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ERFINDUNGSGEBIET
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Vorliegende
Erfindung befaßt
sich im allgemeinen mit Verfahren zur Behandlung eines Säugetiers
mit einem Krankheitsbild, das mit unerwünschter Zellproliferation verbunden
ist, einschließlich
Krebs.
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ERFINDUNGSHINTERGRUND
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Mitglieder
der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-Familie von Zytokinen sind an einer
sich ständig
erweiternden Reihe von entscheidenden biologischen Funktionen beteiligt.
Jedes Mitglied der TNF-Familie agiert über die Bindung an eines oder
mehrere Mitglieder einer parallelen Familie von Rezeptorproteinen,
nämlich der
TNF-Rezeptor-Proteinfamilie. TNF-Rezeptoren
wiederum signalisieren intrazellulär, um eine große Anzahl physiologischer
oder entwicklungsbiologischer Antworten auszulösen. Viele TNF-Rezeptor-Signale
beeinflussen das Zellschicksal und lösen oft die endgültige Zelldifferenzierung
aus. Beispiele für
Zelldifferenzierung sind Proliferation, Reifung, Zellwanderung und
-tod.
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In
US-Patent Nr. 5,969,102 wird TACI (Transmembran-Aktivator-CAML-Interaktor-Protein) beschrieben,
ein neuartiges Mitglied der TNF-Familie von Rezeptorproteinen. Der
mit TACI korrespondierende Ligand aus der TNF-Familie war jedoch
nicht bekannt.
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Die
vorliegende Erfindung offenbart, daß das TNF-Familienmitglied
APRIL, das in WO 99/12965 beschrieben wird, ein Ligand für TACI ist.
Eine weitere Entdeckung im Rahmen dieser Erfindung ist, daß TACI-Reagentien
besonders nützlich
sind für
die Behandlung eines Säugetiers
mit einem Krankheitsbild, das mit unerwünschter Zellproliferation verbunden
ist, einschließlich
z.B. Krebs.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Vorliegende
Erfindung befaßt
sich mit der Verwendung eines TACI-Reagens' zur Herstellung eines Medikaments zur
Vorbeugung oder Behandlung eines festen Tumors, wobei das Medikament
die mittlere Überlebenszeit
verlängert
und/oder die Größe eines
festen Tumors vermindert, wobei das TACI-Reagens die Ligandenbindung
an TACI verstärken
oder vermindern kann und wobei das TACI-Reagens ein Fusionspolypeptid
ist, das mindestens zwei Segmente umfaßt, wobei ein erstes Segment
ein TACI-Polypeptid oder ein Fragment davon umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus:
- (a) Aminosäureresten 1–166 von SEQ ID NO:1;
- (b) Aminosäureresten
1–160
von SEQ ID NO:1;
- (c) Aminosäureresten
1–114
von SEQ ID NO:1;
- (d) Aminosäureresten
32–114
von SEQ ID NO:1;
- (e) einem Polypeptid mit mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität mit Aminosäureresten
1–166
von SEQ ID NO:1;
- (f) einem Polypeptid mit mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität mit Aminosäureresten
1–160
von SEQ ID NO:1;
- (g) einem Polypeptid mit mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität mit Aminosäureresten
1–114
von SEQ ID NO:1; und
- (h) einem Polypeptid mit mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität mit Aminosäureresten
32–114
von SEQ ID NO:1, und
ein zweites Segment ein Immunglobulinpolypeptid
umfaßt.
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Solche
festen Tumoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Krebs und insbesondere
Nierenzellkrebs, Kaposi-Sarkom, Prostatakrebs, Brustkrebs, Sarkom,
Ovarialkarzinom, Rektalkrebs, Halskrebs, Melanom, Kolonkrebs, Blasenkrebs,
Mastozytom, Lungenkrebs, Mamma-Adenokarzinom, Rachenplattenepithelkarzinom,
Gastrointestinalkrebs und Magenkrebs.
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Es
sollte klar sein, daß die
voranstehende Beschreibung und die nachfolgende detaillierte Beschreibung
Beispiel- und Erklärungscharakter
haben, und dafür
gedacht sind, die beanspruchte Erfindung näher zu erklären.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Die
begleitenden Zeichnungen sind beigefügt, um zu einem tieferen Verständnis der
Erfindung beizutragen, und sind in die Beschreibung inkorporiert
und bilden einen Teil davon, illustrieren mehrere Ausführungsformen
der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung zur Erklärung der
Grundgedanken der Erfindung.
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1 ist
eine schematische Darstellung der Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NO:2) einer
cDNA für
humanes TACI und der davon abgeleiteten Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:1), wie
in Vektor pCA336 kloniert.
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2 ist
eine schematische Darstellung des Nukleinsäuresequenz-Inserts in pJST552,
das für
am N-Terminus FLAG-getaggtes humanes Vollängen-TACI kodiert, und der
davon abgeleiteten Aminosäuresequenz.
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3 ist
eine schematische Darstellung der DNA-Sequenz (SEQ ID NO:5) und
der davon abgeleiteten Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO:6) der extrazellulären
Domäne
von TACI mit einer verkürzten,
mit humanem IgG-Fc fusionierten Stelzenregion. Dies wurde als Plasmid
pJST572 kloniert. Die Signalsequenz aus murinem IgG-Kappa, Nukleotide
1–69 (Aminosäuren 1–23), wurde
im Leseraster mit der extrazellulären Domäne von humanem TACI (Aminosäuren 1–114 von
SEQ ID NO:1) als Nukleotide 70–411
fusioniert (Aminosäuren 24–137), die
im Leseraster als Nukleotide 412–1098 (Aminosäuren 138–366) mit
hIgG1-Fc fusioniert wurde. Die vorhergesagte Signalpeptid-Spaltstelle
befindet sich nach Aminosäure
20.
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4 ist
eine schematische Darstellung der DNA-Sequenz (SEQ ID NO:7) und
der davon abgeleiteten Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO:8) der extrazellulären
Domäne
von TACI mit einer verkürzten
nach dem zweiten Methionin beginnenden Stelzenregion, fusioniert
mit humanem IgG-Fc. Dies wurde als Plasmid pJST591 kloniert. Die
Signalsequenz aus murinen IgG-Kappa, Nukleotide 1–66 (Aminosäuren 1–22), wurde im
Leseraster mit der extrazellulären
Domäne
von humanem TACI (Aminosäuren
32–114
von SEQ ID NO:1) als Nukleotide 67–315 fusioniert (Aminosäuren 23–105), die
im Leseraster als Nukleotide 316–1002 (Aminosäuren 106–334) mit
hIgG1-Fc fusioniert wurde. Die vorhergesagte Signalpeptid-Spaltstelle
befindet sich nach Aminosäure
20.
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5 ist
eine schematische Darstellung der Nukleinsäuresequenz und der davon abgeleiteten
Aminosäuresequenz
der gesamten extrazellulären
Domäne
von TACI, fusioniert an eine humane IgG-Fc-Sequenz, wie in Plasmid
PS882 kloniert, worin sich eine kurze Hämagglutinin (HA)-Signalsequenz
im Leseraster mit dem nativen Methionin (Aminosäure 18) und der Sequenz der
extrazellulären
Domäne
von TACI bis Aminosäure 177
(Valin, das Aminosäure
160 von TACI ist) befindet, nach der sich im Leseraster ein humanes
IgG-Fc-Konstrukt befindet.
