PT1592439E - Processo para a preparação de uma solução de albumina - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO DE ALBUMINA" A invenção refere-se a um processo para a preparação de albumina inactivada de virus terapeuticamente aplicável. A albumina é a proteína de plasma mais fortemente representada de entre os componentes do plasma sanguíneo. A albumina pode ligar à sua molécula muitos materiais endógenos e exógenos. A esta capacidade de ligação está também ligada uma das suas funções principais: o transporte dos materiais ligados à albumina.

Devido a esta capacidade de ligação a albumina representa também um depósito importante para um grande número de compostos, por exemplo ácidos gordos de cadeia longa, bilirrubina, triptofano, tiroxina ou iões metálicos. Também ingredientes activos farmacêuticos administrados, como varfarina, digitoxina ou naproxene são ligados à albumina e transportados.

Neste contexto é contudo decisivo saber que apenas a parte livre do ingrediente activo farmacêutico em causa, isto é, a parte não ligada à albumina, é capaz de desenvolver o efeito farmacológico. Uma redução da parte ligada à albumina aumenta a parte livre e, desse modo, a actividade farmacológica.

Todos os preparados de albumina que se encontram no mercado são preparados por meio de um fraccionamento de Cohn modificado, 1 consistindo este processo em geral em vários passos de fraccionamento. A pasteurização (10 horas a 60 °C) do concentrado de albumina emprega-se há décadas como passo de inactivação de virus. Para evitar a desnaturação da albumina durante este passo adicionam-se estabilizadores. De acordo com a farmacopeia europeia, empregam-se como estabilizadores caprilato de sódio (octanoato de sódio) ou N-acetiltriptofano ou uma combinação de ambos.

Para se obterem preparados de factor VIII ou outras proteínas do plasma inactivados de vírus, emprega-se o chamado processo SD, como descrito por exemplo no documento EP A-0 131 740, fazendo-se referência expressa a este documento. É conhecido dos próprios estudos da requerente que a capacidade de ligação da albumina disponível comercialmente, em comparação com a da albumina natural, é muito limitada. Isto é atribuído ao facto de, durante a pasteurização, os estabilizadores utilizados se ligarem à albumina, ocupando desse modo posições de transporte importantes, o que diminui a capacidade de ligação. Isto significa que os doentes que recebem tais preparações de albumina, quando se lhes administram ingredientes activos farmacêuticos, são expostos a uma concentração consideravelmente aumentada de ingrediente activo livre, isto é, não ligado à albumina, o que traz naturalmente para o doente um risco aumentado de efeitos farmacológicos em excesso e de efeitos secundários. A presente invenção tem como objectivo disponibilizar uma preparação de albumina que não apresente esta desvantagem. 2 A Figura 1 apresenta o comportamento de absorção no UV de albuminas de várias proveniências em função do tempo de eluição durante a separação cromatográfica. A Figura 2 ilustra o comportamento de ligação de albuminas de várias proveniências na presença de diferentes concentrações de fenilbutazona. A Figura 3 ilustra o comportamento de ligação de albuminas de várias proveniências na presença de diferentes concentrações de varfarina. 0 objectivo atinge-se com uma albumina inactivada de vírus, de utilização terapêutica, que apresenta uma capacidade aumentada de ligação de substâncias em comparação com albumina inactivada de vírus por pasteurização. A albumina a preparar de acordo com a invenção apresenta em particular uma capacidade de ligação pelo menos 10% mais elevada em comparação com a albumina inactivada de vírus por pasteurização, tipicamente uma capacidade de ligação 20% a 500% mais elevada, em especial uma capacidade de ligação 100% a 500% mais elevada. Conforme a substância a ligar, em casos particulares, são também possíveis valores ainda mais elevados.

