PL206286B1 - Komórka Gram-ujemnej bakterii, sposób wytwarzania heterologicznego peptydu, sposób zapobiegania odcinaniu N-końcowego aminokwasu, sposób odcinania N-końcowego aminokwasu i sposób wytwarzania skróconego polipeptydu - Google Patents
Komórka Gram-ujemnej bakterii, sposób wytwarzania heterologicznego peptydu, sposób zapobiegania odcinaniu N-końcowego aminokwasu, sposób odcinania N-końcowego aminokwasu i sposób wytwarzania skróconego polipeptyduInfo
- Publication number
- PL206286B1 PL206286B1 PL368463A PL36846302A PL206286B1 PL 206286 B1 PL206286 B1 PL 206286B1 PL 368463 A PL368463 A PL 368463A PL 36846302 A PL36846302 A PL 36846302A PL 206286 B1 PL206286 B1 PL 206286B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- polypeptide
- aminopeptidase
- cell
- gene
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 title claims abstract description 107
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 title claims abstract description 107
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 244
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 232
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 229
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 225
- 101100184335 Escherichia coli (strain K12) mnmC gene Proteins 0.000 claims abstract description 106
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 92
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 76
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 67
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 39
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims abstract description 23
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 184
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 123
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 37
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 37
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 37
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 33
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 33
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 32
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 20
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 18
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 17
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 15
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 15
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 15
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 12
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 10
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 6
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 104
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 101100390711 Escherichia coli (strain K12) fhuA gene Proteins 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 101100407828 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ptr-3 gene Proteins 0.000 description 13
- 101100178822 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) htrA1 gene Proteins 0.000 description 12
- 101100277437 Rhizobium meliloti (strain 1021) degP1 gene Proteins 0.000 description 12
- 101150018266 degP gene Proteins 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 11
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 11
- 239000000306 component Substances 0.000 description 10
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 10
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- 206010029155 Nephropathy toxic Diseases 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 230000007694 nephrotoxicity Effects 0.000 description 9
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 9
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 101150088787 deoC2 gene Proteins 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 4
- 101000887490 Homo sapiens Guanine nucleotide-binding protein G(z) subunit alpha Proteins 0.000 description 4
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 4
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 4
- 108090000099 Neurotrophin-4 Proteins 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 108010084313 CD58 Antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000946518 Homo sapiens Carboxypeptidase B2 Proteins 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 3
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 102000044905 human CPB2 Human genes 0.000 description 3
- 102000052301 human GNAZ Human genes 0.000 description 3
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 101100442929 Bacillus licheniformis (strain ATCC 14580 / DSM 13 / JCM 2505 / CCUG 7422 / NBRC 12200 / NCIMB 9375 / NCTC 10341 / NRRL NRS-1264 / Gibson 46) deoC2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 102100028892 Cardiotrophin-1 Human genes 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 101000793115 Homo sapiens Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator Proteins 0.000 description 2
- 101001076422 Homo sapiens Interleukin-1 receptor type 2 Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 108010044023 Ki-1 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 description 2
- 102000003683 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 2
- 102100033857 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-AKLPVKDBSA-N Sulfur-35 Chemical compound [35S] NINIDFKCEFEMDL-AKLPVKDBSA-N 0.000 description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000009520 Vascular Endothelial Growth Factor C Human genes 0.000 description 2
- 108010073923 Vascular Endothelial Growth Factor C Proteins 0.000 description 2
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 108010041776 cardiotrophin 1 Proteins 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 101150013644 deoC gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 102000049150 human ARNT Human genes 0.000 description 2
- 101150020087 ilvG gene Proteins 0.000 description 2
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 2
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 101150093025 pepA gene Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101150106872 rpoH gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 3',6'-dihydroxy-2',4',5',7'-tetraiodo-3h-spiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3-one Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVRVABPNVHYXRT-BQWXUCBYSA-N 52906-92-0 Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 LVRVABPNVHYXRT-BQWXUCBYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 1
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000589151 Azotobacter Species 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 102000013585 Bombesin Human genes 0.000 description 1
- 108010051479 Bombesin Proteins 0.000 description 1
- 102100025279 C-X-C motif chemokine 11 Human genes 0.000 description 1
- 101710098272 C-X-C motif chemokine 11 Proteins 0.000 description 1
- 108010009575 CD55 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-NJFSPNSNSA-N Carbon-14 Chemical compound [14C] OKTJSMMVPCPJKN-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 108090000201 Carboxypeptidase B2 Proteins 0.000 description 1
- 102100035023 Carboxypeptidase B2 Human genes 0.000 description 1
- 206010007572 Cardiac hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000006029 Cardiomegaly Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000863012 Caulobacter Species 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000034573 Channels Human genes 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010030718 DegP protease Proteins 0.000 description 1
- 101100317179 Dictyostelium discoideum vps26 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100407639 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) prtB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241001646719 Escherichia coli O157:H7 Species 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 102100020948 Growth hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100036717 Growth hormone variant Human genes 0.000 description 1
- 101710191157 Growth hormone variant Proteins 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 101100082540 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) pcp gene Proteins 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101001023964 Homo sapiens Growth/differentiation factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101001078151 Homo sapiens Integrin alpha-11 Proteins 0.000 description 1
- 101001013150 Homo sapiens Interstitial collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101001063392 Homo sapiens Lymphocyte function-associated antigen 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000577540 Homo sapiens Neuropilin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000990908 Homo sapiens Neutrophil collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101001130226 Homo sapiens Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000851176 Homo sapiens Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101000837854 Homo sapiens Transport and Golgi organization protein 1 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000622304 Homo sapiens Vascular cell adhesion protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 108010041014 Integrin alpha5 Proteins 0.000 description 1
- 102000000426 Integrin alpha6 Human genes 0.000 description 1
- 108010041100 Integrin alpha6 Proteins 0.000 description 1
- 102000016921 Integrin-Binding Sialoprotein Human genes 0.000 description 1
- 108010028750 Integrin-Binding Sialoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N Leu-enkephalin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102100030984 Lymphocyte function-associated antigen 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002419 Motilin Human genes 0.000 description 1
- 101800002372 Motilin Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108090000095 Neurotrophin-6 Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241001057811 Paracoccus <mealybug> Species 0.000 description 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 102100031538 Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase Human genes 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000316 Pitrilysin Proteins 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 description 1
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000103 Relaxin Proteins 0.000 description 1
- 102000003743 Relaxin Human genes 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 101000924393 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Vacuolar aminopeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 1
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 1
- 108010068542 Somatotropin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- -1 TGF-1 Chemical compound 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 1
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100028569 Transport and Golgi organization protein 1 homolog Human genes 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 1
- 102100032807 Tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein Human genes 0.000 description 1
- 101710169430 Tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000863000 Vitreoscilla Species 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 229940060587 alpha e Drugs 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001455 anti-clotting effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N bombesin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1NC2=CC=CC=C2C=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C(C)C)C1=CN=CN1 DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 108700001680 des-(1-3)- insulin-like growth factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000055098 human ITGA11 Human genes 0.000 description 1
- 102000053852 human LCAT Human genes 0.000 description 1
- 102000053148 human MMP1 Human genes 0.000 description 1
- 102000050920 human NRP1 Human genes 0.000 description 1
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 1
- 102000028416 insulin-like growth factor binding Human genes 0.000 description 1
- 108091022911 insulin-like growth factor binding Proteins 0.000 description 1
- 102000014909 interleukin-1 receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040006732 interleukin-1 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 101150074251 lpp gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 1
- 108010003052 omptin outer membrane protease Proteins 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 101150035909 pepB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150064613 pepN gene Proteins 0.000 description 1
- 150000002994 phenylalanines Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010087851 prorelaxin Proteins 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 101150034869 rpo5 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000005400 testing for adjacent nuclei with gyration operator Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 230000001720 vestibular Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Opis wynalazku
1. Dziedzina wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest komórka Gram-ujemnej bakterii, sposób wytwarzania heterologicznego peptydu, sposób zapobiegania odcinaniu N-końcowego aminokwasu, sposób odcinania N-końcowego aminokwasu i sposób wytwarzania skróconego polipeptydu. W szczególności w wynalazku opisuje się bakteryjne aminopeptydazy. U podłoża wynalazku było stwierdzenie, że usunięcie lub nadekspresję ważnego enzymu z bakterii poprawia odzyskiwanie nie przeciętych lub też przeciętych (skróconych) wytworzonych w bakterii polipeptydów, takich jak zrekombinowane polipeptydy.
2. Stan techniki
Niektóre białka, wytwarzane w bakteriach Gram-ujemnych i archebakteriach takiej jak E. coli, mają odcinane N-końcowe aminokwasy na skutek obecności w tych komórkach aminopeptydaz. W efekcie, zanieczyszczenie ściśle związane z polipeptydem typu dzikiego jest wprowadzane do hodowli komórkowej albo jednocześnie z lizą albo po lizie komórki jako część procesu oczyszczania produktu. Zanieczyszczenie to musi być usunięte z polipeptydu typu dzikiego jeśli mają być przygotowane białka użyteczne terapeutycznie. Przykładem jest ludzki hormon wzrostu (hGH), który posiada swoją N-końcową resztę fenyloalaninową odciętą gdy jest wytworzany w E. coli. Ta postać wariantu hGH (des-phe hGH), wytworzona przy lizie komórki w postaci mieszaniny z hGH z nie odciętym końcem (naturalny hGH) jest trudna do usunięcia z tej mieszaniny. Takie usuwanie wymaga poddania mieszaniny chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Byłoby pożądanym uniknięcie tego, dodatkowego etapu oczyszczania.
Ponadto, jest pożądane w niektórych przypadkach otrzymanie polipeptydów z odciętymi N-końcowymi resztami aminokwasowymi i powielenie ilości takich polipeptydów względem jego odpowiednika sekwencji naturalnej celem uzyskania czystego, przeciętego materiału.
Szereg znanych aminopeptydaz E. coli posiada szerokie spektrum specyficzności i może ciąć różne reszty przy aminokwasowych N-końcach, np. pepA, pepB i pepN (Escherichia coli i Salmonella,
Frederick C. Neidhardt (wyd.), ASM, Press, rozdział 62 z Charles Miller - Protein Degradation and Proteolytic Modyfication str. 938-954 (1996); Gonzales i Robert Baudouy, FEMS Microbiology Reviews. 18 (4) : 319-44 (1996). Gen yfck kodujący b2324 znaleziony w szczepie K12 E. coli został wymieniony jako „przypuszczalna peptydaza” w efekcie projektu sekwencjonowania genomu E. coli (Blattner i wsp., Science, 277: 1453-62 (1997)) w bazie danych GenBank (nr dostępu AE000321), lecz nie dostarczono dalszych informacji o aktywności tego enzymu. Homolog w szczepie E. coli 0157 : H7 jest identyczny z genem yfcK ze szczepu K12. Istnieje potrzeba zidentyfikowania bakteryjnych aminopeptydaz, którymi można manipulować dla uzyskania bardziej czystych, nie przeciętych lub przeciętych polipeptydaz.
3. Streszczenie wynalazku
Enzym b2324 kodowany przez yfcK zidentyfikowany został jako aminopeptydaza tj. enzym odpowiedzialny za odcinanie N-końca polipeptydów.
W jednej postaci, geny kodujące aminopeptydazy homologiczne z tym enzymem, włączając aminopeptydazę b2324 kodowaną przez gen yfcK są eliminowane ze szczepów bakterii Gram-ujemnych przez genetyczne uszkadzanie chromosomu, tak że przyczepione zanieczyszczenia nie są dłużej wytwarzane w znaczącym stopniu. Tym samym zostaje wyeliminowany dodatkowy etap oczyszczania w celu usunięcia przyczepionych zanieczyszceń. Stwierdzono, w przypadku co najmniej jednego otrzymanego szczepu, wytwarzanie polipeptydu bez przyłączeń w ilościach równych ze szczepami rodzicielskimi.
Przedmiotem wynalazku jest zatem komórka Gram-ujemnej bakterii, w której chromosomalny gen jest inaktywowany lub uszkodzony, przy czym gen ten ma co najmniej 80% identyczności sekwencji z (a) cząsteczką DNA kodującą naturalną sekwencję aminopeptydazy b2324 o sekwencji aminokwasowej od 1 do 688 z SEQ ID NO:2 lub (b) komplement cząsteczki DNA z (a) i kodujący aminopeptydazę.
Przedmiotem wynalazku jest również komórka Gram-ujemnej bakterii, w której chromosomalny gen jest inaktywowany lub uszkodzony, przy czym gen ten ma co najmniej 80% identyczności z sekwencją naturalną genu yfcK posiadającego sekwencję nukleotydową od 1 do 2067 z SEQ ID NO:1 i kodujący aminopeptydazę.
Komórką według wynalazku korzystnie może być Salmonella lub Enterobacteriaceae, bardziej korzystnie może być E. coli, ewentualnie z niedoborem co najmniej jednego genu kodującego proteazę.
Również korzystnie może to być komórka z niedoborem naturalnej sekwencji genu yfcK.
PL 206 286 B1
W innym korzystnym rozwiązaniu komórka według wynalazku zawiera kwas nukleinowy kodujący polipeptyd heterologiczny dla komórki. Bardziej korzystnie polipeptydem ty jest polipeptyd ssaczy. Może to być również jeszcze bardziej korzystnie polipeptyd ludzki. Najkorzystniej peptyd ten jest ludzkim hormonem wzrostu.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania heterologicznego peptydu obejmujący hodowanie komórki zdefiniowanej według wynalazku i następnie odzyskiwanie polipeptydu z komórki.
Sposób korzystnie realizuje się przez hodowlę, którą prowadzi się w fermentorze a polipeptyd jest odzyskiwany z peryplazmy lub pożywki hodowlanej komórki. Odzyskiwanie prowadzi się natomiast przez rozbicie komórek do postaci lizatu a niezmieniony polipeptyd oczyszcza się z lizatu.
Korzystnie, w sposobie według wynalazku lizat inkubuje się przed etapem oczyszczenia.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób zapobiegania N-końcowemu odcinaniu aminokwasu od polipeptydu, polegający na tym, że hoduje się komórkę zdefiniowaną wyżej, przy czym komórka ta zawiera kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, w warunkach takich, że kwas nukleinowy ulega ekspresji. Korzystnie polipeptyd odzyskuje się z komórki.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób odcinania N-końcowego aminokwasu od peptydu wyizolowanego z komórki, polegający na tym, że kontaktuje się polipeptyd z aminopeptydazą kodowaną przez kwas nukleinowy o co najmniej 80% identyczności sekwencji z (a) cząsteczką DNA kodującą naturalną sekwencję aminopeptydazy b2324 o sekwencji reszt aminokwasowych od 1 do 688 z SEQ ID NO:2 lub (b) komplementu czą steczki DNA z (a).
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest również sposób odcinania N-końcowego aminokwasu z polipeptydu wyizolowanego z komórki, polegają cy na tym, ż e kontaktuje się polipeptyd z aminopeptydazą o mniej niż 80% identyczności sekwencji z naturalną sekwencję aminopeptydazy b2324 o sekwencji aminokwasowej od 1 do 688 z SEQ ID NO:2. W sposobie tym, korzystną realizacją jest gdy polipeptyd jest inkubowany z aminopeptydazą.