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6 ist
eine schematische Darstellung der Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NO:4) und
der davon abgeleiteten Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO:3) eines myc-getaggten murinen APRIL-Konstrukts zur Expression
in Pichia-pastoris-Zellen, wie in Plasmid pCMM276 kloniert, einschließlich der
Alpha-mating-factor-Signalsequenz, die abgespalten wird; des myc-Epitops
(die ersten 11 Aminosäuren
nach der Signalsequenz; unterstrichen); einer kurzen Linker-Region
(die nächsten
8 Aminosäuren);
und der löslichen
extrazellulären
Domäne der
für murines
APRIL kodierenden Sequenz ab Aminosäure 20, die ein Alanin ist,
bis zum ersten Stop-Codon.
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7 ist
eine schematische Darstellung der Nukleinsäuresequenz der FLAG-getaggten löslichen
extrazellulären
Domäne
von murinen APRIL, und der korrespondierenden Aminosäuresequenz,
wie in den Säuger-Expressionsplasmid
PS784 kloniert (auch als LT032 bekannt), worin es eine HA-Signalsequenz
(im Kasten), das FLAG-Epitop (unterstrichen), eine kurze Linker-Sequenz
und dann eine lösliche
murine APRIL-Sequenz gibt (der Pfeil, der am Alanin beginnt).
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8 ist eine schematische Darstellung von
gereinigtem myc-getaggtem murinen APRIL, das an TACI-transfizierte
Zellen bindet. 293EBNA-Zellen wurden mit dem Expressionsplasmid
pJST552 transfiziert, das FLAG-getaggtes humanes Vollängen-TACI
exprimierte. Die Zellen wurden 48 Stunden später unter Verwendung von 5
mM EDTA geerntet und mit myc-getaggtem murinem APRIL bei verschiedenen
Konzentrationen angefärbt.
Keine Proteinkontrolle wurde von Detektionsreagentien angefärbt (Kaninchen-anti-Maus-APRIL und
Esel-anti-Kaninchen-PE (Jackson-Immunoresearch). Das Anfärben von
Protein, für
das das kotransfizierte GFP-Expressionsplasmid kodiert, in FL1 zeigt
die Effizienz der Expression.
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9 ist
eine schematische Darstellung der DNA-Sequenz der FLAG-getaggten
löslichen
extrazellulären
Domäne
von humanem APRIL (SEQ ID NO:9) und der korrespondierenden Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO:10), wie in den Säuger-Expressionsvektor
LT033 kloniert. Dieses Konstrukt enthält ein HA-Signalsequenz-Tag
(im Kasten), das FLAG-Epitop-Tag (unterstrichen) und eine kurze
Linker-Sequenz, die an lösliches humanes
APRIL fusioniert ist (Pfeil, beginnend beim Alanin).
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10 ist
eine Darstellung von Western-Blots, der die Immunpräzipitation
von FLAG-getaggtem murinem APRIL mit humanem TACI(1–160)-Ig
(hTACI(1–160)-Ig)-Fusionsprotein zeigt. 10A ist eine Darstellung eines Western-Blots,
der das Ponceau-S-Färben
von Proteinbeladungen für
die Liganden zeigt. 10B ist eine Darstellung
eines Western-Blots, der durch Sichtbarmachung des IgG-Fc-Teils
die bei den Immunpräzipitationen
verwendete Menge an hTACI(1–160)-Ig
zeigt. 10C ist eine Darstellung eines
Western-Blots, der zeigt, daß nur
APRIL mit hTACI(1–160)-Ig
immunpräzipitierte,
wie durch Sichtbarmachung des FLAG-Tags bewiesen wurde.
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11 zeigt
die Ergebnisse der in-vivo-Hemmung des Tumorwachstums von HT29-Kolonadenokarzinom-Zellen
durch hTACI(1–114)-Ig.
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12 zeigt
die Ergebnisse der in-vivo-Hemmung des Tumorwachstums von A594-Lungenkarzinom-Zellen
durch hTACI(1–114)-Ig.
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13 zeigt eine Histogramm-Überlagerung
der hTACI(1–114)-Ig-
und hTACI(32–114)-Ig-Bindung an
Zellen, die stabil murines APRIL auf der Oberfläche exprimieren.
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14 zeigt
das Diagramm einer ELISA-Analyse, die die Bindung von murinem und
humanem APRIL an hTACI(32–114)-Ig
zeigt.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Es
wurde jetzt unerwarteterweise entdeckt, daß TACI ein Rezeptor für APRIL
(A Proliferation Inducing Ligand – ein proliferationsinduzierender
Ligand) ist. Es ist auch eine unerwartete Entdeckung der vorliegenden Erfindung,
daß TACI-Reagentien
für die
Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetiers
mit einem Krankheitsbild, das mit festen Tumoren verbunden ist,
verwendet werden können.
Ein solches Medikament erhöht
die mittlere Überlebenszeit
jenes Säugetiers
um etwa 10%, 15%, 20%, 25% oder mehr, verglichen mit der Nichtverabreichung
des Medikaments bei jenem Krankheitsbild. Des weiteren ist es eine
unerwartete Entdeckung der vorliegenden Erfindung, daß die Medikamente
zur Verringerung der Größe eines
sich in oder auf einem Säugetier
befindenden Tumors verwendet werden können, wobei jenes Medikament
die Größe jenes
Tumors um etwa 10%, 15%, 20%, 25% oder mehr verringert, verglichen
mit der Nichtverabreichung des Medikaments.
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Wie
hierin verwendet, bezeichnet „behandeln" oder „Behandlung" eine Vorgehensweise
zur Erlangung günstiger
oder erwünschter
klinischer Resultate. Günstige
oder erwünschte klinische
Resultate umfassen für die
Zwecke dieser Erfindung, sind aber nicht beschränkt auf eins oder mehrere der
folgenden: Linderung von Symptomen, Verringerung des Ausmaßes der
Erkrankung, ein stabilisierter (d.h. sich nicht verschlechternder) Krankheitszustand,
Verhinderung der Ausbreitung (z.B. Metastasierung) der Krankheit,
Verhinderung des Auftretens oder Wiederauftretens der Krankheit,
Verzögerung
oder Verlangsamung des Fortschreitens der Krankheit, Besserung des
Krankheitszustands und Rückgang
(sei es partiell oder vollständig).
Ebenfalls von „Behandlung" umfaßt ist eine
Reduktion pathologischer Folgen eines Krankheitsbilds, das mit unerwünschter
Zellproliferation, einschließlich
insbesondere Krebs, verbunden ist.
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Wie
hierin verwendet, bezeichnet „Säugetier" irgendein Säugetier
einschließlich
Menschen, Rinder, Pferde, Hunde, Ratten, Mäuse und Katzen. In bevorzugten
Ausführungsformen
der Erfindung ist das Säugetier ein
Mensch.
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„Ein Krankheitsbild,
das mit unerwünschter
Zellproliferation verbunden ist",
wie hierin verwendet, umfaßt,
ist aber nicht beschränkt
auf insbesondere Krebs, Krankheitsbilder, die mindestens einen festen
Tumor umfassen, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Nierenzellkrebs, Kaposi-Sarkom, Brustkrebs, Sarkom, Ovarialkarzinom,
Rektalkrebs, Halskrebs, Melanom, Kolonkrebs, Blasenkrebs, Mastozytom,
Lungenkrebs, Mamma-Adenokarzinom,
Rachenplattenepithelkarzinom, Gastrointestinalkrebs oder Magenkrebs.
