、2.3M、2.4M、2.5M、2.6M、2.7M、2.8M、2.9M或3.0M的乙酸为酸滴定剂。“碱滴定剂”或“碱性滴定剂”是指具有比样品更碱性之pH的滴定剂。常用碱滴定剂包括氢氧化钠(NaOH)，其可以不纯固体形式及以约50％w/v溶液形式市购。NaOH溶液可针对弱酸标准进行标准化以确定浓度。其他常用碱滴定剂包括缓血酸胺(亦称为三(羟甲基)胺基甲烷或tris碱，化学式为C4H11NO3)。示例性碱滴定剂包括浓度在0.5M至3.0M、1.0M至2.5M、1.0M至2.0M或1.5M至2.0M之间的缓血酸胺。举例而言，浓度为0.50M、0.60M、0.70M、0.80M、0.90M、1.0M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M、2.0M、2.1M、2.2M、2.3M、2.4M、2.5M、2.6M、2.7M、2.8M、2.9M或3.0M的缓血酸胺为碱滴定剂。
pH计测量基于水之溶液中的氢离子活性，指示其酸度或碱度，以pH表示。pH计测量pH电极与参考电极之间的电位差。pH“探针”是指含有pH电极及参考电极之计量器部分。通常，pH电极为玻璃电极，其为由对特定离子敏感之掺杂玻璃隔膜制成的一种类型离子选择性电极。示例性pH电极为对氢离子敏感之玻璃电极。相对于一些参考值(即参考电极)，玻璃电极之电压对氢离子活性之变化敏感。换言之，所测量溶液中之氢离子活性影响参考电极与氢离子敏感电极之间的电化学电位。校准pH计以使电化学电位与pH值相关联。
“pH计校准”是指针对一或多种已知pH之标准化缓冲液校准pH计的方法，因为已知pH电极自其校准设定偏离。典型校准方法使用由至少三种标准缓冲液生成之校准曲线，但亦可使用两点校准。示例性校准方案包含清洁电极，将经冲洗之电极浸泡在pH 4.0之第一标准中，随后浸泡在pH 7.0之第二标准及pH 10.0之最终标准中，在测量之间清洁电极。
如本文所用，“滑流(slipstream)”是指一种取样方法，其中例如使用***主样品中之管自主样品抽出或分离子样品(小样)，且对子样品进行测量。滑流可为连续的，亦即，不断自样品中抽出，或为不连续的，仅在过程中之离散时间点自样品中抽出。
如本文所用，“在线探针”或“在线pH探针”是指在pH改变(在线pH)期间测量样品pH之探针，以及结合本文所述之模型，使用其中信息确定在滴定剂添加步骤期间添加至样品之滴定剂之量。在线探针可为例如安装在耦接至滑流之流通槽中的滑流探针。或者，可将在线探针直接***反应器中。
如本文所用，“肽”、“多肽”及“蛋白质”通篇可互换使用且是指包含两个或更多个藉由肽键相互接合之氨基酸残基的分子。肽、多肽及蛋白质亦可包括修饰，诸如糖基化、脂质附接、硫酸化、麸胺酸残基之γ-羧化、烷基化、羟基化及ADP核糖基化。肽、多肽及蛋白质可具有科学或商业利益，包括基于蛋白质之药物(生物治疗剂)。肽、多肽及蛋白质尤其包括抗体及嵌合或融合蛋白。肽、多肽及蛋白质可由重组动物细胞株(诸如哺乳动物细胞株)使用细胞培养方法产生。
如本文所用，词组“病毒降低/失活”意欲指特定样品中之病毒粒子数目减少(“降低(reduction)”)，以及特定样品中病毒粒子之活性，例如但不限于感染力或复制能力减少(“失活”)。病毒粒子数目及/或活性之此类减少可大约为50％至约99％、甚至更佳约60％至约99％、更佳约70％至约99％、更佳约80％至99％、更佳约90％至约99％、更佳约95％至99％、更佳约95％至99.9％、更佳约95％至99.99％及更佳约98％至99.99％。在某些非限制性实施例中，纯化抗体产品中之病毒(若存在)之量小于病毒之ID50(将感染50百分比目标群体之病毒之量)，较佳比该病毒之ID50小至少10倍，更佳比该病毒之ID50小至少100倍，且更佳比该病毒之ID50小至少1000倍。
本文提及之所有公开案及专利均以全文引用的方式并入本文中，如同各个别公开案或专利具体地且独立地以引用的方式并入本文中。在有矛盾的情况下，可以本申请案(包括本文中之任何定义)为准。然而，本文所引用之任何参考文献、文章、公开案、专利、专利公开案及专利申请案之提及并非且不应视为承认或以任何形式表明其构成有效的先前技术或形成全球任何国家之公共常识之一部分。
改变样品pH
本公开提供改变样品pH的方法，其包含进行初始pH测量，将至少第一量之滴定剂添加至样品中，测量至少第一额外pH值，及应用模型，该模型将样品pH与归一化之添加至样品之滴定剂量相关联。在一些实施例中，方法进一步包含将第四量之滴定剂添加至样品，且测量第二pH，且应用模型。在一些实施例中，方法进一步包含添加第三、第四、另外量之滴定剂，在每次添加后测量pH，且应用模型。添加保守量之滴定剂及检查pH之额外步骤可用于验证样品行为如模型所预测，且在过程中不存在误差，例如由pH计校准引起之误差。在滴定剂添加一或多次及测量之后，此等测量及模型可用于确定待添加至样品以使样品pH变为最终或目标pH的滴定剂之量。
本公开的方法可使用相对较少次数之离散测量及模型确定添加至样品以改变pH之滴定剂之量来达成。当与藉由将pH探针***至样品中来测量pH的方法相比时，藉由使用该模型，所述方法可提高达到样品最终pH之准确性。所测量之pH值与模型之间的差值亦可用于鉴别过程中之误差，例如pH计校准或功能中之误差。
在一些实施例中，藉由添加多个量之滴定剂改变样品pH。在一些实施例中，藉由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次添加滴定剂来改变样品pH以达到最终pH。在一些实施例中，藉由2次添加滴定剂来改变样品pH以达到最终pH。在一些实施例中，藉由3次添加滴定剂来改变样品pH以达到最终pH。在一些实施例中，藉由4次添加滴定剂来改变样品pH以达到最终pH。在一些实施例中，藉由5次添加滴定剂来改变样品pH以达到最终pH。在一些实施例中，样品pH改变成在最终pH之0.01至0.20、0.01至0.15、0.01至0.10、0.05至0.20、0.05至0.15、0.05至0.10、0.01至0.07或0.05至0.07pH单位内的pH值，接着最终添加滴定剂以达到最终pH。在一些实施例中，样品pH改变成最终pH之0.05至0.10pH单位的pH值，接着最终添加滴定剂以达到最终pH。举例而言，藉由1、2、3、4或5次添加滴定剂，可将样品pH改变成在最终pH之0.05至0.10pH单位内的目标pH，接着最终添加滴定剂以达到最终pH。在一些实施例中，例如样品pH降低之那些实施例，滴定剂为酸。在替代实施例中，例如样品pH提高之那些实施例，滴定剂为碱。在本文所述之添加步骤中之任一步骤由本文所述之模型预测之目标pH与所测量之pH的不匹配可指示用于进行测量之pH计具有校准误差。举例而言，若给定添加步骤之预测与测量之pH值的差值大于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20或更大pH单位，则其指示用于测量样品之pH计正给出错误读数。作为另一实例，若给定添加步骤之预测与测量之pH值的差值大于0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或0.10pH单位，则其指示用于测量样品之pH计正给出错误读数。在一些实施例中，方法包含当预测之pH值与所测量之pH值之间出现差值时，停止改变样品pH之过程，直至重新校准pH计或替换pH探针为止。
本公开的方法可在需要改变样品pH之任何时间使用。举例而言，若诸如蛋白质纯化过程产生包含目标蛋白(有时称作蛋白质池)之液体样品，该液体样品的pH不适合下游纯化步骤或应用，则本文所述的方法可用于将样品pH改变至所需pH。作为另一实例，本公开的方法可用于将蛋白质样品之pH降低至足够低以使可能污染蛋白质样品之病毒失活的pH，且接着将pH升高至中性pH以用于进一步蛋白质纯化及分析过程。
在一些实施例中，样品包含所关注之蛋白质(目标蛋白)，例如治疗性蛋白质，且方法用于使包含治疗性蛋白质之样品中的病毒失活。
pH病毒失活的方法包括(但不限于)在低pH下培育(孵育)混合物一段时间，且随后中和pH且藉由过滤移除微粒。在一些实施例中，样品pH降低至约2与5之间的pH，较佳在约3与4之间的pH下，且更佳在约3.6之pH下，且样品在此pH下培育以使任何存在之病毒失活。样品混合物之pH可藉由任何适合之酸降低，包括(但不限于)磷酸、甘胺酸盐酸盐、过氯酸、盐酸、柠檬酸、乙酸、辛酸或其他适合之酸。pH水平之选择主要视样品中蛋白质之稳定性概况及缓冲液组分而定。
在使样品中之病毒失活的示例性方法中，添加保守初始量之酸滴定剂，评估pH，且接着添加额外保守量之酸滴定剂，接着再进行pH评估。此可在可耗费30分钟与2小时之间的过程中使用少量酸重复进行，直至达成目标pH为止。样品保持在目标pH下足以使病毒失活之时段，且样品pH藉由上述之相同过程升高。
在一些实施例中，使病毒失活之低pH培育时段之持续时间将为0.5小时至2小时，或0.5小时至1.5小时，或0.5小时至1小时。在一些实施例中，低pH培育为约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟、约70分钟、约80分钟或约90分钟。因此，视所关注之蛋白质而定，本领域普通技术人员将能够选择适当蛋白质浓度、pH及持续时间来达成病毒失活。
在一些实施例中，改变包含所关注之蛋白质之样品的pH涉及降低样品pH。举例而言，样品之最终pH(pH最终)小于样品之初始pH(pH初始)，且滴定剂为酸。可使用任何适合之酸性溶液，只要滴定剂之pH小于样品之初始pH即可。
在一些实施例中，例如降低pH之那些实施例，样品之初始pH(pH初始)介于约4.0与4.7之间、介于约4.0与4.5之间、介于约4.0与4.3之间、介于约4.1与4.6之间、介于约4.1与4.5之间、介于约4.1与4.4之间、介于约4.1与4.3之间、介于约4.1与4.2之间、介于约4.2与4.5之间、介于约4.3与4.5之间、介于约4.1与4.4之间或介于约4.2与4.4之间。在一些实施例中，pH初始介于约4.0至4.5之间、介于约4.1与4.5之间、介于约4.2与4.5之间、介于约4.3与4.5之间、介于约4.1与4.4之间或介于约4.2与4.4之间。在一些实施例中，初始pH为约4.1。在一些实施例中，样品之最终pH(pH最终)介于约3.0与3.8之间、介于约2.0与3.7之间、介于约3.0与3.6之间、介于约3.0与3.5之间、介于约3.0与3.4之间、介于约3.0与3.3之间、介于约3.1与3.8之间、介于约3.3与3.8之间、介于约3.5与3.8之间、介于约3.2与3.8之间、介于约3.3与3.7之间、介于约3.4与4.0之间、介于约3.5与4.0,3.4与3.9之间、介于约3.4与3.8之间、介于约3.4与3.7之间、介于约3.4与3.6之间、介于约3.5与3.9之间、介于约3.5与3.8之间、介于约3.5与3.7之间或介于约3.5与3.6之间。在一些实施例中，pH最终介于约3.0与3.8之间、介于约3.1与3.8之间、介于约3.2与3.8之间、介于约3.3与3.7之间、介于约3.4与3.7之间或介于约3.5与3.7之间。在一些实施例中，最终pH介于约3.5与3.7之间。在一些实施例中，最终pH为约3.6。
在一些实施例中，改变包含所关注之蛋白质之样品的pH涉及升高样品pH。举例而言，样品之最终pH(pH最终)大于样品之初始pH(pH初始)，且滴定剂为碱。可使用任何适合之碱性溶液，只要滴定剂之pH大于样品之初始pH即可。
在一些实施例中，例如升高pH之那些实施例，样品之初始pH(pH初始)介于约3.0与3.8之间、介于约2.0与3.7之间、介于约3.0与3.6之间、介于约3.0与3.5之间、介于约3.0与3.4之间、介于约3.0与3.3之间、介于约3.1与3.8之间、介于约3.3与3.8之间、介于约3.5与3.8之间、介于约3.2与3.8之间、介于约3.3与3.7之间、介于约3.4与4.0之间、介于约3.5与4.0,3.4与3.9之间、介于约3.4与3.8之间、介于约3.4与3.7之间、介于约3.4与3.6之间、介于约3.5与3.9之间、介于约3.5与3.8之间、介于约3.5与3.7之间或介于约3.5与3.6之间。在一些实施例中，pH最终介于约3.0与3.8之间、介于约3.1与3.8之间、介于约3.2与3.8之间、介于约3.3与3.7之间、介于约3.4与3.7之间或介于约3.5与3.7之间。在一些实施例中，pH初始介于约3.0与3.8之间、介于约3.1与3.8之间、介于约3.2与3.8之间、介于约3.3与3.7之间、介于约3.4与3.7之间或介于约3.5与3.7之间。在一些实施例中，初始pH介于约3.1与3.8之间。在一些实施例中，初始pH介于约3.3与3.8之间。在一些实施例中，初始pH介于约3.5与3.7之间。在一些实施例中，初始pH为约3.6。在一些实施例中，最终pH(pH最终)介于5.1与8.5之间、介于约5.1与8.3之间、介于约5.1与8.1之间、介于约5.1与8.0之间、介于约5.1与7.7之间、介于约5.1与7.5之间、介于约5.1与7.3之间、介于约5.1与7.0之间、介于约5.3与8.5之间、介于约5.3与8.3之间、介于约5.3与8.1之间、介于约5.3与8.0之间、介于约5.3与7.7之间、介于约5.3与7.5之间、介于约5.3与7.3之间、介于约5.3与7.0之间、介于约5.5与8.5之间、介于约5.5与8.3之间、介于约5.5与8.1之间、介于约5.5与8.0之间、介于约5.5与7.7之间、介于约5.5与7.0之间、介于约6.0与8.5之间、介于约6.0与8.3之间、介于约6.0与8.0之间、介于约6.0与7.7之间、介于约6.0与7.0之间、介于约6.5与8.5之间、介于约6.5与8.3之间、介于约6.5与8.0之间、介于约6.5与7.7之间、介于约6.5与7.0之间、介于约7.0与8.5之间、介于约7.0与8.3之间、介于约7.5与8.0之间、介于约7.7与8.0之间、介于约7.7与8.5之间、介于约7.7与8.3之间、介于约7.9与8.2之间、介于约7.0与8.0之间、介于约7.0与7.9之间、介于约7.0与7.5之间、介于约6.8与7.8之间、介于约6.8与7.6之间或介于约6.8与7.4之间。在一些实施例中，pH最终介于约5.3与8.5之间、介于约5.1与8.1之间、介于约5.5与8.0之间或介于约7.5与8.0之间。在一些实施例中，最终pH介于约5.5与8.0之间。在一些实施例中，最终pH介于约7.0与8.0之间。
本公开提供使样品中之病毒失活的方法。在一些实施例中，方法包含提供包含所关注之蛋白质之样品，例如已经由柱层析法自经培养细胞纯化之样品，且降低pH。示例性样品可具有约4.1至4.5之初始pH，且最终pH为约3.5至3.7，任选地，约3.6。初始pH将视所关注之蛋白质、所用纯化方法及蛋白质纯化步骤之后样品之组成(例如洗脱缓冲液及其类似物)而定。在降低pH且保持一段时间以使病毒失活之后，pH随后升高至约7.5与8.5之间、或约7.5与8.0、或约7.6之最终碱性pH。最终碱性pH将视所关注之蛋白质以及缓冲液及其类似物之选择而定，缓冲液及其类似物之选择将视所需下游应用而定。
因此，本公开提供使样品中之病毒失活的方法。在一些实施例中，样品包含所关注之蛋白质。在一些实施例中，方法包含提供在4.0或更大，例如4.1、4.2、4.3、4.4或4.5之初始pH(pH初始)下的样品。在一些实施例中，方法包含在添加酸滴定剂之前测量初始pH。在一些实施例中，方法包含将第一量之酸滴定剂(滴定剂n_酸)添加至样品且测量第一额外酸pH值(pHn_酸)，滴定剂n_酸为添加至样品以达到pHn_酸之滴定剂之量，其中pHn_酸不同于pH初始。第一量之滴定剂通常为保守量之滴定剂。例如，滴定剂之第一量为根据先前参考样品预测的滴定剂量，其足以使样品pH变化不超过达到目标pH之方式的一半，或不超过达到目标pH之方式的三分之二，或不超过达到目标pH之方式的四分之三。本领域普通技术人员应了解，每次添加时待添加至样品之酸滴定剂之量可视样品、样品之初始pH、最终目标pH以及添加至样品以改变样品pH之酸滴定剂之添加次数进行调整。在一些实施例中，方法包括将pH归一化且应用模型以确定归一化之滴定剂，亦即与初始pH及添加第一量之酸滴定剂之后的pH相对应之归一化之滴定剂量，其中模型将添加至样品之归一化之滴定剂与样品pH相关联。任选地，可重复添加一定量之滴定剂至少一次、两次、三次、四次、五次或更多次，以确认样品之行为与模型相对应。若样品不符合模型，或怀疑存在pH计校准误差，则本领域普通技术人员可减少添加之滴定剂之量，且增加添加滴定剂之次数，以在过程期间更准确地测量pH，且避免超过目标pH。在一些实施例中，方法包含基于归一化之滴定剂、pH及模型确定待添加至样品以达到介于3.4与3.7之间的最终酸pH(pH酸_最终)之滴定剂的剩余量。在一些实施例中，方法包含将剩余量之滴定剂添加至样品以达到pH酸_最终。
在一些实施例中，方法包含将样品保持在pH最终_酸下足以使病毒失活之时段，例如如上所述之培育时间。在一些实施例中，方法包含将第一量之碱性滴定剂(滴定剂n_碱)添加至样品且测量第一额外碱pH值(pHn_碱)，滴定剂n_碱为添加至样品以达到pHn_碱之滴定剂之量，其中pHn_碱不同于pH酸_最终。添加至样品之碱之量通常为保守量之滴定剂，亦即根据先前参考样品预测的滴定剂量，其足以使样品pH变化不超过达到目标碱性pH之方式的一半，或不超过达到目标碱性pH之方式的三分之二，或不超过达到目标碱性pH之方式的四分之三。本领域普通技术人员应了解，每次添加时添加至样品之碱滴定剂之量可视样品、样品之初始pH、最终目标pH以及添加至样品以改变样品pH之碱滴定剂之添加次数进行调整。在一些实施例中，方法包括藉由应用第二模型将滴定剂n_碱归一化。在一些实施例中，方法包含重复添加及测量步骤至少一次、两次、三次、四次、五次或更多次，以确认样品行为与模型相对应。若样品不符合模型，或怀疑存在pH计校准误差，则本领域普通技术人员可减少添加之滴定剂之量，且增加添加滴定剂之次数，以在过程期间更准确地测量pH，且避免超过目标pH。在一些实施例中，方法包含基于归一化之滴定剂、pH及模型确定待添加至样品以将样品pH改变成介于7.0与8.5之间的最终pH(pH最终_碱)之碱性滴定剂的剩余量。在一些实施例中，方法包含将剩余量之滴定剂添加至样品以达到pH最终_碱。
在一些实施例中，方法包含添加一或多个保守量之滴定剂，亦即预期将样品pH改变成目标pH不超过一半之滴定剂之量，测量pH，及应用模型以确定待添加至样品以达到目标或最终pH之pH的剩余量。在一些实施例中，确定待添加至样品中之滴定剂之最终量是藉由下式来确定：
在此式中，归一化之滴定剂总为添加至样品以实现最终pH的归一化之后的总量，归一化之滴定剂初始为添加至样品以实现初始pH的归一化之后的量(此值在归一化前可为0)，且归一化之滴定剂n为添加至样品以达到中间pHn的使用该模型归一化之滴定剂之量，其中pHn落在pH初始与pH最终之间。本领域普通技术人员应了解，在向样品中添加多个中间量之滴定剂且测量对应pH值之情况下，将根据上文所述之式重新计算待添加至样品以达到最终pH之滴定剂之剩余量。
