ES2199284T3

ES2199284T3 - Procedimiento para producir una proteina.

Info

Publication number: ES2199284T3
Application number: ES96906136T
Authority: ES
Inventors: Hans Ageland; Lena Romander
Original assignee: Esperion Therapeutics Inc
Current assignee: Esperion Therapeutics Inc
Priority date: 1995-03-03
Filing date: 1996-03-01
Publication date: 2004-02-16
Anticipated expiration: 2016-03-01
Also published as: US6506879B1; DE69628148T2; SE9500778D0; US5990081A; NZ303325A; IL117320A0; PT813541E; JPH11501046A; AU4960796A; US5834596A; WO1996027608A1; DK0813541T3; ZA961679B; EP0813541B1; AU694623B2; DE69628148D1; ATE240348T1; EP0813541A1; IL117320A; CA2212125A1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LA APOLIPOPROTEINA A (APO A) O APOLIPOPROTEINA E (APOE) SUSTANCIALMENTE LIBRES DE ENDOTOXINA Y A UN PROCESO PARA LA PRODUCCION DE LAS MISMAS MEDIANTE LA SEPARACION DE LAS ENDOTOXINAS DE APOA O APOE, O VARIANTES O MEZCLAS DE LAS MISMAS, A TRAVES DEL CONTACTO DE UNA PRIMERA SOLUCION ACUOSA QUE CONTIENE LAS DICHAS APOA O APOE CON UNA MATRIZ QUE CONTIENE UN COMPUESTO INMOVILIZADO CON UN GRUPO TERMINAL QUE COMPRENDE DOS O TRES ATOMOS DE NITROGENO UNIDOS A UN ATOMO DE CARBONO, Y EL SUBSIGUIENTE TRATAMIENTO DE LA MATRIZ QUE CONTIENE UN COMPUESTO INMOVILIZADO CON UNA SEGUNDA SOLUCION ACUOSA QUE CONTIENE UN SURFACTANTE, O MEDIANTE EL CONTACTO DE UNA PRIMERA SOLUCION ACUOSA QUE CONTIENE DICHAS APOA O APOE CON UNA MATRIZ DE INTERCAMBIO ANIONICO, Y EL SUBSIGUIENTE TRATAMIENTO DE LA MATRIZ DE INTERCAMBIO ANIONICO CON UNA SEGUNDA SOLUCION ACUOSA QUE CONTIENE UN COMPUESTO QUE COMPRENDE DOS O TRES ATOMOS DE NITROGENO UNIDOS A UN ATOMO DE CARBONO. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN AL USO DE UNA MATRIZ QUE CONTIENE UN COMPUESTO INMOVILIZADO QUE COMPRENDE DOS O TRES ATOMOS DE NITROGENO UNIDOS A UN ATOMO DE CARBONO Y UNA SOLUCION QUE CONTIENE UN SURFACTANTE, O UNA MATRIZ DE INTERCAMBIO ANIONICO Y UNA SOLUCION QUE CONTIENE UN COMPUESTO QUE COMPRENDE DOS O TRES ATOMOS DE NITROGENO UNIDOS A UN ATOMO DE CARBONO, PARA LA ELIMINACION DE ENDOTOXINAS DE SOLUCIONES ACUOSAS QUE CONTIENEN APOA O APOE, O VARIANTES O MEZCLAS DE LAS MISMAS. LAS APOA O APOE ASI PRODUCIDAS PUEDEN UTILIZARSE PARA LA FABRICACION DE UN MEDICAMENTO PARA EL TRATAMIENTO DE LA ATEROSCLEROSIS Y ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES, ASI COMO EN UN METODO PARA EL TRATAMIENTO DE LA ATEROSCLEROSIS Y ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES CUANDO SE ADMINISTRAN EN UNA CANTIDAD TERAPEUTICAMENTE EFICAZ.

Description

Procedimiento para producir una proteína.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una apolipoproteína A (ApoA) o una apolipoproteína E (ApoE) sustancialmente exenta de endotoxinas y a un procedimiento para producir las mismas, por la separación de las endotoxinas de la ApoA o ApoE, o variantes o mezclas de las mismas, mediante la puesta en contacto de una primera solución acuosa que contiene dicha ApoA o ApoE con una matriz que contiene un compuesto inmovilizado con un grupo terminal que comprende dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono, y posteriormente mediante el tratamiento de la matriz que contiene un compuesto inmovilizado con una segunda solución acuosa que contiene un tensioactivo, o mediante la puesta en contacto de una primera solución acuosa que contiene dicha ApoA o ApoE con una matriz de intercambio aniónico, y posteriormente mediante el tratamiento de la matriz de intercambio aniónico con una segunda solución acuosa que contiene un compuesto que comprende dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono. La invención se refiere además al uso de una matriz que contiene un compuesto inmovilizado que comprende dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono y una solución que contiene un tensioactivo, o una matriz de intercambio aniónico y una solución que contiene un compuesto que comprende dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono, para la eliminación de las endotoxinas de soluciones acuosas que contienen ApoA o ApoE, o variantes o mezclas de las mismas. La ApoA o ApoE así producida puede usarse para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la aterosclerosis y las enfermedades cardiovasculares, así como en un procedimiento para tratar la aterosclerosis y las enfermedades cardiovasculares cuando se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz.

Antecedentes de la invención

La clara correlación entre niveles elevados de colesterol sérico y el desarrollo de enfermedad cardiaca coronaria (CHD) ha sido confirmada en repetidas ocasiones, basándose en estudios epidemiológicos y longitudinales. Sin embargo, la definición de mecanismos complejos de transporte de colesterol en plasma, ha permitido reconocer una función selectiva de las lipoproteínas circulantes en la determinación del riesgo de padecer CHD.

De hecho, hay cuatro lipoproteínas circulantes principales: los quilomicrones (CM), las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), de baja densidad (LDL) y de alta densidad (HDL). De éstas, las HDL están directamente implicadas en la eliminación del colesterol de los tejidos periféricos, al devolverlo o bien al hígado o bien a otras lipoproteínas, mediante un mecanismo que se conoce como ``transporte inverso del colesterol'' (RCT).

El papel ``protector'' de las HDL ha sido confirmado en varios estudios. Estudios recientes encaminados hacia el (los) mecanismo(s) protector(es) de las HDL se han centrado en la apolipoproteína A-I (ApoA-I), el componente principal de las HDL. Niveles plasmáticos elevados de ApoA-I están asociados con un riesgo reducido de CHD y de presencia de lesiones coronarias.

La ApoA-I plasmática es una cadena polipeptídica sencilla de 243 aminoácidos, cuya secuencia primaria es conocida (Brewer y col. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 623-630). La ApoA-I se sintetiza como un precursor de 267 aminoácidos en la célula. Se cree que el principal requisito estructural de la molécula de ApoA-I es la presencia de unidades repetidas de 11 ó 22 aminoácidos, de los que se supone que están en conformación de hélice anfipática (Segrest y col. FEBS Lett. (1974) 38: 247-253). Esta estructura permite las principales actividades biológicas de la ApoA-I, es decir, la unión de lípidos y la activación de la lecitina colesterol acilo transferasa (LCAT).