As substâncias são em especial aquelas que são ligadas e/ou transportadas pela albumina nativa, às quais pertencem em particular ingredientes activos de baixo peso molecular. Os ingredientes activos de baixo peso molecular são em especial substâncias orgânicas ou inorgânicas, ácidos nucleicos, polipéptidos, que apresentam tipicamente um peso molecular < 10000 Da. 3

Para os efeitos terapêuticos mencionados a albumina a preparar de acordo com a invenção pode encontrar-se em solução liquida ou em estado sólido, em especial em forma liofilizada. A albumina a preparar de acordo com a invenção pode também obter-se por meio de um processo que é caracterizado pela combinação dos sequintes passos:

(a) Submissão de uma primeira solução aquosa de albumina a um tratamento para inactivaçâo de vírus, de acordo com o processo SD, por contacto com reagentes SD a uma temperatura abaixo de 45 °C (b) Remoção dos reagentes SD por extracção com óleo seguida de cromatografia de permuta hidrófoba, pelo menos no essencial, em que para a cromatografia se utiliza uma matriz hidrófoba, em especial uma matriz à qual se podem encontrar ligados, conforme o caso, grupos hidrófobos, com a condição de estes grupos serem grupos alifáticos com C > 24, e obtenção de uma segunda solução de albumina, que (c) Se mistura, conforme o caso, com um ou mais estabilizadores de entre o grupo de açúcares, aminoácidos e álcoois de açúcar, com a condição de não se empregar como estabilizador, um estabilizador de índole nem um ácido gordo C6-Ci0, após o que (d) Se completa a segunda solução de albumina, conforme o caso misturada com o estabilizador, se filtra em condições estéreis e, conforme o caso, se coloca nos recipientes finais. 4 A designação estabilizador de indole deve compreender todos os estabilizadores que apresentam uma estrutura indólica, portanto por exemplo N-acetiltriptofano. 0 processo SD (= Solvente/Detergente) para a inactivação de virus é conhecido do documento EP-A-0131740. Neste documento refere-se também a albumina entre outras proteínas. É, de facto, conhecido do documento EP-A-0366946 que os reagentes SD se podem remover com óleos vegetais, por exemplo óleo de soja, e por cromatografia de permuta hidrófoba subsequente. 0 processo de acordo com a reivindicação 8 deve considerar-se pois, enquanto coincida com o processo de acordo com o documento EP-A-0366946 num aspecto, como processo análogo para a preparação da albumina de acordo com a invenção. Para a cromatografia propõe-se aqui contudo, de um modo preferido, uma matriz, por exemplo uma matriz de sílica, à qual se encontram ligadas cadeias laterais hidrófobas, nomeadamente cadeias alquílicas C6-C24 ramificadas ou não ramificadas.

Verificou-se surpreendentemente que o emprego de uma matriz hidrófoba em vez de uma matriz que contém como cadeias laterais hidrófobas por exemplo cadeias alquílicas Cie, possui uma maior capacidade de ligação para a adsorção de detergentes. Em consequência disso não é necessário, estarem ligados outros grupos hidrófobos à matriz utilizada de acordo com a invenção. Um processo que utilize uma tal matriz é por isso também objectivo da invenção. A inactivação de vírus efectua-se com vantagem a uma temperatura na gama de 25 a 40 °C. 5

Uma forma de realização preferida do processo de acordo com a invenção consiste em efectuar a inactivação de vírus durante um período de tempo na gama de 4 a 6 horas.

Como estabilizador é muito adequada a glicina.

Para a extracção com óleo é muito adequado o óleo de rícino.

Revelou-se particularmente vantajoso para o efeito de purificação, quando se utiliza como matriz hidrófoba um polímero de poliestireno-divinilbenzeno ou um polímero à base de metacrilato.

As matrizes hidrófobas utilizadas de acordo com a invenção podem conter grupos alifáticos ramificados ou lineares com mais do que 24 átomos de C.