在一些实施例中，方法包含将第一量之滴定剂(滴定剂n)添加至样品且测量至少第一额外pH值(pHn)，滴定剂n为添加至样品以达到pHn之滴定剂之量，其中pHn不同于初始pH(pH初始)；应用模型来确定归一化之滴定剂之初始量(滴定剂初始)及归一化之滴定剂n，其中该模型将添加至样品之归一化之滴定剂与样品pH相关联；及确定待添加至样品以达到目标pH(pHn+1)之滴定剂之另一额外量(滴定剂n+1)，pHn+1是藉由将另一额外量之滴定剂(滴定剂n+1)添加至样品而达到的pH。在一些实施例中，方法包含应用模型，且计算添加至样品以达到第二目标pH(pH n+2)之滴定剂之额外量(滴定剂n+2)。在一些实施例中，方法进一步包含将额外量之滴定剂(滴定剂n+2)添加至样品，藉此将样品pH改变成第二目标pH(pHn+2)。在一些实施例中，方法进一步包含应用模型，且计算添加至样品以达到第三目标pH(pHn+3)之滴定剂之额外量(滴定剂n+3)。在一些实施例中，方法包含添加滴定剂n+3，藉此将样品pH改变成pHn+3。在一些实施例中，方法进一步包含应用模型，且计算添加至样品以达到第四目标pH(pHn+4)之滴定剂之额外量(滴定剂n+4)。在一些实施例中，添加滴定剂n+1、滴定剂n+2、滴定剂n+3或滴定剂n+4产生在最终目标pH(pH最终)之0.05至0.10pH单位内的目标pH。在一些实施例中，将藉由应用模型确定之额外量之滴定剂添加至样品以达到最终目标pH。举例而言，pHn+2在最终目标pH之0.05至0.10pH单位内，其藉由添加滴定剂n+3来达到，其中针对滴定剂n+3添加之滴定剂之量藉由应用模型来确定。作为另一实例，pHn+3在最终目标pH之0.05至0.10pH单位内，其藉由添加滴定剂n+4来达到，其中针对滴定剂n+4添加之滴定剂之量藉由应用模型来确定。本领域普通技术人员应了解，视所需pH变化之程度以及样品及滴定剂之性质而定，比上文所述之滴定剂添加多或少之滴定剂添加可用于达到最终目标pH。在一些实施例中，藉由添加1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次滴定剂添加达到最终pH，其中在每次添加之后测量pH，且应用模型以确定待添加以达到额外目标pH及任选地所需最终pH之滴定剂之量。在一些实施例中，方法包含将本文所述之添加步骤中之任一步骤的目标pH(例如pHn+1、pHn+2、pHn+3、pHn+4等)与模型针对该对应步骤所预测之目标pH进行比较。
当进行本文所述之改变pH的方法时，可使用***自样品移出之子样品中的pH探针来测量样品之pH测量值。可经由滑流，例如将含有样品之反应容器连接至其中***pH探针之流通槽的滑流，自样品移出子样品。在一些实施例中，滑流为连续的。在一些实施例中，滑流为不连续或间歇的。在一些实施例中，样品pH不使用直接***样品中之pH探针测量。
pH计校准
本文所述的方法可用于确定pH计校准或功能中是否存在误差。当样品为蛋白质时，超出蛋白质可耐受之pH的pH变化可导致蛋白质变性，可能破坏样品。因此，与此项技术中已知之其他方法相比，快速且可靠地鉴别pH计校准误差之能力是本文所揭示的方法的优点。举例而言，若侦测到pH计校准中之误差，则pH计可经重新校准，换成新pH计，或可使用自第二pH计取得之测量值对自不准确pH计取得之测量值进行数学校正。在一些实施例中，方法包含重新校准pH计。在一些实施例中，方法包含更换pH计或pH探针。在一些实施例中，方法进一步包含：将额外量之滴定剂添加至样品且测量额外pH；应用模型且将归一化之滴定剂及pH或归一化之pH与模型进行比较；及当pH或归一化之pH与模型相对应时，将剩余量之滴定剂添加至样品以达到pH最终；从而防止添加过多滴定剂至样品对所关注之蛋白质造成损伤。
在一些实施例中，所测量之样品pH与模型之间的差值鉴别用于测量样品pH之pH计之校准中的误差。在一些实施例中，所测量之pH与由模型预测之pH的差值>0.01pH单位、>0.02pH单位、>0.03pH单位、>0.04pH单位、>0.05pH单位、>0.06pH单位、>0.07pH单位、>0.08pH单位、>0.09pH单位或>0.10pH单位指示与pH计有关之误差，诸如校准误差。在一些实施例中，>0.01pH单位之差值指示pH计误差。在一些实施例中，>0.05pH单位之差值指示pH计误差。在一些实施例中，>0.10pH单位之差值指示pH计误差。
在一些实施例中，方法进一步包含在测定样品之pH值或用于生成模型之至少一个参考样品的pH值时校正pH计校准。在一些实施例中，针对pH计校准进行校正包含：(a)在添加滴定剂之前移出样品或参考样品的第一部分，且用独立校准之pH计测量该第一部分之pH，藉此生成离线初始pH值(pH初始_离线)；(b)在添加全部量之滴定剂之后移出样品或参考样品之第二部分，且用独立校准之pH计测量该第二部分之pH，藉此生成离线最终pH值(pH最终_离线)；及(c)应用离线pH值与所测量之pH值之间的关系确定参考样品之校正pH。独立校准之pH计可为在另一轮校准之后的与用于进行初始测量之pH计相同的pH计。或者，独立校准之pH计可为不同pH计。
离线测量可用于根据下式计算经校正之pH，其中藉由下式确定样品(或参考样品)之经校正之pH：
此处，pH初始_离线为藉由离线pH计测量之样品之初始pH，pH最终_离线为藉由离线pH计测量之样品之最终pH，pH初始及pH最终为藉由在线pH计(具有校准误差之计量器)测量之初始pH值及最终pH值，且pHn为来自未校正pH计之未校正之pH测量值。若经校正之pH计用于测量参考样品，则经校正之pH与未校正之pH之间保持如针对样品所描述的相同关系。
模型
本公开提供用于本公开方法之模型以及生成此等模型的方法。
在一些实施例中，生成模型包含无因次化，例如参考滴定曲线之滴定剂值之无因次化。无因次化为藉由取代合适变量而自涉及物理量之等式部分或完全移除物理尺寸。举例而言，添加至样品之滴定剂之体积可藉由泵之旋转数/公斤，或每公斤总样品添加之滴定剂毫升数确定，且此等尺寸可藉由无因次化技术移除。无因次化可简化及参数化涉及测量单位之问题。在一些情况下，当无因次化用以将多个数据集转换成共同尺度时，尺度化可与无因次化互换。
在一些实施例中，生成模型包含回归分析。回归分析为用于估计因变量(通常称为『响应』变量)与更多自变量(在此情况下为pH与归一化之滴定剂)之间的关系的一组统计过程。回归分析之一种常见形式为线性回归，其中本领域普通技术人员根据特定数学准则发现最紧密拟合数据之线。举例而言，普通最小平方法计算最小化真实数据与该线之间的差值平方和之独特线。
在一些实施例中，拟合模型包含线性回归。线性回归为用于将纯量反应变量与一或多个解释变量之间的关系模型化的线性方法。一种解释变量之情况称为简单线性回归。在线性回归中，使用线性预测函数将关系模型化，所述线性预测函数之未知模型参数是自数据估计的。此类模型称为线性模型。
线性回归为第一类型回归分析，其被严格研究且广泛用于实际应用中。此是因为线性依赖于其未知参数之模型比与其参数非线性相关联之模型更易于拟合，且因为所得估计值之统计属性更容易确定。
在一些实施例中，回归分析包含多项式回归。多项式回归为回归分析之一种形式，其中独立变量(例如，归一化之滴定剂)与依变量(例如，pH)之间的关系被模型化为第n次多项式。多项式回归拟合独立变量之值与依变量之对应条件均值之间的非线性关系。尽管多项式回归将非线性模型与数据拟合，但作为统计估计问题，其是线性的，意义在于回归函数在自数据估计之未知参数中为线性的。出于此原因，多项式回归被视为一种类型多元线性回归。
可使用最小平方法拟合多项式回归模型。在高斯-马尔可夫定理(Gauss-Markovtheorem)之条件下，最小平方法将是数之无偏估计值的变异数降至最低。
在一些实施例中，拟合模型包含曲线拟合。曲线拟合为建构曲线或数学函数之过程，其与一系列数据点最佳拟合。曲线拟合可涉及内插，其中需要与数据准确拟合，或平滑化，其中建构大致拟合数据之“平滑”函数。曲线可外推，亦即延伸超出所观测数据之范围，但外推曲线具有一定程度不确定性。
拟合模型可使用此项技术中已知之任何适合程序进行，例如Microsoft excel、MATLAB或R。
在一些实施例中，自由一或多个参考样品生成之一或多个滴定曲线确定模型。参考样品可与样品一致，例如经历一致pH过程之较大样品之子样品。或者，参考样品可类似于样品。此类参考样品之实例包括与所关注之蛋白质一致之先前纯化批次之蛋白质，其使用类似或相同方法纯化，且经受实质上相同之pH过程。作为又一替代方案，参考蛋白质可为与所关注之蛋白质类似但不一致的蛋白质，例如两种抗体或两种Fc受体融合蛋白，只要两种蛋白质在经历类似pH变化方案时行为类似即可。归因于本文所述之无因次化及模型化方法，所有参考样品及样品之初始及最终pH值无需完全一致。举例而言，一或多个参考样品及样品之初始及/或最终pH值可相差约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5pH单位。或者，一或多个参考样品及样品之初始及/或最终pH值可一致。
因此，本公开提供用以生成本文所用之模型之一或多个参考样品。本公开提供滴定曲线，其藉由改变参考样品之pH且将参考样品pH与添加至参考样品之滴定剂之量相关联而生成。本领域普通技术人员已知生成及绘制滴定曲线的方法。
在一些实施例中，方法包含：(i)自至少一个参考样品生成至少一个参考滴定曲线，将添加至参考样品之滴定剂之量与参考样品之pH相关联；(ii)将该至少一个参考滴定曲线归一化；及(iii)生成模型以拟合至少一个参考滴定曲线。在一些实施例中，生成至少一个参考滴定曲线包含测量参考样品之初始pH(pH初始_参考)。此后将足以改变参考样品之pH之量的滴定剂添加至参考样品(滴定剂n_参考)，且在添加此滴定剂(pHn_参考)之后测量额外参考pH值。可重复此等步骤直至达到最终pH，且使用此项技术中已知之任何合适程序绘制滴定剂之量相对于参考样品之pH之图。当生成参考滴定曲线时，可使用添加滴定剂之任何合适方法。可在离散步骤中添加滴定剂，例如藉由添加离散量之滴定剂，搅拌一定量之时间以将其混合至参考样品中(例如直至参考样品之pH稳定为止)，且进行pH测量。或者，可连续添加滴定剂，且可连续测量pH。当生成参考样品或样品之滴定曲线时，可使用测量pH之任何合适方法。举例而言，参考样品之pH可藉由直接***参考样品中之pH探针测量，或可藉由***自参考样品抽取之连续或离散取样之滑流中的pH探针测量。
在一些实施例中，添加至参考样品中之滴定剂之量是藉由下式来归一化：
在此式中，滴定剂1_参考为添加至该参考样品以达到第一pH1_参考之滴定剂之量，且滴定剂2_参考为添加至该参考样品以达到pH2_参考之滴定剂之量。
在一些实施例中，例如当单个参考样品及对应滴定曲线用于生成模型时，pH1_参考可与参考样品之初始pH相同，且pH2_参考可与参考样品之最终pH相同。
在替代实施例中，复数个参考样品及对应滴定曲线用于生成模型。当复数个滴定曲线不具有相同初始及/或最终pH值时，pH1_参考不与参考样品之初始pH值中之一些或全部相同，且pH2_参考不与参考样品之最终pH值中之一些或全部相同。各参考滴定曲线包含pH初始_参考及pH最终_参考，且pH1_参考为来自复数个参考滴定曲线中之一者的pH初始_参考，pH2_参考为来自复数个参考滴定曲线中之一者的pH最终_参考，且pH1_参考及pH2_参考经选择以涵盖值之最大差值，同时仍涵盖复数个参考滴定曲线中之所有曲线覆盖的pH值。因此，pH1_参考及pH2尽可能相隔得远，但与pH初始及pH最终偏移一定程度。举例而言，在参考滴定曲线包含升高pH的情况下，pH1_参考可为具有最高初始pH之参考滴定曲线之pH初始_参考，且pH2_参考为具有最低最终pH之参考滴定曲线之pH最终_参考。本领域普通技术人员将了解，当参考滴定曲线包含降低pH时，将保持相反关系。
在一些实施例中，样品之初始pH(pH初始)及pH1_参考约相同。
举例而言，若pH值彼此在约0.05单位内，则pH值可视为约相同。或者，彼此在10％、5％或3％内之pH值可视为约相同。
在一些实施例中，样品之初始pH(pH初始)与pH1_参考不相同，亦即pH初始与pH1_参考之间的差值为约0.05至1.5，为约0.05至1、约0.1至1、约0.1至0.5或约0.1至0.3pH单位。在一些实施例中，pH初始与pH1_参考之间的差值为约0.1至0.5pH单位。
在一些实施例中，样品之最终pH(pH最终)及pH2_参考约相同。
在一些实施例中，pH最终与pH2_参考不相同，亦即pH最终与pH2_参考之间的差值为约0.5至1.5，为约0.05至1、约0.1至1、约0.1至0.5或约0.1至0.3pH单位。在一些实施例中，pH最终与pH2_参考之间的差值为约0.5至1.5pH单位。在一些实施例中，pH最终与pH2_参考之间的差值为约0.5至1.0pH单位。在一些实施例中，pH最终与pH2_参考之间的差值为约0.1至0.5pH单位。
在一些实施例中，pH初始、pH初始_参考及pH1_参考相同，且其中pH最终、pH最终_参考及pH2_参考相同。
本领域普通技术人员应了解pH1_参考及pH2_参考之选择取决于特定参考样品、对应参考滴定曲线及其中所含之相对于初始及最终pH值之变化量。
在一些实施例中，样品之最终pH(pH最终)小于样品之初始pH(pH初始)，且滴定剂为酸。在一些实施例中，样品及复数个参考样品包含所关注之蛋白质。在一些实施例中，pH1_参考为约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8或4.9，且pH2_参考为约3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.8或3.9。在一些实施例中，pH1_参考为约4.1，且pH2_参考为约3.6。在一些实施例中，样品及复数个参考样品之初始pH介于约4.1与4.5之间。在一些实施例中，样品及复数个参考样品之最终pH介于约3.5与3.7之间，任选地约3.6。在一些实施例中，添加至复数个参考样品之滴定剂之量经归一化为约-0.76至约1.49之尺度。在一些实施例中，自复数个参考样品生成模型包含拟合多项式。在一些实施例中，多项式包含下式之四阶多项式：
在一些实施例中，多项式包含：
归一化之滴定剂n＝283.35764-279.43987*pHn+104.25395*pHn 2-17.257125*pHn 3+1.0589067*pHn 4。 (等式19)
上述由模型生成之多项式可用于自所测量之pH值计算添加至样品之归一化之滴定剂。
在一些实施例中，其中样品之最终pH(pH最终)大于初始pH(pH初始)，且滴定剂为碱。在一些实施例中，样品及复数个参考样品包含所关注之蛋白质。在一些实施例中，pH1_参考介于约3.1与3.8之间。在一些实施例中，pH1_参考介于约3.4与4.1之间。在一些实施例中，pH1_参考为约3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.8或3.9。在一些实施例中，pH1_参考为约3.6。在一些实施例中，pH1_参考为约3.7。在一些实施例中，pH2_参考介于约7.5与8.5之间。在一些实施例中，pH2_参考为约6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0.、7.,1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3或8.4。在一些实施例中，pH2_参考为约7.6。在一些实施例中，pH初始介于约3.5与3.7之间。在一些实施例中，pH最终介于约5.1与8.5之间。在一些实施例中，pH最终介于约7.5与8.0之间。在一些实施例中，pH最终介于约7.5与8.0之间。在一些实施例中，pH最终介于约7.0与8.0之间、介于约7.1与7.9之间、介于约7.2与7.8之间、介于约7.3与7.7之间或介于约7.4与7.6之间。在一些实施例中，添加至参考样品之滴定剂之量经归一化至约-0.06至约1.53之尺度。在一些实施例中，自复数个参考样品生成模型包含拟合多项式。在一些实施例中，多项式包含下式之五阶多项式：
(等式20)
在一些实施例中，多项式包含：
归一化之滴定剂n＝12.256725-10.723277*pHn+3.3662386*pHn 2-0.4588175*pHn 3+0.0255417*pHn 4-0.0003153*pHn 5(等式21)
上述由模型生成之多项式可用于自所测量之pH值计算添加至样品之归一化之滴定剂。
上述之模型意欲为示例性且非限制性的。本领域普通技术人员应了解，视一或多个参考样品或样品之初始及最终pH值而定，藉由本文所述的方法自参考样品生成之其他模型(包括其他多项式)将适合用于本文所述的方法中。
所关注之蛋白质(目标蛋白)
本公开提供包含所关注之蛋白质之样品，其用于本文所述的方法中。所关注之蛋白质可为治疗性蛋白质，亦即向个体施用以用于治疗疾病或病症之蛋白质。示例性所关注之蛋白质包括(但不限于)抗体、受体Fc融合蛋白(诸如陷阱蛋白)、细胞介素、趋化介素、生长因子及其类似物。
在一些实施例中，所关注之蛋白质为抗原结合蛋白，诸如抗体。
词组“抗原结合蛋白”包括具有至少一个互补决定区(CDR)且能够选择性识别抗原，亦即能够以至少在微莫耳范围内之KD结合抗原的蛋白质。治疗性抗原结合蛋白(例如，治疗性抗体)常需要在奈莫耳或皮莫耳范围内之KD。通常，抗原结合蛋白包括两个或更多个CDR，例如2、3、4、5或6个CDR。抗原结合蛋白之实例包括抗体、抗体之抗原结合片段，诸如含有抗体之重链及轻链之可变区的多肽(例如，Fab片段、F(ab')2片段)，及含有抗体之重链及轻链之可变区且含有来自重链及/或轻链之恒定区的额外氨基酸(诸如一或多个恒定域，亦即CL、CH1、铰链、CH2及CH3域中之一或多者)的蛋白质。
“抗体”是指由四条多肽链、藉由二硫键互连之两条重(H)链及两条轻(L)链组成的免疫球蛋白分子。各重链具有重链可变区(HCVR或VH)及重链恒定区。重链恒定区含有三个域CH1、CH2及CH3。各轻链具有轻链可变区(VL)及轻链恒定区。轻链恒定区由一个域(CL)组成。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着较保守性区域，称为框架区(FR)。各VH及VL由三个CDR及四个FR构成，自胺基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。术语“抗体”包括任何同型或子类之糖基化与未糖基化免疫球蛋白。术语“抗体”包括藉由重组手段制备、表达、产生或分离之抗体分子，诸如自经核苷酸序列转染以表达抗体之宿主细胞中分离的抗体。术语“抗体”亦包括双特异性抗体，该双特异性抗体包括可结合于超过一种抗原决定基之异源四聚体免疫球蛋白。如本文所用，术语“抗体”亦包括完整抗体分子之抗原结合片段及包含抗体或抗原结合片段之融合蛋白。
术语抗体之“抗原结合部分”(或“抗体片段”)是指抗体之保留特异性结合于抗原之能力的一或多个片段。涵盖在术语抗体之“抗原结合部分”内之蛋白质结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段，其为由VL、VH、CL及CH1域组成之单价片段；(ii)F(ab')2片段，其为包含两个在铰链区由二硫桥键连接之Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH及CH1域组成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂之VL及VH域组成；(v)dAb片段(Ward等人,Nature(1989)241:544-546)，其由VH域组成；(vi)经分离之CDR；以及(vii)scFv，其由Fv片段之两个域VL及VH组成，该VL及VH藉由合成连接符接合以形成单个蛋白质链，其中VL与VH区配对形成单价分子。术语“抗体”下亦涵盖单链抗体之其他形式，诸如双功能抗体。参见例如Holliger等人,PNAS USA(1993)90:6444-6448；Poljak等人,Structure(1994)2:1121-1123。