La apolipoproteína A-IMilano (ApoA-IM) es la primera variante molecular de la ApoA-I humana que se ha descrito (Franceschini y col. (1980) J. Clin. Invest. 66: 892-900). Se caracteriza por la sustitución de Arg 173 por Cys 173 (Weisgraber y col. (1983) J. Biol. Chem. 258: 2508-2513). La apolipoproteína mutante se transmite como un carácter dominante autosómico y se han identificado 8 generaciones de portadores (Gualandri y col. (1984) Am. J. Hum. Genet. 37: 1083-1097). El estado de un individuo portador de la ApoA-IM se caracteriza por una reducción extraordinaria del nivel de colesterol de HDL. Pese a ello, los sujetos afectados no parecen presentar riesgo aumentado de enfermedades arteriales. De hecho, por examen del árbol genealógico parece que estos sujetos puedan estar ``protegidos'' contra la aterosclerosis.

El mecanismo del posible efecto protector de la ApoA-IM en los portadores parece estar relacionado con una modificación en la estructura de la apolipoproteína mutante, con la pérdida de una hélice alfa y una exposición aumentada de residuos hidrófobos (Francheschini y col. (1985) J. Biol. Chem. 260: 1632-1635). La pérdida de la estructura compacta de las múltiples hélices alfa lleva a una flexibilidad aumentada de la molécula que se asocia más fácilmente con los lípidos, en comparación con la ApoA-I normal.

Otra característica muy específica de la ApoA-IM es su capacidad para formar dímeros consigo misma y complejos con la ApoA-II, en ambos casos por la presencia del residuo de Cys.

Para hacer posible la producción de suficientes cantidades de ApoA-I en general, y más específicamente de ApoA-IM, se hace uso de las técnicas del ADN recombinante, por ejemplo, en E. coli. Así, se describen preparaciones recombinantes y uso de ApoA-IM, monómeros así como dímeros, en las memorias descriptivas de las patentes WO-A-88/03166 atribuida a Farmitalia Carlo Erba (FICE), WO-A-90/12879 atribuida a Sirtori y col., así como WO-A-93/12143 y WO-A-94/13819 ambas atribuidas a Pharmacia AB (antes Kabi Pharmacia AB).

El uso de, por ejemplo, E. coli como medio introduce ciertos inconvenientes. Así, las endotoxinas o los lipopolisacáridos (LPS) son complejos de alto peso molecular asociados con la membrana externa (pared celular) de las bacterias Gram negativas, tales como E. coli, Proteus y Salmonella. Las endotoxinas constan de dos partes principales, un resto lipídico denominado lípido A que se encuentra incrustado en la membrana externa y un polisacárido (antígeno O) que sobresale en el entorno. El lípido A es la región que provoca el efecto tóxico de las endotoxinas, siendo un prerrequisito la presencia del resto de lípido A entero. El polisacárido está hecho de una cadena O-específica y un núcleo. La cadena O-específica se proyecta desde el núcleo y es la parte más externa de la endotoxina. El núcleo sirve de enlace entre el lípido A y la cadena O-específica.

Se sabe que las endotoxinas deben liberarse de la superficie bacteriana para provocar efectos tóxicos. Esto ocurre cuando las bacterias se multiplican, en la lisis y durante el estrés. En las soluciones acuosas, las endotoxinas libres forman agregados, micelas y vesículas con un peso molecular de aproximadamente 5 kDa hasta > 10^{3} kDa.

Se sabe de la bibliografía que varias proteínas forman complejos con las endotoxinas. Se forman complejos particularmente sólidos con las HDL y las apolipoproteínas (Emancipator y col. (1992) Infect. Immun. 60: 596-601). Según Ulevitch y col. (1981) J. Clin. Invest. 67: 827-837, la formación de un complejo entre las HDL y las endotoxinas implica un mecanismo en dos etapas, como sigue:

Endotoxinas_{(agregadas)}\rightarrow Endotoxinas_{(desagregadas)}(1)

Endotoxinas_{(desagregadas)} + HDL \rightarrow Endotoxinas-HDL(2)

Este comportamiento ha sido confirmado, por ejemplo, por Munford y col. (1981) Infect. Immun. 34: 835-843. Hay indicios que sugieren que el lípido A es el factor principal en el complejo y que la interacción implica a fuerzas tanto iónicas como hidrófobas (Freudenberg y col. (1979) Nat. Toxins, Proc. Int. Symp. Anim. Plant Microb. Toxins, 6º, 349-354).

Como ya se indicó arriba, se forman complejos sólidos entre las endotoxinas y las HDL en general y en particular con las apolipoproteínas. Este mecanismo se ha usado en el documento US-A-5.128.318 atribuido al instituto Rogosin. El documento US-A-5.128.318 se refiere pues a una apolipoproteína asociada a las HDL que contiene partículas reconstituidas, y el uso de la misma para eliminar materiales lipídicos solubles, incluidas endotoxinas, de las células, fluidos corporales, y similares. Más concretamente, el documento US-A-5.128.318 se refiere a un procedimiento para tratar un sujeto para la toxicidad provocada por endotoxinas, mediante la administración de una partícula reconstituida que contiene ApoA-I o ApoA-II al sujeto, con o sin colesterol. En este caso, por supuesto, el propósito es crear y mantener de forma indefinida el complejo más sólido posible, para evitar la liberación de las endotoxinas en el sujeto.

Los complejos, sólidos en sí, se pueden reforzar aún más, por ejemplo, por la presencia de ciertos compuestos químicos. Así, se sabe que el desoxicolato desagrega las endotoxinas según la fórmula (1) anterior (Munford y col., véase arriba y Emancipator y col., véase arriba). A continuación, el desoxicolato aumenta la unión de las endotoxinas a las HDL según la fórmula (2). El resultado es un complejo de las endotoxinas con las HDL que es muy difícil de separar.

Se conocen procedimientos generales anteriores para reducir o eliminar el efecto de las endotoxinas. Así, el documento EP-A-494848 atribuido a Pharmacia describe procedimientos para inhibir efectos inducidos por las endotoxinas. Una primera realización se refiere a la infusión de un medicamento que contiene arginina o derivados de la arginina para el tratamiento de un efecto inducido por endotoxinas, por ejemplo, una fiebre. Una segunda realización se refiere a un procedimiento para eliminar endotoxinas del agua o de soluciones acuosas mediante la filtración del agua o la solución acuosa a través de un lecho que contiene arginina inmovilizada o un derivado de la arginina. Para ilustrar la segunda realización, se llevaron a cabo pruebas con endotoxinas de E. coli en columnas que contenían Arginina Sepharose® de Pharmacia Biotech de Uppsala, Suecia. La interacción es débil sin embargo, y por lo tanto mucho más fácil de separar en proteína y endotoxinas que en el caso que se daría con los complejos sólidos entre las apolipoproteínas y las endotoxinas.

La cromatografía de intercambio aniónico se usa frecuentemente en la eliminación de endotoxinas de soluciones que contienen proteínas tales como uroquinasa, interferón, asparraginasa y albúmina (Sharma (1986) Biotech. Applied Biochem. 8: 5-22). Sin embargo, la interacción entre las proteínas y las endotoxinas es mucho más débil que los complejos que se forman entre las apolipoproteínas y las endotoxinas.

El documento EP-A-333474 para Mitsui Toatsu se refiere a un procedimiento para eliminar endotoxinas de proteínas mediante la puesta en contacto de una solución acuosa contaminada con endotoxinas que contiene la proteína con un adsorbente de proteínas, el lavado del adsorbente con una solución que contiene un compuesto aminado, y la posterior elución de las proteínas del adsorbente. Las únicas proteínas que se dan a modo de ejemplo son al activador del plasminógeno tisular (t-PA), la sueroalbúmina humana y el inhibidor de la inter-\alpha-tripsina. Son ejemplos de adsorbentes de proteínas los geles de cromatografía de afinidad, adsorción, hidrófoba y con quelatos metálicos.

