DE19729778A1 - Verfahren zur Herstellung von virusinaktivierten biologischen Flüssigkeiten - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von virusinaktivierten biologischen Flüssigkeiten in lyophi­ lisierter Form.

Biologische Flüssigkeiten wie Blutplasma, Blutserum, sowie andere proteinhaltige Lösungen von aus Blutplasma oder Blut­ serum gewonnenen Bestandteilen werden vorwiegend bei der The­ rapie verschiedener Krankheiten, sowie auch zur Notfallsub­ stitution eingesetzt. Da derartige biologische Flüssigkeiten ausschließlich aus Blutspenden gewonnen werden können, ist die Virusinaktivierung derartiger biologischer Flüssigkeiten notwendig, um die Übertragung von Viren auf den Empfänger der biologischen Flüssigkeit auszuschließen.

Virusinaktiviertes Blutplasma wird im allgemeinen eingesetzt, um bei Blutungen Volumenverminderungen im Blutvolumen zu be­ handeln. Es wird weiterhin eingesetzt bei der Therapie von Blutgerinnungsstörungen und Störungen der Inhibitoren des Blutgerinnungssystems, sowie bei Immunoglobulinmangel. Blut­ plasma wird weiterhin auch zur Substitution von Blutgerin­ nungsfaktoren eingesetzt, die im Blutplasma enthalten sind, soweit derartige hochkonzentrierte Präparate noch nicht ver­ fügbar sind.

Für die Virusinaktivierung von Blutplasma sind bereits ver­ schiedene Verfahren aus dem Stand der Technik bekannt, wobei sich das sogenannte Solvens/Detergens-Verfahren, in Fachkrei­ sen S/D-Verfahren genannt, durchgesetzt hat.

Hierbei wird die Virusinaktivierung mit einer Mischung aus Tri-n-butylphosphat als Solvens und einem Alkylphenylpolye­ thylenglykole als Detergens durchgeführt. Anschließend werden diese virusinaktivierenden Substanzen mit Hilfe von Pflanzen­ ölen und nachfolgender chromatographischer Reinigung ent­ fernt.

Aus dem Stand der Technik sind diese Verfahren der Virusinak­ tivierung bereits bekannt. So beschreibt die EP 0 050 061 A2 ein Verfahren zur Virusinaktivierung von biologischen und pharmazeutischen Produkten, insbesondere Plasmaproteinproduk­ ten durch Zusatz von Akylphenylpolyethylenglykolen (Triton-X- 100®) zur Virusinaktivierung von Blutplasma.

Die EP 0 239 859 beschreibt als Weiterentwicklung hiervon die Virusinaktivierung von Blutplasma, sowie anderen biologischen Flüssigkeiten mit Hilfe eines Solvens/Detergens-Gemisches aus Tri-n-butylphosphat (TNBP) und Triton-X-100®. Nach der Virus­ inaktivierung werden die Substanzen durch Extraktion mit Pflanzenölen entfernt. Hierzu werden insbesondere eingesetzt Sojabohnenöl, Ricinusöl, Baumwollsamenöl, Maisöl, Erdnußöl, Olivenöl, sowie andere pflanzliche Öle.

Die WO 91/14439 beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Her­ stellung von nichtinfektiösem Blutplasma, bei dem die vorste­ hend genannten Verfahren angewendet werden. Die Virusinakti­ vierung erfolgt ebenfalls durch Zusatz von Tri-n-butyl­ phosphat und Triton-X-100®. Danach erfolgt die Abtrennung der virusinaktivierenden Substanzen durch Zusatz von biologisch kompatiblen Lipiden wie Soja- oder Ricinusöl. Es erfolgt an­ schließend eine chromatographische Reinigung an einer Säule mit C-18 Adsorbens.

Eine Zusammenfassung des derzeit üblichen Verfahrens kann auch entnommen werden aus "Hellstern P., Sachse H., Schwinn H., Oberfrank K., Vox Sang 1992: 63: 178-185, Manufacture and in vitro Characterization of a Solvens/Detergent-Treated Hu­ man Plasma".

Üblicherweise werden die so gewonnenen virusinaktivierten Flüssigkeiten, insbesondere Blutplasma zum Transport und für den Gebrauch in flüssiger Form in Kunststoffbeutel einge­ bracht. Diese Kunststoffbeutel werden auf Temperaturen von minus 30°C tiefgefroren. In diesem Zustand ist im Falle von Blutplasma beispielsweise eine Lagerung von bis zu 2 Jahren unter Erhalt der Aktivität möglich.