再此外，抗体或其抗原结合部分可为较大免疫黏附分子之一部分，该免疫黏附分子藉由抗体或抗体部分与一或多种其他蛋白质或肽之共价或非共价缔合而形成。此类免疫黏附分子之非限制性实例包括使用链霉抗生物素蛋白核心区制成四聚scFv分子(Kipriyanov等人,Human Antibodies and Hybridomas(1995)6:93-101)及使用半胱胺酸残基、标记肽及C端聚组胺酸标签制成二价且生物素标记之scFv分子(Kipriyanov等人Mol.Immunol.(1994)31:1047-1058)。诸如Fab和F(ab')2片段之抗体部分可由全抗体，使用惯常技术，诸如对全抗体进行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化来制备。此外，抗体、抗体部分及免疫黏附分子可使用此项技术中通常已知之标准重组DNA技术(参见Sambrook等人,1989)获得。
术语“人类抗体”意欲包括具有来源于人类生殖是免疫球蛋白序列之可变及恒定区之抗体。本公开之人类抗体可包括例如CDR且尤其CDR3中不由人类生殖是免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，藉由活体外随机或位点特异性突变诱发或藉由活体内体细胞突变引入之突变)。
如本文所用，术语“重组人类抗体”意欲包括藉由重组手段制备、表达、产生或分离之所有人类抗体，诸如使用转染至宿主细胞中之重组表达载体表达之抗体；自重组组合人类抗体文库分离之抗体；自人类免疫球蛋白基因转殖基因之动物(例如小鼠)分离之抗体(参见例如Taylor等人Nucl.Acids Res.(1992)20:6287-6295)；或藉由涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他手段制备、表达、产生或分离之抗体。此类重组人类抗体具有来源于人类生殖是免疫球蛋白序列之可变及恒定区。然而，在某些实施例中，此类重组人类抗体可经受活体外突变诱发(或当使用人类Ig序列转殖基因之动物时，为活体内体细胞突变诱发)，且因此重组抗体之VH及VL区之氨基酸序列虽然来源于人类生殖是VH及VL序列且与其相关联，但所述氨基酸序列为可在活体内不天然存在于人类抗体生殖是库内之序列。
考虑额外治疗性蛋白质在本发明所揭示之细胞培养方法及治疗性蛋白质产生方法之范畴内。在某些实施例中，治疗性蛋白质为抗体、人类抗体、人类化抗体、嵌合抗体、单株抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双功能抗体、三功能抗体或四功能抗体、Fab片段或F(ab')2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。在某些实施例中，抗体为IgG1抗体、IgG2抗体、IgG4抗体、嵌合IgG2/IgG4抗体、嵌合IgG2/IgG1抗体或嵌合IgG2/IgG1/IgG4抗体。
在一些实施例中，抗体是选自由以下组成之群：抗计划性细胞死亡1抗体(例如，如美国专利申请公开案第US2015/0203579A1号中所描述之抗PD1抗体)、抗计划性细胞死亡配位体-1(例如，如美国专利申请公开案第US2015/0203580A1号中所描述之抗PD-L1抗体)、抗Dll4抗体、抗血管生成素-2抗体(例如，如美国专利第9,402,898号中所描述之抗ANG2抗体)、抗类血管生成素3抗体(例如，如美国专利第9,018,356号中所描述之抗AngPtl3抗体)、抗血小板衍生生长因子受体抗体(例如，如美国专利第9,265,827号中所描述之抗PDGFR抗体)、抗Erb3抗体、抗泌乳素受体抗体(例如，如美国专利第9,302,015号中所描述之抗PRLR抗体)、抗补体5抗体(例如，如美国专利申请公开案第US2015/0313194A1号中所描述之抗C5抗体)、抗TNF抗体、抗表皮生长因子受体抗体(例如，如美国专利第9,132,192号中所描述之抗EGFR抗体或如美国专利申请公开案第US2015/0259423A1号中所描述之抗EGFRvIII抗体)、抗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin-9抗体(例如，如美国专利第8,062,640号或美国专利申请公开案第US2014/0044730A1号中所描述之抗PCSK9抗体)、抗生长及分化因子-8抗体(例如抗GDF8抗体，亦称为抗肌肉抑制素抗体，如美国专利第8,871,209号或第9,260,515号中所描述)、抗升糖素受体(例如，如美国专利申请公开案第US2015/0337045A1号或第US2016/0075778A1号中所描述之抗GCGR抗体)、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、介白素4受体抗体(例如，如美国专利申请公开案第US2014/0271681A1号或美国专利第8,735,095号或第8,945,559号中所描述之抗IL4R抗体)、抗介白素6受体抗体(例如，如美国专利第7,582,298号、第8,043,617号或第9,173,880号中所描述之抗IL6R抗体)、抗IL1抗体、抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗体、抗介白素33(例如，如美国专利申请公开案第US2014/0271658A1号或第US2014/0271642A1号中所描述之抗IL33抗体)、抗呼吸道融合病毒抗体(例如，如美国专利申请公开案第US2014/0271653A1号中所描述之抗RSV抗体)、抗分化簇3(例如抗CD3抗体，如美国专利申请公开案第US2014/0088295A1号及第US20150266966A1号及美国申请案第62/222,605号中所描述)、抗分化簇20(例如，如美国专利申请公开案第US2014/0088295A1号及第US20150266966A1号及美国专利第7,879,984号中所描述之抗CD20抗体)、抗CD19抗体、抗CD28抗体、抗分化簇-48(例如，如美国专利第9,228,014号中所描述之抗CD48抗体)、抗Fel d1抗体(例如，如美国专利第9,079,948号中所描述)、抗中东呼吸道症候群病毒(例如，如美国专利申请公开案第US2015/0337029A1号中所描述之抗MERS抗体)、抗伊波拉病毒(Ebola virus)抗体(例如，如美国专利申请公开案第US2016/0215040号中所描述)、抗兹卡病毒(Zika virus)抗体、抗淋巴球活化基因3抗体(例如抗LAG3抗体或抗CD223抗体)、抗神经生长因子抗体(例如，如美国专利申请公开案第US2016/0017029号及美国专利第8,309,088号及第9,353,176号中所描述之抗NGF抗体)以及抗活化素A抗体。在一些实施例中，双特异性抗体是选自由以下组成之群：抗CD3×抗CD20双特异性抗体(如美国专利申请公开案第US2014/0088295A1号及第US20150266966A1号中所描述)、抗CD3×抗黏蛋白16双特异性抗体(例如抗CD3×抗Muc16双特异性抗体)及抗CD3×抗***特异性膜抗原双特异性抗体(例如抗CD3×抗PSMA双特异性抗体)。在一些实施例中，所关注之蛋白质是选自由以下组成之群：阿利库单抗(alirocumab)、赛瑞单抗(sarilumab)、法神单抗(fasinumab)、奈伐单抗(nesvacumab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、曲弗单抗(trevogrumab)、依凡纳单抗(evinacumab)及瑞努库单抗(rinucumab)。贯穿本公开提及之所有公开案以全文引用的方式并入本文中。
在其他实施例中，治疗性蛋白质为含有Fc部分及另一域之重组蛋白(例如，Fc融合蛋白)。在一些实施例中，Fc融合蛋白为受体Fc融合蛋白，其含有与Fc部分偶合之受体之一或多个胞外域。在一些实施例中，Fc部分包含铰链区，随后为IgG之CH2及CH3域。在一些实施例中，受体Fc融合蛋白含有结合于单一配位体或多个配位体之两条或更多条独特受体链。举例而言，Fc融合蛋白为陷阱蛋白，诸如例如IL-1阱(例如，利纳西普(rilonacept)，其含有与Il-1R1细胞外区融合之IL-1RAcP配位体结合区，该Il-1R1细胞外区与hIgG1之Fc融合；参见美国专利第6,927,004号，其以全文引用的方式并入本文中)、VEGF阱(例如，阿柏西普(aflibercept)或ziv-阿柏西普，其含有与VEGF受体Flk1之Ig域3融合之VEGF受体Flt1之Ig域2，该VEGF受体Flk1之Ig域3与hIgG1之Fc融合；参见美国专利第7,087,411号及第7,279,159号；或康柏西普(conbercept)，其含有与VEGF受体Flk1之Ig域3融合之VEGF受体Flt1之Ig域2，该VEGF受体Flk1之Ig域3与VEGF受体Flk1之Ig域4融合，该VEGF受体Flk1之Ig域4与hIgG1之Fc融合；参见美国专利第8,216,575号)或TNF阱(例如，依那西普(etanercept)，其含有与hIgG1之Fc融合的TNF受体；参见美国专利第5,610,279号)。在其他实施例中，Fc融合蛋白为ScFv-Fc融合蛋白，其含有一或多个抗原结合域中之一者或多者，诸如与Fc部分偶合之抗体的可变重链片段及可变轻链片段。
在一些实施例中，所关注之蛋白质为糖蛋白。具有天冬酰胺连接(N连接)之聚糖之醣蛋白普遍存在于真核细胞中。此等聚糖之生物合成及其向多肽之转移发生在内质网(ER)中。N-聚糖结构进一步藉由ER中之多种糖苷酶及糖基转移酶以及高基复合体(Golgicomplex)修饰。治疗性蛋白质之糖基化对于治疗性蛋白质之质量及有效性可为关键的。举例而言，抗体糖基化为常见转译后修饰，且可在抗体效应功能以及抗体稳定性中起作用。本领域普通技术人员将已知分析蛋白质样品中之糖基化模式及糖基化蛋白质百分比的方法。
蛋白质纯化
本领域普通技术人员将已知纯化由本文所述之细胞及细胞培养方法产生之所关注之蛋白质以产生所关注之蛋白质的方法。自细胞培养基或自细胞纯化所关注之蛋白质的方法包括层析及非层析方法。层析方法包含使包含抗体之溶液穿过固相(例如，二氧化硅树脂或珠粒、整体柱或纤维素膜)且视采用“结合与洗脱”还是“流过”层析法而定，使所关注之蛋白质结合或穿过。层析方法包括(但不限于)亲和力-标签结合、蛋白A结合、离子交换层析法(诸如阴离子交换层析法)、尺寸排阻层析法或免疫亲和层析法。纯化亦可经由使用基因融合之纯化标签(诸如聚组胺酸标签或FLAG标签)实现。
示例性蛋白质纯化方案包含获得包含所关注之蛋白质之澄清溶液，及进行不同纯化技术之组合，包括离子交换分离步骤及疏水相互作用分离步骤。分离步骤基于蛋白质之电荷、疏水性程度或尺寸分离蛋白质混合物。在本发明之一个方面中，使用包括阳离子、阴离子及疏水相互作用之层析法进行分离。此等步骤中之每一个可利用不同层析树脂，从而使得纯化方案针对所涉及之特定蛋白质进行精确修改。分离方法中之每一个的本质在于可引起蛋白质以不同速率沿着柱向下穿过，实现物理分离，该物理分离随着蛋白质进一步沿着柱向下而增加，或选择性地附着于分离介质，随后藉由不同溶剂有差异地洗脱。在一些情况下，当杂质特异性地附着于柱且蛋白质不附于柱时，亦即所关注之蛋白质存在于流过物中，所关注之蛋白质与杂质分开。
在一些实施例中，所关注之蛋白质之纯化涉及主要回收步骤。在一些实施例中，主要回收步骤涉及层析柱，诸如亲和柱。主要回收步骤之后亦可为使用本文所述的方法，例如藉由使洗脱液中所关注之蛋白质池经历本文所述之pH变化来使病毒失活的时刻。
在一些实施例中，自主要回收步骤回收之蛋白质样品经历额外纯化步骤，以进一步纯化所关注之蛋白质。举例而言，可使用亲和层析法。可使用之层析材料之非限制性实例包括：蛋白A、蛋白G、包含由所关注之抗体结合之抗原的层析材料或结合于所关注之蛋白质的抗体及包含Fc结合蛋白之层析材料。作为另一实例，疏水相互作用柱可用于移除杂质，诸如聚集物。
任何纯化步骤均可制备可经受本文所述的方法的样品。可在任何合适纯化步骤之后，在任何合适纯化步骤之后使用本文所述之pH控制过程使潜在病毒失活。另外，或包含所关注之蛋白质之溶液的pH可使用本文所述的方法改变，例如改变成下一纯化步骤或其他下游应用所需之pH。
细胞及细胞培养
本公开提供用于产生本文所述之所关注之蛋白质的细胞群体。合适细胞包括细菌细胞、酵母细胞及哺乳动物细胞。
在一些实施例中，细胞群体自能够产生所关注之蛋白质之细胞株分离或获得。用于产生治疗性蛋白质之细胞株之非限制性实例尤其包括初级细胞、BSC细胞、希拉细胞(HeLa cell)、HepG2细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、VERO细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、BHK-21细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、3T3细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞及鸡胚胎细胞。在一些实施例中，细胞群体包含CHO细胞。在一些实施例中，CHO细胞包含来自经优化以用于大规模产生蛋白质之若干特异性CHO细胞变异体中之一或多者的CHO细胞，例如CHO-K1、CHO-K1来源之(增强表达及稳定性区域)细胞(美国专利第7,771,997号)或美国专利第6,919,183号中所述之FASTR技术，该技术提供产生分泌蛋白之细胞的分离。
在一些实施例中，进行培养且表达所关注之蛋白质之细胞群体为藉由具有且表达编码所关注之治疗性蛋白质之聚核苷酸的细胞(亦即，先驱细胞)之纯是扩增获得的细胞群体。在一些实施例中，藉由自先驱细胞进行纯是扩增而获得或源自纯是扩增之细胞群体之构成细胞的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或约100％含有编码蛋白质之聚核苷酸且表达所关注之蛋白质。
在一些实施例中，进行培养且表达治疗性蛋白质之细胞群体藉由培养已冷冻且储存之细胞产生。哺乳动物细胞可冷冻且冷冻保存在例如含有二甲亚砜(DMSO)及细胞培养基之冷冻保存培养基中。在一示例性冷冻保存方案中，将哺乳动物细胞转移至冷冻保存培养基，且缓慢冷冻，随后储存在液氮下。举例而言，细胞可经扩增且冷冻保存以产生细胞库，其为由具有所需特征之单一细胞池产生的一组细胞。
本公开提供用于在纯化之前培养表达所关注之蛋白质之细胞的方法。
“细胞培养”或“培养”意谓在多细胞生物体或组织外的细胞生长及繁殖。适用于哺乳动物细胞之培养条件是此项技术中已知的。参见例如Animal cell culture:APractical Approach,D.Rickwood编辑,Oxford University Press,New York(1992)。哺乳动物细胞可在悬浮液中培养或同时与固体基板连接。具有或不具有微载体且以分批、分批进料、连续、半连续或灌注模式操作之流体化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶、摇瓶或搅拌槽生物反应器可用于哺乳动物细胞培养。
在一些实施例中，培养表达所关注之蛋白质之细胞群体包含扩增或生长期，其中细胞群体扩增至足以在生产阶段生产所需数量之所关注之蛋白质的尺寸。
在一些实施例中，培养表达所关注之蛋白质之细胞群体包含生产期，其中细胞群体在生产细胞培养基中在足以生产所关注之蛋白质之条件下培养。生产期可在任何培养规模下进行，自个别烧瓶及摇瓶或波袋(wave bag)，至一公升生物反应器，及至大规模工业生物反应器。大规模过程可在约100公升至20,000公升或更大的体积中进行。若干手段中之一或多者可用以控制蛋白质产生，诸如温度变化或化学诱导。生长期可在比生产期更高的温度下进行。举例而言，生长期可在约35℃至38℃之第一温度下进行，且生产期可在约29℃至37℃，任选地约30℃至36℃或约30℃至34℃之第二温度下进行。另外，蛋白质产生之化学诱导剂，诸如咖啡碱、丁酸酯、他莫昔芬(tamoxifen)、***、四环素、脱氧羟四环素(doxycycline)及六亚甲基双乙酰胺(HMBA)可在温度变化的同时、之前或之后添加。若在温度变化之后添加诱导剂，则可在温度变化之后的一小时至五天，诸如在温度变化之后的一天至两天添加所述诱导剂。生产细胞培养物可作为连续馈料培养***操作，如在恒化器中(参见C.Altamirano等人,Biotechnol Prog.2001年11月-12月；17(6):1032-41)，或根据分批进料过程(Huang,2010)。
如本文所用，术语“细胞培养基(cell culture media)”、“培养基(media)”、“细胞培养基(cell media)”、“细胞培养基(cell culture medium)”或“培养基(culturemedium)”是指用于细胞、例如动物或哺乳动物细胞生长的任何营养液，且一般提供至少一或多种来自以下之组分：能量来源(通常呈碳水化合物形式，诸如葡萄糖)；所有必需氨基酸中之一或多者，且一般为二十种基本氨基酸；通常需要低浓度之维生素及/或其他有机化合物；脂质或游离脂肪酸；及微量元素，例如通常需要极低浓度，通常在微莫耳范围内之无机化合物或天然存在之元素。在一些实施例中，藉由将大豆或其他植物蛋白水解产物与一或多种额外成分组合来形成细胞培养基。
如本文所用，“额外成分”包括细胞培养基组分中之任一者或多者，包括但不限于水；能量来源；所有必需氨基酸中之一或多者，且一般为二十种基本氨基酸；通常需要低浓度之维生素及/或其他有机化合物；脂质或游离脂肪酸、微量元素及多胺，诸如鸟胺酸及腐胺。举例而言，细胞培养基可藉由将大豆水解产物与基础细胞培养基组合且向培养基补充额外多胺来形成。
在一些实施例中，细胞培养基含有化学成分确定之基础培养基，诸如定制调配物或市售基础培养基。
市售培养基将为本领域普通技术人员所知，且尤其包括伊格尔MEME(Eagle'sMEME，最低必需培养基)(Eagle,Science,1955,112(3168):501-504)、Ham's F12(Ham,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,1965,53:288-293)、F-12K培养基、杜尔贝科氏培养基(Dulbecco's medium)、杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified EagleMedium)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1952年8月；38(8):747-752)、DMEM/Ham's F12 1:1、Trowell's T8、A2培养基(Holmes及Wolf,Biophys.Biochem.Cytol.,1961,10:389-401)、Waymouth培养基(Davidson及Waymouth,Biochem.J.,1945,39(2):188-199)、Williams E培养基(Williams等人,Exp.Cell Res.,1971,69:105及以下)、RPMI 1640(Moore等人,J.Amer.Med.Assoc.,1967,199:519-524)、MCDB 104/110培养基(Bettger等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,1981,78(9):5588-5592)、Ventrex HL-1培养基、白蛋白-球蛋白培养基(Orr等人,Appl.Microbiol.,1973,25(1):49-54)、RPM I-1640培养基、RPMI-1641培养基、伊斯科夫氏改良杜尔贝科氏培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、McCoy's5A培养基、Leibovitz's L-15培养基及无血清培养基，诸如EX-CELLTM300系列(JRHBiosciences,Lenexa,Kans.)、鱼精蛋白-锌-胰岛素培养基(Weiss等人,1974,美国专利第4,072,565号)、生物素-叶酸盐培养基(Cartaya,1978,US Re30,985)、运铁蛋白-脂肪酸培养基(Baker,1982,美国专利第4,560,655号)、运铁蛋白-EGF培养基(Hasegawa,1982,美国专利第4,615,977号；Chessebeuf,1984,美国专利第4,786,599号)及其他培养基置换(参见Inlow,美国专利第6,048,728号；Drapeau,美国专利第7,294,484号；Mather,美国专利第5,122,469号；Furukawa,美国专利第5,976,833号；Chen,美国专利第6,180,401号；Chen,美国专利第5,856,179号；Etcheverry,美国专利第5,705,364号；Etcheverry,美国专利第7,666,416号；Ryll,美国专利第6,528,286号；Singh,美国专利第6,924,124号；Luan,美国专利第7,429,491号；及其类似物)。