Bardziej korzystnie polipeptyd jest kontaktowany z naturalną sekwencją aminopeptydazy b2324.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania skróconego polipeptydu, polegający na tym, że hoduje się komórki bakterii Gram-ujemnych niosących kwas nukleinowy o przynajmniej 80% identyczności sekwencji z (a) cząsteczką DNA kodującą naturalną sekwencję aminopeptydazy b2324 o sekwencji aminokwasowej od 1 do 688 z SEQ ID NO:2 lub (b) komplement czą steczki DNA z (a) i kodujący aminopeptydazę, które to komórki zawierają kwas nukleinowy kodujący odpowiadający nie skrócony polipeptyd posiadający dodany na jego N-końcu aminokwas, przy czym hodowlę prowadzi się w warunkach takich, aby kwas nukleinowy kodujący aminopeptydazę b2324 uległ nadekspresji, aby zaszła ekspresja kwasu nukleinowego kodującego nie skrócony polipeptyd i jeśli nie skrócony polipeptyd i aminopeptydaza nie kontaktują się po ekspresji, to kontaktuje się ten nie skrócony polipeptyd z aminopeptydazą wytwarzając skrócony polipeptyd.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania skróconego polipeptydu, polegający na tym, że hoduje się komórki bakterii Gram-ujemnych niosących kwas nukleinowy o co najmniej 80% identyczności z naturalną sekwencją genu yfck posiadającego sekwencje nukleotydów od 1 do 2067 w SEQ ID NO:1 i kodującego aminopeptydazę , które to komórki zawierają kwas nukleinowy kodujący odpowiadający nie skrócony polipeptyd posiadający dodany na jego N-końcu aminokwas, przy czym hodowlę prowadzi się w warunkach takich, aby zaszła nadekspresja kwasu nukleinowego kodującego aminopeptydazę b2324 i aby zaszła ekspresja kwasu nukleinowego kodującego nie skrócony polipeptyd i jeśli ten nie skrócony polipeptyd i aminopeptydaza nie kontaktują się po ekspresji, kontaktuje się ten nie skrócony polipeptyd z aminopeptydazą wytwarzając skrócony polipeptyd.
W korzystnej odmianie tego sposobu hoduje się komórki E. coli niosące naturalną sekwencję genu yfcK i nie skrócony polipeptyd następnie kontaktuje się z naturalną sekwencją aminopeptydazy b2324. Korzystnie w sposobie tym polipeptyd jest heterologiczny dla komórek, a bardziej korzystnie polipeptyd ten jest polipeptydem ssaczym.
W sposób wedł ug wynalazku, korzystnie komórki są z niedoborem co najmniej jednego genu kodującego proteazę.
Kontaktowanie w sposobie według wynalazku prowadzi się przez inkubację.
W innym korzystnej realizacji tego sposobu wedł ug wynalazku kwas nukleinowy kodujący aminopeptydazę jest naturalnym dla komórek bakterii i jest on wprowadzony do komórek bakterii.
Sposób według wynalazku realizuje się tak, że hodowlę prowadzi się w fermentorze a nie skrócony polipeptyd odzyskuje się z komórek przed kontaktowaniem z aminopeptydazą. Odzyskiwanie polipeptydu korzystnie prowadzi się z periplazmy lub pożywki hodowlanej komórki.
PL 206 286 B1
Odzyskiwanie można również korzystnie prowadzić przez rozbicie komórki do postaci lizatu a skrócony peptyd jest oczyszczany z lizatu. Bardziej korzystnie lizat inkubuje się przed etapem oczyszczenia. Najbardziej korzystnie lizat inkubuje się przez co najmniej 1 godz. w 20-40°C.
W powyż szych sposobach dla wytwarzania skróconego polipeptydu, korzystne aspekty obejmują te, w których komórka jest z niedoborem przynajmniej jednego genu kodującego proteaze i/lub warunki hodowli są takie, że gen yfcK (naturalna sekwencja i homologi) jest nadeksprymowane i/lub kontaktowanie przez inkubację. Gen yfcK (naturalna sekwencja i homologi) może być naturalny dla komórek bakterii lub wprowadzony do komórek bakterii. Hodowlę korzystnie prowadzić można w fermentorze. Nie skrócony polipeptyd jest korzystnie odzyskany z komórek przed kontaktowaniem ich z aminopeptydazą, gdzie odzyskanie może być z peryplazmy lub pożywki hodowlanej komórek lub przez rozbicie komórek do postaci lizatu, z którego korzystnie oczyszczony jest polipeptyd. Lizat może również być inkubowany przed etapem czyszczenia. Korzystnie lizat jest inkubowany przez przynajmniej 1 godz., korzystniej około 2-50 godz. w około 20-40°C, korzystniej w około 30-40°C.
Krótki opis rysunków
Figura 1 przedstawia wykres wyprowadzenia komórki E. coli 61G3, szczepu gospodarza z delecja yfcK (kodujący b2324).
Figura 2 przedstawia diagram procentowej powierzchni (chromatografia cieczowa/spektroskopia masowa; LC/MS) ekstrakcji rhGH ze szczepu kontrolnego 16C9 inkubowanego w temperaturze pokojowej przez 0, 15, 24 i 48 godzin z naturalnym hGH, des-fenyloalanina hGH i des-fenyloalaninaprolina hGH, gdzie ilości pokazano różnymi cieniami.
Figura 3 przedstawia diagram procentowej powierzchni (LC/MS) dla rhGH szczepu 61G3 posiadającego usunięty gen, inkubowanych w temperaturze pokojowej przez 0, 15, 24 i 48 godzin z naturalnym hGH, des-fenyloalanina hGH i des-fenyloalanina-prolina hGH, gdzie ilości pokazano różnymi cieniami.
Figura 4 przedstawia diagram procentowej powierzchni (chromatografia cieczowa/spektroskopia mas; LC/MS) dla rhGH ekstrakcji rhGH ze szczepu kontrolnego 16C9 inkubowanego w 37°C przez 0, 15, 24 i 48 godzin z naturalnym hGH, des-fenyloalanina hGH i des-fenyloalanina-prolina hGH, gdzie ilości pokazano różnymi cieniami.
Figura 5 przedstawia diagram procentowej powierzchni (LC/MS) dla rhGH szczepu 61G3 posiadającego usunięty gen, inkubowanych w 37°C przez 0, 15, 24 i 48 godzin z naturalnym hGH, des-fenyloalanina hGH i des-fenyloalanina-prolina hGH, gdzie ilości pokazano różnymi cieniami.
Definicje
W użytym tu znaczeniu wyrażenie „komórka”, „linia komórkowa”, „szczep” i „hodowla komórkowa” są użyte tu wymiennie i każde takie określenie obejmuje potomstwo. Co za tym idzie, słowa „transformanty” i „stransformowane komórki” obejmują omawianą komórkę i hodowle z nich otrzymane bez względu na liczbę przeszczepień. Jest również zrozumiałe, że całe potomstwo może nie być dokładnie identyczne pod względem zawartości DNA z uwagi na zamierzone lub nie zamierzone mutacje. Uwzględniono zmutowane potomstwo posiadające tą samą funkcję lub aktywność biologiczną jaką wykryto w oryginalnych, stransformowanych komórkach. Odmienne określenia będą jasno wynikały z kontekstu.
„Bakteria” dla celów niniejszego opisu oznacza bakterię Gram-ujemną. Korzystnym typem bakterii jest Enterobacteriaceae. Przykłady bakterii należących do Enterobacteriaceae obejmują Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia i Shigella. Inne rodzaje użytecznych bakterii obejmują Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobia, Vitreoscilla i Paracoccus. Dogodnie gospodarze E. coli obejmują E. coli W3110, (ATCC 27,325), E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B i E. coli X1776 (ATCC 31,537). Przykłady te są raczej ilustrujące niż ograniczające i preferowany jest W1310. Mogą być również zastosowane zmutowane komórki którejkolwiek z wyżej wspomnianych bakterii. Jest oczywiście niezbędnym wyselekcjonowanie odpowiedniej bakterii biorąc pod uwagę zdolność do replikacji replikonu w komórce bakterii. Gdy dla zapewnienia replikacji użyto dobrze znanych plazmidów takich jak pBR322, pBR325, pACYC177 lub pKN410, jako gospodarze przykładowo mogą być dogodnie użyte, gatunki E. coli, takie jak Serratia lub Salmonella.
„Chromosomowy gen yfcK” określa gen kodujący białko b2324 opisane jako „hipotetyczna peptydaza” w projekcie sekwencjonowania genomu E. coli (Blattner i wsp., powyżej) w bazie danych GenBank (numer dostępu AE000321). Białko ma numer dostępu Dayhoff B65005 i numer dostępu Swiss
PL 206 286 B1
Prot P77182 i gen jest umiejscowiony na chromosomie E. coli w 52.59 i jego lokalizacja podana w parach zasad równa się lewy koniec: 2439784 bp, prawy koniec: 2441790 bp. Sekwencja tego genu jest następująca:
TTGCGCAGCCTTACACACATCGCTAAGATCGAGCCACCGCCTGTAAGACGAGTAACTTAC
GTGAAACACTACTCCATACAACCTGCCAACCTCGAATTTAATGCTGAGGGTACACCTGTT
TCCCGAGATTTTGACGATGTCTATTTTTCCAACGATAACGGGCTGGAAGAGACGCGTTAT
GTTTTTCTGGGAGGCAACCAATTAGAGGTACGCTTTCCTGAGCATCCACATCCTCTGTTT
GTGGTAGCAGAGAGCGGCTTCGGCACCGGATTAAACTTCCTGACGCTATGGCAGGCATTT
GATCAGTTTCGCGAAGCGCATCCGCAAGCGCAATTACAACGCTTACATTTCATTAGTTTT
GAGAAATTTCCCCTCACCCGTGCGGATTTAGCCTTAGCGCATCAACACTGGCCGGAACTG
GCTCCGTGGGCAGAACAACTTCAGGCGCAGTGGCCAATGCCCTTGCCCGGTTGCCATCGT
TTATTGCTCGATGAAGGCCGCGTGACGCTGGATTTATGGTTTGGCGATATTAACGAACTG
ACCAGCCAACTGGACGATTCGCTAAATCAAAAAGTAGATGCCTGGTTTCTGGACGGCTTT
GCGCCAGCGAAAAACCCGGATATGTGGACGCAAAATCTGTTTAACGCCATGGCAAGGTTG
GCGCGTCCGGGCGGCACGCTGGCGACATTTACGTCTGCCGGTTTTGTCCGCCGCGGTTTG
CAGGACGCCGGATTCACGATGCAAAAACGTAAGGGCTTTGGGCGCAAACGGGAAATGCTT
TGCGGGGTGATGGAACAGACATTACCGCTCCCCTGCTCCGCGCCGTGGTTTAACCGCACG
GGCAGCAGCAAACGGGAAGCGGCGATTATCGGCGGTGGTATTGCCAGCGCGTTGTTGTCG
CTGGCGCTATTACGGCGCGGCTGGCAGGTAACGCTTTATTGCGCGGATGAGGCCCCCGCA
CTGGGTGCTTCCGGCAATCGCCAGGGGGCGCTGTATCCGTTATTAAGCAAACACGATGAG
GCGCTAAACCGCTTTTTCTCTAATGCGTTTACTTTTGCTCGTCGGTTTTACGACCAATTA
CCCGTTAAATTTGATCATGACTGGTGCGGCGTCACGCAGTTAGGCTGGGATGAGAAAAGC
CAGCATAAAATCGCACAGATGTTGTCAATGGATTTACCCGCAGAACTGGCTGTAGCCGTT
GAGGCAAATGCGGTTGAACAAATTACGGGCGTTGCGACAAATTGCAGCGGCATTACTTAT
CCGCAAGGTGGTTGGCTGTGCCCAGCAGAACTGACCCGTAATGTGCTGGAACTGGCGCAA
CAGCAGGGTTTGCAGATTTATTATCAATATCAGTTACAGATTTATCCCGTAAGGATGAC
TGTTGGTTGTTGAATTTTGCAGGAGATCAGCAAGCAACACACAGCGTAGTGGTACTGGCG
AACGGGCATCAAATCAGCCGATTCAGCCAAACGTCGACTCTCCCGGTGTATTCGGTTGCC
GGGCAGGTCAGCCATATTCCGACAACGCCGGAATTGGCAGAGCTGAAGCAGGTGCTGTGC
TATGACGGTTATCTCACGCCACAAAATCCGGCGAATCAACATCATTGTATTGGTGCCAGT
TATCATCGCGGCAGCGAAGATACGGCGTACAGTGAGGACGATCAGCAGCAGAATCGCCAGCG
GTTGATTGATTGTTTCCCGCAGGCACAGTGGGCAAAAGAGGTTGATGTCAGTGATAAAGAGG
CGCGCTGCGGTGTGCGTTGTGCCACCCGCGATCATCTGCCAATGGTAGGCAATGTTCCCGAT
TATGAGGCAACACTCGTGGAATATGCGTCGTTGGCGGAGCAGAAAGATGAGGCGGTAAGCGC
GCCGGTTTTTGACGATCTCTTTATGTTTGCGGCTTTAGGTTCTCGCGGTTTG
TGTTCTGCCCCGCTGTGTGCCGAGATTCTGGCGGCGCAGATGAGCGACGAACCGATTCCG ATGGATGCCAGTACGCTGGCGGCGTTAAACCCGAATCGGTTATGGGTGCGGAAATTGTTG AAGGGTAAAGCGGTTAAGGCGGGGTAA (SEQ ID NO:1);
i biał ko kodowane przez nią ma sekwencję nastę pując ą :
MRSLTHIAKIEPPPVRRVTYVKHYSIQPANLEFNAEGTPVSRDFDDVYFSNDNGLEETRYVF
LGGNQLEVRFPEHPHPLFVVAESGFGTGLNFLTLWQAFDQFREAHPQAQLQRLHFISFEKFP
LTRADLALAHQHWPELAPWAEQLQAQWPMPLPGCHRLLLDEGRVTLDLWFGDINELTSQLDD
SLNQKVDAWFLDGFAPAKNPDMWTQNLFNAMARLARPGGTLATFTSAGFVRRGLQDAGFTMQ
KRKGFGRKREMLCGVMEQTLPLPCSAPWFNRTGSSKREAAIIGGGIASALLSLALLRRGWQV
TLYCADEAPALGASGNRQGALYPLLSKHDEALNRFFSNAFTFARRFYDQLPVKFDHDWCGVT
QLGWDEKSQHKIAQMLSMDLPAELAVAVEANAVEQITGVATNCSGITYPQGGWLCPAELTRN
VLELAQQQGLQIYYQYQLQNLSRKDDCWLLNFAGDQQATHSVVVLANGHQISRFSQTSTLPV
YSVAGQVSHIPTTPELAELKQVLCYDGYLTPQNPANQHHCIGASYHRGSEDTAYSEDDQQQN
RQRLIDCFPQAQWAKEVDVSDKEARCGVRCATRDHLPMVGNVPDYEATLVEYASLAEQKDEA
VSAPVFDDLFMFAALGSRGLCSAPLCAEILAAQMSDEPIPMDASTLAALNPNRLWVRKLLKG
KAVKAG (SEQ ID NO:2). „Niedobór” pod względem genu lub kwasu nukleinowego oznacza, że komórka posiada usunięty lub inaktywowany lub nieczynny wspomniany gen tak, że nie wytwarza on białka, które ten gen koduje. Przykładowo, komórki z niedoborem chromosomowego genu yfcK kodującego b2324 nie wytwarzają produktu genu w hodowli. Podobnie, komórka z niedoborem genu kodującego proteazę, gdy jest hodowana nie wytwarza szczególnej proteazy.
PL 206 286 B1
W uż ytym tu znaczeniu „polipeptyd” odnosi się ogólnie do peptydów i biał ek z jakichkolwiek komórek, który posiada więcej niż 10 aminokwasów. Polipeptydy „heterologiczny” są polipeptydami obcymi dla wykorzystywanej komórki gospodarza, takimi jak ludzkie białko wytwarzane w E. coli. O ile heterologiczny polipeptyd może być prokariotycznym lub eukariotycznym polipeptydem to korzystnie jest on eukariotycznym, korzystniej ssaczym, najkorzystniej ludzkim polipeptydem.
