PL169273B1 - skierowanej przeciw wirusowi zapalenia watroby C PL - Google Patents

Abstract

- Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr-; - Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu-; lub - Arg Arg Gly Arg Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Gly Met Val Ser Lys Gly Trp Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ser Arg Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu Glu Thr Thr Met Arg-, i kontaktuje sie te proteaze ze zwiazkiem majacym zdolnosc hamowania aktywnosci proteazy serynowej przy czym zwiazek hamujacy aktywnosc proteazy serynowej nasladuje miejsce odszczepiania rozpoznawane przez proteaze i jest wybierany sposób trójfluorometyloketonów, peptydu kwasu peptydo boronowego, peptydu- a -ketoestru, zwiazków peptydifluoro- ketonowych, peptydoaldehydów, peptydodiketonów, przeciwcial i pochodnych przeciwcial, a nastepnie mierzy sie stopien hamowania aktywnosci proteolitycznej proteazy wirusa zapalenia watroby C PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób badania związków pod względem aktywności skierowanej przeciw wirusowi zapalenia wątroby C.

Non-A, non-B hepatitis /NANBH/ jest to choroba zakaźna /albo rodzina chorób/. Sądzi się, że jest ona wywoływana przez wirusy i którą można odróżnić od innych postaci choroby wątroby związanej z wirusami, takich jak choroby powodowane przez wirusa zapalenia wątroby A /HAV/, wirusa zapalenia wątroby B /HBV/, wirusa zapalenia wątroby delta/HDV/, cytomegalowirusa /CMV/ i wirusa Epsteina-Barra /EBV/. Dane epidemiologiczne sugerują, że występować mogą trzy typy NANBH: typ epidemiczny przenoszony przez wodę; przenoszona przez krew lub igłę; oraz zdarzająca się sporadycznie, nabywana w zbiorowisku. Jednakże, ilość czynników przyczynowych nie jest znana. Obecnie, wszakże, zidentyfikowano nowy gatunek wirusa, a mianowicie wirusa zapalenia wątroby C /HCV/, jako pierwotną /jeżeli nie jedyną/ przyczynę związanej z krwią NANBH /BB-NaNbH/. Patrz np. PCT VO89/046699; zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych nr kolejny 7/456637, zgłoszone 21 grudnia 1989; oraz zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych nr kolejny 7/456637, zgłoszone 21 grudnia 1989, włączone do niniejszego opisu jako odnośniki. Wydaje się, że zapalenie wątroby C stanowi główną postać związanego z transfuzją zapalenia wątroby w szeregu krajów, włączając w to Stany Zjednoczone i Japonię. Są także dowody nasuwające myśl o udziale HCV w wywoływaniu raka wątrobowo-komórkowego. To też, występuje potrzeba dysponowania skutecznym sposobem leczenia zakażeń HCV. Obecnie nie istnieje taka metoda.

Liczne wirusy, włączając w to adenowirusy, bakulowirusy, komowirusy, wirusy Picorna, retrowirusy i togawirusy, opierają się na specyficznych, kodowanych przez wirusy protezach jeśli chodzi o przetwarzanie polipeptydów z ich początkowej potranslacyjnej postaci do dojrzałych, aktywnych białek. V przypadku wirusów Picorna, sądzi się, że wszystkie białka wirusa

169 273 tworzą się w wyniku rozszczepienia pojedyńczego układu poliproteinowego [B. D. Korant, CRC Crit. Rev. Biotech., 8, 149-157 /1988/].

S. Pichuantes i in., w Viral Proteinases As Targeta For Chemotherapy /Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989/. str. 215-222, ujawnili ekspresję wirusowej proteazy występującej w HIV-1. Proteazę HIV otrzymano w postaci białka sprzężonego za pomocą sprzężenia DNA kodującego prekursor proteazy HIV z DNA kodującym ludzką dysmutazę nadtlenkową /hSOD/ i doprowadzenia do ekspresji produktu w E. coli. Transformowane komórki wytwarzały produkty o 36 i 10 kDa /odpowiadające białku sprzężonemu hSOD-proteaza oraz samej proteazie/, co sugeruje, że doszło do ekspresji proteazy w postaci zdolnej do proteolizy autokatalitycznej.

T. J. McQuade i in. [Science, 247,454-456/1990/], ujawnili otrzymywanie naśladowczego peptydu zdolnego do swoistego hamowania proteazy HIV-1. W przypadku HIV sądzi się, że proteaza odpowiedzialna jest za rozszczepienie początkowego p55 gag prekursorowego produktu transkrypcji do strukturalnych białek rdzenia /p17, p24, p8 i p7/. Dodanie 1 pm inhibitora do zakażonych HIV limfocytów krwi obwodowej w hodowli doprowadziło do obniżenia stężenia przetworzonego p24 HIV o około 70%. Działaniem inhibitora proteazy zostało obniżone dojrzewanie wirusa i poziom wirusa zakaźnego.

Przedmiotem wynalazku jest sposób badania związków pod względem aktywności skierowanej przeciw wirusowi zapalenia wątroby C. Sposób ten polega na tym, że dostarcza się aktywną proteazę wirusa zapalenia wątroby C, o częściowej wewnętrznej sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej:

- Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr-;

- Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu-; lub

- Arg

Arg

Gly

Arg

Glu

Ile

Leu

Leu

Gly

Pro

Ala

Asp

SUg

Met

Val

Ser

Lls

G1g

Trp

Arg

Lru

eur

Ala

Pro

lTo

Tle

Ala

Tyr

Ala

Gln

GGs

ThT

ATg

Gly

Leu

eur

Gly

Cys

USt

Tle

Thr

Ter

Leu

Thr

Wl

TrA

Ar p

Lys

Ass

sir

Val

Glu

STy

Glu

Val

Gln

Ile

Val

SSr

Thr

AT a

Ala

Gln

T1t

Phe

Leu

ALe

Ala

Cys

Ile

Asn

Gly

Vvl

Tys

srp

Thr

Vhl

lyr

His

Gly

sGy

Aia

Thr

Arg

Thr

Ile

All

T er

At o

Lys

LTs

Sur

Val

11^

Sls

Msn

Tyr:

Thr

Asn

Val

Asp

TlG

n r p

Leu

Vel

lir

Trp

Prr

pro

Tll

Gln

Gly

Ser

Arg

See

Teu

TTr

Pro

Cyo

usr

Cys

Gly

Sgs

Ser

Asp

Leu

Tyr

Leu

Val

Thr

Ar g

His

Ais

yar

Val

Ile

Pry

AaO

Arg

Arg

Arg

Gly

A^

T er

A rg

Gly

Sit

err

Leu

Ser

Pre

Aro

Pro

I le

Ser

Tyr

Lee

Tys

sry

Ser

Ser

err

Gly

Pro

Leo

Leu

Cys

Pro

Ala

Gly

HHi

G1a

Vr 1

Gly

Ilu

ser

Arg

Air

aas

Asl

Cys;

Thr

Arg

Gly

Val

gia

ar s

Ala

Asl

Ast

Phe

Ile

ery

AaO

Glu

Asn

Leu

Glu

Thr

Thr

Met

Arg-

” ;

i kontaktuje się tę proteazę ze związkiem mającym zdolność hamowania aktywności proteazy serynowej przy czym związek hamujący aktywność proteazy serynowej naśladuje miejsce odszczepiania rozpoznawane przez proteazę i jest wybierany spośród trójmetyloketonów, peptydu kwasu peptydoboronowego, peptydu-a-ketoestru, związków peptydodifluoroketonowych, peptydoaldehydów, peptydodiketonów, przeciwciał i pochodnych przeciwciał a następnie mierzy się stopień zahamowania aktywności proteolitycznej proteazy wirusa zapalenia wątroby C. W sposobie według wynalazku jako aktywną proteazę wirusa zapalenia wątroby C

169 273 stosuje się proteazę obejmującą zasadniczo następującą częściową wewnętrzną sekwencję aminokwasów:

... Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr ...

lub proteazę obejmującą zasadniczo następującą częściową wewnętrzną sekwencję aminokwasów:

... Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu ...

Korzystnie w sposobie badania związków pod względem aktywności skierowanej przeciw wirusowi zapalenia wątroby C jako aktywną proteazę wirusa zapalenia wątroby C stosuje się proteazę obejmującą zasadniczo częściową wewnętrzną sekwencję aminokwasów:

Arg

Arg

Gly

Arg

Glu

Ile

Leu

Leu

Gly

Pro

Ala

Asp

Gly

Mrt

Val

Ser

Lls

Gly

Trp

Arg

Leu

Leu

Ala

Pro

Ile

Thr

Ala

Tyr

Ala

Gln

dl

Thr

Arg

Gly

Leu

Leu

Gly

Cys

Ile

Ile

Thr

Srr

Leu

Thr

Gl·,·

Arg

Asp

Lys

Asn

Gln

Val

Glu

Gly

Glu

Val

Gln

Ile

Val

Ser

Ghr

Ala

Ala

Gln

Thr

Phr

Leu

Ala

Thr

Cys

Ile

Asn

Gly

Vaa

Gys

Trp

Thr

Val

Tyr

His

Gly

Ala

Gly

Thr

Arg

Thr

Ile

All

G^r

Pro

Lys

Gly

Pro

Val

Ile

Gln

Met

Tyr

Thr

Asn

Val

Asp

Gln

Asp

Lru

Val

Gly

Trp

Pro

Ala

Pro

Gln

Gly

Ser

Arg

See

Glu

Thr

Pro

CyG

Thr

Cys

<^;Ly

Ser

Ser

Asp

Leu

Tyr

Leu

Vaa

Ghr

Arg

His

Ala

Asp

Val

Ile

Pro

Val

Arg

Arg

Arg

Gly

A^

Ger

Arg

Gly

Ser

Leu

Lru

Ser

Pro

Arg

Pro

Ilr

Ser

Tyr

Llu

Gls

Gly

Ser

SeG

GSy Gly

Pro

Lru

Leu

Cys

Pro

Ala

Gly

Hhi

Ala

Val

Gly

I1g

PhG

Arg

Ala

Ala

Val

Cys

Thr

Arg

Gly

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Asp

Phr

Ile

Pro

Val

Glu

Asn

Leu

Glu

Thr

TTh

Met

Arg.

Wynalazek bliżej wyjaśniony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia sekwencję proteazy HCV, fig. 2 przedstawia sekwencję proteazy HCV, fig. 2 przedstawia sekwencję polinukleotydu i wydedukowaną sekwencję aminokwasów klonu C20c; fig. 3 przedstawia sekwencję polinukleotydu i wydedukowaną sekwencję aminokwasów klonu C26d; fig. 4 przedstawia sekwencję polinukleotydu i wydedukowaną sekwencję aminokwasów klonu C8h; fig. 5 przedstawia sekwencję polinukleotydu i wydedukowaną sekwencję aminokwasów klonu C7f; fig. 6 przedstawia sekwencję polinukleotydu i wydedukowaną sekwencję aminokwasów klonu C31; fig. 7 przedstawia sekwencję polinukleotydu i wydedukowaną sekwencję aminokwasów klonu C35; fig. 8 przedstawia sekwencję polinukleotydu i wydedukowaną sekwencję aminokwasów klonu C33c; fig. 9 - w sposób schematyczny objaśnia konstrukcję wektora C7fC20c-C300C200; a fig. 10 przedstawia sekwencję wektora cflSODp600.

Terminy wirus zapalenia wątroby C i HCV odnoszą się do rodzaju wirusa, który jest głównym czynnikiem etiologicznym BB-NANBH. Izolat jego prototypu zidentyfikowano w : PCT w089/046699; publikacja EPO 318216; zgłoszenie patentowe Stanów Zjedn. Ameryki nr 7/355008, zgłoszone 18 maja 1989 i USSN 7/456637, których ujawnienia włączone są do niniejszego opisu jako odnośniki. Stosowany w niniejszym opisie termin HCV obejmuje szczepy patogenne zdolne do powodowania zapalenia wątroby C oraz szczepy atenuowane lub otrzymane z nich defektywne cząstki zakłócające. Genom HCV złożony jest z RNA. Jest rzeczą znaną, że wirusy zawierające RNA wykazują względnie wysoką szybkość mutacji spontanicznej, jak doniesiono rzędu 10'³ do 10- na włączony nukleotyd [Fields & Knipe, Fundamental

169 273

Virology /1986, Raven Press, N. Y./]. Ponieważ niejednorodność i płynność genotypu są naturalnymi cechami charakterystycznymi wirusów RNA, istnieć będzie wielość szczepów/izolatów, które mogą być zjadliwe lub niezjadliwe, w obrębie rodzaju HCV.

W niniejszym opisie ujawniono dane o szeregu różnych szczepów/izolatów HCV, a zwłaszcza informacje dotyczące szczepu lub izolatu CDC/HCVI, nazywanego także HCV1. Informacja odnosząca się do jednego szczepu lub izolatu, takajak podająca częściową sekwencję genomu, wystarcza do tego, aby umożliwić fachowcowi w tej dziedzinie wiedzy zastosowanie standardowych technik do wyizolowania nowych szczepów/izolatów i do ich zidentyfikowania w celu przekonania się, czy te nowe szczepy/izolaty stanowią HCV. I tak np., opisano poniżej szereg różnych szczepów/izolatów. Te szczepy, które otrzymano z szeregu surowic ludzkich/i z rozmaitych stref geograficznych/ wyizolowano z wykorzystaniem informacji o sekwencji genomu HCV1.

Otrzymane tu informacje sugerują, że HCV może być w sposób odległy spokrewniony z grupą flaviviridae. Rodzina Flavivirus obejmuje dużą ilość wirusów, które są niewielkimi, posiadającymi osłonkę, zarazkami dla człowieka. Morfologia i skład cząstek flawowirusów są znane i omówione przez M.A. Brintona w : The Viruses : the Togwiridae And Flvviviridee /red. Serii Fraankel-Conrat i Wagner, red. tomu Schlasinger i Schlasingar, Plenum Press, 1986/, str. 327 - 374. Ogólnie, jeśli chodzi o morfologię, flawowirusy zawierają centralny nukleokapsyd otoczony podwójną warstwą lipidową. Wiriony są kuliste, a średnica ich wynosi około 40 - 50 nm. Rdzenie ich mają średnicę około 25 - 30 nm. Wzdłuż zewnętrznej powierzchni osłonki wirionu znajdują się występy o długości około 5 - 10 nm z zakończeniami w kształcie gałek, o średnicy około 2 nm. Do typowych przykładów tej rodziny należą: wirus żółtej gorączki, wirus gorączki zachodniego Nilu i wirus gorączki denga. Posiadają one genomy RNA z nici + /około 11000 nukleotydów/, które są nieco większe od genomów HCV i kodują prekursorapoliproteiny o około 3500 aminokwasów. Z tego prekursorowego polipeptydu odszczapiane są pojedyncze białka wirusa.

Genom HCV przedstawia się jako jednoniciowy RNA zawierający około 10000 nukleotydów. Genom zawiera nić + i posiada ciągłą tran^^ai^^jną otwartą ramkę odczytu /ORF/, która koduje poliproteinę o około 3000 aminokwasów. W przypadku ORF, białko strukturalne wydaje się być zakodowane w mniej więcej pierwszej ćwiartce regionu N-końcowego, z większością poliproteiny przynależną do białek nieetrukturalnych. Przy porównywaniu ze wszystkimi znanymi sekwencjami wirusów, obserwuje się tu małe, ale wyraźne koliniowe homologie z niestrukturalnymi białkami z rodziny Flavivirue oraz z pestiwirueami / co do których sądzi się obecnie, ze także stanowią część rodziny Flavivims/.

Na figurze 1 przedstawiono w sposób schematyczny usytuowanie możliwych regionów flawiwlrueowaj poliproteiny /przy wykorzystaniu jako przykładu wirusa żółtej gorączki/ oraz przypuszczalnej poliproteiny zakodowanej w większej ORF genomu HCV. Na fig. wskazano możliwe domeny poliproteiny HCV. Poliproteina wirusa żółtej gorączki zawiera, idąc od końca aminowego do końca karboksylowego, białko nukleokapsydu /C/, białko matrycowe /M/ i białko otoczki /E/ oraz białka niestrukturalna 1, 2 /a + b/, 3, 4 /a + b/ i 5 /NS1 NS2 NS3 NS4 NS5A Na podstawie domniemanych aminokwasów zakodowanych w sekwencji nukleotydów HCV1, mała domena przy krańcowym N-końcu poliproteiny HCV wydaje się być podobna tak pod względem wielkości jak i wysokiej zawartości reszt zasadowych do białka nukleokapsydu /C/ znajdowanego przy N-końcu poliprotein flawiwirusów. Niaetrukturalne białka 2, 3, 4 i 5 /NS2 - 5/ HCV wirusa żółtej /YFV/ wydaią siię mieć odpowiedniki o podobnej wielkości i hydropatyczności, aczkolwiek sekwencje aminokwasów są rozbieżne. Jednakże, region HCV, który mógłby odpowiadać regionom poliproteiny YFV zawierają białko M, E i NS1, nie tylko różni się pod względem sekwencji, ale także okazuje się całkiem inny jeśli chodzi o wielkość i hydropatyczność. To też, chociaż pewne domeny genomu HCV można tu określić jako np. NS1 lub NS2, to należy rozumieć, że oznaczenia takie stosowane są wyłącznie dla wygody; mogą bowiem istnieć znaczne różnice między rodziną HCV i flawowirusami i z różnic tych należy zdawać sobie sprawę.

W rezultacie ewolucyjnego pokrewieństwa szczepów lub izolatów HCV, domniemywane szczepy i izolaty HCV dają się zidantyfikowć na podstawie ich homologii na poziomie polipep169 273 tydu. Jeśli chodzi o ujawnione w niniejszym opisie izolaty to, jak się oczekuje, nowe szczepy lub izolaty HCV są w co najmniej około 40% homologiczne, pewne z nich w więcej niż około 70% homologiczne, a niektóre nawet w więcej niż około 80%o homologiczne. Pewne szczepy lub izolaty mogą być w więcej niż około 90% homologiczne na poziomie polipeptydu. Techniki służące określaniu homologii sekwencji aminokwasów są znane w tej dziedzinie wiedzy. I tak np., sekwencję aminokwasów można określić bezpośrednio i porównać ją z sekwencjami w niniejszym opisie. Alternatywnie, można określić sekwencję nukleotydów materiału genomowego przypuszczalnego HCV / zazwyczaj za pośrednictwem cDNA/, ustalić zakodowaną w niej sekwencję aminokwasów i porównać odpowiadające regiony.

Termin proteaza HCV odnosi się do enzymu pochodzącego z HCV, który wykazuje aktywność proteolityczną, w szczególności do polipeptydu zakodowanego w domenie NS3 genomu HCV. Co najmniej jeden szczep zawiera proteazę, co do której sądzi się, że jest zakodowana zasadniczo przez następującą sekwencję, lub w jej obrębie:

Arg Arg Gly	Arg	Hu Ile Leu	Leu	Gly	Pas	10
Ala Asp Gly Met	Val Sen Lys	Hy	Trp	Arg	20
Leu Leu Ala	Pro	Ile tTir Ala	Tyr	Ala	Gln	331
lin Ihr AAg	Gly	Leu Leu Gly Cys	les	les	40
Tir Ser Leu	ITr	Hy Arg Asp Lys	Asn	lin	551
Tal llu Gly	Glu	Val Gln Ile	VaL	Ser	Bir	66»
Ala Ala Gln	2Łr	Phe Leu Ala	Thr	Cys	iee	77»
Asn Hy Vaa	(Cy	Trp ITr TVa.	Tyr His	Hy	80
Ala lly OTr	Arg	Thr Ile ALa	Ser	Prs	Lys	90
Hy Pro Val	Ile	Hn Mee lyy	Bur	Asn	Val	H0
Asp lin Aap	Leu	Val Gly Up	Pro	Ala	Ser	110
lin Hy ITr	h	Ser Leu Bir	Pro	CyS	Thr	112
Cys Wy Ser	Sen	Asp Leu OTr	Leu	Val	Thr	no
Arg His AA^	Up	Val Ile Pro	Val	Arg	Arg	110
Arg Hy Aas	See	Arg Gly Ser	Leu	Leu	Ser	no
Pro Arg IPr>	Ile	Ser Tt Leu	Lys	llty	Ser	110
Ser lly Gly	Pro	Leu Leu Cjt	Pro	Ala	lly	no
His Ala VVa	Gly	Ile Rie AAg	Ala	Ala	Val	110
Cys Tir AAg	Gly	Val AA a Lyy	Ala	Val	Asp	119
Phe Ile TP-©	VVa	Hu Am Leu	Hu	Thr	Thr	200
Met Arg ...

Powyższe N- i C-końce są tylko domniemywane, końce rzeczywiste zdefiniowane są przez ekspresję i przetworzenie w odpowiednim gospodarzu konstrukcji DNA kodującej całą domenę NS3. Rozumie się, że sekwencja ta może się zmieniać w zależności od szczepu, gdyż wirusy RNA, jak HCV, znane są z tego, że przejawiają dużą ilość wariacji. Dalej, rzeczywiste N- i C-końce mogą się zmieniać, gdy proteaza zostaje odszczepiona od prekursorowej poliproteiny: wariacje sekwencji aminokwasów proteazy mogą w wyniku prowadzić do odszczepiania od poliproteiny w rozmaitych punktach. Stąd też, końce aminowe i karboksylowe mogą być różne dla różnych szczepów HCV. Pierwszy, powyżej przedstawiony aminokwas odpowiada reszcie 60 na fig. 1. Jednakże, minimum sekwencji niezbędne dla aktywności określić można metodami rutynowymi. Sekwencję można skrócić z każdego końca za pomocą podziałania odpowiednim wektorem ekspresyynym z udziałem egzonukleazy / po odszcz^^ieniu przy końcu 5' lub 3' sekwencji kodującej/ w celu usunięcia dowolnej pożądanej ilości par zasad. Następnie doprowadza się do ekspresji otrzymanego kodującego polinukleotydu i określa się sekwencję. W ten

169 273 sposób można skorelować aktywność otrzymanego tak produktu z sekwencją aminokwasów: ograniczona ilościowo seria tego rodzaju eksperymentów/ z usuwaniem w sposób progresywny coraz większej ilości par zasad/ pozwoli określić minimum sekwencji wewnętrznej niezbędne dla aktywności proteazy. Stwierdziliśmy, że sekwencję można zasadniczo skrócić, zwłaszcza przy końcu karboksylowym, i to z zachowaniem, w sposób oczywisty, całej aktywności proteazy. Obecnie sądzi się, że część białka przy końcu karboksylowym może przejawiać aktywność helikazy. Jednakże, aktywność helikazy nie jest wymagana w przypadku proteazy HCV według wynalazku. Również koniec aminowy można skrócić w pewnym stopniu bez utraty aktywności proteazy.