Vorzugsweise ist der Krebs ein Mastocytom, Melanom, Lymphom, Mamma-Adenokarzinom, Prostata-
und Brustkrebs. Ebenso in Betracht gezogen werden andere Krankheitsbilder,
die mit unerwünschter
Zellproliferation verbunden sind, umfassend, aber nicht beschränkt auf
zelluläre
Hyperproliferation (Hyperplasie), ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus z.B. Sklerodermie, Pannusbildung bei rheumatoider Arthritis,
postoperative Narbenbildung und Lungen-, Leber- und Gebärmutterfibrose.
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Wie
hierin verwendet, bedeutet „Verabreichen", daß das Medikament
allein oder in Kombination mit anderen pharmazeutischen Wirkstoffen
verabreicht werden und mit einem dafür physiologisch akzeptablen Träger kombiniert
werden kann. Die wirksame Menge und das Verabreichungsverfahren
des jeweiligen Medikaments kann je nach dem individuellen Säugetier,
der Phase der Erkrankung und weiteren Faktoren, die dem Fachmann
offenbar sind, variieren. Der/die Verabreichungsweg(e), die für die jeweilige
Anwendung vorteilhaft sind, sind dem Fachmann bekannt.
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Verabreichungwege
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf topisch, transdermal, parenteral, gastrointestinal, transbronchial
und transalveolar. Topische Verabreichung wird mittels einer topisch
angewendeten Creme, eines Gels, einer Spülung etc. durchgeführt, die
ein Oligonukleotid-Konjugat enthalten. Transdermale Verabreichung
wird erreicht durch Anwendung einer Creme, einer Spülung, eines
Gels etc., das dem Medikament erlaubt, die Haut zu durchdringen
und den Blutkreislauf zu erreichen. Parenterale Verabreichungswege
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf elektrische oder direkte Injektion wie direkte Injektion in
eine zentrale Vene, intravenöse,
intramuskuläre,
intraperitoneale oder subkutane Injektion. Gastrointestinale Verabreichungswege
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Verschlucken und rektale Verabreichung. Transbronchiale und
transalveolare Verabreichungswege umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
Inhalation, sei es über
den Mund oder intranasal.
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Eine „wirksame
Menge", wie hierin
verwendet, ist eine Menge, die ausreicht, günstige oder erwünschte klinische
Resultate zu bewirken (Stites et al., BASIC & CLINICAL IMMUNOLOGY, Lange Medical
Publications, Los Altos, Kalifornien, 1982). Eine wirksame Menge
kann in einer oder mehreren Verabreichungen wie hierin beschrieben
verabreicht werden. Für
die Zwecke dieser Erfindung ist eine wirksame Menge eines ein TACI-Reagens
umfassenden Medikaments eine Menge, die ausreicht, um die mittlere Überlebenszeit
eines Säugetiers um
mindestens 10%, alternativ 15%, 20% oder 25%, zu verlängern, verglichen
mit der mittleren Überlebenszeit bei
Nichtverabreichung jenes Medikaments. Die Detektion und die Messung
von Indikatoren für
die Wirksamkeit basieren grundsätzlich
auf der Messung von klinischen Symptomen, die mit dem Krankheitszustand
verbunden sind, wie eine erhöhte
durchschnittliche Lebenserwartung nach Behandlung mit einem ein
TACI-Reagens umfassenden Medikament.
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Eine
wirksame Menge eines ein TACI-Reagens umfassenden Medikaments zur
Reduktion der Größe eines
Tumors in oder auf einem Säugetier
ist eine Menge, die ausreicht, die Tumorgröße in oder auf einem Säugetier
um mindestens 10%, alternativ 15%, 20% oder 25% mehr zu reduzieren
als bei einer Nichtverabreichung jenes Medikaments. Verfahren zur
Messung der Tumorgröße in einem
Säugetier
sind den Fachleuten bekannt und können, wenn der Tumor sich auf
der äußeren Oberfläche eines
Säugetiers
befindet, mit nichtinvasiven Verfahren gemessen werden, umfassend,
aber nicht beschränkt
auf die Verwendung eines Mikrometers zur Messung des Tumordurchmessers.
Befindet sich der Tumor im Inneren des Säugetiers, so kann man alternativ
MRI zur Messung des Tumordurchmessers verwenden. Invasive Verfahren
umfassen das operative Entfernen des Tumors aus dem Säugetier
und das Wiegen des Tumors und das Vergleichen der Tumorgröße mit dem
Zustand vor der Behandlung mit dem ein TACI-Reagens umfassenden
Medikament.
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Wie
hierin verwendet, bezeichnet „ein
TACI-Reagens" die
Reagentien, die beeinflussen können,
wie das TACI-Signal innerhalb der Zelle interpretiert wird, einschließlich antagonistischer
TACI-Reagentien, die die Ligandenbindung an TACI vermindern können, einschließlich z.B.
TACI-Fusionsproteinen wie TACI-IgG-Fc. Auch in Betracht gezogen
werden agonistische TACI-Reagentien, die die Ligandenbindung an
TACI vermehren können,
einschließlich
etwa Antikörpern
gegen TACI wie monoklonalen anti-TACI-Antikörpern. Der Ausdruck Fc-Domäne bezieht
sich auf einen Teil des Moleküls,
der die Scharnier-, CH2- und CH3-Domänen umfaßt, jedoch der Antigenbindestellen
entbehrt. Der Ausdruck. soll die äquivalenten Regionen eines
IgG-, eines IgM- und anderer Antikörper-Isotypen umfassen.
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Wie
hierin verwendet, bedeutet „die
mittlere Überlebenszeit
erhöhen", daß die durchschnittliche
Lebenserwartung, die mit einem bestimmten Krankheitsbild verbunden
ist, das mit unerwünschter
Zellproliferation verbunden ist, im Durchschnitt erhöht wird.
Den Fachleuten bekannt ist die durchschnittliche Lebenserwartung
bei verschiedenen Arten von Krebs in verschiedenen Arten von Säugetieren,
einschließlich
verschiedener Krebsarten in Menschen und verschiedener Krebsarten
in Nagetieren, einschließlich
Mäusen.
Weiterhin, wie hierin verwendet, bedeutet eine erhöhte mittlere Überlebenszeit
von z.B. etwa 10% oder mehr, verglichen mit der mittleren Überlebenszeit
bei Nichtverabreichung eines ein TACI-Reagens umfassenden Medikaments
z.B., daß jenes
Medikament bei einem menschlichen Patienten mit einer Krebsart mit
einer Überlebenszeit
von etwa 365 Tagen (1 Jahr) bei Nichtbehandlung die durchschnittliche
Lebenserwartung um etwa 10% von 365 Tagen oder mehr auf insgesamt
etwa 400 Tage gesamten Überlebens
steigert.
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„Lösliches
TACI-Reagens" bezeichnet
eine lösliche
Form eines TACI-Proteins oder -Polypeptidfragments, in dem die Transmembrandomäne abgespalten
oder so mit üblichen
biochemischen oder DNA-Rekombinations-Verfahren mutiert wurde, daß sie löslich ist.