Przykłady ssaczych polipeptydów obejmują cząsteczki takie jak np. renina, hormon wzrostu, włącznie z ludzkim hormonem wzrostu, bydlęcy hormon wzrostu; czynnik uwalniający hormon wzrostu; hormon przytarczyczki; hormon stymulujący tarczycę; lipoproteiny; 1-antytrypsyna; łańcuch A insuliny; łańcuch B insuliny; proinsulina; trombopoetyna; hormon pobudzający wzrost pęcherzyków jajnikowych; kalcytonina; hormon luteinizujacy; glukagon; czynniki krzepnięcia, takie jak czynnik VIIIC, czynnik IX, czynnik tkankowy i czynnik von Willebrada; czynniki przeciw krzepnięciu takie jak białko C; czynnik przedsionkowy; czynnik zwilżający płuc; aktywator plazminogenu, taki jak urokinaza lub ludzki mocznik lub tkankowy typ aktywatora plazminogenu (t. PA); bombezyna; trombina; chemopoetyczny czynnik wzrostowy; czynnik α i β martwicy nowotworu; enkefalina; albumina surowicy taka jak ludzka albumina surowicy; substancja hamująca mullerynę; łańcuch A relaksyny; łańcuch B relaksyny; prorelaksyna; peptyd towarzyszący mysiej gonadotropinie; białko bakteryjne, takie jak beta-laktamaza; Dnaza; inhibina; aktywina; czynnik wzrostowy śródbłonka naczyń (VEGF); receptory hormonów lub czynników wzrostowych; integryna; białko A lub D; czynniki reumatoidalne; czynniki neurotropowe takie jak pochodzący z mózgu czynnik neurotropowy (BDNF), neurotropina-3, -4, -5 lub -6 (NT-3, NT-4, NT-5 lub NT-6) lub czynnik wzrostowy nerwu tak jak NGF; kardiotrofiny (czynnik hipertrofowy serca) takie jak kardiotrofina-1 (CT-1); płytkowy czynnik wzrostowy (PDGF); czynnik wzrostowy fibroblastu taki jak aFGF i bFGF; czynnik wzrostowy nabłonka (EGF); transformujący czynnik wzrostowy (TGF) taki jak
TGF-α i TGF-β, włącznie z TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 lub TGF-5; czynnik wzrostowy -1 i -2 typu insuliny (IGF-1 i IGF-2); des(1-3)-IGF-1 (mózgowy IGF-1), białka wiążące czynnik wzrostowy typu insuliny; białka CD takie jak CD-3, CD-4, CD-8 i CD-19; erytropoetyna; czynniki indukcyjne kości; immunotoksyny; białko morfogeniczne kości (BNP); interferon taki jak interferon-α, -β i -γ i albumina surowicy taka jak ludzka albumina surowicy (HSA) lub bydlęca albumina surowicy (BSA); czynniki pobudzające wzrost kolonii (CSF) np. M-CSF, GM-CSF i G-CSF; interleukiny (IL), IL-1 do IL-10; przeciwciało anty-HRE-2; dysmutaza nadtlenkowa; receptory komórki T; powierzchniowe białka błonowe; czynnik przyspieszający rozkład; antygen wirusowy taki jak przykładowo część otoczki AIDS; białka transportu; receptory udomowienia; adresyny; białka regulatorowe; przeciwciała i fragmenty któregokolwiek z wyżej wymienionych polipeptydów. Pewien korzystny zestaw interesujących polipeptydów jest taki, które zawierają N-końcową fenyloalaninę, taki jak hGH. Inny, korzystny zestaw interesujących polipeptydów to taki, który jest wytworzony w peryplazmie lub pożywce z hodowli komórkowej bakterii, tak jak hGH.
Wyrażenie „sekwencje kontrolne” określają sekwencje DNA niezbędne dla ekspresji funkcjonalnie przyłączonej sekwencji kodującej w szczególnym organizmie gospodarza. Sekwencje kodujące, które są użyteczne dla bakterii obejmują promotor, warunkowo sekwencję operatora i miejsce wiązania rybosomu.
Kwas nukleinowy jest „przyłączony funkcjonalnie” gdy jest umieszczony w funkcjonalnej zależności z inną sekwencją kwasu nukleinowego. Przykładowo, DNA dla presekwencji lub lidera sekrecyjnego jest przyłączony funkcjonalnie do DNA dla polipeptydu, jeśli jest on wyrażony jako prebiałko uczestniczące w sekrecji polipeptydu; promotor jest przyłączony funkcjonalnie do sekwencji kodującej jeśli wpływa na transkrypcję sekwencji; lub miejsce wiązania rybosomu jest przyłączone funkcjonalnie do sekwencji kodującej jeśli jest ono umiejscowione tak, że zapewnia translację. Ogólnie, „przyłączony funkcjonalnie” oznacza, że sekwencje DNA są połączone w sposób ciągły, a w przypadku lidera sekrecyjnego w sposób ciągły i w fazie odczytu. Przyłączenie jest osiągnięte przykładowo przez ligację w dogodnych miejscach restrykcyjnych. Jeśli takie miejsca nie istnieją, użyte są syntetyczne adaptory lub linkery oligonukleotydowe zgodnie z dogodną praktyką.
Termin „nadekspresja” w odniesieniu do genu lub kwasu nukleinowego określa syntezę specyficznych białek w ilościach większych niż zazwyczaj wytworzane przez komórkę, gdy nie ma sztucznej indukcji takiej syntezy, jak np. zapośrednictwem promotora.
Termin „odzyskanie” polipeptydu ogólnie oznacza uzyskanie polipeptydu wolnego od komórek, w których został wytworzony.
Terminy „polipeptyd aminopeptydazy b2324”, „białko aminopeptydazy b2324” i „aminopeptydaza b2324”, gdy są tu użyte obejmują aminopeptydazę b2324 o natywnej sekwencji i homologi aminopeptydazy b2324 (które są tu dalej zdefiniowane). Zależnie od kontekstu polipeptydy aminopeptydazy
PL 206 286 B1 b2324 mogą być wyizolowane z różnych źródeł, jak na przykład z komórek bakterii lub przygotowane przez rekombinowanie i/lub sposobami syntezy.
„Aminopeptydaza b2324 o natywnej sekwencji” obejmuje polipeptyd posiadający taką samą sekwencję aminokwasową jak aminopeptydaza b2324 pochodząca z środowiska naturalnego. Taka aminopeptydaza b2324 o natywnej sekwencji może być wyizolowana z środowiska naturalnego lub może być wytworzona przez rekombinowanie i/lub syntetycznie. Termin „aminopeptydaza b2324 o natywnej sekwencji” obejmuje naturalnie występujące, skrócone lub sekrecyjne postaci (np. sekwencję domeny zewnątrzkomórkowej), naturalnie występujące postaci wariantów (np. formy powstałe przez alternatywne składanie) i naturalnie występujące warianty alleliczne aminopeptydazy b2324. W jednym wykonaniu wynalazku aminopeptydaza b2324 o natywnej sekwencji jest dojrzałą lub o natywnej sekwencji pełnej długości aminopeptydazą b2324 obejmującą aminokwasy 1 do 688 z SEQ ID NO:2.
„Homolog aminopeptydazy 2324” oznacza aminopeptydazę o około 80% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową reszt 1 do 688 z polipeptydu aminopeptydazy b2324 o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:2. Takie homologi aminopeptydazy b2324 obejmują przykładowo polipeptydy aminopeptydazy b2324, gdzie dodany lub usunięty jest jeden lub więcej aminokwasów na N- lub C-końcach, jak również w obrębie jednej lub większej liczbie wewnętrznych domen z sekwencji SEQ ID NO:2. Korzystnie, homolog aminopeptydazy 2324 będzie miał przynajmniej około 85% identyczności sekwencji aminokwasowej, korzystnie przynajmniej około 90% identyczności sekwencji aminokwasowej i jeszcze korzystniej przynajmniej około 95% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową złożoną z reszt 1 do 688 z SEQ ID NO:2. Homologi nie obejmują sekwencji natywnej.
Gen yfcK oznacza gen posiadający przynajmniej 80% identyczności sekwencji z (a) cząsteczką DNA kodującą aminopeptydazę b2324 o sekwencji natywnej mającej sekwencję aminokwasową od 1 do 688 z SEQ ID NO:2 lub (b) cząsteczką DNA komplementarną do (a) i kodującą aminopeptydazę, i oznacza również gen o przynajmniej 80% identyczności sekwencji z chromosomowym genem yfcK o pełnej sekwencji reszt kwasu nukleinowego z SEQ ID NO:1 i kodującego aminopeptydazę. Takie geny yfcK obejmują, przykładowo, chromosomowy gen yfcK, gdzie dodana lub usunięta jest jedna lub więcej reszt kwasu nukleinowego na końcu 5' lub 3', jak również w obrębie wewnętrznej części sekwencji SEQ ID NO:1. Korzystnie, gen yfcK będzie posiadał przynajmniej 85% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, korzystniej przynajmniej około 90% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego i jeszcze korzystniej przynajmniej około 95% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego z sekwencją kwasu nukleinowego zł o ż onej z nukleotydów 1 do 2067 z SEQ ID NO:1. Termin ten obejmuje gen yfcK o natywnej sekwencji (tj. chromosomowy gen yfcK).
„Procent (%) identyczności sekwencji aminokwasowej” w odniesieniu do sekwencji aminopeptydazy b2324, które tu określono, jest zdefiniowany jako procent reszt aminokwasowych w kandydującej sekwencji, które są identyczne z resztami aminokwasowymi w sekwencji aminopeptydazy b2324, po przyrównaniu z sekwencjami i wprowadzeniu luk, jeśli jest to niezbędne, dla uzyskania maksymalnego procentu identyczności sekwencji i bez rozważania jakichkolwiek konserwatywnych podstawień jako części identyczności sekwencji. Procent wartości identyczności tu użyty można uzyskać przy zastosowaniu WU-BLAST-2, który otrzymano z (Altschul i wsp., Methods in Enzymology, 26:460-480 (1996); http(blast.wustl/edu/blast/README.html). WU-BLAST-2 używa szeregu parametrów badania, większość z nich jest wartościami domyślnymi. Dostosowywane parametry są ustawione przy poniższych wartościach: zasięg zakładki:1, część zachodząca=0,125, długość słowa (T)=11. Parametry HSP S i HSP S2 są wartościami dynamicznymi i są ustalane przez sam program zależnie od składu konkretnej sekwencji i składu konkretnej bazy danych, która jest przeszukiwana przy zastosowaniu sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania. Jednakże, wartości mogą być dostosowane dla zwiększenia czułości. Wartość % identyczności sekwencji aminokwasowej jest określana przez liczbę dopasowanych, identycznych reszt podzielona przez całkowitą liczbę reszt „dłuższej” sekwencji w przyrównanym obszarze. „Dłuższa” sekwencja jest tą, która posiada najczęściej występujące reszty w przyrównanym obszarze (ignorowane są luki wprowadzone przez WU-Blast-2 dla maksymalizacji oceny przyrównania).
Termin „wartości dodatnie” w kontekście porównania sekwencji przeprowadzonego jak opisano powyżej, obejmuje reszty w porównanych sekwencjach, które nie są identyczne, lecz mają podobne właściwości (np. będąc wynikiem konserwatywnych podstawień). Procent wartości dodatnich jest określany przez frakcję reszt uznanych za wartości dodatnie w macierzy BLOSUM 62 podzielonych przez całkowitą liczbę reszt w dłuższej sekwencji, jak zdefiniowano powyżej.
PL 206 286 B1
W podobny sposób „procent (%) identyczności sekwencji kwasu nukleinowego” w odniesieniu do sekwencji, która koduje peptydy aminopeptydazy b2324, które tu zidentyfikowano, określono jako procent resztami nukleotydowymi w kandydującej sekwencji identycznych z nukleotydami sekwencji kodującej aminopeptydazę b2324. Wartości identyczności, których tu użyto można uzyskać przy zastosowaniu przez moduł BLASTN z WU-BLAST-2 z ustawionymi parametrami domyślnymi, z zasięgiem zakładki i frakcją zakładki ustawionymi odpowiednio jako 1 i 0,125.
„Wyizolowane” użyty dla opisu różnych ujawnionych tu polipeptydów, oznacza polipeptyd, który zidentyfikowano i rozdzielono i/lub odzyskano ze składnika jego naturalnego środowiska. Zanieczyszczające składniki tego naturalnego środowiska są materiałami, które typowo będą zaburzały diagnostyczne lub terapeutyczne zastosowania polipeptydu i mogą obejmować enzymy, hormony oraz różne rozpuszczalne substancje białkowe lub niebiałkowe. W korzystnych wykonaniach, polipeptyd będzie oczyszczony (1) w stopniu dostatecznym dla uzyskania przynajmniej 15 reszt N-końcowych przy zastosowaniu sekwenatora z nasadką wirówkową, lub (2) do homogenności przez SDS-PAGE w nieredukujących lub redukujących warunkach przy zastosowaniu barwienia błękitem Coomasie lub korzystnie barwienia srebrem. Wyizolowany polipeptyd obejmuje polipeptyd wewnątrz zrekombinowanej komórki, ponieważ nie będzie występował przynajmniej jeden składnik naturalnego środowiska aminopeptydazy b2324. Jednakże zazwyczaj wyizolowany polipeptyd będzie wytworzony przez przynajmniej jeden etap oczyszczania.
„Wyizolowana” cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd aminopeptydazy b2324 jest cząsteczką kwasu nukleinowego, która jest zidentyfikowana i oddzielona od przynajmniej jednej zanieczyszczającej cząsteczki kwasu nukleinowego, z którą jest zazwyczaj związana w naturalnym źródle kwasu nukleinowego kodującego aminopeptydazę b2324. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca aminopeptydazę b2324 jest inna niż postać lub układ, w którym jest znajdowana w naturze. Co za tym idzie, wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego są odróżnialne od cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej aminopeptydazę b2324, jaka występuje w naturalnych komórkach. Jednakże, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd aminopeptydazy b2324 obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą aminopeptydazę b2324 zawartą w komórkach, które zazwyczaj wyrażają aminopeptydazę b2324, gdzie przykładowo, cząsteczka kwasu nukleinowego jest umiejscowiona na chromosomie inaczej niż w komórkach naturalnych.
Sposoby wykonania wynalazku
W pewnym aspekcie, wynalazek dotyczy określonego szczepu komórki bakteryjnego gospodarza, który nie ma aminopeptydazy (tj. enzymu, który odcina reszty aminokwasowe umiejscowione na N-końcu polipeptydów, tak jak ten, który tnie pomiędzy N-końcową fenyloalaniną i kolejnym sąsiadującym z nią aminokwasem), co za tym idzie pozwala na lepsze oczyszczanie polipeptydu.
Dokładniej, niniejszy wynalazek dostarcza w tym aspekcie komórek bakterii gram ujemnych z niedoborem chromosomowego genu (którego to genu nie brakuje w wersji typu dzikiego takich komórek) posiadającego przynajmniej 80% identyczności sekwencji z (a) cząsteczką DNA kodującą aminopeptydazę b2324 o naturalnej sekwencji mającej sekwencję aminokwasową złożoną z reszt od 1 do 688 z SEQ ID NO:2 lub (b) cząsteczką komplementarn ą DNA do (a) i kodującą aminopeptydazę. Tak więc, taki gen wykazuje przynajmniej 80% identyczności sekwencji z sekwencją genu yfcK. Korzystnie, gen ten wykazuje przynajmniej 85% identyczności sekwencji, korzystniej przynajmniej około 90% identyczności sekwencji, jeszcze korzystniej przynajmniej około 95% identyczności sekwencji i najkorzystniej 100% identyczności sekwencji z sekwencją genu yfcK (który koduje aminopeptydazę b2324 o sekwencji naturalnej). W innym aspekcie komórki bakterii gram ujemnych są pozbawione chromosomowego genu (którego to genu nie brakuje w wersji dzikiej takich komórek) kodującego aminopeptydazę o przynajmniej 80% identycznoś ci sekwencji z aminopeptydazą b2324 o naturalnej sekwencją maj ą cej sekwencję aminokwasową złożoną z reszt od 1 do 688 z SEQ ID NO:2. Korzystnie, aminopeptydaza ma przynajmniej około 85%, korzystniej przynajmniej około 90%, a jeszcze korzystniej przynajmniej około 95% identyczności sekwencji. Obejmuje to komórki z niedoborem chromosomowego genu yfc K o sekwencji natywnej.