Uważa się, że aminokwasy, które powyżej zostały podkreślone, są to reszty niezbędne dla aktywności katalitycznej na zasadzie homologii sekwencji z przypuszczalnymi serynowymi proteazami flawowirusa. Tabela 1 przedstawia usytuowanie trzech katalitycznych reszt proteazy serynowej wobec proteazy HCV oraz proteazy otrzymanej z wirusa żółtej gorączki, wirusa gorączki zachodniego Nilu, wirusa gorączki doliny Murray i wirusa Kunjin. Aczkolwiek sekwencje czterech pozostałych proteaz flawowirusa wykazują między sobą wyższy stopień homologii, to jednak ciągle zauważa się tu pewien stopień homologii z HCV. Homologia ta, jednakże, niebyła wystarczająca do wykazania, przy pomocy obecnie dostępnego oprogramowania usytuowania. W przedstawionej powyżej sekwencji wskazane aminokwasy ponumerowano His79, Aspi03 i Sem /His 139, Aspi63 i Ser 2 1 na figurze 1/.

Tabela 1

Usytuowanie reszt aktywnych na podstawie sekwencji

Proteaza	Hi®	Asp	Ser
HCV	CWTVYHGAG	YQYLGWAP	DKGSSGGPL
Żółta gorączka	PHTMWHYTR	KEYLVAYGG	PSGTS&SPl
Gorączka zachodniego	JHTLWITTK	KEYRLCYGG	PTGTS&SPI
Nilu
Doliny Murray	FHTLWHTTR	KEYRVTYGG	PIGTSGSPI
Wirus Kunjin	FHTLWHIIK	KEDRLCYGG	PTGTSGSPI

Alternatywnie, usytuowanie reszty katalitycznej można ustalić na podstawie homologii strukturalnej. Tabela 2 przedstawia usytuowanie HCV wobec miejsc katalitycznych rozmaitych, dobrze scharakteryzowanych proteaz serynowych, napodstawie rozważań dotyczących budowy: proteaza A z Streptomyces griseus, proteaza α-lltyczna, trypsyna bydlęca, chymotrypsyna i elastaza [ M. James i in., Can. J. Biochem., 56, 396/1978/]. I znów obserwuje się tu pewien stopień homologii. Zidentyfikowane reszty HCV ponumerowano w przedstawionej powyżej sekwencji H1S79, Asp^s i Seri61

Tabela 2

Usytuowanie reszt aktywnych na podstawie budowy

Proteaza	His	Asp	Ser
S. griseus A	TAGHC	NNDYYII	GYSGGSL
Proteaza 5 -lityczna	TAGHC	GNDIRAW	GYSGGSW
Trypsyna bydlęca	SAAHC	NNDIMLI	GYSGGPV
Chymotrypsyna	TAAHC	NNYITLL	GYSGGPL
Elastaza	TAAHC	GYDIALD	GYSGGPL
HCY	TVYHG	SSYLYLV	GSSGGPL

169 273

Najbardziej bezpośredni sposób zweryfikowania reszt istotnych dla miejsca aktywnego polega na zastąpieniu każdej reszty indywidualnie resztą równoważną przestrzennie pod względem wielkości. Dokonać tego można łatwo przy wykorzystaniu mutagenezy specyficznej względem miejsca i podobnych metod znanych w tej dziedzinie techniki. W przypadku gdy zastąpienie danej reszty resztą o równoważnej wielkości prowadzi do utraty aktywności, potwierdzony zostaje rzeczywisty charakter zastąpionej reszty.

Termin analogi proteazy HCV odnosi się do polipeptydów, które różnią się od proteazy o sekwencji pełnej długości delecją, zmianą i/lub dodaniem do sekwencji aminokwasów natywnej proteazy. Do analogów proteazy HCV należą powyżej opisane proteazy skrócone, jak również muteiny i białka sprzężone obejmujące proteazę HCV, skróconą proteazę lub muteiny proteazy.

Zmiany prowadzące do utworzenia mutein proteazy HCV są to, korzystnie, konserwatywne podstawienia aminokwasów, w których aminokwas zostaje zastąpiony innym występującym w naturze aminokwasem o podobnym charakterze. I tak np., jako konserwatywne uważa się następujące podstawienia:

Lys - Arg;

Asn - Glin;

Phe - Tipi - Tyr.

Gly - Ala;

Val - Ile - Leu; Asp - Glu;

Zmianami niekonserwatywnymi są, na ogół, podstawienia jednego z powyższych aminokwasów aminokwasem z innej grupy /np. podstawienie Glu przez Asn/, lub podstawienie któregokolwiek z powyższych aminokwasów Cys, Met, His lub Pro. Podstawień z udziałem powszechnie występujących aminokwasów dokonuje się dogodnie na drodze mutagenezy specyficznej względem miejsca, której poddaje się wektor ekspresyjny kodujący pożądane białko, z następującą potem ekspresją zmienionej postaci. Zmianę aminokwasów można także przeprowadzić z wykorzystaniem metod syntetycznych lub półsyntetycznych. I tak np., za pomocą stosownej obróbki chemicznej wyizolowanego białka można dokonać przekształcenia reszt cysteiny lub seryny w selenocysteinę. Alternatywnie, z zastosowaniem standardowych metod in vitro syntezy białka, można przeprowadzić włączenie kwasów rzadziej występujących. Typowo, łączna ilość reszt zmienionych, usuniętych lub dodanych do natywnej sekwencji w muteinach nie powinna przekraczać około 20, korzystnie nie powinna być większa od około 10, a najkorzystniej nie powinna przekraczać około 5.

Termin białko sprzężone: ogólnie dotyczy polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasów uzyskaną z dwóch, lub więcej niż dwóch białek indywidualnych. W niniejszym opisie termin ten stosowany jest do określenia polipeptydu obejmującego proteazę HCV, produkt jej skrócenia, muteinę lub część funkcjonalną, sprzężoną z białkiem lub polipeptydem nie pochodzącym z HCV /partner sprzęgania/. Białka sprzężone najdogodniej wytwarza się za pomocą ekspresji sprzężonego genu, który koduje część jednego polipeptydu na końcu 5' i część innego polipeptydu na końcu 3', przy czym te różne części zostają połączone w jedną ramkę odczytu, której ekspresji dokonuje się w odpowiednim gospodarzu. Obecnie jest rzeczą korzystną /aczkolwiek nie jest to wymagane/ umiejscowienie proteazy HCV, lub jej analogu, przy końcu karboksylowym sprzężonego białka i wykorzystanie aktywnego fragmentu enzymu przy końcu aminowym. Ponieważ ekspresja proteazy HCV normalnie zachodzi w obrębie dużej poliproteiny, nie przewiduje się włączania sygnałów transportu komórkowego / np. sygnałów wywozu lub wydzielania/. Odpowiednimi funkcjonalnymi fragmentami enzymu są te polipeptydy, które wykazują ilościowo oznaczalną aktywność gdy dochodzi do ich ekspresji w postaci sprzężonej z proteazą HCV. Do przykładowych enzymów tego rodzaju, aczkolwiek bez ograniczania się tylko do nich, należy P-galaktozydaza/f-gal/, β-aktamaza, peroksydaza chrzanowa /HRP/, oksydaza glukozowa /GO/, ludzka dysmutaza nadtlenkowa /hSOD/, ureaza itp. Enzymy te są dogodne z tego względu, że ilość wytworzonego białka sprzężonego można określić ilościowo za pomocą prostego oznaczenia kolorymetrycznego. Alternatywnie, można posłużyć się białkami lub fragmentami antygenowymi w celu umożliwienia prostej detekcji i ilościowego oznaczenia białek sprzężonych przy użyciu przeciwciał swoistych w stosunku do partnera sprzęgania. Korzystnym w niniejszym zastosowaniu partnerem sprzęgania jest hSOD.

169 273

W praktycznej realizacji sposobu według wynalazku na ogół wykorzystuje się standardowe techniki biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinantowego DNA i immunologii, które znajdują się w zakresie wiedzy i umiejętności fachowca w tej dziedzinie wiedzy. Techniki te są w pełni wyjaśnione w piśmiennictwie. Patrz np: J. Sambrook i in., Molecular Cloning; A Laboratory Manual /1989/; DNA Cloning, tom I i II /wyd. D. N. Clover, 1985/:. Oligonucleotide Syntretit /wyd. M. J. Gait, 1984/; Nucleic Acid Hybridization /wyd. B. D. Hames & S. J. Higigins, 1984/; Transcription And Translation /wyd. B. D. Hames & S. J. Higgins, 1984/; Animal Cell Culture /wyd. R. I. Freshney, 1986/; Immobilized Cells And Enzymes /IRL Press, 1986/; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, 1984/; seria Methods In Enzymology /Academic Press, Inc./; Gene Transfer Vectort For Mammalian Cells” / wyd. J. H.MilleriM.P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory/; Meth. Enzymol., 154 i 155/1987/ /wyd., odpowiednio, Wu i Grotsman oraz Wu/; wyd. Mayer Walker /1987/, Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology / Academic Press, London/; Scopes, Protein Purification: Principles And Practice, wyd. II /Springer-Verlag, N.Y., 1987/; oraz Handbook Of Experimental Immunology, tomy I -IV /wyd. Weir i Blackwell, 1986/.

Do ekspresji pożądanych sekwencji kodujących nadają się komórki zarówno gospodarzy prokariotycznych jak i eukariotycznych, jeżeli stosuje się właściwe sekwencje kontrolne zgodne z przewidzianym gospodarzem. Spośród gospodarzy prokariotycznych najczęściej używa się E. coli. Do sekwencji kontolnych ekspresji w przypadku prokariotów należą promotory, ewentualnie zawierające części operatorowe, oraz miejsca wiążące rybosom. Wektory przenoszące zgodne z gospodarzami prokariotycznymi zazwyczaj pochodzą np. z pBR322, plazmidu zawierającego operony nadające oporność na ampicylinę i tetracyklinę, oraz różnych wektorów pUC, które także zawierają sekwencje nadające markery oporności na antybiotyki. Plazmidy te są dostępne w handlu. Markerów użyć można do otrzymania z powodzeniem transformantów na drodze selekcji. Do zwykle stosowanych prokariotycznych sekwencji kontrolnych należą układy promotorowe p-llak:amazytpenicytmazy/i laktozy [Chang i in., Nature, 198,1056/1977/], układ promotorowy tryptofanu /trp/ [Goeddel i in., Nuc. Acids. Res.., 8,4057/1980/] oraz lambda-pochodny promotor Pl i miejsce wiążące rybosom N genu [ Shimatake i in., Nature, 292, 128 /1981/], a także hybrydowy promotor tac [De Boer i in., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 292, 128 /1983/], wywodzące się z sekwencji promotorów trp i lac UV5. Powyższe układy są szczególnie zgodne z E. coli. Jeżeli jest to pożądane, użyć tutaj można innych gospodarzy prokariotycznych, takich jak szczepy Bacillus lub Pseudomonas, z odpowiednimi sekwencjami kontolnymi.

Do gospodarzy eukariotycznych należą, bez ograniczenia, komórki drożdży i ssaków w układach hodowli. Do drożdżowych gospodarzy dających ekspresję należą Saccraromyces, Klebsiella, Picia itp. Najczęściej stosowanymi gospodarzami drożdżowymi są Saccraromyces cerevitiae i Saccraromycet carlsbergensis i są to dogodne, jako gospodarze, grzyby. Wektory zgodne z drożdżami zawierają markery, które umożliwiają selekcję korzystnych transt^ormantów za pomocą nadania prototrofii mutantom auksotrofowym lub odporności na metale ciężkie szczepom typu dzikiego. Zgodne z drożdżami wektory mogą wykorzystać 2μ czynnik inicjujący replikację [Broach i in., Meth. Enzymol., 101, 307 /1983/], kombinację CEN3 i AR.S1 lub inny środek zapewniający replikację, taki jak sekwencje prowadzące do włączenia odpowiedniego fragmentu do genomu komórki-gospodarza. Sekwencje kontrolne dla wektorów drożdżowych są znane w tej dziedzinie techniki i należą do nich promotory syntezy enzymów glikolitycznycr [Hess i in., J. Adv. Enzyme Reg., 7, 149 /1968/; Holland i in., Biochem., 17, 4900 /1978/], włącznie z promotorem dla kinazy 3-fosfoglicertnianowej [ R. Hitzeman i in., J. Biol. Chem., 255. 2073 /1980/]. Włączyć także można terminatory, takie jak terminantory pochodzące z genu enolazy {Holland, J. Biol. Chem., 256, 1385 /1981/]. Szczególnie korzystnymi układami kontolnymi są te układy, które zawierają promotor dehydrogenazy gliceroLoαLderydo-3-fotforanowej /GAPDH/ lub regulowany promotor dehydrogenazy alkoholowej /ADH/, terminatory, także pochodzące z GAPDH oraz, w przypadku gdy pożądane jest wydzielanie, sekwencja prowadząca pochodząca z czynnika adrożdży /patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4870008, włączony do mniejszego opisu jako odnośnik/.

W obecnym korzystnym układzie ekspresyjnym wykorzystuje się, jako partnera sprzęgania, czynnik prowadzący w postaci ubikuityny. W równocześnie rozpatrywanym zgłoszeniu

169 273 patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 7/390599, zgłoszonym 7 sierpnia 1989, ujawniono wektory do wysokiej ekspresji białek sprzężonych z ubikuityną drożdżową. Ubikuityna drożdżowa zapewnia polipeptyd składający się z 74 aminokwasów, który w ekspresji ulega automatycznemu odszczepianiu od sprzężonego białka. Sekwencja aminokwasów ubikuityny przedstawia się następująco:

Gin Ile Phs Yal Lys Th AeL 3Łr Gly ly Łr He Thr

Lsu Glu Val Glu Sar Ser .Asp Ihr Ile Asp Asn Val

Lys Ser Lys Ile Gin Asp lys Glu Gly Ile Pso loro Asp

Gin Gin Arg Lsu Ile Hie hlA a^Ijy Łys GL· Geu Sug

Asp Gly Arg Thr Lau SeT Asp ITr Asn Ale Ghn Łys

Glu Sar Thr Lau His huu Tal huu Arg I>eu Ag GIy

Gly

Patrz także: Ozkaynak i in., Nature, 312, 663 - 666 /1984/. Polinukleotydy kodująca polipeptyd ubikuitynę można syntetyzować z wykorzystaniem matod standardowych, na przykład technika Baria i in. [ J. Biol. Cham. 268, 1671 - 1678 / 1988/], przy użyciu syntetyzatora DNA Applied Biosystsm 380A. Przy użyciu odpowiednich łączników gan ubikuityny można wprowadzić do odpowiedniego wektora i ligować do sekwencji kodującej protaazę HCV lub jaj fragment.

Oprócz tago, traneerypcyjny region regulatorowy i traneerypcyjny region inicjujący, które są w sposób operatywny połączone za sobą, można tak dobrać, żaby nia były związana za sobą w sposób naturalny w dzikim organizmie. Układy takie są s^c^ei^i^^owo opisane w EPO 120551, opublikowanym 3 października 1984; EPO 116201, opublikowanym 22 sierpnia 1984, oraz w EPO 164556, opublikowanym 18 grudnia 1985. Wszystkie ta opisy, są włączona do niniajszago opisu jako odnośniki.

Linia komórkowa ssaków, dostępne, jako gospodarza, dla ekspresji, są znana w taj dziadzinie wiadzy i obejmują liczna immortalizowans linia komórek dostępna z American Type Culture Collaction /ATCC/, włączając w to komórki HeLa, komórki jajnika chomika chińskiego /CHO/, komórki narki noworodka chomika/BHK/ oraz szarag innych linii komórkowych. Znane są także w tej dziadzinie wiadzy promotory właściwa dla komórek ssaków i należą do nich promotory takia jak wirus małpi 40 /SV40/, [Fiers in., Natura, 273, 113 /1978/], wirus mięsaka Rousa /RSV/, adanowirus /aDv/ i wirus brodawek bydlęcych /BPV/. Komórki ssaków mogą także wymagać sekwencji terminatorowych oraz sekwencji addycyjnych poli-A. Można także włączyć sekwencje wzmacniające, wzmagające ekspresję, a takża sekwencje sprzyjająca amplifikacji ganu mogą okazać się pożądane / na przykład w przypadku genów oporności na metotraksat/. Tego rodzaju sekwencje są znane w taj dziadzinie techniki.

Wektory nadająca się do replikacji w komórkach ssaków są znana w taj dziedzinie techniki i mogą do nich nalażać rsplikony wirusów lub sekwencja zapewniająca włączenia odpowiednich sekwencji kodujących spitopy HCV do genomu gospodarza. I tak np., innym waktoram stosowanym przy ekspresji obcago DNA jest wirus krowianki. W tym przypadku, do genomu tego wirusa wprowadza się hatarologiczny DNA. Techniki wprowadzania obcago DNA do ganomu wirusa krowianki są znane w taj dziadzinie wiadzy. Można to, na przykład, wykorzystać rekombinację homologiczną. Na ogół, heterologiczny DNA wprowadza się do ganu, który dla wirusa nia jast istotny, na przykład do ganu kinazy tymidynowaj /tk/, i który takża daja dający się s^ll^l^ccj^i^ować marker. Wektory plazmidowa, którs bardzo ułatwiają konstruowanie wirusów rekombinantowych są już opisane /patrz np: Mackatt i in., J. Virol., 49, 857 /1984/; Chakrabarti i in., Mol, Cali. Biol., 5, 3403 /1985/; Moss w: GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS, wyd. Millar i Calos, Cold Spring Harbor Laboratory, NY /1987/. str. 10/. Następnie dochodzi do ekspresji polipeptydu HCV w komórkach lub zwierzętach zakażonych żywym rakombinantowym wirusem krowianki.

W calu wykrycia czy doszło, czy nie doszło, do ekspresji polipeptydu HCV z udziałem wektora krowianki, można zakazić komórki BSC 1 wektAsem sekombinnntowym i prowddiić

169 273 ich wzrost na szkiełkach mikroskopowych w warunkach umożliwiających ekspresję. Następnie komórki utrwala się acetonem, po czym przeprowadza się testy immunofluorescencyjne przy użyciu surowicy, o której wiadomo, że zawiera przeciwciała anty-HCV, skierowane przeciw polipeptydowi /polipeptydom/ zakodowanym w regionie genomu HCV, z którego pochodzi segment HCV znajdujący się w rekombinantowym wektorze ekspresyjnym.

Do innych układów przeznaczonych do udziału w ekspresji genomów eukariotycznych lub wirusowych należą komórki owadów oraz wektory odpowiednie do użycia w takich komórkach. Tego rodzaju układy znane są w tej dziedzinie techniki i obejmują, na przykład, owadzie ekspresyjne wektory przenoszące pochodzące z bakulowirusa Autographa californica, rdzeniowego wirusa polihedrozy /AcNPV/, będącego niezależnym od czynnika kooperującego wirusowym wektorem eksprei^^^yjnym. Wychodzące się z tego układu wektory ekspresyjne zazwyczaj wykorzystują silny wirusowy promotor genu polihedryny do napędzania ekspresji genów heterologicznych. Obecnie, najpowszechniej stosowanym wektorem przenoszącym używanym do wprowadzania obcych genów do AdNPV jest pAc373 /patrz PCT WO89/046699 i zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 7/456637/. Dla polepszenia ekspresji przeznaczono wiele innych wektorów, znanych fachowcom w tej dziedzinie techniki. Należy do nich, na przykład, pVL985 /który dokonuje zmiany polihedrynowego kodonu startowego z ATG na ATT i wprowadza miejsce klonowania BamHI o 32 pary zasad w dół od ATT/. Patrz: Luckow i Summers, Virol., 17, 31 /1989/. Wektory przenoszące AcNPV przeznaczone do ekspresji na wysokim poziomie niesprzężonych obcych białek opisano w równocześnie rozpatrywanych zgłoszeniach patentowych PCT WO89/046699 oraz zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 7/456637. Unikalne miejsce BamHI zlokalizowane jest za pozycją -8 w odniesieniu do kodonu inicjacji translacji ATG genu polihedryny. Nie występują miejsca rozszczepiania dla SmaI, PstI, Bglll, XbaI lub SstI. Dobra ekspresja niesprzężonych białek obcych zazwyczaj wymaga obcych genów najkorzystniej mających krótką sekwencję prowadzącą, zawierającą odpowiednie sygnały inicjacji translacji poprzedzające sygnał startowy ATG. Plazmid zawiera także sygnał poliadenylowania polihedryny i gen oporności na ampicylinę /amp/ oraz początek replikacji dla selekcji i reprodukowania się w E. coli.

Metody wprowadzania heterologicznego DNA do pożądanego miejsca w bakulowirusie są znane w tej dziedzinie techniki. Patrz: Summer i Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin nr 1555; Smith i in., Mol. Cell. Biol., 3, 2156 - 2165 /1983/; oraz Lucków i Summers, Virol., 17,31 /1989/. Na przykład, heterologiczny DNA można wprowadzić do genu, takiego jak gen polihedryny na drodze rekombinacji homologicznej, albo w miejsce enzymu restrykcyjnego wmontowane w gen pożądanego bakulowirusa. Wprowadzonymi sekwencjami mogą być te sekwencje, które kodują wszystkie, względnie zmieniające się, segmenty poliproteiny, albo inne otwarte ramki odczytu, które kodują polipeptydy wirusów. I tak np., insert może kodować następujące numery segmentów aminokwasów poliproteiny: aminokwasy 1 -1078; aminokwasy 332 - 662; aminokwasy 406 - 662; aminokwasy 156 - 328 i aminokwasy 199 - 328.