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Daher
bietet die Erfindung die Verwendung eines TACI-Reagens' zur Herstellung
eines Medikaments zur Vorbeugung oder Behandlung eines festen Tumors,
wobei das Medikament die mittlere Überlebenszeit verlängert und/oder
die Größe eines
festen Tumors vermindert, wobei das TACI-Reagens die Ligandenbindung
an TACI verstärken
oder vermindern kann und wobei das TACI-Reagens ein Fusionspolypeptid
ist, das mindestens zwei Segmente umfaßt, wobei ein erstes Segment
ein TACI-Polypeptid oder ein Fragment davon umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus:
- (a) Aminosäureresten 1–166 von SEQ ID NO:1;
- (b) Aminosäureresten
1–160
von SEQ ID NO:1;
- (c) Aminosäureresten
1–114
von SEQ ID NO:1;
- (d) Aminosäureresten
32–114
von SEQ ID NO:1;
- (e) einem Polypeptid mit mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität mit Aminosäureresten
1–166
von SEQ ID NO:1;
- (f) einem Polypeptid mit mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität mit Aminosäureresten
1–160
von SEQ ID NO:1;
- (g) einem Polypeptid mit mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität mit Aminosäureresten
1–114
von SEQ ID NO:1; und
- (h) einem Polypeptid mit mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität mit Aminosäureresten
32–114
von SEQ ID NO:1, und
ein zweites Segment ein Immunglobulinpolypeptid
umfaßt.
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Die
beanspruchte Erfindung umfaßt
in gewissen Ausführungsformen
die Verwendung von Fragmenten von TACI, die an APRIL binden können. Fragmente
von TACI können
auf verschiedene Arten hergestellt werden, z.B. rekombinant, durch
PCR, proteolytischen Verdau oder durch chemische Synthese. Interne
oder terminale Fragmente eines Polypeptids können durch Entfernen eines
oder mehrerer Nukleotide von einem Ende oder beiden Enden einer
für das
Polypeptid kodierenden Nukleinsäure
erzeugt werden. Die Expression der mutagenierten DNA ergibt Polypeptidfragmente.
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Polypeptidfragmente
können
auch chemisch mittels im Fachgebiet bekannten Verfahren wie konventioneller
Merrifield-Festphasen-Fmoc- oder -Tboc-Chemie synthetisiert werden.
Zum Beispiel können
Peptide und DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung beliebig in
Fragmente gewünschter
Länge ohne Überlappung
der Fragmente geteilt werden, oder in überlappende Fragmente gewünschter
Länge geteilt
werden. Verfahren wie diese werden weiter unten detaillierter beschrieben.
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Lösliche Formen
von TACI können
oft wirksam signalisieren und daher als Wirkstoff verabreicht werden,
der nun die natürliche
membranständige
Form imitiert. Es ist möglich,
daß hierin
beschriebene TACI von Natur aus als lösliche Cytokine sekretiert
werden; wenn nicht, kann man jedoch das Gen so modifizieren, daß die Sekretion
erzwungen wird. Um eine lösliche
sekretierte Form von TACI zu erzeugen, würde man die N-terminalen Transmembranregionen
und einen Teil der Stelzenregion auf DNA-Stufe entfernen, und sie
mit einer Typ-I-Leit- oder alternativ einer Typ-II-Leit-Sequenz
ersetzen, die eine wirksame proteolytische Spaltung im gewählten Expressionssystem
erlaubt. Ein Fachmann könnte
die Größe der im
Sekretions-Expressionskonstrukt verbleibenden Stelzenregion variieren,
um sowohl Ligandenbindungseigenschaften als auch die Sekretionsfähigkeit
zu optimieren. Zum Beispiel könnten
Konstrukte mit allen möglichen
Stelzenlängen
(d.h. N-terminale Verkürzungen)
hergestellt werden. In gewissen Ausführungsformen werden Proteine,
die bei Aminosäuren
1 bis 32 beginnen, hergestellt. Die Stelzensequenz optimaler Länge würde sich
aus dieser Art von Analyse ergeben.
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„Im wesentlichen
rein" oder „im wesentlichen
gereinigt" bezeichnet
eine Verbindung (z.B. eine Nukleinsäure oder ein Protein), die
von Komponenten (z.B. Nukleinsäuremolekülen, Proteinen,
Lipiden und/oder Kohlehydraten), die sie in natura begleiten, getrennt
wurde. Wasser, Puffer und andere Kleinmoleküle (z.B. Moleküle mit einem
Molekulargewicht von weniger als etwa 1000 Dalton) können eine
im wesentlichen reine Verbindung nach der Erfindung begleiten. Vorzugsweise
ist eine im wesentlichen gereinigte Verbindung mindestens 70% (nach
Gewicht) frei von Komponenten, die sie in natura begleiten. Mehr
bevorzugterweise ist eine im wesentlichen gereinigte Verbindung
mindestens 75% (nach Gewicht) frei von Komponenten, die sie in natura
begleiten; immer noch mehr bevorzugterweise mindestens 80% (nach
Gewicht) frei; sogar noch mehr bevorzugterweise mindestens 85% (nach
Gewicht) frei; und sogar noch mehr bevorzugterweise mindestens 90% (nach
Gewicht) frei von Komponenten, die sie in natura begleiten. Am bevorzugtesten
ist eine im wesentlichen gereinigte Verbindung mindestens 95% (nach
Gewicht) frei von Komponenten, die sie in natura begleiten.
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„Die extrazelluläre Domäne von TACI" bezieht sich auf
eine Form eines TACI-Proteins oder -Polypeptids, die der Transmembran-
und zytoplasmatischen Domänen
von TACI entbehrt. Gewöhnlich
besteht die extrazelluläre
Domäne
von TACI aus Aminosäuren
1 bis etwa 166 von SEQ ID NO:1. Dem Fachmann ist klar, daß die im
TACI-Protein oder -Polypeptidfragment nach der vorliegenden Erfindung
identifizierte Transmembrandomäne
nach Kriterien identifiziert wird, die im Fachbereich zur Identifizierung
dieses Typs von hydrophoben Domänen
routinemäßig angewendet
werden. Die genauen Grenzen einer Transmembrandomäne variieren,
aber höchstwahrscheinlich
um nicht mehr als etwa fünf
Aminosäuren
an jedem Ende der Domäne,
die hierin speziell erwähnt
ist.
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„Sequenzidentität" in Hinblick auf
hierin identifizierte TACI-Aminosäuresequenzen ist definiert
als der Prozentsatz an Aminosäuren
in einer Vergleichssequenz, die identisch mit den Aminosäureresten
in der TACI-Aminosäuresequenz
sind, nach dem Aneinanderlegen der Sequenzen („Alignment") und dem Einfügen von Lücken, wenn nötig, um
den maximalen Prozentsatz an Sequenzidentität zu erreichen, und unter Nichtberücksichtigung
jeglicher konservativer Substitutionen als Teil der Sequenzidentität. Ein Alignment
zum Zwecke der Bestimmung der prozentualen Aminosäuresequenzidentität wird auf verschiedene
Arten erreicht, die im Vermögen
des Fachmanns liegen, z.B. mittels öffentlich erhältlicher
Computersoftware wie BLAST, ALIGN oder der Megalign (DNASTAR)-Software. Fachleute
bestimmen geeignete Parameter zur Messung des lokalen Alignments,
einschließlich
von Algorithmen, die benötigt
werden, um ein maximales Alignment über die gesamte Länge der
zu vergleichenden Sequenzen zu erreichen, um Beziehungen zwischen
Sequenzen aufzudecken, die nur isolierte Regionen von Ähnlichkeit
teilen. (Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410).