W trzecim aspekcie, komórki bakterii gram ujemnych nie posiadają chromosomowego genu (którego to genu nie brakuje w wersji typu dzikiego takich komórek), który to gen zawiera (a) DNA kodujący polipeptyd dający przynajmniej 80% wartości dodatnich, gdy porówna się go z sekwencją aminokwasową aminopeptydazy b2324 o naturalnej sekwencji rozciągającej się od 1 do 688 SEQ ID NO:2, lub (b) DNA komplementarny do (a), gdzie ten polipeptyd jest aminopeptydazą. Obejmuje to komórki dające 100% wartości dodatnich, przy porównaniu z natywną sekwencją aminopeptydazy b2324.
PL 206 286 B1
Komórki według wynalazku są bakteriami gram ujemnymi, przykładowo bakteriami o zsekwencjonowanych genomach, takimi jak Salmonella, Yersinia, Haemophilus, Caulobacter, Agrobacterium, Vibrio itd.), gdzie przewidywana jest obecność homologa yfcK. Korzystniej, komórką jest Salmonella lub Enterobacetriaceae, jeszcze korzystniej E. coli, najkorzystniej W3110.
Komórka jest ponadto warunkowo pozbawiona jednego lub więcej innych chromosomowych genów występujących w wersjach typu dzikiego takich komórek, takich jak geny, które kodują bakteryjne proteazy. Szczepy E. coli z niedoborem proteaz lub genów kontrolujących regulacę proteaz są znane (Beckwith i Strauch, WO 88/05821 opublikowany 11 sierpnia 1988; Chaudhury i Smith, J. Bacteriol., 160:788-791 (1984); Elish i wsp., J. Gen. Microbiol., 134:1355-1364 (1988); Baneyx i Georgiou, „Expression of proteolyticaly sensitive peptides in Escherichia coli”, w: Stability of Protein Pharmaceuticals, torn 3: Chemical and Physical Pathways of Protein Degradation, Ahern i Manning, wyd. (Plenum Press, Nowy Jork, 1992), str. 69-108).
Niektóre z tych szczepów z niedoborem proteazy użyto w próbach wydajnego wytwarzania peptydów wrażliwych na proteolizę, w szczególności tych o potencjalnym znaczeniu medycznym lub komercyjnym. Patent US nr 5,508,192 (dla Georgiou i wsp.) opisuje konstrukcję wielu gospodarzy bakteryjnych z niedoborem proteazy i/lub białka szoku cieplnego. Tacy gospodarze obejmują bakterie z brakiem jednej, dwóch, trzech lub czterech proteaz i bakterię z pojedynczą proteazą, która posiada również mutację w genie rpoH. Przykłady ujawnionych genów proteaz obejmują szczep degP ompT ptr3, pre (tsp) i degP rpoH dla opisano wytwarzanie wysokich mian zrekombinowanych białek w E. coli. Park i wsp., Biotechnol. Prog., 15:164-167 (1999) donoszą również, że szczep (HM114) z niedoborem dwóch proteaz otoczki komórki (degP prc) rośnie nieznacznie szybciej i wytwarza więcej białka fuzyjnego niż inne szczepy z niedoborem większej liczby proteaz. Komórki tutaj opisane mogą mieć niedobór którejkolwiek lub większej liczby takich proteaz, z preferencją takich proteaz, które są kodowane przez chromosomowy ptr3 kodujący Proteazę III, chromosomowy ompT kodujący proteazę OmpT i/lub chromosomalny degP kodujący proteazę DegP. Szczepy mogą również być pozbawione tonA (fhuA), phoA i/lub deoC. Korzystnie, komórka nie ma degP i/lub fhuA. Najkorzystniej, komórka ma genotyp
W3110 AfhuA A(arg-F-lac) 169 phoAΔE15 deoC2 degP::kanR ilvG2096 ΔyfcK.
W innym wykonaniu komórka zawiera kwas nukleinowy kodujący polipeptyd heterologiczny dla komórki. Kwas nukleinowy może być wprowadzony do komórki jakimkolwiek sposobem, lecz korzystnie do transformacji używa się kwas nukleinowym albo przez zastosowanie zrekombinowanego wektora ekspresyjnego albo przez rekombinację homologiczną, najkorzystniej z zastosowaniem wektora.
Przykładami odpowiednich heterologicznych polipeptydów są te, zdefiniowane powyżej i obejmujące białka i polipeptydy zaczynające się od metioniny i posiadające fenyloalaninę jako drugi aminokwas, jak również białka rozpoczynające się od fenyloalaniny (tj. te, które w dojrzałej postaci rozpoczynają się od fenyloalaniny lub są dalej poddane proteolitycznej obróbce dla usunięcia początkowej metioniny i te, które są preprobiałkami z odciętym peptydem sygnałowym tak aby zostawić Phe jako N-koniec dojrzałego białka, tak jak ma to miejsce w przypadku ludzkiego hormonu wzrostu). A zatem, jakikolwiek polipeptyd heterologiczny dla komórki bakterii, w której został otrzymany, w którym aminowy koniec dojrzałego lub końcowego produktu to Phe jest uwzględniony tu dla tych celów.
Przykłady ludzkich polipeptydów spełniających to wymaganie lokalizacji fenyloalaniny obejmują prekursor łańcucha alfa-2 kolagenu, prekursor łańcucha delta powierzchniowej glikoproteiny cd3 komórki T, prekursor insuliny, prekursor integryny alfa-3, prekursor integryny alfa-5, prekursor integryny alfa-6, prekursor integryny alfa-7, prekursor integryny alfa-e, prekursor integryny alfa-n, prekursor integryny alfa-v, prekursor integryny alfa-x, prekursor acetylotransferazy fosfatydylocholina-sterol, prekursor antygenu 3 związango z funkcją limfocytów, prekursor jelitowej kolagenazy, prekursor kolagenazy z limfocytów obojętnochłonnych, prekursor motyliny, prekursor neurofiliny-1, prekursor acetylohydrolazy czynnika aktywującego płytki, prekursor sialoproteiny ii z kości, prekursor wariantu hormonu wzrostu (Seeburg, DNA 1:239-249 (1982)), prekursor somatotropiny, prekursor małej indukowalnej cytokiny a13, prekursor małej indukowalnej cytokiny a27, prekursor małej indukowalnej cytokiny b11, prekursor przedstawiciela 8 nadrodziny receptora czynnika martwicy nowotworów, prekursor łańcucha beta tyrotropiny, prekursor czynnika wzrostowego c śródbłonka naczyń, preproinsulina (BE885196-A), wariant HGH-V ludzkiego hormonu wzrostu (EP89666-A), ludzka proinsulina (US4431740), peptyd sygnałowy AP i ludzki hormon wzrostu (hGH) kodowany przez pAP-1 (EP177343-A), prekursor ludzkiego hormonu wzrostu (hGF) (EP245138-A), ludzki BMP (EP409472-A) ludzkie białko LFA-3 (CD58) (DE4008354-A), receptor typu II ludzkiej interleukiny-1 (EP460846-A), analog nr 6 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności (WO9206111-A), analog nr 7 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności
PL 206 286 B1 (WO9206111-A), analog nr 8 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności (WO9206111-A), analog nr 10 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności (WO9206111-A), analog nr 9 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności (WO9206111-A), analog nr 11 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności (WO9206111-A), analog nr 12 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności (WO9206111-A), analog nr 13 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności (WO9206111-A), analog nr 14 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności (WO9206111-A), podjednostka alfa 6A integryny (WO9219647-A), podjednostka alfa 6B integryny (WO9219647-A), ludzkie białko LFA-3 (EP517174-A), ludzka plazmatyczna karboksypeptydaza B (US5206161-A), IL-1R pochodzenia limfoblastoidalnego (WO9319777-A), ludzkie LFA-3 (JP06157334-A), ludzki receptor indukowany przez aktywację limfocytu (ILA) (CA2108401-A), receptor białka komórki endotelium (WO9605303-A1), ludzka acetylotransferaza lecytyna-cholesterol (LCAT) (WO9717434-A2), ludzki rozpuszczalny antygen CD30 (DE9219038-U1), ludzki mały czynnik wzrostowy typu CCN (WO9639486-A1), ludzka plazmatyczna karboksypeptydaza B (US5593674-A), ludzki hormon wzrostu (WO9820035-A1), analog insuliny kodowany przez fragment plazmidu pKFN-864 (EP861851-A1), polipeptyd CXC chemokiny „IBICK” naczelnych (WO9832858-A2), ludzki mały czynnik wzrostowy typu CCN (US5780263-A), sekwencja aminokwasowa ludzkiej plazmatycznej hialuronidazy (hpHAza) (WO9816655-A1), ludzkie białko IL-1R typu II (US5767064-A), białko klonu CC365_40 od Homo sapiens (WO9807859-A2), ludzki hormon wzrostu (US5955346-A), ludzki rozpuszczalny receptor hormonu wzrostu (US5955346-A), ludzkie białko antygenu CD30 (WO9940187-A1), ludzka neuropilina-1 (WO9929858-A1), ludzki polipeptyd pochodzący z tkanki mózgowej (klon OMB096) (WO9933873-A1), ludzkie białko Toll PRO285 (WO9920756-A2), sekwencja aminokwasowa ludzkiego wydzielanego peptydu (WO9911293-A1), sekwencja aminokwasowa ludzkiego wydzielanego peptydu (WO9911293-A1), sekwencja aminokwasowa ludzkiego wydzielanego peptydu (WO9911293-A1), sekwencja aminokwasowa ludzkiego wydzielanego peptydu (WO9911293-A1), sekwencja aminokwasowa ludzkiego wydzielanego peptydu (WO9907891-A1), sekwencja aminokwasowa ludzkiego wydzielanego białka (WO9907891-A1), sekwencja aminokwasowa ludzkiego wydzielanego białka (WO9907891-A1), ludzka plazmatyczna karboksypeptydaza B (PCPB) thr147 (WO9855645-A1), białko ludzkiej chemokiny MIG-beta (EP887409-A1), sekwencja aminokwasowa ludzkiego wydzielanego białka (WO200052151-A2), ludzka fuzja białkowa hGH/EGF kodowana przez plazmid pWRG1630 (US6090790-A), ludzkie wydzielane białko kodowane przez klon cDNA 3470865 (WO200037634-A2), ludzkie białko FDF03DeltaTM pochodzące z monocytu (WO200040721-A1), ludzkie białko FDF03-S1 pochodzące z monocytu (WO200040721-A1), ludzkie białko FDF03-M14 pochodzące z monocytów (WO200040721-A1), ludzkie białko FDF03-S2 pochodzące z monocytów (WO200040721-A1), ludzkie wydzielane biało nr 2 (EP1033401-A2), ludzki pre-pro czynnik wzrostu C śródbłonka naczyń (WO200021560-A1), ludzkie błonowe białko transportujące, MTRP-15 (WO200026245-A2), białko ludzkiego czynnika wzrostowego śródbłonka naczyń (VEGF)-C (WO200024412-A2), ludzkie TANGO 191 (WO200018800-A1), receptor-HKAEF92 interferonu (WO9962934-A1), ludzka podjednostka alfa-10 integryny (WO9951639-A1), wariant składania ludzkiej podjednostki alfa-10 integryny (WO9951639-A1), homolog ludzkiej reduktazy delta 1-pirrolino-5-karboksylazy (P5CRH) (US6268192-B1), ludzkie białko typu czynnika wzrostu/różnicowania 6 AMF10 (WO200174897-A2), białko ludzkiego transportera i kanału jonowego-6 (TRICH-6) (WO200162923-A2), białko ludzkiego transportera i kanału jonowego-7 (TRICH-7) (WO200162923-A2), ludzkie białko metaloproteinazy-1 substancji międzykomórkowej (WO200166766-A2), ludzkie białko metaloproteinazy-8 substancji międzykomórkowej (MMP-8) (WO200166766-A2), ludzkie białko metaloproteinazy-18P substancji międzykomórkowej (MMP-18P) (WO200166766-A2), ludzkie białko receptora 6 związanego z białkiem G (GPCR6) (WO200181378-A2), ludzkie białko Zlec1 (WO200166749-A2), ludzkie białko substancji międzykomórkowej typu mataloproteazy (MMP) (WO200157255-A1), ludzkie wydzielane białko HFXDI56 kodowane przez gen 15 (WO200154708-A1), ludzkie wydzielane białko HTEGF16 kodowane przez gen 9, (WO200154708-A1), ludzkie wydzielane białko (SECP) nr 4 (WO200151636-A2), ludzkie wydzielane białko HUSIB13 kodowane przez gen 20 (WO200151504-A1), ludzkie wydzielane białko HISAQ04 kodowane przez gen 28 (WO200151504-A1), ludzkie wydzielane białko HCNAH57 kodowane przez gen 35 (WO200151504-A1), ludzkie wydzielane białko HBMCF37 kodowane przez gen 17 (WO200151504-A1), ludzkie białko kodowane przez gen-6 (TSG-6) pobudzane czynnikiem martwicy nowotworów (TNF) (US6210905-B1), FCTR10 (WO200146231-A2), ludzkie wydzielane białko HFKHW50 kodowane przez gen 18 (WO200136440-A1), ludzkie wydzielane białko kodowane przez gen 18 HFKHW50 (WO200136440-A1), ludzkie wydzielane białko HE8FC45 kodowane przez gen 13 (WO200077022-A1), ludzkie wydzielane białko HTLIF12 kodowane przez gen 32 (WO200077022-A1), ludzkie wydzielane białko HCRPV17 koPL 206 286 B1 dowane przez gen 4 (WO200134643-A1), ludzkie wydzielane białko HE8OK73 kodowane przez gen 23 (WO200134643-A1), ludzkie wydzielane białko HCRPV17 kodowane przez gen 4 (WO200134643-A1), ludzkie wydzielane białko HMSFK67 kodowane przez gen 22 (WO200132676-A1), ludzkie wydzielane białko HMSFK67 kodowane przez gen 22 (WO200132676-A1), ludzkie wydzielane białko HMSFK67 kodowane przez gen 22 (WO200132676-A1), ludzkie wydzielane białko HCRNF14 kodowane przez gen 19 (WO200134800-A1), ludzkie wydzielane białko HNEEB45 kodowane przez gen 6 (WO200132687-A1), ludzkie wydzielane białko HNEEB45 kodowane przez gen 6 (WO200132687-A1), ludzkie wydzielane białko HHPDV90 kodowane przez gen 9 (WO200132675-A1), ludzkie wydzielane białko B7-H6 kodowane przez gen 1 (WO200134768-A2), ludzkie wydzielane białko HDPMS12 kodowane przez gen 3 (WO200134768-A2), ludzkie wydzielane białko HRABS65 kodowane przez gen 13 klon (WO200134768-A2), ludzkie wydzielane białko HDPAP35 kodowane przez gen 1 (WO200134768-A2), ludzkie wydzielane białko HDPMS12 kodowane przez gen 3 (WO200134768-A2), ludzkie wydzielane białko HACCL63 kodowane przez gen 17 (WO200134769-A2), ludzkie wydzielane białko HACCL63 kodowane przez gen 17 (WO200134769-A2), ludzkie wydzielane białko HHEPJ23 kodowane przez gen 10 (WO200134629-A1), ludzkie wydzielane białko HHEPJ23 kodowane przez gen 10 (WO200134629-A1), ludzkie wydzielane białko HE9QN39 kodowane przez gen 5 (WO200134626-A1), ludzkie wydzielane białko HCRNO87 kodowane przez gen 14 (SEQ 104) (WO200134626-A1), ludzkie wydzielane białko HE9QN39 kodowane przez gen 5 (WO200134626-A1), ludzkie wydzielane białko HCRNO87 kodowane przez gen 14 (SEQ 