在一些实施例中，细胞培养基无血清。在一些实施例中，细胞培养基无血清且无水解产物
在一些实施例中，培养基在其适用浓度下(亦即，1×)含有至少40±6mM或至少55±10.5mM之氨基酸或氨基酸盐之混合物。在一个实施例中，培养基含有至少40mM之氨基酸混合物。在此或另一实施例中，培养基含有至少55mM之氨基酸混合物。在一个实施例中，氨基酸混合物(除麸酰胺酸之外，其可作为使用点添加物来加回至培养基)含有丙胺酸、精胺酸、天冬酰胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麸胺酸(谷氨酸)、甘胺酸、组胺酸、异白胺酸(异亮氨酸)、白胺酸(亮氨酸)、离胺酸(赖氨酸)、甲硫胺酸、***酸、脯胺酸、丝胺酸、苏胺酸、色胺酸、酪胺酸及缬胺酸。
在一些实施例中，培养基含有一或多种脂肪酸。在一个特定实施例中，培养基含有脂肪酸(或脂肪酸衍生物)与α生育酚之混合物。脂肪酸或脂肪酸衍生物是选自由以下组成之群：亚麻油酸、次亚麻油酸、硫辛酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、癸酸、十二酸、己酸、木质酸、肉豆蔻酸和辛酸。
在一些实施例中，培养基含有核苷混合物。在一个实施例中，培养基含有腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷及次黄嘌呤。
在一些实施例中，培养基含有盐混合物。盐包括二价阳离子，诸如钙及镁。在一个实施例中，培养基含有氯化钙及硫酸镁。其他盐可包括磷酸盐之盐。
视细胞培养过程而定，在细胞培养期间不同时间可使用不同细胞培养基。举例而言，当扩增来自冷冻等分试样之初始细胞群体以产生用于产生所关注之蛋白质之细胞群体时，可使用扩增细胞培养基。第二生产细胞培养基可用于培养经扩增之细胞群体以生产所关注之蛋白质，且第三“进料”细胞培养基可用于在生产期间细胞培养物进料。或者，可在整个细胞培养过程中使用相同细胞培养基。作为另一替代方案，扩增培养基可不同于生产及进料培养基，生产及进料培养基具有相同或类似组成。
在一些实施例中，一或多种使用点(point-of-use)添加物可在细胞培养期间添加至如本文所述之细胞培养基中之任一者。
在一些实施例中，培养细胞群体包含将进料培养基添加至生产细胞培养物中。如本文所用，“进料培养基”是指添加至培养细胞以补充耗尽之营养物的培养基。进料培养基可经浓缩。举例而言，当与生产细胞培养基相比时，进料培养基之一种或所有组分可浓缩。或者，进料培养基之浓度可与生产细胞培养基类似。培养基可以连续添加，也可以在培养过程中间隔添加，例如每天或每隔一天添加一次，也可以在监测的特定培养基成分浓度超出预期范围时添加培养。
在一些实施例中，在细胞培养期间根据分批进料过程以一定时间间隔补充培养基。分批进料培养一般为此项技术中已知且用于优化蛋白质生产。参见例如Y.M.Huang等人,Biotechnol Prog.(2010)26(5)第1400-1410页。
可在本文所述之细胞培养方法期间的任何时间点测量活细胞百分比。测定活细胞计数及细胞密度的方法包括(但不限于)成像细胞及定量细胞数目、密度、直径及生物标记物表达。
哺乳动物细胞(诸如CHO细胞)可在小规模细胞培养容器中，诸如在具有约25ml培养基之125ml容器、具有约50至100ml培养基之250ml容器或具有约100至200ml培养基之500ml容器中培养。举例而言，此等小规模容器可为摇瓶。细胞培养烧瓶为此项技术中已知，且可购自例如Corning、Fisher Scientific及其他供货商。
或者，细胞培养物可以实验室规模生长。此等包括例如具有约300至1000ml培养基之1000ml容器、具有约500ml至3000ml培养基之3000ml容器、具有约2000ml至8000ml培养基之8000ml容器及具有约4000ml至15000ml培养基之15000ml容器。合适细胞培养***为可商购的。
用于制备之培养物(亦即生产细胞培养物)可含有10,000L培养基或更多。诸如用于蛋白质治疗剂之制备的大规模细胞培养物或“生产细胞培养物”通常维持数天或甚至数周，同时细胞生产所需蛋白质。在此时间期间，培养物可补充有浓缩进料培养基，该浓缩进料培养基含有在培养过程期间消耗的组分，诸如营养物及氨基酸。
在一些实施例中，在细胞生长或蛋白质生产过程期间，细胞培养基补充有一或多种“使用点添加物”，亦称为添加物、使用点成分或使用点化学物质。使用点添加物包括生长因子或其他蛋白质、缓冲液、能量来源、盐、氨基酸、金属、渗透剂及螯合剂中之任一者或多者。其他蛋白质包括运铁蛋白及白蛋白。包括细胞介素及趋化介素之生长因子一般为此项技术中已知的，且已知刺激细胞生长，或在一些情况下刺激细胞分化。生长因子通常为蛋白质(例如胰岛素)、小肽或类固醇激素，诸如***、DHEA、睪固酮及其类似物。
在一些实施例中，细胞培养基补充有以下使用点添加物中之任一者或多者或全部：碳酸氢钠、右旋糖、L-麸酰胺酸、L-酪胺酸、氨基酸混合物及磷酸钠。
缓冲剂一般为此项技术中已知的。本发明并不限于任一或任何特定缓冲液，且任何本领域普通技术人员可选择供与产生特定蛋白质之特定细胞株一起使用的适当缓冲液或缓冲***。
适用作细胞培养物中之使用点添加物的能源来源亦为此项技术中熟知的。非限制性地，在一些实施例中，使用点添加物能量来源为葡萄糖。在其他实施例中，使用点添加物能量来源为右旋糖。
螯合剂同样为细胞培养及蛋白质生产之技术中熟知的。EDTA四钠脱水物及柠檬酸盐为在此项技术中使用之两种常用螯合剂，但其他螯合剂可用于本发明之实践中。
其他使用点添加物包括各种金属盐中之一或多者，诸如铁盐、镍盐、锌盐及铜盐。在一个实施例中，细胞培养基补充有硫酸铜、硫酸锌、氯化铁及硫酸镍中之任一者或多者。
设备
本公开提供用于本文所述的方法中的设备。
在一些实施例中，设备可用于控制pH且实施pH顺序(改变样品pH之顺序)，以有效地使反应器中蛋白质样品中的病毒失活。自反应器抽取样品及测量样品pH可解决由使用***反应器中之探针产生的若干问题。举例而言，探针在灭菌之后通常无法进行校准。灭菌可影响探针校准曲线。高压灭菌通常包括与第三方协调，因此耗时。探针可在灭菌之后储存于干燥环境中，此可降低探针效能及存放期。探针之使用通常包括使用额外无菌连接孔口。另外，探针之使用包括探针断裂且使参比溶液渗漏至藉由探针测量之蛋白质产物中的风险。
图19是根据一实施例之用于pH控制的设备100的方块图。如所示，设备100包括反应器110、pH流通槽120、酸滴定剂供应装置130、碱滴定剂供应装置140及任选地选用之废物接收器150。pH流通槽120含有安置于其中之pH探针121以测量流通槽中之流体样品之pH。组件之间的管线表示流体联通。设备100可包括一或多个控制器以控制其过程单元中之任一者。控制器可控制步骤顺序(例如使用酸滴定剂/碱滴定剂)。在一些实施例中，一或多个控制器可基于pH流通槽中之pH测量(值)控制顺序。控制器可经由用户接口存取。在一些实施例中，用户接口可包括计算机、膝上型计算机、行动装置、平板计算机、移动电话或任何其他适合装置。
在反应器110中，基于用户定义之顺序，例如用户定义之经设计以使包含经纯化或部分纯化之蛋白质之样品中的病毒失活的pH变化顺序控制pH。在一些实施例中，反应器110可为分批反应器或具有分批反应器之性质。在一些实施例中，反应器110可为持续搅拌槽反应器(CSTR)或具有CSTR之性质。在一些实施例中，反应器110可为塞流式反应器(PFR)或具有PFR之性质。在一些实施例中，反应器110可包括安置于其中之混合器。在一些实施例中，混合器可包括叶轮。混合器可在即将添加酸滴定剂及/或碱滴定剂时、添加酸滴定剂及/或碱滴定剂之后或期间使反应器110之内含物均匀化。在一些实施例中，混合器由控制器控制，亦即，控制器将信号发送至混合器以开启叶轮、终止叶轮或控制叶轮之速率。在一些实施例中，设备100可包括安置于反应器110外部之混合器。换言之，混合器可为与反应器110分开之单元。在一些实施例中，酸混合器(未示)可流体联通至酸滴定剂供应装置130且在添加至反应器110之前混合酸滴定剂。在一些实施例中，碱混合器(未示)可流体联通至碱滴定剂供应装置140且在添加至反应器110之前混合碱滴定剂。在一些实施例中，反应器110可不存在安置于其中之pH测量探针。反应器110可经由自酸滴定剂供应装置130及/或碱滴定剂供应装置140递送酸滴定剂及/或碱滴定剂而保持在所需pH值。
在一些实施例中，控制器在开始酸滴定剂泵(对于酸滴定剂添加)之前或在开始碱滴定剂泵(对于碱滴定剂添加)之前将信号发送至混合器以开启混合器。在一些实施例中，控制器将信号发送至混合器以在酸滴定剂泵或碱滴定剂泵停止之后停止固定时段。举例而言，控制器可将信号发送至混合器以在酸滴定剂泵或碱滴定剂泵停止之后停止15秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟或1小时。
在一些实施例中，反应器110可具有至少约1L、至少约2L、至少约3L、至少约4L、至少约5L、至少约6L、至少约7L、至少约8L、至少约9L、至少约10L、至少约20L、至少约30L、至少约40L、至少约50L、至少约60L、至少约70L、至少约80L、至少约90L、至少约100L、至少约200L、至少约300L、至少约400L、至少约500L、至少约600L、至少约700L、至少约800L、至少约900L、至少约1m3、至少约2m3、至少约3m3、至少约4m3、至少约5m3、至少约6m3、至少约7m3、至少约8m3、至少约9m3、至少约10m3、至少约20m3、至少约30m3、至少约40m3、至少约50m3、至少约60m3、至少约70m3、至少约80m3或至少约90m3之体积。在一些实施例中，反应器110可具有至多约100m3、至多约90m3、至多约80m3、至多约70m3、至多约60m3、至多约50m3、至多约40m3、至多约30m3、至多约20m3、至多约10m3、至多约9m3、至多约8m3、至多约7m3、至多约6m3、至多约5m3、至多约4m3、至多约3m3、至多约2m3、至多约1m3、至多约900L、至多约800L、至多约700L、至多约600L、至多约500L、至多约400L、至多约300L、至多约200L、至多约100L、至多约90L、至多约80L、至多约70L、至多约60L、至多约50L、至多约40L、至多约30L、至多约20L、至多约10L、至多约9L、至多约8L、至多约7L、至多约6L、至多约5L、至多约4L、至多约3L或至多约2L之体积。
反应器110之上述体积的组合亦为可能的(例如，至少约1L且至多约100m3或至少约10L且至多约500L)，包括其间之所有值及范围。在一些实施例中，反应器110可具有约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L、约10L、约20L、约30L、约40L、约50L、约60L、约70L、约80L、约90L、约100L、约200L、约300L、约400L、约500L、约600L、约700L、约800L、约900L、约1m3、约2m3、约3m3、约4m3、约5m3、约6m3、约7m3、约8m3、约9m3、约10m3、约20m3、约30m3、约40m3、约50m3、约60m3、约70m3、约80m3、约90m3或约100m3之体积。在一些实施例中，反应器110可包括液位指示器。
在一些实施例中，pH探针121可安置于pH流通槽120中。在一些实施例中，可基于来自pH流通槽120中之pH探针121之读数来确定或确认反应器110中之pH。pH流通槽120中之pH探针121在***来自反应器110之流出物中时测量参考电极与氢离子选择性电极之间的电位差。换言之，流出物中之氢离子活性影响参考电极与氢离子选择性电极之间的电化学电位，且校准pH变送器(传送器)(未示)以将电位差与pH相关联。在一些实施例中，设备100可包括pH变送器(未示)。在一些实施例中，pH变送器耦接至pH探针121且配置成接收由pH探针121产生之信号。在一些实施例中，pH变送器将自pH探针121接收之信号转换成pH测量值。在一些实施例中，pH变送器包含配置成显示pH测量值之用户接口。在一些实施例中，pH变送器可为与pH流通槽120分开之组件。在一些实施例中，pH变送器可将pH读数自pH探针121传达至控制器。在一些实施例中，控制器将pH读数自pH变送器发送至配置成显示pH读数之用户接口(未示)。基于pH变送器所传达之pH，设备100可维持其当前操作或起始操作之改变(例如，自酸滴定剂供应装置130添加酸滴定剂)。在一些实施例中，可自动实施操作之改变。在一些实施例中，操作之改变可经由使用者输入来实施。
在一些实施例中，安置于pH流通槽120中之pH探针121可测量下限pH值与上限pH值之间的pH。在一些实施例中，下限pH值可为约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0，包括其间之所有值及范围。在一些实施例中，上限pH值可为约8.5、约8.7、约8.8、约8.9、约9.0、约9.1、约9.2、约9.3、约9.4、约9.5、约9.6、约9.7、约9.8、约9.9、约10.0、约10.2、约10.5、约10.7、约11.0、约11.5、约12.0或约12.5，包括其间之所有值及范围。
pH探针测量pH流通槽120中来自反应器110之样品体积的pH。在一些实施例中，样品体积可为至少约0.1mL、至少约0.2mL、至少约0.3mL、至少约0.4mL、至少约0.5mL、至少约0.6mL、至少约0.7mL、至少约0.8mL、至少约0.9mL、至少约1mL、至少约2mL、至少约3mL、至少约4mL、至少约5mL、至少约6mL、至少约7mL、至少约8mL、至少约9mL、至少约10mL、至少约20mL、至少约30mL、至少约40mL、至少约50mL、至少约60mL、至少约70mL、至少约80mL、至少约90mL、至少约100mL、至少约110mL、至少约120mL、至少约130mL、至少约140mL或至少约150mL。在一些实施例中，样品体积可为至多约150mL、至多约140mL、至多约130mL、至多约120mL、至多约110mL、至多约100mL、至多约90mL、至多约80mL、至多约70mL、至多约60mL、至多约50mL、至多约40mL、至多约30mL、至多约20mL、至多约10mL、至多约9mL、至多约8mL、至多约7mL、至多约6mL、至多约5mL、至多约4mL、至多约3mL、至多约2mL、至多约1mL、至多约0.9mL、至多约0.8mL、至多约0.7mL、至多约0.6mL、至多约0.5mL、至多约0.4mL、至多约0.3mL或至多约0.2mL。上述样品体积之组合亦为可能的(例如至少约0.1mL且至多约100mL或至少约10mL且至多约20mL)，包括其间之所有值及范围。在一些实施例中，样品体积可为约0.1mL、约0.2mL、约0.3mL、约0.4mL、约0.5mL、约0.6mL、约0.7mL、约0.8mL、约0.9mL、约1mL、约2mL、约3mL、约4mL、约5mL、约6mL、约7mL、约8mL、约9mL、约10mL、约20mL、约30mL、约40mL、约50mL、约60mL、约70mL、约80mL、约90mL或约100mL。
在一些实施例中，样品体积可为固定体积。在一些实施例中，样品体积可为可变体积。在一些实施例中，样品体积可基于多种因素变化，所述因素包括但不限于反应器110中流体之量、反应器110中蛋白质之类型及/或反应器110之尺寸。在一些实施例中，可自反应器110抽取样品且以规定时间间隔测量。在一些实施例中，可自反应器110抽取样品且以使用者指定之自发时间间隔测量。
在一些实施例中，一或多个控制器可基于pH流通槽120所测量之pH值触发动作。举例而言，若藉由pH流通槽120测量之pH大于所需pH值，则控制器可触发酸滴定剂自酸滴定剂供应装置130递送至反应器110。在一些实施例中，若藉由pH流通槽120测量之pH小于所需pH值，则控制器可触发碱滴定剂自碱滴定剂供应装置140递送至反应器110。在一些实施例中，控制器可将pH保持在所需值下所需时间段。在一些实施例中，动作可手动触发(亦即，经由使用者干扰)。在一些实施例中，动作可自动(亦即，基于规定顺序)触发。在一些实施例中，规定顺序可包括使反应器110中之pH降低至第一pH值，且接着使反应器中之pH增加至第二pH值。在一些实施例中，第一pH值可介于约3.0与约4.5之间、介于约3.5与约4.3之间、介于约3.5与约4.0之间、介于约3.1与约3.9之间、介于约3.2与约3.8之间、介于约3.3与约3.7之间、介于约3.4与约3.7之间、介于约3.3与约3.6之间、介于约3.4与约3.6之间、介于约3.4与约3.5之间或介于约3.5与约3.6之间。在一些实施例中，第二pH值可介于约7与约8.5之间、介于约7.1与约8.4之间、介于约7.2与约8.3之间、介于约7.3与约8.2之间、介于约7.4与约8.2之间、介于约7.4与约8.1之间、介于约7.4与约8.0之间、介于约7.5与约8.2之间、介于约7.5与约8.1之间、介于约7.5与约8.0之间、介于约7.6与约8.1之间、介于约7.6与约8.0之间、介于约7.6与约7.9之间、介于约7.7与约8.0之间、介于约7.7与约7.9之间或介于约7.7与约7.8之间。
在一些实施例中，可呈多个阶段递送酸滴定剂以达到第一pH值。换言之，可添加具有颗粒性之酸滴定剂，使得可以精细方式监测反应器110之内含物的pH。在一些实施例中，可呈1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、约15、约20、约35、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95或约100个阶段，包括其间之所有值及范围，递送酸滴定剂以达到第一pH值。在一些实施例中，可呈1、2、3或4个阶段递送酸滴定剂以达到第一pH值。此可解决检查pH计之困难，因为滴定剂之少量添加可更加可预测地改变反应器110之内含物的pH。