Die virusinaktivierten biologischen Flüssigkeiten können wei­ terhin aber auch als lyophilisierte Produkte hergestellt, ge­ lagert und vertrieben werden. Der Vorteil der Lyophilisierung (Gefriertrocknung) liegt darin, daß zur Lagerung dieser Pro­ dukte erheblich weniger Energieaufwand notwendig ist. So kön­ nen lyophilisierte biologische Flüssigkeiten, beispielsweise lyophilisiertes Blutplasma bei Kühlschranktemperaturen von 2 bis 8°C über 2 Jahre unter Erhalt der Aktivität gelagert werden. Aus verschiedenen Gründen hat sich die Lyophilisation von biologischen Flüssigkeiten, insbesondere Blutplasma bis­ her jedoch nicht durchgesetzt. So wird der größte Teil des Blutplasmas im allgemeinen in Kunststoffbeuteln und tiefge­ froren hergestellt und eingesetzt.

Bei der Gefriertrocknung von biologischen Flüssigkeiten kommt es bei der herkömmlichen Vorgehensweise, bei der das flüssige Produkt in Flaschen abgefüllt wird, die Flaschen anschließend auf mindestens minus 30°C tiefgefroren werden und dann dem Gefriertrocknungsprozeß unterzogen werden, häufig zu Proble­ men, da das erhaltene Lyophilisat beim Lösen eine nur schlechte Löslichkeit zeigt. Weiterhin besitzt das lyophili­ sierte Präparat eine geringere Stabilität, da ein Anteil Restwasser im Lyophilisat vorhanden ist, der durch den Ge­ friertrocknungsprozeß nicht entfernt werden kann. Auch kommt es beim Gefriertrocknungsprozeß häufig dazu, daß das gefrore­ ne Produkt beim Abziehen des Wassers durch die Wanderung der Lösungsmittelkristalle in der gefrorenen Lösung aus der Fla­ sche herauswandert. Dies muß durch aufwendige Maßnahmen ver­ hindert werden.

Die technische Aufgabe der Erfindung liegt daher darin, ein Verfahren zur Herstellung von virusinaktivierten biologischen Flüssigkeiten in lyophilisierter Form zur Verfügung zu stel­ len, bei dem die vorstehend genannten Nachteile der Gefrier­ trocknungsprozesse nicht auftreten, ein besser lösliches Lyo­ philisat erhalten wird und aufgrund einer geringeren Restwas­ sermenge eine höhere Stabilität erzielt wird.

Diese technische Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von virusinaktivierten biologischen Flüssigkeiten in lyophilisierter Form durch Behandeln der biologischen Flüssigkeiten mit virusinaktivierenden Substanzen, Entfernung der virusinaktivierenden Substanzen, wobei das Abfüllen der virusinaktivierten biologischen Flüssigkeit in Behälter er­ folgt, die man nach dem Füllen bei 600 bis 1000 U/min solange rotieren läßt, bis die Flüssigkeit im Behälter die Form eines hohlen Zylinders angenommen hat, Eintauchen der rotierenden Behälter in ein Kühlmedium, so daß die darin befindliche Flüssigkeit gefriert, Entnehmen des Behälters mit der gefro­ renen Flüssigkeit und Lyophilisation der gefrorenen Flüssig­ keit.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann die biologische Flüssigkeit ausgewählt sein aus der Gruppe Blutplasma, Blut­ serum. Als virusinaktivierende Substanz wird ein Sol­ vens/Detergens-Gemisch eingesetzt, das in bevorzugter Weise TNBP (Tri-n-butylphosphat) als Solvens und Triton-X-100® (Alkylphenylpolyethylenglykole) als Detergens enthält. Zur Entfernung der virusinaktivierenden Substanzen werden bevor­ zugt Pflanzenöle und/oder chromatographische Reinigungsver­ fahren an C-18 Säulenmaterialien eingesetzt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die virus­ inaktivierte biologische Flüssigkeit vor dem Abfüllen einer Sterilfiltration unterzogen.

Bevorzugt werden runde Behälter eingesetzt, wobei Glasfla­ schen besonders bevorzugt sind. Das Eintauchen der Behälter in das Kühlmedium erfolgt je nach verwendetem Kühlmedium für 1 bis 40 Minuten. Das Kühlmedium ist besonders bevorzugt aus­ gewählt aus der Gruppe Ethanol, flüssiger Stickstoff oder an­ dere flüssige Gase oder Gasgemische.

Der Einsatz von flüssigem Stickstoff oder anderen flüssigen Gasen oder Gasgemischen als Kühlmedium ist besonders bevor­ zugt. Hierbei werden Eintauchzeiten von 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise 1 bis 5 Minuten erreicht.