145) (WO200134626-A1), ludzkie wydzielane białko HSODE04 kodowane przez gen 4 (WO200134623-A1), ludzkie wydzielane białko kodowane przez gen 6 HMZMF54 (WO200134623-A1), ludzkie wydzielane białko HPJAP43 kodowane przez gen 18 (WO200134623-A1), ludzkie wydzielane białko HNTSL47 kodowane przez gen 27 (WO200134623-A1), ludzkie wydzielane białko HSODE04 kodowane przez gen 4 (WO200134623-A1), ludzkie wydzielane białko HMZMF54 kodowane przez gen 6 (WO200134623-A1), ludzkie wydzielane białko HPJAP43 kodowane przez gen 18 (WO200134623-A1), ludzkie wydzielane białko HNTSL47 kodowane przez gen 27 (WO200134623-A1), ludzkie wydzielane białko HLJEA01 kodowane przez gen 21 (WO200134767-A2), ludzkie wydzielane białko HTJNX29 kodowane przez gen 25 (SEQ 115) (WO200134627-A1), ludzkie wydzielane białko HTJNX29 kodowane przez gen 25 (SEQ 165) (WO200134627-A1), ludzka sekwencja aminokwasowa TANGO 509 (WO200121631-A2), ludzkie białko TANGO 210 (WO200118016-A1), ludzkie białko 12 związane z rakiem (WO200118014-A1), ludzkie białko 18 związane z rakiem (WO200118014-A1), ludzkie wydzielone białko B7-4 (B7-4S) (WO200114557-A1), ludzkie błonowe białko B7-4 (B7-4M) (WO200114557-A1), ludzkie wydzielone białko B7-4 (B7-4S) (WO200114556-A1), ludzkie błonowe białko B7-4 (B7-4M) (WO200114556-A1), wariant ludzkiej interleukiny DNAX 80 (WO200109176-A2), ludzka acylotransferaza lecytyna-cholesterol (LCAT) (WO200105943-A2 sekwencja aminokwasowa ludzkiego polipeptydu PR01419 (WO200077037-A2), sekwencja aminokwasowa ludzkiego łańcucha alfa11 integryny (WO200075187-A1), ludzkie A259 (WO200073339-A1), ludzki peptyd pochodzący ze szpiku kostnego (WO200166558-A1), ludzkie antygenowe białko target-169 związane z guzem (TAT169) (WO200216602-A2), ludzkie wydzielane białko HKZAO35ID kodowane przez gen 3 (WO200218411-A1), ludzkie wydzielane białko HKZAO35 kodowane przez gen 3 (WO200218411-A1), ludzkie wydzielane białko HLYCK27 kodowane przez gen 11 (WO200218435-A1), ludzkie białko INTG-1 (WO200212339-A2), ludzkie wydzielane białko HFPHA80 kodowane przez gen 15, SEQ 70 (WO200216390-A1), ludzkie wydzielane białko HFPHA80 kodowane przez gen 15, SEQ 94 (WO200216390-A1), ludzkie wydzielane białko HDQFU73 kodowane przez gen 2, SEQ 69 (WO200-224719-A1), ludzkie wydzielane białko HDPTC31 kodowane przez gen 8, SEQ 75 (WO200224719-A1), ludzkie wydzielane białko HDQFU73 kodowane przez gen 2, SEQ 90 (WO200224719-A1), ludzkie wydzielane białko HDPRJ60 kodowane przez gen 6, SEQ 95 (WO200224719-A1), ludzkie wydzielane białko HDPTC31 kodowane przez gen 8, SEQ 99 (WO200224719-A1), ludzkie wydzielane białko HDPTC31 kodowane przez gen 8, SEQ 100 (WO200224719-A1), ludzki analog proinsuliny (WO200-204481-A2), antygenowe docelowe białko związane z nowotworem, TAT136 (WO200216429-A2), antygenowy docelowy polipeptyd związany z nowotworem (TAT) 136 (WO200216581-A2), sekwencja ludzkiego białka CD30 (WO200211767-A2), sekwencja białka ludzkiej interleukiny 1R2 (IL-1R2) (WO200211767-A2), ludzkie białko receptora-7 związanego z białkiem G (GPCR-7) (WO200206342-A2), ludzki receptor związany z białkiem G (GPCR6a) (WO200208289-A2), ludzki receptor związany z biał kiem G (GPCR6b) (WO200208289-A2), ludzki receptor typu II dla interleukiny-1 (WO200187328-A2), ludzki polipeptyd A259 (WO200181414-A2), ludzka cząsteczka adhezyjna dla komórek naczyń, VCAM1 (US6307025-B1), ludzka cząsteczka adhezyjna dla komórek naczyń, VCAM1b (US6307025-B1),
PL 206 286 B1 ludzkie transportery i kanały jonowe (TRICH)-6 (WO200177174-A2) i ludzka cząsteczka-8 modyfikująca i utrzymująca białko (PMMM-8) (WO200202603-A2).
W dalszym aspekcie, wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania heterologicznego polipeptydu obejmującego (a) hodowanie komórek niosących kwas nukleinowy kodujący heterologiczny polipeptyd i (b) odzyskiwanie polipeptydu z komórek. Odzyskiwanie moż e być z cytoplazmy, peryplazmy lub pożywki hodowlanej komórek, choć korzystnie polipeptyd jest odzyskiwany z peryplazmy lub pożywki hodowlanej. Korzystnie hodowla ma miejsce w fermentorze. Użyte parametry hodowli i wytwarzanie polipeptydu jest prowadzone w dogodny sposób, tak jak opisane poniżej procedury. Gdy pożądany polipeptyd jest wytworzony w cytoplazmie, nie jest konieczna inkubacja komórek przed lub po lizie, choć może ona zwiększyć wydajność tworzenia przyciętego materiału. Gdy pożądany polipeptyd jest wydzielony do peryplazmy lub pożywki hodowlanej, wtedy etap inkubacji jest preferowany i zalecany jako trwający przynajmniej około 0,5 godziny. Korzystny sposób odzyskiwania polipeptydów wytworzonych w peryplazmie jest związany z rozbiciem lub zmiażdżeniem komórek przykładowo przy pomocy homogenizatorów, prasy Frencha do komórek oraz mikrofluidyzerów dla dużych objętości i sonikatorów dla małych objętości. Lizat tworzy sie z rozbitych komórek, z którego może być oczyszczony niezmieniony polipeptyd. Korzystnie, lizat taki jest inkubowany przed etapem oczyszczania. Inkubacja ta może być przeprowadzona w jakiejkolwiek dogodnej temperaturze, lecz korzystnie w temperaturze pokojowej lub niższej przez przynajmniej około 1 godzinę, korzystniej przez około 2-50 godzin. Polipeptyd i typ komórki są korzystnie jak podano powyżej.
Ponadto, wynalazek dostarcza sposobu zapobiegania N-końcowemu odcięciu reszty aminokwasowej z polipeptydu, obejmującego hodowanie komórki, gdzie komórka zawiera kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, w warunkach takich, że kwas nukleinowy ulega ekspresji. Takie warunki hodowli są tradycyjne i dobrze znane biegłym w tej dziedzinie. Korzystnie, polipeptyd jest odzyskany z komórki. Korzystny polipeptyd i typ komórki są opisane powyżej.
Alternatywnie, odwrotne postępowanie stosuje się, gdy przecięty polipeptyd jest odczyszczony od nieprzeciętego polipeptydu, który jest zanieczyszczeniem. W tym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu odcięcia N-końcowego aminokwasu z polipeptydu obejmującego doprowadzenie do kontaktu polipeptydu z białkiem aminopeptydazy b2324, jak to opisano powyżej, korzystnie gdy kontaktowanie to jest prowadzone przez inkubowanie z białkiem aminopeptydazy b2324. Ponadto, sposób wytwarzania przeciętego polipeptydu wymaga hodowania komórek bakterii niosących gen yfcK (gdzie gen jest endogenny lub heterologiczny dla komórek) i zawierających kwas nukleinowy kodujący odpowiedni, nieprzecięty polipeptyd, który ma dodany aminokwas na swoim N-końcu, gdzie hodowanie jest w warunkach takich jak dla ekspresji lub nadekspresji genu yfcK i dla ekspresji kwasu nukleinowego kodującego nieprzecięty polipeptyd i jeśli nie przecięty polipeptyd i białko aminopeptydazy b2324 nie mają kontaktu po ekspresji, doprowadzenie do kontaktu nie przeciętego polipeptydu z białkiem aminopeptydazy b2324 tak, że wytworzony jest przecięty polipeptyd.
Korzystnie, polipeptyd jest heterologiczny dla komórek, a i korzystniej jest jednym z polipeptydów z podanych wyżej kategorii. Korzystnie, typ komórki jest wybrany z tych, podanych powyżej, z wyjątkiem takich bez delecji genu yfcK. Gen yfcK może być wprowadzony przy pomocy wektora lub może być endogennym dla komórki gospodarza i korzystnie ulega nadekspresji względem ekspresji kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd tak, że jest to korzystne dla enzymatycznej reakcji cięcia.
W kolejnym, korzystnym aspekcie nieprzecięty polipeptyd jest odzyskiwany z komórek przed kontaktem z białkiem aminopeptydazy b2324. Podczas odzyskiwania, korzystnie komórki są rozbijane (przy zastosowaniu podanych wyżej sposobów) i następnie zlizowane. Po lizie, nie przecięty polipeptyd jest korzystnie inkubowany z białkiem aminopeptydazy b2324 tak, że usunięty jest koniec aminowy i przecię ty polipeptyd jest oczyszczony z inkubowanego lizatu. Korzystnie, lizat jest inkubowany przez przynajmniej około 1 godz. w około 20-40°C, korzystniej przez około 2-50 godzin, w około 30-40°C.
I. Wytwarzanie i odzyskanie nieprzeciętego polipeptydu.
A. Wbudowanie kwasu nukleinowego do ulegającego replikacji wektora.
Kwasem nukleinowym kodującym polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania jest dogodnie cDNA lub genomowy DNA z jakiegokolwiek źródła przy założeniu, że koduje polipeptyd(y) będący przedmiotem zainteresowania.
Heterologiczny kwas nukleinowy (np. cDNA lub genomowy DNA) jest odpowiednio wbudowany do ulegającego replikacji wektora dla ekspresji w bakterii, pod kontrolą odpowiedniego promotora. Dla tych celów dostępnych jest wiele wektorów i selekcja odpowiedniego wektora będzie zależała głównie od wielkości kwasu nukleinowego, który będzie wbudowany do wektora i określonej komórki gospodaPL 206 286 B1 rza, która będzie stransformowana wektorem. Każdy wektor zawiera różne składniki, zależnie od konkretnej komórki gospodarza, z którą jest zgodny. Zależnie od konkretnego typu gospodarza składniki wektora ogólnie obejmują, lecz będąc ograniczone do jednej lub więcej poniższych: sekwencji sygnałowej, miejsca inicjacji replikacji, jednego lub większej liczby genów markerowych, promotora i sekwencji terminatora transkrypcji.
Ogólnie, wektory plazmidowe zawierające replikon i sekwencje kontrolujące pochodzące od gatunków zgodnych z komórkami gospodarza są stosowane w połączeniu z gospodarzami E. coli. Wektor zazwyczaj niesie miejsce replikacji, jak również sekwencje markerowe zdolne do zapewnienia stransformowanym komórkom fenotypu podlegającego selekcji. Przykładowo, E. coli jest typowo transformowana przy pomocy pBR322, plazmidu pochodzącego z gatunków E. coli (patrz np. Bolivar i wsp., Gene, 2:95 (1977)). Plazmid pBR322 zawiera geny oporno ś ci na ampicylinę i tetracyklinę i co za tym idzie zapewnia łatwy sposób identyfikacji stransformowanych komórek. Plazmid pBR322 lub inny plazmid bakteryjny lub fag ogólnie zawiera również lub jest zmodyfikowany tak aby zawierał promotory, które mogą być użyte przez gospodarza E. coli dla ekspresji genów markerów selekcyjnych.
(i) Składnik-sekwencja sygnałowa
DNA kodujący polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania może być wyrażony nie tylko bezpośrednio, lecz również jako fuzja z innym polipeptydem, korzystnie sekwencją sygnałową lub innym polipeptydem posiadającym miejsce cięcia na N-końcu dojrzałego polipeptydu. Ogólnie, sekwencja sygnałowa może być składnikiem wektora lub może być częścią DNA dla polipeptydu, który jest wbudowany do wektora. Wybrana heterologiczna sekwencja sygnałowa powinna być taką, która jest rozpoznawana i ulega obróbce (tj. jest cięta przez sygnałową peptydazę) przez komórki gospodarza.
Dla komórek gospodarza, które nie rozpoznają i nie prowadzą obróbki sekwencji sygnałowej natywnego lub eukariotycznego polipeptydu, sekwencja sygnałowa jest podstawiona przez odpowiednią prokariotyczną sekwencję sygnałową wybraną przykładowo z grupy obejmującej lidery alkalicznej fosfatazy, penicylinazy, lpp lub termostabilnej enterotoksyny 2.
(ii) Składnik - miejsce inicjacji replikacji
Wektory ekspresyjne zawierają sekwencję kwasu nukleinowego umożliwiającą wektorowi replikację w jednym lub większej liczbie komórek gospodarza. Sekwencje takie są dobrze znane dla różnych bakterii. Miejsce inicjacji replikacji z plazmidu pBR322 jest odpowiednie dla bakterii Gram-ujemnych, takich jak E. coli.
(iii) Składnik - gen selekcyjny
Wektory ekspresyjne ogólnie zawierają gen selekcyjny, określany również jako marker selekcyjny. Gen ten koduje białko niezbędne dla przeżycia lub wzrostu stransformowanych komórek gospodarza rosnących w pożywce selekcyjnej. Komórki gospodarza nie stransformowane wektorem zawierającym gen selekyjny nie przeżyją w pożywce hodowlanej. Ten marker selekcyjny jest oddzielony od markerów genetycznych tak jak wykorzystywany i zdefiniowany przez niniejszy wynalazek. Typowe geny selekcyjne kodują białka, które (a) nadają oporność na antybiotyki lub inne toksyny, np. ampicylina, neomycyna, metotreksat lub tetracyklina, (b) komplementują wymagania auksotroficzne inne niż te, wywołane obecnością znacznika(ów) genetycznych lub (c) dostarczają krytycznych substancji odżywczych niedostępnych w pożywce pełnej, np. kodujący racemazę D-alaniny z Bacilli.
Przykładowy schemat selekcji wykorzystuje lek dla zahamowania wzrostu komórki gospodarza. W tym wypadku komórki, które są pomyś lnie stransformowane kwasem nukleinowym b ę d ą cym przedmiotem zainteresowania wytwarzają polipeptyd nadający oporność na lek i tym samym umożliwiają przeżycie w warunkach selekcyjnych. Przykłady takiej, dominującej selekcji wykorzystują leki, neomycynę (Southern i wsp., J. Molec. Appl. Genet., 1: 327 (1982)), kwas mykofenolowy (Mulligan i wsp., Science 209:1422 (1980)) lub higromycynę (Sugden i wsp., Mol. Cell. Biol., 5:410-413 (1985)). Trzy podane wyżej przykłady wykorzystują geny bakteryjne pod kontrolą eukariotyczną zapewniające oporność na odpowiedni lek, odpowiednio, G418 lub neomycynę (genetycyna), xgpt (kwas mykofenolowy) lub higromycynę.