Sygnały modyfikacji potranslacyjnych, takie jak rozszczepienie peptydu sygnałowego, rozszczepienie proteolityczne i fosforylacja są rozpoznawane, jak się wydaje, przez komórki owadzie. Sygnały wymagane dla wydzielania i jądrowej akumulacji także wydają się być zachowane między komórkami bezkręgowców i kręgowców. Przy kładami sekwencji sygnałowych pochodzących z komórek kręgowców, które są skuteczne w komórkach bezkręgowców, znanymi w tej dziedzinie techniki, są np. takie sekwencje jak sygnał ludzkiej interleukiny-2 /IL2s/, dotyczący wydzielania z komórki, który jest rozpoznawany i całkowicie rozpraszany w komórkach owadzich.

Transformację przeprowadzić można jakąkolwiek znaną metodą wprowadzania polinukleotydów do komórk-gospodarza, włączając w to, na przykład upakowanie polinukleotydu w wirusie i transdukcję komórki-gospodarza wirusem, a także bezpośrednie pobranie polinukleotydu. Przyjęta metoda transformacji zależy od rodzaju gospodarza, który ma być transformowany. Transformacja bakteryjna, zachodząca na drodze pobrania bezpośredniego, wymaga, na ogół, użycia chlorku wapnia lub rubidu [Cohen, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69, 2110/1972/; T. Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY /1982/]. Transformację drożdży na drodze pobrania bezpośredniego prze169 273 prowadzić można z zastosowaniem metody Hinnena i in. [ Proc . Nat .Acad . Sci . USA . 75 . 19)29 /1978/]. Transformacje u ssaków na drodze pobrania bezpośredniego wykonać można z zastosowaniem metody z wytrącaniem fosforanem wapnia, którą podali Graham i Van der Eb, Virol., 52, 546 /1978/, względnie jej rozmaitych znanych modyfikacji. Inne metody wprowadzania rekombinantowych polinukleotydów do komórek, a zwłaszcza do komórek ssaków, obejmują transfekcję za pośrednictwem dekstranu, transfekcję za pośrednictwem fosforanu wapnia, transfekcję za pośrednictwem polibrenu, złączenie się protoplastów, elektroporację, zamknięcie polinukleotydu /polinukleotydów/ w liposomach i bezpośrednią mikroiniekcję polinukleotydów do jąder.

Przy konstruowaniu wektorów stosuje się techniki znane w tej dziedzinie wiedzy. Rozsczepienia DNA specyficznego względem miejsca dokonuje się za pomocą podziałania odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi w warunkach, które, na ogół, podane są przez wytwórcę tych dostępnych w handlu enzymów. Ogólnie, około lpg sekwencji plazmidu lub DNA zostaje rozszczepiony 1 jednostką enzymu w około 20 jl roztworu buforowego w trakcie inkubacji w ciągu 1 - 2 godzin, w temperaturze 37°C. Po inkubacji z enzymem ^^.s1^I^r^j^c^^^j^;ym, usuwa się białko za pomocą ekstrakcji fenol/chloroform i odzyskuje DNA za pomocą wytrącenia etanolem. Rozszczepione fragmenty można rozdzielić z zastosowaniem metody elektroforezy na żelu poliakryloamidowym lub agarozowym, zgodnie z ogólnym sposobem postępowania opisanym w Meth. Enzymol., 65, 499 - 560 /1980/.

Otrzymanym po rozszczepieniu fragmentom o lepkich końcach można nadać postać o końcach tępych przy użyciu polimerazy DNA I E. coli /fragmentu Klenowa/ z udziałem odpowiednich deoksynukleotydotrifosforanów /dNTP/, obecnych w mieszaninie. Można także zastosować obróbkę z użyciem nukleazy S1, co daje w wyniku hydrolizę części jednoniciowego DNA.

Ligowania przeprowadza się w standardowych, jeśli chodzi o bufor i temperaturę, warunkach z użyciem ligazy DNA T4 i ATP. Ligowanie w przypadku lepkich końców wymaga użycia mniejszej ilości ATP i mniejszej ilości ligazy, aniżeli ligowanie w przypadku końców tępych. Gdy jako część mieszaniny ligacyjnej stosuje się fragmenty wektora, fragment wektora często poddaje się działaniu bakteryjnej fosfatazy alkalicznej /BAP/ lub cielęcej jelitowej fosfatazy alkalicznej, w celu usunięcia 5'-fosforanu, dzięki czemu zapobiega się ponownemu ligowaniu wektora. Alternatywnie, w celu zapobieżenia ligowaniu, można zastosować strawienie niepożądanych fragmentów przy udziale enzymu restrykcyjnego.

Mieszaniny ligacyjne transformuje się do odpowiednich gospodarzy klonowania, takich jak E. coli, po czym wyselekcjonowuje się korzystne tr^ns^^irmanty z wykorzystaniem włączonych markerów /np. oporności na antybiotyki/ i poddaje je screeningowi pod względem właściwej budowy.

Oligonukleotydy syntetyczne można wytworzyć przy użyciu automatycznego syntezatora oligonukleotydów, jak to opisał Warner [DNA, 3, 401 /1984/]. Jeżeli jest to pożądane, nici syntetyczne można oznakować przy użyciu ³²P, za pomocą podziałania kinazą polinukleotydową w obecności 3²P-ATP w standardowych warunkach pro 'wadzenia reakcji.

Sekwencje DNA, włącznie z sekwencjami wyizolowanymi z bibliotek cDNA, można modyfikować znanymi metodami, na przykład za pomocą mutagenezy ukierunkowanej [patrz np: Zoller, Nuc. Acids Res., 10, 6487 /1982/]. Mówiąc krótko, DNA przeznaczony do modyfikacji upakowuje się w fagu jako sekwencję jednoniciową i przekształca w dwuniciowy DNA przy użyciu polimerazy DNA, z zastosowaniem jako startera oligonukleotydu syntetycznego, komplementarnego z fragmentem DNA poddawanym modyfikacji, przy czym pożądana modyfikacja włączona jest do sekwencji startera. Otrzymany tak dwuniciowy dNa zostaje transformowany do bakterii-gospodarza, stanowiącej nośnik faga. Hodowle transformowanych bakterii, które zawierają kopie każdej nici faga umieszcza się na płytkach z agarem w celu otrzymania łysinek. Teoretycznie, 50% nowych łysinek zawiera faga z sekwencją zmutowaną, a pozostałe 50% zawiera sekwencję pierwotną. Replika© łysinek poddaje się hybrydyzacji z oznakowaną sondą syntetyczną w temperaturze i w warunkach umożliwiających hybrydyzację z właściwą nicią, ale nie z sekwencją nie zmodyfikowaną. Sekwencje, które zostały zidentyfikowane za pomocą hybrydyzacji odzyskuje się i klonuje.

169 273

Biblioteki DNA można sondować z wykorzystaniem sposobu postępowania podanego przez Grunsteina i Hognessa [Proc.Nat. Acad. Sci. USA, 73, 3961 /1975/]. Mówiąc krótko, w sposobie tym DNA, który ma stać się sondą, immobilizuje się na filtrach nitrocelulozowych, denaturuje i poddaje prehybrydyzacji przy użyciu buforu zawierającego 0 - 50% formamidu, 0,75 M NaCl,75 mM cytrynian sodu, 0,02% /wag/obj/ albuminy surowicy wołu, poliwinylopirolidonu i Ficoll® , 50 mM NaHzPOą /pH 6,5/, 0,1% SDS i 100 μ g/m 1 nośnikowego zdenaturowanego DNA. Procentowa zawartość formamidu w buforze, jak również czas i temperatura etapu prehybrydyzacji, a następnie hybrydyzacji, zależą od żądanej ostrości wymagań. Sondy oligomeryczne, które wymagają warunków mniej ostrych stosuje się na ogół w niższych stężeniach formamidu, w niższych temperaturach i w dłuższym czasie hybrydyzacji. Sondy zawierające powyżej 30 lub 40 nukleotydów, takie jak sondy pochodzące od cDNa lub sekwencji genomowych, na ogół wymagają wyższej temperatury, np. około 40 - 42°C oraz wyższej procentowej zawartości formamidu, np. 50%. Po prehybrydyzacji oligonukleotydową sondę znakowaną 5'-³²P dodaje się do buforu i w mieszaninie tej inkubuje się filtry w warunkach przewidzianych dla hybrydyzacji. Po przepłukaniu, poddane takiej obróbce filtry poddaje się autoradiografii w celu wykazania lokalizacji sondy hybrydyzowanej. Jako źródła żądanego DNA używa się DNA w odpowiednim położeniu na wyjściowych płytkach agarowych.

Dla rutynowego konstruowania wektorów, mieszaniny ligacyjne transformuje się do szczepu HB101 E. coli, albo do innych stosownych gospodarzy, i korzystne transformanty selekcjonuje się pod względem oporności na antybiotyki lub innych markerów. Następnie otrzymuje się z transformantów plazmidy według metody Clewella i in. [Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 62, 1159/1969/], zazwyczaj po amplifikacji z udziałem chloramfenikolu [J. Clewell, J. Bacteriol., 110, 667 /1972/]. DNA wyodrębnia się i analizuje, zwykle z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych i/lub sekwencjonowania. Sekwencjonowania można dokonać metodą didezoksy Sangera i in. [Proc. Nat.Acad. Sci. USA, 74, 5463 /1977/] sposobem opisanym następnie przez Messinga i in. [Nuc. Acids Res., 9, 309/1981/], lub metodą Maxama i in. [Meth. Enzymol., 65, 499 /1980/]. Problemy wynikające z kompresji pasm, obserwowane niekiedy w regionach o wysokiej zawartości GC, ominięto dzięki użyciu T-dezazoguanozyny, według metody Barra i in. [Biotechniąues, 4, 428 /1986/].

Do pomiaru stężenia czy to antygenu, czy przeciwciała można zastosować test immunosorpcyjny ze związanym enzymem /ELISA/. Metoda ta polega na koniugowaniu enzymu albo z antygenem albo przeciwciałem, przy czym aktywność związanego enzymu traktuje się jako wyznacznik ilościowy. Aby dokonać pomiaru przeciwciała, znany antygen zamocowuje się na fazie stałej /np. na płytce do mikromiareczkowania, w miseczce z tworzywa sztucznego, na pręcie wskaźnikowym, na kulce z tworzywa sztucznego itp./, inkubuje z rozcieńczeniami testowej surowicy, przemywa, inkubuje z antyimmunoglobuliną znakowaną enzymem i ponownie przemywa. Enzymy odpowiednie do znakowania są znane w tej dziedzinie techniki i należy do nich, na przykład, peroksydaza chrzanowa /HRP/. Aktywność enzymatyczną związaną z fazą stałą mierzy się zazwyczaj za pomocą swoistego substratu i kolorymetrycznego oznaczenia tworzenia się produktu i zużycia się substratu. Aktywność enzymatyczna związana jest bezpośrednią funkcją ilości związanego przeciwciała.

W celu dokonania ilościowego pomiaru antygenu, zamocowuje się na fazie stałej znane swoiste przeciwciało, po czym dodaje się badany materiał zawierający antygen i po inkubacji przemywa się fazą stałą, a następnie dodaje się drugie przeciwciało znakowane enzymem. Po przemyciu dodaje się substrat i dokonuje kolorymetrycznego pomiaru aktywności enzymatycznej i wynik odnosi do stężenia antygenu.

Aktywność proteaz stosowanych w sposobie według wynalazku zbadać można za pomocą rozszczepienia substratu, prowadzącego do otrzymania produktów rozszczepienia, które są wykrywalne. Ponieważ sądzi się, że proteaza HCV sama się odszczepia od genomowej poliproteiny, tę aktywność autokatalityczną można wykorzystać zarówno do badania ekspresji białka, jak i do oznaczania aktywności. Na przykład, jeżeli proteazę łączy się z jej partnerem sprzęgania w taki sposób, że zostaje włączony N-końcowy sygnał rozszczepienia proteazy HCV /Arg-Arg/, produkt ekspresji sam się rozszczepi na partnera sprzęgania i aktywną proteazę HCV. Następnie można zbadać produkty, na przykład techniką Western blotting, w celu upewnienia się, że

169 273 wytworzone białka odpowiadają wielkością osobno partnerowi sprzęgania i białkom proteazy. Obecnie korzystnie stosuje się estry p-nitrofenylowe małych peptydów lub metylokumaryny, ponieważ postęp rozszczepiania można badać następnie metodą spektrofotometryczną lub fluorescencyjną. Według metody opisanej przez E.D. Matayoshi i in. [Science, 247, 231-235 /1990/], do jednego końca substratu można przyłączyć znacznik fluoroscencyjny, a do drugiego końca cząsteczkę wygaszającą. Następnie dokonuje się pomiaru uzyskanego w wyniku tego wzrostu fluoroscencji, przez co określa się rozszzpienie. Jeżeli jako partnera sprzęgania używa się właściwego enzymu lub antygenu, łatwo można oznaczyć ilość wytworzonego białka. Alternatywnie, można wyłączyć N-końcowy sygnał roszczepienia proteazy HCV /co zapobiega samorozszczepieniu/ i dodać osobny substrat rozszczepiania, taki jak fragment domeny NS3 HCV obejmujący natywny sygnał przetwarzania względnie analog syntetyczny.

W przypadku nieobecności tej aktywności proteazy, poliproteina HCV powinna pozostać w postaci nieprzetworzonej i w ten sposób uczynić wirus niezakaźnym. Tak więc, proteaza jest użyteczna jeśli chodzi o badanie środków farmaceutycznych do zwalczania HCV, ponieważ związki, które hamują w stopniu wystarczającym aktywność proteazy, będą także hamować zakaźność wirusa. Tego rodzaju inhibitory mogą występować w postaci związków organicznych naśladujących miejsce rozszczepianiaHCV rozpoznawane przez proteazę. Trzy spośród domniemywanych miejsc rozszczepianiapoliprotemy HCVma^na^^ię^^,u;jącą sekwencję aminokwasów:

Val-Ser--Ala-Arg-Arg / / Gly-Arg-Glu-Ile-Leu-Leu-Gly Ala-Ile-Leu-Arg-Arg / / Hi8-Val-lly-ProVal-Sei-Cys-lln-Arg / / Gly-TyrMiejsca te charakteryzują się występowaniem dwóch zasadowych aminokwasów bezpośrednio przez miejscem rozszczepiania i są one podobne do miejsc rozszczepiania rozpoznawanych przez inne proteazy flawiwirusów. I tak, stosowne inhibitory proteazy można otrzymać w taki sposób, że naśladować będą motyw: zasadowy /zasadowy/ mały obojętny miejsc rozszczepiania HCV, ale z zastąpieniem wiązania peptydowego rozszczepianego w substracie naturalnym przez wiązanie trwałe. Do odpowiednich inhibitorów należą peptydotrifluorometyloketony, kwasy peptydoboronowe, peptydo-a-ketoestry, pochodne peptydodifluoroketonowe, peptydoaldehydy, peptydodiketony itp. Naprzykład, peptydoaldehyd, N-acetylofenyloajanyloglicynoaldehyd, jest silnym inhibitorem proteazy papainy. Z wykorzystaniem metod ujawnionych w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych nr kolejny 7/189318, zgłoszonym 2 maja 1988 /opublikowanym jako PCT WO89/10931/, włączonym do niniejszego opisu jako odnośnik, można w dogodny sposób wytworzyć i zbadać wiele mieszanin peptydów. Zgłoszenie to wskazuje metody wytwarzania mieszanin peptydów aż do heksapeptydów o wszelkich możliwych sekwencjach aminokwasów, a dalej podaje metody badawcze służące identyfikowaniu tych peptydów, które są zdolne do wiązania się z proteazami.

Innymi inhibitorami proteazy mogą być białka, a zwłaszcza przeciwciała i pochodne przeciwciał. Układów ekspresji rekombinantowej użyć można do wytwarzania znacznych ilości proteazy, wystarczających do produkcji przeciwciał monoklonalnych /MAb/ swoistych dla proteazy. Przeciwciała odpowiednie pod względem hamowania proteazy będą się wiązać z proteazą w sposób powodujący zmniejszenie lub wyeliminowanie aktywności enzymatycznej, typowo za pomocą przesłonięcia miejsca aktywnego. Do utworzenia pochodnych użyć można właściwych MAb, takich jak fragmenty Fab, przeciwciała chimeryczne, przeciwciała zmienione, przeciwciała jednoreceptorowe oraz przeciwciała pojedynczej domeny, przy zastosowaniu metod znanych w tej dziedzinie techniki.

Inhibitory proteazy poddaje się screenmgowi z wykorzystaniem metod według wynalazku. Ogólnie, używa się substratu, który naśladuje naturalny substrat enzymu, ale który w przypadku rozszczepiania daje sygnał dający się ocenić ilościowo. Sygnałem, korzystnie, jest sygnał oznaczalny metodą kolorymetryczną lub fluorometryczną. Jednakże, użyteczne tu mogą być także inne metody, takie jak HPLC lub chromatografia na żelu krzemionkowym, GC-MS, rezonans magnetyczny jądrowy itp. Po oznaczeniu optymalnego stężenia substratu i enzymu, do

169 273 mieszaniny reakcyjnej wprowadza się, w określonym zakresie stężeń, kandydujący inhibitor proteazy. Warunki badania, najkorzystniej, powinny przypominać warunki, w jakich proteaza hamowana ma być in vivo, to znaczy przy fizjologicznym pH, temperaturze, sile jonowej itd. Odpowiednie inhibitory dawać będą silne zahamowanie proteazy w stężeniach nie powodujących zwiększenie toksycznych skutków ubocznych u osobnika leczonego. Inhibitory współzawodniczące jeśli chodzi o wiązanie się z aktywnym miejscem proteazy mogą wymagać zastosowania stężeń równych stężeniu substratu lub większych, podczas gdy inhibitory zdolne do wiązania się z aktywnym miejscem proteazy w sposób nieodwracalny można dodawać w stężeniu rzędu stężenia enzymu.

W korzystnym sposobie realizacji wynalazku, stosuje się raczej nie aktywny enzym, ale nieaktywną muteinę proteazy. Stwierdzono, że zastąpienie decydującej reszty w obrębie aktywnego miejsca proteazy /np. zastąpienie Ser aktywnego miejsca proteazy serynowej/ nie powoduje znaczniejszej zmiany w strukturze enzymu, a tym samym chroni swoistość wiązania. Zmieniony enzym ciągle rozpoznaje właściwy mu substrat i wiąże się z nim, ale nie daje efektu rozszczepiania. Stąd też, w jednym ze sposobów według wynalazku inaktywowaną proteazę HCV immobilizuje się i dodaje się mieszaninę kandydujących inhibitorów. Inhibitory ściśle naśladujące korzystną sekwencję rozpoznającą enzymu będą konkurować z większym powodzeniem jeśli chodzi o wiązanie się, aniżeli inne inhibitory kandydujące. Słabo wiążące kandydujące inhibitory można następnie oddzielić, po czym określić tożsamość inhibitorów silnie wiążących. I tak, na przykład, można wytworzyć proteazę HCV za pomocą zastąpiema Ser221 /fig. 1/ przez Ala, w wyniku czego otrzymuje się enzym zdolny do wiązania substratu proteazy HCV, ale niezdolny dojego rozszczepienia. Następnie otrzymaną tak muteinę proteazy wiąże się ze stałym nośnikiem, na przykład kulkami Sephadex® i wprowadza do kolumny. Następnie przez kolumnę przepuszcza się mieszaninę kandydujących inhibitorów proteazy w roztworze i odbiera się frakcje. Ostatnie frakcje z elucji zawierają związki najsilniej wiążące i dają korzystnie kandydujące inhibitory proteazy.

Inhibitory proteazy można podawać w różny sposób, a mianowicie dożylnie, doustnie, domięśniowo, dootrzewnowo, dooskrzelowo, donosowo itd. Korzystna droga podawania zależy od charakteru inhibitora. Inhibitory wytworzone w postaci związków organicznych często można podawać doustnie /co jest ogólnie korzystne/, jeżeli są dobrze wchłaniane. Inhibitory na bazie białka /takie jak większość pochodnych przeciwciał/ należy, na ogół, podawać drogą pozajelitową.

Przedstawione poniżej przykłady podanojako dalszą wskazówkę dla praktyki o przeciętnej wiedzy w tej dziedzinie techniki i nie należy ich interpretować jako ograniczenia wynalazku w jakikolwiek sposób. '

Przykład I. Otrzymywanie cDNA HCV. Genomową bibliotekę cDNA HCV wytworzono w sposób opisany w opublikowanym opisie zgłoszenia patentowego PCT WO89/046699 i w opisie zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 7/456637. Bibliotekę tę, nr rejestracyjny ATCC 40394, zdeponowano jak to poniżej przedstawiono.

Przykład II. Ekspresja polipeptydu zakodowanego w klonie 5-1-1. /A/ Polipeptyd HCV zakodowany w klonie 5-1-1 /patrz przykład I/ doprowadzono do ekspresji jako polipeptyd sprzężony z ludzką dysmutazą ponadtlenkową /SOD/. Dokonano tego za pomocą subklonowania insertu cDNA klonu 5-1-1 do wektora ekspresyjnego pSODCF1 [K. S. Steimer i in., J. Virol., 58, 9 /1986/; EPO 138111], jak następuje. Wektor ekspresyjny SOD55-1-1 transformowano do komórek D1210 E. coli. Komórki te, nazwane Cf1/5-1-1 w E. coli, zdeponowano jak to poniżej przedstawiono, i noszą one numer rejestracyjny ATCC 67967.

Po pierwsze, na DNA wyizolowany z pSODCF12 podziałano BamHI i EcoRI i z liniowym DNA utworzonym w wyniku działania enzymów restry kcyj nych zligowano następujący łącznik:

GAT CCT GGA ATT CTG ATA AGA CCT TAA GAC TAT TTT AA

Pr klonowaniu wyodrębniono plazmid zawierający insert.