Conforme o material de partida utilizado, pode ser necessário um passo para a diminuição da chamada actividade do activador de precalicreína (PKA) . 0 PKA é conhecido pelo facto de, por libertação da substância vasoactiva bradiquinina a partir do cininogénio de alto peso molecular (HMWK), levar à diminuição da pressão sanguínea após a administração de preparados contendo PKA. 0 PKA é inactivado em geral durante a pasteurização de preparados de proteína. Uma vez que um tratamento por calor, através do qual o PKA é pelo menos parcialmente inactivado de acordo com a invenção, é desvantajoso pelas razões acima indicadas para a albumina preparada de acordo com o processo, o PKA pode ser removido, caso seja necessário, por medidas 6 especiais. Entre estas contam-se a incubação com carvão activado seguida de filtração, de um modo preferido com filtros fundos, ou a filtração directa através de filtros contendo carvão activado. São ainda bem adequados permutadores iónicos, como permutadores catiónicos ou aniónicos, para a remoção do PKA. Isto pode efectuar-se por contacto da solução contendo albumina com a matriz em colunas ou por processos em "batch" conhecidos do especialista. Em alternativa, podem empregar-se matrizes de sulfato de dextrano ou de heparina para a redução do PKA.

Na solução contendo albumina a obter o PKA encontra-se reduzido e, no caso ideal, nem sequer é identificável. De acordo com o actual estado da técnica, o PKA é idêntico ao Factor XII (de coagulação) activado (FXIIa), que é gerado a partir da sua forma de proenzima (FXII) . Isto pode ocorrer em superfícies por via auto-catalitica ou por acção enzimática, por exemplo da calicreina. Deste modo, é também aconselhável um empobrecimento do FXII (proenzima) como substância de partida do PKA, embora não obrigatoriamente necessário. Para impedir contudo uma nova geração do PKA a partir da forma proenzima, pode também remover-se este por cromatografia de permuta iónica. A diminuição do FXII pode efectuar-se, conforme o caso, para permitir um armazenamento de longa duração da albumina em estado liquido. Isto é também importante após a descongelação de uma solução de albumina eventualmente armazenada na forma congelada. Deste modo, pode congelar-se a solução de albumina após colocação nos recipientes finais, podendo contudo arrefecer e armazenar-se também em estado liquido ou liofilizado até uma temperatura de 40 °C. 7

Para a remoção do PKA ou das substâncias precursoras do PKA pode assim, antes dos passos (a) , (b) ou (c), remover-se a actividade do activador de precalicreína (PKA) eventualmente presente, de modo em si conhecido, sendo especialmente a solução de albumina: A) colocada em contacto com carvão activado, removendo-se depois o carvão activado da solução de albumina, ou B) submetida a uma cromatografia de permuta iónica. 0 passo (A) realiza-se com uma concentração de albumina entre 1 e 25% em peso, em especial entre 5 e 10% em peso. O passo (B) realiza-se em especial com uma concentração de albumina entre 5 e 10% em peso.

Uma outra forma de realização do processo de acordo com a invenção consiste em o permutador iónico ser um permutador aniónico e a solução de albumina ser tamponizada com acetato de sódio na gama de 100-150 mMol/L e o pH se situar na gama de 5,0-6,0, em especial < 5,5.

Descreve-se ainda um processo que se caracteriza por o permutador iónico ser um permutador catiónico e a solução de albumina ser tamponizada com acetato de sódio na gama de 20-30 mMol/L e o pH se situar na gama de 4,8-6,0, em especial na gama de 4,8 a 5,2. O processo de acordo com a invenção é aplicável a soluções de albumina, obtidas a partir de diversas fontes, por exemplo a partir de plasma ou de soro do sangue, a partir de fracções contendo albumina do fraccionamento do plasma, a partir de albumina proveniente de sobrenadantes de cultura após preparação recombinante, ou de albumina preparada por via transgénica, ou a partir de um meio contendo albumina, como leite.

Uma forma de realização preferida da invenção é ilustrada mais em detalhe com base no Exemplo seguinte.