(iv) Składnik - promotor
Wektor ekspresyjny dla wytwarzania polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania zawiera odpowiedni promotor, który jest rozpoznany przez organizm gospodarza i jest połączony funkcjonalnie z kwasem nukleinowym kodującym będący przedmiotem zainteresowania polipeptyd. Promotory dogodne do użycia z prokariotycznymi gospodarzami obejmują systemy promotora beta-laktamazy i laktozy (Chang i wsp., Nature 275: 615 (1978); Goeddel i wsp., Nature, 281: 544 (1979)), system promotora arabinozy (Guzman i wsp., J. Bacteriol., 174:7716-7728 (1992)), system promotora
PL 206 286 B1 alkalicznej fosfatazy i tryptofanu (trp) (Goeddel, Nucleic Acid Res. 8:4057 (1980) i EP 36,776) oraz hybrydowe promotory takie jak promotor tac (deBoer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). Jednakże odpowiednie są inne promotory bakteryjne. Ich sekwencje nukleotydowe zostały opublikowane co umożliwia biegłemu pracownikowi funkcjonalne włączenie ich do DNA kodującego interesujący polipeptyd (Siebenlist i wsp., Cell, 20:269 (1980)) przy pomocy łączników lub adaptorów dla zapewnienia wymaganych miejsc restrykcyjnych.
Promotory dla zastosowania w systemach bakteryjnych ogólnie zawierają również sekwencję Shine-Dalgarno (S.D.) połączoną funkcjonalnie z DNA kodującym polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania. Promotor może być pobrany z bakteryjnego źródła DNA przez trawienie enzymem restrykcyjnym i wbudowany do wektora zawierającego pożądany DNA.
(v) Konstrukcja i analiza wektorów
Konstrukcja dogodnych wektorów zawierających jeden lub więcej wyżej wyszczególnionych składników wykorzystuje standardowe techniki ligacji. Wyizolowane plazmidy lub fragmenty DNA są przecinane, dobudowuje im się końce i ponownie są łączone (ligowane) w postaci pożądanej dla wytworzenia wymaganych plazmidów.
Dla analizy dla potwierdzenia poprawności sekwencji w skonstruowanych plazmidach mieszaniny ligacyjne są użyte dla transformacji szczepu 294 E. coli K12 (ATCC 31,446) lub innych szczepów i pomyślnie uzyskane transformanty są selekcjonowane, tam gdzie jest to odpowiednie, pod kątem na oporności na ampicylinę lub tetracyklinę. Plazmidy z transformantów są przygotowane, analizowane przez trawienie endonukleazą restrykcyjną i/lub sekwencjonowane metodą według Sangera i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977) lub Messing i wsp., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981) albo metodą według Maxama i wsp., Methods in Enzymology, 65:499 (1980).
B. Selekcja i transformacja komórek gospodarza
Jak określono powyżej wiele typów komórek bakterii Gram-ujemnych może być użytych dla celów uzyskania braku genu yfcK, i te, które wspomniano powyżej, są ich przykładami. Szczep E. coli W3110 jest korzystnym szczepem rodzicielskim, ponieważ jest powszechnie stosowanym szczepem gospodarza dla fermentacji produktów zrekombinowanego DNA. Korzystnie, komórki gospodarza powinny wydzielać minimalne ilości enzymów proteolitycznych. Przykładowo, szczep W3110 może być zmodyfikowany dla uzyskania mutacji genetycznej w genach kodujących białka, a przykłady takich gospodarzy E. coli, wraz z ich genotypami, zamieszczono w tabeli poniżej.
Szczep | Genotyp |
1 | 2 |
W3110 | K-12 F lambda IN(rrnD-rrnE)l |
1A2 | W3110 \fhuA lub W3110 tonAΔ |
7C1 | W3110 \fhuA \(argF-lac)169 phoAΔE15 |
9E4 | W3110\ fhuA ptr3 |
16C9 | W3110 \fhuA \(arg-F-lac)169 phoAΔE15 deoC2 |
23E3 | W3110 ΔfhuA Δ(arg-F-lac)169 phoAΔE15 deoC2 degP::kanR |
27A7 | W3110 \fhuA ptr3 phi\E15 \(argF-lac)169 |
27C6 | W3110ΔfhuA ptr3 phoA\E15 Δ(argF-lac)169)ompT |
27C7 | W3110 \fhuA ptr3 phoA\E15 Δ(argF-lac)169 ΔompT degP41 ΔpstI-kanR) |
33B6 | W3110 \fhuA \(arg-F-lac)169 phoA\E15 deoC2 degP::kanR ilvG2096 |
33D3 | W3110 \fhuA ptr3 laclq lacL8 \ompT degP41 \pstI-kanR) |
36F8 | W3110 \fhuA phoA\E15 \(argF-lac)169 ptr3 degP41 \pstI-kanR) ilvG2096R |
37D6 | W3110 tonAA ptr3 phoA\E15 \(argF-lac)169 ompT\ degP41kanr rbs7\ ilvG |
40B4 | Szczep 37D6 z delecją degP bez oporności na kanamycynę |
PL 206 286 B1
c.d. tabeli
40G3 | W3110tonA\ phoA\E15 Δ(argF-lac)169 deoC \ompT degP41 (\Pstl-kanr) ilvG2096R phn(EcoB) |
43D3 | W3110 \fhuA ptr3 phoA\E15 \(argF-lac)169 \ompT degP41 \Pstl-kanr) ilvG2096R |
43E7 | W3110 \fhuA \(argF-lac)169 \ompT ptr3 phoA\E15 degP41 \Pstl-kans) ilvG2096R |
44D6 | W3110 \fhuA ptr3 \(argF-lac)169 degP41 \pstl-kans) \ompT ilvG2096R |
45F8 | W3110 \fhuA ptr3 \(argF-lac)169 degP41 \pstl-kans) \ompT phoS* (T10Y) ilvG2096R |
45F9 | W3110 \fhuA ptr3 \(argF-lac)169 degP41 \pstl- kans) \ompT ilvG2096R phoS* (T10Y) \cyo::kanR |
Również użyteczne są szczepy pośrednie dla otrzymania szczepu 36F8, tj. 27B4 (patent US nr 5,304,472) i 35E7 (spontaniczna kolonia odporna na temperaturę będąca izolatem rosnącym lepiej niż 27B4). Kolejnym, użytecznym szczepem jest szczep E. coli posiadający zmutowaną peryplazmatyczną proteazę ujawniony w patencie US nr 4,946,783 nadanym 7 sierpnia 1990.
Zmutowana komórka według niniejszego wynalazku może być wytworzona przez wbudowanie genu yfcK do chromosomu, do komórki rodzicielskiej lub przy pomocy innych technik obejmujących te podane w przykładach poniżej.
Kwas nukleinowy kodujący polipeptyd jest wbudowany do komórek gospodarza. Kwas nukleinowy jest wprowadzony do odpowiedniej komórki gospodarza przy zastosowaniu jakiegokolwiek użytecznego sposobu obejmującego transformację wektorem kodującym polipeptyd. Transformacja oznacza wprowadzenie DNA do organizmu tak, że DNA ulega replikacji, zarówno jako element pozachromosomowy lub przez włączenie do chromosomu. Zależnie od użytej komórki gospodarza, transformacja jest dokonana przy pomocy typowych sposobów odpowiednich dla takich komórek. Działanie wapniem w którym wykorzystuje się chlorek wapnia jak to opisano w rozdziale 1.82 Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nowy Jork: Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989), jest ogólnie stosowane w przypadku komórek prokariotycznych lub innych komórek posiadających istotne bariery ściany komórkowej. Inny sposób transformacji wykorzystuje glikol polietylenowy/DMSO, jak to opisano w Chung i Miller, Nucleic Acids Res., 16:3580 (1988). Jeszcze innym sposobem jest użycie techniki nazwanej elektroporacją.
Przykładowa transformacji przez wbudowanie genu kodującego polipeptyd do genomu gospodarza E. coli wymaga wbudowania do wektora dla transformacji sekwencji DNA, która jest komplementarna do sekwencji znalezionej w genomowym DNA E. coli. Transformacja E. coli wektorem prowadzi do rekombinacji homologicznej z genomem i wbudowania genu kodującego polipeptyd. Korzystnie, kwas nukleinowy jest wbudowany przez przeniesienie komórek gospodarza z wyżej opisanymi wektorami ekspresyjnym i hodowanie w zwykłej pożywce odżywczej zmodyfikowanej w sposób odpowiedni dla indukcji różnych promotorów.
C. Hodowanie komórek gospodarza
Komórki gospodarza użyte dla wytworzenia polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania, według niniejszego wynalazku są hodowane w odpowiedniej pożywce jak to ogólnie opisano np. w Sambrook i wsp., jak wyżej.
Dla wydzielania wyeksprymowanego lub nadeksprymowanego produktu genu, komórka gospodarza jest hodowana w warunkach dogodnych dla wydzielania produktu genu. Takie warunki obejmują np. temperaturę, substancje odżywcze i warunki zagęszczenia komórek umożliwiające wydzielanie przez komórkę. Ponadto, takie warunki są tymi, w których komórka może realizować podstawowe funkcje komórkowe transkrypcję, translację i przenoszenie białek z jednego przedziału komórkowego do drugiego, co jest znane fachowcom w tej dziedzinie.
Gdy użyty jest promotor alkalicznej fosfatazy, komórki E. coli użyte dla wytworzenie polipeptydu według niniejszego wynalazku hoduje się w odpowiedniej pożywce, w której promotor alkalicznej fosfatazy może być częściowo lub całkowicie zaindukowany jak to opisano ogólnie np. w Sambrook i wsp., jak wyżej. Hodowanie nie powinno nigdy mieć miejsca przy braku nieorganicznego fosforu lub w warunkach głodu fosforanowego. Po pierwsze, pożywka zawiera nieorganiczny fosforan w ilości powyżej poziomu indukcji syntezy białka i dostatecznej dla wzrostu bakterii. Wraz ze wzrostem komórek i wykorzystaniem poziom fosforanu w pożywce ulega obniżeniu, co w konsekwencji powoduje indukcję syntezy polipeptydu.
PL 206 286 B1
Jakiekolwiek inne niezbędne składniki pożywki, włącznie ze źródłami węgla, azotu i nieorganicznego fosforanu mogą również być uwzględnione w odpowiednich stężeniach, wprowadzone same lub jako mieszanina z innymi składnikami pożywki, takimi jak złożone źródło azotu. Pożywka może mieć jakiekolwiek pH w zakresie 5-9, głównie w zależności od organizmu gospodarza.
Jeśli promotor jest promotorem indukowalnym, dla zajścia indukcji, typowo komórki są hoduje się aż do osiągnięcia określonej gęstości optycznej np. A550 wynoszącego około 200, wykorzystując proces z wysoką gęstością komórek, przy której zachodzi zapoczątkowanie indukcji (np. przez dodanie induktora, przez usunięcie składnika pożywki, itp.), w celu indukcji ekspresji kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania.
D. Wykrywanie ekspresji
Ekspresja kwasu nukleinowego może być zmierzona bezpośrednio w próbce, przykładowo przy pomocy klasycznej techniki Southerna, techniki northern dla ilościowego oznaczenia transkrypcji mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), techniki kroplowej (ang. dot blot) (analiza DNA) lub hybrydyzacji in situ, przy pomocy odpowiedniej wyznakowanej sondy, opierając się na sekwencjach polipeptydu. Różne znaczniki mogą być użyte, najczęściej radioizotopy, szczególnie 32P. Jednakże, mogą również być użyte inne techniki, tak jak zastosowanie zmodyfikowanych biotyną nukleotydów dla wprowadzenia do polinukleotydu. Następnie biotyna służy jako miejsce dla wiązania awidyny lub przeciwciał, które mogą być wyznakowane bardzo różnymi znacznikami takimi jak radionuklidy, fluoresceiny, enzymy i tym podobne. Alternatywnie, dla wykrycia białka można zastosować oznaczenia lub żele.
Procedury dla obserwowania, czy produkt genu ulegającego ekspresji lub nadekspesji jest wydzielony są łatwo dostępne dla biegłego praktyka. Gdy pożywka hodowlana jest oddzielona od komórek gospodarza, przykładowo przez wirowanie lub filtrowanie, produkt genu może być następnie wykryty w pożywce wolnej od komórek dzięki znanym właściwościom charakterystycznym dla produktu genu. Takie właściwości mogą obejmować wyróżnialne właściwości immunologiczne, enzymatyczne lub fizyczne produktu genu.
Przykładowo, jeśli produkt genu ulegającego nadekspresji ma unikalną aktywność enzymatyczną przeprowadzone może być oznaczenie tej aktywności na pożywce hodowlanej wykorzystywanej przez komórki gospodarza. Ponadto, gdy dostępne są przeciwciała reaktywne wobec danego produktu genu, przeciwciała takie mogą być użyte dla wykrycia produktu genu, przy pomocy jakiegokolwiek znanego oznaczenia immunologicznego (np. jak w Harlowe i wsp., Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nowy Jork, 1988).
Wydzielony produkt genu może również być wykryty przy pomocy testów wyróżniających polipeptydy na podstawie charakterystycznych właściwości fizycznych, takich jak masa cząsteczkowa. Aby wykryć właściwości fizyczne produktu genu, wszystkie nowo zsyntetyzowane przez komórkę gospodarza polipeptydy mogą być wyznakowane, np. radioizotopem. Powszechnie stosowany radioizotop, który może być użyty dla wyznakowania polipeptydów zsyntetyzowanych w komórce gospodarza obejmuje tryt (3H), węgiel-14 (14C), siarkę-35 (35S) i tym podobne. Przykładowo, komórka gospodarza może być hodowana na podłożu z 35S-metioniną lub 35S-cysteiną i znaczące ilości znacznika 35S będą preferencyjnie wbudowane do nowo syntetyzowanych polipeptydów, obejmując ulegające nadekspresji heterologiczne polipeptydy. Następnie usunięta jest pożywka hodowlana zawierająca 35S i komórki są płukane i umieszczane w świeżej nie radioaktywnej pożywce hodowlanej. Po przetrzymaniu komórek w świeżej pożywce, przez czas i w warunkach wystarczających dla umożliwienia wydzielania wyznakowanych 35S, wyrażonych heterologicznych polipeptydów, pożywka hodowlana jest zebrana i oddzielona od komórek gospodarza. Następnie może być oznaczona masa cząsteczkowa wydzielonych, wyznakowanych polipeptydów w pożywce hodowlanej, przy pomocy znanych sposobów jak np. elektroforeza w żelu poliakrylamidowym. Takie procedury i/lub inne procedury dla wykrycia wydzielonych produktów genu są dostarczone w Goeddel, D.V. (wyd.) 1990, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, tom 185 (Academic Press) oraz Sambrook i wsp., jak wyżej.