El sulfato de polimixina B es un polipéptido antibiótico que tiene la capacidad de prevenir los efectos tóxicos de las endotoxinas por interacción con el resto de lípido A. Karplus y colaboradores (Karplus y col. (1987) J. Immuno. Methods 105: 211-220) han usado este conocimiento para adsorber endotoxinas a Polimixina Sepharose® 4B, que vende Pharmacia AB de Uppsala, Suecia. Sin embargo, la polimixina es biológicamente activa en sí y por ello no es adecuada para eliminar endotoxinas de soluciones para inyección por vía intravenosa (H. Matsumae y col. (1990) Biotechn. Biochem. 12: 129-140).

El PROSEP® Remtox que vende Bioprocessing Ltd. de Gran Bretaña, es una matriz preparada para la eliminación específica de endotoxinas de sustancias de bajo y alto peso molecular, tales como antibióticos, vitaminas, enzimas, anticuerpos y productos sanguíneos. El gel consiste en un ligando sintético de bajo peso molecular no proteico, no carbohidrato.

Los filtros cargados son capaces de eliminar endotoxinas y otras moléculas cargadas negativamente de distintas soluciones. Por ejemplo, Pall del Reino Unido ofrece filtros de Posidyne™, que consisten en un medio de filtro de nailon 66 hidrófilo que contiene grupos de amonio cuaternario por toda la estructura de la membrana. La capacidad de retención del filtro es independiente de la temperatura y es óptima a un pH de 5-8 y a un caudal bajo.

Actualmente hay varios procedimientos conocidos para reducir o eliminar la influencia de las endotoxinas en soluciones de proteínas de manera general. Por ejemplo, Anspach y col., 1995 (Journal of Chromatography A., Vol. 711: 81-92) estudian la eliminación de endotoxinas procedentes de E. coli mediante adsorbentes por afinidad de histidina, histamina y polimixina B, pero concluyen que los resultados de estos estudios no se pueden trasladar a condiciones en las que hay proteínas que están presentes. Este documento enseña que cada procedimiento de descontaminación se debe optimizar por separado.

Por lo tanto, no hay procedimiento existente para superar la fuerte interacción entre las endotoxinas y la ApoA o la ApoE. La presente invención tiene el propósito de resolver este problema.

Descripción detallada de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento de purificación eficaz para producir ApoA o ApoE con un muy bajo contenido en endotoxinas.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento eficaz, en el que se conserva esencialmente la actividad de la ApoA o la ApoE.

Un objetivo adicional de la presente invención es un procedimiento que proporciona un alto rendimiento de ApoA o ApoE, es decir, un procedimiento con una pérdida mínima de producto.

Los objetivos anteriores están alcanzados por la presente invención, que se refiere a un procedimiento para producir una apolipoproteína A (ApoA) o una apolipoproteína E (ApoE) sustancialmente exenta de endotoxinas o variantes o mezclas de las mismas mediante la separación de las endotoxinas de la ApoA o la ApoE que se han producido mediante una técnica de ADN recombinante, dicho procedimiento caracterizándose por la puesta en contacto de una primera solución acuosa que contiene dicha ApoA o ApoE con una matriz que contiene un compuesto inmovilizado con un grupo terminal que comprende dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono, y posteriormente mediante el tratamiento de la matriz que contiene un compuesto inmovilizado con una segunda solución acuosa que contiene un tensioactivo, o mediante la puesta en contacto de una primera solución acuosa que contiene dicha ApoA o ApoE con una matriz de intercambio aniónico, y posteriormente mediante el tratamiento de la matriz de intercambio aniónico con una segunda solución acuosa que contiene un compuesto que comprende dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono.

Los inventores de la presente invención han encontrado sorprendentemente que las matrices que contienen, por ejemplo, arginina, guanidina o histidina inmovilizada pueden usarse para unir fuertemente las endotoxinas, y de ese modo la ApoA y la ApoE, a la matriz. Al realizar la elución posteriormente con una solución que contiene tensioactivos, se pueden liberar las moléculas de ApoA o ApoE, mientras que las endotoxinas siguen unidas a la matriz. También es posible unir fuertemente las ApoA o ApoE y de ese modo las endotoxinas a una matriz de intercambio aniónico. Al realizar la elución posteriormente con una solución que contiene, por ejemplo, urea o arginina, o sales de guanidina o histidina, se pueden liberar las endotoxinas, mientras que las moléculas de ApoA o ApoE siguen unidas a la matriz. Finalmente, se pueden liberar las moléculas de ApoA o ApoE de la matriz mediante el aumento de la fuerza iónica.

La selección de condiciones en las cuales llevar a cabo el presente procedimiento se regirá por el deseo de alcanzar la concentración más baja posible de las endotoxinas, mientras se obtenga al mismo tiempo una recuperación aceptable de ApoA o ApoE.

Con el presente procedimiento es posible producir ApoA o ApoE que están sustancialmente exentas de endotoxinas. En la presente invención, sustancialmente exentas de endotoxinas significa una concentración por debajo de aproximadamente 1 UE/mg de ApoA o ApoE. Específicamente, es posible producir ApoA o ApoE sustancialmente exenta de endotoxinas que han sido producidas mediante técnica de ADN recombinante, más específicamente en bacterias Gram negativas, e incluso más específicamente en E. coli.

Con el presente procedimiento es posible producir ApoA o ApoE con un bajo contenido en endotoxina en combinación con una recuperación de proteínas de por lo menos 70%, adecuadamente por lo menos 80%, preferiblemente por lo menos 90% y más preferiblemente por lo menos 95%.

La presente invención se refiere también al uso de una matriz que contiene un compuesto inmovilizado con un grupo terminal que comprende dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono y una solución que contiene un tensioactivo, o una matriz de intercambio aniónico y una solución que contiene un compuesto que comprende dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono, para la eliminación de las endotoxinas de soluciones acuosas que contienen ApoA o ApoE, o variantes o mezclas de las mismas.

La presente invención se refiere además al uso de la ApoA o la ApoE producida según el procedimiento de la invención para la fabricación de un medicamento que comprende la ApoA o la ApoE en el tratamiento de la aterosclerosis y de enfermedades cardiovasculares.

En una primera realización, se carga una solución acuosa que contiene ApoA o ApoE en una matriz con ligandos inmovilizados con un grupo terminal que comprende dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono. Posteriormente, se separa el complejo de ApoA o ApoE y endotoxinas por elución con una solución acuosa que contiene un tensioactivo, por lo cual se libera la ApoA o la ApoE mientras que las endotoxinas quedan unidas a los ligandos. Finalmente, se regenera la matriz por lavado con uno o más líquidos que contienen varias combinaciones de, por ejemplo, NaOH, C_{2}H_{5}OH, HAc y NaAc.

Los ejemplos de grupos terminales que se pueden usar en la presente invención son aquellos que contienen un grupo guanidino, por ejemplo la arginina y la guanidina, o un grupo heterocíclico, por ejemplo, la histidina. Adecuadamente, los grupos terminales son no heterocíclicos, preferiblemente conteniendo un grupo guanidino, lo cual hace de los grupos terminales bases fuertes. El grupo terminal que contiene un grupo guanidino es más preferiblemente arginina o guanidina, muy preferiblemente arginina. Los grupos terminales pueden estar unidos directamente a la matriz. Sin embargo, el grupo terminal se encuentra más habitualmente unido a la matriz a través de un espaciador, que puede ser inerte o exhibir una capacidad de unión adicional. Los espaciadores bien adecuados para el presente procedimiento se pueden encontrar, por ejemplo, en la arginina unida a Sepharose® e histidina unida a Minileak®.