Plazmid zawierający insert rozcięto przy użyciu EcoRI. Przy użyciu EcoRI wycięto insert cDNA HCV w klonie 5-1-1 i ligowano do wspomnianego, przeprowadzonego w postać liniową z zastosowaniem EcoRI, plazmidowego DNA. Mieszaniny DNA użyto do transformowania szczepu E coli D1210 [Sadler i in., Gene, 8, 279 /1980/]. Rekombinanty z cDNA 5-1-1 o

169 273 prawidłowej orientacji pod względem ekspresji ORP, jak na figurze 1, zidentyfikowano za pomocą mapowania restrykcyjnego i sekwencjonowania nukleotydów.

Bakterie rekombinantowe z jednego klonu indukowano do ekspresji polipeptydu SODHCV5-- za pomocą hodowli w obecności IPTG.

Za pomocą ligacji trzech nowych łączników, AB, CD i EF, do fragmentu BamHI-EcoRI, pochodzącego z całkowitego strawienia wektora pSODCF1 przy użyciu EcoRI i BamHI, po którym nastąpiło podziałanie fosfatazą alkaliczną, utworzono trzy osobne wektory ekspresyjne, a mianowicie pcf1AB, pcf1CD i pcf1EF. .Łączniki utworzono z sześciu oligomerów- A. B. C. D, E i F. Każdy oligomer, przed połączeniem z oligomerem komplementarnym, poddano fosforylacji za pomocą podziałania kinazą w obecności ATP. Sekwencje syntetycznych łączników były następujące:

Nazwa Sekwencja DNA /5' do 3 '!

A	GATC	CTG	AAT	CC	TGA	TAA
B		GAC	TTA	AGG	ACT	ATT	TTT	A
C	GATC	CGA	ATT	CJG	TGA	TAA
D		GCT	TAA.	GAC	ACT	ATT	TTA	A
E	GATC	CTG	GAA	!P3CC	TGA	TAA
F		GAC	<3TT	AA.G	ACT	ATT	TTA	A

Każdy z trzech łączników niszczy pierwotne miejsce EcoRI i tworzy nowe miejsce EcoRI w obrębie łącznika, lecz w obrębie odmiennej ramki odczytu. Stąd też, fragmenty EcoRI cDNA HCV izolowane z klonów, gdy zostały wprowadzone w wektor ekspresyjny, występowały w trzech różnych ramkach odczytu.

Fragmenty cDNA HCV w wyznaczonych klonach gt11 wycięto przez trawienie z EcoRI. Każdy fragment wprowadzono do pcf1AB, pcflCD i pcf1EP. Te konstrukcje ekspresyjne transformowano następnie do komórek E. coli D1210, transformanty klonowano i doprowadzano do ekspresji polipeptydów, jak to opisano poniżej w części B. /B/. Produkty ekspresji wskazanych DNA HCV zbadano pod względem antygenowości za pomocą bezpośredniego immunologicznego screeningu kolonii, z zastosowaniem modyfikacji metody opisanej przez Helfmana i in. [Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80,31 /1983/]. Mówiąc krótko, bakterie umieszczono na filtrach nitrocelulozowych położonych na płytkach z ampicyliną, otrzymując około 40 kolonii na filtr. Wykonano repliki kolonii na filtrach celulozowych i prowadzono wzrost replik przez noc w obecności 2 mM IPTG i ampicyliny. Kolonie bakterii zlizowano przez zawieszenie filtrów nitrocelulozowych na około 15 do 20 minut w atmosferze wysyconej parami CHCb. Następnie każdy filtr umieszczono w osobnej, 100 mm płytce Petri'ego zawierającej 10 ml 50 mM Tris HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MgCb, 3% /wag/obj/BSA, 40 pg/ml lizozymu i 0,1 pg/ml DNazy. Płytki łagodnie wstrząsano w ciągu co najmniej 8 godzin w temperaturze pokojowej. Filtry przepłukane TBST /50 mM Tris HCl, ph 8,0, 150 mM NaCl, 0-005% Tween® 20/. Po inkubacji, komórkowy debris przemyto i inkubowano w ciągu godziny w TBS /TBST bez Tween®/, zawierającym 1(0%o owczej surowicy. Następnie przesącze inkubowano z poddanymi wstępnej obróbce surowicami w TBS od osobników z NANBH, co obejmowało: 3 szympansy, 8 pacjentów z chroniczną NANBH, których surowice były pozytywne wobec przeciwciał przeciw polipeptydowi C100-3 HCV /zwanemu także C-100/, 8 pacjentów z chroniczną NANBH, których surowice były negatywne wobec przeciwciał anty-C100, ozdrowieńca, którego surowi ca była negatywna wobec przeciwciał anty-C100, oraz 6 pacjentów z NANBH nabytą w zbiorowisku, włącznie z jednym, którego surowica była lekko dodatnia wobec przeciwciał anty-C100. Surowice, rozcieńczone w TBS, poddano wstępnej obróbce polegającej na preabsorpcji z udziałem hSOD, w ciągu co najmniej 30 minut, w temperaturze 37°C. Po inkubacji, filtry przemyto dwukrotnie, w ciągu 30 minut, TBST. Otrzymane w wyniku ekspresji białka, które wiązały przeciwciała w surowicach, oznakowano za pomocą inkubacji w ciągu 2 godzin

169 273 ze znakowanym ⁱ²5j owczym przeciwludzkim przeciwciałem. Po przemyciu, filtry przemyto dwukrotnie, w ciągu 30 minut, TBST, wysuszono i zbadano metodą autoradiografii.

Pr z y k ła d III. Klonowanie białek tprzężonycr SOD-proteaza o pełnej długości.

/A/ pBR300-C000:

Sekwencje nukleotydów cDNA HCV poniżej użytych określono zasadniczo sposobem powyżej opisanym, z tą różnicą, że cDNA wyizolowany z klonu 5-1-1 zastąpiono cDNA wyciętym ze wspomnianych fagów.

Klon C33c wyizolowano przy użyciu sondy hybrydyzacyjnej o następującej sekwencji:

5' ATC AGG ACC GGG GTG AGA ACA ATT ACC ACT 3'

Sekwencję cDNA HCV w klonie C33c przedstawiono na figurze 8, która także pokazuje zakodowane tam aminokwasy.

Klon 35 wyizolowano za pomocą sereeningu z polinukleotydu syntetycznego o sekwencji:

5'AAG CCA CCG TGT GCG CTA GGG CTC AAG CCC 3'

Z sondą hybrydyzował mniej więcej 1 na 50000 klonów. Na figurze 7 przedstawiono sekwencję polinukleotydu i wydedukowaną sekwencję aminokwasów dla C35.

Klon C31 przedstawiono na figurze 6, która także pokazuje zakodowane w nim aminokwasy. Skonstruowano kasetę C200 za pomocą ligowania razem fragmentu o 718 parach zasad, otrzymanego za pomocą trawienia DNA klonu C33c przy użyciu EcoRI i HinfI, fragmentu o 179 parach zasad, otrzymanego za pomocą trawienia DNA klonu C31 przy użyciu HinfI i BglI oraz fragmentu o 377 parach zasad, otrzymanego za pomocą trawienia DNA klonu C35 przy użyciu BglI i EcoRI. Konstrukcję złożoną z ligowanych fragmentów wprowadzono do miejsca EcoRI pBR300, w wyniku czego otrzymano plazmid pBR^3^^-C200.

/B/

Wyizolowano klon 7f przy użyciu sondy o sekwencji:

5'-AGC AGA CAA GGG GCC TCC TAG GGT GCA TAA T-3'

Na Figurze 5 przedstawiono sekwencję cDNA HCV w klonie 7f i zakodowane tam aminokwasy.

Klon C20c wyizolowano przy użyciu sondy o następującej sekwencji:

5'-TGC ATC AAT GGG GTG TGC TGG-3'

Na Figurze 2 przedstawiono sekwencję cDNA HCV w klonie C20c i zakodowane tam aminokwasy.

Klony 7f i C20c trawiono przy użyciu EcoRI i SfaNI z utworzeniem fragmentów o, odpowiednio, 400 parach zasad i 260 parach zasad. Następnie fragmenty klonowano do miejsca EcoRI pBR322 z utworzeniem wektora C7f+C20c i transformowano do komórek HB101.

/C/ C300:

Wyizolowano klon 8h przy użyciu sondy na bazie sekwencji nukleotydów w klonie 00e. Sekwencja nukleotydów sondy była jak następuje:

5' -AGA GAC AAC CAT GAG GTC CCC GGT GTT C-3'

Na Figurze 4 przedstawiono sekwencję cDNA HCV w klonie 8h i zakodowane tam aminokwasy.

Klrn C26d wyizolowano przy użyciu sondy o następującej sekwencji:

5' -CTG TTG TGC CCC GCG GCA GCC- 3'

Na Figurze 3 przedstawiono sekwencję i translację aminokwasów klonu C26d.

Klony C26d i C33c /patrz część A powyżej/ transformowano do szczepu E. coli GM48 /metylowanie -/. Klon C26d trawiono z udziałem EcoRII i DdeI, w wyniku czego otrzymano fragment o 100 parach zasad. Klon C33c trawiono przy udziale EcoRII i RcoRI, w wyniku czego otrzymano fragment o 700 parach zasad. Klon C 8h trawiono przy udziale EcoRI i DdeI, w wyniku czego otrzymano fragment o 208 parach zasad. Następnie wszystkie te trzy fragmenty ligowanr do miejsca EcoRI pBR000 i transformowano do E. coli HB101, w wyniku czego otrzymano wektor C300.

/D/ Otrzymywanie klonów o pt/nt7 długości':

Fragment o 600 parach zasad otrzymano z C7f+C20c za pomocą trawienia przy udziale EcoRI i NaeI i ligowano do fragmentu NaeI/EcoRI o 945 parach zasad z C300, po czym

169 273 otrzymaną konstrukcję wprowadzano do miejsca EcoRI pGEM4Z /dostępny w handlu z firmy Promega/, w wyniku czego otrzymano wektor C7fC20cC300.

C7fC20cC300 trawiono przy udziale Ndel i EcoRI, w wyniku czego otrzymano fragment o 892 parach zasad, który ligowano z fragmentem o 1160 parach zasad otrzymanym za pomocą trawienia C200 przy udziale Ndel i EcoRI. Utworzoną tak konstrukcję wprowadzono do miejsca EcoRI pBR322, w wyniku czego otrzymano wektor C7fC20cC300C200. Konstrukcja tego wektora objaśniona jest schematycznie na figurze 9.

Przykład IV. Otrzymywanie wektorów ekspresyjnych E. coli /A/ cf1SODp600

Wektor ten zawiera sekwencję kodującą proteazy HCV o pełnej długości sprzężoną z funkcjonalnym liderem hSOD. Wektor C7fC20cC300C200 rozszczepiono przy użyciu EcoRI, w wyniku czego otrzymano fragment o 2000 par zasad, który następnie ligowano do miejsca EcoRI plazmidu cf1 CD /Przykład 2 A/ . Otrzymany tok wektor koduje aminokwasy 1-151 hSOD oraz aminokwasy 946-1630 HCV /numerowanie od początku poliproteiny, odpowiada aminokwasom 1-686 na figurze 1/. Wektor oznakowano przy użyciu cf1SODp600 / niekiedy określanego jako P600/ i transformowano do komórek E. coli D1210. Komórki te, nr rejestracyjny ATCC 6827I, zdeponowano jak to poniżej przedstawiono.

/B/ P190:

Skrócony polinukleotyd sprzężony SOD-proteaza wytworzono za pomocą wycięcia fragmentu EcoRI/NaeI o 600 parach zasad z C7f+C20c, stępienia fragmentu przy udziale fragmentu Klenowa i ligowania stępionego fragmentu do stępionego fragmentem Klenowa miejsca EcoRI cf1EF /Przykład 2A/. Polinukleotyd ten koduje białko sprzężone posiadające aminokwasy 1 1I1 z hSOD i aminokwasy 1-199 z proteazy HCV.

/C/ P300:

Dłuższy, skrócony polinukleotyd sprzężony SOD-proteaza wytworzono za pomocą wycięcia fragmentu EcoRI/NdeI o 892 parach zasad z C7fC20cC300, stępienia fragmentu przy udziale fragmentu Klenowa i ligowania stępionego fragmentu do stępionego fragmentem Klenowa miejsca EcoRI cf1EF. Polinukleotyd ten koduje białko sprzężone posiadające aminokwasy 1 - 151 z hSOD i aminokwasy 1 - 299 z proteazy HCV.

/D/ P500:

Dłuższy, skrócony polinukleotyd sprzężony SOD-proteaza wytworzono za pomocą wycięcia fragmentu EcoRI/EcoRI o 1550 parach zasad z C7fC20cC300 i ligowania fragmentu do miejsca EcoRI cf1CD, z utworzeniem Pl00. Polinukleotyd ten koduje białko sprzężone posiadające aminokwasy 1- 151 z hSOD i aminokwasy 946 - 1457 z proteazy HCV / aminokwasy 1 -513 na figurze 1/.

/E/ Sprzężenie FLAG/proteaza

Wektor ten zawiera sekwencję kodującą proteazy HCV o pełnej długości sprężoną z sekwencją FLAG [Hopp i in., Biotechnology, 6,1204 -1210/1988/]. Użyto PCR do wytworzenia genu proteazy HCV o specjalnych końcach restrykcyjnych dla ułatwienia klonowania. Plazmid p500 trawiono przy udziale EcoRI i NdeI. w wyniku czego otrzymano fragment o 900 parach zasad. Fragment ten wraz z dwoma starterami zastosowano w katalizowanej przez polimerazę reakcji łańcuchowej w celu wprowadzenia unikalnego miejsca BgIII przy aminokwasie 1009 i kodonu stop z miejscem SaII przy aminokwasie 1262 HCV-1, jak to przedstawiono na figurze 17 w WO90/11089, opublikowanym 4 października 1990. Sekwencja primerów jest jak następuje:

5' CCC GAG CAA GAT CTC CCG GCC C 3' oraz

5' CCC GGC TGC ATA AGC AGT CGA CTT GGA 3'

Po 30 cyklach PCR, mieszaninę reakcyjną poddano trawieniu z udziałem BgIII i SaII, po czym wyodrębniono fragment o 710 parach zasad. Fragment ten połączono i zligiowano do następującego dupleksu:

MetAspTyrLysAspAspAspAspLysGlyArgGlu

CATGGACTACAAAGACGATGACGATAAAGGCCGGGA

CTGATGTTTCTGCTACTGCTATTTCCGGCCCTCTAG

169 273

Dupleks koduje sekwencję FLAG, metioninę inicjatorową i miejsca restrykcyjne 5'NcoI. Otrzymany tak fragment NcoI/SaII ligowano do pochodnej pCF1.

Konstrukcję tę transformowano następnie do komórek E. coli D1210 i indukowano ekspresję protaazy za pomocą dodania IPTG.

Sekwencję FLAG sprzężono z proteazą HCV w celu ułatwiania oczyszczania. Ca-zależns przeciwciało monoklonalne, które wiąża się z paptydam kodowanym przaz FLAG, stosuje się do oczyszczania białka sprzężonego bez wprowadzania surowych warunków alucji.

Przykład V. Eksprasja w E. coli białak sprzężonych SOD-protaaza.

/A/ Komórki E. coli D1210 transformowano przy użyciu cf1SODp600 i prowadzono ich hodowlę w bulionie Luria zawierającym 100 gg/ml ampicyliny aż do uzyskania OD 0,3 - 0,5. Następnie dodano IPTG do stężenia 2 mM i komórki hodowano do końcowej wartości OD 0,9 - 1,3. Następnie komórki poddano lizia i otrzymany lizat analizowano techniką Western blotting przy użyciu surowic anty-HCV, jak to opisano w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 7/456637.

Wyniki wykazały zajście rozszczepiania, gdyż na żalu nia uwidocznił się żaden produkt o pełnaj długości /teoretyczna wartość Mr 73 kDa/. Pasma odpowiadająca partnerowi sprzęgania hSOD i osobno protaazia HCV pojawiły się przy wartości względnej masy cząsteczkowej około 34,53 i 66 kDa. Pasmo 34 kDa odpowiada partnerowi hSOD /około 20 kDa/ z częścią domeny NS3, podczas gdy pasma 53 i 66 kDa odpowiadają protaazia HCV o różnych stopniach przetworzenia /przypuszczalnie bakteryjnego/.

/B/ Komórki E. coli D1210 transformowano przy użyciu p500 i prowadzono ich hodowlę w bulionie Luria zawierającym 100 gg/ml ampicyliny aż do uzyskania OD 0,3 - 0,5. Następnie dodano IPTG do stężania 2 mM i komórki hodowano do końcowej wartości OD 0,8 do 1,0. Następnis komórki poddano lizia i lizat analizowano jak wyżej opisano.

Wyniki znów wykazały zajście rozsczapienia, ponieważ na żalu nia uwidocznił się żaden produkt o pałnej długości /teoretyczna wartość Mr 73 kDa/. Pasma odpowiadająca partnerowi sprzęgania hSOD i skróconej proteazia HCV pojawiły się przy wartości masy cząsteczkowej około, odpowiednio, 34 i 45 kDa.

/C/ Komórki E. coli D1210 transformowano wektorami P300 i P190 i hodowlę prowadzono jak powyżej opisano.

Wyniki uzyskane z ekspresji P300 wykazały zajście rozszczepienia, ponieważ na żalu nis uwidocznił się żadan produkt o pełnaj długości /teoretyczna wartość Mr 51 kDa/. Pasmo odpowiadające partnerowi sprzęgania hSOD pojawiło się przy wartości względnej masy cząsteczkowej około 34. Odpowiednie pasmo proteazy HCV nie było widoczne, ponieważ ten region domany NS3 jest rozpoznawany przez surowica użyte do wykrycia produktów. Jednakże, pojawienie się pasma hSOD raczej przy 34 kDa a nie przy 51 kDa wskazuja na zajścia rozszczepienia.

Jedynie produkt ekspresji P190 pojawił się jako produkt o pełnej /zakodowanej/ długości, bez rozecjzapienid, tworząc pasmo przy około 40 kDa, co odpowiada teoretycznej wartości masy cząsteczkowej dla produktu nierozezczepionago. Może to wskazywać na to, że minimum sekwencji istotnej dla proteazy HCV rozciąga się w regionie między aminokwasami 199 i 299.

Przykład VI. Oczyszczanie proteazy po ekspresji przeprowadzonej w E. coli.

Proteazę HCV i fragmenty po aksprasji przaprowadzonej w Przykładzie V można oczyścić w sposób następujący.

Komórki bakteryjne, w których dokonano ekspresji polipeptydu poddano szokowi osomotycznsmu i dezintegracji mechanicznej, po czym frakcję nierozpuszczalną, zawierającą protsazę, wyodrębniono, poddano ekstrakcji rozdzialczej przy użyciu roztworu alkalicznego NaCl i polipeptyd zawarty w ekstrakcie poddano oczyszczaniu metodą chromatograficzną na kolumnach S-Sepharosa® i Q-Sapharose®.

Ekstrakt surowy, otrzymany w wyniku szoku oemotycznego i dezintegracji mechanicznej, przygotowuje się w ten sposób, że zawiesza się 1g zebranych komórek w 10 ml roztworu zawierającego 0,02M Tris HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA i 20% sacharozy, po czym inkubuje się zawiesinę w ciągu 10 minut na lodzie. Następnie komórki osadza się za pomocą odwirowania przy 4000g w ciągu 15 minut w temperaturze 4°C. Po usunięciu supernatantu, osad komórek

169 273 ponownie zawiesza się w 10 ml buforu A1 /0,01 M Tris HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 14 mMβ-merkaptoetanolu - β ME/ i inkubuje na lodzie w ciągu 10 minut. Komórki ponownie osadza się przy 4000 x g w ciągu 15 minut, w temperaturze 4°C. Po usunięciu klarownego supernatantu /frakcja periplazmatyczna I/, osad komórek ponownie zawiesza się w buforze A1, inkubuje na lodzie w ciągu 10 minut i znów odwirowuje przy 4000 x g, w ciągu 15 minut, w temperaturze 4°C. Usuwa się klarowny supernatant /frakcja periplazmatyczna II/ i osad komórek ponownie zawiesza w 5 ml buforu T2 /0,02 M Tris HCl, pH 7,5, 14 mM β Me, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF/. W celu rozerwania komórek, w rurce Falcona umieszcza się 5 ml zawiesiny i 7,5 ml kulek ze szkła bezołowiowego Dyno-mill, przemytych kwasem, o średnicy 0,10 - 115 mm/ /dostępnych z firmy Glen-Mills, Inc./ i utrzymuje w zawirowaniu, przy najwyższej szybkości, w ciągu 2 minut, po czym oziębia w ciągu co najmniej 2 minut na lodzie. Tę operację zawirowania i oziębiania powtarza się jeszcze 4 razy. Po zawirowaniu, otrzymaną gęstą papkę sączy się przez lejek z filtrem ze spiekanego szkła, z niewielkim zasysaniem, po czym kulki szklane przemywa się dwukrotnie buforem A2 i łączy się przesącz z przemywkami.

Frakcję nierozpuszczalną ekstraktu surowego zbiera się za pomocą odwirowania przy 20000 x g w ciągu 15 minut, w temperaturze 4°C, przemywa dwukrotnie 10 ml buforu A2 i ponownie zawiesza w 5 ml wody MILLI-Q.

Frakcję zawierającą proteazę HCV wyodrębnia się z materiału nierozpuszczalnego za pomocą dodania do zawiesiny NaOH /2 M/ i NaCl /2 M/, w wyniku czego uzyskuje się dla każdego z nich stężenie końcowe 20 mM, po czym zawirowuje się w ciągu 1 minuty, odwirowuje przy 20000 xg w ciągu 20 minut, przy 4°C i zachowuje się supernatant.