E. Odzyskiwanie/oczyszczanie
Po wytworzeniu, polipeptyd może być odzyskany z komórek w jakikolwiek odpowiedni sposób zależny, przykładowo od tego, z jakiej części komórki jest odzyskiwany. Polipeptyd może być odzyskany z cytoplazmy, peryplazmy lub pożywki hodowlanej. Polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania jest korzystnie odzyskiwany z pożywki hodowlanej jako wydzielony polipeptyd. Polipeptyd ten odczyszcza się od zrekombinowanych białek komórkowych lub polipeptydów dla uzyskania preparatów, które są zasadniczo homogenne, np. pod względem polipeptydu będącego przedmiotem zaintePL 206 286 B1 resowania. Jako pierwszy etap, pożywka hodowlana lub lizat jest odwirowywany dla usunięcia fragmentów komórki. Błony i rozpuszczalne frakcje białkowe mogą być następnie rozdzielone, jeśli to konieczne. Polipeptyd może być następnie oczyszczony z rozpuszczalnej frakcji białkowej i z frakcji błonowej lizatu komórkowego, zależnie od tego czy polipeptyd jest związany z błoną, jest rozpuszczalny lub występuje w postaci zagregowanej. Następnie polipeptyd jest rozpuszczany i poddawany refałdowaniu, jeśli to niezbędne, i jest oczyszczany od zanieczyszczających rozpuszczalnych białek i polipeptydów. Jakikolwiek typowy etap usuwania zanieczyszczeń przeciętego polipeptydu z mieszaniny jest wyeliminowany ze schematu oczyszczania, ponieważ aminopeptydaza nie jest już dłużej obecna. W korzystnej postaci, zagregowany polipeptyd jest izolowany, po czym następuje etap rozpuszczania i refałdowania jak to opisano w patencie US nr 5,288,931.
W szczególnie korzystnym wykonaniu odzyskiwanie następuje z peryplazmy przez rozbicie komórek (przy pomocy technik jakie podano powyżej) dla utworzenia lizatu, a następnie przez oczyszczenie nienaruszonego, nieprzeciętego polipeptydu z lizatu. Korzystnie, lizat jest inkubowany przed oczyszczaniem. Korzystniej, lizat jest inkubowany przez przynajmniej 1 godziny, w około 20-25°C, jeszcze korzystniej przez około 2-50 godzin w temperaturze pokojowej, jeszcze korzystniej przez około 5-45 godzin w temperaturze pokojowej i najkorzystniej przez około 20-30 godzin w temperaturze pokojowej.
Następujące procedury są przykładowo odpowiednimi procedurami oczyszczania: frakcjonowanie na kolumnach powinowactwa immunologicznego lub jonowymiennej; wytrącenie etanolem; HPLC z odwróconymi fazami; chromatografia na żywicy krzemionkowej lub kationowymiennej, takiej jak DEAE; chromatoogniskowanie; SDS-PAGE; wytrącanie siarczanem amonu i sączenie molekularne przy pomocy, przykładowo, kolumn SEPHADEX G-75™.
II. Wytwarzanie i odzyskiwanie przeciętego polipeptydu
W tym, alternatywnym procesie, doprowadza się do kontaktowania polipeptydu bezpośrednio z polipeptydem aminopeptydazy b2324 tak, że jest przycięty. Może być to osiągnięte szeregiem sposobów obejmujących inkubację w około 20-40°C, korzystnie w około 30-40°C przez czas w zakresie do około 50 godzin, korzystnie przynajmniej około 1 godzinę do 45 godzin. W korzystnym aspekcie tego sposobu doprowadzanie do kontaktu, wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania przeciętego polipeptydu, obejmującego hodowanie komórek bakterii niosących gen yfcK i zawierających kwas nukleinowy kodujący odpowiedni nieprzecięty polipeptyd posiadający dodane aminokwasy na swoim N-końcu. Hodowanie jest w warunkach takich, że ekspresji lub nadekspresji ulega gen yfcK i ekspresji ulega kwas nukleinowy kodujący nie przecięty polipeptyd i jeśli nieprzecięty polipeptyd i białko aminopeptydazy B2324 nie mają kontaktu po ekspresji, doprowadzenie do kontaktu nieprzeciętego polipeptydu z białkiem aminopeptydazy b2324 dla wytworzenia przeciętego polipeptydu. Korzystnie, doprowadzenie do kontaktu jest poprzez inkubowanie w warunkach podanych powyżej, a hodowanie ma miejsce w fermentorze.
W korzystnym aspekcie polipeptyd jest heterologiczny dla komórek, korzystniej jest polipeptydem eukariotycznym a jeszcze korzystniej polipeptydem ssaczym, szczególnie ludzkim. Korzystną komórką jest komórka Salmonella lub Enterobacteriaceae, jeszcze korzystniej komórka E. coli, a szczególnie W3110. Również preferowana jest komórka z brakiem przynajmniej jednego genu kodującego proteazę, taka jak degP lub fhuA lub obie.
W korzystnym aspekcie warunki hodowli są takie, że gen yfcK ulega nadekspresji. Gen yfcK może być naturalnym dla komórek bakterii lub do nich wprowadzonym, np. przez transformację wektorem niosącym taki gen.
W kolejnym, korzystnym aspekcie nieprzecięty polipeptyd jest odzyskiwany z komórek przed doprowadzeniem do kontaktu z białkiem aminopeptydazy b2324 i nieprzecięty polipeptyd jest odzyskiwany z peryplazmy lub pożywki z hodowli komórkowej. W jednym z wykonań, odzyskanie odbywa się poprzez rozbicie komórek (jak opisano powyżej) do postaci lizatu, dodawana jest aminopeptydaza i następnie przecięty polipeptyd jest oczyszczony z lizatu. Korzystnie, w tym przypadku lizat jest inkubowany z aminopeptydazą przed etapem oczyszczania. Korzystniej, lizat jest inkubowany przez przynajmniej około 1 godzinę w około 20-40°C, jeszcze korzystniej przez około 2-50 godzin w około 30-40°C, jeszcze korzystniej przez około 5-45 godzin w około 30-40°C i najkorzystniej przez około 20-30 godzin w około 35-38°C przed etapem oczyszczenia.
Gdy przecięte polipeptydy są przygotowane przez rekombinowanie, rodzicielskie szczepy, warunki hodowli, wykrycie ekspresji, odzyskanie/oczyszczanie i podstawowe techniki są jak ogólnie podano powyżej. Jednakże, dla nadekspresji w szczepie, który będzie hodowany, typowo gen yfcK, zarówno
PL 206 286 B1 endogenny (w chromosomie) jak i egzogenny dla komórki gospodarza jest połączony funkcjonalnie z indukowanym promotorem tak, ż e gen moż e ulec nadekspresji, gdy promotor jest zaindukowany. Hodowanie korzystnie ma miejsce w warunkach, w których ekspresja genu yfcK jest zaindukowana przed indukcją ekspresji kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd. Odpowiednie techniki dla nadekspresji użytecznych tu genów obejmują te, opisane przez Joly i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2773-2777 (1998); patent US nr 5,789,199 i 6,639,635; Knappik i wsp., Bio/Technology, 11(1):77-83 (1993) i Wulfing i Pluckthun, Journal of Molecular Biology, 242 (5) : 655-69 (1994).
Wynalazek został zilustrowany poniższymi przykładami.
P r z y k ł a d 1
Materiały i metody
Sekwencje DNA namnażano poprzez rekcję PCR powyżej i poniżej genu yfcK kodującego b2324, zidentyfikowanego przez projekt sekwencjonowania genomu (zestawienie według GenBank Blattner i wsp., jak wyżej). Następnie te połączone sekwencje) wrekombinowano do chromosomu szczepu W3110 przez transdukcję P1 i przeszukanie przy pomocy PCR pod kątem delecji (Metcalf i wsp., Gene, 138 : 1-7 (1994)) dla wytworzenia szczepu 61G3 o genotypie W3110ΔfhuA A(arg-F-lac)169 phoAAE15 deoC2 degP::kanR ilvG2096 AyfcK.
Dokładniej, szczep ten skonstruowano w szeregu etapach, przy pomocy technik obejmujących transdukcję fagiem P1kc, pochodzącym od P1 (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) i genetyki transpozonowej (Kleckner i wsp., J. Mol. Biol., 116:125-159 (1977)). Wyjściowo użytym gospodarzem była E. coli K-12 W3110, która jest szczepem K-12, który jest Flambda- (Bachmann, Bact. Rev., 36:525-557 (1972); Bachmann, „Derivations and Genotypes of Some Mutants Derivatives of Escherichia coli K-12” str. 1190-1219 w F.C. Neidhardt i wsp., wyd. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, torn 2, American Society for Microbiology, Waszyngton D.C., 1987). Wprowadzenie mutacji tonA (fhuA) do genomu opisano szczegółowo w patencie US nr 5,304,472 nadanym 19 kwietnia 1994. Insercja Tn10 w gen ilv została wprowadzona przez transdukcję P1. Auksotrof izoleucyna/walina został transdukowany do prototrofa przy pomocy faga P1 rosnącego na szczepie niosącym mutację ilvG2096R (Lawther i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:922-925 (1981)) co naprawiło mutację typu zmiany ramki odczytu, która powodowała, że szczep E. coli K-12 typu dzikiego był wrażliwy na walinę. Mutacja degP41 kanr jest opisana w patencie US nr 5,304,472. Locus ilvG2096R może być potwierdzony przez odporność gospodarza 33B6 na walinę w stężeniu 40 μg/ml (0,3 ) mM). Dwie mutacje delecyjne phoAAE15 i A(argF-lac)169 są opisane w patencie US nr 5,304,472. Mutacja deoC2 jest opisana w Mark i wsp., Mol. Gen. Genet., 155:145-152 (1977). Całkowite wyprowadzenie szczepu 61G3 przedstawiono na fig. 1.
Szczep ten następnie stransformowano plazmidem ekspresyjnym oznaczonym hGH4R, który wyraża i wydziela hGH (z N-końcową fenyloalaniną), zarówno w wytrząsanej kolbie jak i 10-1 fermentacjach. Konstrukcja phGH4R jest podana szczegółowo w Chang i wsp., Gene, 55:189-196 (1987). Ta transformacja doprowadziła do powstania szczepu JJGH1. Komórki hodowano jak opisano w Andersen i wsp., Biotechnology and Bioengineering, 75(2), 212-218 (2001). Nieoczyszczony lizat przygotowano przez rozbijanie ultradźwiękami komórek po wytworzeniu hGH i lizat inkubowano w 37°C przez 0 do 24 godzin w 37°C i w temperaturze pokojowej przez 0 do 42 godzin. Użycie wyższej temperatury poprawiło zdolność wykrycia des-phe i des-phe-pro hGH przy zastosowaniu sposobu oznaczenia, lecz nie było korzystne dla oczyszczania hGH. Normalnie, oczyszczanie hGH jest przeprowadzone w chłodzie dla zmniejszenia ilości przyciętych postaci.
To samo doświadczenie przeprowadzono przy pomocy szczepu rodzicielskiego jako kontroli (16C9 o genotypie W3110 AfhuA A(argF-lac)169 phoAAE15 deoC2) stransformowanego phGH4R. Szczep ten jest użyteczny dla tych celów bowiem mutacje degP i ilvG w szczepie 60G3 nie mają wpływu na aktywność aminopeptydazy.
Kontrola i próbki doświadczalne były następnie odwirowane dla usunięcia cząstek i rozpuszczone fazy zbadano przez LC-MS (chromatografia cieczowa, analiza przez spektrometrię mas). Śledzono masy dla niezmienionej postaci des-phe i des-phe-pro hGH.
Wyniki
Figury 2 i 4 pokazują, odpowiednio wyniki dla inkubacji w temperaturze pokojowej i 37°C dla szczepu kontrolnego (16C9/phGH4R) a fig. 3 i 5 pokazują, odpowiednio wyniki dla inkubacji w temperaturze pokojowej i 37°C dla JJGH1, który posiada nokaut aminopeptydazy. Aktualną numerację dla czterech figur przedstawiono poniżej w tabeli 1 (poniżej Temp=37°C i Temp=RT). Można dostrzec, że
PL 206 286 B1 zasadniczo nie ma zanieczyszczeń z przyciętą fenyloalaniną po 15 godzinach inkubacji w 37°C i nawet bez inkubacji następuje obniżenie ilości zanieczyszczeń. Można również dostrzec, że nawet w przypadku inkubacji w temperaturze pokojowej ilość zmutowanego polipeptydu pozbawionego N-końcowej fenyloalaniny jest zmniejszona w linii komórek JJGH1 w porównaniu z kontrolą we wszystkich czasach inkubacji. Oczyszczenie niezmienionego polipeptydu można łatwo przeprowadzić tradycyjnie lub znanymi sposobami chromatograficznymi.
T a b e l a 1
Temp = 37°C | |||||||
Powierzchnia | Powierzchnia % | ||||||
Próbka | Czas | des-phe | Natywne | des-phe-pro | des-phe | Natywne | des-phe-pro |
Kontrola | 0 | 16159.80 | 4486460.00 | 19642.70 | 0.36 | 99.21 | 0.43 |
JJGHl | 0 | 11927.90 | 3376380.00 | 7637.14 | 0.35 | 99.42 | 0.22 |
Kontrola | 15 | 14372.30 | 1097210.00 | 976760.00 | 46.77 | 52.53 | 0.69 |
JJGHl | 15 | 27163.70 | 2674010.00 | 16357.80 | 1.00 | 98.40 | 0.60 |
Kontrola | 24 | 1058950.00 | 839418.00 | 17580.50 | 55.27 | 43.81 | 0.92 |
JJGH1 | 24 | 29409.90 | 2306690.00 | 11999.30 | 1.25 | 98.23 | 0.51 |
Temp = RT | |||||||
Powierzchnia | Powierzchnia % | ||||||
Próbka | Czas | des-phe | Natywne | des-phe-pro | des-phe | Natywne | des-phe-pro |
Kontrola | 0 | 16159.80 | 4486460.00 | 19642.70 | 0.36 | 99.21 | 0.43 |
JJGHl | 0 | 11927.90 | 3376380.00 | 7637.14 | 0.35 | 99.42 | 0.22 |
Kontrola | 15 | 46158.20 | 364234.00 | 7950.57 | 1.24 | 98.53 | 0.21 |
JJGHl | 15 | 183740.00 | 19431400.00 | 39130.00 | 0.94 | 99.06 | 0.20 |
Kontrola | 24 | 100774.00 | 4561070.00 | 19501.10 | 2.15 | 97.43 | 0.42 |
JJGHl | 24 | 160737.00 | 19711600.00 | 98221.60 | 0.80 | 98.70 | 0.49 |
Kontrola | 42 | 122177.00 | 3933770.00 | 19246.40 | 3.00 | 96.53 | 0.47 |
JJGHl | 42 | 213143.00 | 18242500.00 | 91090.90 | 1.15 | 98.36 | 0.49 |
Wyniki pokazują, że szczep ΔyfcK może być użyty dla zapobiegania N-końcowemu cięciu polipeptydów.
Claims (34)
- Zastrzeżenia patentowe1. Komórka Gram-ujemnej bakterii, w której chromosomalny gen jest inaktywowany lub uszkodzony, przy czym gen ten ma co najmniej 80% identyczności sekwencji z (a) cząsteczką DNA kodującą naturalną sekwencję aminopeptydazy b2324 o sekwencji aminokwasowej od 1 do 688 z SEQ ID NO:2 lub (b) komplement cząsteczki DNA z (a) i kodujący aminopeptydazę.
- 2. Komórka Gram-ujemnej bakterii, w której chromosomalny gen jest inaktywowany lub uszkodzony, przy czym gen ten ma co najmniej 80% identyczności z sekwencją naturalną genu yfcK posiadającego sekwencję nukleotydową od 1 do 2067 z SEQ ID NO:1 i kodujący aminopeptydazę.
- 3. Komórka według zastrz. 1 lub 2, którą jest Salmonella lub Enterobacteriaceae.
- 4. Komórka według zastrz. 3, którą jest E. coli.
- 5. Komórka według zastrz. 4, z niedoborem co najmniej jednego genu kodującego proteazę.
- 6. Komórka według zastrz. 4, z niedoborem naturalnej sekwencji genu yfcK.