En una segunda realización, se carga una solución acuosa que contiene ApoA o ApoE en una matriz de intercambio aniónico. Posteriormente, se separan los complejos de ApoA o ApoE y endotoxinas por elución con una solución acuosa que contiene un compuesto que comprende dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono. De esta manera, las endotoxinas se liberan mientras que la ApoA o la ApoE se quedan unidas a los ligandos. Son ejemplos adecuados de compuestos que contienen nitrógeno el clorhidrato de urea, de arginina y de guanidina. Finalmente, la ApoA y la ApoE se liberan de la matriz al aumentar la fuerza iónica, adecuadamente de aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 2 M, preferiblemente por adición de NaCl.

Convencionalmente, en los procedimientos para purificar proteínas se mantienen las concentraciones de por ejemplo clorhidrato de urea y de guanidina a un mínimo para evitar la desnaturalización irreversible de la proteína en cuestión. Sorprendentemente, los inventores han encontrado que una concentración superior a la convencional de compuesto que contiene nitrógeno es ventajosa cuando se lleva a cabo la presente invención, puesto que hace posible que se destape el complejo sólido entre las endotoxinas y la ApoA. Por lo tanto, la concentración de urea debería encontrarse en el intervalo de aproximadamente 0,75 M hasta la saturación a la temperatura reinante, adecuadamente en el intervalo de 2,5 M hasta 8 M, preferiblemente de 4,5 hasta 7,5 M. Dentro de las capacidades de una persona experta en la materia se encuentra el escoger las concentraciones correspondientes para, por ejemplo, el clorhidrato de guanidina y la arginina.

En una tercera realización, se combinan la primera y la segunda realización de tal modo que proporcionen un producto con un muy bajo nivel de endotoxinas. Así, se puede cargar la solución acuosa que contiene la ApoA o la ApoE en una etapa de intercambio aniónico tras lo cual se liberan las endotoxinas por elución con un compuesto que comprende dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono. Las ApoA o ApoE con una concentración reducida de endotoxinas, se liberan de la matriz de intercambio aniónico, y, opcionalmente, tras una o más etapas de procesamiento intermedias tales como etapas de desalinización, las ApoA o ApoE que se obtienen se cargan en una matriz con compuestos inmovilizados con grupos terminales que comprenden dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono. Finalmente, las ApoA o ApoE se pueden liberar en una forma muy pura. Se puede usar también la secuencia invertida, es decir, una primera etapa con una matriz que contiene ligandos inmovilizados, y una segunda etapa con la matriz de intercambio aniónico lo cual es una ventaja de la presente invención.

Las matrices de la presente invención pueden ser solubles o insolubles en diversos disolventes comunes, por ejemplo, polímeros orgánicos solubles o insolubles en agua con o sin etanol. Las matrices incluyen también, por ejemplo, filtros a los que se han acoplado ligandos que comprenden dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono.

Los compuestos inmovilizados con un grupo terminal que comprende dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono pueden ser soportados en cualquier matriz inorgánica u orgánica. Así, la matriz se puede escoger de entre diversas matrices fuertemente hidrófilas, por ejemplo, matrices de agarosa tales como una amplia diversidad de matrices de Sepharose® que vende Pharmacia Biotech de Uppsala, Suecia, matrices de polímeros orgánicos tales como los geles TSK que vende Tosoh Corp. de Tokio, Japón, o matrices de polímero orgánico muy porosas que vende Per Septive Bio-systems de Boston, EE.UU. La matriz es preferiblemente una matriz de agarosa. Las matrices de agarosa adecuadas en la presente invención son, además de Sepharose®, Minileak® que vende Kem-En-Tec A/S de Copenhague, Dinamarca y Bio-Gel A que vende Bio-Rad, de Bruselas, Bélgica. Preferiblemente, la matriz se entrecruza de manera a permitir un caudal elevado (FF) y de ese modo una alta capacidad de producción.

Las matrices de intercambio aniónico útiles en un procedimiento según la segunda realización son, por ejemplo, matrices de agarosa tales como las matrices de DEAE Sepharose® y de Q Sepharose® que vende Pharmacia Biotech de Uppsala, Suecia. Son ejemplos adicionales de matrices de intercambio aniónico que se pueden usar en el presente procedimiento el Super Q-650 y el Fractogel EMD DEAE-650 que vende Toso Haas de Tokio, Japón, e Hyper D que vende Biosepra S.A. de Francia. La matriz de intercambio aniónico es adecuadamente una matriz de agarosa. Preferiblemente, la matriz de intercambio aniónico se entrecruza de manera a permitir un caudal elevado (FF) y de ese modo una alta capacidad de producción.

La presente invención se usa ventajosamente para eliminar endotoxinas de cualquier apolipoproteína A (ApoA) o apolipoproteína E (ApoE), o variantes o mezclas de las mismas. La presente invención es particularmente adecuada cuando las ApoA o las ApoE están producidas por una técnica de ADN recombinante en bacterias Gram negativas, y en particular cuando se producen en E. coli. En la presente invención, los términos ApoA y ApoE incluyen cualquier forma previa o fragmento, o cualquier forma truncada, extendida o mutada, o cualquier mezcla de cualquiera de estas formas o fragmentos. Forma previa se refiere, por ejemplo, a la forma de Met 249 aminoácidos de ApoA-I como se describe en el documento WO-A-88/03166 atribuido a Sirtori y col. Otras formas previas son las proapolipoproteínas A-I descritas en el documento US-A-5059528 para UCB así como en los documentos EP-A-308336, JP216988/1984 y JP252048/1987 todas para Mitsubishi Chem. Ind. Fragmento se refiere a una parte de ApoA o ApoE que contiene por lo menos una hélice alfa, por ejemplo, como se describe en el documento WO-A-93/25581 atribuido a Innogenetics S.A. de Bélgica. Formas truncadas o extendidas se refiere a moléculas de ApoA o ApoE en las que falta o se han añadido uno o más aminoácidos, respectivamente, en los extremos N y/o C terminales de las moléculas. Adecuadamente, faltan o se han añadido de dos hasta ocho aminoácidos, preferiblemente de tres hasta seis aminoácidos. Formas mutadas se refiere a moléculas de ApoA o ApoE en las que uno o más aminoácidos han sido sustituidos por otro aminoácido, por ejemplo, la ApoA-IM como se describe en los documentos WO-A-93/12143 y WO-A-94/13819. Otras formas mutadas son la ApoA-ISeattle (Deeb y col (1991) J. Bio. Chem. 266:13654-13660), la ApoA-IYame (Takada y col (1991) J. Lipid Res. 32: 1275 y sgtes.), y una forma mutada de ApoA-I aún sin denominar (Matsunaga y col (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2793-2797).

La ApoE humana y variantes de la misma están descritas en ``Human Apolipoprotein Mutants III'', ed. por C.R. Sirtori y col (1993) Nato ASI Series, Springer Verlag, Berlin, II 73:81-96.

La presente invención se puede usar con ventaja para eliminar endotoxinas de las ApoA así como de las ApoE. Sin embargo, en la siguiente descripción, se hará uso de ApoA para describir más detalladamente la presente invención.