Exemplo

Misturam-se 1000 g de uma solução aquosa de albumina do processo Cohn (após dia-/ultrafiltração), com um teor de proteína de cerca de 23%, com Triton X-100 e fosfato de tri-n-butilo (TNBP) até uma concentração de 1% cada. Em seguida agita-se a solução de albumina durante 4 horas a 30 °C. Para a remoção dos reagentes SD adiciona-se primeiro óleo de rícino, sob agitação, até uma concentração de 5%, enquanto se leva a solução a uma temperatura na gama de 20-25 °C. Em seguida agita-se a mistura durante 30 minutos. Após a agitação deixa-se a mistura em repouso durante 60 minutos, formando-se uma fase aquosa mais densa e uma fase leve. Separa-se a fase densa e filtra-se através de um filtro com membranas com um tamanho de poros < 1 μηι e < 0,45 pm. A fase leve (fase oleosa) contém o TNBP e rejeita-se. A solução filtrada alimenta-se a uma coluna de extracção em fase sólida para a remoção do Triton X-100. Como matriz hidrófoba utiliza-se um polímero de poliestireno-divinilbenzeno (Amberchrome CG 161) sem cadeias laterais hidrófobas. Utiliza-se água para injecções para eluir a coluna, controlando-se este processo por medição da absorção UV a 280 nm. Após a utilização regenera-se a coluna. 9

Com estabilizadores podem adicionar-se: glicina, glutamato, arginina, maltose, sorbite ou misturas destas substâncias. A solução obtida leva-se a pH = 7,0 e ajusta-se o teor em proteína a 200 g/L e o teor em sódio a 80 mMol/L de Na+. Filtra-se depois a solução em condições estéreis através de um filtro de membrana com um tamanho de poros < 0,2 pm. A solução filtrada estéril coloca-se, sob condições assépticas, em recipientes de PVC esterilizados, isentos de agentes pirogénicos, e rotula-se.

As embalagens rotuladas congelam-se a uma temperatura < -60 °C, de modo que a temperatura no interior das embalagens seja < -30 °C. As embalagens armazenam-se a esta temperatura (< -30 °C) .

Empobrecimento em precalicreína:

Para o empobrecimento em precalicreína pode proceder-se de acordo com as seguintes variantes: a) Agita-se uma solução de albumina com uma concentração de proteína de 1-25% em peso, em especial de 5-10% em peso, com 3-10% em peso, em especial 5% em peso de carvão activado, a pH = 5, durante uma hora. Em seguida remove-se o carvão activado por filtração. b) Submete-se uma solução de albumina com uma concentração de proteína de 5-10% em peso, a pH 5-6, em especial < 5,5, num sistema tamponizado com 100-150 mMol de acetato de sódio, a uma cromatografia de permuta iónica (DEAE-Sepharose, 10 Q-Sepharose). Devido à elevada força iónica obtém-se no eluído uma solução de albumina isenta de PKA. c) Submete-se uma solução de albumina com uma concentração de proteina de 5-10% em peso, a pH 5-6, de um modo preferido 4,8-5,2, num sistema tamponizado com 20-30 mMol/L de acetato de sódio, a uma cromatografia de permuta iónica (SP-Toyopearl, CM-Sepharose) . Obtém-se no eluído uma solução de albumina isenta de PKA.

Formulação final

As soluções obtidas são todas levadas a pH 7,0 e o teor em proteina ajustado a 200 g/L e o teor em sódio a 80 mMol/L de Na+. Filtra-se depois a solução em condições estéreis através de um filtro de membrana com um tamanho de poros <0,2 pm.

As soluções estéreis filtradas colocam-se, sob condições assépticas, em recipientes de PVC esterilizados, isentos de agentes pirogénicos, e rotulam-se.

As embalagens rotuladas congelam-se a uma temperatura < -60 °C, de modo que a temperatura no interior das embalagens seja < -30 °C. As embalagens armazenam-se a esta temperatura (< -30 °C) . Efectua-se a medição da ligação de substâncias a várias preparações de albumina.