- 7. Komórka według zastrz. od 1 do 6, zawierająca kwas nukleinowy kodujący polipeptyd heterologiczny dla komórki.PL 206 286 B1
- 8. Komórka wed ług zastrz. 7, znamienna tym, ż e polipeptyd jest polipeptydem ssaczym.
- 9. Komórka wed ług zastrz. 8, znamienna tym, ż e polipeptyd jest polipeptydem ludzkim.
- 10. Komórka według zastrz. 9, znamienna tym, że polipeptyd jest ludzkim hormonem wzrostu.
- 11. Sposób wytwarzania heterologicznego peptydu obejmujący (a) hodowanie komórki zdefiniowanej w zastrz. 7-10 i (b) odzyskiwanie polipeptydu z komórki.
- 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w fermentorze a polipeptyd jest odzyskiwany z peryplazmy lub pożywki hodowlanej komórki.
- 13. Sposób według zastrz. 11 lub 12, znamienny tym, że odzyskiwanie prowadzi się przez rozbicie komórek do postaci lizatu i niezmieniony polipeptyd oczyszcza się z lizatu.
- 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że lizat inkubuje się przed etapem oczyszczenia.
- 15. Sposób zapobiegania N-końcowemu odcinaniu aminokwasu od polipeptydu, znamienny tym, że hoduje się komórkę zdefiniowaną w zastrz. od 1 do 10, przy czym komórka zawiera kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, w warunkach takich, że kwas nukleinowy ulega ekspresji.
- 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że polipeptyd odzyskuje się z komórki.
- 17. Sposób odcinania N-końcowego aminokwasu od peptydu wyizolowanego z komórki, znamienny tym, że kontaktuje się polipeptyd z aminopeptydazą kodowaną przez kwas nukleinowy o co najmniej 80% identyczności sekwencji z (a) cząsteczką DNA kodującą naturalną sekwencję aminopeptydazy b2324 o sekwencji reszt aminokwasowych od 1 do 688 z SEQ ID NO:2 lub (b) komplementu cząsteczki DNA z (a).
- 18. Sposób odcinania N-końcowego aminokwasu z polipeptydu wyizolowanego z komórki, znamienny tym, że kontaktuje się polipeptyd z aminopeptydazą o mniej niż 80% identyczności sekwencji z naturalną sekwencję aminopeptydazy b2324 o sekwencji aminokwasowej od 1 do 688 z SEQ ID NO:2.
- 19. Sposób według zastrz. 17 lub 18, znamienny tym, że polipeptyd jest inkubowany z aminopeptydazą.
- 20. Sposób według zastrz. od 17 do 19, znamienny tym, że polipeptyd jest kontaktowany z naturalną sekwencją aminopeptydazy b2324.
- 21. Sposób wytwarzania skróconego polipeptydu, znamienny tym, że hoduje się komórki bakterii Gram-ujemnych niosących kwas nukleinowy o przynajmniej 80% identyczności sekwencji z (a) cząsteczką DNA kodującą naturalną sekwencję aminopeptydazy b2324 o sekwencji aminokwasowej od 1 do 688 z SEQ ID NO: 2 lub (b) komplement cząsteczki DNA z (a) i kodujący aminopeptydazę, które to komórki zawierają kwas nukleinowy kodujący odpowiadający nie skrócony polipeptyd posiadający dodany na jego N-końcu aminokwas, przy czym hodowlę prowadzi się w warunkach takich, aby kwas nukleinowy kodujący aminopeptydazę b2324 uległ nadekspresji, aby zaszła ekspresja kwasu nukleinowego kodującego nie skrócony polipeptyd i jeśli nie skrócony polipeptyd i aminopeptydaza nie kontaktują się po ekspresji, to kontaktuje się ten nie skrócony polipeptyd z aminopeptydazą wytwarzając skrócony polipeptyd.
- 22. Sposób wytwarzania skróconego polipeptydu, znamienny tym, że hoduje się komórki bakterii Gram-ujemnych niosących kwas nukleinowy o co najmniej 80% identyczności z naturalną sekwencją genu yfck posiadającego sekwencje nukleotydów od 1 do 2067 w SEQ ID NO:1 i kodującego aminopeptydazę, które to komórki zawierają kwas nukleinowy kodujący odpowiadający nie skrócony polipeptyd posiadający dodany na jego N-końcu aminokwas, przy czym hodowlę prowadzi się w warunkach takich, aby zaszła nadekspresja kwasu nukleinowego kodującego aminopeptydazę b2324 i aby zaszł a ekspresja kwasu nukleinowego kodują cego nie skrócony polipeptyd i jeś li ten nie skrócony polipeptyd i aminopeptydaza nie kontaktują się po ekspresji, kontaktuje się ten nie skrócony polipeptyd z aminopeptydazą wytwarzając skrócony polipeptyd.
- 23. Sposób według zastrz. 21 lub 22, znamienny tym, że hoduje się komórki E. coli niosące naturalną sekwencję genu yfcK i nie skrócony polipeptyd następnie kontaktuje się z naturalną sekwencją aminopeptydazy b2324.
- 24. Sposób według zastrz. 21 do 23, znamienny tym, że polipeptyd jest heterologiczny dla komórek.
- 25. Sposób według zastrz. 21 do 23, znamienny tym, że polipeptyd jest polipeptydem ssaczym.
- 26. Sposób według zastrz. 21 lub 22, znamienny tym, że komórki są z niedoborem co najmniej jednego genu kodującego proteazę.
- 27. Sposób według zastrz. 21 lub 22, znamienny tym, że kontaktowanie prowadzi się przez inkubację.PL 206 286 B1
- 28. Sposób według zastrz. 21 lub 22, znamienny tym, że kwas nukleinowy kodujący aminopeptydazę jest naturalnym dla komórek bakterii.
- 29. Sposób według zastrz. 21 lub 22, znamienny tym, że kwas nukleinowy kodujący aminopeptydazę jest wprowadzony do komórek bakterii.
- 30. Sposób według zastrz. 21 lub 22, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w fermentorze i nie skrócony polipeptyd odzyskuje się z komórek przed kontaktowaniem z aminopeptydazą .
- 31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że polipeptyd odzyskuje się z periplazmy lub pożywki hodowlanej komórki.
- 32. Sposób według zastrz. 30 lub 31, znamienny tym, że odzyskiwanie prowadzi się przez rozbicie komórki do postaci lizatu i skrócony peptyd jest oczyszczany z lizatu.
- 33. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że lizat inkubuje się przed etapem oczyszczenia.
- 34. Sposób według zastrz. 32 do 33, znamienny tym, że lizat inkubuje się przez co najmniej1 godz. w 20-40°C.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US32235001P | 2001-09-13 | 2001-09-13 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL368463A1 PL368463A1 (pl) | 2005-04-04 |
PL206286B1 true PL206286B1 (pl) | 2010-07-30 |
Family
ID=23254494
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL368463A PL206286B1 (pl) | 2001-09-13 | 2002-09-12 | Komórka Gram-ujemnej bakterii, sposób wytwarzania heterologicznego peptydu, sposób zapobiegania odcinaniu N-końcowego aminokwasu, sposób odcinania N-końcowego aminokwasu i sposób wytwarzania skróconego polipeptydu |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6921659B2 (pl) |
EP (1) | EP1432793B1 (pl) |
JP (2) | JP4831932B2 (pl) |
KR (2) | KR100956907B1 (pl) |
CN (1) | CN100552023C (pl) |
AT (1) | ATE440134T1 (pl) |
AU (1) | AU2002326884B2 (pl) |
BR (1) | BR0212886A (pl) |
CA (1) | CA2460309C (pl) |
CY (1) | CY1109903T1 (pl) |
DE (1) | DE60233417D1 (pl) |
DK (1) | DK1432793T3 (pl) |
ES (1) | ES2329880T3 (pl) |
HK (1) | HK1062695A1 (pl) |
HU (3) | HU225346B1 (pl) |
IL (2) | IL160658A0 (pl) |
MX (1) | MXPA04002326A (pl) |
NZ (2) | NZ531516A (pl) |
PL (1) | PL206286B1 (pl) |
PT (1) | PT1432793E (pl) |
WO (1) | WO2003023030A2 (pl) |
ZA (1) | ZA200401752B (pl) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK1432793T3 (da) | 2001-09-13 | 2009-12-07 | Genentech Inc | Aminopeptidase b2324 |
JP5014116B2 (ja) | 2004-03-11 | 2012-08-29 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | ポリペプチドの精製 |
EP2376619A4 (en) | 2008-12-15 | 2012-07-04 | Greenlight Biosciences Inc | METHODS FOR CONTROLLING FLOWS IN METABOLIC PATHWAYS |
EP2379728A4 (en) * | 2008-12-22 | 2016-04-13 | Greenlight Biosciences Inc | COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING A COMPOUND |
DK2566953T3 (en) | 2010-05-07 | 2019-04-15 | Greenlight Biosciences Inc | METHODS OF MANAGING THE POWER BY METABOLIC ROADS USING ENZYMOUS LOCATION |
CA2809284C (en) | 2010-08-31 | 2021-02-23 | Greenlight Biosciences, Inc. | Methods for control of flux in metabolic pathways through protease manipulation |
EP2753702B1 (en) | 2011-09-09 | 2021-12-15 | GreenLight Biosciences, Inc. | Cell-free preparation of carbapenems |
CN105658807A (zh) | 2013-08-05 | 2016-06-08 | 绿光生物科技股份有限公司 | 具有蛋白酶切割位点的工程化蛋白 |
US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
WO2016160936A1 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free production of ribonucleic acid |
CA3020312A1 (en) | 2016-04-06 | 2017-10-12 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free production of ribonucleic acid |
US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
CN106967658B (zh) * | 2017-02-23 | 2020-09-15 | 郑州大学 | 一种提高Fab抗体表达量的方法 |
WO2019075167A1 (en) | 2017-10-11 | 2019-04-18 | Greenlight Biosciences, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF NUCLEOSIDE TRIPHOSPHATE AND RIBONUCLEIC ACID |
US11471497B1 (en) | 2019-03-13 | 2022-10-18 | David Gordon Bermudes | Copper chelation therapeutics |
US10973908B1 (en) | 2020-05-14 | 2021-04-13 | David Gordon Bermudes | Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE251217T1 (de) * | 1984-08-16 | 2003-10-15 | Savient Pharmaceuticals Inc | Methode zur herstellung von menschlichen wachstumshormonen |
WO1986007380A1 (en) * | 1985-06-04 | 1986-12-18 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Process for preparing polypeptide |
US4865974A (en) * | 1985-09-20 | 1989-09-12 | Cetus Corporation | Bacterial methionine N-terminal peptidase |
US4946783A (en) | 1987-01-30 | 1990-08-07 | President And Fellows Of Harvard College | Periplasmic protease mutants of Escherichia coli |
WO1988005821A1 (en) | 1987-01-30 | 1988-08-11 | President And Fellows Of Harvard College | Periplasmic protease mutants of escherichia coli |
JPH01181796A (ja) * | 1988-01-14 | 1989-07-19 | Ajinomoto Co Inc | 組換えdna法を用いたポリペプチドの製造法 |
JP2844870B2 (ja) * | 1989-07-21 | 1999-01-13 | 味の素株式会社 | 組み替えdna法によるポリペプチドの製造法 |
US5508192A (en) | 1990-11-09 | 1996-04-16 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides |
US5304472A (en) | 1992-11-20 | 1994-04-19 | Genentech, Inc. | Method of controlling polypeptide production in bacterial cells |
US5573923A (en) * | 1993-12-22 | 1996-11-12 | Eli Lilly And Company | Method for removing N-terminal dipeptides from precursor polypeptides with immobilized dipeptidylaminopeptidase from dictyostelium discoideum |
US6127144A (en) * | 1993-12-23 | 2000-10-03 | Cangene Corporation | Method for expression of proteins in bacterial host cells |
US5639635A (en) | 1994-11-03 | 1997-06-17 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
US5789199A (en) | 1994-11-03 | 1998-08-04 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
KR100369839B1 (ko) | 1997-02-28 | 2003-06-12 | 주식회사 엘지생명과학 | 바실러스리케니포미스균주에서유래한아미노펩티다제,그의제조방법및이를이용한천연형단백질의제조방법 |
CN1329665A (zh) * | 1998-12-07 | 2002-01-02 | 诺维信公司 | 具有n末端延伸的葡糖淀粉酶 |
EP1173572B1 (en) * | 1999-04-30 | 2007-01-24 | Pharmacia Corporation | Method of removing n-terminal alanine residues from polypeptides with aeromonas aminopeptidase |
KR100400638B1 (ko) | 2000-12-06 | 2003-10-08 | 주식회사 엘지생명과학 | 재조합 인간 성장호르몬 유사체의 분리방법 |
DK1432793T3 (da) | 2001-09-13 | 2009-12-07 | Genentech Inc | Aminopeptidase b2324 |
-
2002
- 2002-09-12 DK DK02761635T patent/DK1432793T3/da active
- 2002-09-12 BR BR0212886-1A patent/BR0212886A/pt not_active Application Discontinuation
- 2002-09-12 JP JP2003527095A patent/JP4831932B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-12 KR KR1020087030860A patent/KR100956907B1/ko active IP Right Grant
- 2002-09-12 AT AT02761635T patent/ATE440134T1/de active
- 2002-09-12 PL PL368463A patent/PL206286B1/pl unknown
- 2002-09-12 PT PT02761635T patent/PT1432793E/pt unknown
- 2002-09-12 US US10/243,789 patent/US6921659B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-12 IL IL16065802A patent/IL160658A0/xx unknown
- 2002-09-12 CN CNB028179846A patent/CN100552023C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-12 AU AU2002326884A patent/AU2002326884B2/en not_active Expired
- 2002-09-12 NZ NZ531516A patent/NZ531516A/xx not_active IP Right Cessation
- 2002-09-12 HU HU0600310A patent/HU225346B1/hu unknown
- 2002-09-12 WO PCT/US2002/029015 patent/WO2003023030A2/en active Application Filing
- 2002-09-12 EP EP02761635A patent/EP1432793B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-12 HU HU0600309A patent/HU225430B1/hu unknown
- 2002-09-12 KR KR1020047003708A patent/KR100954641B1/ko active IP Right Grant
- 2002-09-12 HU HU0401869A patent/HU225243B1/hu unknown
- 2002-09-12 MX MXPA04002326A patent/MXPA04002326A/es active IP Right Grant
- 2002-09-12 ES ES02761635T patent/ES2329880T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-12 CA CA2460309A patent/CA2460309C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-12 NZ NZ544964A patent/NZ544964A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-09-12 DE DE60233417T patent/DE60233417D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-03-01 IL IL160658A patent/IL160658A/en unknown
- 2004-03-03 ZA ZA2004/01752A patent/ZA200401752B/en unknown
- 2004-07-15 HK HK04105179.8A patent/HK1062695A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-05-16 US US11/131,035 patent/US7229787B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-04-27 US US11/741,510 patent/US7632658B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-10-26 CY CY20091101111T patent/CY1109903T1/el unknown
-
2011
- 2011-04-20 JP JP2011094093A patent/JP5372061B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7632658B2 (en) | Method of using aminopeptidase to produce cleaved polypeptides | |
EP0786009B1 (en) | Process for bacterial production of heterologous polypeptides with disulphide bonds | |
US5789199A (en) | Process for bacterial production of polypeptides | |
JP4056880B2 (ja) | 細菌性宿主株 | |
AU2002326884A1 (en) | Aminopeptidase | |
Henderson et al. | Artifactual processing of penicillin-binding proteins 7 and 1b by the OmpT protease of Escherichia coli | |
Beckwith et al. | Genetic studies on protein export in bacteria | |
WO2000024769A2 (en) | Process for recovering heterologous polypeptide from bacterial refractile particles |