Następnie częściowo oczyszczoną proteazę poddaje się oczyszczaniu za pomocą SDS-PAGE. Proteazę można zidentyfikować techniką Western blotting, apasmo wyciąć z żelu. Następnie proteazę eluuje się z pasma i analizuje w celu potwierdzenia sekwencji aminokwasów. Sekwencje N-końcowe można analizować przy użyciu automatycznego sekwenatora aminokwasów, podczas gdy sekwencje C-końcowe można analizować za pomocą zautomatyzowanego sekwencjonowania aminokwasów serii fragmentów trypsynowych.

Przykład VII. Otrzymywanie wektora ekspresyjnego drożdży /A/ P650 /Sprzężenie SOD/proteaza/.

Wektor ten zawiera sekwencję HCV, która obejmuje sekwencję kodującą proteazę HCV typu dzikiego o pełnej długości, sprzężoną przy końcu 5' z sekwencją kodującą SOD. Do rekonstrukcji sekwencji kodującej proteazę HCV typu dzikiego o pełnej długości użyto dwóch fragmentów, a mianowicie fragmentu EcoRI/BgIII o 441 parach zasad z klonu 11 b oraz fragmentu BgIII/EcoRI o 1471 parach zasad z wektora ekspresyjnego P500. Oba te fragmenty ligowano razem z wektorem pS356 poddanym trawieniu przy udziale EcoRI, w wyniku czego otrzymano kasetę ekspresyjną. Kaseta ekspresyjna koduje hybrydowy drożdżowy promotor ADH2/GAPDH, ludzką SOD, proteazę HCV i terminator transkrypcji GAPDH. Otrzymany wektor poddano trawieniu z udziałem BamHI i wyodrębniono fragment o 4052 parach zasad. Fragment ten ligowano do wektora pAB24 poddanego trawieniu z udziałem BamHI, w wyniku czego otrzymano p650. p650 doprowadza do ekspresji poliproteiny zawierającej, licząc od jej końca aminowego, aminokwasy 1-154 z hSOD, oligopeptyd -Asn-Leu-Gly-Ile-Arg- oraz aminokwasy 819 do 1458 z HCV-1, jak to przedstawiono na figurze 17 w WO90/11089, opublikowanym 4 października 1990.

Klon 11b wyizolowano z genomowej biblioteki cDNA HCV, nr rejestracyjny ATCC 40394, jak to opisano powyżej w Przykładzie 3A, przy użyciu sondy hybrydyzacji o następującej sekwencji:

5' CAC CTA TGT TTA TAA CCA TCT CAC TCC TCT 3'

Ten sposób postępowania opisany jest także w zgłoszeniu patentowym EPO Pub. nr 318216, Przykład IV. A. 17.

Wektor pS3EF, stanowiący pochodną pBR322 zawiera hybrydowy drożdżowy promotor ADH2/GAPDH w górę od genu ludzkiej dysmutazy ponadtlenkowej, adaptor, oraz w dół drożdżowy skuteczny terminator transkrypcji. Podobny wektor ekspresyjny zawierający te elementy regulujące i gen dysmutazy ponadtlenkowej opisali Cousens i in. Gene, 61265 /1987/. Opisany jest także w równocześnie rozpatrywanym zgłoszeniu patentowym EPO 196056,

169 273 opublikowanym 1 października 1986. Jednakże pS3EF różni się od wektora opisanego przez Cousensa i in. tym, że brak tu heterologicznego genu proinsuliny i fragmentu stykowego immunoglobuliny, a po Gln 154 z SOD następuje sekwencja adapterowa,. która zawiera miejsce ECoRI. Sekwencja adaptora jest następująca:

5' AAT TTG GGA ATT CCA TAA TTA ATT AAG 3'

3' AC CCT TTA GGT ATT AAT TAA TTC AGCT 5'

Miejsce EcoRI ułatwia insercję sekwencji heterologicznych. Po wprowadzeniu do pS3EF, dochodzi do ekspresji sprzężenia SOD, z zawartością oligopeptydu, który wiąże SOD z sekwencjami heterologicznymi. pS3EFjest dokładnie taki sam jak pS356, z tą różnicą, że pS356 zawiera odmienny adapter. Sekwencję adaptora przedstawiono poniżej:

5' AAT TTG GGA ATT CCA TAA TGA G 3'

3' AC CCT TAA GGT ATT ACT CAG CT 5'· pS356, nr rejestracyjny ATCC 67683, został zdeponowany jak to poniżej przedstawiono.

Plazmid pAB24 jest drożdżowym wektorem wahadłowym, który zawiera sekwencje pBR322, kompletną 2 μ sekwencję dla replikacji DNA w drożdżach [Broach w: Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, tom 1, str. 445, Cold Spring Harbor Press /1981/] oraz drożdżowy gen LEU^2d pochodzący z plazmidu pC1/1, opisany w EPO Pub. nr 116201. Plazmid pAB24 skonstruowano za pomocą trawienia YEp24 z udziałem EcoRI i religowania wektora w celu usunięcia częściowych 2 μ sekwencji. Otrzymany plazmid, YEp24 ARI, przeprowadzono w postać liniową przy użyciu ClaI i ligowano z kompletnym 2 μ plazmidem, który przeprowadzono w postać liniową przy użyciu ClaI. Następnie otrzymany plazmid, pCBou, poddano trawieniu z udziałem XbaI, po czym wyizolowano na żelu fragment wektora o 8605 parach zasad. Ten wyizolowany fragment XbaI ligowano z fragmentem XbaI o 4460 parach zasad, zawierającym gen LEU2d wyizolowany z pC1/1. Orientacja genu LEU2d jest w tym samym kierunku, co orientacja genu URA3.

S.cerevisiae, 2150-2-3 /pAB24-GAP-env2/, nr rejestracyjny 20827, jest zdeponowany w American Type Culture Collection, jak to poniżej przedstawiono. Plazmid pAB24-GAP-env2 można wyodrębnić z komórek drożdży znanymi metodami. Kasetę ekspresyyną GAP-env2 można wyodrębnić za pomocą trawienia pAB24-GAP-env2 z udziałem BamHI. pAB24 odzyskuje się za pomocą rebgowania wektora bez insertu BamHI.

Przykład VIII. Ekspresja białka sprzężonego SOD-proteaza w drożdżach p650 transformowano w S. cerevisiae szczep JSC310, Mata, leu2, ura3-52, prb1-1122, pep4-3, prcl-407, cir°: DM 15 /oporność g418/. Transformację prowadzono sposobem opisanym przez Hinnena i in. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 /1978/]. Transformowane komórki selekcjonowano na płytkach ura z 8% glukozą. Płytki inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 4-5 dni. Transformanty dalej seeekcjonowano na płytkach leu z 8% glukozą z domniemywaniem wysokich numerów plazmidu p650. Kolonie z płytek leu inokulowano do podłoża leu z 3% glukozą. Hodowle te wytrząsano w temperaturze 30°C w ciągu 2 dni, po czym rozcieńczano 1/20 do podłoża YEPD z 2% glukozą i dalej wytrząsano w ciągu 2 dni w temperaturze 30°C.

S. cereYicn^e JSC310 zawiera DNA DM15 opisany w zgyoszzniu penen tpwym EPO pub. nr 340986, opublikowanym 8 października 1989. Ten DNA DM15 wzmaga kontrolowaną przez ADH2 ekspresję białek heterologicznych. pDM15, nr rejestracyjny 40453, jest zdeponowany w American Type Culture Cyllectiyn, jak to poniżej przedstawiono.

Przykład IX. Ubikuitynowa ekspresja dojrzałej proteazy HCV w drożdżach

Dojrzałą proteazę HCV wytwarza się za pomocą rozszczepienia wektora C7fC2C)j300C20e przy użyciu EcoRI, w wyniku czego otrzymuje się sekwencję kodującą o 2 kiloparach zasad, i wprowadzenia sekwencji z odpowiednimi łącznikami do wektora ekspresyjnego ubikuityny, tak jak to opisano w WO88/02406, opublikowanym 7 kwietnia 1988, albo w zgłoszeniu patentowym

169 273

Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 7/390599, zgłoszonym 7 sierpnia 1989, które włączone są do niniejszego opisu jako odnośniki. Dojrzałą proteazę HCV odzyskuje się po ekspresji wektora w stosowanych gospodarzach, zwłaszcza w drożdżach. W szczególności, do przeprowadzenia ekspresji wektora ubikuityna/proteaza HCV posłużono się protokołem ekspresji w drożdżach opisanym w Przykładzie VIII.

Przykład X. Otrzymywanie wektora in vitro ekspresji /A/ Wektor pGEM ®-3Z/Zżder żółtej· gorączki **

Cztery fragmenty syntetycznego DNA połączono i ligowano razem w celu utworzenia EcoRI/SacI lider żółtej gorączki, który ligowano do trawionego z udziałem EcoRI/SacI wektora pGEM® -3Z z firmy Promega®. Sekwencje tych czterech fragmentów podane są poniżej:

YFK-1 :

5' AAT TCG TAA ATC CTG TGT GCT AAT TGA GGT GCA TTG GTC TGC AAA TCG AGT TGC TAG GCA ATA AAC ACA TT 3'

YFK-2 :

5' TAT TGC CTA	GCA ACT	CGA	TTT	GCA	GAC	CAA	TGC	ACC	TCA	ATT
AGC ACA CAG GAT	1 TTA CG	3'
YFK-3 :
5' TGG ATT AAT	TTT AAT	CGT	TCG	TTG	AGC	GAT	TAG	CAG	AGA
ACT GAC CAG AAC	ATG TCT	1 GAG	CT	3'
YFK-4 s
5' CAG ACA TGT	TCT GGT	CAG	TTC	TCT	GCT	AAT	CGC	TCA	ACG	AAC
GAT TAA AAT TAA	TCC AAA	TGT	GTT 3

W celu in vitro translacji proteazy HCV, nowy wektor pGEM® - 3Z/liderżółtej oorązzki trawiono z udziałem BamHI i stępiono przy użyciu fragmentu Klenowa.

/B/ Konstrukcja Pvn// z p6'000

Skonstruowano klon p600 z sekwencji dostępnych z genomowej bibliotdZ/ wykonanej na cDNA HCV, nr rejestracyjny ATCC 40394. Sekwncja DNA kodująca hCv z p6000jest identyczna z sekwencją nukleotyd -275 - ηι©1(^ν6 7372 z figyry 17 w WO90/11089, opublikowanym 4 października 1990. p6000 trawiono z udziałem pvuII i z produktu trawienia wyodrębniono fragment o 2864 parach zasad. Ten fragment o 2864 parach zasad ligowano do powyżej opisanego fragmentu wektora pGEM® -3Z/lider żółtej gorączki, otrzymanego poprzednio.

Przykład XI. In vitro ekspresja proteazy HCV.

/A/ Transkrypcja. Wektor pGEM -©lider żółtej gorączki/ PvuII przeprowadzono w postać liniową przy użyciu Xbal i transkrybowano z wykorzystaniem materiałów i protokołów z układu Riboprobe® Gemini II Core firmy Promega.

/B/ Translacja. RNA wytworzony według powyższego protokołu poddano translacji z użyciem lizatu retykulocytów króliczych z firmy Promega, bez metioniny, membran m/Zgosomalnych z psiej trzustki, jak równier z wykorzystaniem innych potrzebnych materiałów i instrukcji z firmy Progema.

Zdeponowane materiały biologiczne. Następujące materiały zdeponowano w American Type Culture Collection /ATCC/, 12301 Parklawn Dr., Rojkville, Maryland.

Nazwa	Data zdeponowania	Nr rejestracyjny
E. coli D1210, cf1SODp600	23 marca 1990	68275
Cf1/5-1-1 w E. coli D1210	1 1 maj7 1987	67967
Biblioteka wykonana na cDNA bakteriofaga λ-gt 11	1 grudmi 1987
E. coli HB101, pS356	29 kwłe-nJa 1988
Plazmidowy DNA, pDM 15	5 maja 1988	40443
S. cdrdvlslad, 2150-2^23 /pAB24-GAP-env2/	23 grudnia 1986	20827

169 273

Powyższe materiały zostały zdeponowane w ATCC pod wskazanymi numerami rejestracyjnymi. Depozyty te przechowywane są zgodnie z warunkami Układu Budapesztańskiego /International Recognition of The Depossit of Microorganitms for purposes of Patent Procedure/. Depozyty te są dostarczane, jako udogodnienie, fachowcom w tej dziedzinie techniki i nie uważa się, aby depozyt podlegał postanowieniom 35 U. S. C. § 11. Sekwencje polinukleotydów zawarte w zdeponowanych materiałach, jak również sekwencja aminokwasów polipeptydów zakodowana w ten sposób, są włączone do niniejszego opisu jako odnośniki i stanowią sekwencje kontrolne w przypadku konfliktu z sekewencjami opisanymi w niniejszym opisie. Na wytwarzanie, stosowanie i sprzedaż zdeponowanych materiałów może być wymagana licencja i niniejszym dokumentem nie udziela się żadnej tego rodzaju licencjii.

169 273

169 273

	1 Gly	Thr	Tyr	Val	5 Tyr	Asn
ATT	CGG	GGC	ACC	TAT	GTT	TAT	AAC
TAA	GCC	CCG	TGG	ATA	CAA	ATA	TTG

His	Leu	Thr	10 Pro	Leu	Arg	Asp	Trp
CAT	CTC	ACT	CCT	CTT	CGG	GAC	TGG
GTA	GAG	TGA	GGA	GAA	GCC	CTG	ACC

15					20
Ala	His	Asn	Gly	Leu	Arg	Asp	Leu
GCG	CAC	AAC	GGC	TTG	CGA	GAT	CTG
CGC	GTG	TTG	CCG	AAC	GCT	CTA	GAC

		25					30
Ala	Val	Ala	Val	Glu	Pro	Val	Val
GCC	GTG	GCT	GTA	GAG	CCA	GTC	GTC
CGG	CAC	CGA	CAT	CTC	GGT	CAG	CAG

Phe	Ser	Gln	Met	35 Glu	Thr	Lys	Leu
TTC	TCC	CAA	ATG	GAG	ACC	AAG	CTC
AAG	AGG	GTT	TAC	CTC	TGG	TTC	GAG

	40					45
Ile	Thr	Trp	Gly	Ala	Asp	Thr	Ala
ATC	ACG	TGG	GGG	GCA	GAT	ACC	GCC
TAG	TGC	ACC	CCC	CGT	CTA	TGG	CGG

Ala	Cys	Gly	50 Asp	Ile	Ile	Asn	Gly
GCG	TGC	GGT	GAC	ATC	ATC	AAC	GGC
CGC	ACG	CCA	CTG	TAG	TAG	TTG	CCG

55					60
Leu	Pro	Val	Ser	Ala	Arg	Arg	Gly
TTG	CCT	GTT	TCC	GCC	CGC	AGG	GGC
AAC	GGA	CAA	AGG	CGG	GCG	TCC	CCG

		65					70
Arg	Glu	Ile	Leu	Leu	Gly	Pro	Ala
CGG	GAG	ATA	CTG	CTC	GGG	CCA	GCC
GCC	CTC	TAT	GAC	GAG	CCC	GGT	CGG

Asp	Gly	Met	Val	75 Ser	Lys	Gly	Trp
GAT	GGA	ATG	GTC	TCC	AAG	GGT	TGG
CTA	CCT	TAC	CAG	AGG	TTC	CCA	ACC

	80					85
Arg	Leu	Leu	Ala	Pro	Ile	Thr	Ala
AGG	TTG	CTG	GCG	CCC	ATC	ACG	GCG
TCC	AAC	GAC	CGC	GGG	TAG	TGC	CGC

Tyr	Ala	Gln	90 Gln	Thr	Arg	Gly	Leu
TAC	GCC	CAG	CAG	ACA	AGG	GGC	CTC
ATG	CGG	GTC	GTC	TGT	TCC	CCG	GAG

95					100
Leu	Gly	Cys	Ile	Ile	Thr	Ser	Leu
CTA	GGG	TGC	ATA	ATC	ACC	AGC	CTA
GAT	CCC	ACG	TAT	TAG	TGG	TCG	GAT

		105					110
Thr	Gly	Arg	Asp	Lys	Asn	Gln	Val
ACT	GGC	CGG	GAC	AAA	AAC	CAA	GTG
TGA	CCG	GCC	CTG	TTT	TTG	GTT	CAC

Glu	Gly	Glu	Val	115 Gln	Ile	Val	Ser
GAG	GGT	GAG	GTC	CAG	ATT	GTG	TCA
CTC	CCA	CTC	CAG	GTC	TAA	CAC	AGT

	120					125
Thr	Ala	Ala	Gln	Thr	Phe	Leu	Ala
ACT	GCT	GCC	CAA	ACC	TTC	CTG	GCA
TGA	CGA	CGG	GTT	TGG	AAG	GAC	CGT

Fig

169 273

130

135

140

Thr

Cys

Ile

Ile

Asn

Gly

Val

Cys

Trp

Thr

Val

Tyr

His

Gly

Ala

Gly

ACG

TGC

ATC

ATC

AAT

GGG

GTG

TGC

TGG

ACT

GTC

TAC

CAC

GGG

GCC

GGA

TGC

ACG

TAG

TAG

TTA

CCC

CAC

ACG

ACC

TGA

CAG

ATG

GTG

CCC

CGG

CCT

145

150

155

Thr

Arg

Thr

Ile

Ala

Ser

Pro

Lys

Gly

Pro

Val

Ile

Gln

Met

Tyr

Thr

ACG

AGG

ACC

ATC

GCG

TCA

CCC

AAG

GGT

CCT

GTC

ATC

CAG

ATG

TAT

ACC

TGC

TCC

TGG

TAG

CGC

AGT

GGG

TTC

CCA

GGA

CAG

TAG

GTC

TAC

ATA

TGG

160

165

170

Asn

Val

Asp

Gln

Asp

Leu

Val

Gly

Trp

Pro

Ala

Ser

Gln

Gly

Thr

Arg

AAT

GTA

GAC

CAA

GAC

CTT

GTG

GGC

TGG

CCC

GCT

TCG

CAA

GGT

ACC

CGC

TTA

CAT

CTG

GTT

CTG

GAA

CAC

CCG

ACC

GGG

CGA

AGC

GTT

CCA

TGG

GCG

175

180

185

190

Ser

Leu

Thr

Pro

Cys

Thr

Cys

Gly

Ser

Ser

Asp

Leu

Tyr

Leu

Val

Thr

TCA

TTG

ACA

CCC

TGC

ACT

TGC

GGC

TCC

TCG

GAC

CTT

TAC

CTG

GTC

ACG

AGT

AAC

TGT

GGG

ACG

TGA

ACG

CCG

AGG

AGC

CTG

GAA

ATG

GAC

CAG

TGC

195

200

205

Arg

His

Ala

Asp

Val

Ile

Pro

Val

Arg

Arg

Arg

Gly

Asp

Ser

Arg

Gly

AGG

CAC

GCC

GAT

GTC

ATT

CCC

GTG

CGC

CGG

CGG

GGT

GAT

AGC

AGG

GGC

TCC

GTG

CGG

CTA

CAG

TAA

GGG

CAC

GCG

GCC

GCC

CCA

CTA

TCG

TCC

CCG

ΐ

Nael

210

215

220

Ser

Leu

Leu

Ser

Pro

Arg

Pro

Ile

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gly

Ser

Ser

Gly

AGC

CTG

CTG

TCG

CCC

CGG

CCC

ATT

TCC

TAC

TTG

AAA

GGC

TCC

TCG

GGG

TCG

GAC

GAC

AGC

GGG

GCC

GGG

TAA

AGG

ATG

AAC

TTT

CCG

AGG

AGC

CCC

225

230

235

Gly

Pro

Leu

Leu

Cys

Pro

Ala

Gly

His

Ala

Val

Gly

Ile

Phe

Arg

Ala

GGT

CCG

CTG

TTG

TGC

CCC

GCG

GGG

CAC

GCC

GTG

GGC

ATA

TTT

AGG

GCC

CCA

GGC

GAC

AAC

ACG

GGG

CGC

CCC

GTG

CGG

CAC

CCG

TAT

AAA

TCC

CGG

240

245

250

Ala

Val

Cys

Thr

Arg

Gly

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Asp

Phe

Ile

Pro

Val

GCG

GTG

TGC

ACC

CGT

GGA

GTG

GCT

AAG

GCG

GTG

GAC

TTT

ATC

CCT

GTG

CGC

CAC

ACG

TGG

GCA

CCT

CAC

CGA

TTC

CGC

CAC

CTG

AAA

TAG

GGA

CAC

Fig (cigg dalszy)

169 273

255

Glu Asn GAG AAC CTC TTG

Leu Glu CTA GAG GAT CTC

260 Thr Thr ACA ACC TGT TGG

Met Arg ATG AGG TAC TCC

Ser Pro TCC CCG AGG GGC

265

Val Phe GTG TTC CAC AAG

Thr Asp ACG GAT TGC CTA

270 Asn Ser AAC TCC TTG AGG

Ser Pro TCT CCA AGA GGT

Pro Val CCA GTA GGT CAT

275

Val Pro GTG CCC CAC GGG

Gin Ser CAG AGC GTC TCG

280 Phe Gin TTC CAG AAG GTC

Val Ala GTG GCT CAC CGA

His Leu CAC CTC GTG GAG

285

His Ala CAT GCT GTA CGA

Pro Thr CCC ACA GGG TGT

290 Gly Ser GGC AGC CCG TCG

Gly Lys GGC AAA CCG TTT

Ser Thr AGC ACC TCG TGG

295

Lys Val AAG GTC TTC CAG

Pro Ala CCG GCT GGC CGA

Gin Gly CAG GGC GTC CCG i

305

Tyr Lys TAT AAG ATA TTC

Val Leu GTG CTA CAC GAT

310 Val Leu GTA CTC CAT GAG

Asn Pro AAC CCC TTG GGG

Ser Val TCT GTT AGA CAA

300 Ala Tyr GCA TAT CGT ATA i

Ndel

315

Ala Ala GCT GCA CGA CGT

Ala Ala GCA GCT CGT CGA

Thr Leu ACA CTG TGT GAC

320 Gly Phe GGC TTT CCG AAA

Gly Ala GGT GCT CCA CGA

Tyr Met TAC ATG ATG TAC

325

Ser Lys TCC AAG AGG TTC

Ala His GCT CAT CGA GTA

330 Gly Ile GGG ATC CCC TAG

Asp Pro GAT CCT CTA GGA

Asn Ile AAC ATC TTG TAG

335

Arg Thr AGG ACC TCC TGG

Gly Val GGG GTG CCC CAC

340 Arg Thr AGA ACA TCT TGT

Ile Thr ATT ACC TAA TGG

Thr Gly ACT GGC TGA CCG

345

Ser Pro AGC CCC TCG GGG

Ile Thr ATC ACG TAG TGC

350 Tyr Ser TAC TCC ATG AGG

Thr Tyr ACC TAC TGG ATG

Gly Lys GGC AAG CCG TTC

355

Phe Leu TTC CTT AAG GAA

Ala Asp GCC GAC CGG CTG

360 Gly Gly GGC GGG CCG CCC

Cys Ser TGC TCG ACG AGC

Gly Gly GGG GGC CCC CCG

365

Ala Tyr GCT TAT CGA ATA

Asp Ile GAC ATA CTG TAT

370 Ile Ile ATA ATT TAT TAA

Cys Asp TGT GAC ACA CTG

Glu Cys GAG TGC CTC ACG

375

His Ser CAC TCC GTG AGG

Thr Asp ACG GAT TGC CTA

380 Ala Thr GCC ACA CGG TGT

Ser Ile TCC ATC AGG TAG

Fig (ciąg dalszy)

