JP2844870B2 - 組み替えｄｎａ法によるポリペプチドの製造法 - Google Patents
組み替えｄｎａ法によるポリペプチドの製造法Info
- Publication number
- JP2844870B2 JP2844870B2 JP19216290A JP19216290A JP2844870B2 JP 2844870 B2 JP2844870 B2 JP 2844870B2 JP 19216290 A JP19216290 A JP 19216290A JP 19216290 A JP19216290 A JP 19216290A JP 2844870 B2 JP2844870 B2 JP 2844870B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- gene
- producing
- aminopeptidase
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組み替えDNA法により形質転換された微生
物を培養して目的とするポリペプチドを製造する方法に
おいて、そのＮ末端の不均一さを是正し、より均一なＮ
末端を有するポリペプチドの製造法に関する。
物を培養して目的とするポリペプチドを製造する方法に
おいて、そのＮ末端の不均一さを是正し、より均一なＮ
末端を有するポリペプチドの製造法に関する。
均一なＮ末端を有するポリペプチドを取得できる技術
の確立により、例えば、目的ポリペプチドの医療への応
用においては、抗原性での問題点等の克服に利用できう
ると考えられる。
の確立により、例えば、目的ポリペプチドの医療への応
用においては、抗原性での問題点等の克服に利用できう
ると考えられる。
組み替えDNA技術を用いて大腸菌により真核生物由来
等の目的ポリペプチドをコードする遺伝子を単純に、現
在広く用いられている遺伝子発現系により高発現させた
時、多くの場合において、そのＮ末端には翻訳開始コド
ンに由来するメチオニン残基が付加していたり、あるい
はメチオニン残基が付加した物と無いもの、さらに目的
ポリペプチド内の数アミノ酸までが削除された物といっ
た混合物であることがある。
等の目的ポリペプチドをコードする遺伝子を単純に、現
在広く用いられている遺伝子発現系により高発現させた
時、多くの場合において、そのＮ末端には翻訳開始コド
ンに由来するメチオニン残基が付加していたり、あるい
はメチオニン残基が付加した物と無いもの、さらに目的
ポリペプチド内の数アミノ酸までが削除された物といっ
た混合物であることがある。
このようなＮ末端の不均一なポリペプチドは、その安
定性、生理機能に変化を与える可能性があることはもち
ろん、医薬品への応用を目指した場合には生体中での抗
原性の出現といった不適当な作用を及ぼすことも十分考
えられうる。
定性、生理機能に変化を与える可能性があることはもち
ろん、医薬品への応用を目指した場合には生体中での抗
原性の出現といった不適当な作用を及ぼすことも十分考
えられうる。
そこで、従来は、目的ポリペプチドのＮ末端を揃える
ために、精製し取り出した目的ポリペプチド前躯体に、
別に精製を加えた各種の大腸菌のアミノペプチダーゼ
を、試験管内で作用させており、そのような過程を経
て、Ｎ末端を均一化させていた。
ために、精製し取り出した目的ポリペプチド前躯体に、
別に精製を加えた各種の大腸菌のアミノペプチダーゼ
を、試験管内で作用させており、そのような過程を経
て、Ｎ末端を均一化させていた。
最近、A.Ben−bassatら（J.Bacteriology,169,751〜7
57,1987）は、大腸菌のメチオニンアミノペプチダーゼ
（MAP）をクローニングし、大腸菌でインターロイキン
２やリシンＡを発現生産するときに、それらのＮ末端メ
チオニンを削除する目的で用いている。
57,1987）は、大腸菌のメチオニンアミノペプチダーゼ
（MAP）をクローニングし、大腸菌でインターロイキン
２やリシンＡを発現生産するときに、それらのＮ末端メ
チオニンを削除する目的で用いている。
しかしながら、精製した目的ポリペプチドの中に精製
したとはいえ大腸菌のアミノペプチダーゼを加えること
は、目的ポリペプチド画分の不純物を増大させる結果と
なる。一方、アミノペプチダーゼ自身もその生産菌の培
養や酵素の精製と、コスト、時間がかかり、経済性の点
からも、この方法は、改善されるべきものと考えられ
る。
したとはいえ大腸菌のアミノペプチダーゼを加えること
は、目的ポリペプチド画分の不純物を増大させる結果と
なる。一方、アミノペプチダーゼ自身もその生産菌の培
養や酵素の精製と、コスト、時間がかかり、経済性の点
からも、この方法は、改善されるべきものと考えられ
る。
また、メチオニンアミノペプチダーゼを用いてＮ末端
メチオニンを削除する方法は、in vivoでの作用の結
果、インターロイキン２ではその60％のものがＮ末端か
ら２番目のアラニン残基までが切除されており、生産菌
体内での産生ポリペプチドのＮ末端制御はまだ確立され
ていない。
メチオニンを削除する方法は、in vivoでの作用の結
果、インターロイキン２ではその60％のものがＮ末端か
ら２番目のアラニン残基までが切除されており、生産菌
体内での産生ポリペプチドのＮ末端制御はまだ確立され
ていない。
本発明の目的は上記の問題点を解決し、目的ポリペプ
チド生産菌体内にて、そのＮ末端をより均一に調製する
ための技術を提供することにある。
チド生産菌体内にて、そのＮ末端をより均一に調製する
ための技術を提供することにある。
本発明者らは大腸菌のアミノペプチダーゼＰがその特
異性が極めて高いことに着目した。そして、目的ポリペ
プチド生産菌体内に本アミノペプチダーゼ導入すること
によって、より均一なＮ末端を有する目的ポリペプチド
を極めて効率のよい、かつ経済的に製造する方法の開発
に成功し、本発明を完成するに至った。
異性が極めて高いことに着目した。そして、目的ポリペ
プチド生産菌体内に本アミノペプチダーゼ導入すること
によって、より均一なＮ末端を有する目的ポリペプチド
を極めて効率のよい、かつ経済的に製造する方法の開発
に成功し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、アミノペプチダーゼＰ遺伝子を含有
するベクター及び目的ポリペプチドをコードする遺伝子
を含有するベクターを保持する生物を培養し、生物体内
及び、又は培養液中に蓄積した目的ポリペプチドを採取
することを特徴とするポリペプチドの製造法に関するも
のである。
するベクター及び目的ポリペプチドをコードする遺伝子
を含有するベクターを保持する生物を培養し、生物体内
及び、又は培養液中に蓄積した目的ポリペプチドを採取
することを特徴とするポリペプチドの製造法に関するも
のである。
アミノペプチダーゼＰは（Aminopeptidase P〔EC 3.