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„Fusionsprotein" bezeichnet ein Protein,
das mindestens zwei Segmente eines Proteins oder Polypeptidfragments
umfaßt,
miteinander verbunden durch beliebige Mittel, einschließlich, aber
ohne Beschränkung auf
eine kovalente Bindung (z.B. eine Peptidbindung), eine nichtkovalente
Bindung (z.B. eine Ionenbindung oder eine Wasserstoffbrücke) oder
durch einen chemischen Quervernetzer. Es kann auch jede beliebige
Variante von Fusionsprotein erzeugt werden, die nur die extrazelluläre Domäne des TACI-Proteins
trägt.
Nichtlimitierende Beispiele umfassen ein Fusionsprotein, das die
extrazelluläre
Domäne
des TACI-Proteins und ein Immunglabulin-Polypeptid umfaßt, einschließlich z.B.
des Immunglobulin-Polypeptids IgG.
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Des
weiteren können
die üblichen
DNA-Rekombinationsverfahren angewendet werden, um die Bindeaffinitäten der
rekombinanten Antikörper
zu ihren Antigenen zu verändern,
indem man die Aminosäuren
in der Umgebung der Antigen-Bindestellen verändert. Die Antigen-Bindeaffinität eines
humanisierten Antikörpers kann
durch Mutagenese auf Basis von molekularem Modellieren erhöht werden.
(Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029–10033),
hierin durch Verweis einbezogen.
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Das
ein TACI-Polypeptid umfassende Medikament kann einen pharmazeutisch
akzeptablen Hilfsstoff umfassen. Geeignete Trägerstoffe für das Medikament und deren
Formulierungen sind z.B. in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16. Edition,
Editoren: Oslo et al., Mack Publishing Co., 1980 beschrieben. Üblicherweise
wird eine geeignete Menge eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes
in der Formulierung verwendet, um die Formulierung isotonisch zu
machen. Beispiele für
den Träger
umfassen Puffer wie Saline, Ringer-Lösung und Dextrose-Lösung. Der
pH der Lösung
ist vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 8, und mehr vorzugsweise von
etwa 7,4 bis etwa 7,8. Weitere Träger umfassen Präparate mit
verlängerter
Freisetzung wie semipermeable Matrizes von festen hydrophoben Polymeren,
welche Matrizes in Form von Formartikeln vorliegen, z.B. Liposomen,
Filmen oder Mikropartikeln. Den Fachleuten wird klar sein, daß gewisse
Träger
bevorzugter sein können,
abhängig
z.B. vom Verabreichungsweg und der Konzentration des verabreichten
Medikaments.
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Die
Verabreichung kann durch Injektion (z.B. intravenös, intraperitoneal,
subkutan, intramuskulär) oder
durch andere Verfahren wie Infusion erreicht werden, die eine Zuführung in
den Blutkreislauf in wirksamer Form garantieren.
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Die
TACI-Reagentien umfassenden Medikamente werden in einer wirksamen
Menge verabreicht, die mit Fachleuten bekannten Verfahren auf einfache
Weise aus den Tierdaten extrapoliert werden kann (z.B. basierend
auf Körpergewicht,
Körperoberfläche). Des
weiteren liegt es im Bereich des erfahrenen Arztes, die Mengen des
TACI-Reagens umfassenden Medikaments zu erhöhen oder zu erniedrigen, um
die erwünschten Wirkungen
zu erzielen, ohne irgendwelche unerwünschten Nebenwirkungen zu verursachen.
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Folgende
Beispiele werden angeführt,
um die vorliegende Erfindung zu verdeutlichen, und sollten nicht
als deren Beschränkung
ausgelegt werden.
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BEISPIELE
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Die
folgenden Verfahren und Materialien wurden in den danach offenbarten
Beispielen verwendet.
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I. Verfahren und Materialien
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A. Klonierung und Expression
von myc-getaggtem A88 murinem APRIL in Pichia pastoris
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Der
Expressionsvektor pCCM276 (4) wurde
durch Polymerasekettenreaktion mit pCCM213.10 (myc-getaggtes H98-muAPRIL)
als Template und den synthetischen Oligonukleotiden CDL620 und LTB619 als
forward- bzw. reverse-Primer konstruiert. Forward-Primer CDL620
fügt 10
Aminosäuren
aus der murinen APRIL-Sequenz wieder hinzu, um die native gespaltene
Form darzustellen, zusammen mit einem vom FAS-Ligand abgeleiteten
KEL-Motiv und einer SacI-Schnittstelle. Die daraus erzeugten amplifierten
Fragmente wurden mit SacI und NotI verdaut, gelgereinigt und in
dieselben Restriktionsstellen von pCCM213.10 ligiert. Dieses Expressionskonstrukt
enthält
Hefe-Alpha-Mating-Faktor-Signalsequenz
direkt fusioniert an das myc-Epitoptag, das KEL-Motiv und mit Alanin 88 beginnendes
murines APRIL. pCCM2786 wurde mit StuI linearisiert, in den GS115-Stamm
(his4-) elektroporiert und auf Dextrose enthaltendes Minimalmedium
ausplattiert. HIS4-Transformanten wurde auf Proteinexpression analysiert,
indem eine einzelne repräsentative
Kolonie in Vollmedium (BMGY) angeimpft und 48 Stunden bei 30°C bis zur
Dichte wachsen gelassen wurde. Die Kulturen wurden zentrifugiert
und die Zellpellets in einem 2% Methanol enthaltenden Induktions-Vollmedium (BMMY) resuspendiert
(1:5). Nach zwei Tagen Induktion bei 30°C wurden die Überstände auf
SDS-PAGE aufgetragen und auf die Anwesenheit von muAPRIL untersucht.
Coomassie-Blaufärbung
und Western-Blot-Analyse (mit dem anti-myc-mAk 9E10) bestätigten die
Anwesenheit des glykosylierten myc-getaggten murinen A88-APRIL.
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B. Reinigung von murinem
myc-A88-APRIL
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Myc-getaggtes
murines APRIL (myc-muAPRIL) wurde in P. pastoris exprimiert. Das
Protein hat einen isoelektrischen Punkt von etwa 7,45. 175 ml Pichia-Überstand
wurden ü.N.
mit einer 30 kD-Ausschlußgrenzen-Dialysemembran
gegen PBS dialysiert. Das Dialysat wurde dann durch eine Q-Sepharose-Säule geschickt.
Das myc-muAPRIL fand sich im Säulendurchlauf,
während
Kontaminanten an die Säule
banden. Das eluierte myc-muAPRIL
wurde 20fach konzentriert und dann auf einer Superdex-75-Gelfiltrationssäule chromatographiert.
Nach der Gelfiltration wurden 8 mg myc-muAPRIL mit einer OD von
1,0AU-1 mg myc-muAPRIL gewonnen. Eine Coomassie-gefärbte SDS-PAGE
zeigte eine homogene Präparation
von myc-muAPRIL mit zwei Banden, die bei Molekulargewichten von
etwa 22 kD und 18 kD migrierten. Eine Western-Blot-Analyse mit monoklonalem
Maus-9E10-Antikörper
(anti-myc) zeigte, daß beide
beobachteten Banden immunreaktiv waren. Der erwartete N-Terminus
des gereinigten myc-muAPRIL wurde durch Edman-Abbau des geblotteten Proteins verifiziert.