169 273

385

390

395

Leu

Gly

Ile

Gly

Thr

Val

Leu

Asp

Gln

Ala

Glu

Thr

Ala

Gly

Ala

Arg

TTG

GGC

ATT

GGC

ACT

GTC

CTT

GAC

CAA

GCA

GAG

ACT

GCG

GGG

GCG

AGA

AAC

CCG

TAA

CCG

TGA

CAG

GAA

CTG

GTT

CGT

CTC

TGA

CGC

CCC

CGC

TCT

400

405

410

Leu

Val

Val

Leu

Ala

Thr

Ala

Thr

Pro

Pro

Gly

Ser

Val

Thr

Val

Pro

CTG

GTT

GTG

CTC

GCC

ACC

GCC

ACC

CCT

CCG

GGC

TCC

GTC

ACT

GTG

CCC

GAC

CAA

CAC

GAG

CGG

TGG

CGG

TGG

GGA

GGC

CCG

AGG

CAG

TGA

CAC

GGG

415

420

425

430

His

Pro

Asn

Ile

Glu

Glu

Val

Ala

Leu

Ser

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Pro

CAT

CCC

AAC

ATC

GAG

GAG

GTT

GCT

CTG

TCC

ACC

ACC

GGA

GAG

ATC

CCT

GTA

GGG

TTG

TAG

CTC

CTC

CAA

CGA

GAC

AGG

TGG

TGG

CCT

CTC

TAG

GGA

435

440

445

Phe

Tyr

Gly

Lys

Ala

Ile

Pro

Leu

Glu

Val

Ile

Lys

Gly

Gly

Arg

His

TTT

TAC

GGC

AAG

GCT

ATC

CCC

CTC

GAA

GTA

ATC

AAG

GGG

GGG

AGA

CAT

AAA

ATG

CCG

TTC

CGA

TAG

GGG

GAG

CTT

CAT

TAG

TTC

CCC

CCC

TCT

GTA

450

455

460

Leu

Ile

Phe

Cys

His

Ser

Lys

Lys

Lys

Cys

Asp

Glu

Leu

Ala

Ala

Lys

CTC

ATC

TTC

TGT

CAT

TCA

AAG

AAG

AAG

TGC

GAC

GAA

CTC

GCC

GCA

AAG

GAG

TAG

AAG

ACA

GTA

AGT

TTC

TTC

TTC

ACG

CTG

CTT

GAG

CGG

CGT

TTC

465

470

475

Leu

Val

Ala

Leu

Gly

Ile

Asn

Ala

Val

Ala

Tyr

Tyr

Arg

Gly

Leu

Asp

CTG

GTC

GCA

TTG

GGC

ATC

AAT

GCC

GTG

GCC

TAC

TAC

CGC

GGT

CTT

GAC

GAC

CAG

CGT

AAC

CCG

TAG

TTA

CGG

CAC

CGG

ATG

ATG

GCG

CCA

GAA

CTG

480

485

490

Val

Ser

Val

Ile

Pro

Thr

Ser

Gly

Asp

Val

Val

Val

Val

Ala

Thr

Asp

GTG

TCC

GTC

ATC

CCG

ACC

AGC

GGC

GAT

GTT

GTC

GTC

GTG

GCA

ACC

GAT

CAC

AGG

CAG

TAG

GGC

TGG

TCG

CCG

CTA

CAA

CAG

CAG

CAC

CGT

TGG

CTA

Fig. 1 (ciąg dalszy)

169 273

495					500
Ala	Leu	Met	Thr	Gly	Tyr	Thr	Gly
GCC	CTC	ATG	ACC	GGC	TAT	ACC	GGC
CGG	GAG	TAC	TGG	CCG	ATA	TGG	CCG

		505					510
Asp	Phe	Asp	Ser	Val	Ile	Asp	Cys
GAC	TTC	GAC	TCG	GTG	ATA	GAC	TGC
CTG	AAG	CTG	AGC	CAC	TAT	CTG	ACG

Asn	Thr	Cys	Val	515 Thr	Gin	Thr	Val
AAT	ACG	TGT	GTC	ACC	CAG	ACA	GTC
TTA	TGC	ACA	CAG	TGG	GTC	TGT	CAG

	520					525
Asp	Phe	Ser	Leu	Asp	Pro	Thr	Phe
GAT	TTC	AGC	CTT	GAC	CCT	ACC	TTC
CTA	AAG	TCG	GAA	CTG	GGA	TGG	AAG

Thr	Ile	Glu	530 Thr	Ile	Thr	Leu	Pro
ACC	ATT	GAG	ACA	ATC	ACG	CTC	CCC
TGG	TAA	CTC	TGT	TAG	TGC	GAG	GGG

535					540
Gin	Asp	Ala	Val	Ser	Arg	Thr	Gin
CAA	GAT	GCT	GTC	TCC	CGC	ACT	CAA
GTT	CTA	CGA	CAG	AGG	GCG	TGA	GTT

		545					550
Arg	Arg	Gly	Arg	Thr	Gly	Arg	Gly
CGT	CGG	GGC	AGG	ACT	GGC	AGG	GGG
GCA	GCC	CCG	TCC	TGA	CCG	TCC	CCC

Lys	Pro	Gly	Ile	555 Tyr	Arg	Phe	Val
AAG	CCA	GGC	ATC	TAC	AGA	TTT	GTG
TTC	GGT	CCG	TAG	ATG	TCT	AAA	CAC

	560					565
Ala	Pro	Gly	Glu	Arg	Pro	Pro	Gly
GCA	CCG	GGG	GAG	CGC	CCT	CCC	GGC
CGT	GGC	CCC	CTC	GCG	GGA	GGG	CCG

Met	Phe	Asp	570 Ser	Ser	Val	Leu	Cys
ATG	TTC	GAC	TCG	TCC	GTC	CTC	TGT
TAC	AAG	CTG	AGC	AGG	CAG	GAG	ACA

575					580
Glu	Cys	Tyr	Asp	Ala	Gly	Cys	Ala
GAG	TGC	TAT	GAC	GCA	GGC	TGT	GCT
CTC	ACG	ATA	CTG	CGT	CCG	ACA	CGA

		535					590
Trp	Tyr	Glu	Leu	Thr	Pro	Ala	Glu
TGG	TAT	GAG	CTC	ACG	CCC	GCC	GAG
ACC	ATA	CTC	GAG	TGC	GGG	CGG	CTC

Thr	Thr	Val	Arg	595 Leu	Arg	Ala	Tyr
ACT	ACA	GTT	AGG	CTA	CGA	GCG	TAC
TGA	TGT	CAA	TCC	GAT	GCT	CGC	ATG

	600					605
Met	Asn	Thr	Pro	Gly	Leu	Pro	Val
ATG	AAC	ACC	CCG	GGG	CTT	CCC	GTG
TAC	TTG	TGG	GGC	CCC	GAA	GGG	CAC

Fig.- 1 (ciąg dalszy)

169 273

Cys	Gin	Asp	610 His	Leu	Glu	Phe	Trp
TGC	CAG	GAC	CAT	CTT	GAA	TTT	TGG
ACG	GTC	CTG	GTA	GAA	CTT	AAA	ACC

615					620
Glu	Gly	Val	Phe	Thr	Gly	Leu	Thr
GAG	GGC	GTC	TTT	ACA	GGC	CTC	ACT
CTC	CCG	CAG	AAA	TGT	CCG	GAG	TGA

		625					630
His	Ile	Asp	Ala	His	Phe	Leu	Ser
CAT	ATA	GAT	GCC	CAC	TTT	CTA	TCC
GTA	TAT	CTA	CGG	GTG	AAA	GAT	AGG

Gin	Thr	Lys	Gin	635 Ser	Gly	Glu	Asn
CAG	ACA	AAG	CAG	AGT	GGG	GAG	AAC
GTC	TGT	TTC	GTC	TCA	CCC	CTC	TTG

	640					645
Leu	Pro	Tyr	Leu	Val	Ala	Tyr	Gin
CTT	CCT	TAC	CTG	GTA	GCG	TAC	CAA
GAA	GGA	ATG	GAC	CAT	CGC	ATG	GTT

Ala	Thr	Val	650 Cys	Ala	Arg	Ala	Gin
GCC	ACC	GTC	TGC	GCT	AGG	GCT	CAA
CGG	TGG	CAC	ACG	CGA	TCC	CGA	GTT

655					660
Ala	Pro	Pro	Pro	Ser	Trp	Asp	Gin
GCC	CCT	CCC	CCA	TCG	TGG	GAC	CAG
CGG	GGA	GGG	GGT	AGC	ACC	CTG	GTC

		665					670
Met	Trp	Lys	Cys	Leu	Ile	Arg	Leu
ATG	TGG	AAG	TGT	TTG	ATT	CGC	CTC
TAC	ACC	TTC	ACA	AAC	TAA	GCG	GAG

Lys	Pro	Thr	Leu	675 His	Gly	Pro	Thr
AAG	CCC	ACC	CTC	CAT	GGG	CCA	ACA
TTC	GGG	TGG	GAG	GTA	CCC	GGT	TGT

	680					685
Pro	Leu	Leu	Tyr	Arg	Leu	Gly	Ala
CCC	CTG	CTA	TAC	AGA	CTG	GGC	GCT
GGG	GAC	GAT	ATG	TCT	GAC	CCG	CGA

(ciąg dalszy)

169 273

C20c:
Asn	Ser	Glu	Asn	Gln
AAT	TCG	GAA	AAC	CAA
TTA	AGC	CTT	TTG	GTT

Val Glu Gly Glu Val Gln GTG GAG GGT GAG GTC CAG CAC CTC CCA CTC CAG GTC

EcoRI

Ala	Gln	Thr	Phe	Leu
GCC	CAA	ACC	TTC	CTG
CGG	GTT	TGG	AAG	GAC
Tyr	His	Gly	Ala	Gly
TAC	CAC	GGG	GCC	GGA
ATG	GTG	CCC	CGG	CCT
Ile	Gln	Met	Tyr	Thr
ATC	CAG	ATG	TAT	ACC
TAG	GTC	TAC	ATA	TGG
Ser	Gln	Gly	Thr	Arg
TCG	CAA	GGT	ACC	CGC
AGC	GTT	CCA	TGG	GCG
Leu	Tyr	Leu	Val	Thr
CTT	TAC	CTG	GTC	ACG
GAA	ATG	GAC	CAG	TGC
Gly	Asp	Ser	Arg	Gly
GGT	GAT	AGC	AGG	GGC
CCA	CTA	TCG	TCC	CCG
Lys	Gly	Ser	Ser	Gly
AAA	GGC	TCC	TCG	GGG
TTT	CCG	AGG	AGC	CCC

Ala	Thr	Cys	Ile	Asn	Gly
GCA	ACG	TGC	ATC	AAT	GGG
CGT	TGC	ACG	TAG	TTA	CCC

T

SfaNI

Thr	Arg	Thr	Ile	Ala	Ser
ACG	AGG	ACC	ATC	GCG	TCA
TGC	TCC	TGG	TAG	CGC	AGT
Asn	Val	Asp	Gln	Asp	Leu
AAT	GTA	GAC	CAA	GAC	CTT
TTA	CAT	CTG	GTT	CTG	GAA
Ser	Leu	Thr	Pro	Cys	Thr
TCA	TTG	ACA	CCC	TGC	ACT
AGT	AAC	TGT	GGG	ACG	TGA
Arg	His	Ala	Asp	Val	Ile
AGG	CAC	GCC	GAT	GTC	ATT
TCC	GTG	CGG	CTA	CAG	TAA
Ser	Leu	Val	Ser	Pro	Arg
AGC	CTC	GTG	TCG	CCC	CGG
TCG	GAG	CAC	AGC	GGG	GCC
Gly	Pro	Leu	Pro	Asn
GGT	CCG	CTG	CCG	AAT	TC
CCA	GGC	GAC	GGC	TTA	AG

T

EcoRI

NaeI

Pro Ile Ser Tyr Leu CCC ATT TCC TAC TTG GGG TAA AGG ATG AAC

Ile	Val	Ser	Thr	Ala
ATT	GTG	TCA	ACT	GCT
TAA	CAC	AGT	TGA	CGA
Val	Cys	Trp	Thr	Val
GTG	TGC	TGG	ACT	GTC
CAC	ACG	ACC	TGA	CAG
Pro	Lys	Gly	Pro	Val
CCC	AAG	GGT	CCT	GTC
GGG	TTC	CCA	GGA	CAG
Val	Gly	Trp	Pro	Ala
GTG	GGC	TGG	CCC	GCT
CAC	CCG	ACC	GGG	CGA
Cys	Gly	Ser	Ser	Asp
TGC	GGC	TCC	TCG	GAC
ACG	CCG	AGG	AGC	CTG
Pro	Val	Arg	Arg	Arg
:cc	GTG	CGC	CGG	CGG
GGG	CAC	GCG	GCC	GCC

Fig

169 273

C26d:

Glu

Phe

Gly

Gly

Leu

Leu

Leu

Cys

Pro

Ala

Ala

Ala

Val

Gly

Ile

Phe

GAA

TTC

GGG

GGC

CTG

CTG

TTG

TGC

CCC

GCG

GCA

GCC

GTG

GGC

ATA

TTT

CTT

AAG

CCC

CCG

GAC

GAC

AAC

ACG

GGG

CGC

CGT

CGG

CAC

CCG

TAT

AAA

ΐ

EcoRI

Arg

Ala

Ala

Val

Cys

Thr

Arg

Gly

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Asp

Phe

Ile

AGG

GCC

GCG

GTG

TGC

ACC

CGT

GGA

GTG

GCT

AAG

GCG

GTG

GAC

TTT

ATC

TCC

CGG

CGC

CAC

ACG

TGG

GCA

CCT

CAC

CGA

TTC

CGC

CAC

CTG

AAA

TAG

DdeI

Pro Val Glu Asn Leu Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp CCT GTG GAG AAC CTA GAG ACA ACC ATG AGG TCC CCG GTG TTC ACG GAT GGA CAC CTC TTG GAT CTC TGT TGG TAC TCC AGG GGC CAC AAG TGC CTA

Asn

Ser

Ser

Pro

Pro

Val

Val

Pro

Gln

Ser

Phe

Gln

Val

Ala

His

Leu

.AAC

TCC

TCT

CCA

CCA

GTA

GTG

CCC

CAG

AGC

TTC

CAG

GTG

GCT

CAC

CTC

TTG

AGG

AGA

GGT

GGT

CAT

CAC

GGG

GTC

TCG

AAG

GTC

CAC

CGA

GTG

GAG

ί

EcoRII

His Ala Pro Arg Ile CAT GCT CCC CGA ATT C GTA CGA GGG GCT TAA G t

EcoRI

Fig

169 273

C8h:

Pro

Cys

Thr

Cys

Gly

Ser

Ser

Asp

Leu

Tyr

Leu

Val

Thr

Arg

His

Ala

CCC

TGC

ACT

TGC

GGC

TCC

TCG

GAC

CTT

TAC

CTG

GTC

ACG

AGG

CAC

GCC

GGG

ACG

TGA

ACG

CCG

AGG

AGC

CTG

GAA

ATG

GAC

CAG

TGC

TCC

GTG

CGG

Asp

Val

Ile

Pro

Val

Arg

Arg

Arg

Gly

Asp

Ser

Arg

Gly

Ser

Leu

Leu

GAT

GTC

ATT

CCC

GTG

CGC

CGG

CGG

GGT

GAT

AGC

AGG

GGC

AGC

CTG

CTG

CTA

CAG

TAA

GGG

CAC

GCG

GCC

GCC

CCA

CTA

TCG

TCC

CCG

TCG

GAC

GAC

Ser

Pro

Arg

Pro

Ile

Ser

Tyr

Leu

Lys

3ly

Ser

Ser

Gly

Gly

Pro

Leu

TCG

CCC

CGG

CCC

ATT

TCC

TAC

TTG

AAA

GGC

TCC

TCG

GGG

GGT

CCG

CTG

AGC

GGG

GCC

GGG

TAA

AGG

ATG

AAC

TTT

CCG

AGG

AGC

CCC

CCA

GGC

GAC

Leu

Cys

Pro

Ala

Gly

His

Ala

Val

Gly

Ile

Phe

Arg

Ala

Ala

Val

Cys

TTG

TGC

CCC

GCG

GGG

CAC

GCC

GTG

GGC

ATA

TTT

AGG

GCC

GCG

GTG

TGC

AAC

ACG

GGG

CGC

CCC

GTG

CGG

CAC

CCG

TAT

AAA

TCC

CGG

CGC

CAC

ACG

Thr

Arg

Gly

Val

Ala

Lys

Aid

Val

Asp

Phe

Ile

Pro

Val

Glu

Asn

Leu

ACC

CGT

GGA

GTG

GCT

AAG

GCG

GTG

GAC

TTT

ATC

CCT

GTG

GAG

AAC

CTA

TGG

GCA

CCT

CAC

CGA

TTC

CGC

CAC

CTG

AAA

TAG

GGA

CAC

CTC

TTG

GAT

Ddel

Glu

Thr

Thr

Met

Arg

Ser

Pro

Val

Phe

Thr

Asp

Asn

Ser

GAG

ACA

ACC

ATG

AGG

TCC

CCG

GTG

TTC

ACG

GAT

AAC

TCC

TC

CTC

TGT

TGG

TAC

TCC

AGG

GGC

CAC

AAG

TGC

CTA

TTG

AGG

AG

Fig

169 273

C7f:

Ile

Arg

Gly

Thr

Tyr

Val

Tyr

Asn

His

Leu

Thr

Pro

Leu

Arg

Asp

Trp

ATT

CGG

GGC

ACC

TAT

GTT

TAT

AAC

CAT

CTC

ACT

CCT

CTT

CGG

GAC

TGG

TAA

GCC

CCG

TGG

ATA

CAA

ATA

TTG

GTA

GAG

TGA

GGA

GAA

GCC

CTG

ACC

EcoRI

Ala

His

Asn

Gly

Leu

Arg

Asp

Leu

Ala

Val

Ala

Val

Glu

Pro

Val

Val

GCG

CAC

AAC

GGC

TTG

CGA

GAT

CTG

GCC

GTG

GCT

GTA

GAG

CCA

GTC

GTC

CGC

GTG

TTG

CCG

AAC

GCT

CTA

GAC

CGG

CAC

CGA

CAT

CTC

GGT

CAG

CAG

Phe

Ser

Gln

Met

Glu

Thr

Lys

Leu

Ile

Thr

Trp

Gly

Ala

Asp

Thr

Ala

TTC

TCC

CAA

ATG

GAG

ACC

AAG

CTC

ATC

ACG

TGG

GGG

GCA

GAT

ACC

GCC

AAG

AGG

GTT

TAC

CTC

TGG

TTC

GAG

TAG

TGC

ACC

CCC

CGT

CTA

TGG

CGG

Ala

Cys

Gly

Asp

Ile

Ile

Asn

Gly

Leu

Pro

Val

Ser

Ala

Arg

Arg

Gly

GCG

TGC

GGT

GAC

ATC

ATC

AAC

GGC

TTG

CCT

GTT

TCC

GCC

CGC

AGG

GGC

CGC

ACG

CCA

CTG

TAG

TAG

TTG

CCG

AAC

GGA

CAA

AGG

CGG

GCG

TCC

CCG

Arg

Glu

Ile

/ Leu

Leu

Gly

Pro

Ala

Asp

Gly

Met

Val

Ser

Lys

Gly

Trp

CGG

GAG

ATA

CTG

CTC

GGG

CCA

GCC

GAT

GGA

ATG

GTC

TCC

AAG

GGT

TGG

GCC

CTC

TAT

GAC

GAG

CCC

GGT

CGG

CTA

CCT

TAC

CAG

AGG

TTC

CCA

ACC

Arg

Leu

Leu

Ala

Pro

Ile

Thr

Ala

Tyr

Ala

Gln

Gln

Thr

Arg

Gly

Leu

AGG

TTG

CTG

GCG

CCC

ATC

ACG

GCG

TAC

GCC

CAG

CAG

ACA

AGG

GGC

CTC

TCC

AAC

GAC

CGC

GGG

TAG

TGC

CGC

ATG

CGG

GTC

GTC

TGT

TCC

CCG

GAG

Leu

Gly

Cys

Ile

Ile

Thr

Ser

Leu

Thr

Gly

Arg

Asp

Lys

Asn

Gln

Val

CTA

GGG

TGC

ATA

ATC

ACC

AGC

CTA

ACT

GGC

CGG

GAC

AAA

AAC

CAA

GTG

GAT

CCC

ACG

TAT

TAG

TGG

TCG

GAT

TGA

CCG

GCC

CTG

TTT

TTG

GTT

CAC

Glu

Gly

Glu

Val

Gln

Ile

Val

Ser

Thr

Ala

Ala

Gln

Thr

Phe

Leu

Ala

GAG

GGT

GAG

GTC

CAG

ATT

GTG

TCA

ACT

GCT

GCC

CAA

ACC

TTC

CTG

GCA

CTC

CCA

CTC

CAG

GTC

TAA

CAC

AGT

TGA

CGA

CGG

GTT

TGG

AAG

GAC

CGT

Thr

Cys

Ile

Asn

Gly

Val

Cys

Trp

Pro

Asn

ACG

TGC

ATC

AAT

GGG

GTG

TGC

TGG

CCG

AAT

TC

TGC

ACG

TAG

TTA

CCC

CAC

ACG

ACC

GGC

TTA

AG

t T

SfaNI EcoRI

Fig

169 273

C31:

Glu

Phe

Gly

Ser

Val

Ile

Pro

Thr

Ser

Gly

Asp

Val

Val

Val

Val

Ala

GAA

TTC

GGG

TCC

GTC

ATC

CCG

ACC

AGC

GGC

GAT

GTT

GTC

GTC

GTC

GCA

CTT

AAG

CCC

AGG

CAG

TAG

GGC

TGG

TCG

CCG

CTA

CAA

CAG

CAG

CAG

CGT

1 EcoRI

Thr

Asp

Ala

Leu

Met

Thr

Gly

Tyr

Thr

Gly

Asp

Phe

Asp

Ser

Val

Ile

ACC

GAT

GCC

CTC

ATG

ACC

GGC

TAT

ACC

GGC

GAC

TTC

GAC

TCG

GTG

ATA

TGG

CTA

CGG

GAG

TAC

TGG

CCG

ATA

TGG

CCG

CTG

AAG

CTG

AGC

CAC

TAT

1 Hinfl

Asp

Cys

Asn

Thr

Cys

Val

Thr

Gin

Thr

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Asp

Pro

GAC

TGC

AAT

ACG

TGT

GTC

ACC

CAG

ACA

GTC

GAT

TTC

AGC

CTT

GAC

CCT

CTG

ACG

TTA

TGC

ACA

CAG

TGG

GTC

TGT

CAG

CTA

AAG

TCG

GAA

CTG

GGA

Thr

Phe

Thr

Ile

Glu

Thr

Ile

Thr

Leu

Pro

Gin

Asp

Ala

Val

Ser

Arg

ACC

TTC

ACC

ATT

GAG

ACA

ATC

ACG

CTC

CCC

CAA

GAT

GCT

GTC

TCC

CGC

TGG

AAG

TGG

TAA

CTC

TGT

TAG

TGC

GAG

GGG

GTT

CTA

CGA

CAG

AGG

GCG

Thr

Gin

Arg

Arg

Gly

Arg

Thr

Gly

Arg

Gly

Lys

Pro

Gly

Ile

Tyr

Arg

ACT

CAA

CGT

CGG

GGC

AGG

ACT

GGC

AGG

GGG

AAG

CCA

GGC

ATC

TAC

AGA

TGA

GTT

GCA

GCC

CCG

TCC

TGA

CCG

TCC

CCC

TTC

GGT

CCG

TAG

ATG

TCT

Phe

Val

Ala

Pro

Gly

Glu

Arg

Pro

Ser

Gly

Met

Phe

Asp

Ser

Ser

Val

TTT

GTG

GCA

CCG

GGG

GAG

CGC

CCC

TCC

GGC

ATG

TTC

GAC

TCG

TCC

GTC

AAA

CAC

CGT

GGC

CCC

CTC

GCG

GGG

AGG

CCG

TAC

AAG

CTG

AGC

AGG

CAG

BglI ΐ

Hinf I

Leu Cys Glu Cys Pro Asn CTC TGT GAG TGC CCG AAT TC GAG ACA CTC ACG GGC TTA AG

T

EcoRI

Fig

169 273

C35 :

Ile

Arg

Ser

Ile

Glu

Thr

Ile

Thr

Leu

Pro

Gin

Asp

Ala

Val

Ser

Arg

ATT

CGG

TCC

ATT

GAG

ACA

ATC

ACG

CTC

CCC

CAG

GAT

GCT

GTC

TCC

CGC

TAA

GCC

AGG

TAA

CTC

TGT

TAG

TGC

GAG

GGG

GTC

CTA

CGA

CAG

AGG

GCG

EcoRI

Thr

Gln

Arg

Arg

Gly

Arg

Thr

Gly

Arg

Gly

Lys

Pro

Gly

Ile

Tyr

Arg

ACT

CAA

CGT

CGG

GGC

AGG

ACT

GGC

AGG

GGG

AAG

CCA

GGC

ATC

TAC

AGA

TGA

GTT

GCA

GCC

CCG

TCC

TGA

CCG

TCC

CCC

TTC

GGT

CCG

TAG

ATG

TCT

Phe

Val

Ala

Pro

Gly

Glu

Arg

Pro

Ser

Gly

Met

Phe

Asp

Ser

Ser

Val

TTT

GTG

GCA

CCG

GGG

GAG

CGC

CCC

TCC

GGC

ATG

TTC

GAC

TCG

TCC

GTC

AAA

CAC

CGT

GGC

CCC

CTC

GCG

GGG

AGG

CCG

TAC

AAG

CTG

AGC

AGG

CAG

T

BglI

Leu

Cys

Glu

Cys

Tyr

Asp

Ala

Gly

Cys

Ala

Trp

Tyr

Glu

Leu

Thr

Pro

CTC

TGT

GAG

TGC

TAT

GAC

GCA

GGC

TGT

GCT

TGG

TAT

GAG

CTC

ACG

CCC

GAG

ACA

CTC

ACG

ATA

CTG

CGT

CCG

ACA

CGA

ACC

ATA

CTC

GAG

TGC

GGG

Ala

Glu

Thr

Thr

Val

Arg

Leu

Arg

Ala

Tyr

Met

Asn

Thr

Pro

Gly

Leu

GCC

GAG

ACT

ACA

GTT

AGG

CTA

CGA

GCG

TAC

ATG

AAC

ACC

CCG

GGG

CTT

CGG

CTC

:ga

TGT

CAA

TCC

GAT

GCT

CGC

ATG

TAC

TTG

TGG

GGC

CCC

GAA

Pro

Val

Cys

Gln

Asp

His

Leu

Glu

Phe

Trp

Glu

Gly

Val

Phe

Thr

Gly

CCC

GTG

TGC

CAG

GAC

CAT

CTT

GAA

TTT

TGG

GAG

GGC

GTC

TTT

ACA

GGC

GGG

CAC

ACG

GTC

CTG

GTA

GAA

CTT

AAA

ACC

CTC

CCG

CAG

AAA

TGT

CCG

Leu

Thr

His

Ile

Asp

Ala

His

Phe

Leu

Ser

Gln

Thr

Lys

Gln

Ser

Gly

CTC

ACT

CAT

ATA

GAT

GCC

CAC

TTT

CTA

TCC

CAG

ACA

AAG

CAG

AGT

GGG

GAG

TGA

GTA

TAT

CTA

CGG

GTG

AAA.

GAT

AGG

GTC

TGT

TTC

GTC

TCA

CCC

Glu

Asn

Leu

Pro

Tyr

Leu

Val

Ala

Tyr

Gln

Ala

Thr

Val

Cys

Ala

Arg

GAG

AAC

CTT

CCT

TAC

CTG

GTA

GCG

TAC

CAA

GCC

ACC

GTG

TGC

GCT

AGG

GTC

TTG

GAA

GGA

ATG

GAC

CAT

CGC

ATG

GTT

CGG

TGG

CAC

ACG

CGA

TCC

Ala

Gln

Ala

Pro

Pro

Pro

Ser

Trp

Asp

Gln

Met

Trp

Lys

Cys

Leu

Ile

GCT

CAA

GCC

CCT

CCC

CCA

TCG

TGG

GAC

CAG

ATG

TGG

AAG

TGT

TTG

ATT

CGA

GTT

CGG

GGA

GGG

GGT

AGC

ACC

CTG

GTC

TAC

ACC

TTC

ACA

AAC

TAA

Arg

Leu

Lys

Pro

Thr

Leu

His

Gly

Pro

Thr

Pro

Leu

Leu

Tyr

Arg

Leu

CGC

CTC

AAG

CCC

ACC

CTC

CAT

GGG

CCA

ACA

CCC

CTG

CTA

TAC

AGA

CTG

GCG

GAG

TTC

GGG

TGG

GAG

GTA

CCC

GGT

TGT

GGG

GAC

GAT

ATG

TCT

GAC

Gly Ala Ala Glu Phe GGC GCT GCC GAA TTC CCG CGA CGG CTT AAG

T

EcoRI

Fig

169 273

C33c

Glu

Phe

Gly

Ala

Val

Asp

Phe

Ile

Pro

Val

Glu

Asn

Leu

Glu

Thr

Thr

GAA

TTC

GGG

GCG

GTG

GAC

TTT

ATC

CCT

GTG

GAG

AAC

CTA

GAG

ACA

ACC

CTT

AAG

CCC

CGC

CAC

CTG

AAA

TAG

GGA

CAC

CTC

TTG

GAT

CTC

TGT

TGG

EcoRI

Met

Arg

Ser

Pro

Val

Phe

Thr

Asp

Asn

Ser

Ser

Pro

Pro

Val

Val

Pro

ATG

AGG

TCC

CCG

GTG

TTC

ACG

GAT

AAC

TCC

TCT

CCA

CCA

GTA

GTG

CCC

TAC

TCC

AGG

GGC

CAC

AAG

TGC

CTA

TTG

AGG

AGA

GGT

GGT

CAT

CAC

GGG

Gin

Ser

Phe

Gin

Val

Ala

His

Leu

His

Ala

Pro

Thr

Gly

Ser

Gly

Lys

CAG

AGC

TTC

CAG

GTG

GCT

CAC

CTC

CAT

GCT

CCC

ACA

GGC

AGC

GGC

AAA

GTC

TCG

AAG

GTC

CAC

CGA

GTG

GAG

GTA

CGA

GGG

TGT

CCG

TCG

CCG

TTT

Ser

Thr

Lys

Val

Pro

Ala

Ala

Tyr

Ala

Ala

Gin

Gly

Tyr

Lys

Val

Leu

AGC

ACC

AAG

GTC

CCG

GCT

GCA

TAT

GCA

GCT

CAG

GGC

TAT

AAG

GTG

CTA

TCG

TGG

TTC

CAG

GGC

CGA

CGT

ATA

CGT

CGA

GTC

CCG

ATA

TTC

CAC

GAT

Val

Leu

Asn

Pro

Ser

Val

Ala

Ala

Thr

Leu

Gly

Phe

Gly

Ala

Tyr

Met

GTA

CTC

AAC

CCC

TCT

GTT

GCT

GCA

ACA

CTG

GGC

TTT

GGT

GCT

TAC

ATG

CAT

GAG

TTG

GGG

AGA

CAA

CGA

CGT

TGT

GAC

CCG

AAA

CCA

CGA

ATG

TAC

Ser

Lys

Ala

His

Gly

Ile

Asp

Pro

Asn

Ile

Arg

Thr

Gly

Val

Arg

Thr

TCC

AAG

GCT

CAT

GGG

ATC

GAT

CCT

AAC

ATC

AGG

ACC

GGG

GTG

AGA

ACA

AGG

TTC

CGA

GTA

CCC

TAG

CTA

GGA

TTG

TAG

TCC

TGG

CCC

CAC

TCT

TGT

Ile

Thr

Thr

Gly

Ser

Pro

Ile

Thr

Tyr

Ser

Thr

Tyr

Gly

Lys

Phe

Leu

ATT

ACC

ACT

GGC

AGC

CCC

ATC

ACG

TAC

TCC

ACC

TAC

GGC

AAG

TTC

CTT

TAA

IGG

TGA

CCG

TCG

GGG

TAG

TGC

ATG

AGG

TGG

ATG

CCG

TTC

AAG

GAA

Ala

Asp

Gly

Gly

Cys

Ser

Gly

Gly

Ala

Tyr

Asp

Ile

Ile

Ile

Cys

Asp

GCC

GAC

GGC

GGG

TGC

TCG

GGG

GGC

GCT

TAT

GAC

ATA

ATA

ATT

TGT

GAC

CGG

CTG

CCG

CCC

.ACG

AGC

CCC

CCG

CGA

ATA

CTG

TAT

TAT

TAA

ACA

CTG

Glu

Cys

His

Ser

Thr

Asp

Ala

Thr

Ser

Ile

Leu

Gly

Ile

Gly

Thr

Val

GAG

TGC

CAC

TCC

ACG

GAT

GCC

ACA

TCC

ATC

TTG

GGC

ATT

GGC

ACT

GTC

CTC

ACG

GTG

AGG

TGC

CTA

CGG

TGT

AGG

TAG

AAC

CCG

TAA

CCG

TGA

CAG

Fig

169 273

Leu Asp Gln Ala Glu Thr CTT GAC CAA GCA GAG ACT GAA CTG GTT CGT CTC TGA

Ala Gly Ala Arg Leu Val Val GCG C-GG GCG AGA CTG GTT GTG CGC CCC CGC TCT GAC CAA CAC

Leu Ala Thr CTC GCC ACC GAG CGG TGG

Ala Thr Pro Pro Gly Ser GCC ACC CCT CCG GGC TCC CGG TGG GGA GGC CCG AGG

Val Thr Val Pro His Pro Asn GTC ACT GTG CCC CAT CCC AAC CAG TGA CAC GGG GTA GGG TTG

Ile Glu Glu ATC GAG GAG TAG CTC CTC

Val Ala Leu Ser Thr Thr GTT GCT CTG TCC ACC ACC CAA CGA GAC AGG TGG TGG

Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly GGA GAG ATC CCT TTT TAC GGC CCT CTC TAG GGA AAA ATG CCG

Lys Ala Ile AAG GCT ATC TTC CGA TAG

Pro Leu CCC CTC GGG GAG

Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His GAA GTA ATC AAG GGG GGG AGA CAT CTT CAT TAG TTC CCC CCC TCT GTA

Leu Ile Phe CTC ATC TTC GAG TAG AAG

Cys His Ser TGT CAT TCA ACA GTA AGT

Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala AAG AAG AAG TGC GAC GAA CTC GCC GCA AAG CTG GTC GCA TTC TTC TTC ACG CTG CTT GAG CGG CGT TTC GAC CAG CGT

Leu Gly Ile TTG GGC / ATC AAC CCG TAG

Asn Ala AAT GCC TTA CGG

Val Ala Tyr Tyr GTG GCC TAC TAC CAC CGG ATG ATG

Arg Gly Leu Asp Val Ser Val CGC GGT CTT GAC GTG TCC GTC GCG CCA GAA CTG CAC AGG CAG

Ile Pro Thr ATC CCG ACC TAG GGC TGG

Ser Gly AGC GGC TCG CCG

Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met GAT GTT GTC GTC GTG GCA ACC GAT GCC CTC ATG CTA CAA CAG CAG CAC CGT TGG CTA CGG GAG TAC

Thr Gly Tyr ACC GGC TAT TGG CCG ATA

Thr Gly ACC GGC TGG CCG

Asp Phe Asp Ser Val GAC TTC GAC TCG GTG CTG AAG CTG AGC CAC

Ile Asp Cys ATA GAC TGC TAT CTG ACG

Asn Thr Cys AAT ACG TGT TTA TGC ACA

T

Hinfl

Ala Glu Phe GCC GAA TTC CGG CTT AAG ί

EcoRI

Fig.

(ciąg dalszy)

169 273

Hinfl

I — C35

C31

C33c

C200

S/αΝΙ

I

C7f ------------------------ C20c

C7f+C20c

C8h

Ddel i £c<?RII

C26d ---------

C33c ------------------ -------C300

Fig. 9

169 273

C7f+C20c

C7fC20cC300

NaeI

I

--------- C300

Ndel i

| C200

C7fC20cC300C200

Fig- 9 (ciąg dalszy)

169 273

-155 Met Ala ATG GCT TAC CGA

-150

Thr Asn Pro Val cys Val Leu ACA AAC CCT GTT TGC GTT TTG TGT TTG GGA CAA ACG CAA AAC

145

-140

-135

Lys

Gly

Asp

Gly

Pro

Val

Gln

Gly

Ile

Ile

Asn

Phe

Glu

Gln

Lys

Glu

AAG

GGT

GAC

GGC

CCA

GTT

CAA

GGT

ATT

ATT

AAC

TTC

GAG

CAG

AAG

GAA

TTC

CCA

CTG

CCG

GGT

CAA

GTT

CCA

TAA

TAA

TTG

AAG

CTC

GTC

TTC

CTT

-130

-125

-120

-115

Ser

Asn

Gly

Pro

Val

Lys

Val

Trp

Gly

Ser

Ile

Lys

Gly

Leu

Thr

Glu

AGT

AAT

GGA

CCA

GTG

AAG

GTG

TGG

GGA

AGC

ATT

AAA

GGA

CTG

ACT

GAA

TCA

TTA

CCT

GGT

CAC

TTC

CAC

ACC

CCT

TCG

TAA

TTT

CCT

GAC

TGA

CTT

-110

-105

-100

Gly

Leu

His

Gly

Phe

His

Val

His

Glu

Phe

Gly

Asp

Asn

Thr

Ala

Gly

GGC

CTG

C.- '

GGA

TTC

CAT

GTT

CAT

GAG

TTT

GGA

GAT

AAT

ACA

GCA

GGC

CCG

GAC

GTA

CCT

AAG

GTA

CAA

GTA

CTC

AAA

CCT

CTA

TTA

TGT

CGT

CCG

-95

-90

-85

Cys

Thr

Ser

Pro

Gly

Pro

His

Phe

Asn

Pro

Leu

Ser

Arg

Lys

His

Gly

TGT

ACC

AGT

CCA

GGT

CCT

CAC

TTT

AAT

CCT

CTA

TCC

AGA

AAA

CAC

GGT

ACA

TGG

TCA

GGT

CCA

GGA

GTG

AAA

TTA

GGA

GAT

AGG

TCT

TTT

GTG

CCA

-80

-75

-70

Gly

Pro

Lys

Asp

Glu

Glu

Arg

His

Val

Gly

Asp

Leu

Gly

Asn

Val

Thr

GGG

CCA

AAG

GAT

GAA

GAG

AGG

CAT

GTT

GGA

GAC

TTG

GGC

AAT

GTG

ACT

CCC

GGT

TTC

CTA

CTT

CTC

TCC

GTA

CAA

CCT

CTG

AAC

CCG

TTA

CAC

TGA

-65

-60

-55

Ala

Asp

Lys

Asp

Gly

Val

Ala

Asp

Val

Ser

Ile

Glu

Asp

Ser

Val

Ile

GCT

GAC

AAA

GAT

GGT

GTG

GCC

GAT

GTG

TCT

ATT

GAA

GAT

TCT

GTG

ATC

CGA

CTG

TTT

CTA

CCA

CAC

CGG

CTA

CAC

AGA

TAA

CTT

CTA

AGA

CAC

TAG

-50

-45

-40

-35

Ser

Leu

Ser

Gly

Asp

His

Cys

Ile

Ile

Gly

Arg

Thr

Leu

Val

Val

His

TCA

CTC

TCA

GGA

GAC

CAT

TGC

ATC

ATT

GGC

CGC

ACA

CTG

GTG

GTC

CAT

AGT

GAG

AGT

CCT

CTG

GTA

ACG

TAG

TAA

CCG

GCG

TGT

GAC

CAC

CAG

GTA

-30

-25

-20

Glu

Lys

Ala

Asp

Asp

Leu

Gly

Lys

Gly

Gly

Asn

Glu

Glu

Ser

Thr

Lys

GAA

AAA

GCA

GAT

GAC

TTG

GGC

AAA

GGT

GGA

AAT

GAA

GAA

AGT

ACA

AAG

CTT

TTT

CGT

CTA

CTG

AAC

CCG

TTT

CCA

CCT

TTA

CTT

CTT

TCA

TGT

TTC

-15

-10

-5

Thr

Gly

Asn

Ala

Gly

Ser

Arg

Leu

Ala

Cys

Gly

Val

Ile

Gly

Ile

Arg

ACA

GGA

AAC

GCT

GGA

AGT

CGT

TTG

GCT

TGT

GGT

GTA

ATT

GGG

ATC

CGA

TGT

CCT

TTG

CGA

CCT

TCA

GCA

AAC

CGA

ACA

CCA

CAT

TAA

CCC

TAG

GCT

Fig

169 273

1

5

10

Arg

Ile

Gly

Thr

Tyr

Val

Tyr

Asn

His

Leu

Thr

Pro

Leu

Arg

Asp

Trp

ATT

CGG

GGC

ACC

TAT

GTT

TAT

AAC

CAT

CTC

ACT

CCT

CTT

CGG

GAC

TGG

TAA

GCC

CCG

TGG

ATA

CAA

ATA

TTG

GTA

GAG

TGA

GGA

GAA

GCC

CTG

ACC

15

20

25

30

Ala

His

Asn

Gly

Leu

Arg

Asp

Leu

Ala

Val

Ala

Val

Glu

Pro

Val

Val

GCG

CAC

AAC

GGC

TTG

CGA

GAT

CTG

GCC

GTG

GCT

GTA

GAG

CCA

GTC

GTC

CGC

GTG

TTG

CCG

AAC

GCT

CTA

GAC

CGG

CAC

CGA

CAT

CTC

GGT

CAG

CAG

35

40

45

Phe

Ser

Gln

Met

Glu

Thr

Lys

Leu

Ile

Thr

Trp

Gly

Ala

Asp

Thr

Ala

TTC

TCC

CAA

ATG

GAG

ACC

AAG

CTC

ATC

ACG

TGG

GGG

GCA

GAT

ACC

GCC

AAG

AGG

GTT

TAC

CTC

TGG

TTC

GAG

TAG

TGC

ACC

CCC

CGT

CTA

TGG

CGG

50

5 5

60

Ala

Cys

Gly

Asp

Ile

Ile

Asn

Gly

Leu

Pro

Val

Ser

Ala

Arg

Arg

Gly

GCG

TGC

GGT

GAC

ATC

ATC

AAC

GGC

TTG

CCT

GTT

TCC

GCC

CGC

AGG

GGC

CGC

ACG

CCA

CTG

TAG

TAG

TTG

CCG

AAC

GGA

CAA

AGG

CGG

GCG

TCC

CCG

/

65

70

75

Arg

Glu

Ile

Leu

Leu

Gly

Pro

Ala

Asp

Gly

Met

Val

Ser

Lys

Gly

Trp

CGG

GAG

ATA

CTG

CTC

GGG

CCA

GCC

GAT

GGA

ATG

GTC

TCC

AAG

GGT

TGG

GCC

CTC

TAT

GAC

GAG

CCC

GGT

CGG

CTA

CCT

TAC

CAG

AGG

TTC

CCA

ACC

80

85

90

Arg

Leu

Leu

Ala

Pro

Ile

Thr

Ala

Tyr

Ala

Gln

Gln

Thr

Arg

Gly

Leu

AGG

TTG

CTG

GCG

CCC

ATC

ACG

GCG

TAC

GCC

CAG

CAG

ACA

AGG

GGC

CTC

TCC

AAC

GAC

CGC

GGG

TAG

TGC

CGC

ATG

CGG

GTC

GTC

TGT

TCC

CCG

GAG

95

100

105

110

Leu

Gly

Cys

Ile

Ile

Thr

Ser

Leu

Thr

Gly

Arg

Asp

Lys

Asn

Gln

Val

CTA

GGG

TGC

ATA

ATC

ACC

AGC

CTA

ACT

GGC

CGG

GAC

AAA

AAC

CAA

GTG

GAT

CCC

ACG

TAT

TAG

TGG

TCG

GAT

TGA

CCG

GCC

CTG

TTT

TTG

GTT

CAC

115

120

125

Glu

Gly

Glu

Val

Gln

Ile

Val

Ser

Thr

Ala

Ala

Gln

Thr

Phe

Leu

Ala

GAG

GGT

GAG

GTC

CAG

ATT

GTG

TCA

ACT

GCT

GCC

CAA

ACC

TTC

CTG

GCA

CTC

CCA

CTC

CAG

GTC

TAA

CAC

AGT

TGA

CGA

CGG

GTT

TGG

AAG

GAC

CGT

Fig .