在一些实施例中，可以多个阶段递送碱滴定剂以达到第二pH值。换言之，可添加具有颗粒性之碱滴定剂，使得可以精细方式监测反应器110之内含物的pH。在一些实施例中，可以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、约15、约20、约35、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95或约100个阶段，包括其间之所有值及范围，递送碱滴定剂以达到第二pH值。在一些实施例中，可呈1、2、3或4个阶段递送碱滴定剂以达到第二pH值。
必要时，可自酸滴定剂供应装置130递送酸滴定剂。在一些实施例中，酸滴定剂可经由泵(未示)递送。在一些实施例中，酸滴定剂供应装置130可包括容器。在一些实施例中，酸滴定剂供应装置130可包括槽。在一些实施例中，酸滴定剂供应装置130可具有至少约10mL、至少约20mL、至少约30mL、至少约40mL、至少约50mL、至少约60mL、至少约70mL、至少约80mL、至少约90mL、至少约100mL、至少约200mL、至少约300mL、至少约400mL、至少约500mL、至少约600mL、至少约700mL、至少约800mL、至少约900mL、至少约1L、至少约2L、至少约3L、至少约4L、至少约5L、至少约6L、至少约7L、至少约8L、至少约9L、至少约10L、至少约20L、至少约30L、至少约40L、至少约50L、至少约60L、至少约70L、至少约80L、至少约90L、至少约100L、至少约200L、至少约300L、至少约400L、至少约500L、至少约600L、至少约700L、至少约800L、至少约900L、至少约1m3、至少约2m3、至少约3m3、至少约4m3、至少约5m3、至少约6m3、至少约7m3、至少约8m3或至少约9m3之体积。在一些实施例中，酸滴定剂供应装置130可具有至多约10m3、至多约9m3、至多约8m3、至多约7m3、至多约6m3、至多约5m3、至多约4m3、至多约3m3、至多约2m3、至多约1m3、至多约900L、至多约800L、至多约700L、至多约600L、至多约500L、至多约400L、至多约300L、至多约200L、至多约100L、至多约90L、至多约80L、至多约70L、至多约60L、至多约50L、至多约40L、至多约30L、至多约20L、至多约10L、至多约9L、至多约8L、至多约7L、至多约6L、至多约5L、至多约4L、至多约3L、至多约2L、至多约1L、至多约900mL、至多约800mL、至多约700mL、至多约600mL、至多约500mL、至多约400mL、至多约300mL、至多约200mL、至多约100mL、至多约90mL、至多约80mL、至多约70mL、至多约60mL、至多约50mL、至多约40mL、至多约30mL或至多约20mL之体积。
酸滴定剂供应装置130之上述体积的组合亦为可能的(例如，至少约10mL且至多约10m3或至少约1L且至多约5L)，包括其间之所有值及范围。在一些实施例中，酸滴定剂供应装置130可具有约10mL、约20mL、约30mL、约40mL、约50mL、约60mL、约70mL、约80mL、约90mL、约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L、约10L、约20L、约30L、约40L、约50L、约60L、约70L、约80L、约90L、约100L、约200L、约300L、约400L、约500L、约600L、约700L、约800L、约900L、约1m3、约2m3、约3m3、约4m3、约5m3、约6m3、约7m3、约8m3或约9m3或约10m3之体积。
在一些实施例中，酸滴定剂供应装置130可维持在至少约0.5、至少约1、至少约1.5、至少约2、至少约2.5、至少约3、至少约3.5、至少约4、至少约4.5、至少约5、至少约5.5、至少约6或至少约6.5之pH下。在一些实施例中，酸滴定剂供应装置130可维持在至多约7、至多约6.5、至多约6、至多约5.5、至多约5、至多约4.5、至多约4、至多约3.5、至多约3、至多约2.5、至多约2、至多约1.5、至多约1或至多约0.5之pH下。酸滴定剂供应装置130中上述pH值之组合亦为可能的(例如，至少约0.5且至多约7或至少约2且至多约6)，包括其间之所有值及范围。在一些实施例中，酸滴定剂供应装置130可维持在约0、约0.5、约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5或约7之pH下。
必要时，可自碱滴定剂供应装置140递送碱滴定剂。在一些实施例中，碱滴定剂可经由泵(未示)递送。在一些实施例中，碱滴定剂供应装置140可包括容器。在一些实施例中，碱滴定剂供应装置140可包括槽。在一些实施例中，碱滴定剂供应装置140可具有至少约10mL、至少约20mL、至少约30mL、至少约40mL、至少约50mL、至少约60mL、至少约70mL、至少约80mL、至少约90mL、至少约100mL、至少约200mL、至少约300mL、至少约400mL、至少约500mL、至少约600mL、至少约700mL、至少约800mL、至少约900mL、至少约1L、至少约2L、至少约3L、至少约4L、至少约5L、至少约6L、至少约7L、至少约8L、至少约9L、至少约10L、至少约20L、至少约30L、至少约40L、至少约50L、至少约60L、至少约70L、至少约80L、至少约90L、至少约100L、至少约200L、至少约300L、至少约400L、至少约500L、至少约600L、至少约700L、至少约800L、至少约900L、至少约1m3、至少约2m3、至少约3m3、至少约4m3、至少约5m3、至少约6m3、至少约7m3、至少约8m3或至少约9m3之体积。在一些实施例中，碱滴定剂供应装置140可具有至多约10m3、至多约9m3、至多约8m3、至多约7m3、至多约6m3、至多约5m3、至多约4m3、至多约3m3、至多约2m3、至多约1m3、至多约900L、至多约800L、至多约700L、至多约600L、至多约500L、至多约400L、至多约300L、至多约200L、至多约100L、至多约90L、至多约80L、至多约70L、至多约60L、至多约50L、至多约40L、至多约30L、至多约20L、至多约10L、至多约9L、至多约8L、至多约7L、至多约6L、至多约5L、至多约4L、至多约3L、至多约2L、至多约1L、至多约900mL、至多约800mL、至多约700mL、至多约600mL、至多约500mL、至多约400mL、至多约300mL、至多约200mL、至多约100mL、至多约90mL、至多约80mL、至多约70mL、至多约60mL、至多约50mL、至多约40mL、至多约30mL或至多约20mL之体积。
碱滴定剂供应装置140之上述体积之组合亦为可能的(例如，至少约10mL且至多约10m3或至少约1L且至多约5L)，包括其间之所有值及范围。在一些实施例中，碱滴定剂供应装置140可具有约10mL、约20mL、约30mL、约40mL、约50mL、约60mL、约70mL、约80mL、约90mL、约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L、约10L、约20L、约30L、约40L、约50L、约60L、约70L、约80L、约90L、约100L、约200L、约300L、约400L、约500L、约600L、约700L、约800L、约900L、约1m3、约2m3、约3m3、约4m3、约5m3、约6m3、约7m3、约8m3或约9m3或约10m3之体积。
在一些实施例中，碱滴定剂供应装置140可维持在至少约7、至少约7.5、至少约8、至少约8.5、至少约9、至少约9.5、至少约10、至少约10.5、至少约11、至少约11.5、至少约12、至少约12.5、至少约13或至少约13.5之pH下。在一些实施例中，碱滴定剂供应装置140可维持在至多约14、至多约13.5、至多约13、至多约12.5、至多约12、至多约11.5、至多约11、至多约10.5、至多约10、至多约9.5、至多约9、至多约8.5、至多约8或至多约7.5之pH下。碱滴定剂供应装置140中上述pH值之组合亦为可能的(例如，至少约7.5且至多约14或至少约8且至多约10)，包括其间之所有值及范围。在一些实施例中，碱滴定剂供应装置140可维持在约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约10.5、约11、约11.5、约12、约12.5、约13、约13.5或约14之pH下。
废物接收器150任选地存在且可接收来自在pH流通槽120中测量之样品的流出物。在一些实施例中，废物接收器150可包括可接收来自pH流通槽120之流出物的容器、槽、处理设施或任何其他适合之装置。
图20是根据一实施例之用于pH控制的设备200的示意图。如所示，设备200包括反应器210、具有pH探针221之pH流通槽220、取样泵222、止回阀224(亦称为逆止阀)、酸滴定剂供应装置230、酸滴定剂泵232、酸滴定剂流量计234、碱滴定剂供应装置240、碱滴定剂泵242、碱滴定剂流量计244、废物接收器250、控制器260及用户接口262。在一些实施例中，止回阀224允许仅在一个方向上流动，自反应器210流出，藉此防止反应器210被pH流通槽220中该体积之样品污染。在一些实施例中，反应器210、pH流通槽220、酸滴定剂供应装置230、碱滴定剂供应装置240及废物接收器250可与反应器110、pH流通槽120、酸滴定剂供应装置130、碱滴定剂供应装置140及废物接收器150相同或实质上相似，如上文参考图19所述。因此，本文中未更详细地描述反应器210、pH流通槽220、酸滴定剂供应装置230、碱滴定剂供应装置240及废物接收器250之某些方面。如所示，箭头表示流体之流动。
如所示，物流可自反应器210流动至废物接收器250。反应器210自酸滴定剂供应装置230及碱滴定剂供应装置240接收物流。在一些实施例中，反应器210可包括安置于其中之混合器。在一些实施例中，设备200可包括一或多个在反应器210外部之混合器。
在一些实施例中，pH流通槽220可为Mettler Toledo pH流通槽。在一些实施例中，pH探针221可安置于pH流通槽220中。适合于本文所述的设备的示例性pH探针包括来自Mettler Toledo、Thermo Fisher Scientific或Cole-Parmer之直列式pH探针。在一些实施例中，pH探针221耦接至pH变送器。pH变送器可例如为Mettler Toledo M400 pH变送器。在一些实施例中，pH变送器可在视觉上在其上面显示pH读数。在一些实施例中，pH变送器将pH读数传送至控制器260。在一些实施例中，控制器260将pH读数传达至用户接口262，该用户接口显示pH读数。在一些实施例中，pH变送器可将pH读数传达至用户接口262。流过流通槽220之流量可藉由取样泵222控制。
取样泵222泵送来自反应器210之一定体积的样品流体(亦即滑流)，使得该体积之样品流体可进入pH流通槽220。在一些实施例中，取样泵222可包括蠕动泵、隔膜泵、齿轮泵、多叶泵、活塞泵、离心泵或任何其他适合之泵或其组合。在一些实施例中，取样泵222可包括Watson-Marlow 120泵。
止回阀224允许仅在一个方向上流动，自反应器210流出，藉此防止反应器210被流通槽220中该体积之样品污染。如所示，阀224在取样泵222上游。在一些实施例中，阀224可位于取样泵222的下游。在一些实施例中，设备200可包括反应器210下游且流体联通至反应器210之截流阀(未示)。在一些实施例中，截流阀可实体耦接至反应器。
酸滴定剂供应装置230含有酸滴定剂。可经由酸滴定剂泵232自酸滴定剂供应装置230抽取出酸滴定剂。酸滴定剂泵232自酸滴定剂供应装置230抽取流体且促进酸滴定剂流动至反应器210。在一些实施例中，酸滴定剂泵232可促成至少约1mL/min、至少约2mL/min、至少约3mL/min、至少约4mL/min、至少约5mL/min、至少约6mL/min、至少约7mL/min、至少约8mL/min、至少约9mL/min、至少约10mL/min、至少约20mL/min、至少约30mL/min、至少约40mL/min、至少约50mL/min、至少约60mL/min、至少约70mL/min、至少约80mL/min、至少约90mL/min、至少约100mL/min、至少约200mL/min、至少约300mL/min、至少约400mL/min、至少约500mL/min、至少约600mL/min、至少约700mL/min、至少约800mL/min、至少约900mL/min、至少约1L/min、至少约2L/min、至少约5L/min、至少约10L/min、至少约20L/min、至少约30L/min、至少约40L/min或至少约50L/min之酸滴定剂流速。在一些实施例中，酸滴定剂泵232可促成至多约50L/min、至多约40L/min、至多约30L/min、至多约20L/min、至多约10L/min、至多约5L/min、至多约2L/min、至多约1L/min、至多约900mL/min、至多约800mL/min、至多约700mL/min、至多约600mL/min、至多约500mL/min、至多约400mL/min、至多约300mL/min、至多约200mL/min、至多约100mL/min、至多约90mL/min、至多约80mL/min、至多约70mL/min、至多约60mL/min、至多约50mL/min、至多约40mL/min、至多约30mL/min、至多约20mL/min、至多约10mL/min、至多约9mL/min、至多约8mL/min、至多约7mL/min、至多约6mL/min、至多约5mL/min、至多约4mL/min、至多约3mL/min或至多约2mL/min之酸滴定剂流速。
上述酸滴定剂流速之组合亦为可能的(例如，至少约1mL/min且至多约1L/min或至少约10mL/min且至多约50mL/min)，包括其间之所有值及范围。在一些实施例中，酸滴定剂泵232可促成约1mL/min、约2mL/min、约3mL/min、约4mL/min、约5mL/min、约6mL/min、约7mL/min、约8mL/min、约9mL/min、约10mL/min、约20mL/min、约30mL/min、约40mL/min、约50mL/min、约60mL/min、约70mL/min、约80mL/min、约90mL/min、约100mL/min、约200mL/min、约300mL/min、约400mL/min、约500mL/min、约600mL/min、约700mL/min、约800mL/min、约900mL/min或约1L/min之酸滴定剂流速。
酸滴定剂之流速可藉由酸滴定剂流量计234测量。在一些实施例中，酸滴定剂流量计234可包括超声波计、旋涡混合器、磁力计、Coriolis计或任何其他适合之流量计或其组合。适合之酸滴定剂流量计可购得，例如酸滴定剂流量计234可包括Sonotec超声波流量计。
在一些实施例中，酸滴定剂泵232可包括蠕动泵、隔膜泵、齿轮泵、多叶泵、活塞泵、离心泵或任何其他适合之泵或其组合。适合之酸滴定剂泵(232)可购得，例如Watson-Marlow 530泵。
碱滴定剂供应装置240含有碱滴定剂。可经由碱滴定剂泵242自碱滴定剂供应装置240抽取出碱滴定剂。碱滴定剂泵242自碱滴定剂供应装置240抽取流体且促进碱滴定剂流动至反应器210。在一些实施例中，碱滴定剂泵242可促成至少约1mL/min、至少约2mL/min、至少约3mL/min、至少约4mL/min、至少约5mL/min、至少约6mL/min、至少约7mL/min、至少约8mL/min、至少约9mL/min、至少约10mL/min、至少约20mL/min、至少约30mL/min、至少约40mL/min、至少约50mL/min、至少约60mL/min、至少约70mL/min、至少约80mL/min、至少约90mL/min、至少约100mL/min、至少约200mL/min、至少约300mL/min、至少约400mL/min、至少约500mL/min、至少约600mL/min、至少约700mL/min、至少约800mL/min、至少约900mL/min、至少约1L/min、至少约2L/min、至少约5L/min、至少约10L/min、至少约20L/min、至少约30L/min、至少约40L/min或至少约50L/min之碱滴定剂流速。在一些实施例中，碱滴定剂泵242可促成至多约50L/min、至多约40L/min、至多约30L/min、至多约20L/min、至多约10L/min、至多约5L/min、至多约2L/min、至多约1L/min、至多约900mL/min、至多约800mL/min、至多约700mL/min、至多约600mL/min、至多约500mL/min、至多约400mL/min、至多约300mL/min、至多约200mL/min、至多约100mL/min、至多约90mL/min、至多约80mL/min、至多约70mL/min、至多约60mL/min、至多约50mL/min、至多约40mL/min、至多约30mL/min、至多约20mL/min、至多约10mL/min、至多约9mL/min、至多约8mL/min、至多约7mL/min、至多约6mL/min、至多约5mL/min、至多约4mL/min、至多约3mL/min或至多约2mL/min之酸滴定剂流速。
上述碱滴定剂流速之组合亦为可能的(例如，至少约1mL/min且至多约1L/min或至少约10mL/min且至多约50mL/min)，包括其间之所有值及范围。在一些实施例中，碱滴定剂泵242可促成约1mL/min、约2mL/min、约3mL/min、约4mL/min、约5mL/min、约6mL/min、约7mL/min、约8mL/min、约9mL/min、约10mL/min、约20mL/min、约30mL/min、约40mL/min、约50mL/min、约60mL/min、约70mL/min、约80mL/min、约90mL/min、约100mL/min、约200mL/min、约300mL/min、约400mL/min、约500mL/min、约600mL/min、约700mL/min、约800mL/min、约900mL/min或约1L/min之碱滴定剂流速。
碱滴定剂之流速可藉由碱滴定剂流量计244测量。在一些实施例中，碱滴定剂流量计244可包括超声波计、旋涡混合器、磁力计、Coriolis计或任何其他适合之流量计或其组合。适合之碱滴定剂流量计可购得，例如碱滴定剂流量计244可包括Sonotec超声波流量计。
在一些实施例中，碱滴定剂泵242可包括蠕动泵、隔膜泵、齿轮泵、多叶泵、活塞泵、离心泵或任何其他适合之泵或其组合。适合之碱滴定剂泵可购得，例如碱滴定剂泵242可包括Watson-Marlow 530泵。
如所示，点线框包围组件，用户接口262可在所述组件上展现一定控制水平。换言之，用户接口262可经由控制器260或多个控制器起作用以控制设备200之组件中之任一者。在一些实施例中，用户接口262可与反应器210、pH流通槽220、取样泵222、阀224、酸滴定剂供应装置230、酸滴定剂泵232、酸滴定剂流量计234、碱滴定剂供应装置240、碱滴定剂泵242、碱滴定剂流量计244及/或废物接收器250通信且可对其进行控制。在一些实施例中，对上述组件中之任一者的控制可由使用者起始。换言之，用户可手动控制设备200之组件中之任一者以起始组件中之至少一者中的动作。在一些实施例中，设备200之组件中之任一者的控制可响应于设备200中之条件(例如，在pH流通槽220中测量之pH)而自动进行。在一些实施例中，对设备200之组件中之任一者的控制可在无任何使用者参与的情况下进行。在一些实施例中，用户可经由用户接口262将指令发送至控制器260以控制或推进预程序化之pH顺序或添加预定量之酸滴定剂或碱滴定剂。