4.11.5〕、以下AP−Ｐと表示する。）Ｎ末端側から２番
目のアミノ酸がブロリンである時、１番目のアミノ酸を
切断遊離する。従って、Ｘ−Pro−Ｙ−（Ｘは任意のア
ミノ酸、Ｙはブロリン以外のアミノ酸）のアミノ酸配列
でＸを切断遊離させる。アミノペプチダーゼＰ遺伝子は
アミノペプチダーゼＰを産生するいかなる生物からも取
り出すことができるが、例えば大腸菌から分離すること
ができる。
4.11.5〕、以下AP−Ｐと表示する。）Ｎ末端側から２番
目のアミノ酸がブロリンである時、１番目のアミノ酸を
切断遊離する。従って、Ｘ−Pro−Ｙ−（Ｘは任意のア
ミノ酸、Ｙはブロリン以外のアミノ酸）のアミノ酸配列
でＸを切断遊離させる。アミノペプチダーゼＰ遺伝子は
アミノペプチダーゼＰを産生するいかなる生物からも取
り出すことができるが、例えば大腸菌から分離すること
ができる。
目的ポリペプチドの種類も問わないが、各種生理活性
物質を含み、例えば、各種インターロイキン、インター
フェロン、コロニー形成因子、リンホトキシン等のリン
ホカインや各種成長ホルモン類等である。目的ポリペプ
チドのＮ末端がブロリン残基であるようなポリペプチド
としては、ヒトIL−６、塩基性繊維芽細胞成長因子等が
好ましい。ヒトインターロイキン６（IL−６）はBSF−
２（Ｂ−cell Stimulatory Factor−２）とも呼ばれ、
当初Ｂ細胞を抗体産生細胞へ分化させる因子（BCDF:B−
cell Differenciation Factor）としてクローニングさ
れたリンフォカインである。〔T.Hirano et.al.Nature
324,73（1986）〕しかし、その後、IL−６は単にＢ細胞
分化能を担っているのではなく、種々の細胞で産生さ
れ、抗体産生増強能に加えて造血機能亢進能、分化誘導
能等を有することが確認されている。目的ポリペプチド
をコードする遺伝子の前半部分（目的ポリペプチドのＮ
末端側領域をコードするDNA部分）は生産させるポリペ
プチドのアミノ酸配列を変えない範囲でアデニン（Ａ）
またはチミン（Ｔ）に富む塩基配列を有するDNAを用い
るほうがより好ましい。
物質を含み、例えば、各種インターロイキン、インター
フェロン、コロニー形成因子、リンホトキシン等のリン
ホカインや各種成長ホルモン類等である。目的ポリペプ
チドのＮ末端がブロリン残基であるようなポリペプチド
としては、ヒトIL−６、塩基性繊維芽細胞成長因子等が
好ましい。ヒトインターロイキン６（IL−６）はBSF−
２（Ｂ−cell Stimulatory Factor−２）とも呼ばれ、
当初Ｂ細胞を抗体産生細胞へ分化させる因子（BCDF:B−
cell Differenciation Factor）としてクローニングさ
れたリンフォカインである。〔T.Hirano et.al.Nature
324,73（1986）〕しかし、その後、IL−６は単にＢ細胞
分化能を担っているのではなく、種々の細胞で産生さ
れ、抗体産生増強能に加えて造血機能亢進能、分化誘導
能等を有することが確認されている。目的ポリペプチド
をコードする遺伝子の前半部分（目的ポリペプチドのＮ
末端側領域をコードするDNA部分）は生産させるポリペ
プチドのアミノ酸配列を変えない範囲でアデニン（Ａ）
またはチミン（Ｔ）に富む塩基配列を有するDNAを用い
るほうがより好ましい。
アミノペプチダーゼＰ遺伝子を含有するベクターと目
的ポリペプチドをコードする遺伝子を含有するベクター
はひとつのベクターに含まれていてもよく、また別々の
ベクターであってもよい。
的ポリペプチドをコードする遺伝子を含有するベクター
はひとつのベクターに含まれていてもよく、また別々の
ベクターであってもよい。
アミノペプチダーゼＰ遺伝子を含有するベクター及び
目的ポリペプチドをコードする遺伝子の取得方法として
以下に述べると、例えば、大腸菌の染色体を制限酵素に
より判断し、適当なベクターにクローニングした後、大
腸菌に形質転換し各クローンのアミノペプチダーゼＰ活
性を測定し、AP−Ｐ活性の高まったクローンからプラス
ミドDNAを調製する事で、一般にはAP−Ｐ遺伝子を含有
するベクターを得ることが出来る。
目的ポリペプチドをコードする遺伝子の取得方法として
以下に述べると、例えば、大腸菌の染色体を制限酵素に
より判断し、適当なベクターにクローニングした後、大
腸菌に形質転換し各クローンのアミノペプチダーゼＰ活
性を測定し、AP−Ｐ活性の高まったクローンからプラス
ミドDNAを調製する事で、一般にはAP−Ｐ遺伝子を含有
するベクターを得ることが出来る。
また、一般に、目的遺伝子は目的ポリペプチドを産生
している細胞からmRNAを調製し、そのcDNAを作製後、目
的ポリペプチドの一部のアミノ酸配列の情報から作製し
たDNAプローブを用いて目的遺伝子を取得できる。ある
いは目的ポリペプチドのアミノ酸配列が既知の場合は、
直接目的遺伝子を合成DNAにより作製することも可能で
ある。
している細胞からmRNAを調製し、そのcDNAを作製後、目
的ポリペプチドの一部のアミノ酸配列の情報から作製し
たDNAプローブを用いて目的遺伝子を取得できる。ある
いは目的ポリペプチドのアミノ酸配列が既知の場合は、
直接目的遺伝子を合成DNAにより作製することも可能で
ある。
アミノペプチダーゼＰ遺伝子を含有するベクターある
いは目的ポリペプチドをコードする遺伝子を含有するベ
クターがプロモーターあるいは翻訳開始コドンを含んで
いないときはそれらを組込む必要がある。
いは目的ポリペプチドをコードする遺伝子を含有するベ
クターがプロモーターあるいは翻訳開始コドンを含んで
いないときはそれらを組込む必要がある。
プロモーターの由来は問うところではなく、例えば大
腸菌のtrpプロモーター、lacプロモーター、合成プロモ
ーターのtacプロモーター、trcプロモーター、λファー
ジのPlプロモーター、PRプロモーターなどを用いること
ができる。
腸菌のtrpプロモーター、lacプロモーター、合成プロモ
ーターのtacプロモーター、trcプロモーター、λファー
ジのPlプロモーター、PRプロモーターなどを用いること
ができる。
翻訳開始コドンは、DNA塩基配列上、目的ポリペプチ
ドをコードする領域の直前にATGを付加することにな
る。
ドをコードする領域の直前にATGを付加することにな
る。
これらのベクターを組込む上記の遺伝子発現ベクター
を組込む生物は原核生物及び真核生物のいずれであって
もよい。原核生物の例としては大腸菌、枯草菌などを挙
げることができる。真核生物は例えば、酵母などであ
る。遺伝子発現ベクターをこれらの生物に組込む方法も
公知の方法を利用すればよく、例えば、大腸菌では、対
数増殖期の細胞を50mMの塩化カルシウムで氷中約30分処
理する事により、大腸菌の細胞壁の構造が変化し、続い
てDNAを注入し、約10分後30℃〜42℃で２分間の熱処理
を施した後、培地を加え30℃〜37℃で約60分培養するこ
とで遺伝子発現ベクターを生物に組み込むことが出来
る。
を組込む生物は原核生物及び真核生物のいずれであって
もよい。原核生物の例としては大腸菌、枯草菌などを挙
げることができる。真核生物は例えば、酵母などであ
る。遺伝子発現ベクターをこれらの生物に組込む方法も
公知の方法を利用すればよく、例えば、大腸菌では、対
数増殖期の細胞を50mMの塩化カルシウムで氷中約30分処
理する事により、大腸菌の細胞壁の構造が変化し、続い
てDNAを注入し、約10分後30℃〜42℃で２分間の熱処理
を施した後、培地を加え30℃〜37℃で約60分培養するこ
とで遺伝子発現ベクターを生物に組み込むことが出来
る。
大腸菌のアミノペプチダーゼＰ遺伝子は、既にpUC19
のプラスミド上にクローニングされているが、〔T.Yosh
imotoらJ.Biochem.105,412〜416（1989）〕このpUC系の
プラスミドは、一般に目的ポリペプチドの大量発現に用
いられるプラスミドpBR系のものとは１つの細胞中に安
定して共存し得ない。そのため、pBR系、あるいはpUC系
の複製起点を有する発現ベクターと共存し得るプラスミ
ドであるpACYC177の上にAP−Ｐ遺伝子を移し直し、AP−
Ｐの高生産株を作製することにより、目的ポリペプチド
の生産宿主を構築した。
のプラスミド上にクローニングされているが、〔T.Yosh
imotoらJ.Biochem.105,412〜416（1989）〕このpUC系の
プラスミドは、一般に目的ポリペプチドの大量発現に用