Las ApoA que se conocen son, por ejemplo, la ApoA-I, la ApoA-II y la ApoA-IV. En la presente invención, adecuadamente, la ApoA es la ApoA-I, o variante o mezclas de la misma. La ApoA-I natural es una cadena polipeptídica sencilla, compuesta de 243 aminoácidos. Más adecuadamente, la ApoA es una forma mutada de la ApoA-I en la que se ha sustituido por lo menos un residuo de Arg por un residuo de Cys lo cual hace posible la formación de dímeros unidos por disulfuro. En la secuencia de aminoácidos de la ApoA-I natural humana, los residuos de Arg están situados en las posiciones 10, 27, 61, 83, 116, 123, 131, 149, 151, 153, 160, 171, 173, 177, 188 y 215. De éstas, se prefieren las sustituciones en una o más de las posiciones 160, 171, 173, 177 y 188, es decir en posiciones dentro de la misma hélice alfa. Más preferiblemente, el residuo de Arg se sustituye en las posiciones 171 y/o 173.

La apolipoproteína A-IMilano (ApoA-IM) humana es una forma mutada que existe en la naturaleza de la ApoA-I normal (Weisgraber y col (1980) J. Clin. Invest. 66: 901-907). En la ApoA-IM, un residuo del aminoácido arginina (Arg 173) ha sido sustituido por un residuo del aminoácido cisteína (Cys 173). Puesto que la ApoA-IM contiene un residuo de cisteína por cadena polipeptídica, puede existir como un monómero o como un dímero unido por un disulfuro. El peso molecular del monómero es de aproximadamente 28.000 Da y para el dímero de aproximadamente 56.000 Da. Estas dos formas son químicamente intercambiables, y en el presente contexto, el término ApoA-IM no hace distinciones entre las dos formas.

La concentración inicial de endotoxina en la solución acuosa que contiene ApoA puede ser superior a 10^{6}, superior a 10^{7} e incluso superior a 10^{8} UE/mg de proteína. La concentración final de endotoxina se puede reducir hasta por debajo de 100 UE/mg, mediante la aplicación de la presente invención a soluciones acuosas que contienen ApoA. Adecuadamente, la concentración final de endotoxina se reduce hasta por debajo de aproximadamente 10 UE/mg, y preferiblemente hasta por debajo de 1 UE/mg, lo cual hace la ApoA sustancialmente exenta de endotoxinas.

Para conseguir bajos niveles de endotoxina en las soluciones acuosas que contienen ApoA, puede ser necesario recircular la solución de modo a que entre en contacto con la matriz por lo menos dos veces. También es posible, por supuesto, usar la misma o matrices distintas en por lo menos dos pasos sucesivos, para alcanzar un nivel de endotoxinas suficientemente bajo. De cualquiera de estas maneras, es posible reducir la concentración inicial de endotoxinas por lo menos 10^{4} veces, adecuadamente por lo menos 10^{5} veces, y preferiblemente por lo menos 10^{6} veces en el procedimiento.

Normalmente la matriz se equilibra con un primer tampón antes de que se cargue la muestra que contiene la ApoA en la matriz. Después de la carga, la matriz se trata con un segundo tampón para realizar la elución de la ApoA esencialmente exenta de endotoxinas de la matriz.

En una realización preferida, la primera solución acuosa que contiene ApoA contiene además un tensioactivo. El tensioactivo se añade para desagregar por lo menos parcialmente los complejos entre las endotoxinas y la ApoA antes de poner dicha primera solución acuosa con la matriz. Por lo tanto, al mantener la primera solución acuosa que contiene un tensioactivo durante por lo menos 5 min antes de poner en contacto dicha primera solución acuosa con la matriz, se hace más fácil la interacción entre el complejo y el ligando particular. Adecuadamente, el tensioactivo se añade y la solución obtenida se mantiene durante un periodo de tiempo en el intervalo de 15 min hasta 10 h, preferiblemente de 30 min hasta 4 h, antes de que se ponga en contacto con la matriz.

Es un prerrequisito en la primera realización, y se prefiere en la segunda realización, que el tampón de elución contenga un tensioactivo, adecuadamente uno que se sea aniónico tal como el dodecilsulfato sódico (SDS). El tensioactivo aumenta el efecto del compuesto que comprende dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono, probablemente al destapar el complejo sólido entre las endotoxinas y la ApoA, y separando posteriormente las endotoxinas de la ApoA. La separación está muy probablemente controlada por cinética de reacción, motivo por el cual el periodo de tiempo antes de que se alcance el equilibrio puede ser importante.

Son ejemplos de tensioactivos que se pueden usar con ventaja en la presente invención los distintos ácidos biliares o sales de los mismos, tales como el desoxicolato sódico y el colato sódico. También se pueden usar con ventaja en la presente invención tensioactivos no iónicos, por ejemplo tensioactivos de carga neta nula tales como los ésteres grasos de polioxietileno sorbitán, copolímeros de bloque, y etoxilatos de alquilo. Son ejemplos de ésteres grasos de polioxietileno sorbitán el monolaurato de polioxietileno-(20)-sorbitán, por ejemplo el Tween® 80, y el monooleato de polioxietileno-(20)-sorbitán, por ejemplo el Tween® 20, ambos vendidos por ICI de Gran Bretaña. Son ejemplos de los copolímeros de bloque las combinaciones de polipropilenglicol y polietilenglicol, por ejemplo el Pluronic® que vende BASF en Alemania. Son ejemplos de etoxilatos de alquilo el Triton® X-100 y el Triton® X-114 vendidos por Union Carbide en EE.UU.

En la presente invención, tensioactivo incluye también diversos lípidos, que pueden ser compuestos naturales o sintéticos que consisten en portadores de acilos, tales como los glicéridos, la esfingosina, el colesterol, o derivados o mezclas de los mismos, a los que pueden estar unidos uno o más aminoácidos. Los lípidos pueden, según su polaridad, dividirse en lípidos no polares, polares y anfífilos. Son ejemplos de lípidos no polares los monoacilglicéridos, los diacilglicéridos, los triacilglicéridos, y el colesterol. Son ejemplos de lípidos polares y anfífilos, los fosfolípidos y los glicolípidos. Adecuadamente, los lípidos polares y anfífilos son formadores de bicapas, tales como la fosfatidilcolina (PC), el fosfatidilinositol (PI), el fosfatidilglicerol, la fosfatidiletanolamina, las fosfatidilserina, la esfingomielina, o mezclas de los mismos. Los lípidos naturales pueden producirse a partir de, por ejemplo, el aceite de soja, el aceite de maíz, la lecitina de soja y la lecitina de huevo. Otros ejemplos adecuados son las PC sintéticas y saturadas o insaturadas, tales como la dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) y la dimiristil fosfatidilcolina (DMPC).

La concentración de tensioactivo en el tampón de elución puede encontrarse en el intervalo de aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 200 mM, adecuadamente de 10 mM hasta 100 mM. La concentración del tensioactivo se encuentra preferiblemente en el intervalo de 15 mM hasta 50 mM.

El pH del tampón de elución se encuentra adecuadamente en el intervalo de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 9, y preferiblemente en el intervalo de 6 hasta 8.

La fuerza iónica total del tampón de elución puede encontrarse en el intervalo de 0,1 hasta aproximadamente 20 mS/cm, adecuadamente de 1 hasta 8 mS/cm, y preferiblemente de 2 hasta 5 mS/cm.

El tampón de equilibrado, el tampón de pretratamiento, el tampón de lavado de las muestras y el tampón de elución pueden ser idénticos o distintos. La concentración de tensioactivo, el pH y la fuerza iónica total pueden tomar los mismos o distintos valores que los que se proporcionan para el tampón de elución.

El procedimiento puede ser continuo, por ejemplo, llevarse a cabo en una columna, o discontinuo.