Das N-terminale Sequenzieren und die Immunreaktivität gegen
9E10 beweisen, daß der myc-Tag
an den myc-muAPRIL-N-Termini
vorhanden war.
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C. Reinigung von murinem
FLAG-APRIL
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Plasmid
PS784 (auch LT032 genannt; 7) wurde
zur transienten Transfektion von 293-T-Zellen mittels Lipofectamin-Reagens
(Gibco-BRL) und serumfreiem Medium verwendet. Das im Säuger-Expressionsvektor
PCR3 (Invitrogen) konstruierte Plasmid kodiert für die lösliche rezeptorbindende Domäne von murinem APRIL,
mit einem N-terminalen
FLAG-Tag, und das exprimierte Protein wird in das Zellkulturmedium
sekretiert. FLAG-APRIL-Protein wurde aus serumfreiem Medium mit
einer anti-FLAG-mAk-M2-Säule gereinigt
und nach den Anweisungen des Herstellers (Kodak) mit einem Überschuß gereinigten
FLAG-Peptids eluiert. Alternativ wurden murines APRIL und andere
FLAG-getaggte Liganden direkt im konditionierten Medium analysiert.
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D. Expression von hTACI(1–160)-Ig
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Ein
lösliches
hTACI(1–160)-Ig
kodierendes Plasmid (PS882; 5) wurde
verwendet, um 293-Zellen transient zu transfizieren. Konditioniertes
Medium von hTACI(1–160)-Ig überexprimierenden
293-Zellen wurde bei der Immunpräzipitations-Analyse verwendet,
um Bindung an APRIL zu detektieren.
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E. Expression von Vollängen-TACI
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Ein
FLAG-getaggtes Vollängen-TACI
kodierendes Plasmid (pJST552; 2) wurde
transient in 293-Zellen transfiziert. Die Vollängen-Form des Moleküls verbleibt
auf der Zelloberfläche.
Diese transfizierten Zellen wurden in FACS-Analysen zur Detektion
von APRIL-Protein verwendet.
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F. Gewinnung von humanem
FLAG-APRIL
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Plasmid
LT033 (9) wurde verwendet, um 293-T-Zellen transient
mittels Lipofectamin-Reagens (Gibco-BRL) und serumfreiem Medium
zu transfizieren. Das im Säuger-Expressionsvektor
PCR3 (Invitrogen) konstruierte Plasmid kodiert für die lösliche rezeptorbindende Domäne von humanem
APRIL, mit einem N-terminalen FLAG-Tag, und das exprimierte Protein
wird in das Zellkulturmedium sekretiert. Humanes FLAG-APRIL wurde
direkt im Zellkulturüberstand
analysiert.
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BEISPIEL 1
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Auf Zellen
exprimiertes humanes TACI interagiert mit myc-getaggtem murinem
APRIL
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293EBNA-Zellen
wurden mit einem Plasmid, das N-terminal FLAG-getaggtes humanes
Vollängen-TACI
exprimiert (pJST552; siehe 2) und einem
GFP-Marker (AN050) kotransfiziert. Die Transfektionen wurden mittels
Lipofectamin 2000 (LifeTechnologies) nach den Anweisungen des Herstellers
durchgeführt.
Das Transfektionsmedium war mit 10% FBS, 4 mM Glutamin und 50 μM Z-VAD (Bachem
Bioscience Inc.) versehenes DMEM. Die Zellen wurden 24 Stunden nach
Transfektion mit mit 5 mM EDTA versehenem PBS geerntet. Die Zellen
wurden in FACS-Puffer (PBS – 10%
FBS – 0,02%
NaN3) gewaschen und auf eine Dichte von
5 × 106 Zellen/ml resuspendiert. Die Expression
von TACI wurde durch 30-minütiges
Anfärben
von 100 Mikrolitern transfizierter Zellen mit anti-FLAG-mAk bei
5 μg/ml
auf Eis, gefolgt von Esel-anti-Maus
IgG-PE bei 1:100 (Jackson ImmunoResearch) verifiziert. Die Zellen
wurden auf ihre Fähigkeit,
APRIL zu binden, über
einen Konzentrationsbereich von 3 μg/ml bis 300 ng/ml durch 30-minütiges Inkubieren
auf Eis in FACS-Puffer untersucht. Die Bindung wurde mittels Rb1532,
eines polyklonalen Kaninchen-Ak gegen mAPRIL (1:100), gefolgt von Esel-anti-Kaninchen-IgG-PE
(1:100, Jackson Immunoresearch) sichtbar gemacht. 7-AAD war in der letzten Anfärbung enthalten
und wurde verwendet, um tote Zellen auszublenden. Die Proben wurden
mit FACS analysiert und aufgetragen (8).
Der analysierte Zellbereich ist als R1 gezeigt. Spezifische Anfärbung kann bei
den drei gezeigten verschiedenen Konzentrationen von myc-getaggtem
murinem APRIL beobachtet werden, im Vergleich zu einer Kontrolle
ohne Protein (8).
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BEISPIEL 2
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Lösliches hTACI(1–160)-Ig
interagiert mit FLAG-getaggtem murinem APRIL
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250 μl hTACI(1–160)-Ig
enthaltendes Optimem wurden mit verschiedenen FLAG-Liganden der TNF-Familie
gemischt. Einige der Liganden waren in Optimem, während andere
anti-FLAG (mAk M2)-gereinigt waren. Das gemeinsame Charakteristikum
war, daß die
verwendete Menge empirisch dieselbe war (500 ng bei gereinigten
Liganden, d.h. hBAFF, muBAFF, TRAIL, FasL, EDA). Die Liganden wurden
in Bakterien produziert (hBAFF, TRAIL) oder transient in 293-EBNA-Zellen
exprimiert (alle anderen). Kontroll-Rezeptor-Fcs wurden meistens als Optimem-Überstand
verwendet, außer
TNFR1, OX40 und LTBR, die auf Protein-A-Säulen gereinigt wurden. 1 μg gereinigter
Rezeptoren wurde verwendet. Rezeptor-Fc-Proteine (etwa 1 μg) wurden
mit FLAG-Liganden (etwa 500 ng) gemischt. Das Volumen wurde mit
PBS auf 1,2 ml eingestellt, und 5 μl Protein-A-Sepharose wurden zugegeben. Die Inkubation
wurde auf einem Rad 1 Stunde bei 4°C durchgeführt. Die Kügelchen wurden durch Zentrifugation
geerntet und auf eine Minisäule
(gelbe Spitzen mit einer 1-mm-Durchmesser-Fritte) geladen. Waschungen
wurden durch Anlegen eines Vakuums unten an der Säule zum
Ansaugen des Mediums und zweimalige 400-μl-PBS-Waschschritte durchgeführt. Die
getrockneten Kügelchen
wurden mit 20 μl
Citrat-NaOH (pH 2,7) eluiert, und das Eluat wurde mit 6 μl 1 M Tris-HCl
pH 9,0 neutralisiert. 10 μl
3fach-Probenpuffer plus DTT wurden zugegeben, die Probe gekocht
und 22 μl
für eine
Western-Blot-Analyse aufgetragen. Die Membran wurde nacheinander
mit Ponceau-S gefärbt,
in 4% Milch und 0,5% Tween-20 geblockt, dann mit 1 μg/ml M2 in
Blockierpuffer inkubiert, gewaschen und mit Ziegen-anti-Maus-Ig-Peroxidase (1/5000
in Blockierpuffer) entwickelt. ECL wurde zur Verstärkung des
Signals verwendet. Peroxidase-Aktivität wurde mit Azid entfernt,
die Membran gewaschen, und dann erneut mit Esel-anti-Mensch-Peroxidase
beschickt.