いられるプラスミドpBR系のものとは１つの細胞中に安
定して共存し得ない。そのため、pBR系、あるいはpUC系
の複製起点を有する発現ベクターと共存し得るプラスミ
ドであるpACYC177の上にAP−Ｐ遺伝子を移し直し、AP−
Ｐの高生産株を作製することにより、目的ポリペプチド
の生産宿主を構築した。
また一方で、AP−Ｐ遺伝子を目的ポリペプチド発現プ
ラスミド上へ移すことにより、逆に、AP−Ｐの発現プラ
スミドに目的ポリペプチドの遺伝子発現系をのせること
により、AP−Ｐ活性を高めた生産菌体内で目的ポリペプ
チドを生産させ、より均一なＮ末端となった目的ポリペ
プチドを得ることが可能となった。さらに、目的ポリペ
プチドを発現させる宿主のアミノペプチダーゼＰ活性
を、その染色体中のアミノペプチダーゼＰ遺伝子発現を
増強することにより上昇させ、目的ポリペプチドのＮ末
端を揃えることも可能である。
ラスミド上へ移すことにより、逆に、AP−Ｐの発現プラ
スミドに目的ポリペプチドの遺伝子発現系をのせること
により、AP−Ｐ活性を高めた生産菌体内で目的ポリペプ
チドを生産させ、より均一なＮ末端となった目的ポリペ
プチドを得ることが可能となった。さらに、目的ポリペ
プチドを発現させる宿主のアミノペプチダーゼＰ活性
を、その染色体中のアミノペプチダーゼＰ遺伝子発現を
増強することにより上昇させ、目的ポリペプチドのＮ末
端を揃えることも可能である。
これらのベクターを保持する生物を培養することによ
って目的ポリペプチド及びアミノペプチダーゼＰを生物
体内あるいは培養液中に蓄積させることができる。培地
は各生物を培養しうるそれぞれの公知の培地を利用すれ
ばよく、培養条件も公知の条件でよい。培養後は目的ポ
リペプチドを公知の方法で取得すればよい。
って目的ポリペプチド及びアミノペプチダーゼＰを生物
体内あるいは培養液中に蓄積させることができる。培地
は各生物を培養しうるそれぞれの公知の培地を利用すれ
ばよく、培養条件も公知の条件でよい。培養後は目的ポ
リペプチドを公知の方法で取得すればよい。
アミノペプチダーゼＰ遺伝子を含有するベクター及び
目的ポリペプチドをコードする遺伝子を含有するベクタ
ーを保持する生物を培養するとまず生物体内あるいは培
養液中に目的ポリペプチドを含む前駆体ポリペプチドと
アミノペプチダーゼＰが生成蓄積される。そこでアミノ
ペプチダーゼＰが前駆体ポリペプチドに作用してＮ末端
の均一な目的ポリペプチドを生成させている。
目的ポリペプチドをコードする遺伝子を含有するベクタ
ーを保持する生物を培養するとまず生物体内あるいは培
養液中に目的ポリペプチドを含む前駆体ポリペプチドと
アミノペプチダーゼＰが生成蓄積される。そこでアミノ
ペプチダーゼＰが前駆体ポリペプチドに作用してＮ末端
の均一な目的ポリペプチドを生成させている。
実施例１ ヒトインターロイキン６の製造法 成熟型ヒトインターロイキン６（以下、IL−６と略
す）のＮ末端アミノ酸はブロリン（Pro）であるが、組
み替えDNA法により製造する組み替え型IL−６は、一般
に、そのＮ末端にメチオニンが付加したメチオニルIL−
６か、もしくは、メチオニンの切除された物との混合物
であることが多い。
す）のＮ末端アミノ酸はブロリン（Pro）であるが、組
み替えDNA法により製造する組み替え型IL−６は、一般
に、そのＮ末端にメチオニンが付加したメチオニルIL−
６か、もしくは、メチオニンの切除された物との混合物
であることが多い。
そこで、本発明者らは、アミノペプチダーゼＰをクロ
ーニングしたプラスミドを保持し、アミノペプチダーゼ
Ｐ活性を高めた大腸菌をIL−６生産の宿主とすることに
より、また、アミノペプチダーゼＰ遺伝子を直接にIL−
６生産プラスミドにクローニングし、アミノペプチダー
ゼＰを量産化することにより、Ｎ末端がブロリンにより
揃ったIL−６の生産に成功した。
ーニングしたプラスミドを保持し、アミノペプチダーゼ
Ｐ活性を高めた大腸菌をIL−６生産の宿主とすることに
より、また、アミノペプチダーゼＰ遺伝子を直接にIL−
６生産プラスミドにクローニングし、アミノペプチダー
ゼＰを量産化することにより、Ｎ末端がブロリンにより
揃ったIL−６の生産に成功した。
（１）AP−Ｐ活性を高めた宿主中でIL−６を生産する例 IL−６を生産させる直接発現プラスミドDNAの構築 pBSF−2D（本プラスミドを含有するE.coli pTBCDF−0
2/HB101は、FERM P−9061として寄託されている。）
は、J.Biochem.104,30−34（1988）に記載されているIL
−６の直接発現プラスミドである。これはpBR系の複製
起点を持ち、遺伝子発現系としてはtrpプロモーター、t
rpLのSD配列を配備し、また遺伝子の下流にはtrpAター
ミネーターが配置されている。しかしながら、pBSF−2D
はインドールアクリル酸（以下、IAAと略す）添加によ
るtrpプロモーター誘導後もIL−６発現量は低く、また
菌体内にIL−６の顆粒は確認できなかった。
2/HB101は、FERM P−9061として寄託されている。）
は、J.Biochem.104,30−34（1988）に記載されているIL
−６の直接発現プラスミドである。これはpBR系の複製
起点を持ち、遺伝子発現系としてはtrpプロモーター、t
rpLのSD配列を配備し、また遺伝子の下流にはtrpAター
ミネーターが配置されている。しかしながら、pBSF−2D
はインドールアクリル酸（以下、IAAと略す）添加によ
るtrpプロモーター誘導後もIL−６発現量は低く、また
菌体内にIL−６の顆粒は確認できなかった。
また、IL−６のcDNA上の翻訳終止コドンはアンバー
（TAG）であり、大腸菌HB101はアンバーサプレッサーを
有するため完全にTAGコドンでIL−６ポリペプチドの合
成を終止させることができす、不用部分が付加したIL−
６の産生を引き起こす可能性がある。
（TAG）であり、大腸菌HB101はアンバーサプレッサーを
有するため完全にTAGコドンでIL−６ポリペプチドの合
成を終止させることができす、不用部分が付加したIL−
６の産生を引き起こす可能性がある。
そこでまず、pBSF−2Dの複製起点のpUCへの転換とIL
−６翻訳終止コドンのオーカー（TAA）へ変換を目指し
て、プラスミドpBSF2C−DUCを第１図に示すようにして
構築した。図中の黒帯部分はtrpプロモーター／オペレ
ーター部分を、黒三角部分はtrpAターミネーター部分を
そして白帯部分はIL−６コード領域をそれぞれ示してい
る。
−６翻訳終止コドンのオーカー（TAA）へ変換を目指し
て、プラスミドpBSF2C−DUCを第１図に示すようにして
構築した。図中の黒帯部分はtrpプロモーター／オペレ
ーター部分を、黒三角部分はtrpAターミネーター部分を
そして白帯部分はIL−６コード領域をそれぞれ示してい
る。
第１図に示したように、まずpBSF−2Dを制限酵素EcoR
I、Pvu IIで切断し、IL−6 cDNAを含むDNA断片とpUC19
（Messing,R.（1983）Methods in Enzymology,101,20〜
78）を制限酵素Hinc II、EcoR Iで切断し得られる大き
いDNA断片とをT4DNAリガーゼで連結することにより複製
起点をpUC系とするpBSF2−DUCを得た。
I、Pvu IIで切断し、IL−6 cDNAを含むDNA断片とpUC19
（Messing,R.（1983）Methods in Enzymology,101,20〜
78）を制限酵素Hinc II、EcoR Iで切断し得られる大き
いDNA断片とをT4DNAリガーゼで連結することにより複製
起点をpUC系とするpBSF2−DUCを得た。
またpT13SNco（本プラスミドを含有するE.coli AJ−1
2447はFERM P−10757として寄託されている。）〔J.Bio
chem.104,30〜34（1988）に記載〕を制限酵素EcoR I、P
vu IIで切断し得られる小DNA断片と上記のpUC19断片を
連結することにより、pT13SNco−UCを構築した。
2447はFERM P−10757として寄託されている。）〔J.Bio
chem.104,30〜34（1988）に記載〕を制限酵素EcoR I、P
vu IIで切断し得られる小DNA断片と上記のpUC19断片を
連結することにより、pT13SNco−UCを構築した。
次に、pBSF2−DUCを制限酵素Hind III、Ban IIで切断