Um método directo para a determinação das propriedades de ligação de substratos a albumina é a cromatografia de exclusão de tamanhos (SEC, "size exclusion chromatography") segundo Hummel e Dreyer (Biochim. Biophys. Acta 1962; 63: 530-532). 11

Para tal equilibra-se uma coluna SEC com uma solução tampão contendo o ligando de ligação (por exemplo fenilbutazona ou varfarina). Regista-se continuamente a absorção na região UV. Aplica-se a proteína sobre a coluna e elui-se no tampão de equilíbrio. 0 ligando ligado elui neste caso juntamente com a albumina, o ligando não ligado, habitualmente mais pequeno, elui mais tarde. A absorção do ligando ligado interfere neste caso maioritariamente com a absorção da albumina e de possíveis substâncias acompanhantes, como estabilizadores. 0 pico "negativo" que elui mais tarde, o chamado pico "vacancy", é causado pela deplecção do ligando no tampão seguinte, que ocupa tanto mais área quanto mais se encontra ligado à albumina anteriormente eluída. Koizumi et al. (Biomed. Chromatogr. 1998; 12: 203-210) utilizaram este método, numa forma ligeiramente modificada, para investigar as capacidades de ligação de substâncias à albumina ou as respectivas afinidades, misturando-se por exemplo concentrações constantes de albumina em ensaios separados com quantidades crescentes do ligando, podendo calcular-se assim a capacidade de ligação na forma de razões albumina/substância.

Utilizou-se para estes ensaios uma coluna Biosep-SEC-S 4000, 300x4,6 mm mícron (Phenomenenx) num equipamento de HPLC Shimadzu. O caudal do tampão foi de 0,35 mL/min, tendo a coluna sido equilibrada com tampão de fosfato de potássio 50 mM, pH 7,4. A concentração de proteína era de 50 μΜ, o volume de injecção de 80 pL. Seguiu-se a fenilbutazona a 263 nm e a varfarina a 308 nm. As gamas de absorção lineares tinham sido previamente determinadas. 12

Utilizou-se a albumina (1) descrita neste pedido, bem como dois preparados de albumina (estabilizada) de origem comercial (2,3). Tratava-se neste caso de soluções de albumina a 20%. A Figura 1 representa uma sobreposição de quatro cromatogramas diferentes, tendo a coluna sido equilibrada com 50 μΜ de fenilbutazona (em tampão de fosfato) . A um tempo de retenção de 11 minutos eluiu primeiro a albumina, correspondendo o pico à soma da absorção da proteína e da substância ligada. A 14,5 min aparece, no caso de uma albumina comercial, geralmente um pico de N-acetiltriptofano (estabilizador). Após 18,5 min aparece o pico "vacancy" na forma de uma absorção "negativa" em relação ao nível do tampão de equilíbrio com a substância. Quanto maior (no sentido negativo) for este pico, ou seja quanto maior for a área do pico, tanto mais substância se ligou à albumina anteriormente eluída. A Figura 2 apresenta as absorções no UV de três concentrações de fenilbutazona ligada à albumina (após subtracção do pico de tampão) . Para tal cromatografaram-se duas albuminas de origem comercial (contendo caprilato e N-acetiltriptofano), bem como a albumina preparada de acordo com o processo descrito neste pedido, e compararam-se as qualidades de ligação. Para concentrações molares comparáveis de fenilbutazona e albumina, verifica-se claramente que o pico é nitidamente maior em altura e área no caso da nova albumina. Isto é igualmente válido para o segundo exemplo, a saber varfarina, como representado na Figura 3.

Estes resultados mostram que a albumina comercial é inferior à albumina aqui descrita, no que respeita à sua propriedade de ligação. 13

Comparação da capacidade de ligação de colunas RP-18 em comparação com polímeros de poliestireno-divinilbenzeno (Amberchrome 161 M).