Tiene ventajas, cuando se lleva a cabo la presente invención, hacer uso de una alta temperatura, ya que una alta temperatura destapa más fácilmente el complejo sólido entre las endotoxinas y las ApoA. Sin embargo, la temperatura se restringe al intervalo en el que no se produce desnaturalización irreversible de la proteína. Así, cuando se lleva a cabo la presente invención, la temperatura puede encontrarse en el intervalo de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 95ºC, adecuadamente de 15 hasta 90ºC, preferiblemente de 30 hasta 85ºC, más preferiblemente de 40 hasta 75ºC.

\newpage

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar más aún la presente invención, sin restringir el alcance de dicha
invención.

Parte experimental Materiales

Se usó ApoA-IM parcialmente purificada en tampón fosfato 20 mM, pH = 7 como material de partida en todas las pruebas que se llevaron a cabo. Fue producida en E. coli por Pharmacia AB en Estocolmo, Suecia.

Las pruebas de separación se llevaron a cabo en diversos geles. En la presente, gel se refiere a una matriz con compuestos inmovilizados unidos a la misma. Así, las pruebas se llevaron a cabo en gel de arginina Sepharose® 4B y en un gel de intercambio aniónico, el gel Q Sepharose® FF, ambos vendidos por Pharmacia Biotech de Uppsala, Suecia. Las pruebas se llevaron también a cabo en gel Prosep® Remtox que vende Bioprocessing Ltd. de Gran Bretaña, y en un filtro cargado de N66 Posidyne® con disco de filtro, que vende Pali de Gran Bretaña.

Las pruebas analíticas se llevaron a cabo con Coatest Endotoxin y Endo-LAL, ambas vendidas por Chromogenix de Mölndal, Suecia.

Procedimientos analíticos

Se determinó la cantidad de ApoA-IM mediante el uso de RP-HPLC. El procedimiento se usa para identificar ApoA-IM en los cromatogramas y calcular el rendimiento en los distintos procedimientos. La desviación típica relativa (RSD) del procedimiento es de 11%.

Se usó espectrofotometría en UV para la detección de proteínas en los procedimientos cromatográficos. Se midió la absorbancia a 280 nm.

La prueba del producto de lisis del amebocito de Limulus (prueba LAL) es un procedimiento específico para medir la concentración de endotoxinas. La prueba se basa en los mecanismos de coagulación sanguínea primitivos en el cangrejo cacerola, Limulus polyphemus. Los resultados se proporcionan en la unidad UE, que es equivalente a 0,1 ng de una media de diversas endotoxinas.

La prueba de punto final de coagulación en gel, también conocida como Endo-LAL es vendida por Chromogenix de Mölndal, Suecia. En esta prueba, se mezclan un mismo volumen de reactivo de LAL (preparado a partir de células de amebocito de cangrejo cacerola sometidas a lisis) y de solución de prueba y se incuba a 37ºC durante una hora.

La prueba de sustrato cromogénico, también conocida como Coatest Endotoxin y vendida por Chromogenix de Mölndal, Suecia, es un procedimiento cuantitativo, relativamente nuevo, que se lleva a cabo en una placa de microvaloración y se lee por espectrofotometría a 405 nm. Este procedimiento contiene las enzimas específicas que se activan en presencia de endotoxinas. Las enzimas activadas separan la para-nitroanilina (pNA) de un sustrato sintético. La pNA liberada forma un color amarillo que es proporcional a la cantidad de endotoxinas presentes en la mezcla de reacción. Se realiza una curva patrón y se leen las cantidades de endotoxinas. Se detiene el desarrollo del color mediante la adición de ácido acético. Se informa de que el procedimiento tiene una desviación típica relativa (RSD) del 25%.

Ejemplos Ejemplo 1 Pruebas 1a a 1g (geles)

Se llevaron a cabo cinco pruebas en Arginina Sepharose® (pruebas 1a a 1e) según la invención. A efectos de comparación, se llevó a cabo una prueba en Arginina Sepharose® mediante el uso de un tampón sin tensioactivo (prueba 1f). A efectos de comparaciones adicionales mediante el uso de un tampón de elución con tensioactivo, se llevó a cabo una prueba en Prosep® Remtox (prueba 1g) y dos en filtros cargados Posidyne™ (1h a 1i).

Para conseguir resultados comparables entre los diversos procedimientos, las pruebas 1a a 1g se llevaron a cabo de una manera similar, cada una en un ciclo. Sin embargo, el Prosep® Remtox no resiste al tratamiento con NaOH 0,5 M. Por ello, el programa de limpieza en la prueba 1g constituye un programa modificado, en el que la concentración de NaOH es 0,1 M.

Todas las pruebas se llevaron acabo a temperatura ambiente (aproximadamente 20ºC).

Caudal de empaquetamiento: 1 ml/min

Altura del lecho: 7,5 a 9,5 cm

Volumen del gel: 6 a 7 ml

Modo de equilibrado

Tampón de equilibrado (tampón 1): Tris-HCl 0,1 M + desoxicolato sódico aproximadamente 20 mM, pH = 8

Caudal en el equilibrado: 0,5 ml/min

Volumen total de tampón: 5 volúmenes de columna

Tratamiento de las muestras: Se añadió desoxicolato sódico aproximadamente 20 mM a la muestra y se mezcló la solución durante 30 min antes de cargarla en la columna.

Modo de carga

Carga de las muestras: aproximadamente 1 mg de ApoA-IM/ml de gel

Caudal: 0,2 ml/min

Modo de elución

Tampón de elución (tampón 1): Tris-HCl 0,1 M + desoxicolato sódico aproximadamente 20 mM, pH = 8

Caudal en la elución: 0,2 ml/min

Modo de limpieza

Después de la elución, se lavaron los geles de Arginina Sepharose® y de Prosep® Remtox con 4,5 volúmenes de columna de un primer líquido de lavado que contenía C_{2}H_{5}OH al 50% y HAc al 5%, seguido de 4,5 volúmenes de columna de un segundo líquido de lavado que contenía NaOH 0,5 M (pruebas 1a a 1g). Los lavados se llevaron a cabo tres veces.

Pruebas 1h a 1i (filtros cargados)

Se llevaron a cabo dos pruebas en filtros cargados Posidyne™ (pruebas 1h a 1i) a efectos de comparación con el procedimiento según la invención. Las pruebas se llevaron a cabo en un ciclo cada una.

En las dos pruebas, los filtros se colocaron en un disco de filtros, se conectó una bomba y se eliminó el aire del sistema.

Modo de equilibrado

Caudal: 1 ml/min

Duración: 40 min

Tampón de equilibrado (tampón 1) en la prueba 1h: Tris-HCl 0,1 M, pH = 8

Tampón de equilibrado (tampón 2) en la prueba 1i: Tris-HCl 0,1 M + desoxicolato sódico aproximadamente 20 mM, pH = 8

Tratamiento de las muestras: Se añadió 4 ml de tampón 1 en la prueba 1h y 4 ml de tampón 2 en la prueba 1i a las muestras y se mezclaron las soluciones durante 30 min antes de cargarlas en el sistema de filtros.

Modo de carga

Muestras: 1,2 mg de ApoA-IM/ml de solución de muestra, volumen total 1 ml

Carga: Se hicieron circular las muestras en el sistema de filtros durante 30 min, tras lo cual se recogió el producto.

Los filtros se desecharon después de cada prueba.

Los valores de endotoxina se analizaron con el procedimiento del sustrato cromógeno de LAL (pruebas 1a a 1i). La concentración de las endotoxinas antes del tratamiento según la presente invención, se encontraba entre 10^{6} y 10^{7} UE/mg en todas las pruebas.