して得られる大きいDNA断片と、通常の方法で作製した
合成DNA断片BSCT（IL−６翻訳終止コドン変換用）と、
さらにpT13SNco−UCを制限酵素BamH I、Hind IIIで消化
して得られるtrpAターミネーターを有するDNA断片との
３つのDNA断片をT4DNAリガーゼで連結することによりpB
SF2C−DUCを構築した。尚、合成DNA断片BSCTは下記の配
列を有している。
して得られる大きいDNA断片と、通常の方法で作製した
合成DNA断片BSCT（IL−６翻訳終止コドン変換用）と、
さらにpT13SNco−UCを制限酵素BamH I、Hind IIIで消化
して得られるtrpAターミネーターを有するDNA断片との
３つのDNA断片をT4DNAリガーゼで連結することによりpB
SF2C−DUCを構築した。尚、合成DNA断片BSCTは下記の配
列を有している。
一方、IL−６コード領域の前にSD配列を２つ配備する
ためにIL−6cDNAの一部を化学合成DNAにより第２図に示
したように改変した（合成DNA断片BSFN）。図中の破線
部分はSD配列を示している。
ためにIL−6cDNAの一部を化学合成DNAにより第２図に示
したように改変した（合成DNA断片BSFN）。図中の破線
部分はSD配列を示している。
この合成DNAは39マー（mer）から45マーの化学合成DN
A断片６本（BSFN1F,1R,2F,2R,3F,3R）より次のように作
製した。すなわち、DNA合成機（Applied Biosystems社
製model 380B）により化学合成した各DNA断片を燐酸化
後（BSFN1F,BSFN3Rは燐酸化しない）、BSFN1FとBSFN1
R、BSFN2FとBSFN2R、BSFN3FとBSFN3Rとをアニールさ
せ、続いてそれらを混合し、T4DNAリガーゼにより連結
させた。次に、その反応液を５％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけ、泳動、エチジュウムブロマイド染色
の後、目的合成DNA断片BSFNに相当するDNAのバンド（約
130bp）を分取し、精製することにより合成部分IL−6DN
Aを得た。この合成DNA断片BSFNは、第３図に示すように
制限酵素EcoR I、Acc Iで消化したpUC19の大きいDNA断
片にT4DNAリガーゼにて連結させ、pUC−SD6Nを得た。図
中の格子帯部分は合成DAN部分を示している。なお、合
成DNA断片BSFNのDNA塩基配列は、このpUC−SD6Nを用
い、両方向からdideoxy法にて確認した。
A断片６本（BSFN1F,1R,2F,2R,3F,3R）より次のように作
製した。すなわち、DNA合成機（Applied Biosystems社
製model 380B）により化学合成した各DNA断片を燐酸化
後（BSFN1F,BSFN3Rは燐酸化しない）、BSFN1FとBSFN1
R、BSFN2FとBSFN2R、BSFN3FとBSFN3Rとをアニールさ
せ、続いてそれらを混合し、T4DNAリガーゼにより連結
させた。次に、その反応液を５％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけ、泳動、エチジュウムブロマイド染色
の後、目的合成DNA断片BSFNに相当するDNAのバンド（約
130bp）を分取し、精製することにより合成部分IL−6DN
Aを得た。この合成DNA断片BSFNは、第３図に示すように
制限酵素EcoR I、Acc Iで消化したpUC19の大きいDNA断
片にT4DNAリガーゼにて連結させ、pUC−SD6Nを得た。図
中の格子帯部分は合成DAN部分を示している。なお、合
成DNA断片BSFNのDNA塩基配列は、このpUC−SD6Nを用
い、両方向からdideoxy法にて確認した。
続いて、第４図に示すように、pUC−SD6Nを制限酵素C
la Iで切断し、クレノウフラグメントにより平滑末端と
した後、TthHB81で消化することにより得られるIL−６
の一部を有するDNA断片（約120bp）と、pBSF2C−DUCをP
vu II、BamH I、TthHB81で消化し得られるIL−６の後半
部分を有するDNA断片（約470bp）と、pBR322をEco RV、
BamH Iで消化し、得られる大きいDNA断片とをT4DNAリガ
ーゼにより連結することによりpBR−SD7を構築した。図
中、黒帯部分はtrpプロモーター／オペレーター部分
を、黒三角部分はtrpAターミネーター部分を、白帯部分
はIL−６コード領域の部分をそして格子帯部分は合成DN
A部分をそれぞれ示している。
la Iで切断し、クレノウフラグメントにより平滑末端と
した後、TthHB81で消化することにより得られるIL−６
の一部を有するDNA断片（約120bp）と、pBSF2C−DUCをP
vu II、BamH I、TthHB81で消化し得られるIL−６の後半
部分を有するDNA断片（約470bp）と、pBR322をEco RV、
BamH Iで消化し、得られる大きいDNA断片とをT4DNAリガ
ーゼにより連結することによりpBR−SD7を構築した。図
中、黒帯部分はtrpプロモーター／オペレーター部分
を、黒三角部分はtrpAターミネーター部分を、白帯部分
はIL−６コード領域の部分をそして格子帯部分は合成DN
A部分をそれぞれ示している。
次に、同じ第４図に示すように、pBR−SD7をdam-株の
大腸菌に通常の方法により形質転換後、プラスミドを調
製しpBR−SD7（dam-）を得、これをCla I、BamH I切断
することにより、半合成IL−6DNAを有するDNA断片を取
得した。そして、このDNA断片に、再びpBSF2C−DUCを制
限酵素Cla I、BamH Iで切断して得られるtrpプロモータ
ーおよびtrpAターミネーターを有するDNA断片とをT4DNA
リガーゼによって連結する事によりIL−６の高発現、か
つ直接発現プラスミドpBSF2−SD7を構築、取得した。
大腸菌に通常の方法により形質転換後、プラスミドを調
製しpBR−SD7（dam-）を得、これをCla I、BamH I切断
することにより、半合成IL−6DNAを有するDNA断片を取
得した。そして、このDNA断片に、再びpBSF2C−DUCを制
限酵素Cla I、BamH Iで切断して得られるtrpプロモータ
ーおよびtrpAターミネーターを有するDNA断片とをT4DNA
リガーゼによって連結する事によりIL−６の高発現、か
つ直接発現プラスミドpBSF2−SD7を構築、取得した。
続いて、pBSF2−SD7を大腸菌HB101に形質転換し、IL
−６高生産菌（E.coli pBSF2−SD7/HB101 AJ−12448、F
ERM P−10758）を得た。
−６高生産菌（E.coli pBSF2−SD7/HB101 AJ−12448、F
ERM P−10758）を得た。
アミノペプチダーゼＰ大量生産プラスミドDNAの構築 アミノペプチダーゼＰの高生産プラスミドpAPP4はJ.B
iochem.105,412−416（1989）に記載されているプラス
ミドで、大腸菌HB101株由来のアミノペプチダーゼＰをp
UC19にクローニングしたものである。
iochem.105,412−416（1989）に記載されているプラス
ミドで、大腸菌HB101株由来のアミノペプチダーゼＰをp
UC19にクローニングしたものである。
本pAAP4は上記のpBSF2−SD7とは一つの大腸菌内に共
存しえないため（不和合性を示す）、pAPP4上のAP−Ｐ
遺伝子をpBSF2−SD7と共存し得るプラスミドベクターpA
CYC177に移した。
存しえないため（不和合性を示す）、pAPP4上のAP−Ｐ
遺伝子をpBSF2−SD7と共存し得るプラスミドベクターpA
CYC177に移した。
第５図に示したように、pACYC177をまず制限酵素Hinc
IIで切断し、つづいて、子牛の腸由来のアルカリ性脱
燐酸化酵素（Calf intestine Alkaline Phosphatase）
を作用させた。一方、pAPP4に制限酵素Pvu IIを作用さ
せ、AP−Ｐ遺伝子を含むDNA断片を得た。次にT4DNAリガ
ーゼにより両DNA断片を連結し、複製起点がp15A由来
で、pUC系プラスミドと共存可能なベクター上にAP−Ｐ
遺伝子が乗っているpAPP4−Kmを構築した。
IIで切断し、つづいて、子牛の腸由来のアルカリ性脱