Nachfolgend soll die Herstellung der biologischen Flüssigkei­ ten am Beispiel von Blutplasma genauer beschrieben werden. Das virusinaktivierte Blutplasma wird getrennt nach den Blut­ gruppen 0, A, B und AB hergestellt. Es ist frei von Zellen und Zellbestandteilen, enthält jedoch beispielsweise die Ge­ rinnungsfaktoren und deren Inhibitoren neben weiteren Be­ standteilen. Zur Herstellung wird gefrorenes Frischplasma von ärztlich kontrollierten Spendern eingesetzt, das nach den gültigen Richtlinien gewonnen, getestet, zertifiziert und freigegeben wurde. Das Blutplasma wird im Produktionsmaßstab von etwa 100-300 kg zu lyophilisiertem Blutplasma verarbei­ tet. Dies erfolgt in dafür ausgewiesenen Räumen der Rein­ heitsklassen 100 und 10 000 (US-Federal Standard 209 E). Die Herstellung des Blutplasmas erfolgt unter definierten Bedin­ gungen nach dem Solvens/Detergens-Verfahren. Der Verarbei­ tungsprozeß vom Ausgangsmaterial, gefrorenem Frischplasma, durchläuft die folgenden Stufen.

Das gefrorene Frischplasma wird zunächst bei 10 bis 15°C aufgetaut. Das Plasma wird gepoolt und anschließend durch die Einstellung der Temperatur, des pH-Wertes und Zusatz vorgege­ bener Mengen an Natriumdihydrogenphosphat und Glycin kondi­ tioniert. Es erfolgt danach eine Klärfiltration des Plasmas. Als virusinaktivierende Substanz wird Tri-n-butylphosphat als Solvens und Triton-X-100® als Detergens bei 26 bis 28°C und pH 7 dem Blutplasma zugegeben, so daß eine Endkonzentration von jeweils 1% erreicht wird. Die Virusinaktivierung erfolgt bei 29°C über vier Stunden. Anschließend werden die Sol­ vens/Detergens-Reagenzien mittels Ricinusöl-Extraktion bei 15 bis 18°C aus dem virusinaktiviertem Plasma abgetrennt. Es erfolgt eine Phasentrennung. Anschließend erfolgt eine Fil­ tration des Blutplasmas über Filter, z. B. der Größen 0,45-1,0 µm. Danach werden die restlichen Solvens/Detergens- Reagenzien, sowie die Rückstände des Ricinusöls aus dem viru­ sinaktivierten Blutplasma durch chromatographische Reinigung mittels C-18 Säulenmaterialien entfernt. Der pH-Wert von 6 bis 7 wird durch Zusatz von Zitronensäure eingestellt. An­ schließend wird eine Sterilfiltration über 0,45 und 0,2 µm Filter durchgeführt. Das virusinaktivierte sterilfiltrierte Blutplasma wird entweder in Transferbeutel bzw. zur Lyophili­ sation in Flaschen abgefüllt. Die Transferbeutel werden an­ schließend tiefgefroren. Es erfolgt eine Zwischenlagerung bis zur abschließenden Verpackung bei mindestens minus 30°C. Die für die Lyophilisation vorgesehenen Flaschen werden mit GT- Stopfen versehen.

Danach werden die gefüllten Glasflaschen mit ihrem flüssigen Inhalt in einer Apparatur in Rotation um ihre Längsachse bei 600 bis 1000 U/min versetzt. Hierdurch steigt die Flüssigkeit in dem Behältnis an den Wänden empor und gibt den Boden des Behältnisses frei. Die Flüssigkeit nimmt in dem Behälter die Form eines hohlen Zylinders an. Dadurch ändert sich das Ver­ hältnis von Oberfläche zu Dicke der Flüssigkeit in dem Be­ hältnis zugunsten der Oberfläche, d. h. die Oberfläche wird größer, die Dicke geringer. Diese Veränderung des Verhältnis­ ses von Oberfläche zu Dicke ist wichtig für die später fol­ gende Gefriertrocknung, bei der feste Lösungsmittelkristalle durch die gesamte tiefgefrorene Eissäule im Behältnis wandern müssen, um der tiefgefrorenen Lösung entzogen zu werden.

Das Rotieren des Behältnisses vor dem Gefrierprozeß kann au­ ßerhalb oder innerhalb des Kühlmediums geschehen. Es muß nur sichergestellt sein, daß der Gefrierprozeß erst einsetzt, wenn die Flüssigkeit gleichmäßig an den senkrechten Wänden des Behältnisses verteilt ist und die Form eines hohlen Zy­ linders angenommen hat.