在一些实施例中，控制器260可与酸滴定剂流量计234、碱滴定剂流量计244、pH探针221、酸滴定剂泵232及/或碱滴定剂泵242通信。在一些实施例中，控制器260可接收来自酸滴定剂流量计244之信号，藉此控制器260确定添加至样品之酸滴定剂之量。在一些实施例中，控制器260可接收来自碱滴定剂流量计244之信号，藉此控制器260确定添加至样品之碱滴定剂之量。在一些实施例中，控制器260可接收来自pH探针221之信号，藉此该信号将pH测量值传送至控制器260，且控制器260将pH测量值与添加至样品之酸滴定剂或碱滴定剂之对应量相关联。在一些实施例中，控制器260可将信号发送至酸滴定剂泵232以开启泵、停止泵或改变泵速度。在一些实施例中，控制器260可将信号发送至碱滴定剂泵242以开启泵、停止泵或改变泵速度。在一些实施例中，控制器260可将模型应用于pH测量值及添加至样品之酸或碱滴定剂之对应量。
在一些实施例中，用户接口262可经由控制器260与反应器210及/或安置于其中之混合器通信。在一些实施例中，控制器260可与混合器通信以控制混合时序及混合速度。举例而言，控制器260可将信号发送至混合器以在即将添加酸滴定剂及/或碱滴定剂时及添加酸滴定剂及/或碱滴定剂期间起始。在滴定剂添加期间混合可防止样品中出现大量高滴定剂浓度，此可能会损坏样品。在一些实施例中，混合时序可基于添加多少酸滴定剂及/或碱滴定剂进行修改。在一些实施例中，控制器260可与阀224通信以停止或允许取样流体流过其。在一些实施例中，控制器260可与取样泵222通信以启动取样流体泵送穿过其或改变取样流体穿过其之流动速率。在一些实施例中，至取样泵222及阀224之次序可基于经由pH变送器及控制器260传达至用户接口262之数据。
控制器260配置成接收来自本文所述的设备之组件的信号，且将指令发送至本文所述的设备之组件。在一些实施例中，控制器260可与酸滴定剂泵232通信以泵送酸滴定剂从其穿过。举例而言，控制器260发送开启酸滴定剂泵232之信号，停止酸滴定剂泵，或改变酸滴定剂泵之速度。在一些实施例中，与酸滴定剂泵232之通信可基于经由pH变送器及/或酸滴定剂流量计234传达至控制器260之数据。在一些实施例中，控制器260可与碱滴定剂泵242通信以泵送碱滴定剂穿过其。举例而言，控制器260发送开启碱滴定剂泵242之信号，停止碱滴定剂泵，或改变碱滴定剂泵之速度。在一些实施例中，与碱滴定剂泵242之通信可基于经由pH变送器及/或碱滴定剂流量计244传达至控制器260之数据。在一些实施例中，控制器260配置成接收来自pH探针221之pH值(例如经由pH变送器)，且控制器260在测量pH时将数学模型应用于pH值，应用于添加至样品之酸或碱滴定剂之对应量。在一些实施例中，控制器260配置成将本文所述之模型应用于一或多个pH值及添加至样品之滴定剂之对应量。在一些实施例中，控制器260配置成自所测量之pH值、添加至样品之滴定剂之量及模型确定待添加至样品以达到目标pH之滴定剂的剩余量。任选地，此等步骤可重复一或多次，直至达到最终目标pH。举例而言，控制器260配置成接收初始pH读数，将信号发送至酸或碱滴定剂泵242，藉此将预定量之酸或碱滴定剂添加至样品中，其后pH探针221获取读数且经由pH变送器将所测量之pH值发送至控制器260。接着控制器260将模型应用于初始pH值、添加滴定剂之后测量之pH值及添加至样品之滴定剂之量，且确定添加至样品之滴定剂之额外量。在一些实施例中，例如在存在预定之pH顺序的情况下，控制器260可发送指令以自动推进pH顺序。在其他实施例中，用户经由用户接口发指令给控制器260以推进pH顺序，且控制器260例如藉由启动酸滴定剂泵232或碱滴定剂泵242、获取pH读数及其类似方面来将所述指令转送至设备。
在一些实施例中，控制器260可包括服务器、计算机、膝上型计算机、行动装置、平板计算机、移动电话或任何其他适合装置。控制器260可包括一或多个中央处理单元(“处理器”)、内存及输入/输出装置。在某些实施例中，控制器260包括一或多个内存及/或储存装置。内存及储存装置可为一或多个计算机可读储存媒体，其可储存实施本文所述之各种实施例之至少部分的计算机可执行指令。在一些实施例中，控制器260包括计算机可读储存媒体，其储存计算机可执行指令，包括(但不限于)以下每一个：启动、停止酸滴定剂泵232或改变其速度之指令；启动、停止碱滴定剂泵242或改变其速度之指令；接收及储存来自pH探针221及/或pH变送器之pH值的指令；及接收及储存来自酸滴定剂流量计234及/或碱滴定剂流量计244之数据的指令。在一些实施例中，计算机可执行指令包括接收及储存用户输入之pH值的指令，例如当侦测到安置于pH流通槽220中之pH探针221中的误差时由使用者测量及输入之离线pH值。在一些实施例中，计算机可执行指令包括用以自来自酸滴定剂流量计234或碱滴定剂流量计244及任选地酸滴定剂泵232或碱滴定剂泵242之数据计算添加至样品之酸或碱滴定剂之量的指令。在一些实施例中，计算机可执行指令包括将本文所述之模型应用于pH值及添加至样品之滴定剂之量的指令。在一些实施例中，计算机可执行指令包括任选地响应于经由用户接口来自用户之命令，执行pH顺序之一或多个步骤的指令。在一些实施例中，控制器260包括配置成执行上文所述之指令的处理器。
本公开提供用户接口262，其配置成接收来自控制器260之信号且将指令发送至控制器260。在一些实施例中，用户接口262为工业用人机接口。适合之用户接口包括视觉接口(计算机监视器、平面屏幕、触控屏幕及其类似物)以及键盘、指针设备(诸如鼠标)及等效装置。在一些实施例中，用户接口262配置成显示来自控制器260之pH测量值。在一些实施例中，用户接口262配置成接收来自使用者之一或多个离线pH测量值。在一些实施例中，用户接口262配置成接收来自用户之指令，藉此将指令发送至控制器260以推进pH顺序。
本说明书阐述大量示例性组态、方法、参数及其类似者。然而，应认识到此类描述并不意欲限制本公开之范畴，而是被提供作为示例性实施例之描述。上文所描述之本发明主题之实施例单独或与一或多个其他方面或实施例组合可为有益的。在不限制前述描述之情况下，本发明之某些非限制性实施例提供于下文中。如本领域普通技术人员在阅读本公开时将显而易见，可使用经单独编号之实施例中之每一个或与之前或之后经单独编号之实施例中之任一者组合使用。此意欲提供对实施例之所有此类组合的支持且不限于下文明确提供之实施例的组合。
列举实施例
可参看以下所列举实施例理解本公开：
1.一种方法，其包含：
(a)测量样品之初始pH(pH初始)；
(b)将至少第一量之滴定剂(滴定剂n)添加至该样品且测量至少第一额外pH值(pHn)，滴定剂n为添加至该样品以达到pHn之滴定剂之量，其中pHn不同于pH初始；
(c)应用模型来确定归一化之滴定剂初始量(滴定剂初始)及归一化之滴定剂n，其中该模型将添加至该样品之该归一化之滴定剂与该样品之pH相关联；及
(d)确定待添加至该样品以达到目标pH(pHn+1)之滴定剂之另一额外量(滴定剂n+1)，pHn+1是藉由将该另一额外量之滴定剂添加至该样品而达到的pH。
2.实施例1的方法，其包含将第二量之滴定剂(滴定剂n+2)添加至该样品且测量第二额外pH(pHn+2)，且重复步骤(c)及(d)。
3.实施例2的方法，其包含将第三量之滴定剂(滴定剂n+3)添加至该样品且测量第三额外pH(pHn+3)，且重复步骤(c)及(d)。
4.实施例3的方法，其中将该第三量之滴定剂添加至该样品中引起pH在最终目标pH(pH最终)之0.05至0.10pH单位内。
5.实施例1至4中任一项的方法，其包含将第四量之滴定剂添加至该样品且测量第四额外pH。
6.实施例1至5中任一项的方法，其中该方法包含不超过3或4次添加滴定剂以将该样品之该pH变为pH最终。
7.实施例1至6中任一项的方法，其包含：
(i)自至少一个参考样品生成至少一个参考滴定曲线，将添加至该参考样品之滴定剂之量与该参考样品之pH相关联；
(ii)任选地将该至少一个参考滴定曲线归一化；及
(iii)生成该模型以拟合该至少一个参考滴定曲线。
8.实施例7的方法，其中生成该至少一个参考滴定曲线包含：
(i)测量该参考样品之初始pH(pH初始_参考)；
(ii)将一定量之滴定剂添加至该参考样品(滴定剂n_参考)且测量额外参考pH值(pHn_参考)，滴定剂n_参考为添加至该样品以达到pHn_参考之滴定剂之量，其中pHn_参考不同于pH初始_参考；
(iii)重复步骤(i)-(ii)直至藉由将全部量之滴定剂添加至该参考样品(滴定剂总_参考)，该至少一个参考样品达到最终pH(pH最终_参考)；及
(iv)将所添加之滴定剂之量相对于该参考样品之pH绘图。
9.实施例7或8的方法，其中在复数个时段期间在离散步骤中将滴定剂添加至该参考样品。
10.实施例7或8的方法，其中将滴定剂连续添加至该参考样品中。
11.实施例7至10中任一项的方法，其中该参考样品之pH藉由直接***该参考样品中之pH探针测量。
12.实施例7至10中任一项的方法，其中该参考样品之pH藉由***来自该参考样品之连续或离散取样之滑流中的pH探针测量。
13.实施例7至12中任一项的方法，其中添加至该参考样品之滴定剂之量藉由以下来归一化：
其中滴定剂1_参考为添加至该参考样品以达到pH1_参考之滴定剂之量，且滴定剂2_参考为添加至该参考样品以达到pH2_参考之滴定剂之量。
14.实施例7至13中任一项的方法，其中该至少一个参考滴定曲线包含单个滴定曲线，且其中pH1_参考＝pH初始_参考，且pH2_参考＝pH最终_参考。
15.实施例7至13中任一项的方法，其中该至少一个参考滴定曲线包含复数个参考滴定曲线。
16.实施例15的方法，其中各参考滴定曲线包含pH初始_参考及pH最终_参考，且其中：
(a)pH1_参考为来自该复数个参考滴定曲线中之一者的pH初始_参考，
(b)pH2_参考为来自该复数个参考滴定曲线中之一者的pH最终_参考，且其中pH1_参考及pH2_参考经选择以涵盖值之最大差异，同时仍涵盖由所有该复数个参考滴定曲线覆盖的pH值。
17.实施例13至16中任一项的方法，其中该样品之该初始pH(pH初始)与pH1_参考大约相同。
18.实施例13至16中任一项的方法，其中该样品之该初始pH(pH初始)与pH1_参考不相同。
19.实施例18的方法，其中pH初始与pH1_参考之间的差值为约0.05至1、约0.1至1、约0.1至0.5或约0.1至0.3pH单位。
20.实施例13至19中任一项的方法，其中该样品之该最终pH(pH最终)与pH2_参考大约相同。
21.实施例13至19中任一项的方法，其中pH最终与pH2_参考不相同。
22.实施例21的方法，其中pH最终与pH2_参考之间的差值为约0.05至1、约0.1至1、约0.1至0.5或约0.1至0.3pH单位。
23.实施例13至22中任一项的方法，其中pH初始、pH初始_参考及pH1_参考大约相同，且其中pH最终、pH最终_参考及pH2_参考大约相同。
24.实施例1至23中任一项的方法，其中该样品之该最终pH(pH最终)小于该样品之该初始pH(pH初始)，且该滴定剂为酸。
25.实施例24的方法，其中添加至该参考样品之滴定剂之量经归一化为约-0.76至约1.49之尺度。
26.实施例24或25的方法，其中pH1_参考介于约4.0与4.3之间，且任选地其中pH1_参考为约4.1，且pH2_参考介于约3.4与3.9之间，且任选地其中pH2_参考为约3.7。
27.实施例24至26中任一项的方法，其中pH初始介于约4.0至4.5之间、介于约4.1与4.5之间、介于约4.2与4.5之间、介于约4.3与4.5之间、介于约4.1与4.4之间或介于约4.2与4.4之间。
28.实施例24至27中任一项的方法，其中pH最终介于约3.0与3.8之间、介于约3.1与3.8之间、介于约3.2与3.8之间、介于约3.3与3.7之间、介于约3.4与3.7之间或介于约3.5与3.7之间。
29.实施例24至27中任一项的方法，其中pH最终为约3.6。
30.实施例24至29中任一项的方法，其中该模型包含多项式。
31.实施例30的方法，其中该模型包含下式之四阶多项式：
32.实施例30或31的方法，其中该多项式包含：
33.实施例1至23中任一项的方法，其中该样品之该最终pH(pH最终)大于该初始pH(pH初始)，且该滴定剂为碱。
34.实施例33的方法，其中添加至该参考样品之滴定剂之量经归一化为约-0.06至约1.53之尺度。
35.实施例33或34的方法，其中pH1_参考介于约3.0与3.8之间或介于约之间、介于约3.1与3.8之间、介于约3.2与3.8之间、介于约3.3与3.7之间、介于约3.4与3.7之间或介于约3.5与3.7，且pH2_参考介于约5.3与8.5之间、介于约5.1与8.1之间、介于约5.5-8.0之间或介于约7.5与8.0之间。
36.实施例33或34的方法，其中pH1_参考为约3.7，且pH2_参考为约7.6。
37.实施例33至36中任一项的方法，其中pH初始介于约3.0与3.8之间、介于约3.1与3.8之间、介于约3.2与3.8之间、介于约3.3与3.7之间、介于约3.4与3.7之间或介于约3.5与3.7之间。
38.实施例33至37中任一项的方法，其中pH最终介于约5.3与8.5之间、介于约5.1与8.1之间、介于约5.5-8.0之间或介于约7.5与8.0之间。
39.实施例33至38中任一项的方法，其中该模型包含多项式。
40.实施例39的方法，其中该模型包含下式之5阶多项式：
41.实施例37或38的方法，其中该多项式包含：
归一化之滴定剂n＝12.256725-10.723277*pHn+3.3662386*pHn^2-0.4588175*pHn^3+0.0255417*pHn^4-0.0003153*pHn^5(等式21)。
42.实施例1至41中任一项的方法，其进一步包含在测定该样品或该至少一个参考样品之pH值时针对pH计校准进行校正。
43.实施例42的方法，其中针对pH计校准进行校正包含：
(a)在滴定剂之该添加之前移除该样品或该参考样品之第一部分，且用独立校准之pH计测量该第一部分之pH，藉此生成离线初始pH值(pH初始_离线)；(b)在该全部量之滴定剂之该添加之后移除该样品或该参考样品之第二部分且用独立校准之pH计测量该第二部分之pH，藉此生成离线最终pH值(pH最终_离线)；及
(c)应用该离线pH值与所测量之pH值之间的关系来确定该参考样品之校正pH。
44.实施例43的方法，其中该参考样品之经校正之pH藉由以下来确定：
45.实施例43的方法，其中该样品之经校正之pH藉由以下来确定：
46.实施例1至45中任一项的方法，其中确定待添加至该样品之滴定剂的剩余量藉由以下在步骤(d)来确定：
47.实施例1至46中任一项的方法，其中该样品之该pH使用***自该样品移除之子样品或分开取样之滑流中之pH探针来测量。
48.实施例1至46中任一项的方法，其中该样品之该pH使用直接***该样品或连续滑流中之pH探针来测量。
49.实施例1至48中任一项的方法，其中该样品包含第一所关注之蛋白质且该至少一个参考样品包含第二所关注之蛋白质。
50.实施例49的方法，其中该第一所关注之蛋白质与该第二所关注之蛋白质相同。
51.实施例49的方法，其中该第一所关注之蛋白质与该第二所关注之蛋白质不相同，但针对该滴定剂至该样品及该参考样品之该添加类似地反应。
52.实施例49至51中任一项的方法，其中该第一所关注之蛋白质及该第二所关注之蛋白质为糖基化蛋白质。
53.实施例49至52中任一项的方法，其中该第一所关注之蛋白质及该第二所关注之蛋白质各自为抗体。
54.实施例53的方法，其中该抗体是选自由以下组成之群：选自由以下组成之群：抗PD1抗体、抗PDL-1抗体、抗Dll4抗体、抗ANG2抗体、抗AngPtl3抗体、抗PDGFR抗体、抗Erb3抗体、抗PRLR抗体、抗TNF抗体、抗EGFR抗体、抗PCSK9抗体、抗GDF8抗体、抗GCGR抗体、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、抗IL4R抗体、抗IL6R抗体、抗IL1抗体、抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗体、抗RSV抗体、抗NGF抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗CD19抗体、抗CD28抗体、抗CD48抗体、抗CD3/抗CD20双特异性抗体、抗CD3/抗MUC16双特异性抗体及抗CD3/抗PSMA双特异性抗体。
55.实施例49至54中任一项的方法，其中该第一所关注之蛋白质及该第二所关注之蛋白质各自为受体Fc融合(TRAP)蛋白。
56.实施例55的方法，其中该TRAP蛋白包含VEGF TRAP或IL-1TRAP。
57.实施例1至56中任一项的方法，其中与pH藉由将pH探针直接***该样品或自该样品抽取之连续滑流中来测量的方法相比，该方法提高达到该样品之最终pH的准确度。
58.实施例1至57中任一项的方法，其中与pH藉由***自该样品抽取之连续滑流中的pH计测量的方法相比，该方法减少样品废物。
59.实施例1至58中任一项的方法，其中所测量之样品pH与该模型之间的差值鉴别用于测量样品pH之pH计校准中的误差。
60.实施例59的方法，其包含：
(a)重新校准该pH计；
(b)将额外量之滴定剂添加至该样品且测量额外pH；
(c)应用该模型且将归一化之滴定剂及pH或归一化之pH与该模型进行比较；及
(d)当该pH或归一化之pH与该模型相对应时，将剩余量之滴定剂添加至该样品以达到pH最终；
藉此防止由添加过多滴定剂至该样品引起之对该所关注之蛋白质之损伤。
61.一种使样品中之病毒失活的方法，其包含：
(a)提供在4.0或更大之初始pH(pH初始)下的样品；
(b)将第一量之酸滴定剂(滴定剂n_酸)添加至该样品且测量第一额外酸pH值(pHn_酸)，滴定剂n_酸为添加至该样品以达到pHn_酸之滴定剂之量，其中该pHn_酸不同于该pH初始；
(c)应用模型以确定归一化之滴定剂初始量(滴定剂初始)及归一化之滴定剂，其中该模型将归一化之添加至该样品之滴定剂与该样品之该pH相关联；
(d)基于该归一化之滴定剂、pH及该模型，确定待添加至该样品以达到目标酸pH(pH酸_目标)之滴定剂之量；
(e)将该量之滴定剂添加至该样品中以达到pH酸_目标；
(f)重复步骤(d)及(e)直至达到最终酸pH(pH酸_最终)为止；
(g)将该样品保持在pH最终_酸下足以使该病毒失活之时段；
(h)将第一量之碱性滴定剂(滴定剂n_碱)添加至该样品且测量第一额外碱pH值(pHn_碱)，滴定剂n_碱为添加至该样品以达到pHn_碱之滴定剂之量，其中pHn_碱不同于该pH酸_最终；
(i)藉由应用第二模型将滴定剂n_碱归一化；
(j)基于归一化之滴定剂、pH及该模型，确定添加至该样品以将该样品之该pH变为目标碱性pH(pH目标_碱)之碱性滴定剂之量；
(k)将该量之碱性滴定剂添加至该样品中以达到pH目标_碱；及
(l)重复步骤(j)及(k)直至达到最终碱性pH(pH最终_碱)为止。
62.实施例61的方法，其包含重复步骤(b)及(c)至少一次以确认该样品之行为与该模型相对应。
63.实施例61或62的方法，其包含重复步骤(d)及(e)1、2或3次。
64.实施例61至63中任一项的方法，其包含重复步骤(d)及(e)2或3次，且其中重复步骤(d)及(e)2或3次引起目标酸pH在pH酸_最终之0.05至0.10pH单位内。
65.实施例64的方法，其包含再一次重复步骤(d)及(e)以达到pH酸_ 最终。
66.实施例61至65中任一项的方法，其包含重复步骤(h)及(i)至少一次，以确认该样品之行为与该模型相对应。