燐酸化酵素（Calf intestine Alkaline Phosphatase）
を作用させた。一方、pAPP4に制限酵素Pvu IIを作用さ
せ、AP−Ｐ遺伝子を含むDNA断片を得た。次にT4DNAリガ
ーゼにより両DNA断片を連結し、複製起点がp15A由来
で、pUC系プラスミドと共存可能なベクター上にAP−Ｐ
遺伝子が乗っているpAPP4−Kmを構築した。
図中、Placはラクトースプロモーターを白帯部分はAP
−Ｐ遺伝子部分を、Kmrはカナマイシン耐性をそしてApr
はアンピシリン耐性をそれぞれ示している。なお、この
AP−Ｐ遺伝子はlacプロモーターの支配下にある。次
に、このプラスミドを大腸菌HB101株に形質転換し、AP
−Ｐ高生産部を得た。
−Ｐ遺伝子部分を、Kmrはカナマイシン耐性をそしてApr
はアンピシリン耐性をそれぞれ示している。なお、この
AP−Ｐ遺伝子はlacプロモーターの支配下にある。次
に、このプラスミドを大腸菌HB101株に形質転換し、AP
−Ｐ高生産部を得た。
また、同様に本pAPP4−Km上のIacプロモーターを欠失
させたAP−Ｐ生産プラスミドpAPP4−KmΔＢを構築し
た。これは第６図に示したようにpAPP4−Kmを制限酵素B
amH Iで切断し、自己連結を行うことによりpAPP4−KmΔ
Ｂを作製した。このプラスミドも同様にして大腸菌HB10
1株に形質転換し、AP−Ｐ生産株を得た。
させたAP−Ｐ生産プラスミドpAPP4−KmΔＢを構築し
た。これは第６図に示したようにpAPP4−Kmを制限酵素B
amH Iで切断し、自己連結を行うことによりpAPP4−KmΔ
Ｂを作製した。このプラスミドも同様にして大腸菌HB10
1株に形質転換し、AP−Ｐ生産株を得た。
続いて、PAAP4−KmまたはpAPP4−KmΔＢを保持する大
腸菌HB101へpBSF2−SD7を形質転換し、アンピシリン及
びカナマイシンで選択することによりそれぞれ、両プラ
スミドを持つ大腸菌pBSF2−SD7、pAPP4−Km/HB101（AJ
−12456）及び大腸菌pBSF2−SD7、pAPP4−KmΔB/HB101
（AJ−12457）を得た。なお本菌株はそれぞれ微工研菌
寄第10766号、微工研菌代10767号である。
腸菌HB101へpBSF2−SD7を形質転換し、アンピシリン及
びカナマイシンで選択することによりそれぞれ、両プラ
スミドを持つ大腸菌pBSF2−SD7、pAPP4−Km/HB101（AJ
−12456）及び大腸菌pBSF2−SD7、pAPP4−KmΔB/HB101
（AJ−12457）を得た。なお本菌株はそれぞれ微工研菌
寄第10766号、微工研菌代10767号である。
培養、及び生産物の取得 選択した形質転換株E.coli pBSF2−SD7、pAPP4−Km/H
B101（FERM P−10766）またはE.coli pBSF2−SD7、pAPP
4−KmΔB/HB101（FERM P−10767）を50μg/mlのアンピ
シリン及び50μg/mlのカナマイシンを含む2xTY培地（1.
6％バクトトリプトン、１％酵母エキス、0.5％NaCl、pH
7.0）5ml中で30℃一晩生育させた。ついで、各々の培養
懸濁液5mlを100mlのM9−カザミノ酸培地（0.6％Na2HPO4
・12H2O,0.3％KH2PO4,0.05％NaCl,0.1％NH4Cl,0.05％Mg
SO4・7H2O,0.00147％CaCl2,0.2％グルコース,0.2％カザ
ミノ酸,0.02％Ｌ−ロイシン,0.02％Ｌ−ブロリン,0.000
2％チアミン塩酸塩,100μg/mlアンビシリン、50μg/ml
カナマイシン、pH6.9）へ接種し、37℃にて３時間培養
した。その後、25μg/mlになるように３−インドールア
クリル酸（IAA）を添加し、さらに、37℃にて21時間誘
導培養した。
B101（FERM P−10766）またはE.coli pBSF2−SD7、pAPP
4−KmΔB/HB101（FERM P−10767）を50μg/mlのアンピ
シリン及び50μg/mlのカナマイシンを含む2xTY培地（1.
6％バクトトリプトン、１％酵母エキス、0.5％NaCl、pH
7.0）5ml中で30℃一晩生育させた。ついで、各々の培養
懸濁液5mlを100mlのM9−カザミノ酸培地（0.6％Na2HPO4
・12H2O,0.3％KH2PO4,0.05％NaCl,0.1％NH4Cl,0.05％Mg
SO4・7H2O,0.00147％CaCl2,0.2％グルコース,0.2％カザ
ミノ酸,0.02％Ｌ−ロイシン,0.02％Ｌ−ブロリン,0.000
2％チアミン塩酸塩,100μg/mlアンビシリン、50μg/ml
カナマイシン、pH6.9）へ接種し、37℃にて３時間培養
した。その後、25μg/mlになるように３−インドールア
クリル酸（IAA）を添加し、さらに、37℃にて21時間誘
導培養した。
これらの一部の菌体懸濁液を位相差顕微鏡により、約
1500倍にて観察すると両生産菌体内に顆粒の形状が認め
られた。
1500倍にて観察すると両生産菌体内に顆粒の形状が認め
られた。
続いて、上記の如く培養した各菌体懸濁液を遠心分離
機にかけ、菌体を集め２倍濃縮になるように、30mM NaC
lを含む20mM Tris−HCl緩衝液（pH7.5）を添加し、懸濁
後、そこへ0.5M EDTA（pH8.0）で1mg/mlになるように溶
かしたリゾチーム溶液37.5mlを添加し、撹拌した後、氷
中にて１時間放置した。ついで超音波破砕で菌体を破壊
し、6000rpm,5minの遠心分離で各々の顆粒を回収した。
機にかけ、菌体を集め２倍濃縮になるように、30mM NaC
lを含む20mM Tris−HCl緩衝液（pH7.5）を添加し、懸濁
後、そこへ0.5M EDTA（pH8.0）で1mg/mlになるように溶
かしたリゾチーム溶液37.5mlを添加し、撹拌した後、氷
中にて１時間放置した。ついで超音波破砕で菌体を破壊
し、6000rpm,5minの遠心分離で各々の顆粒を回収した。
この顆粒を6M塩酸グアニジンで可溶化し、目的ポリペ
プチドIL−６濃度が100μg/ml、及び2M塩酸グアニジン
溶液となるように、濃度調製を行い、これに酸化型グル
タチオン1mMと還元型グルタチオン10mMとなるように添
加し、pH8.0で室温で10〜16時間放置した。次に、Sepha
dex G−25によるゲル濾過で塩酸グアニジンを除去し、
両生産菌からのIL−６画分を得た。
プチドIL−６濃度が100μg/ml、及び2M塩酸グアニジン
溶液となるように、濃度調製を行い、これに酸化型グル
タチオン1mMと還元型グルタチオン10mMとなるように添
加し、pH8.0で室温で10〜16時間放置した。次に、Sepha
dex G−25によるゲル濾過で塩酸グアニジンを除去し、
両生産菌からのIL−６画分を得た。
一方、pBSF2−SD7/HB101も同様に培養し、IL−６画分
を調製した。但し、抗生物質はアンピシリンのみの添
加、選択によった。
を調製した。但し、抗生物質はアンピシリンのみの添
加、選択によった。
それら物質はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より、その分子量はアミノ酸組成から計算した値とほぼ
一致したが、プロテインシークエンサーにてＮ末端側の
アミノ酸配列を検定した結果、pBSF2−SD7/HB101由来の
IL−６のＮ末端は、約40％がメチオニン残基を有する物
であったが、AP−Ｐ遺伝子を組み入れたpBSF2−SD7、pA
PP4−Km/HB101及びpBSF2−SD7、pAPP4−KmΔB/HB101は
ともにＮ末端のメチオニン残基は検出限界以下で、目的
産物である成熟型IL−６の配列を有するポリペプチドは
約95％以上であることが確認された。
より、その分子量はアミノ酸組成から計算した値とほぼ
一致したが、プロテインシークエンサーにてＮ末端側の
アミノ酸配列を検定した結果、pBSF2−SD7/HB101由来の
IL−６のＮ末端は、約40％がメチオニン残基を有する物
であったが、AP−Ｐ遺伝子を組み入れたpBSF2−SD7、pA
PP4−Km/HB101及びpBSF2−SD7、pAPP4−KmΔB/HB101は
ともにＮ末端のメチオニン残基は検出限界以下で、目的
産物である成熟型IL−６の配列を有するポリペプチドは
約95％以上であることが確認された。
また、生理活性としては、IgMを産生するヒトＢ細胞
株CL4（T.HiranoらProc.Natl.Acad.Sci.,82,5490.198