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Die
Western-Ergebnisse der Koimmunpräzipitation
zeigen, daß nur
FLAG-muAPRIL mit TACI(1–160)-Ig
koimmunpräzipitiert
werden kann. Die Bindung von TACI(1–160)-Ig an muAPRIL scheint
spezifisch zu sein, da keiner der anderen 14 FLAG-getaggten löslichen
TNF-Familien-Liganden mit TACI(1–160)-Ig interagieren konnte.
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BEISPIEL 3
-
Verwendung
der abgeleiteten TACI-Sequenz und von Antagonisten und Agonisten
der TACI-Bindung und -Aktivität
als Modifikatoren onkologischer und neoplastischer Störungen
-
Beispiele
für die
Präparation
und Animpfung transformierter Zellen zur Beurteilung der Tumorgröße sind
in Celis et al., CELL BIOLOGY, A LABORATORY HANDBOOK, Band Eins,
Academic Press, San Diego, CA, 1997 beschrieben. Die Tumorzellen
waren verschiedenster Herkunft, einschließlich der umfangreichen von
der ATCC (Bethesda, MD) unterhaltenen Tumorzellbanken, immortalisierter
Zellinien, immortalisierter Primärzellinien,
stabil transfizierter Zellinien, und aus Säugern (einschließlich Menschen)
gewonnenen Tumorgewebes. Die Gewebeherkunft ist ein wichtiger Faktor
bei der Wahl zwischen immundefizienten und normalen Tieren (Celis
et al., a.a.O.). Des weiteren gibt es eine Vielzahl an Verfahren
zur Induktion des Tumorwachstums in verschiedenen Tiermodellen mittels
karzinogener oder anderer Insulte.
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Es
wurden Modelle entwickelt, die die Tumorgröße in immundefizienten Mäusen als
Mittel zur einfachen Bestimmung der Aktivität neuer Liganden in der Tumorbiologie
(Hahne et al. (1998) J. Exp. Med. 188: 1185–1190) nutzen. Sowohl Liganden
als auch ihre Antagonisten wurden in solchen Systemen untersucht
(z.B. Kashii et al. (1999) J. Immunol. 163: 5358–5366; Zhai et al. (1999) FASEB
J. 13: 181–189).
Ein agonistischer mAk gegen ein TNF-Rezeptor-Familienmitglied (LTBR) beeinflußte massiv
das Tumorzellwachstum, und Überleben
wurde gezeigt (Browning et al. (1996) J. Exp. Med. 183: 867–878).
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Tumorzellinien
wurden subkutan in immundefiziente Mäuse implantiert, und die Wachstumsrate
von Tumoren in mit TACI-Ig behandelten Mäusen war der Wachstumsrate
von Tumoren in mit ungefähr
5 mg/kg/Woche CBE11 behandelten Mäusen vergleichbar, das bedeutet
ein viel langsameres Tumorwachstum im Vergleich mit der Wachstumsrate
von Mäusen,
die Kontroll-Behandlungen erhielten.
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Eine
weitere Abwandlung dieser Modelle war, Zellen als Tumorquelle zu
verwenden, die dafür
bekannt sind, in immundefizienten oder genidentischen Tieren Metastasierung
zu induzieren. Zum Beispiel lieferte die ATCC (Bethesda, MD) eine
Anzahl von menschlichen Tumorlinien mit bekanntem metastatischem
Potential in einer Vielzahl von Geweben, und diese Linien werden
zur Untersuchung der Auswirkungen der TACI-Aktivität oder -Antagonisierung
auf die Metastasierung verwendet. Diese Modelle wurden und werden auch
jetzt (z.B. vom NCI) verwendet, um das Potential zur Behandlung
von menschlichen Patienten zu beurteilen.
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BEISPIEL 4
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Herstellung
von löslichen
TACI-Rezeptoren
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Um
einen Rezeptor-Inhibitor zur Verwendung in Menschen herzustellen,
wurde die humane Rezeptor-cDNA-Sequenz der extrazellulären Domäne von TACI
verwendet (SEQ ID NO:2). Mit einer humanen cDNA-Sequenz wurden Oligonukleotid-Primer
entwickelt, um die extrazelluläre
Domäne
des Rezeptors in Abwesenheit der Transmembran- und intrazellulären Domänen mittels
PCR zu amplifizieren. Üblicherweise
würde ein
Fachmann die meisten Aminosäuren
zwischen der letzten disulfidverknüpften „TNF-Domäne" und der Transmembrandomäne einbeziehen.
Alternativ wurde die Größe der „Stelzen"-Region variiert,
um die Wirksamkeit des sich daraus ergebenden löslichen Rezeptors zu optimieren.
Dieses amplifizierte Stück
wurde manipuliert, indem geeignete Restriktionsstellen eingebaut
wurden, die das Klonieren in verschiedene C-terminale Ig-Fusions-Chimären-Vektoren erlauben.
Alternativ wurde ein Stop-Signal am 3'-Ende eingefügt, um eine lösliche Form
des Rezeptors zu generieren, ohne auf die Herangehensweise der Verwendung
einer Ig-Fusions-Chimäre
zurückzugreifen.
Die resultierenden Vektoren wurde in den meisten in der Biotechnologie
verwendeten Systemen einschließlich
Hefe, Insektenzellen, Bakterien und Säugerzellen exprimiert, und
Beispiele existieren für
alle Expressionstypen. Verschiedene humane Fc-Domänen wurden
angehängt,
um FcR- und Komplement-Interaktionen je nach Wunsch zu optimieren
oder zu eliminieren. Alternativ wurden mutierte Formen dieser Fc-Domänen verwendet,
um selektiv FcR- oder Komplement-Interaktionen oder die Anheftung
von N-verknüpften
Zuckern an die Fc-Domäne zu verhindern,
was gewisse Vorteile hat.
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BEISPIEL 5
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Screening
auf Inhibitoren der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung
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Mithilfe
des Rezeptor-Ig-Fusionsproteins kann man dieselben kombinatorischen
Bibliotheken screenen, die auch nach Molekülen gescreent werden, die den
Rezeptor direkt binden. Diese Moleküle werden dann in einem Assay
im ELISA-Format mithilfe des Rezeptor-Ig-Fusionsproteins und einer
löslichen
Form des Liganden auf ihre Fähigkeit
getestet, die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung zu hemmen. Dieser ELISA
wird direkt verwendet, um verschiedene natürliche Produktbibliotheken
usw. auf Hemmstoffe zu screenen. Der Rezeptor wird in eine Zellinie
wie die HT29-Linie transfiziert, um einen biologischen Assay (in
diesem Falle Zytotoxizität)
zu bilden, der dann den Screening-Assay zur weiteren Demonstration der
Blockierung bildet.