67.实施例61至66中任一项的方法，其包含重复步骤(j)及(k)1、2或3次。
68.实施例61至66中任一项的方法，其包含重复步骤(j)及(k)2或3次，且其中重复步骤(j)及(k)2或3次引起pH在pH最终_碱之0.05至0.10pH单位内。
69.实施例68的方法，其包含再一次重复步骤(j)及(k)以达到pH最终_ 碱。
70.实施例61至69中任一项的方法，其中pH酸_最终介于约3.0与3.8之间、介于约3.1与3.8之间、介于约3.2与3.8之间、介于约3.3与3.7之间、介于约3.4与3.7之间或介于约3.5与3.7之间。
71.实施例61至70中任一项的方法，其中pH最终_碱介于约5.3与8.5之间、介于约5.1与8.1之间、介于约5.5-8.0之间或介于约7.0与8.5之间。
72.实施例61至71中任一项的方法，其中该第一模型包含多项式。
73.实施例72的方法，其中该多项式包含：
74.实施例61至73中任一项的方法，其中该第二模型包含多项式。
75.实施例74的方法，其中该多项式包含：
归一化之滴定剂n＝12.256725-10.723277*pHn+3.3662386*pHn 2-0.4588175*pHn 3+0.0255417*pHn 4-0.0003153*pHn 5(等式21)。
76.实施例61至75中任一项的方法，其进一步包含针对pH计校准进行校正。
77.实施例61至76中任一项的方法，其中该样品之该pH使用***自该样品移除之子样品或分开取样之滑流中之pH探针来测量。
78.实施例61至77中任一项的方法，其中测量该样品之该pH不包括直接***该样品中之pH探针。
79.实施例61至78中任一项的方法，其中该样品包含所关注之蛋白质。
80.实施例79的方法，其中该所关注之蛋白质为治疗性蛋白质。
81.实施例79或80的方法，其中该所关注之蛋白质为抗体。
82.实施例79或80的方法，该所关注之蛋白质为受体Fc融合(TRAP)蛋白。
83.实施例61至82中任一项的方法，其中与pH藉由将pH计***该样品或自该样品抽取之连续滑流中来测量的方法相比，该方法提高达到该样品之最终pH的准确度。
84.实施例61至83中任一项的方法，其中与pH藉由***自该样品抽取之连续滑流中的pH计测量的方法相比，该方法减少样品废物。
85.实施例61至84中任一项的方法，其中所测量之样品pH与该模型之间的差值鉴别用于测量样品pH之pH计之校准中的误差。
86.实施例85的方法，其包含：
(a)重新校准该pH计；
(b)将额外量之滴定剂添加至该样品且测量额外pH；
(c)应用该模型且将归一化之滴定剂及pH与该模型进行比较；及
(d)当该pH与该模型相对应时，将剩余量之滴定剂添加至该样品以达到pH最终；
藉此防止由添加过多滴定剂至该样品对该所关注之蛋白质造成损伤。
87.一种设备，其配置成执行实施例1至86中任一项的方法。
88.实施例87的设备，其包含：
一反应器；
一pH流通槽，其包含一安置于其中之pH探针，该pH流通槽流体联通至该反应器，该pH流通槽配置成接收来自该反应器之取样滑流且测量该滑流之pH；
一酸滴定剂供应装置，其流体联通至该反应器，该酸滴定剂供应装置配置成向该反应器提供酸滴定剂，以降低该反应器中之pH；及/或
一碱滴定剂供应装置，其流体联通至该反应器，该碱滴定剂供应装置配置成向该反应器提供碱滴定剂，以增加该反应器中之pH。
89.一种设备，其包含：
一反应器；
一pH流通槽，其包含一安置于其中之pH探针，该pH流通槽流体联通至该反应器，该pH流通槽配置成接收来自该反应器之取样滑流且测量该滑流之pH；
一酸滴定剂供应装置，其流体联通至该反应器，该酸滴定剂供应装置配置成向该反应器提供酸滴定剂，以降低该反应器中之pH；及/或
一碱滴定剂供应装置，其流体联通至该反应器，该碱滴定剂供应装置配置成向该反应器提供碱滴定剂，以增加该反应器中之pH。
90.实施例88或89的设备，其进一步包含：
一取样泵，其配置成将该滑流自该反应器递送至该pH流通槽。
91.实施例88或89的设备，其进一步包含：
一废物接收器，其配置成接收来自该pH流通槽之流出物。
92.实施例88或89的设备，其进一步包含：
一酸滴定剂泵，其配置成自该酸滴定剂供应装置递送该酸滴定剂至该反应器；及
一酸滴定剂流量计，其配置成测量该酸滴定剂自该酸滴定剂供应装置至该反应器之流速。
93.实施例92的设备，其进一步包含：
一碱滴定剂泵，其配置成自该碱滴定剂供应装置递送该碱滴定剂至该反应器；及
一碱滴定剂流量计，其配置成测量该碱滴定剂自该碱滴定剂供应装置至该反应器之流速。
94.实施例93的设备，其进一步包含一控制器，该控制器与该酸滴定剂流量计、该碱滴定剂流量计、该pH探针、该酸滴定剂泵及该碱滴定剂泵通信。
95.实施例94的设备，其中该控制器配置成：
(a)接收来自该酸滴定剂流量计之一信号，藉此该控制器确定添加至该样品之酸滴定剂之量；
(b)接收来自该碱滴定剂流量计之一信号，藉此该控制器确定添加至该样品之碱滴定剂之量；
(c)接收来自该pH探针之一信号，藉此该信号传达pH测量值至该控制器，且该控制器将该pH测量值与添加至该样品之酸滴定剂或碱滴定剂之对应量相关联；
(d)发送一信号至该酸滴定剂泵以开启该泵、停止该泵或改变泵速度；及
(e)发送一信号至该碱滴定剂泵以开启该泵、停止该泵或改变泵速度。
96.实施例94或95的设备，其中该控制器与该取样泵通信，其中该控制器配置成发送一信号至该取样泵以开启该泵、停止该泵或改变泵速度。
97.实施例94至96中任一项的设备，其中该控制器配置成将模型应用于该pH测量值及添加至该样品之酸或碱滴定剂之对应量。
98.实施例94至97中任一项之实施例的设备，其中该控制器配置成当在该pH流通槽中测量之pH大于所需值时启动该酸滴定剂泵且添加预定数量之酸滴定剂，且该控制器经进一步组态以当在该pH流通槽中测量之该pH小于该所需值时启动该碱滴定剂泵且添加预定数量之碱滴定剂。
99.实施例94至98中任一项的设备，其中该控制器配置成当预定量之酸滴定剂已添加至该样品时发送一信号至该酸滴定剂泵以停止该泵，且当预定量之碱滴定剂已添加至该样品时发送一信号至该碱滴定剂泵以停止该泵。
100.实施例94至99中任一项的设备，其中该控制器配置成将该pH保持在所需值下一段时间。
101.实施例100的设备，其中该所需值随时间推移变化，与pH顺序一致。
102.实施例101的设备，其中该pH顺序适合于使可能存在于该反应器中之病毒失活。
103.实施例102的设备，其中该pH顺序包含
(a)将pH降低至介于约3.0与3.8之间、介于约3.1与3.8之间、介于约3.2与3.8之间、介于约3.3与3.7之间、介于约3.4与3.7之间或介于约3.5与3.7之间的第一目标pH，
(b)将该pH值保持在该第一目标pH下一段时间，
(c)将该pH升高至介于约5.3与8.5之间、介于约5.1与8.1、介于约5.5-8.0之间或介于约7.5与8.0之间的第二目标pH，及
(d)将该pH保持在该第二目标pH下。
104.实施例103的设备，其中在步骤(a)降低该pH或在步骤(c)升高该pH包含添加足以改变该样品之该pH的一或多种量之滴定剂且测量该样品之该pH。
105.实施例88至104中任一项的设备，其进一步包含：
一止回阀，其在该反应器与该pH流通槽之间流体联通，该止回阀配置成防止该反应器被来自该pH流通槽之回流污染。
106.实施例88至105中任一项的设备，其中该反应器不包括安置于其中之一pH测量探针。
107.实施例88至106中任一项的设备，其进一步包含安置于该反应器中之一混合器，其配置成在即将添加该酸滴定剂及/或该碱滴定剂时、添加该酸滴定剂及/或该碱滴定剂期间及/或之后混合该反应器中之内含物。
108.实施例107的设备，其中该控制器与该混合器通信，且其中该控制器配置成在开启该酸泵或该碱泵之前发送一信号至该混合器，启动该混合器。
109.实施例108的设备，其中该控制器配置成发送一信号至该混合器，藉此该混合器在停止该酸泵或碱泵之后停止固定时段。
110.实施例88至109中任一项的设备，其进一步包含用户接口(用户界面)，该用户接口配置成接收且显示来自该控制器之pH测量值。
111.实施例110的设备，其中该用户接口配置成发送一信号至该控制器，藉此该控制器发信号给该酸滴定剂泵或碱滴定剂泵，以向该样品添加预定体积之酸或碱滴定剂。
112.实施例110或111的设备，其中该用户接口配置成发送一信号至该控制器，藉此该用户可或发指令给该控制器在该pH顺序中前进一步骤。
113.实施例110至112中任一项的设备，其中该用户接口配置成接收来自该使用者之一或多个离线pH测量值，其中该一或多个离线pH测量值包含独立于安置于该pH流通槽中之该pH探针的该样品之pH测量值。
114.实施例88至113中任一项的设备，其中递送至该反应器之酸滴定剂或碱滴定剂之体积具有10％或更低之误差百分比。
实例
实例1：降低蛋白质溶液pH值之滴定的模型化
表达五种不同蛋白质之细胞在生物反应器中生长，且蛋白质分泌于细胞培养基中。在移除细胞及细胞碎片之初始收获步骤之后，使用蛋白A层析***捕集蛋白质，洗涤且洗脱。接着将含有部分纯化之蛋白质的洗脱液转移至自动化***以藉由将pH降低至3.6使病毒失活。
为测量pH，校准Mettler Toledo InPro 3253pH探针，接着在具有Kleenpak连接件之密封波纹管中经由高压釜或γ照射灭菌以使得能够与含有部分纯化之蛋白质溶液之池容器无菌连接。将pH探针***池容器中，且添加酸溶液直至获得3.6之目标pH。将pH探针直接***池容器中允许对滴定进行反馈控制以控制最终pH。在此实例中，连续给与滴定剂，且连续测量pH。
针对跨越5种不同蛋白质之11次病毒失活操作，测量pH对比所添加之碱的量，且绘制于图1中。在图1中，所添加之碱的量是以任何滴定剂添加之前容器中每千克产物之泵旋转数为单位来指示，且泵速度数据经时间迁移以考虑碱添加与pH响应之间的延迟。如图1中可见，所有滴定曲线之形状在视觉上相似。滴定曲线基本上为线性，观测到略微向下曲线。滴定曲线在X及Y截距方面亦不同。
将轴之线性变换应用于图1中所示之滴定曲线。
使用以下等式将Y轴(pH)变换成1→0之尺度(初始pH→最终pH)：
使用以下等式将X轴(所添加之酸)变换成0→1之尺度(初始→最终)：
引起各曲线上之2个点收敛之两条轴之线性变换应导致所有曲线收缩，如图2中所示。图2中所示之所得变换数据模型化产生二阶多项式：
归一化之pH v1＝1.0584433-1.0049047*归一化之滴定剂添加v1-0.214062*(归一化之滴定剂添加v1-0.56403)^2(等式3)。
多项式拟合之概述展示于下表1中：
表1.拟合之概述
R平方值 0.996943
R平方值调整 0.996936
均方根误差 0.017471
响应平均值 0.470191
观测(或权重和) 830
二次拟合之RMSE(均方根误差)＝0.0175归一化之pH单位，其以pH为单位大约为：初始及最终pH值在各操作之间略微变化。
实例2：升高蛋白质溶液之pH值之滴定的模型化
在病毒失活之后，使用与实例1中所描述相同的方法，藉由添加碱性溶液使溶液之pH升高至中性或接近中性之pH。
针对跨越7种不同蛋白质之12次病毒失活操作，测量pH对比所添加之碱的量，且绘制于图4中。在图4中，所添加之碱的量是以任何滴定剂添加之前容器中每千克产物之泵旋转数为单位来指示，且泵速度数据经时间迁移以考虑碱添加与pH响应之间的延迟。如图4中可见，曲线形状相似，其中一致反曲点大约为pH 6。此反曲点在X轴上之位置为可变的。
将轴之线性变换应用于图4中所示之滴定曲线。理论上，引起各曲线上之2个精选点收敛之线性变换应导致所有曲线收缩成单个曲线。初始方法是基于以上实例1中所述之酸滴定模型化。
在此第一方法中，使用以下等式将Y轴(pH)变换成0→1之尺度(初始pH→最终pH)：
使用以下等式将X轴(所添加之碱)变换成0→1之尺度(初始→最终)：
此变换之结果展示于图5中。如图5中可见，此初始归一化方法未引起碱滴定曲线在实例1中之酸滴定曲线之程度上收缩(比较图5与图2)。
对于此变化之一个解释为，虽然酸滴定之目标pH跨越蛋白质(蛋白质之间)是相同的(pH 3.6)，但碱滴定之目标pH在蛋白质之间不同，在7.7至8.0范围内，视蛋白质而定。因此，在归一化下滴定曲线之最终数据点不应收敛。
因此，第二种归一化方法考虑到滴定终点不应收敛。在此第二方法中，Y轴在时间＝0时设定为0，且接近但小于目标pH之pH 7.60设定为1。类似地，针对时间＝0，X轴固定于0，且针对达到pH 7.60所需之滴定剂之量，固定于1。
在此第二种方法中，使用以下等式将Y轴(pH)变换成0→1+之尺度(初始→pH7.60)：
使用以下等式将X轴(所添加之碱)变换成0→1+之尺度(初始→pH7.60)：
此第二次变换之结果展示于图6中。如图6中所示，在时间＝0及pH＝7.60之迫敛性实质上改良拟合。然而，两个滴定曲线仍偏离其余曲线。
此偏离可能由pH探针校准问题引起。举例而言，在密封袋中使用高压釜或γ照射对用于生成滴定曲线之pH探针进行灭菌。在校准后但在使用前进行灭菌，以便探针在校准与其进行第一次测量之时间之间干燥一段时间。pH探针之问题可能导致此两个滴定曲线偏离模型。所有pH滴定操作开始及结束时测量离线pH。亦即，在降低或升高pH之各次操作开始及结束时，自池移除少量蛋白质溶液，且用未进行灭菌之探针分开测量pH。如图7所示，与模型偏离最大之两次操作在初始在线及离线测量中亦显示最大差异，表明该问题最有可能由用于生成此两个滴定曲线之探针引起。
在线pH测量之问题可使用两个离线测量(初始及最终)藉由线性变换来校正。此相当于事后2点pH标准化。第三种归一化方法考虑(1)滴定终点不应收敛，及(2)在线测量与离线测量之间的差异。使用以下等式计算经校正之在线pH：
结果展示于图8中。如图8中所示，在线pH值之校正增加拟合。
使用第四种方法来进一步收紧拟合。因为不同操作具有略微不同之初始pH，所以迫使不同滴定曲线在2个中间点处收敛，而非如先前尝试中之单一中间点(pH 7.60)。迫使在2个中间点处收敛：pH 3.70及7.60。不需要pH值变换(Y轴)，因为迫使在2个固定pH值下收敛。使用以下计算，将所添加之碱之量(X轴)变换成约0→1+之尺度(pH 3.70→pH 7.60)：
结果展示于图10中。此经校正、经变换之数据集用于生成用于添加碱之模型(线，图10)。由于与酸添加滴定曲线相比，碱添加滴定曲线之曲线形状更复杂，所以拟合需要6+阶多项式：
pH(在线，校正)＝2.5460075+5.5157799*滴定剂-0.1694419*(滴定剂-0.63949)^2-11.009696*(滴定剂-0.63949)^3+2.1806629*(滴定剂-0.63949)^4+13.771715*(滴定剂-0.63949)^5-7.7443576*(滴定剂-0.63949)^6(等式11)。
(滴定剂值为来自等式10之归一化值)。
碱调整模型RMSE＝0.080pH单位。拟合之概述展示于下表2中。
表2.拟合之概述
R平方值 0.997091
R平方值调整 0.997069
均方根误差 0.079609
响应平均值 6.035137
观测(或权重和) 773
总体而言，实例1及2中所描述的方法使得能够藉由非连续滑流测量方法进行准确的自动pH调整。在调整pH值时可取少量样品，且pH模型用于以高度准确性确定应添加多少额外酸或碱来达到目标pH，且无需连续取样或测量。可利用少至一个实验数据集来开发用于模型化之滴定曲线。此方法亦使得能够滴定至训练数据集内之任何pH值。最后，可藉由添加额外中间取样点来提高pH控制准确度。
实例3：用于pH调整及控制之***的开发
开发一种***以在病毒失活期间测量pH，其使用***不连续滑流中之pH探针及将pH与添加至样品之滴定剂相关联的无因次模型。用于此***之部件之示例性清单展示于图11中。***之图式展示于图19-20中。
在该***之此实例中，酸及碱滴定剂添加至含有样品之反应容器各自由连接至SonotecCO.55超声波流量计之各别Watson Marlow 530泵控制。泵自连接至滴定剂袋之管接收滴定剂，接着经由流量计将滴定剂传送至反应容器。来自反应容器之取样管线经由止回阀连接至取样泵，该止回阀可用于在取样总成错误安装之情况下防止反应容器被污染。取样泵将样品自反应容器传送至其中插有pH探针之pH流通槽。pH探针连接至pH变送器。样品自流通槽传送至废物接收器。所有泵均连接至控制器，使得控制器之程序化控制逻辑可控制酸及碱滴定剂之体积及流速以及是否自反应容器抽取样品及抽取多少样品用于分析。
此***之优点包括以下。当探针***反应容器中时，探针在灭菌之后(且在***之前)无法校准。灭菌可影响探针校准曲线。在此***中，探针***单独流通槽中，且不需要灭菌。不需要高压釜或Kleenpak无菌连接孔口，且消除反应容器中之探针断裂或使探针溶液渗漏至蛋白质产物中的风险。取样泵及止回阀产生离散样品供pH测量，从而减少产品废物。***亦可经由取样管线连接至任何反应容器，且因此为高度可挠性的。
酸调整工作流程之实例展示于图12中。在包括探针校准及使流量计自动归零之装备设定之后，在酸滴定剂之任何添加之前自动进行初始pH测量，且将第一量之酸滴定剂添加至样品。添加体积使用来自流量计之反馈来控制。酸之此初始量通常为保守的，以确保目标pH不被超过。以恒定速率(反应容器中每千克蛋白质池的酸毫升数)添加酸，允许计算总初始添加体积。接着在已添加此初始添加中的全部体积之滴定剂之后自动测量pH，且将初始及所测量之pH值及经添加以得到第二pH值之酸的量馈入模型中以确定对应的无因次滴定剂添加值。选择介于最终目标pH与第一次添加滴定剂之后的pH之间的中间目标pH，且使用模型计算对应的无因次滴定剂添加值。根据下式计算需要添加至样品以达到此中间pH之无因次滴定剂之量：
在此式中，归一化之滴定剂总为在归一化后添加至样品以实现中间目标pH之总量，归一化之滴定剂初始为在归一化后添加至样品中以达到初始pH之滴定剂之量(此值在归一化前可为0)，且归一化之滴定剂n为添加至样品以达到第一中间pH之滴定剂之量，使用模型归一化。应注意，模型亦用于计算归一化之滴定剂初始。利用两个归一化之滴定剂以及添加之实际(因次)量之滴定剂，可在归一化之滴定剂与未归一化之滴定剂之间进行转换。添加第二体积之酸，重复此等步骤以验证模型及pH计之准确性，且接着添加最终体积之酸以达到目标pH。在保持低pH以使病毒失活之后，使用一系列类似步骤将pH调回中性。
用于升高pH之类似工作流程展示于图13中。在使流量计自动归零之后，将第一量之碱滴定剂添加至样品中，测量pH，且使用将所添加之碱之mL/kg与目标中性pH相关联的线性函数计算第一体积。将初始pH、所测量之pH及碱滴定剂之体积与模型拟合。添加第二体积之碱，重复此等步骤以验证模型及pH计之准确性，且接着添加最终体积之碱以达到目标pH。
在此等过程中，在各次测量之后，将滑流pH值与期望值进行比较。若所测量之pH超出预期范围，则提示使用者获取样品，以独立校准之pH计测量离线pH，且将离线值输入至模型中。若两个测量值相差>0.10pH单位，则用户应利用离线pH测量值完成过程，且使用保守体积及额外测量步骤完成过程。在酸调整步骤期间保守添加弥补先期自在线pH探针进行自动取样之pH测量的潜在不准确性。
虽然该过程仍为自动化，但代替在每次添加滴定剂后自动取样pH，用户界面提示用户取样，例如使用独立pH探针离线测量pH，且将离线值输入用户接口。换言之，若在调整步骤中间(例如在已进行第一次酸添加之后的酸调整期间)确定pH流通槽中之在线探针误校准，则使用保守添加及离线pH测量进行该调整步骤之剩余部分(例如酸调整)。在此情境下，碱调整亦使用无因次滴定模型进行，但用户应继续使用独立pH探针及输入用户界面中之离线pH值，而非测量流通槽中之pH值。将模型应用于离线pH值以结束pH顺序。