5）を用いて、IgM産生活性を測定した。つまり、抗体産
生活性を測定する検液と6x103個のCL4を200μの10％F
CSを含むFRMI 1640培地（1ml当りペニシリン100単位、
ストリプトマイシン100μｇ、ゲンタマイシン10μｇ及
びNaHCO3 16mMを含む）に入れ、この混合物を96穴マイ
クロプレート中で３日間、５％CO2存在下、37℃で培養
し、培養上清のIgM量を酵素免疫測定法により測定し
た。また、この条件に於いて、最大のIgM生産量（最高
のCL4の反応）の50％を示す抗体産生活性を1u/mlとし
た。
株CL4（T.HiranoらProc.Natl.Acad.Sci.,82,5490.198
5）を用いて、IgM産生活性を測定した。つまり、抗体産
生活性を測定する検液と6x103個のCL4を200μの10％F
CSを含むFRMI 1640培地（1ml当りペニシリン100単位、
ストリプトマイシン100μｇ、ゲンタマイシン10μｇ及
びNaHCO3 16mMを含む）に入れ、この混合物を96穴マイ
クロプレート中で３日間、５％CO2存在下、37℃で培養
し、培養上清のIgM量を酵素免疫測定法により測定し
た。また、この条件に於いて、最大のIgM生産量（最高
のCL4の反応）の50％を示す抗体産生活性を1u/mlとし
た。
その結果、上記の如く取得した３つの組み替えIL−６
は、約6.0u/ngの比活性を示し、それは動物細胞より得
られた天然のIL−６と同程度の生理活性を持つことが判
明した。
は、約6.0u/ngの比活性を示し、それは動物細胞より得
られた天然のIL−６と同程度の生理活性を持つことが判
明した。
以上のようにして、本発明の如くIL−６生産菌体内で
アミノペプチダーゼＰを多量に生産させることにより、
Ｎ末端のより揃ったIL−６ポリペプチドを製造、取得す
ることができた。
アミノペプチダーゼＰを多量に生産させることにより、
Ｎ末端のより揃ったIL−６ポリペプチドを製造、取得す
ることができた。
（２）IL−６生産プラスミド上へのAP−Ｐ遺伝子のクロ
ーニングより、AP−Ｐ活性を高めた宿主中でのIL−６の
発現生産 プラスミドDNAの構築 第７図に示したように、まずpBSF2−SD7を制限酵素Hi
nd IIIで切断し、続いてクレノウフラグメントによりそ
の末端を平滑末端とした後、EcoR Iで消化することによ
り得られるIL−６遺伝子を有するDNA断片とpAPP4を制限
酵素Sac Iで切断し、T4DNAポリメラーゼによりその３′
突出端を削除し平滑端とした後、EcoRで切断し得られる
大きいDNA断片とをT4DNAリガーゼにより連結することに
より、IL−６とAP−Ｐを共にコードするプラスミドpBSF
2−SD7P1を構築し、取得した。図中、黒帯部分はtrpプ
ロモーター、格子帯部分はIL−６コード領域、そして白
帯部分はAP−Ｐコード領域をそれぞれ示している。
ーニングより、AP−Ｐ活性を高めた宿主中でのIL−６の
発現生産 プラスミドDNAの構築 第７図に示したように、まずpBSF2−SD7を制限酵素Hi
nd IIIで切断し、続いてクレノウフラグメントによりそ
の末端を平滑末端とした後、EcoR Iで消化することによ
り得られるIL−６遺伝子を有するDNA断片とpAPP4を制限
酵素Sac Iで切断し、T4DNAポリメラーゼによりその３′
突出端を削除し平滑端とした後、EcoRで切断し得られる
大きいDNA断片とをT4DNAリガーゼにより連結することに
より、IL−６とAP−Ｐを共にコードするプラスミドpBSF
2−SD7P1を構築し、取得した。図中、黒帯部分はtrpプ
ロモーター、格子帯部分はIL−６コード領域、そして白
帯部分はAP−Ｐコード領域をそれぞれ示している。
続いて、本プラスミドを大腸菌HB101株に形質転換す
ることにより、高いAP−Ｐ活性を有し、同時にIL−６を
大量発現する生産宿主ベクター系が構築できた。なお、
本菌（pBSF2−SD7P1/HB101 AJ−12458）は微工研菌寄第
10768号である。
ることにより、高いAP−Ｐ活性を有し、同時にIL−６を
大量発現する生産宿主ベクター系が構築できた。なお、
本菌（pBSF2−SD7P1/HB101 AJ−12458）は微工研菌寄第
10768号である。
培養、及び生産物の取得 実施例１（１）と同様にE.coli pBSF2−SD7P1/HB101
（FERM P−10768）を培養し、IL−６を調製し、取得し
た。
（FERM P−10768）を培養し、IL−６を調製し、取得し
た。
本手法で得られたIL−６も生理活性を有しており、実
施例（１）と同様に、当然Ｎ末端アミノ酸配列も成熟型
IL−６であると考えられるはずである。
施例（１）と同様に、当然Ｎ末端アミノ酸配列も成熟型
IL−６であると考えられるはずである。
以上のようにして、本発明の手法を用いることにより
Ｎ末端がより揃ったヒトIL−６ポリペプチドを製造、取
得することができる。
Ｎ末端がより揃ったヒトIL−６ポリペプチドを製造、取
得することができる。
（３）大腸菌染色体のAP−Ｐ遺伝子を２コピーにし、AP
−Ｐ活性を高めた宿主中でのIL−６の発現生産 大腸菌の相同的組換え能を利用したAP−Ｐ遺伝子の染
色体への組み込み 第８図に示したように、pAPP4を制限酵素Kpn Iで消化
して得られるAP−Ｐ遺伝子を含むDNA断片を、pHSG299
（Takeshita.Sら（1987）Gene,61,63〜74）のKpn Iサイ
トへ挿入し、pHAP4を構築した。また、複製機能が温度
感受性となったプラスミドであるpMAN031（Matsuyama.S
ら（1985）J.Bacteriol.voll62,1196〜1202）を制限酵
素Pst I、Hind IIIで消化し得られる複製起点を含んだD
NA断片を、pBR322のPst I−Hind III断片にクローニン
グすることにより、pTS1を構築した。次に、このpTS1を
EcoR I、Hind IIIで切断し得られる大きいDNA断片と、p
HAP4を同様に、EcoR I、Hind IIIで消化し、得られるAP
−Ｐ遺伝子を含むDNA断片とを連結する事で、温度感受
性複製起点を有するプラスミドの上にAP−Ｐ遺伝子を載
せたpTSAP1を構築した。
−Ｐ活性を高めた宿主中でのIL−６の発現生産 大腸菌の相同的組換え能を利用したAP−Ｐ遺伝子の染
色体への組み込み 第８図に示したように、pAPP4を制限酵素Kpn Iで消化
して得られるAP−Ｐ遺伝子を含むDNA断片を、pHSG299
（Takeshita.Sら（1987）Gene,61,63〜74）のKpn Iサイ
トへ挿入し、pHAP4を構築した。また、複製機能が温度
感受性となったプラスミドであるpMAN031（Matsuyama.S
ら（1985）J.Bacteriol.voll62,1196〜1202）を制限酵
素Pst I、Hind IIIで消化し得られる複製起点を含んだD
NA断片を、pBR322のPst I−Hind III断片にクローニン
グすることにより、pTS1を構築した。次に、このpTS1を
EcoR I、Hind IIIで切断し得られる大きいDNA断片と、p
HAP4を同様に、EcoR I、Hind IIIで消化し、得られるAP
−Ｐ遺伝子を含むDNA断片とを連結する事で、温度感受
性複製起点を有するプラスミドの上にAP−Ｐ遺伝子を載
せたpTSAP1を構築した。
続いて、構築したpTSAP1を大腸菌RR1株に形質転換
し、アンピシリン耐性となった菌株を選択した。この菌
株を5mlのＬ培地（アンピシリンを50μg/ml含む）で30
度・６時間培養し、希釈した後、Ｌ−プレート（アンピ
シリン50μg/ml含む）にまき、42度で一晩培養し、42度
で生育したコロニーを選択した。
し、アンピシリン耐性となった菌株を選択した。この菌
株を5mlのＬ培地（アンピシリンを50μg/ml含む）で30
度・６時間培養し、希釈した後、Ｌ−プレート（アンピ
シリン50μg/ml含む）にまき、42度で一晩培養し、42度
で生育したコロニーを選択した。
次に、この菌株のRecA機能を欠損させるために、P1フ
ァージによる形質導入法を利用した。大腸菌JC 10240株
はrecA-であり、このrecA-近傍にTn10が存在している菌
株である。常法に従って、P1ファージを調製し、これを
上記JC 10240株に感染させ、溶原菌を得、さらにこの菌
よりP1ファージを再度調製し、これを先に得たAP−Ｐ遺
伝子が２コピーになったRR1株へ感染させ、テトラサイ
クリン耐性になった菌株（RR1:pTSAP1（RecA-））を選
択した。本菌株は、常法の紫外線照射によるRecA能を検
定したところ、recA-に変化していることがわかった。
ァージによる形質導入法を利用した。大腸菌JC 10240株
はrecA-であり、このrecA-近傍にTn10が存在している菌
株である。常法に従って、P1ファージを調製し、これを
上記JC 10240株に感染させ、溶原菌を得、さらにこの菌
よりP1ファージを再度調製し、これを先に得たAP−Ｐ遺
伝子が２コピーになったRR1株へ感染させ、テトラサイ
クリン耐性になった菌株（RR1:pTSAP1（RecA-））を選
択した。本菌株は、常法の紫外線照射によるRecA能を検
定したところ、recA-に変化していることがわかった。
また、得られたRR1:pTSAP1（RecA-）の染色体上にAP
−Ｐ遺伝子が２コピー存在することはサザンハイブリダ
イゼーションにより確認した。まず、37度で培養したRR
1株とRR1:pTSAP1（RecA-）の各々より高分子DNAを調製
し、これらDNAを制限酵素BamH I、あるいはSal Iで消化
した後、アガロースゲル電気泳動に供し、DNAをGeneScr
eenPlusに転写して、AP−Ｐ遺伝子（pAPP4のEcoR I、Hi
nd III断片）をプローブとして、サザンブロットハイブ
リダイゼーションを行なった。その結果、RR1株ではBam
H I消化、Sal I消化共に、AP−Ｐ遺伝子を示すバンドが
一本しか存在しなかったが（第９図中、レーン１、
３）、RR1:pTSAP1（RecA-）株では両制限酵素共に、２
本のバンドが検出され（第９図中、レーン２、４）、AP
−Ｐ遺伝子が染色体上で２コピーに増えていることが確
認できた。また、AP−Ｐ活性を測定したところ、RR1:pT
SAP1（RecA-）株のAP−Ｐ活性はRR1株の約２倍であるこ
とが確認できた。
−Ｐ遺伝子が２コピー存在することはサザンハイブリダ
イゼーションにより確認した。まず、37度で培養したRR
1株とRR1:pTSAP1（RecA-）の各々より高分子DNAを調製
し、これらDNAを制限酵素BamH I、あるいはSal Iで消化
した後、アガロースゲル電気泳動に供し、DNAをGeneScr
eenPlusに転写して、AP−Ｐ遺伝子（pAPP4のEcoR I、Hi
nd III断片）をプローブとして、サザンブロットハイブ
リダイゼーションを行なった。その結果、RR1株ではBam
H I消化、Sal I消化共に、AP−Ｐ遺伝子を示すバンドが
一本しか存在しなかったが（第９図中、レーン１、
３）、RR1:pTSAP1（RecA-）株では両制限酵素共に、２
本のバンドが検出され（第９図中、レーン２、４）、AP
−Ｐ遺伝子が染色体上で２コピーに増えていることが確
認できた。また、AP−Ｐ活性を測定したところ、RR1:pT
SAP1（RecA-）株のAP−Ｐ活性はRR1株の約２倍であるこ
とが確認できた。
RR1:pTSAP1（RecA-）を用いたIL−６の生産 IL−６直接発現用プラスミドpBSF2−SD7を制限酵素Ec
oR I、Hind IIIで消化し、IL−６遺伝子を含むDNA断片
とpHSG399（Takeshita.Sら（1987）Gene,61,63〜74）を
同様に、EcoR I、Hind IIIで消化して得られる大きいDN
A断片とを連結する事により、pBSF2−SD7−Cmを構築し
た（第10図）。次に本プラスミドを大腸菌HB101株及びR
R1:pTSAP1（RecA-）株へ各々、形質転換し、HB101/pBSF
2−SD7−Cm（AJ 12540）、RR1:pTSAP1（RecA-）/pBSF2
−SD7−Cm（AJ 12541）を得た。なお、本菌株はそれぞ
れ、微工研菌寄第11607号、微工研菌寄第11608号であ
る。これらの菌株を、実施例１と同様に、培養しIL−６
を調製し、取得した。プロテインシークエンサーで、そ
れぞれの菌株より得られたIL−６のアミノ末端を検定し
たところ、前者のものでは、約15％がメチオニン残基を
有するIL−６であったが、AP−Ｐ遺伝子を２コピーにし
た後者の菌株では、約96％が目的産物である成熟型IL−
６の配列を有するポリペプチドであることが確認され
た。また、生理活性においても、天然型IL−６と同程度
の生理活性を持つことが判明した。
oR I、Hind IIIで消化し、IL−６遺伝子を含むDNA断片
とpHSG399（Takeshita.Sら（1987）Gene,61,63〜74）を
同様に、EcoR I、Hind IIIで消化して得られる大きいDN
A断片とを連結する事により、pBSF2−SD7−Cmを構築し
た（第10図）。次に本プラスミドを大腸菌HB101株及びR
R1:pTSAP1（RecA-）株へ各々、形質転換し、HB101/pBSF
2−SD7−Cm（AJ 12540）、RR1:pTSAP1（RecA-）/pBSF2
−SD7−Cm（AJ 12541）を得た。なお、本菌株はそれぞ
れ、微工研菌寄第11607号、微工研菌寄第11608号であ
る。これらの菌株を、実施例１と同様に、培養しIL−６
を調製し、取得した。プロテインシークエンサーで、そ
れぞれの菌株より得られたIL−６のアミノ末端を検定し
たところ、前者のものでは、約15％がメチオニン残基を
有するIL−６であったが、AP−Ｐ遺伝子を２コピーにし
た後者の菌株では、約96％が目的産物である成熟型IL−
６の配列を有するポリペプチドであることが確認され
た。また、生理活性においても、天然型IL−６と同程度
の生理活性を持つことが判明した。
以上のようにして、本発明の如くAP−Ｐ遺伝子を２コ
ピーにした大腸菌宿主内でIL−６を生産させることで、
Ｎ末端のより揃ったヒトIL−６ポリペプチドを製造、取
得することができた。
ピーにした大腸菌宿主内でIL−６を生産させることで、
Ｎ末端のより揃ったヒトIL−６ポリペプチドを製造、取
得することができた。
本発明によれば、組み替えDNA法により目的ポリペプ
チドを製造する場合に於いて、Ｎ末端のより揃った目的
ポリペプチドが、多量に、かつ安価に製造することがで
きる。
チドを製造する場合に於いて、Ｎ末端のより揃った目的
ポリペプチドが、多量に、かつ安価に製造することがで
きる。
第１図はプラスミドpBSF2C−DUCの構築工程を示す図面
である。 第２図は合成DNA断片BSFNの塩基配列を示す図面であ
る。 第３図はプラスミドpUC−SD6Nの構築工程を示す図面で
ある。 第４図はIL−６の直接発現プラスミドであるpBSF2−SD7
の構築工程を示す図面である。 第５図はアミノペプチダーゼＰの発現プラスミドである
pAPP4−Kmの構築工程を示す図面である。 第６図はアミノペプチダーゼＰの発現プラスミドである
pAPP4−KmΔＢの構築工程を示す図面である。 第７図はIL−６及びアミノペプチダーゼＰの両発現プラ
スミドであるpBSF2−SD7P1の構築工程を示す図面であ
る。 第８図はプラスミドpTSAP1の構築工程を示す図面であ
る。 第９図はサザンブロットハイブリダイゼーションのオー
トラジオグラムを示す図面である。 第10図はプラスミドpBSF2−SD7−Cmの構築工程を示す図
面である。
である。 第２図は合成DNA断片BSFNの塩基配列を示す図面であ
る。 第３図はプラスミドpUC−SD6Nの構築工程を示す図面で
ある。 第４図はIL−６の直接発現プラスミドであるpBSF2−SD7
の構築工程を示す図面である。 第５図はアミノペプチダーゼＰの発現プラスミドである
pAPP4−Kmの構築工程を示す図面である。 第６図はアミノペプチダーゼＰの発現プラスミドである
pAPP4−KmΔＢの構築工程を示す図面である。 第７図はIL−６及びアミノペプチダーゼＰの両発現プラ
スミドであるpBSF2−SD7P1の構築工程を示す図面であ
る。 第８図はプラスミドpTSAP1の構築工程を示す図面であ
る。 第９図はサザンブロットハイブリダイゼーションのオー
トラジオグラムを示す図面である。 第10図はプラスミドpBSF2−SD7−Cmの構築工程を示す図