Als Kühlmedium für die Temperaturen, die bei minus 35°C oder tiefer liegen müssen, können beispielsweise dienen Ethanol, flüssiger Stickstoff oder andere flüssige Gase oder Gasgemi­ sche. Dabei ist es wichtig, daß das Kühlmedium sich ohne Rückstände entfernen läßt oder selbständig verdampft, um zu verhindern, daß bei Kontakt des Anwenders mit dem Behältnis Nebenwirkungen verursacht werden. Der Gefriervorgang ist ab­ geschlossen, wenn der gesamte Behältnisinhalt tiefgefroren ist. Die dazu benötigte Zeit liegt je nach Kühlmedium zwi­ schen 1 und 40 Minuten.

Die Verwendung von flüssigem Stickstoff als Kühlmedium ist besonders bevorzugt. Bei der Verwendung von flüssigem Stick­ stoff oder anderen flüssigen Gasen oder Gasgemischen ergeben sich aufgrund der tiefen Temperaturen erhebliche Vorteile ge­ genüber der Verwendung von Ethanol. So kommt es zu einem schnelleren Gefrieren des Flascheninhaltes bereits nach etwa 1 bis 5 Minuten. Gegenüber dem bisher eingesetzten Ethanol als Kühlmedium ergeben sich hierdurch zahlreiche Vorteile. Ethanol mußte auf Temperaturen von etwa minus 40°C gehalten werden. Beim Eintauchen mehrerer Behälter benötigte man etwa 30 Minuten für das Gefrieren der in dem Behälter enthaltenen Flüssigkeiten. Weiterhin konnten oft nicht mehrere Chargen hintereinander gefroren werden, da sich das Ethanol zu stark aufheizte und damit zwischen den einzelnen Chargen zunächst Pausen eingelegt werden mußten.

Durch die Verwendung von Stickstoff als Kühlmedium und der viel niedrigeren Kühltemperatur sind derartige Nachteile nicht mehr vorhanden. Vielmehr ist der Gefrierprozeß nunmehr auch für einen industriellen Durchlaufprozeß im größeren Maß­ stab geeignet, da ein schnelleres Gefrieren möglich ist und zwischen den einzelnen Chargen keine Pausen mehr eingelegt werden müssen.

Nachfolgend soll das Verfahren der Flaschenabfüllung und der Gefriertrocknung näher beschrieben werden. Nach Durchführung der Sterilfiltration wird eine Verbindung in einen Reinst­ raumbereich (RK 100), in dem sich eine Abfüllstation befin­ det, über einen autoklavierten Schlauch hergestellt. Zum Ab­ füllen der Glasflaschen wird eine für diesen Zweck spezifisch eingerichtete Glasflaschenabfüllanlage eingesetzt. Als Glas­ flaschen werden Flaschen mit Volumina von 100 bzw. 250 ml der Glasart II nach dem DAB eingesetzt. Die Glasflaschen werden erst unmittelbar vor Gebrauch in einer Industrieflaschen­ spülanlage gewaschen, verlassen über ein Förderband unter La­ minarflow, also unter Reinstraumbedingungen die Spülmaschine und werden von dort aus über ein Förderband sofort in einen Heißluftsterilisationstunnel geführt. Die Flaschen werden mittels eines Förderbandes durch den Tunnel transportiert, gleichzeitig bei einer Lufttemperatur von 360 bis 370°C ste­ rilisiert und anschließend durch sterilgefilterte Kaltluft auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach Verlassen des Heißlufttun­ nels werden die Flaschen über einen Drehteller zur Flaschen­ abfüllmaschine befördert und dort für die anschließende Be­ füllung bereitgehalten.

Der Sterilfilterausgang wird z. B. über ein Milchrohrgewinde direkt mit der Flaschenabfüllmaschine verbunden. Durch den auf dem Kessel mit dem virusinaktiviertem Plasma anliegenden Stickstoffüberdruck wird das virusinaktivierte Blutplasma nach Öffnen des Bodenventils und der Stickstoffüberdrucklei­ tung durch den Sterilfilter zur Flaschenabfüllmaschine beför­ dert. Die Flaschenbefüllung stoppt automatisch, sobald die gewünschte Menge an Blutplasma den Durchflußimpulsgeber pas­ siert hat und dieser das Durchflußventil schließt. Die ge­ füllten Flaschen werden noch unter Reinstraumbedingungen mit einem silikonisierten, autoklavierten Gummistopfen (GT- Stopfen) verschlossen und anschließend in einer Apparatur un­ ter Rotation gefroren. Nach dem Frieren werden die Flaschen aus der Gefriervorrichtung entnommen, in Transportbehältnisse gestellt und bis zur Gefriertrocknung bei minus 30°C gela­ gert. Erst unmittelbar vor der Gefriertrocknung werden die gefüllten Glasflaschen aus dem minus 30°C Zwischenlager ent­ nommen. Unter Reinstraumbedingungen werden die Glasflaschen durch Anheben des Gefriertrocknungsstopfens geöffnet und das mehrere Tage dauernde Gefriertrocknungsprogramm gestartet.