Los resultados quedan claros a partir de la tabla siguiente.

TABLA I

Procedimientos en una etapa para reducir la concentración de endotoxinas en ApoA.

Prueba nº	Procedimiento	Recuperación (%)	UE/mg en el	Reducción
			producto final	(veces)
Valores medios	Arginina Sepharose® con	53	900	1 x 10^{3}
de 1a-1e	tensioactivo
1f	Arginina Sepharose® sin	15	8 x 10^{3}	1 x 10^{3}
	tensioactivo
1g	Prosep® Remtox con	63	1 x 10^{5}	1
	tensioactivo
1h	Filtro Posidyne™ cargado	68	5 x 10^{5}	2
	sin tensioactivo
1i	Filtro Posidyne™ cargado	77	4 x 10^{4}	30
	con tensioactivo

Como queda patente a partir de la tabla, el presente procedimiento es eficaz para reducir la concentración de endotoxinas unidas a una ApoA. Como también queda patente a partir de la tabla, la ausencia de un tensioactivo en el tampón de elución da lugar a una recuperación de mala calidad y una concentración más elevada de endotoxinas en el producto final.

Ejemplo 2

Las condiciones en las pruebas 2a a 2d coincidieron con aquellas de las pruebas 1a a 1g del ejemplo 1, con la salvedad de que la concentración de Tris-HCl fue de 20 mM. El caudal fue de 10 cm/h. Todas las pruebas se llevaron a cabo a temperatura ambiente (aproximadamente 20ºC).

La concentración de las endotoxinas antes del tratamiento según la invención se encontraba entre 10^{6} y 10^{7} UE/mg en todas las pruebas. La recuperación fue de por lo menos 90%.

Los resultados quedan claros a partir de la siguiente tabla.

TABLA II

Procedimiento en una etapa según la invención, en el que los valores de endotoxinas se analizaron con el procedimiento del punto final de coagulación en gel de LAL.

	Carga	Carga
Prueba nº	mg/ml	UE/ml de gel	Volumen	UE/mg en el	Reducción
	de gel		del gel (ml)	producto final	(veces)
2a	1,2	> 10^{6}; < 10^{7}	26	> 50; < 100	> 2 x 10^{4}; <10^{5}
2b	0,9	> 10^{5}; < 10^{6}	40	> 5; < 10	> 2 x 10^{4}; < 10^{5}
2c	0,8	> 10^{6}; < 10^{7}	40	> 10; < 20	> 1 x 10^{5}; < 10^{6}
2d	2	> 2 x 10^{6}; < 2 x 10^{7}	373	> 3,3; < 6,6	> 3 x 10^{5}; < 2 x 10^{6}

Como queda patente a partir de la tabla, la primera realización del presente procedimiento es eficaz para reducir la concentración de endotoxinas unidas a una ApoA.

\newpage

Ejemplo 3

Las pruebas se llevaron a cabo en un gel de Q Sepharose® FF (pruebas 3a y 3b). El volumen del gel fue de aproximadamente 0,37 l y el caudal en todas las etapas de 36 cm/h. El flujo era descendente en las etapas 1 a 6, mientras que el flujo era ascendente en la etapa 7.

Etapa 1 Modo de limpieza

Antes del preequilibrado, se lavó el gel de Q Sepharose® con 4 l de un líquido de lavado que contenía NaOH 1,0 M (solución 1).

Etapa 2 Modo de preequilibrado

a) Tampón de preequilibrado (tampón 2): Na_{2}HPO_{4} x 12 H_{2}O 0,2 M, pH = 8,0

Volumen total del tampón: 3 l

b) Agua destilada

Volumen total de agua: 5 l

c) Se midió la concentración de las endotoxinas que quedaban según la prueba del punto final de la coagulación en gel de LAL: < 0,125 UE/ml

Etapa 3 Modo de equilibrado

Tampón de equilibrado (tampón 3): Na_{2}HPO_{4} x 12 H_{2}O 0,01 M, urea 6 M, pH = 8,0

Volumen total del tampón: 10 l

Etapa 4 Modo de carga

Volumen total de la muestra: 2,55 l

Etapa 5 Modo de lavado de la muestra

Tampón de lavado de la muestra (tampón 3): Na_{2}HPO_{4} x 12 H_{2}O 0,01 M, urea 6 M, pH = 8,0

Volumen total del tampón: 0,5 l

Etapa 6 Modo de elución

Tampón de elución (tampón 4): Na_{2}HPO_{4} x 12 H_{2}O 0,01 M, NaCl 0,1 M, urea 6 M, pH = 8,0

Volumen total de tampón: 8 l

Elución con un gradiente lineal 0-100% (agua destilada y tampón 4) en 200 min

Etapa 7 Modo de regeneración

Tampón de regeneración (tampón 5): NaCl 2 M

Volumen total de tampón: 0,75 l

Los resultados quedan claros a partir de la siguiente tabla.

TABLA III

Gel de intercambio aniónico (gel de Q Sepharose® FF) usado según la invención para reducir la concentración de endotoxinas en ApoA.

Prueba nº	Carga	Recuperación (%)	UE/mg en	UE/mg en	Reducción
	(mg/ml		el material	el producto	(veces)
	de gel)		de partida	final
3a	1,4	77	2,4 x 10^{3}	< 1,3	1,9 x 10^{3}
3b	2,8	46	43	< 0,3	1,5 x 10^{2}

Como queda patente a partir de la tabla, la segunda realización del presente procedimiento también es eficaz para reducir la concentración de endotoxinas unidas a una ApoA.

Ejemplo 4

Una prueba se llevó a cabo en un gel de Arginina Sepharose® (prueba 4a) según la invención, en dos ciclos. Otra prueba se llevó a cabo en un gel de Q Sepharose® FF (etapa 1) seguido de un gel de Arginina Sepharose® (etapa 2) (prueba 4b) también según la invención. Las condiciones en las pruebas 4a y 4b coincidieron con aquellas de los ejemplos 1 y 3, cuando proceda. Todas las pruebas se llevaron a cabo a temperatura ambiente (aproximadamente 20ºC).

Los resultados quedan claros a partir de las siguientes tablas.

TABLA IV

Procedimiento con dos etapas sucesivas de Arginina Sepharose®, y un procedimiento con una etapa inicial de intercambio aniónico seguida de una etapa de Arginina Sepharose®, ambos según la invención. Los valores de endotoxina que se proporcionan en las tablas IV a VI se analizaron con el procedimiento del punto final de coagulación en gel de LAL.

	Procedimiento	Procedimiento
Prueba nº	Etapa 1	Etapa 2	Recuperación total (%)	UE/mg en el	Reducción
				producto final	(veces)
4a	Arg.-Seph.	Arg.-Seph.	81	< 14	4 x 10^{6}
4b	Intercambio aniónico	Arg.-Seph.	76	< 8	10^{6}

TABLA V

Etapa 1
Prueba nº	UE/mg en el material	Recuperación(%)	UE/mg en el	Reducción
	de partida		producto final	(veces)
4a	> 10^{6}; < 10^{7}	87	> 10^{3}; < 2 x 10^{3}	> 2 x 10^{3}; < 9,5 x 10^{3}
4b	> 10^{6}; < 10^{7}	84	> 90; < 180	> 10^{4}; < 6 x 10^{4}

TABLA VI

Etapa 2
Prueba nº	Recuperación (%)	Reducción (veces)
4a	93	> 150
4b	90	> 10

Como queda patente a partir de las tablas, un procedimiento en dos etapas según la invención proporciona un medio para reducir la concentración de las endotoxinas unidas a una ApoA hasta niveles muy bajos.