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BEISPIEL 6
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In-vivo-Inhibition
des Tumorwachstums
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Die
Anzahl der subkutan (s.c.) injizierten Tumorzellen kann in Titrationsstudien
vor dem Beginn der Arbeit mit Antagonisten bestimmt werden. Zum
Beispiel können
8 × 105 Zellen bzw. 5 × 106 Zellen
der SW480-Kolon-Adenokarzinom-Festtumorlinie und der NIH-3T3-Fibrosarkom-Linie,
die aggressiv wachsen, in Nacktmäuse
implantiert werden. Die Verabreichung von Kontrolle oder TACI-Ig-Proteinen
kann kurz vor der Implantation beginnen, mit weiteren Dosen danach
alle 7 Tage. Die Dosis kann z.B. 100 μg/Maus sein. Der Tumordurchmesser
wird dann mit einem Mikrometer gemessen, und das Volumen mit der
Formel Vol = 4/3πr3 berechnet.
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BEISPIEL 7
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In-vivo-Inhibition
des Tumorwachstums
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Die
Anzahl der s.c. in immundefiziente (nu/nu) Mäuse injizierten Tumorzellen
wurde in früheren
Dosis-Antwort-Studien bestimmt. Für die Studien mit HT29 wurden
1 × 106 Zellen pro Maus implantiert. HT29 ist von
einem humanen Kolon-Adenokarzinom abgeleitet und hat einigen anderen
humanen Kolon-Aenokarzinomlinien (z.B. SW480) vergleichbare Wachstumscharakteristika,
wie schnelle Tumorbildung und schnelles Tumorwachstum. Mäuse, denen
HT29-Zellen implantiert waren, wurden am Tag der Implantation und
jede Woche danach mit 100 μg
hTACI(1–114)-Ig,
intraperitoneal (i.p.) verabreicht, behandelt. Die Negativkontrollen
umfaßten
die irrelevanten Proteine polyklonales hIgG und mAk MOPC21. Die
Positivkontrollen umfaßten
BCMA-Ig, einen weiteren Inhibitor der APRIL-Bindung, und CBE11, einen mAk gegen
mLTb-R, von dem bekannt ist, dass er das Adenokarzinom-Tumorwachstum
verlangsamt (Browning et al. (1996) J. Exp. Med. 183: 867–878). Der
Tumordurchmesser wurde mit einem Mikrometer gemessen, und das Volumen
mit der Formel Vol = 4/3πR3 berechnet.
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Für Studien
mit dem Lungenkarzinom A549 implantierten wir 1 × 106 Zellen/Maus.
Die Mäuse
wurden, beginnend am Tag der Implantation, mit 100 μg TACI(1–114)-Ig,
100 μg BCMA-Ig,
100 μg hIgG
oder 100 μl PBS
und danach wöchentlich
behandelt. Der Tumordurchmesser wurde mit einem Mikrometer gemessen,
und das Volumen mit der Formel Vol = 4/3πR3 berechnet.
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Die
Ergebnisse, die die Hemmung des Tumorwachstums des HT29-Kolon-Adenokarzinoms zeigen, sind
in 11 dargestellt. Die Ergebnisse, die die Hemmung
des Tumorwachstums des A549-Lungenkarzinoms zeigen, sind in 12 dargestellt.
In beiden Experimenten wurde eine signifikante Verlangsamung des Tumorwachstums
erreicht. Da Tumorgröße und Überlebenszeit
in diesen Modellen direkt verknüpft
sind, beeinflußte
die TACI-Ig-Behandlung auch die Tierüberlebenszeit. Zum Beispiel
wurden 95 Tage nach Tumorimplantation 50% der hIgG-behandelten Mäuse als
präfinal
eingestuft, verglichen mit nur 12,5% der mit TACI-Ig behandelten
Mäuse.
Dies bedeutet eine 4fache Erhöhung
in der Überlebenszeit
zu diesem Endstadiums-Zeitpunkt.
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BEISPIEL 8
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hTACI(1–114)-Ig
und hTACI(32–114)-Ig
binden an oberflächenständiges APRIL
-
Dieses
Beispiel zeigt die titrierbare Bindung von TACI-Ig-Fusionsproteinen
an eine stabile Zellinie, die muAPRIL auf ihrer Oberfläche exprimiert.
Entweder 25 μl
oder 5 μl
konditioniertes Medium von 293EBNA-Zellen, die transient mit hTACI(1–114)-Ig,
hTACI(32–114)
oder hFN14-Fc exprimierenden Plasmiden transfiziert waren, wurden
in FACS-Puffer auf ein Endvolumen von 50 μl verdünnt und 1 Stunde auf Eis mit
2,5 × 105 293-Zellen inkubiert, die stabil die Rezeptor-Bindedomäne von muAPRIL
auf ihrer Oberfläche
exprimieren. Nach Waschen mit FACS-Puffer wurden die Zellen mit
anti-Mensch-IgG-PE
(1:100-Verdünnung,
Jackson ImmunoResearch) 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen
wurden erneut gewaschen, in 1% Paraformaldehyd fixiert und mittels FACS
analysiert. 13 zeigt eine FL2-Verschiebung,
was ein titrierbares Anfärben
von Oberflächen-muAPRIL
durch hTACI(1–114)-Ig
und hTACI(32–114)-Ig
anzeigt. Keine Färbung
wurde bei der Kontrolle beobachtet, die nur den zweiten Schritt
beinhaltete. Keine Färbung
wurde beobachtet mit irgendeiner Verdünnung eines Kontroll-Ig oder
eines FN14-Ig-Fusionsproteins,
die beide mit dem Nur-zweiter-Schritt-Histogramm korrigrieren.
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BEISPIEL 9 Bindung von
murinem und humanem APRIL an hTACI(32–114)-Ig im ELISA-Format
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ELISA-Platten
(Corning) wurden mit 5 μg/ml
hTACI(32–114)-Ig
oder mLTbR-Ig-Kontrolle
in Hydrogencarbonat-Puffer pH = 9,6 über Nacht beschichtet, dann
in PBS/0,05% Tween-20-Lösung
gewaschen, und dann 2 Stunden bei 37°C mit PBS/2% bovinem Serumalbumin
(BSA) blockiert. APRIL-Proteinpräparationen
wurden im Bereich von 0,0048 bis 3 μg/ml zugegeben, verdünnt in PBS/2%
BSA. Spezifische APRIL-Bindung wurde mit Kaninchen-anti-Maus-APRIL-Antiseren
(R1532) und Esel-anti-Kaninchen-HRP (Jackson ImmunoResearch) oder
mit HRP-gekoppeltem anti-FLAG-mAk M2 (Kodak) detektiert. Die enzymatische
Entwicklung wurde mit TMA und H2O2 durchgeführt und mit H2SO4 gestoppt, nach Standardprotokollen. Die
entwickelte gelbe Färbung
wurde bei 450 nm auf einem Plattenleser ausgelesen. Die Ergebnisse
sind in 14 dargestellt.
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BEISPIEL 10
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Bevorzugte
Expression von APRIL in Tumorproben
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APRIL-mRNA
wird bevorzugt in Tumorproben exprimiert. Die Analyse der von Incyte
Inc. gesammelten und in Tabelle I dargestellten cDNA-Bibliotheken
zeigt, daß APRIL
verbreitet in zahlreichen Festtumor- und Neoplasma-Proben, aber
viel seltener in Normalgewebe-Proben exprimiert wird. Die Expression
in erkranktem Gewebe ist gelegentlich markant.
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