Nach Beendigung der Gefriertrocknung werden die Flaschen noch unter Vakuum in der Gefriertrocknungskammer durch Anheben der Kammerbodenplatten und Eindrücken der Gummistopfen in die Glasflaschen automatisch verschlossen. Zur Entnahme der Glas­ flaschen wird die Lyophilisationskammer automatisch langsam belüftet, die Flaschen mit dem gefriergetrockneten Blutplasma entnommen und mit einem Testgerät überprüft, ob in den Fla­ schen ein Unterdruck herrscht. Anschließend werden die Fla­ schen verbördelt und konfektioniert.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläu­ tern.

BEISPIELE Beispiel 1 Rotationsgefrieren mit Ethanol als Kühlmedium

Eine 250 ml Glasflasche, die mit 200 ml flüssigem virusinak­ tiviertem Blutplasma gefüllt ist, wird mit einem Gummistopfen verschlossen und bei Raumtemperatur mit 800 U/min gedreht. Die rotierende Flasche wird anschließend in ein Ethanolbad, das auf eine Temperatur von minus 40°C eingestellt ist, ein­ getaucht. Man läßt 30 Minuten rotieren. Nach dem Gefriervor­ gang wird die Flasche in einem Tiefkühllager bei mindestens minus 30°C zwischengelagert und danach der Gefriertrocknung unterzogen.

Beispiel 2 Rotationsgefrieren mit flüssigem Stickstoff als Kühlmedium

Der Vorgang wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, jedoch mit dem Unterschied, daß die Flaschen bereits vor dem Eintauchen in das Kühlmedium bei 800 U/min rotieren. Dieser Vorgang wird solange durchgeführt, bis die Flüssigkeit in der Flasche die Form eines hohlen Zylinders angenommen hat. Erst danach er­ folgt das Eintauchen in das Kühlmedium flüssiger Stickstoff. Der Vorgang ist nach weniger als 5 Minuten beendet. Die Fla­ schen werden entnommen und bis zur Gefriertrocknung bei min­ destens minus 30°C zwischengelagert.

Claims (10)

1. Verfahren zur Herstellung von virusinaktivierten biolo­ gischen Flüssigkeiten in lyophilisierter Form durch Be­ handeln der biologischen Flüssigkeit mit virusinaktivie­ renden Substanzen, Entfernung der virusinaktivierenden Substanzen, wobei das Abfüllen der virusinaktivierenden biologischen Flüssigkeit in Behälter erfolgt, die man nach dem Füllen bei 600 bis 1000 U/min solange rotieren läßt, bis die Flüssigkeit im Behälter die Form eines hohlen Zylinders angenommen hat, Eintauchen der rotie­ renden Behälter in ein Kühlmedium, so daß die darin be­ findliche Flüssigkeit gefriert, Entnehmen des Behälters mit der gefrorenen Flüssigkeit und Lyophilisation der Flüssigkeit.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologischen Flüssigkeiten ausgewählt sind aus der Gruppe Blutplasma, Blutserum.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die biologische Flüssigkeit Blutplasma ist.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als virusinaktivierende Substanz ein Sol­ vens/Detergens-Gemisch eingesetzt wird.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als virusinaktivierende Substanz Tri-n-butylphosphat (TNBP) als Solvens und Alkylphenylpolye­ thylenglykole (Triton-X-100®) als Detergens eingesetzt werden.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß zur Entfernung der virusinaktivierenden Substanzen Pflanzenöle und/oder chromatographische Rei­ nigungsverfahren an C-18 Säulenmaterialien eingesetzt werden.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die virusinaktivierte biologische Flüssig­ keit vor dem Abfüllen einer Sterilfiltration unterzogen wird.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als runde Behälter Flaschen eingesetzt werden.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Eintauchen des Behälters je nach ver­ wendetem Kühlmedium für 1 bis 40 Minuten vorgenommen wird.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Kühlmedium ausgewählt ist aus der Gruppe Ethanol, flüssiger Stickstoff oder andere flüssi­ ge Gase oder Gasgemische.