Ejemplo 5 Pruebas 5a y 5b (con urea)

Las pruebas se llevaron a cabo en un gel de DEAE Sepharose® FF (pruebas 5a y 5b). El volumen del gel era aproximadamente de 114 l, la altura de la columna de 15 cm y el caudal en todas las etapas aproximadamente 50 cm/h (prueba 5a). El volumen del gel era aproximadamente de 85 l, la altura de la columna de 30 cm y el caudal en todas las etapas aproximadamente 50 cm/h (prueba 5b). Las pruebas 5a y 5b se llevaron a cabo a temperatura ambiente (aproximadamente 20ºC).

Etapa 1 Modo de limpieza

a) Se lavó el gel de DEAE Sepharose® con un líquido de lavado que contenía NaOH 1,0 M (solución 1)

b) Agua destilada

c) Se midió la concentración de las toxinas que quedaban según la prueba del punto final de la coagulación en gel de LAL: < 0,125 UE/ml

Etapa 2 Modo de equilibrado

Tampón de equilibrado (tampón 2): Tris 0,03 M, urea 8 M, ditiotreitol (DTT) 1 mM, pH = 7,5

Etapa 3 Modo de carga Etapa 4 Modo de lavado de las muestras

Tampón de lavado de las muestras (tampón 2): Tris 0,03 M, urea 8 M, ditiotreitol (DTT) 1 mM, pH = 7,5

Etapa 5 Modo de elución

Tampón de elución (tampón 3): Tris 0,055 M, urea 8 M, ditiotreitol (DTT) 1 mM, pH = 7,5

Etapa 6 Modo de regeneración

Tampón de regeneración (tampón 4): NaCl 2 M ==Prueba 5c (sin urea)

Se llevó a cabo una prueba en ausencia de urea, a efectos de comparación con la presente invención. Las demás condiciones y concentraciones fueron idénticas a aquellas de la prueba 5a.

Los resultados quedan claros a partir de la siguiente tabla.

TABLA VII

Gel de intercambio aniónico (gel de DEAE Sepharose® FF) usado según la invención para reducir la concentración de endotoxinas en ApoA. Los valores de endotoxina que se proporcionan en la tabla V se analizaron con el procedimiento del punto final de coagulación en gel de LAL.

Prueba nº	Carga (mg/ml	Recuperación(%)	UE/mg en el	UE/mg en el	Reducción
	de gel)		material de partida	producto final	(veces)
5a	3	37	10^{8}	10	10^{7}
5b	3	54	10^{8}	2 x 10^{3}	5 x 10^{5}
5c	3	0	- - - - -	- - - - -	- - - - -

Como queda patente a partir de la tabla, la segunda realización del presente procedimiento es eficaz para reducir la concentración de las endotoxinas unidas a una ApoA incluso a gran escala. En ausencia de urea, la recuperación de ApoA es indetectable, motivo por el cual no se pudieron medir tampoco las concentraciones de las endotoxinas.

El producto de la elución del gel de DEAE Sepharose® FF en la prueba 5b se llevó a una columna que contenía 60 ml de gel de DEAE Sepharose® FF, siendo la altura del lecho de 30 cm. Se equilibró la columna con el tampón de elución (tampón 3) según las pruebas 5a y 5b. Se cargó la muestra y se pasó directamente a través de la columna, produciéndose la elución con el tampón de elución (tampón 3). La segunda etapa de la prueba 5b se llevó a cabo a temperatura ambiente (aproximadamente 20ºC).

Los resultados quedan claros a partir de la siguiente tabla.

TABLA VIII

Procedimiento con dos etapas sucesivas con DEAE Sepharose®, ambas según la invención. Los valores de endotoxina que se proporcionan en la tabla VI se analizaron con el procedimiento del punto final de coagulación en gel de LAL.

Prueba	Etapa 1	Etapa 2	Recuperación	UE/mg en	Reducción
nº			total(%)	el producto final	(veces)
5b	Intercambio aniónico	Intercambio aniónico	38	< 2	> 5 x 10^{7}

TABLA IX

Etapa 2
Prueba	Carga (mg/ml	Recuperación (%)	UE/mg en el	UE/mg en el	Reducción
nº	de gel)		material de partida	el producto final	(veces)
5b	6	70	2 x 10^{3}	< 2	> 10^{3}

Claims

1. Un procedimiento para producir una apolipoproteína A (ApoA) o una apolipoproteína E (ApoE) sustancialmente exenta de endotoxinas o variantes o mezclas de las mismas mediante la separación de las endotoxinas de la ApoA o la ApoE que se ha producido mediante una técnica de ADN recombinante, caracterizándose dicho procedimiento por la puesta en contacto de una primera solución acuosa que contiene dicha ApoA o ApoE con una matriz que contiene un compuesto inmovilizado con un grupo terminal que comprende dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono, y posteriormente mediante el tratamiento de la matriz que contiene un compuesto inmovilizado con una segunda solución acuosa que contiene un tensioactivo, o mediante la puesta en contacto de una primera solución acuosa que contiene dicha ApoA o ApoE con una matriz de intercambio aniónico, y posteriormente mediante el tratamiento de la matriz de intercambio aniónico con una segunda solución acuosa que contiene un compuesto que comprende dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la primera solución acuosa contiene además un tensioactivo.

3. Un procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la primera solución acuosa se mantiene por un periodo de tiempo en el intervalo de 15 min hasta un máximo de 10 h, antes de poner en contacto dicha primera solución acuosa con la matriz que contiene un compuesto inmovilizado o la matriz de intercambio aniónico.

4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el tensioactivo es aniónico.

5. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la ApoA o la ApoE se produce mediante la técnica de ADN recombinante en bacterias Gram negativas.

6. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la ApoA es la ApoA-I, o variantes o mezclas de la misma.

7. Un procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque la ApoA-I es la ApoA-IMilano.

8. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el grupo terminal contiene un grupo guanidino.

9. Un procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque el grupo terminal es arginina o guanidina.

10. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la matriz de intercambio aniónico se trata con una segunda solución acuosa que contiene un tensioactivo y urea, arginina o una sal de guanidina.

11. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la matriz es una matriz de agarosa.

12. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la matriz que contiene un compuesto inmovilizado y la matriz de intercambio aniónico se usan secuencialmente, en orden arbitrario.

13. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la concentración de las endotoxinas se reduce por lo menos 10^{4} veces en el procedimiento.

14. Un procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque la concentración de las endotoxinas se reduce por lo menos 10^{6} veces en el procedimiento.

15. Una proteína ApoA o ApoE producida por técnica de ADN recombinante en bacterias Gram negativas que se encuentra sustancialmente exenta de endotoxinas.

16. Una proteína ApoA o ApoE según la reivindicación 15, en la que la proteína se produce en E. coli.

17. Una ApoA o ApoE según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, que se produce según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

18. Uso de una matriz que contiene un compuesto inmovilizado con un grupo terminal que comprende dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono y una solución que contiene un tensioactivo, o una matriz de intercambio aniónico y una solución que contiene un compuesto que comprende dos o tres átomos de nitrógeno unidos a un átomo de carbono, para la eliminación de las endotoxinas de soluciones acuosas que contienen ApoA o ApoE que ha sido producida mediante una técnica de ADN recombinante, o variantes o mezclas de las mismas.

\newpage

19. Uso de ApoA o ApoE según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 para la fabricación de un medicamento que comprende la ApoA o ApoE en el tratamiento de la aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares.