PL186123B1 - Zastosowanie dipeptydu L-Glu-L-Trp - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie dipeptydu L-Glu-L-Trp, cyklicznej postaci tego dipeptydu i liniowego lub cyklicznego polimeru tego dipeptydu o nie wiecej niz 20 aminokwasach oraz ich far- maceutycznie dopuszczalnych soli do wytwarzania leku do leczenia stanu patologicznego zwiazanego z neounaczynieniem. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie dipeptydu L-Glu-L-Trp i jego pochodnych do wytwarzania leku do leczenia stanu patologicznego związanego z neounaczynieniem.

Neounaczynienie, powstawanie nowych naczyń krwionośnych, jest inicjowane we wczesnym etapie embriogenezy, a także podczas gojenia się ran, przebudowy tkanek i prawdopodobnie podczas normalnego zachowania układu naczyniowego. Do procesów zachodzących podczas neounaczyniania należą co najmniej uaktywnianie komórek śródbłonka i perycytów; degradacja blaszki podstawnej naczyniówki; migracja i proliferacja komórek śródbłonka i perycytów; tworzenie się światła nowego naczynia włosowatego; pojawianie się perycytów wokół nowych naczyń; rozwój nowej blaszki podstawnej naczyniówki; powstawanie pętli włośniczki; kontynuowanie inwolucji z różnicowaniem się nowych naczyń; powstawanie siatki naczyń włosowatych; oraz, ostatecznie, organizowanie się siatki w większe mikronaczynia.

Wiadomo, że pewne cytokiny, takie jak interleukina-12 (IL-12), transformujący czynnik wzrostu β (TGF-β), interferon-α (IFN-α) i czynnik płytkowy 4 (PF-4), wykazują działanie hamujące neounaczynienie. Jednakże doświadczenia kliniczne z terapią cytokinową dały problematyczne wyniki z uwagi na toksyczność pewnych związków tego typu.

Istnieje szereg stanów patologicznych, w których angiogeneza odgrywa ogólną rolę lub uczestniczy bezpośrednio w różnych następstwach choroby. Należą do nich np. neounaczynienie guzów nowotworowych; powstawanie naczyniaków krwionośnych; neounaczynienie związane z różnymi chorobami wątroby; angiogenna dysfunkcja związana z nadmiarem hormonu; neonaczyniowe następstwa cukrzycy; neonaczyniowe następstwa nadciśnienia; neounaczynienie w następstwie wyzdrowienia po udarze mózgowo-naczyniowym; neounaczynienie spowodowane urazem głowy; neounaczynienie przy przewlekłym zakażeniu wątroby; restenoza po plastyce naczyń; oraz neounaczynienie spowodowane urazem termicznym wysokotemperaturowym lub niskotemperaturowym.

Jakkolwiek angiogeneza jest niewątpliwie niezbędna do utrzymania zdrowego układu naczyniowego, w medycynie klinicznej pożądany byłby lek umożliwiający realizację nietoksycznego sposobu leczenia dla przejściowego hamowania neounaczynienia, np. wywołującego przejściową angiostazę.

W WO 95/03067 ujawniono preparat farmaceutyczny do wywoływania podwyższonego stanu odporności komórkowej lub humoralnej przeciw drobnoustrojom, zawierający L-Glu-L-Trp. Wiadomo także, że L-Glu-L-Trp pobudza powstawanie komórek odpornościowych oraz doprowadza ich liczbę do normalnego stanu w warunkach niedoboru odporności (patrz np. WO 89/06134, WO 92/17191 i WO 93/08815).

Nieoczekiwanie stwierdzono, że dipeptyd L-Glu-L-Trp wykazuje również działanie angiostatyczne niezależnie od działania w warunkach niedoboru odporności. Wyniki badań in vitro wykazały, że w niskim stężeniu dipeptyd L-Glu-L-Trp hamuje neounaczynienie błon kośmówkowo-omoczniowych kurcząt podczas embriogenezy. W badaniach na zwierzętach L-Glu-L-Trp hamuje neounaczynienie nowotworu płuc Lewisa po śródskómym wstrzyknięciu myszy C57/BL/6 oraz hamuje wzrost mięsaka 180 u myszy Swiss-Webster·.

Tak więc wynalazek dotyczy zastosowania dipeptydu L-Glu-L-Trp, cyklicznej postaci tego dipeptydu i liniowego lub cyklicznego polimeru tego dipeptydu o nie więcej niż 20 aminokwasach oraz ich farmacetycznie dopuszczalnych soli do wytwarzania leku do leczenia stanu patologicznego związanego z neounaczynieniem.

Zgodnie z wynalazkiem korzystynie stosuje się dipeptyd L-Glu-L-Trp.

186 123

Korzystnie dipeptyd L-Glu-L-Trp, jego pochodne i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole stosuje się do wytwarzania leku do leczenia stanu patologicznego, którym jest naczyniak krwionośny.

Korzystnie dipeptyd L-Glu-L-Trp, jego pochodne i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole stosuje się do wytwarzania leku do leczenia stanu patologicznego, którym jest unaczyniony nowotwór złośliwy lub unaczyniony nowotwór łagodny.

Korzystnie dipeptyd L-Glu-L-Trp, jego pochodne i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole stosuje się do wytwarzania leku do leczenia stanu patologicznego, którym jest neounaczynienie w następstwie wyzdrowienia po udarze mózgowo-naczyniowym; neounaczynienie spowodowane urazem głowy; restenoza po plastyce naczyń; oraz neounaczynienie spowodowane urazem termicznym wysokotemperaturowym lub niskotemperaturowym.

Korzystnie dipeptyd L-Glu-L-Trp, jego pochodne i ich farmaceutycznie dopuszczalnne sole stosuje się do wytwarzania leku do leczenia stanu patologicznego, którym jest neounaczynienie związane z wywołanym przez substancję neounaczynieniem wątroby, angiogenna dysfunkcja związana z nadmiarem hormonu; neonaczyniowe następstwa cukrzycy; neonaczyniowe następstwa nadciśnienia lub przewlekłe zakażenie wątroby.

Korzystnie wytwarza się lek zawierający dipeptyd L-Glu-L-Trp lub jego pochodną ewentualnie w postaci soli w ilości odpowiadającej dawce od około 0,5 pg/kg masy ciała do około 1 mg/kg masy ciała.

Korzystnie wytwarza się lek zawierający dipeptyd L-Glu-L-Trp lub jego pochodną ewentualnie w postaci soli w ilości odpowiadającej dawce od około 1-50 (ug/kg masy ciała.

Korzystnie lek jest przeznaczony do podawania codziennie przez okres od 1 dnia do około 30 dni.

Korzystnie lek jest przeznaczony do podawania domięśniowego lub donosowego.

Korzystnie lek ma postać roztworu iniekcyjnego zawierającego 0,001 - 0,01% dipeptydu L-Glu-L-Trp lub jego pochodnej ewentualnie w postaci soli, a zwłaszcza L-Glu-L-Trp.

Zazwyczaj lek jest jednostkową postacią dawkowaną stanowiącą tabletkę, czopek, kapsułkę, błonę na oko, preparat do inhalacji, preparat do rozpylania na śluzówkę, krople do nosa, krople do oczu, pastę do zębów, maść lub krem z podłożem rozpuszczalnym w wodzie.

W szczególności jednostkowa postać dawkowana zawiera zasadniczo 0,01 mg dipeptydu L-Glu-L-Trp lub jego pochodnej ewentualnie w postaci soli.

Lek może być przeznaczony do podawania wraz z lekiem naczyniowoczynnym, takim jak inhibitor enzymu przekształcającego angiotensynę (ACE) lub otwieracz kanałów potasowych (PCO).

Lek może być przeznaczony do podawania wraz ze środkiem chemioterapeutycznym.

Lek może być przeznaczony do podawnia osobnikowi nieupośledzonemu odpomościowo.

W szczególności lek można stosować do leczenia nowotworu, którym jest nowotwór opon, nowotwór wewnątrzmózgowy, mięsak, kostniakomięsak, nowotwór przełyku lub nowotwór tchawicy.

Lek można stosować zwłaszcza do leczenia neonaczyniowego następstwa cukrzycy, którym jest środkowa surowicza chorioretynopatia.

Lek można stosować szczególnie do leczenia nowotworu, którym jest mięsak Lewisa lub mięsak Kaposiego.

Lek zazwyczaj stosuje się w postaci preparatu farmaceutycznego zawierającego dipeptyd L-Glu-L-Trp lub jego pochodną ewentualnie w postaci soli jako substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Wynalazek umożliwia realizację sposobu leczenia osobnika ze stanem patologicznym związanym z neounaczynieniem, zwłaszcza przez podawanie temu osobnikowi preparatu farmaceutycznego zawierającego wyżej określoną substancję czynną w ilości skutecznie hamującej neounaczynienie i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Do stanów patologicznych związanych z neounaczynieniem należą w szczególności naczyniaki krwionośne; unaczynione złośliwe i łagodne nowotwory, takie jak nowotwory opon

186 123 mózgowych, nowotwory wewnątrzmózgowe, mięsaki, kostniakomięsaki, nowotwory tkanki miękkiej, np. przełyku i tchawicy; wywołane przez substancję neounaczynienie, w tym wywołane wtórnie po nadużyciu leku, alkoholu lub innej substancji; dysfunkcja związana z nadmiarem hormonu, np. estrogenu; neounaczyniowe następstwa cukrzycy, takie środkowa surowicza chorioretynopatia; neonaczyniowe następstwa nadciśnienia; neounaczynienie w następstwie wyzdrowienia po udarze mózgowo-naczyniowym; neounaczynienie spowodowane urazem głowy; przewlekłe zakażenie wątroby (np. przewlekłe zapalenie wątroby); restenoza po plastyce naczyń; oraz neounaczynienie spowodowane urazem termicznym wysokotemperaturowym lub niskotemperaturowym, takim jak oparzenia lub odmrożenia. Dipeptyd wykazuje taką aktywność zarówno w przypadku osobników ze zdrowymi układami odpornościowymi, czyli bez upośledzenia odporności, jak i u osobników z upośledzeniem odporności.

Do wytwarzania leków przeznaczonych do leczenia stanów związanych z neounaczynianiem można też stosować związki o wzorze R'-Glu-Trp-R, stanowiące produkty derywatyzacji dipeptydu w wyniku kowalencyjnego przyłączenia odpowiedniej grupy R' i/lub R”. Należą do nich np. farmaceutycznie dopuszczalne sole dipeptydu, amidy, imidy, estry, bezwodniki, etery, estry metylo- lub etylo-alkilowe, pochodne alkilowe, arylowe lub mieszane alkilo/arylowe o masie cząsteczkowej poniżej około 5000 daltonów lub poniżej 1000 daltonów, multimeryczne lub cykliczne odmiany dipeptydu oraz peptydy zawierające mniej niż około 20 aminokwasów lub mniej niż około 10 aminokwasów, zawierające glu-trp w sekwencji aminokwasów. Do reprezentatywnych przykładów należą HEW, EWEW, GEW, EWKHG, EWKKHG, EW-NH-NH-GHK-NH₂, Ac-L-Glu-L-Trp-OH, Suc-EW, Cpr-EW, But-EW, RKEWY, RKEW, KEWY, KEW i pEW.

Można stosować także analogi związku o wzorze R'-Glu-Trp-R, w których D-aminokwasy są zastąpione L-aminokwasami, takie jak L-Glu-D-Trp, D-Glu-L-Trp lub D-Glu-D-Trp, a także analogi tryptofanu, takie jak 5-hydroksytryptamina, kwas 5-hydroksyindolooctowy oraz analogi pirolu, w których atom azotu w pierścieniu pirolowym jest zastąpiony atomem węgla.

Dipeptyd L-Glu-L-Trp to obecnie najkorzystniejszy związek. W opisie L-Glu-L-Trp jest również określany wymiennie jako „EW” i „dipeptyd EW”, z zastosowaniem jednoliterowej konwencji, przy czym pierwszy określony aminokwas zawiera koniec aminowy, a ostatni określony aminokwas zawiera koniec karboksylowy.

Stosowane tu określenie „neounaczynienie” oznacza tworzenie się nowych naczyń krwionośnych. Proces, w którym powstają nowe naczynia krwionośne, może obejmować procesy uaktywniania komórek śródbłonka i perycytów; degradację blaszki podstawnej naczyniówki; migrację i proliferację (czyli podział komórek) komórek śródbłonka i perycytów/ tworzenie się światła nowego naczynia włosowatego; pojawianie się perycytów wokół nowych naczyń; rozwój nowej blaszki podstawnej naczyniówki; powstawanie pętli włośniczki; kontynuowanie inwolucji z różnicowaniem się nowych naczyń; powstawanie siatki naczyń włosowatych; oraz, ostatecznie, organizowanie się siatki w większe mikronaczynia. W niniejszym opisie proces proliferacji komórek śródbłonka, np. w pączku naczyniowym, określany jest jako „angiogeneza” i związany jest z neounaczynieniem stanowiąc jego podproces. Reprezentatywne kliniczne objawy diagnostyczne chorób zostały sklasyfikowane i skodowane (patrz np. International Classification of Diseases, ICD-9-CM, Washington, D.C., 1989). Reprezentatywne objawy neounaczynienia obejmują (lecz nie wyłącznie) dane zgromadzone w angiogramach, obrazach CAT i sonogramach, a także badania wzrokowe z wykorzystaniem metod endoskopowych i/lub kapilaroskopowych.

Określenia „angiostaza”, „angiostatyczny” i „hamowanie neounaczynienia” oznaczj% że szybkość lub stopień neounaczynienia w tkance po leczeniu zmniejszają się w porównaniu z wartościami i przed leczeniem. Angiostazę można określić wykorzystując wymienione powyżej laboratoryjne lub kliniczne wskaźniki nasilenia choroby. Angiostaza może obejmować hamowanie jedńego lub więcej podprocesów zachodzących podczas neounaczyniania, np. proliferacji lub migracji komórek śródbłonka lub komórek naczyniowych mięśni gładkich.

186 123

Określenie „stan patologiczny związany z neounaczynieniem” odnosi się do stanu patologicznego, którego składnik stanowi neounaczynienie lub jego ryzyko. Obejmuje ono, bez jakichkolwiek ograniczeń, patologie, w których neounaczynienie stanowi patologię podstawową, takie jak naczyniaki krwionośne; patologie, w których neounaczynienie nie stanowi patologii podstawowej, lecz przyczynia się do niej, takie jak neounaczynienie nowotworów; oraz patologie, w których neounaczynienie jest następstwem choroby podstawowej, takie jak środkowa surowicza chorioretynopatia u cukrzyków.

Określenie „osobnik” odnosi się do ssaka, w tym do ludzi i naczelnych nie będących ludźmi, zwierząt domowych i zwierząt hodowlanych, zwierząt futerkowych itp., np. kotów, gryzoni, ptaków, koni, krów, świń, ryb itp. Wynalazek umożliwia realizację sposobów terapeutycznego i zapobiegawczego leczenia potrzebujących tego osobników.

Określenie „upośledzenie odporności” odnosi się do osobnika o niższej od normalnej liczbie jednego lub więcej typów komórek odpornościowych, takich jak komórki NK, T-limfocyty T4 i T8, B-limfocyty lub fagocyty, oznaczanej na podstawie typowych klinicznych wskaźników diagnostycznych. Obejmuje ono także osobników o osłabionym działaniu komórek odpornościowych, określonym na podstawie znanego badania funkcjonowania takich komórek, np. wytwarzania immunoglobulin, chemotaksji, mieszanej reakcji leukocytowej lub w teście opóźnionej nadwrażliwości. U osobników z upośledzeniem odporności często występują niezwykłe lub nieoczekiwane zakażenia drobnoustrojami oportunistycznymi.

„Polipeptyd” oznacza szeregowy układ aminokwasów zawierający od ponad 16 do wielu setek aminokwasów, np. białko.

Określenie „nienormalny” odnosi się do laboratoryjnych oznak neounaczynienia poza zakresem wartości rejestrowanych u zdrowych osobników.

Określenie „unormowany” odnosi się do zmian w laboratoryjnych lub klinicznych wskaźnikach neounaczynienia, które po leczeniu powróciło, do normalnego zakresu wielkości rejestrowanych u zdrowych osobników. Osobnik bez defektu naczyniowego oraz bez znanego niedoboru w jakimkolwiek układzie koagulacyjnym, fibrolitycznym lub naczyniowym, określany jest wymiennie w opisie jako „osobnik normalny”.

Określenia „modulator” i „modulowanie” odnoszą się do środka i sposobu zmniejszania neounaczynienia lub angiogenezy u osobnika normalnego lub z upośledzeniem.

Leczenie z użyciem dipeptydu lub jego pochodnej ewentualnie, w postaci soli oznacza sposób dostarczania potrzebującemu tego osobnikowi odpowiedniego preparatu farmaceutycznego w celu wywołania zmniejszenia szybkości lub zakresu neounaczynienia lub angiogenezy.

Preparat farmaceutyczny podaje się pacjentowi choremu na raka w ilości i przez okres czasu wystarczający do zmniejszenia jednego lub większej liczby klinicznych lub laboratoryjnych objawów neounaczynienia lub angiogenezy, osiągając dzięki temu poprawę stanu klinicznego leczonego w ten sposób pacjenta. Sposób ten zmniejsza neounaczynienie w nowotworze hamując dopływ krwi do nowotworu, a zatem i hamując wzrost nowotworu.

Zgodnie z korzystnym trybem leczenia osobnikowi podaje się dawki od około 0,5 pg do około 1 mg/kg masy ciała dziennie przez okres od 1 dnia do około 30 dni. Korzystnie dawkę podaje jako pojedynczą dzienną dawkę domięśniową preparatu farmaceutycznego (domięśniowo), albo jako pojedynczą dzienną dawkę donosową (donosowo). Dawkę korzystnie podaje się stosując sterylny roztwór do iniekcji, do inhalacji, krople do nosa lub roztwór do rozpylania na śluzówkę, zawierający około 0,001 - 0,01% substancji czynnej. Preparatowi farmaceutycznemu można również nadawać formę jednostkowej postaci dawkowanej, np. tabletki, czopka, kapsułki, błony do nakładania na oko, albo do pasty lub maści, np. do pasty do zębów, maści do nanoszenia na skórę lub kremu na podłożu rozpuszczalnym w wodzie. Najkorzystniejsza jednostkowa postać dawkowana jest przeznaczona do dostarczania około 0,01 mg substancji czynnej.

186 123

Dipeptyd L-Glu-L-Trp, jego pochodne i ich sole są użyteczne w wielu profilaktycznych i terapeutycznych zastosowaniach w leczeniu stanów patofizjologicznych u ludzi i zwierząt domowych. Znajdują one zastosowanie w utrzymywaniu in vitro hodowli komórek śródbłonkowych i tkanek naczyniowych, co może mieć miejsce przed wykonaniem autoprzeszczepu lub przeszczepu alogenicznego. Utrzymywanie hodowli komórek śródbłonkowych lub hodowli tkanek naczyniowych in vitro polega na hodowaniu tkanek w pożywce zawierającej dipeptyd L-Glu-L-Trp lub jego pochodną ewentualnie w postaci soli. Zaletą jest utrzymywanie tkanki naczyniowej oraz ograniczenie zmian zapalnych powodowanych przez uszkodzenie tkanki podczas chirurgicznego jej usuwania i przechowywania w hodowli tkankowej.

W leczeniu zapobiegawczym preparaty zawierające dipeptyd L-Glu-L-Trp lub jego pochodną ewentualnie w postaci soli podaje się pacjentowi, u którego występuje podatność lub innego typu ryzyko rozwinięcia się neounaczynienia, np. po operacji, aby zapobiec neounaczynieniu nawrotowego nowotworu pierwotnego lub jego przerzutowych komórek. Określenie „zapobiegawczo skuteczna dawka” oznacza ilość wystarczającą do osiągnięcia działania angiostatycznego w tkance, przy czym ilość ta będzie zależna od stanu zdrowia i wagi pacjenta, z tym, że zazwyczaj będzie przypadać w zakresach podanych dla zastosowań terapeutycznych. Podawanie zapobiegawcze może być szczególnie pożądane w przypadku osobników, u których występuje ryzyko obejmujące w następstwie choroby neounaczynienie lub angiogenezę jako komplikację, np. w przypadku retynopatii cukrzycowej.

Wynalazek umożliwa realizację trybów stosowania terapeutycznego, zgodnie z którymi omawiany preparat farmaceutyczny podaje się sam lub w połączeniu z drugim środkiem farmaceutycznym, czyli stosuje się „terapię skojarzoną”. Do przykładowych terapii skojarzonych należą te, w których taki preparat podaje się z jednym lub większą liczbą antybiotyków, ze środkiem przeciwzapalnym lub ze związkami chemioterapeutycznymi. Takie preparaty można podawać w połączeniu z innymi środkami leczniczymi, albo też oddzielnie, np. w różnym czasie albo w różnych strzykawkach lub tabletkach. Często takie preparaty stosuje się w skojarzonej terapii ze środkami przeciwzapalnymi, przeciwhistaminowymi, środkami chemioterapeutycznymi itp. Przykładowe leczenie skojarzone z użyciem takich preparatów może obejmować np. stosowanie powszechnie znanych środków przeciwzapalnych.

Przykładowe leczenie skojarzone z użyciem dipeptydu L-Glu-L-Trp lub jego pochodnej ewentualnie w postaci soli może również obejmować podawanie leku naczyniowoczynnego jako drugiego środka. Do przykładowych leków naczyniowoczynnych należą leki z grupy inhibitorów enzymu przekształcającego angiotensynę (ACE), otwieraczy kanałów potasowych (PCO) itp.

Do przykładowych terapii skojarzonych raka z użyciem dipeptydu lub jego pochodnych ewentualnie w postaci soli należy podawanie środka chemioterapeutycznego jako drugiego składnika. Leczenie za pomocą dipeptydu L-Glu-L-Trp lub jego pochodnej ewentualnie w postaci soli może być skuteczne w osłabianiu niepożądanych skutków ubocznych związanych z terapią kortykosteroidową, takich jak neounaczynienie. Przykładowe środki chemioterapeutyczne są dobrze znane.

Specjaliści praktycy będą ustalać czas podawania i dawkę tak, aby dostosować je do klinicznych objawów u pacjentów. Wiedza taka została zgromadzona w ciągu dziesięcioleci i jest przedstawiona w literaturze medycznej oraz w podręcznikach medycznych. Moment rozpoczęcia terapii skojarzonej lub z użyciem pojedynczego środka wybiera lekarz na podstawie osądu klinicznego.

Terapia empiryczna jest terapią przeznaczoną do leczenia najbardziej rozpowszechnionego lub prawdopodobnego czynnika sprawczego w oparciu o informacje historyczne, demograficzne i epidemiologiczne. Terapia empiryczna może często obejmować stosowanie wielu środków terapeutycznych dobranych tak, aby osiągnąć szeroki zakres możliwości terapeutycznych. Gdy dostępne są wyniki testów laboratoryjnych, dobór terapii można dostosować tak, aby skuteczniej leczyć chorobę, gdyż leczenie przyczynowe zespołów klinicznych bardzo często zapoczątkowuje się empirycznie. W przypadku konkretnego zespołu klinicznego należy raczej sprawdzić nową metodę terapeutyczną.

186 123

Przy opracowywaniu leków farmaceutycznych w badaniach przedklinicznych terapii ocenia się wpływ terapii w odniesieniu nie tylko do jednego stanu, ale w odniesieniu do wielu interesujących czynników lub stanów. Wyniki różnych (czasami niejednoznacznych) badań rozważa się w aspekcie korzyści i zagrożeń konkretnej terapii w oparciu o wiedzę medyczną zagrożeń związanych z konkretną chorobą.

Wiadomo, że nie wszyscy pacjenci z danym zespołem zostaną wyleczeni w wyniku pojedynczej terapii, z tym, że może istnieć podgrupa pacjentów, w przypadku której terapia przynosi dodatnie i korzystne wyniki. Przykłady zespołów klinicznych, w przypadku których terapie z użyciem opisanych środków mogą przynieść korzystne rezultaty, podano poniżej.

Środki farmaceutyczne zawierające dipeptyd lub jego pochodną ewentualnie w postaci soli jako substancję czynną są przeznaczone do podawania pozajelitowego, miejscowego, podskórnego, domięśniowego, dooponowego, doustnego, donosowego, dootrzewnowego lub miejscowego (np. na skórę jako krem), zapobiegawczo i/lub leczniczo. Korzystnie środki te podaje się pozajelitowe, domięśniowo lub donosowo. Zaletą tych środków jest to, że zapewniają one pożądane działanie przy bardzo niskim poziomie dawki bez działania toksycznego. Zatem celem terapii w ostrych przypadkach może być szybkie zwiększenie stężenia substancji czynnej w tkance, np. w wyniku wielkoobjętościowej dożylnej iniekcji lub infuzji. W innych przypadkach pożądane może być wprowadzanie substancji czynnej w dłuższym okresie czasu.

Środki farmaceutyczne można wytwarzać w sposób umożliwiający wchłanianie przez krwioobieg. Środki zawierające wyżej określoną substancję czynną są modulatorami naczyniowymi wywołującymi zmiany na poziomie komórkowym, które z kolei wywołują takie zmiany w procesach komórkowych, które nie sąjuż zależne od . obecności środka. Zaobserwowano, że działanie peptydu może trwać bardzo długo, np. przez tygodnie lub miesiące, pomimo tego, że degradacja peptydu przebiega raczej szybko, np. w ciągu 5 minut. Jakkolwiek dipeptyd i jego pochodne są rozpuszczalne w wodzie w niskim stężeniu, w którym są stosowane, to korzystnie stosuje się je w postaci soli z kwasami lub alkaliami, utworzonych z farmaceutycznie dopuszczalnymi środkami, np. z kwasem octowym, cytrynowym, maleinowym lub bursztynowym, albo jako sole sodowe, potasowe, amonowe lub cynkowe. Dobrze rozpuszczające się sole można również przeprowadzać w sole o mniejszej rozpuszczalności w płynach ustrojowych, np. w farmaceutycznie dopuszczalną. sól o umiarkowanej rozpuszczalności w wodzie, taką jak sól z kwasem taninowym lub kwasem z oleju palmowego, sprzęgać kowalencyjnie z większym nośnikiem w celu uzyskania preparatu zapewniającego uwalnianie w pewnym okresie czasu, albo wprowadzać do kapsułki zapewniającej uwalnianie w pewnym okresie czasu itp.

Preparaty farmaceutyczne mogą zawierać peptydy w wolnej postaci lub w postaci rozpuszczalnych w wodzie farmaceutycznie dopuszczalnych soli, takich jak sól sodowa, potasowa, amonowa lub cynkowa. Zrozumiałe jest, że dipeptyd można podawać z innymi składnikami aktywnymi, które niezależnie wpływają na aktywność środka farmaceutycznego. Farmaceutycznie dopuszczalne sole można dogodnie wytwarzać z użyciem np. dipeptydu L-Glu-L-Trp (lub jego agonisty) znanymi sposobami. Tak więc takie sole można wytworzyć np. działając na dipeptyd L-Glu-L-Trp wodnym roztworem pożądanego farmaceutycznie dopuszczalnego wodorotlenku metalu lub innego zasadowego związku metalu, a następnie odparowując uzyskany roztwór do sucha, korzystnie pod zmniejszonym ciśnieniem w atmosferze azotu. Można także roztwór dipeptydu L-Glu-L-Trp zmieszać z alkoholanem pożądanego metalu i uzyskany roztwór następnie odparować do sucha. Do farmaceutycznie dopuszczalnych wodorotlenków·'·, zasad i alkoholanów należą związki z odpowiednimi kationami obejmującymi (lecz nie wyłącznie) kation potasowy, sodowy, amonowy, wapniowy i magnezowy. Do innych reprezentatywnych farmaceutycznie dopuszczalnych soli należą chlorowodorek, bromowodorek, siarczan, wodorosiarczan, octan, szczawian, walerianian, oleinian, laurynian, boran, benzoesan, mleczan, fosforan, tosylan, cytrynian, maleinian, fumaran, bursztynian, winian itp.

18<ί 123

Do podawania pozajelitowego nadają się preparaty farmaceutyczne stanowiące roztwór substancji czynnej w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, korzystnie w nośniku wodnym. Można stosować różne nośniki wodne, np. wodę, buforowaną wodę, 0,4% roztwór soli, 0,3% roztwór glicyny itp., zawierający białka i/lub glikoproteiny w celu zwiększenia trwałości, takie jak albumina, lipoproteina, globulina itp. Takie środki można sterylizować powszechnie stosowanymi, dobrze znanymi metodami sterylizacji. Uzyskane wodne roztwory można pakować do stosowania albo sączyć w aseptycznych warunkach i liofilizować, przy czym liofilizowany preparat łączy się ze sterylnym wodnym roztworem przed użyciem. Środki farmaceutyczne mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze niezbędne dla dostosowania do warunków fizjologicznych, takie jak środki regulujące pH i buforujące, środki regulujące toniczność itp., np. octan sodu, mleczan sodu, chlorek sodu, chlorek potasu, chlorek wapnia itp. Pożądane może być stabilizowanie substancji czynnej w celu zwiększenia jej trwałości podczas przechowywania oraz farmakokinetycznego okresu półtrwania. Trwałość podczas przechowywania można zwiększyć dodając zarobek, takich jak

a) środki hydrofobowe (np. gliceryna); b) cukry (np. sacharoza, mannoza, sorbitol, ramnoza, ksyloza); c) złożone węglowodany (np. laktoza); i/lub d) środki bakteriostatyczne. Farmakokinetyczny okres półtrwania peptydów modyfikuje się poprzez sprzęganie z nośnikowymi peptydami, polipeptydami i węglowodanami drogą derywatyzacji chemicznej (np. poprzez sprzęganie łańcucha bocznego albo reszt N- lub C-końcowych), albo chemicznie zmieniając aminokwas na inny aminokwas (jak podano powyżej). Farmakokinetyczny okres półtrwania i farmakodynamikę można także modyfikować poprzez a) kapsułkowanie (np. w liposomach);

b) regulowania stopnia hydratacji (np. poprzez regulowanie stopnia i rodzaju glikozylowania peptydu); oraz c) regulowania ładunku elektrostatycznego i hydrofobowości peptydu.

Środki farmaceutyczne można podawać w postaci fizjologicznie zgodnego preparatu do podawania pozajelitowego (np. dożylnie, podskórnie lub domięśniowo). Preparaty można poddawać typowym operacjom farmaceutycznym, takim jak sterylizacja, a ponadto mogą one zawierać środki pomocnicze, takie jak konserwanty, stabilizatory, środki zwilżające itp.

Środki farmaceutyczne zawierające dipeptyd L-Glu-L-Trp lub jego pochodną ewentualnie w postaci soli jako substancję czynną są zazwyczaj biologicznie czynne w dawkach około 0,5 -1 mg/kg, korzystnie około 1-50 pg/kg. Stężenie substancji czynnej w środku farmaceutycznym może wynosić np. od około 0,001% nawet do 15 lub 20% wagowych, przy czym dobiera się je przede wszystkim uwzględniając objętość płynu, jego lepkość itp., w zależności od konkretnych wymagań związanych z leczeniem oraz sposobu podawania pacjentowi. Przy stosowaniu domięśniowym roztwór do iniekcji zawiera substancję czynną w ilości skutecznie hamującej neounaczynienie, np. od około 0,001 do 0,01% wagowych. Przy wytwarzaniu tabletki, kapsułki lub czopka korzystnie zawartość substancji czynnej odpowiada ilości około 0,1 mg dipeptydu na tabletkę, czopek lub kapsułkę. Farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem dla postaci do iniekcji może być dowolny farmaceutycznie dopuszczalny rozpuszczalnik, taki jak 0,9% wodny roztwór chlorku sodu, woda destylowana, roztwór nowokainy, roztwór Ringera, roztwór glukozy itp. Preparat w postaci kapsułki, czopka lub tabletki może również zawierać inne znane zarobki i nośniki, takie jak wypełniacze, skrobia, glukoza itp. W preparatach do stosowania miejscowego substancja czynna jest zawarta zazwyczaj w opartych na moczniku środkach zmiękczających, maściach opartych na wazelinie itp., w stężeniu od około 0,1 do 10 000 części na milion (ppm), korzystnie od około 1 do 1000 ppm, a najkorzystniej około 10 - 100 ppm. Konkretne sposoby wytwarzania środków do podawania pozajelitowego, doustnego i miejscowego są znane specjalistom i opisane szczegółowo np. w Remington’s Pharmaceutical Science, 17 wyd., Mack Publishing Company, Easton, PA (1985).

Środki farmaceutyczne korzystnie podaje się domięśniowo i donosowo. Korzystna ilość środka farmaceutycznego przy podawaniu domięśniowym odpowiada od około 50 do 100 pg substancji czynnej na dawkę w przypadku osoby dorosłej (przy całkowitej dawce w terapii wynoszącej od 300 do 1000 pg); w przypadku dzieci do 1 roku życia około 10 pg/dawkę, w przypadku dzieci od 1 do 3 lat około 10 -20 pg/dawkę; w przypadku dzieci w wieku 4 - 6 lat

186 123 około 20-30 gg/dawkę, a w przypadku dzieci w wieku 7 - 14 lat około 50 gg/dawkę. Wszystkie podane wyżej dawki stosuje się w leczeniu przez 3-10 dni, zależnie od wymagań dla konkretnego pacjenta. W razie potrzeby leczenie można powtórzyć, zwykle w okresie 1-6 miesięcy. W innym korzystnym trybie dawkę wynoszącą od około 10 gg do około 1 mg substancji czynnej podaje się pacjentowi codziennie przez okres od około 6 do około 10 dni, a ewentualnie pod kontrolą nadzorującego lekarza przez okres do około 30 dni. W innym korzystnym trybie terapia obejmuje domięśniowe podawanie substancji czynnej codziennie w dawce 1-100 (ig/kg przez 5-7 dni, po której następuje 1-6 miesięczna przerwa przed powtórzeniem iniekcji w analogiczny sposób.

Substancję czynną można podawać samą lub w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami, w dawce pojedynczej lub w wielu dawkach. Do odpowiednich farmaceutycznych nośników należą obojętne stałe rozcieńczalniki lub wypełniacze, sterylne roztwory wodne oraz różne nietoksyczne rozpuszczalniki organiczne. Środki farmaceutyczne wytwarza się łącząc substancję czynną z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i ewentualnie z antybiotykiem. Złożone środki terapeutyczne można łatwo podawać w wielu różnych postaciach dawkowanych, takich jak tabletki, pastylki do ssania, syropy, roztwory do iniekcji itp. Złożone środki terapeutyczne mogą również zawierać np. dipeptyd L-Glu-L-Trp w tej samej jednostkowej postaci dawkowanej. Nośniki farmaceutyczne mogą w razie potrzeby zawierać dodatkowe składniki, takie jak środki smakowo-zapachowe, środki więżące, zarobki itp.

Tak więc do podawania doustnego można stosować tabletki zawierające różne zaróbki, takie jak cytrynian sodu, węglan wapnia i fosforan wapnia, wraz z różnymi środkami rozsadzającymi, takimi jak skrobia, korzystnie skrobia ziemniaczana lub tapiokowa, kwas alginowy i pewne złożone krzemiany, oraz ze środkami wiążącymi, takimi jak poliwinylopirolidon, sacharoza, żelatyna i guma arabska. Dodatkowe często przydatne jest stosowanie środków smarujących, takich jak stearynian magnezu, laurylosiarczan sodu i talk, ułatwiających tabletkowanie. Stałe środki podobnego typu można także stosować jako wypełniacze w miękkich i twardych kapsułkach żelatynowych. Do korzystnych stosowanych w tym celu substancji należą laktoza czyli cukier mlekowy oraz glikole polietylenowe o dużej masie cząsteczkowej. Gdy do podawania doustnego pożądane są wodne zawiesiny typu eliksirów, podstawową substancję czynną można połączyć z różnymi środkami słodzącymi lub smakowo-zapachowymi, składnikami barwiącymi lub barwnikami oraz, w razie potrzeby, ze środkami emulgującymi lub zawieszającymi, wraz z rozcieńczalnikami, takimi jak woda, etanol, glikol propylenowy, gliceryna i ich mieszaniny.

Do podawania, pozajelitowego można stosować roztwory substancji czynnej w oleju sezamowym lub arachidowym albo w wodnym roztworze glikolu polipropylenowego, a także sterylne roztwory odpowiednich rozpuszczalnych w wodzie soli metali, opisanych powyżej, w wodnym roztworze soli. W razie potrzeby taki wodny roztwór powinien być odpowiednio buforowany, przy czym ciekłemu rozcieńczalnikowi najpierw nadaje się izotoniczność stosując odpowiednią ilość soli lub glukozy. Takie konkretne wodne roztwory są szczególnie przydatne do iniekcji dożylnej, domięśniowej, podskórnej i dootrzewnowej. Wszystkie stosowane sterylne wodne nośniki można łatwo otrzymać typowymi metodami znanymi specjalistom. Dodatkowo wyżej wspomniane związki można także podawać miejscowo (np. poprzez odpowiednio umiejscowiony cewnik) stosując odpowiedni nadający się do tego roztwór.

Odpowiednią ilość zapewniającą działanie terapeutyczne u więcej niż 50% leczonych osobników określa się jako „terapeutycznie skuteczną dawkę”. Leczenie w stanach ostrych zazwyczaj będzie się prowadzić przez około 3 - 10 dni. Leczenie stanów przewlekłych lub zapobiegawcze prowadzi się w taki sam sposób, z tym, że można je powtórzyć po upływie 1-6 miesięcy lub nawet po dłuższym okresie. W pewnych przypadkach pożądane może być podawanie środków farmaceutycznych w sposób przerywany przez okres około 2-20 dni, korzystnie przez około 3-14 dni, korzystniej przez około 4-10 dni, powtarzając kurację po co najmniej około 15 dniach, korzystnie po około 20 dniach, a nawet po około 1-6 miesiącach.

186 123

Sposób dostarczania środka farmaceutycznego jest uzależniony od choroby oraz miejsca, w którym wymagane jest działanie terapeutyczne. W przypadku podawania miejscowego może być pożądane miejscowe podawanie środka (np. poprzez umieszczenie igły w tkance w danym miejscu), albo założenie bandaża nasyconego tym środkiem, np. w miejscu występowania nowotworu po jego chirurgicznym usunięciu, w przypadku innych chorób może być pożądane podawanie środka farmaceutycznego doustrojowo. Przy innych wskazaniach środki farmaceutyczne można podawać dożylnie, dootrzewnowe, domięśniowo, podskórnie, donosowo lub śródskómie, a także dooskrzelowo (np. za pomocą rozpylacza), przezskómie (np. z użyciem rozpuszczalnego w lipidach nośnika w plastrze na skórę), lub do układu pokarmowego (np. stosując kapsułkę lub tabletkę).

Zazwyczaj środki zawierające sole addycyjne dipeptydu lub jego pochodnych z kwasami, czyli z farmaceutycznie dopuszczalnymi kwasami, będą pod względem biologicznym równoważne środkom zawierającym dipeptyd lub jego pochodną.

Korzystne środki terapeutyczne, inokula, sposoby podawania i dawki będą oczywiście zmieniać się w zależności od wskazań klinicznych. Do iniekcji domięśniowej inokula zazwyczaj przygotowuje się z wysuszonego peptydu (lub koniugatu peptydu) zawieszając peptyd w fizjologicznie dopuszczalnym rozcieńczalniku, takim jak woda, roztwór soli lub roztwór soli buforowany fosforanem. Oczywiście będą występować pewne zmiany w dawkowaniu w zależności od stanu leczonego pacjenta, toteż w każdym przypadku lekarz będzie ustalać właściwą dawkę dla określonego pacjenta. Skuteczna ilość peptydu stanowiąca dawkę jednostkową zależy między innymi od masy ciała, fizjologii i wybranego trybu szczepienia. Dawka jednostkowa peptydu odnosi się do masy peptydu, bez masy nośnika (w przypadku gdy stosuje się nośnik). Skuteczne działanie będzie osiągnięte, gdy miejscowe stężenie np. dipeptydu L-Glu-L-Trp w mikrośrodowisku komórek wynosi 10'⁵-10'⁹ M. Wyszkoleni praktycy mogą wykorzystać wskaźniki kliniczne i laboratoryjne (wymienione powyżej) do śledzenia reakcji pacjenta na zastosowaną terapię i odpowiedniego dostosowywania dawki. W związku z tym, że farmakokinetyka i farmakodynamika dipeptydów, agonistów, antagonistów itp. są różne w przypadku różnych pacjentów, najkorzystniejszy sposób uzyskania terapeutycznego stężenia w tkance stanowi stopniowe zwiększanie dawki i śledzenie wskaźników klinicznych i laboratoryjnych (wymienionych powyżej). Wyjściowa dawka, przy takim trybie podawania wzrastających dawek, będzie zależeć od sposobu podawania. Przy podawaniu dożylnym dipeptydu lub jego pochodnej o przybliżonej masie cząsteczkowej 200 - 400 daltonów stosuje się wyjściową dawkę około 0,5 pg/kg masy ciała, po czym stężenie dawki zwiększa się 10-krotnie dla każdego przedziału trybu wzrastającego dawkowania.

Gdy środek ma postać tabletki, kapsułki lub czopka, to zawartość substancji czynnej korzystnie wynosi około 0,1 mg/tabletkę, czopek lub kapsułkę. Gdy środek ma taką postać, to kapsułka, czopek lub tabletka może również zawierać inne znane zarobki i nośniki, takie jak wypełniacze, skrobia, glukoza itp.

Dogodnie dipeptydy i ich pochodne syntetyzuje się dowolną z szeregu powszechnie dostępnych zautomatyzowanych technik. Ogólnie syntezy takie obejmują stopniową syntezę drogą kolejnej addycji aminokwasów prowadzącej do coraz większych cząsteczek. Aminokwasy łączą się ze sobą w wyniku kondensacji grupy karboksylowej jednego aminokwasu z grupą aminową innego aminokwasu, z utworzeniem wiązania peptydowego. W celu kontrolowania tych reakcji należy zablokować grupę aminową jednego aminokwasu i grupę karboksylową innego. Grupy blokujące powinny być tak dobrane, aby można je było łatwo usunąć bez niepożądanego oddziaływania na peptydy, takiego jak racemizacja lub hydroliza powstałych wiązań peptydowych. Aminokwasy z grupami karboksylowymi (np. Asp, Glu) lub hydroksylowymi (np. Ser, homoseryna i tyrozyna) również wymagają blokowania przed kondensacją.

Znanych jest wiele sposobów syntezy peptydów, z tym, że zazwyczaj korzystna jest synteza w fazie stałej. Zgodnie z tym sposobem aminokwas wiąże się z cząstką żywicy, a peptyd powstaje w sposób stopniowy w wyniku kolejnych addycji zabezpieczonych aminokwasów

18(5123 do rosnącego łańcucha. Powszechnie wykorzystuje się modyfikacje metody opisanej przez Merrifielda. W przykładowej zautomatyzowanej syntezie w fazie stałej peptydy syntetyzuje się łącząc aminokwas mający końcową grupę karboksylową z organicznym linkerem (np. PAM, 4-oksymetylofenyloacetamidometylem) kowalencyjnie przyłączonym do nierozpuszczalnej żywicy polistyrenowej usieciowanej diwinylobenzenem. Do zabezpieczenia końcowej grupy aminowej wykorzystuje się blokowanie grupą t-Boc, a grupy hydroksylowe i karboksylowe blokuje się zazwyczaj grupami O-benzylowymi. Syntezę wykonuje się w zautomatyzowanym syntetyzatorze peptydów (Applied Biosystems, Foster City, CA, np. Model 430-A). Po syntezie produkt można oddzielić od żywicy; grupy blokujące usuwa się stosując kwas fluorowodorowy lub kwas trifluorometylosulfonowy, zgodnie ze znanymi sposobami (B. J. Bergot i S. N. McCurdy, Applied Biosystems Bulletin, 1987). W rutynowej syntezie można uzyskać 0,5 mmola peptydożywicy. Wydajność po odszczepieniu i oczyszczeniu wynosi około 60 - 70%. Tak np. pochodną zaktywowanego estru Glu z zabezpieczoną grupą aminową i zabezpieczonym łańcuchem bocznym poddaje się reakcji z Trp z zabezpieczoną grupą boczną, przyłączonym C-końcem do fazy stałej. Po usunięciu grupy zabezpieczającej grupę aminową peptyd można odszczepić od fazy stałej, albo też można w podobny sposób dodać innego aminokwasu. Dodatkowe aminokwasy wprowadza się kolejno. Peptydy odszczepia się z użyciem silnie kwaśnego środka odszczepiającego, który zazwyczaj usuwa również grupy zabezpieczające.

Peptydy można następnie wyodrębnić, liofilizować i przechowywać przed późniejszym użyciem. Odpowiednie metody syntezy peptydów są opisane szczegółowo w publikacjach: Steward i Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2 wyd., Pierce Chemical Company, 1984; oraz Tam i inni, J. Am. Chem. Soc., 105: 6442 (1983).

Wytworzone peptydy oczyszcza się np. drogą krystalizacji z rozpuszczalnika organicznego, takiego jak eter metylowo-butylowy, po czym rozpuszcza się je w wodzie i poddaje dializie (w przypadku masy cząsteczkowej powyżej około 500), albo chromatografii cienkowarstwowej, chromatografii żelowej, liofilizowaniu lub odwrotnej HPLC (np. z zastosowaniem kolumny C18 oraz 0,1% kwasu trifluorooctowego i acetonitrylu jako rozpuszczalników), w przypadku masy cząsteczkowej poniżej 500. Oczyszczony peptyd liofilizuje się i przechowuje w stanie suchym aż do użycia. Przykładowy preparat farmaceutyczny stanowi oczyszczony dipeptyd L-Glu-L-Trp, który stanowi biały proszek (po zliofilizowaniu; w innym przypadku jest on krystaliczny) , rozpuszczalny w wodzie i DMF, nierozpuszczalny w chloroformie i eterze; α₀ ²²= +12,6; C = 0,5, H₂0. Rf = 0,65 (butan!: kwas octowy : woda = 3:1:1). UV (275 ± 5 nm, max). NMR (500 MHz) : roztwór peptydu 0,001 mola/litr: Trp (3,17, 3,37, 4,57, 7,16, 7,24, 7,71, 7,49); Glu (1,90, 1,96, 2,21, 3,72).

Zazwyczaj pochodną zaktywowanego estru kwasu glutaminowego, z zabezpieczoną grupą aminową i zabezpieczonym łańcuchem bocznym, poddaje się reakcji z zabezpieczonym L-tryptofanem. Po usunięciu grup zabezpieczających i zwykłym oczyszczeniu, np. metodą chromatografii cienkowarstwowej lub gaz-ciecz, peptyd można oczyścić np. drogą liofilizacji, oczyszczania na żelu itp.

Nie chcąc wiązać się jakimkolwiek konkretnym mechanizmem działania możliwe wydaje się, że peptydy zawierające trypto-fan mogą w sposób odwracalny ulegać asocjacji ze specyficznymi komórkowymi receptorami EW na komórkach śródbłonka, przy czym jeden z takich receptorów określany jako wszechobecna determinanta powierzchni komórki „CD2” występuje również na limfocytach, komórkach śródbłonka i pewnych komórkach nabłonka. Wydaje się prawdopodobne, że wiązanie się dipeptydu EW z CD2 (i innymi receptorami EW) uruchamia zmianę konformacyjną w receptorze, która może inicjować uaktywniającą regulację cyklazy adenylanowej i prowadzić do wzrostu ilości wewnątrzkomórkowego cAMP. Obecnie uważa się za możliwe, że L-Glu-L-Trp wywiera działanie regulując hamująco mechanizmy komórkowe, według których mediatory zapalne, takie jak TNF-α i IL-1, uruchamiają aktywację i proliferację komórek śródbłonka i perycytów. Aktywacja powoduje zmiany w ekspresji przez powierzchnię komórek adhezyn odgrywających rolę w wiązaniu zapalnych

186 123 komórek z wystąpieniem zapalenia naczyń, natomiast proliferacja odgrywa rolę w neounaczynianiu. Hamujące regulowanie przez L-Glu-L-Trp śródbłonkowych efektów zapalnych wywoływanych przez mediator może obejmować odfosforylowanie jednej lub większej liczby komórkowych kinaz tyrozynowych. Uważa się za prawdopodobne, że taka hamująca regulacja może spowodować zmiany w syntezie lub ekspresji przez powierzchnię komórek śródbłonkowych adhezyn, selektyn i/lub integryn, np. ELAM, VCAM itp. Te ostatnie zmiany komórkowe wywołane przez dipeptydy zawierające tryptofan mogą spowodować zmniejszenie zdolności komórek zapalnych (np. limfocytów, neutrofili i/lub monocytów) do zbierania się w miejscach występowania zapalenia naczyń.

Stosowane w opisie symbole aminokwasów są zgodne z zaleceniami IUPAC-IUB, opublikowanymi w Arch. Biochem. Biophys. 115: 1 - 12, 1966, używania następujących jednoliterowych symboli dla aminokwasów: L, Leu, leucyna; V, Val, walina; Y, Tyr, tyrozyna; D, Asp, kwas asparaginowy; W, Trp, tryptofan; P, Pro, prolina; I, Ile, izoleucyna; G, Gly, glicyna; M, Met, metionina; E, Glu, kwas glutaminowy; T, Thr, treonina; K, Lys, lizyna; N, Asn, asparagina; R, Arg, arginina; Q, Gln, glutamina; A, Ala, alanina; C, Cys, cysteina; S, Ser, seryna; F, Phe, fenyloalanina; H, His, histydyna; C, Cys, cysteina; S, Ser, seryna.

Wynalazek ilustruj ą poniższe przykłady.

Przykład 1. Brak mutagennności i toksyczności L-Glu-L-Trp: farmakokinetyka i biodystrybucja

Procedura A. Badanie toksyczności ostrej

Podsumowanie: Stwierdzono, że po wstrzyknięciu domięśniowym L-Glu-L-Trp w dawkach, które, jak to wyliczono, są około 10 000 razy większe od dawki terapeutycznej, nie obserwuje się toksyczności u myszy, świnek morskich, kurcząt i psów, co ustalono śledząc stan ogólny, zachowanie, ruchy, fizjologię serca i oddychania oraz ogólną patologię.

Procedura B. Badanie toksyczności przewlekłej

Podsumowanie: L-Glu-L-Trp wstrzykiwany domięśniowo lub dożylnie raz dziennie przez 28 dni nie wywoływał niekorzystnego działania, co ustalono śledząc zachowanie, apetyt, masę ciała, stan sierści, błony śluzowe, liczbę czerwonych i białych krwinek, fizjologię serca i oddychania, działanie wątroby i nerek oraz ogólną patologię. Działanie nerek oznaczano określając diurezę po obfitym napojeniu wodą; w pewnych innych doświadczeniach psy i szczury uśmiercano i badano po 10,20, 30 i 60 dniach.

Procedura C. Farmakokinetyka i biodystrybucja: Badania GLP ¹⁴C-radioznaczony L-Glu-L-Trp (110 pg/kg) podawano donosowo szczurom SpragueDawley. Próbki krwi i tkanek pobierano od różnych szczurów po 0,5, 2, 8 i 24 godzinach, po czym zawartość nienaruszonego L-Glu-L-Trp oznaczano metodą HPLC. Próbki tkanek obejmowały koncentrat krwinek czerwonych, krwinek białych, wątroby, nerki, serca, płuc, śledziony, grasicy, mózgu, mięśni, skóry, tłuszczu, oka, jajnika, jądra, podżuchwowych węzłów chłonnych oraz przewodu pokarmowego wraz z zawartoiścią Podawany donosowo ^WC-L-Glu-L-Trp był szybko wchłaniany z Cm w osoczu 0,349 pg*równ. *godz./g ¹⁴C. Po 30 minutach nie stwierdzono nienaruszonego związku w krwi przy czułości pomiaru w zakresie 5-101 ng/ml, co sugeruje, że okres półtrwania we krwi wynosi poniżej 30 minut. Ustalono, że połówkowy okres wydalania z tkanki wynosi 18,7 godziny.

Przykład 2. Działanie hamujące L-Glu-L-Trp na angiogenezę w testach z błoną kosmówkowo-omoczniową (CAM)

8-dniowe embriony kurcząt usunięto z jaj i umieszczono na sterylnych płytkach Petriego. Pojedyncze krążki bibuły nasączono 7,5 pl różnych roztworów podstawowych L-Glu-L-Trp rozpuszczonego w sterylnym 0,14 M NaCl, aby uzyskać końcowe stężenia testowe 0,001, 0,01, 0,1,1,0, 10, 100, 500 i 1000 pg/krążek. Krążki wysuszono na powietrzu, po czym umieszczono na powierzchni odpowiednich embrionów. Unaczynienie embrionów oceniano po 48 godzinach inkubacji z wykorzystaniem skali ocen podanej poniżej w tabeli 1.

186 123

Tabela 1

Ocena unaczynienia embrionów kurcząt: test CAM

Stopień zahamowania	Opis	Zahamowanie (%)
0	Brak wyraźnej różnicy w porównaniu z ujemną próbą kontrolną	0
1	Nieznaczne zahamowanie tworzenia się naczyń	25
2	Umiarkowane zahamowanie tworzenia się naczyń	50
3	Prawie całkowite zahamowanie tworzenia się naczyń	75
4	Całkowite zahamowanie tworzenia się naczyń	100

W doświadczeniu tym roztwór soli służył jako ujemna próba kontrolna, a heparyna w ilości 10 pg/krążek jako dodatnia próba kontrolna. Pentapeptyd Tyr-Ala-Glu-Glu-Lys (TAEEK) służył jako próba kontrolna specyficzności (w celu oceny ewentualnych niespecyficznych oddziaływań peptydów na neounaczynianie w badanych stężeniach). 9-12 krążków testowych oraz odpowiednią liczbę różnych embrionów zastosowano w przypadku każdego z badanych stężeń, oraz po 82 embriony w próbach kontrolnych, dodatniej i ujemnej. Wyniki zestawiono w poniższej tabeli 2.

T a b e la 2

Wyniki testu CAM z embrionami kurcząt

Badany produkt	Liczba embrionów	Stężenie (gg/krążek)	Hamowanie neounaczyniania
Stopień/zakres hamowania	Stopień/średnia±SD'	Średnio (%)
1	2	3	4	5	6
Roztwór soli	82	0	0-0	0 ± 0	0 ± 0
Heparyna	82	10	1-4	3,26 ± 0,73	81 ± 18
10	1000	2-4	3,3 ± 0,82	83 ±20
10	500	1-4	2,4 ± 0,84	60 ±20
9	100	3-4	3,44 ± 0,73	85 ± 18
L-Glu-L-Trp	11	10	1-4	3,09 ±1,14	78 ±28
12	1	1-4	2,33 ± 0,89	58 ±23
10	0,1	0-3	1,9 ± 0,88	48 ±23
10	0,01	1-2	1,5 ±0,53	38 ± 13
10	0,001	0-2	1,3 ±0,82	33 ±20

186 123 ciąg dalszy tabeli 2

1	2	3	4	5	6
TAEEK	10	1000	0-2	0,7 ± 0,82	18 ±20
10	500	0-2	0,3 ± 0,48	9 ± 13
9	100	0-2	0,67 ± 0,087	18 ±23
11	10	0-1	0,18 ±0,40	5± 10
12	1	0-1	0,33 ± 0,49	8± 10
10	0,1	0-0	0 ±0	0
10	0,01	0-0	0 ± 0	0
10	0,001	0-0	0 ± 0	0

* Średnia ± SD=wielkość średnia ± odchylenie standardowe, n = 10 dla testu oraz n=80 dla roztworu soli i heparyny

Wyniki wykazują 30 - 88% zmniejszenie unaczynienia embrionów traktowanych 10 pg - 1000 pg L-Glu-L-Trp w roztworze soli. Poziom hamowania przy dawkach 10 - 1000 pg był zbliżony do uzyskiwanego przy użyciu heparyny (10 pg). Jakkolwiek zaobserwowano pewne zakładane niespecyficzne działanie kontrolnego pentapeptydu TAEEK na unaczynianie embrionów przy wyższych dawkach (czyli 100 - 1000 pg), wpływ ten nie był tak znaczący jak uzyskiwany w przypadku L-Glu-L-Trp, a przypuszczalnego działania niespecyficznego nie zaobserwowano przy niższych dawkach. Łącznie wyniki te sugerują, występowanie działania L-Glu-L-Trp na proces tworzenia się naczyń w tkankach embrionów kurcząt.

Przykład 3. Hamowanie neounaczyniania raka Lewisa

Komórki raka płuc Lewisa (5 x 10⁷) po wstrzyknięciu (0,1 ml) w obydwa boki myszy C57BL/6 (dzień 0) powodują powstanie widocznych silnie unaczynionych guzków nowotworowych w ciągu 7 dni. Wycinając nowotwór można mikroskopowo określić stopień unaczynienia nowotworu zliczając liczbę dużych naczyń rozchodzących się promieniowo z masy nowotworu. Niezależne badania przeprowadzono (patrz poniżej) w zatwierdzonej przez GLP kontraktowej organizacji badawczej.

Roztwór soli zastosowano jako ujemną próbę kontrolną, a Cytoxan jako dodatnią próbę kontrolną. Dodatni związek kontrolny, Cytoxan (200 mg/kg) podawano jedynie w dniu 2. Badany L-Glu-L-Trp podawano codziennie domięśniowo poczynając od dnia 1 po wstrzyknięciu nowotworu przez 5 kolejnych dni (czyli do dnia 6). L-Glu-L-Trp podawano w dawkach 125, 250, 500, 1000 i 2000 pg/kg. Ujemny środek kontrolny, roztwór soli podawano dootrzewnowo w taki sam sposób przez 5 dni. W przypadku każdej dawki i środka kontrolnego oceniano 10 myszy (20 nowotworów). Wyniki zestawiono w poniższej tabeli.

186 123

Tabela 3

Hamowanie neounaczyniania nowotworu płuc Lewisa

Nr grupy	Traktowanie	Ilość (gg/kg/dawkę)	Liczba naczyń (średnia ± S. D. ) *
1	-	0	19 ±6
2	Cytoxan	200	9 ±5*
3	L-Glu-L-Trpr	2000	17 ±7
4	1000	12 ±5*
5	500	9 ±4*
6	250	7 ±2*
7	125	6±3*

* Porównanie metodąwielokrotnego parowania według Studenta-Newmana-Keulsa; statystycznie różne od grupy 1 przy poziomie p < 0,05.

Wyniki wskazują wyraźnie statystycznie znaczące hamowanie neounaczyniania w wyniku użycia Cytoxanu lub L-Glu-L-Trp. W niższych dawkach L-Glu-L-Trp skuteczniej hamuje angiogenezę (grupy 4-7) niż w dawkach większych (grupa 3). Odwrotny profil reakcji na dawkę, to znaczy mniejsza aktywność przy większych dawkach, jest zgodny z uprzednio obserwowanym działaniem innych modyfikatorów reakcji biologicznej w takim teście (np. IFN-α lub IL-12) .

Wszystkie zastosowane terapie były dobrze tolerowane, tak że nie zaobserwowano spadków wagi lub przypadków padnięcia zwierząt.

Przykład 4. Działanie -przeciwnowotworoweL-Glu-L-Trp): mięsak 180

Wzrost nowotworu wymaga neounaczyniania. Działanie przeciwnowotworowe L-Glu-L-Trp zostało ocenione w niezależnej kontraktowej organizacji badawczej. Nowotwory w postaci mięsaka 180 (ATCC CCL-89 CCRF S-180-II) wywołano wstrzykując domięśniowo 2 x 10⁶ komórek w 0,1 ml w każdy bok myszy Swiss-Webster. Grupy składały się z 10 zwierząt (20 nowotworów). L-Glu-L-Trp podawano w pojedynczej 0,1 ml dawce w ilości 10, 75, 250 lub 1000 gg/kg. Wielkość nowotworu oceniano usuwając chirurgicznie i ważąc zaatakowaną kończynę oraz porównując jej masę z masą normalnych kontrolnych kończyn (bez nowotworów). Pierwszy zapobiegawczy tryb leczenia (PDR-1) obejmował 5 kolejnych codziennych iniekcji dootrzewnowych, rozpoczynających się w dniu -5 i kończących się w dniu -1. Drugi zapobiegawczy tryb leczenia (PDR-2) obejmował 5 kolejnych codziennych iniekcji domięśniowych w lewy tylny bok (miejsce nowotworu), rozpoczynających się w dniu -5 i kończących się w dniu -1. Komórki mięsaka 180 wstrzykiwano w dniu 0. W ujemnej próbie kontrolnej zastosowano 0,1 ml roztworu soli.

Tabela 4

Wpływ stosowania L-Glu-L-Trp na wielkość nowotworu, mięsaka 180

Grupa	Tryb podawania	Dawka	Masa nogi (g)	Średnia masa nowotworu a	Zmniejszenie procentowe masy nowotworu b
(gg/kg)	lewej	prawej	lewego	prawego
1	2	3	4	5	6	7	8	9
1A (normalna)	-	0	1,2 ±0,1	1,2 ±0,2	0	0	-	-
1B (nowotwór)	-	0	3,7 ± 0,6	3,5 ± 0,7	2,5	2,3	0	0

186 123 ciąg dalszy tabeli 4

1	2	3	4	5	6	7	8	9
2	PDR-1	10	4,2 ± 0,9	4,1 ±0,7	3,0	2,9	120	126
3	PDR-1	75	4,2 ± 0,8	4,2 ± 0,8	3,0	3,0	120	130
4	PDR-1	250	3,5 + 1,0	3,1 ±0,6	2,3	1,9	92	83
5	PDR-1	1000	2,5 ± 0,7	2,2 ± 0,5	1,3	1,0	52	43
6	PDR-2	10	3,6 ± 0,7	3,8 ± 0,7	2,4	2,6	96	113
7	PDR-2	75	3,6 ±0,7	3, 5 ± 0,3	2,4	3,3	96	143
8	PDR-2	250	3,0 ±0,1	2,3 ± 0,5	1,8	1,1	72	48
9	PDR-2	1000	2,4 ± 0,5	2,5 ± 0,5	1,2	1,3	48	57

a Średnia masa nowotworu = (średnia masa nogi traktowanej - średnia masa normalnej nogi kontrolnej) ^b Hamowanie = (masa nowotworu traktowanego/masa nowotworu kontrolnego) x 100%

Wyniki podane w tabeli 5 wskazują, że zapobiegawcze podawanie L-Glu-L-Trp dootrzewnowe lub domięśniowo w dawkach 250 i 1000 (ig/kg hamuje wzrost wywołanego następnie domięśniowo nowotworu. Należy podkreślić, że można wywołać układowe działanie hamujące przy miejscowym podawaniu domięśniowym, gdyż podawanie domięśniowe w lewy bok zahamowało następnie wzrost nowotworu w prawym boku (np. grupy 8 i 9). Uzyskane wyniki są zgodne z hamowaniem neounaczyniania zaobserwowanym w przykładach 2 i 3, powyżej.

186 123

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (21)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie dipeptydu L-Glu-L-Trp, cyklicznej postaci tego dipeptydu i liniowego lub cyklicznego polimeru tego dipeptydu o nie więcej niż 20 aminokwasach oraz ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli do wytwarzania leku do leczenia stanu patologicznego związanego z neounaczynieniem.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, dipeptydu L-Glu-L-Trp.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, w którym tym stanem jest naczyniak krwionośny.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, w którym tym stanem jest unaczyniony nowotwór złośliwy lub unaczyniony nowotwór łagodny.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, w którym tym stanem jest neounaczynienie w następstwie wyzdrowienia po udarze mózgowo-naczyniowym; neounaczynienie spowodowane urazem głowy; restenoza po plastyce naczyń; oraz neounaczynienie spowodowane urazem termicznym wysokotemperaturowym lub niskotemperaturowym.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, w którym tym stanem jest neounaczynienie związane z wywołanym przez substancję neounaczynieniem wątroby, angiogenna dysfunkcja związana z nadmiarem hormonu; neonaczyniowe następstwa cukrzycy; neonaczyniowe następstwa nadciśnienia lub przewlekłe zakażenie wątroby.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, w którym lek zawiera dipeptyd L-Glu-L-Trp lub jego pochodną ewentualnie w postaci soli w ilości odpowiadającej dawce od około 0,5 gg/kg masy ciała do około 1 mg/kg masy ciała.
8. 8. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, w którym lek zawiera dipeptyd L-Glu-L-Trp lub jego pochodną ewentualnie w postaci soli w ilości odpowiadającej dawce od około 1-50 gg/kg masy ciała.
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, w którym lek jest przeznaczony do podawania codziennie przez okres od 1 dnia do około 30 dni.
10. 10. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, w którym lek jest przeznaczony do podawania domięśniowego lub donosowego.
11. 11. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, w którym lek ma postać roztworu iniekcyjnego zawierającego 0,001 - 0,01% dipeptydu L-Glu-L-Trp lub jego pochodnej ewentualnie w postaci soli, a zwłaszcza L-Glu-L-Trp.
12. 12. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, w którym lek jest jednostkową postacią dawkowaną stanowiącą tabletkę, czopek, kapsułkę, błonę na oko, preparat do inhalacji, preparat do rozpylania na śluzówkę, krople do nosa, krople do oczu, pastę do zębów, maść lub krem z podłożem rozpuszczalnym w wodzie.
13. 13. Zastosowanie według zastrz. 12, w którym jednostkowa postać dawkowana zawiera zasadniczo 0,01 mg substancji czynnej.
14. 14. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, w którym lek jest przeznaczony do podawania wraz z lekiem naczyniowoczynnym.
15. 15. Zastosowanie według zastrz. 14, w którym lek jest przeznaczony do podawania wraz z lekiem naczyniowoczynnym stanowiącym inhibitor enzymu przekształcającego angiotensynę (ACE) lub otwieracz kanałów potasowych (PCO).
16. 16. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, w którym lek jest przeznaczony do podawania wraz ze środkiem chemioterapeutycznym.
17. 17. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, w którym lek jest przeznaczony do podawnia osobnikowi nieupośledzonemu odpomościowo.
18. 18. Zastosowanie według zastrz. 4, w którym nowotworem jest nowotwór opon, nowotwór wewnątrzmózgowy, mięsak, kostniakomięsak, nowotwór przełyku lub nowotwór tchawicy.

    186 123
19. 19. Zastosowanie według zastrz. 6, w którym neonaczyniowym następstwem cukrzycy jest środkowa surowicza chorioretynopatia.
20. 20. Zastosowanie według zastrz. 4, w którym nowotworem jest mięsak Lewisa.
21. 21. Zastosowanie według zastrz. 4, w którym nowotworem jest mięsak Kaposiego.

    * * *