面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 菊池 慶実 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１―１ 味 の素株式会社中央研究所内 (56)参考文献 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，169, ｐ．751〜757，1987 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/00 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (8)
- 【請求項１】アミノペプチダーゼＰ遺伝子を含有するベ
クター及び目的ポリペプチドをコードする遺伝子を含有
するベクターを保持する生物を培養し、生物体内及び、
又は培養液中に蓄積した目的ポリペプチドを採取するこ
とを特徴とするポリペプチドの製造法 - 【請求項２】アミノペプチダーゼＰをコードする遺伝子
と目的ポリペプチドをコードする遺伝子が同一ベクター
上に存在するベクターである請求項（１）に記載のポリ
ペプチドの製造法 - 【請求項３】アミノペプチダーゼＰをコードする遺伝子
発現が増強された染色体を有し、かつ目的ポリペプチド
をコードする遺伝子を含有するベクターを保持する生物
である請求項（１）に記載のポリペプチドの製造法 - 【請求項４】生物が原核生物である請求項（１）、
（２）又は（３）に記載のポリペプチドの製造法 - 【請求項５】原核生物が大腸菌である請求項（４）に記
載のポリペプチドの製造法 - 【請求項６】生物が真核生物である請求項（１）、
（２）又は（３）に記載のポリペプチドの製造法 - 【請求項７】目的ポリペプチドのＮ末端がプロリン残基
である請求項（１）、（２）又は（３）に記載のポリペ
プチドの製造法 - 【請求項８】目的ポリペプチドがインターロイキン６で
ある請求項（１）、（２）又は（３）に記載のポリペプ
チドの製造法
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1-189269 | 1989-07-21 | ||
| JP18926989 | 1989-07-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03130088A JPH03130088A (ja) | 1991-06-03 |
| JP2844870B2 true JP2844870B2 (ja) | 1999-01-13 |
Family
ID=16238489
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19216290A Expired - Lifetime JP2844870B2 (ja) | 1989-07-21 | 1990-07-20 | 組み替えｄｎａ法によるポリペプチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2844870B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0603393A4 (en) * | 1991-07-08 | 1995-03-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | INTERLEUKIN 6 HUMAN RECOMBINATION WITH HOMOGENEOUS N TERMINATION AND PRODUCTION OF THIS INTERLEUKIN. |
| IL160658A0 (en) * | 2001-09-13 | 2004-08-31 | Genentech Inc | Aminopeptidase |
| UA97628C2 (ru) * | 2005-08-16 | 2012-03-12 | Ханми Холдингз Ко., Лтд. | Способ получения fc-фрагмента иммуноглобулина, свободного от начального метионинового остатка, в массовом масштабе |
-
1990
- 1990-07-20 JP JP19216290A patent/JP2844870B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１６９，ｐ．７５１〜７５７，１９８７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03130088A (ja) | 1991-06-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5212058A (en) | Nucleic acid encoding ubiquitin-specific proteases | |
| JP2766621B2 (ja) | 組み換えｇ−ｃｓｆ | |
| JP3041644B2 (ja) | ユビキチン特異的プロテアーゼ | |
| JP2686090B2 (ja) | 新規融合蛋白質およびその精製方法 | |
| AU8640798A (en) | Recombinant expression of insulin c-peptide | |
| EP0321940B1 (en) | An improved method for the preparation of natural human growth hormone in pure form | |
| JP2844870B2 (ja) | 組み替えｄｎａ法によるポリペプチドの製造法 | |
| CA1339464C (en) | ¬leu13| motilin, dnas coding for same and methods for producing same | |
| JPH1175876A (ja) | 新規な微生物トランスグルタミナーゼの製造法 | |
| CA1338900C (en) | Escherichia coli plasmid vector with lipoprotein promoter and modified shine-dalgarno sequence | |
| JP2005506319A (ja) | 融合タンパク質から目的タンパク質を分離する方法。 | |
| EP0076037B1 (en) | Amplified expression of dna sequences | |
| KR0161656B1 (ko) | 글루카곤의 생산방법 | |
| JPH0816120B2 (ja) | 成長ホルモン放出因子を含むハイブリドポリペプチド | |
| WO1988005816A1 (en) | Polypeptide | |
| JP2549504B2 (ja) | Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 | |
| JPH07114702B2 (ja) | ヒトインスリン様成長因子▲ｉ▼の製造法 | |
| JP2007501622A (ja) | 組換えポリペプチドを精製するための方法 | |
| RU2453604C1 (ru) | Гибридный белок (варианты), штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка (варианты) и способ получения безметионинового интерферона альфа-2 человека | |
| RU2441072C1 (ru) | ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b ЧЕЛОВЕКА ИЗ ЭТОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА | |
| JP2845558B2 (ja) | メチオニンアミノペプチダーゼのｄｎａ配列 | |
| JP3003135B2 (ja) | ポリペプチドの発現ベクター及びポリペプチドの製造法 | |
| KR0149955B1 (ko) | 융합단백질을 이용한 인간 글루카곤의 제조방법 | |
| JP2662044B2 (ja) | Ｄｎａ配列、発現ベクターおよびポリペプチドの周辺質生産方法 | |
| JPS6137099A (ja) | 蛋白質の製造法 |