Sistema de teste: volume da coluna: 44 mL Caudal. 4 mL/min

Carregou-se a coluna com uma solução de 1% de Triton X-100. Mediu-se o teor em Triton X no eluido, após cada volume de coluna, por meio de HPLC de fase reversa. Quando se identificou Triton no eluido, atingiu-se a capacidade do gel.

Resultado: 0 gel de RP-18 liga 140 mg de Triton Χ-100/mL de gel e o gel de Amberchrome liga 160 mg de Triton Χ-100/mL de gel.

Lisboa, 12 de Junho de 2007 14

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a preparação de albumina, caracterizado pela combinação dos seguintes passos: (a) Submissão de uma primeira solução aquosa de albumina a um tratamento para inactivação de vírus, de acordo com o processo SD, por contacto com reagentes SD a uma temperatura abaixo de 45 °C, (b) Remoção dos reagentes SD por extracção com óleo seguida de cromatografia de permuta hidrófoba, pelo menos no essencial, em que para a cromatografia se utiliza uma matriz hidrófoba, em especial uma matriz à qual se podem encontrar ligados, conforme o caso, grupos hidrófobos, com a condição de estes grupos serem grupos alifáticos com C > 24, e obtenção de uma segunda solução de albumina, que (c) Se mistura, conforme o caso, com um ou mais estabilizadores de entre o grupo de açúcares, aminoácidos e álcoois de açúcar, com a condição de não se empregar como estabilizador, um estabilizador de índole nem um ácido gordo Cê-Cio, após o que (d) Se completa a segunda solução de albumina, conforme o caso misturada com o estabilizador, se filtra em condições estéreis e, conforme o caso, se coloca nos recipientes finais.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a inactivação de vírus se efectuar a uma temperatura na gama de 25 a 40 °C. 1
3. 3. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e/ou 2, caracterizado por a inactivação de virus se efectuar durante um período de tempo na gama de 4 a 6 horas.
4. 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por, como estabilizador, se empregar glicina, glutamato, arginina ou lisina, ou uma combinação destes.
5. 5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por, como estabilizador, se empregar maltose e/ou sorbitol.
6. 6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por, para a extracção com óleo, se empregar óleo de rícino.
7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por, como matriz hidrófoba, se empregar um polímero de poliestireno-divinilbenzeno ou um polímero à base de metacrilato.
8. 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por se encontrarem ligados à matriz grupos alifáticos ramificados ou lineares com mais do que 24 átomos de C.
9. 9. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por a solução de albumina ser congelada após a colocação nos recipientes finais. 2
10. 10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por, antes ou depois dos passos (a) , (b) ou (c), se remover a actividade do activador de precalicreina (PKA), de modo em si conhecido.
11. 11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por, para a remoção da actividade do activador de precalicreina eventualmente presente, a solução de albumina a) ser colocada em contacto com carvão activado, removendo-se depois o carvão activado da solução de albumina, ou b) ser submetida a uma cromatografia de permuta iónica.
12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o passo (A) se efectuar a uma concentração de albumina entre 1 e 25% em peso.
13. 13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a concentração de albumina se situar entre 5 e 10% em peso.
14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o passo (B) se efectuar a uma concentração de albumina entre 5 e 10% em peso.
15. 15. Processo de acordo com uma das reivindicações 11 ou 14, caracterizado por o permutador iónico ser um permutador aniónico e a solução de albumina ser tamponizada com acetato de sódio na gama de 100-150 mMol/L e o pH se situar na gama de 5,0-6,0. 3
16. 16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o pH ser < 5,5.
17. 17. Processo de acordo com uma das reivindicações 11 ou 14, caracterizado por o permutador iónico ser um permutador catiónico e a solução de albumina ser tamponizada com acetato de sódio na gama de 20-30 mMol/L e o pH se situar na gama de 4,8-6,0.
18. 18. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o pH se situar na gama de 4,8-5,2. Lisboa, 12 de Junho de 2007 4