若差值≤0.10pH单位，则过程可使用滑流pH测量方法继续。过程步骤、体积计算方法及可接受之在线pH的概述展示于下表3中：
表3.在线pH之接受准则
表3适用于具有3个添加步骤之pH顺序。举例而言，若使用四次(或更多次)添加，则相对于最终pH，每次添加之目标pH应相应地调整。
实例4：用于在线过程中之pH计之校准
需要用当前***解决之一个问题为pH探针校准及如何在pH变送器(传送器)外部进行校准。工业pH变送器(例如Mettler Toledo M400)通常限于2点校准过程。然而，跨pH 2至10以确保准确性之4点校准为合乎需要的，且标准程序使用离线探针。
因此，开发用于在线探针之4点校准过程，接受与离线探针所接受之校准程序同等的校准程序。
开发一种校准程序，其在***之控制逻辑内进行(例如经由MATLAB)而非使用变送器校准函数。在此校准程序中，替代所计算之pH信号，变送器将原始探针mV及探针温度信号发送至控制器。控制逻辑引导用户完成校准步骤且记录各缓冲标准之mV及温度。使用以下校准接受准则：
斜率：95-105％
偏移：±(0-15mV)
温度：所有标准物均为20-25℃
线性测试：校准之后所有标准物在0.05pH单位内
在校准期间，亦在控制逻辑内计算温度补偿以考虑缓冲液标准物之pH之温度依赖性。亦在滴定过程期间之过程内测量期间计算温度补偿。
图14中展示示例性在线探针校准曲线。
实例5：在无pH归一化下用于pH调整之额外模型
开发将滴定剂与pH相关联之另一模型，其并未针对酸或碱添加使用pH归一化。
在此方法中，对于酸添加，自实例1中所述之历史滴定曲线选择两个pH值，其与滴定曲线之终点偏移。选择此等pH参考pH值(pH1及pH2)，以使得其尽可能相隔得远，同时仍为包括在每个参考滴定曲线上之pH值。接着藉由以下等式计算归一化滴定剂：
归一化之滴定剂＝(所添加之滴定剂-在参考pH1下添加之滴定剂)/(在参考pH2下添加之滴定剂-在参考pH1下添加之滴定剂)(等式12)。
对于酸滴定剂模型，参考pH1为4.1且参考pH2为3.7。对于碱滴定剂模型，参考pH1为3.7且参考pH2为7.6。
此归一化滴定剂在低于0至高于1之范围内。用于生成酸调整模型之数据集的范围为-0.76至1.49，其产生将酸滴定剂归一化之尺度。用于生成碱调整模型之数据集的范围为-0.06至1.53，其产生将碱滴定剂归一化之尺度。所用范围视数据集中初始及最终pH值之变化性而定。选择用于归一化之两个参考pH值尽可能相隔得远，同时保持在参考滴定曲线集合之界限内。此方法之一个优点为样品之最终pH可沿着由参考样品生成之滴定曲线在任何位置，只要其含在参考滴定曲线内即可。举例而言，用于酸调整之最终pH可大于或等于参考物之最终pH。类似地，用于碱调整之最终pH可小于或等于参考物之最终pH。
使用此归一化策略产生以下4阶多项式，用于在酸添加期间将酸滴定剂归一化：
归一化之酸滴定剂添加＝283.35764-279.43987*pH+104.25395*pH^2-17.257125*pH^3+1.0589067*pH^4
(等式13)。
使用类似模型5阶多项式用于在碱添加期间将碱滴定剂归一化：
归一化之碱滴定剂添加＝12.256725-10.723277*pH+3.3662386*pH^2-0.4588175*pH^3+0.0255417*pH^4-0.0003153*pH^5(等式14)。
在小规模蛋白质池上使用实例3中所描述的设备及此处所描述之模型以测试效能。测试滑流pH测量及超声波流量计准确性。来自五次测试操作之结果展示于图15中。对于五次测试操作中之每一个，按过程步骤之ΔpH及给与误差(％)绘制于图16中。
如图15中所示，对于所有添加步骤，在在线探针与离线探针之间观测到的pH差值为0.05或更小。除了第一次测试操作之最终碱添加以外，给与误差一般小于5％。图16展示来自图15之数据，其中在线pH与离线pH之间的差值在顶部且给与误差在底部，跨越病毒失活pH顺序绘制。给与误差为在各步骤添加之滴定剂之体积的误差，报导为目标体积与实际体积之间的差值％。
亦在测试操作中分析流通槽对pH探针效能之影响，其比较此方法中所用之在线探针、离线探针及在流通槽外部进行测量之在线探针。在此情况下，存在四个酸添加步骤，因为在第三酸添加步骤之后离线pH不在范围内。
对于三种探针条件中之每一个，将pH相对于滴定剂添加步骤绘制于图17中。在各滑流pH测量之后，在测试操作期间，自流通槽移出探针且直接***样品中以评估流通槽对测量之影响。如图17中所示，藉由流通槽中之在线探针、藉由流通槽外部之在线探针及藉由离线探针进行之pH测量展示良好对应。
使用55.1kg蛋白质池之测试操作中之一者的实时目测展示于图18中。
实例6：使用自动滴定***及模型添加3或4次之pH调整
实例3中所述之自动滴定***用于对18批次蛋白质进行低pH病毒失活，所述批次蛋白质代表7种不同蛋白质产物。使用未使用pH归一化之实例5中所述之模型将在pH调整过程期间滴定剂之量与pH相关联。在18批次蛋白质之病毒失活中，目标为当降低pH以使潜在病毒失活及在病毒失活之后将pH升回至中性时达成与最终目标pH相差小于0.10pH单位之pH。
当每个调整步骤添加3或4次酸或碱时，根据用于酸及碱调整步骤之离线参考探针，所有18批次蛋白质均满足与目标pH相差<0.10pH单位。结果展示于图21中，其绘制在酸(左)或碱(右)调整之后由离线参考探针测量之pH与目标pH之间的差值。酸或碱分别以3次添加(圆形)或4次添加(十字形)进行添加。用于病毒失活之目标酸pH介于3.50与3.60之间。病毒失活后之目标中和pH介于5.50与8.00之间，视蛋白质而定。
当每个调整步骤使用3次添加时，在添加酸或碱之后，所有蛋白质批次均在目标pH之<0.10pH单位内(图21)。然而，当在低pH病毒失活步骤之后将pH调至中性时，当每个调整步骤使用3次添加时，根据在线控制探针，在目标pH之小于0.05pH单位内之最终pH的更严格目标始终未满足(图22，右侧)。
实施4次添加策略以改良方法之准确性。使用此修订方法，第三次添加酸或碱将pH调至目标pH之0.05至0.10pH单位内。进行少量的第四次添加以准确达成目标pH。如图21及22中可见，4次添加策略提高方法之准确性，使得对于酸及碱调整步骤两者一致地达成在目标pH之0.05pH单位内之最终pH。如图22中可见，使用4次添加步骤策略调整pH之所有13批次符合根据在线探针之与目标相差小于0.05pH单位之目标。
自动化***亦能够在整个病毒失活过程中准确测量蛋白质样品之pH。当在各添加步骤确定由离线参考探针测量之pH与由在线控制探针测量之pH之间的差值时，发现151个离散pH测量中之147个在离线参考探针与***于流通槽中之在线控制探针之间的0.05pH单位差值内(图23)。因此，该模型能够准确地确定在各步骤添加之酸或碱的量，且对于任何给定添加步骤，***可添加需要量之酸或碱以在酸或碱滴定过程期间一致地产生在目标pH之0.05pH单位内的pH变化。
另外，自动化***能够准确地添加由模型确定之酸或碱滴定剂的体积。如图24中所示，133次添加中之133次添加之滴定剂体积具有小于10％误差。

Claims (55)

1.一种方法，其包含：
a.测量样品之初始pH(pH初始)；
b.将至少第一量之滴定剂(滴定剂n)添加至该样品且测量至少第一额外pH值(pHn)，滴定剂n为添加至该样品以达到pHn之滴定剂之量，其中pHn不同于pH初始；
c.应用模型来确定归一化之滴定剂初始量(滴定剂初始)及归一化之滴定剂n，其中该模型将添加至该样品之该归一化之滴定剂与该样品之pH相关联；及
d.确定待添加至该样品以达到目标pH(pHn+1)之滴定剂之另一额外量(滴定剂n+1)，pHn+1是藉由将全部量之滴定剂添加至该样品而达到的pH。
2.如权利要求1的方法，其包含将第二量之滴定剂(滴定剂n+2)添加至该样品且测量第二额外pH(pHn+2)，且重复步骤(c)及(d)。
3.如权利要求2的方法，其包含将第三量之滴定剂添加至该样品且测量第三额外pH，且重复步骤(c)及(d)。
4.如权利要求3的方法，其中将该第三量之滴定剂添加至该样品中引起pH在最终目标pH(pH最终)之0.05至0.10pH单位内。
5.如权利要求1至4中任一项的方法，其包含将第四量之滴定剂添加至该样品。
6.如权利要求1至5中任一项的方法，其中该方法包含不超过3或4次添加滴定剂以将该样品之该pH变为pH最终。
7.如权利要求1至6中任一项的方法，其包含：
(i)自至少一个参考样品生成至少一个参考滴定曲线，将添加至该参考样品之滴定剂之量与该参考样品之pH相关联；
(ii)任选地，将该至少一个参考滴定曲线归一化；及
(iii)生成该模型以拟合该至少一个参考滴定曲线。
8.如权利要求7的方法，其中生成该至少一个参考滴定曲线包含：
(i)测量该参考样品之初始pH(pH初始_参考)；
(ii)将一定量之滴定剂添加至该参考样品(滴定剂n_参考)且测量额外参考pH值(pHn_参考)，滴定剂n_参考为添加至该样品以达到pHn_参考之滴定剂之量，其中pHn_参考不同于pH初始_参考；
(iii)重复步骤(i)-(ii)直至，藉由将全部量之滴定剂添加至该参考样品(滴定剂总_参考)，该至少一个参考样品达到最终pH(pH最终_参考)；及
(iv)将所添加之滴定剂之量相对于该参考样品之pH绘图。
9.如权利要求7或8的方法，其中添加至该参考样品之滴定剂之量藉由以下来归一化：
归一化之滴定剂
其中滴定剂1_参考为添加至该参考样品以达到pH1_参考之滴定剂之量，且滴定剂2_参考为添加至该参考样品以达到pH2_参考之滴定剂之量。
10.如权利要求7至9中任一项的方法，其中该至少一个参考滴定曲线包含单个滴定曲线，且其中pH1_参考＝pH初始_参考，且pH2_参考＝pH最终_参考。
11.如权利要求7至9中任一项的方法，其中该至少一个参考滴定曲线包含复数个参考滴定曲线，其中各参考滴定曲线包含pH初始_参考及pH最终_参考，且其中：
a.pH1_参考为来自该复数个参考滴定曲线中之一者的pH初始_参考，
b.pH2_参考为来自该复数个参考滴定曲线中之一者的pH最终_参考，且
其中pH1_参考及pH2_参考经选择以涵盖值之最大差异，同时仍涵盖由所有该复数个参考滴定曲线覆盖的pH值。
12.如权利要求9至11中任一项的方法，其中该样品之该初始pH(pH初始)与pH1_参考大约相同，或其中该样品之该初始pH(pH初始)与pH1_参考不相同。
13.如权利要求9至12中任一项的方法，其中该样品之该最终pH(pH最终)与pH2_参考大约相同，或其中pH最终与pH2_参考不相同。
14.如权利要求9至13中任一项的方法，其中pH初始、pH初始_参考及pH1_参考大约相同，且其中pH最终、pH最终_参考及pH2_参考大体相同。
15.如权利要求1至14中任一项的方法，其中该样品之该最终pH(pH最终)小于该样品之该初始pH(pH初始)，且该滴定剂为酸。
16.如权利要求15的方法，其中pH1_参考介于约4.0与4.3之间，且任选地，其中pH1_参考为约4.1，且pH2_参考介于约3.4与3.9之间，且任选地，其中pH2_参考为约3.7。
17.如权利要求15或16的方法，其中pH初始介于约4.0至4.5之间、介于约4.1与4.5之间、介于约4.2与4.5之间、介于约4.3与4.5之间、介于约4.1与4.4之间或介于约4.2与4.4之间。
18.如权利要求15至17中任一项的方法，其中pH最终介于约3.0与3.8之间、介于约3.1与3.8之间、介于约3.2与3.8之间、介于约3.3与3.7之间、介于约3.4与3.7之间或介于约3.5与3.7之间。
19.如权利要求15至18中任一项的方法，其中该模型包含四阶多项式。
20.如权利要求1至19中任一项的方法，其中该样品之该最终pH(pH最终)大于该初始pH(pH初始)，且该滴定剂为碱。
21.如权利要求20的方法，其中pH1_参考介于约3.0与3.8之间或介于约之间、介于约3.1与3.8之间、介于约3.2与3.8之间、介于约3.3与3.7之间、介于约3.4与3.7之间或介于约3.5与3.7，且pH2_参考介于约5.3与8.5之间、介于约5.1与8.1之间、介于约5.5与8.0之间或介于约7.5与8.0之间。
22.如权利要求20或21的方法，其中pH初始介于约3.0与3.8之间、介于约3.1与3.8之间、介于约3.2与3.8之间、介于约3.3与3.7之间、介于约3.4与3.7之间或介于约3.5与3.7之间。
23.如权利要求20至22中任一项的方法，其中pH最终介于约5.3与8.5之间、介于约5.1与8.1之间、介于约5.5-8.0之间或介于约7.5与8.0之间。
24.如权利要求20至23中任一项的方法，其中该模型包含五阶多项式。
25.如权利要求1至24中任一项的方法，其进一步包含在测定该样品或该至少一个参考样品之pH值时针对pH计校准进行校正。
26.如权利要求1至25中任一项的方法，其中该样品包含第一所关注之蛋白质且该至少一个参考样品包含第二所关注之蛋白质。
27.如权利要求26的方法，其中该第一所关注之蛋白质及该第二所关注之蛋白质为糖基化蛋白质。
28.如权利要求27的方法，其中该第一所关注之蛋白质及该第二所关注之蛋白质各自为抗体或受体Fc融合(TRAP)蛋白。
29.如权利要求1至28中任一项的方法，其中该方法，与pH藉由将pH探针直接***该样品或自该样品抽取之连续滑流中来测量的方法相比，提高达到该样品之最终pH的准确度。
30.如权利要求1至29中任一项的方法，其中该方法，与pH藉由***自该样品抽取之连续滑流中的pH计来测量的方法相比，减少样品废物。
31.如权利要求1至30中任一项的方法，其中所测量之样品pH与该模型之间的差值鉴别用于测量样品pH之pH计之校准中的误差。
32.一种使样品中之病毒失活的方法，其包含：
a.提供在4.0或更大之初始pH(pH初始)下的样品；
b.将第一量之酸滴定剂(滴定剂n_酸)添加至该样品且测量第一额外酸pH值(pHn_酸)，滴定剂n_酸为添加至该样品以达到pHn_酸之滴定剂之量，其中该pHn_酸不同于该pH初始；
c.应用模型以确定归一化之滴定剂初始量(滴定剂初始)及归一化之滴定剂，其中该模型将归一化之添加至该样品之滴定剂与该样品之该pH相关联；
d.基于该归一化之滴定剂、pH及该模型，确定待添加至该样品以达到目标酸pH(pH酸_目标)之滴定剂之量；
e.将该滴定剂之量之滴定剂添加至该样品中以达到pH酸_目标；
f.重复步骤(d)及(e)直至达到最终酸pH(pH酸_最终)为止；
g.将该样品保持在pH最终_酸下足以使该病毒失活之时段；
h.将第一量之碱性滴定剂(滴定剂n_碱)添加至该样品且测量第一额外碱pH值(pHn_碱)，滴定剂n_碱为添加至该样品以达到pHn_碱之滴定剂之量，其中pHn_碱不同于该pH酸_最终；
i.藉由应用第二模型将滴定剂n_碱归一化；
j.基于归一化之滴定剂、pH及该模型，确定添加至该样品以将该样品之该pH变为目标碱性pH(pH目标_碱)之碱性滴定剂之量；
k.将该量之碱性滴定剂添加至该样品中以达到pH目标_碱；及
l.重复步骤(j)及(k)直至达到最终碱性pH(pH最终_碱)为止。
33.如权利要求32的方法，其包含重复步骤(b)及(c)至少一次以确认该样品之行为与该模型相对应。
34.如权利要求32的方法，其包含重复步骤(d)及(e)1、2或3次。
35.如权利要求32的方法，其包含重复步骤(d)及(e)2或3次，且其中重复步骤(b)及(c)2或3次引起pH在pH酸_最终之0.05至0.10pH单位内。
36.如权利要求35的方法，其包含再一次重复步骤(d)及(e)以达到pH酸_最终。
37.如权利要求32至36中任一项的方法，其包含重复步骤(h)及(i)至少一次，以确认该样品之行为与该模型相对应。
38.如权利要求32至36中任一项的方法，其包含重复步骤(j)及(k)1、2或3次。
39.如权利要求32至36中任一项的方法，其包含重复步骤(j)及(k)2或3次，且其中重复步骤(j)及(k)2或3次引起pH在pH最终_碱之0.05至0.10pH单位内。
40.如权利要求39的方法，其包含再一次重复步骤(j)及(k)以达到pH最终_碱。
41.如权利要求32至40中任一项的方法，其中pH酸_最终介于约3.0与3.8之间、介于约3.1与3.8之间、介于约3.2与3.8之间、介于约3.3与3.7之间、介于约3.4与3.7之间或介于约3.5与3.7之间。
42.如权利要求32至41中任一项的方法，其中pH最终_碱介于约5.3与8.5之间、介于约5.1与8.1之间、介于约5.5与8.0之间或介于约7.0与8.5之间。
43.如权利要求32至42中任一项的方法，其中该第一模型包含多项式。
44.如权利要求32至43中任一项的方法，其进一步包含针对pH计校准进行校正。
45.如权利要求32至44中任一项的方法，其中该样品包含所关注之蛋白质。
46.如权利要求45的方法，其中该所关注之蛋白质为治疗性蛋白质。
如权利要求44或45的方法，其中该所关注之蛋白质为抗体或受体Fc融合(TRAP)蛋白。
47.如权利要求32至46中任一项的方法，其中该方法，与pH藉由将pH计***该样品或自该样品抽取之连续滑流中来测量的方法相比，提高达到该样品之最终pH的准确度。
48.如权利要求32至47中任一项的方法，其中该方法，与pH藉由***自该样品抽取之连续滑流中的pH计来测量的方法相比，减少样品废物。
49.如权利要求32至48中任一项的方法，其中所测量之样品pH与该模型之间的差值鉴别用于测量样品pH之pH计之校准中的误差。
50.一种设备，其配置成执行如权利要求1至49中任一项的方法。
51.一种设备，其包含：
反应器；
pH流通槽，其包含安置于其中之pH探针，该pH流通槽流体联通至该反应器，该pH流通槽配置成接收来自该反应器之取样滑流且测量该滑流之pH；
酸滴定剂供应装置，其流体联通至该反应器，该酸滴定剂供应装置配置成向该反应器提供酸滴定剂，以降低该反应器中之pH；及
碱滴定剂供应装置，其流体联通至该反应器，该碱滴定剂供应装置配置成向该反应器提供碱滴定剂，以增加该反应器中之pH。
52.如权利要求51的设备，其进一步包含：
取样泵，其配置成将该滑流自该反应器递送至该pH流通槽；
废物接收器，其配置成接收来自该pH流通槽之流出物；
酸滴定剂泵，其配置成自该酸滴定剂供应装置递送该酸滴定剂至该反应器；
酸滴定剂流量计，其配置成测量该酸滴定剂自该酸滴定剂供应装置至该反应器之流速；
碱滴定剂泵，其配置成自该碱滴定剂供应装置递送该碱滴定剂至该反应器；及
碱滴定剂流量计，其配置成测量该碱滴定剂自该碱滴定剂供应装置至该反应器之流速。
53.如权利要求51或52的设备，其进一步包含控制器，该控制器与该酸滴定剂流量计、该碱滴定剂流量计、该pH探针、该酸滴定剂泵及该碱滴定剂泵通信。
54.如权利要求53的设备，其中该控制器配置成：
(a)接收来自该酸滴定剂流量计之信号，藉此该控制器确定添加至该样品之酸滴定剂之量；
(b)接收来自该碱滴定剂流量计之信号，藉此该控制器确定添加至该样品之碱滴定剂之量；
(c)接收来自该pH探针之信号，藉此该信号传达pH测量值至该控制器，且该控制器将该pH测量值与添加至该样品之酸滴定剂或碱滴定剂之对应量相关联；
(d)发送信号至该酸滴定剂泵以开启该泵、停止该泵或改变泵速度；及
(e)发送信号至该碱滴定剂泵以开启该泵、停止该泵或改变泵速度，其中该控制器配置成将模型应用于该pH测量值及添加至该样品之酸或碱滴定剂之对应量。
55.如权利要求51至54中任一项的设备，其中递送至该反应器之酸滴定剂或碱滴定剂之体积具有10％或更低之误差百分比。
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