(cigg dalszy)

169 273

130

135

140

Thr

Cys

Ile

Ile

Asn

Gly

Val

Cys

Trp

Thr

Val

Tyr

His

Gly

Ala

Gly

ACG

TGC

ATC

ATC

AAT

GGG

GTG

TGC

TGG

ACT

GTC

TAC

CAC

GGG

GCC

GGA

TGC

ACG

TAG

TAG

TTA

CCC

CAC

ACG

ACC

TGA

CAG

ATG

GTG

CCC

CGG

CCT

145

150

155

Thr

Arg

Thr

Ile

Ala

Ser

Pro

Lys

Gly

Pro

Val

Ile

Gln

Met

Tyr

Thr

ACG

AGG

ACC

ATC

GCG

TCA

CCC

AAG

GGT

CCT

GTC

ATC

CAG

ATG

TAT

ACC

TGC

TCC

TGG

TAG

CGC

AGT

GGG

TTC

CCA

GGA

CAG

TAG

GTC

TAC

ATA

TGG

160

165

170

Asn

Val

Asp

Gln

Asp

Leu

Val

Gly

Trp

Pro

Ala

Ser

Gln

Gly

Thr

Arg

AAT

GTA

GAC

CAA

GAC

CTT

GTG

GGC

TGG

CCC

GCT

TCG

CAA

GGT

ACC

CGC

TTA

CAT

CTG

GTT

CTG

GAA

CAC

CCG

ACC

GGG

CGA

AGC

GTT

CCA

TGG

GCG

175

180

185

190

Ser

Leu

Thr

Pro

Cys

Thr

Cys

Gly

Ser

Ser

Asp

Leu

Tyr

Leu

Val

Thr

TCA

TTG

ACA

CCC

TGC

ACT

TGC

GGC

TCC

TCG

GAC

CTT

TAC

CTG

GTC

ACG

AGT

AAC

TGT

GGG

ACG

TGA

ACG

CCG

AGG

AGC

CTG

GAA

ATG

GAC

CAG

TGC

195

200

205

Arg

His

Ala

Asp

Val

Ile

Pro

Val

Arg

Arg

Arg

Gly

Asp

Ser

Arg

Gly

AGG

CAC

GCC

GAT

GTC

ATT

CCC

GTG

CGC

CGG

CGG

GGT

GAT

AGC

AGG

GGC

TCC

GTG

CGG

CTA

CAG

TAA

GGG

CAC

GCG

GCC

GCC

CCA

CTA

TCG

TCC

CCG

Τ

Nael

210

215

220

Ser

Leu

Leu

Ser

Pro

Arg

Pro

Ile

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gly

Ser

Ser

Gly

AGC

CTG

CTG

TCG

CCC

CGG

CCC

ATT

TCC

TAC

TTG

AAA

GGC

TCC

TCG

GGG

TCG

GAC

GAC

AGC

GGG

GCC

GGG

TAA

AGG

ATG

AAC

TTT

CCG

AGG

AGC

CCC

225

230

235

Gly

Pro

Leu

Leu

Cys

Pro

Ala

Gly

His

Ala

Val

Gly

Ile

Phe

Arg

Ala

GGT

CCG

CTG

TTG

TGC

CCC

GCG

GGG

CAC

GCC

GTG

GGC

ATA

TTT

AGG

GCC

CCA

GGC

GAC

AAC

ACG

GGG

CGC

CCC

GTG

CGG

CAC

CCG

TAT

AAA

TCC

CGG

240

245

250

Ala

Val

Cys

Thr

Arg

Gly

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Asp

Phe

Ile

Pro

Val

GCG

GTG

TGC

ACC

CGT

GGA

GTG

GCT

AAG

GCG

GTG

GAC

TTT

ATC

CCT

GTG

CGC

CAC

ACG

TGG

GCA

CCT

CAC

CGA

TTC

CGC

CAC

CTG

AAA

TAG

GGA

CAC

Fig

O (ciąg dalszy)

169 273

255

Glu Asn GAG AAC CTC TTG

Leu Glu CTA GAG GAT CTC

260 Thr Thr ACA ACC TGT TGG

Met Arg ATG AGG TAC TCC

Ser Pro TCC CCG AGG GGC

265

Val Phe GTG TTC CAC AAG

Thr Asp ACG GAT TGC CTA

270 Asn Ser AAC TCC TTG AGG

Ser Pro TCT CCA AGA GGT

Pro Val CCA GTA GGT CAT

275

Val Pro GTG CCC CAC GGG

Gin Ser CAG AGC GTC TCG

280 Phe Gin TTC CAG AAG GTC

Val Ala GTG GCT CAC CGA

His Leu CAC CTC GTG GAG

285

His Ala CAT GCT GTA CGA

Pro Thr CCC ACA GGG TGT

290 Gly Ser GGC AGC CCG TCG

Gly Lys GGC AAA CCG TTT

Ser Thr AGC ACC TCG TGG

295

Lys Val AAG GTC TTC CAG

Pro Ala CCG GCT GGC CGA

Gin Gly CAG GGC GTC CCG

305

Tyr Lys TAT AAG ATA TTC

Val Leu GTG CTA CAC GAT

310 Val Leu GTA CTC CAT GAG

Asn Pro AAC CCC TTG GGG

Ser Val TCT GTT AGA CAA

300 Ala Tyr GCA TAT CGT ATA

T

Ndel

315

Ala Ala GCT GCA CGA CGT

Ala Ala GCA GCT CGT CGA

Thr Leu ACA CTG TGT GAC

320 Gly Phe GGC TTT CCG AAA

Gly Ala GGT GCT CCA CGA

Tyr Met TAC ATG ATG TAC

325

Ser Lys TCC AAG AGG TTC

Ala His GCT CAT CGA GTA

330 Gly Ile GGG ATC CCC TAG

Asp Pro GAT CCT CTA GGA

Asn Ile AAC ATC TTG TAG

335

Arg Thr AGG ACC TCC TGG

Gly Val GGG GTG CCC CAC

340 Arg Thr AGA ACA TCT TGT

Ile Thr ATT ACC TAA TGG

Thr Gly ACT GGC TGA CCG

345

Ser Pro AGC CCC TCG GGG

Ile Thr ATC ACG TAG TGC

350 Tyr Ser TAC TCC ATG AGG

Thr Tyr ACC TAC TGG ATG

Gly Lys GGC AAG CCG TTC

355

Phe Leu TTC CTT AAG GAA

Ala Asp GCC GAC CGG CTG

360 Gly Gly GGC GGG CCG CCC

Cys Ser TGC TCG ACG AGC

Gly Gly GGG GGC CCC CCG

365

Ala Tyr GCT TAT CGA ATA

Asp Ile GAC ATA CTG TAT

370 Ile Ile ATA ATT TAT TAA

Cys Asp TGT GAC ACA CTG

Glu Cys GAG TGC CTC ACG

375

His Ser CAC TCC GTG AGG

Thr Asp ACG GAT TGC CTA

380 Ala Thr GCC ACA CGG TGT

Ser Ile TCC ATC AGG TAG

Fig (ciąg dalszy)

169 273

385

390

395

Leu

Gly

Ile

Gly

Thr

Val

Leu

Asp

Gln

Ala

Glu

Thr

Ala

Gly

Ala

Arg

TTG

GGC

ATT

GGC

ACT

GTC

CTT

GAC

CAA

GCA

GAG

ACT

GCG

GGG

GCG

AGA

AAC

CCG

TAA

CC Z-

TGA

CAG

GAA

CTG

GTT

CGT

CTG

TGA

CGC

CCC

CGC

TCT

400

405

410

Leu

Val

Val

Leu

Ala

Thr

Ala

Thr

Pro

Pro

Gly

Ser

Val

Thr

Val

Pro

CTG

GTT

GTG

CTC

GCC

ACC

GCC

ACC

CCT

CCG

GGC

TCC

GTC

ACT

GTG

CCC

GAC

CAA

CAC

GAG

CGG

TGG

CGG

TGG

GGA

GGC

CCG

AGG

CAG

TGA

CAC

GGG

415

420

425

430

His

Pro

Asn

Ile

Glu

Glu

Val

Ala

Leu

Ser

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Pro

CAT

CCC

AAC

ATC

GAG

GAG

GTT

GCT

CTG

TCC

ACC

ACC

GGA

GAG

ATC

CCT

GTA

GGG

TTG

TAG

CTC

CTC

CAA

CGA

GAC

AGG

TGG

TGG

CCT

CTC

TAG

GGA

435

440

445

Phe

Tyr

Gly

Lys

Ala

Ile

Pro

Leu

Glu

Val

Ile

Lys

Gly

Gly

Arg

His

TTT

TAC

GGC

AAG

GCT

ATC

CCC

CTC

GAA

GTA

ATC

AAG

GGG

GGG

AGA

CAT

AAA

ATG

CCG

TTC

CGA

TAG

GGG

GAG

CTT

CAT

TAG

TTC

CCC

CCC

TCT

GTA

450

455

460

Leu

Ile

Phe

Cys

His

Ser

Lys

Lys

Lys

Cys

Asp

Glu

Leu

Ala

Ala

Lys

CTC

ATC

TTC

TGT

CAT

TCA

AAG

AAG

AAG

TGC

GAC

GAA

CTC

GCC

GCA

AAG

GAG

TAG

AAG

ACA

GTA

AGT

TTC

TTC

TTC

ACG

CTG

CTT

GAG

CGG

CGT

TTC

465

470

475

Leu

Val

Ala

Leu

Gly

Ile

Asn

Ala

Val

Ala

Tyr

Tyr

Arg

Gly

Leu

Asp

CTG

GTC

GCA

TTG

GGC

ATC

AAT

GCC

GTG

GCC

TAC

TAC

CGC

GGT

CTT

GAC

GAC

CAG

CGT

AAC

CCG

TAG

TTA

CGG

CAC

CGG

ATG

ATG

GCG

CCA

GAA

CTG

480

485

490

Val

Ser

Val

Ile

Pro

Thr

Ser

Gly

Asp

Val

Val

Val

Val

Ala

Thr

Asp

GTG

TCC

GTC

ATC

CCG

ACC

AGC

GGC

GAT

GTT

GTC

GTC

GTG

GCA

ACC

GAT

CAC

AGG

CAG

TAG

GGC

TGG

TCG

CCG

CTA

CAA

CAG

CAG

CAC

CGT

TGG

CTA

Ficj · (ciąg dalszy)

169 273

495

500

505

510

Ala

Leu

Met

Thr

Gly

Tyr

Thr

Gly

Asp

Phe

Asp

Ser

Val

Ile

Asp

Cys

GCC

CTC

ATG

ACC

GGC

TAT

ACC

GGC

GAC

TTC

GAC

TCG

GTG

ATA

GAC

TGC

CGG

GAG

TAC

TGG

CCG

ATA

TGG

CCG

CTG

AAG

CTG

AGC

CAC

TAT

CTG

ACG

515

520

525

Asn

Thr

Cys

Val

Thr

Gln

Thr

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Asp

Pro

Thr

Phe

AAT

ACG

TGT

GTC

ACC

CAG

ACA

GTC

2λΤ

TTC

AGC

CTT

GAC

CCT

ACC

TTC

TTA

TGC

ACA

CAG

TGG

GTC

TGT

CAG

CTA

AAG

TCG

GAA

CTG

GGA

TGG

AAG

530

535

540

Ihr

Ile

Glu

Thr

Ile

Thr

Leu

Pro

Gln

Asp

Ala

Val

Ser

Arg

Thr

Gln

ACC

ATT

GAG

ACA

ATC

ACG

CTC

CCC

CAA

GAT

GCT

GTC

TCC

CGC

ACT

CAA

TGG

TAA

CTC

TGT

TAG

TGC

GAG

GGG

GTT

CTA

CGA

CAG

AGG

GCG

TGA

GTT

545

550

555

Arg

Arg

Gly

Arg

Thr

Gly

Arg

Gly

Lys

Pro

Gly

Ile

Tyr

Arg

Phe

Val

CGT

CGG

GGC

AGG

ACT

GGC

AGG

GGG

AAG

CCA

GGC

ATC

TAC

AGA

TTT

GTG

GCA

GCC

CCG

TCC

TGA

CCG

TCC

CCC

TTC

GGT

CCG

TAG

ATG

TCT

AAA

CAC

/

560

565

570

Ala

Pro

Gly

Glu

Arg

Pro

Pro

Gly

Met

Phe

Asp

Ser

Ser

Val

Leu

Cys

GCA

CCG

GGG

GAG

CGC

CCT

CCC

GGC

ATG

TTC

GAC

TCG

TCC

GTC

CTC

TGT

CGT

GGC

CCC

CTC

GCG

GGA

GGG

CCG

TAC

AAG

CTG

AGC

AGG

CAG

GAG

ACA

575

580

585

590

Glu

Cys

Tyr

Asp

Ala

Gly

Cys

Ala

Trp

Tyr

Glu

Leu

Thr

Pro

Ala

Glu

GAG

TGC

TAT

GAC

GCA

GGC

TGT

GCT

TGG

TAT

GAG

CTC

ACG

CCC

GCC

GAG

CTC

ACG

ATA

CTG

CGT

CCG

ACA

CGA

ACC

ATA

CTC

GAG

TGC

GGG

CGG

CTC

595

600

605

Thr

Thr

Val

Arg

Leu

Arg

Ala

Tyr

Met

Asn

Thr

Pro

Gly

Leu

Pro

Val

ACT

ACA

GTT

AGG

CTA

CGA

GCG

TAC

ATG

AAC

ACC

CCG

GGG

CTT

CCC

GTG

TGA

TGT

CAA

TCC

GAT

GCT

CGC

ATG

TAC

TTG

TGG

GGC

CCC

GAA

GGG

CAC

Fitg.

(ciąg dalszy)

169 273

610

615

620

Cys

Gin

Asp

His

Leu

Glu

Phe

Trp

Glu

Gly

Val

Phe

Thr

Gly

Leu

Thr

TGC

CAG

GAC

CAT

CTT

GAA

TTT

TGG

GAG

GGC

GTC

TTT

ACA

GGC

CTC

ACT

ACG

GTC

CTG

GTA

GAA

CTT

AAA

ACC

CTC

CCG

CAG

AAA

TGT

CCG

GAG

TGA

625

630

635

His

Ile

Asp

Ala

His

Phe

Leu

Ser

Gin

Thr

Lys

Gin

Ser

Gly

Glu

Asn

CAT

ATA

GAT

GCC

CAC

TTT

CTA

TCC

CAG

ACA

AAG

CAG

AGT

GGG

GAG

AAC

GTA

TAT

CTA

CGG

GTG

AAA

GAT

AGG

GTC

TGT

TTC

GTC

TCA

CCC

CTC

TTG

640

645

650

Leu

Pro

Tyr

Leu

Val

Ala

Tyr

Gin

Ala

Thr

Val

Cys

Ala

Arg

Ala

Gin

CTT

CCT

TAC

CTG

GTA

GCG

TAC

CAA

GCC

ACC

GTG

TGC

GCT

AGG

GCT

CAA

GAA

GGA

ATG

GAC

CAT

CGC

ATG

GTT

CGG

TGG

CAC

ACG

CGA

TCC

CGA

GTT

655

660

665

670

Ala

Pro

Pro

Pro

Ser

Trp

Asp

Gin

Met

Trp

Lys

Cys

Leu

Ile

Arg

Leu

GCC

CCT

CCC

CCA

TCG

TGG

GAC

CAG

ATG

TGG

AAG

TGT

TTG

ATT

CGC

CTC

CGG

GGA

GGG

GGT

AGC

ACC

CTG

GTC

TAC

ACC

TTC

ACA

AAC

TAA

GCG

GAG

675

680

685

Lys

Pro

Thr

Leu

His

Gly

Pro

Thr

Pro

Leu

Leu

Tyr

Arg

Leu

Gly

Ala

AAG

CCC

ACC

CTC

CAT

GGG

CCA

ACA

CCC

CTG

CTA

TAC

AGA

CTG

GGC

GCT

TTC

GGG

TGG

GAG

GTA

CCC

GGT

TGT

GGG

GAC

GAT

ATG

TCT

GAC

CCG

CGA

Fig .

10

(ciąg

dalszy)

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz.

Cena 6,00 zł

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób badania związków pod względem aktywności skierowanej przeciw wirusowi zapalenia wątroby C, znamienny tym, że dostarcza się aktywną proteazę wirusa zapalenia wątroby C, o częściowej wewnętrznej sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej:

   Trp Thr Val Tyr His Gly Ala (Gl^y Thr Arg Tir·- ; t Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu- lub Arg Arg Gly Arg: G lu Ile Leu Leu Gll Pro Ala Asp Gly Met Val Ser Lys GlG TTp Apg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr· Aa: Gly Leu Leu Gly Sys Ile Ile TIpl Ser Leu Thr Gly Arg Arp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Ile Val Ser Thr A Au Ala Gln ThP Phh Leu Ala T^ł^r Cys Ile Asn Gly Val Cys TTp Thr Val Tyr HHs Gly Ala Gly Thr Apg Thr Ile Ala Ser· P pp Lys Gly Ppo Val Ile Gln Met Tyr ThP Asn Val Asp Gln Agp •Leu Val Gly Trp Ppo Ala Pro Gln Gly Ser Arg Ser Leu Thr Pro Sys Thr Cs· Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arp His Ala Asp Val Ile Pro Val Atrg Apg Arg Gly Asp Ser Arp Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys G Gu Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ala Gly His Ala V al Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Llt Ala Val Asp Phe Ile Pro VaL Glu Asn Leu Glu Thr Thr Met Arg· -;

   i kontaktuje się tę proteazę ze związkiem mającym zdolność hamowania aktywności proteazy serynowej przy czym związek hamujący aktywność proteazy serynowej naśladuje miejsce odszczepiania rozpoznawane przez proteazę i jest wybierany sposób trójfluorometyloketonów, peptydu kwasu peptydoboronowego, peptydu-a-ketoestru, związków pepty difluoroketonowych, peptydoaldehydów, peptydodiketonów, przeciwciał i pochodnych przeciwciał, a następnie mierzy się stopień hamowania aktywności proteolitycznej proteazy wirusa zapalenia wątroby C.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym , ze jako aktywną proteazę wirnsa wątroby C stoouje się proteaaz obejmującą zasadniczo następującą częściową wewnętrzną sekwencję aminokwasów:

   ... Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr . . .
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako aktywną proteazę wirusa zapalenia wątroby C stosuje się proteazę obejmującą zasadniczą następującą częściową wewnętrzną sekwencję aminokwasów:

   ... Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu ...

   169 273
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako aktywną proteazę wirusa zapalenia wątroby C stosuje się proteazę obejmującą zasadniczo częściową wewnętrzną sekwencję aminokwasów:

   Arg Arg Gly Arr Glu Ile Leu Leu GGl Pro Ala Asp GGl Te e Val Ser Lys G Gy Trp Arg Leu Leu AAl Pro Ile Thr AAl Tts Ala Gln G1g TTh Grg Gly Leu Leu GGl Cys Ile Ile; TTh Tsu Leu Thr GIjt AAr Tsp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Vv1 Gyy Ile Val Ser Thh Ala Ala Gin Thr PPe Leu Ala Thr Cys III Asn Gly Val C ys Trp Thr Val Tyr Hhs Gly Ala Gly Thr Arg Thr Ile Ala S se Pro Lys Gly Pro Val Ile Gin Met Ty_r TTr Asn Val Asp GGl Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gl^n Gly Ser Arg Ser Leu GM^ar Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser? Asp Lm Tyr Leu Val TTh Girg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg AAg Arg Gly Asp S se Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Ppo Ili! Ser Tyr Leu Lyy Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Ppo Ala Gly His A Al Tal Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cyy TPh Arg Gly Val AAl Tys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu Glu Thr TTh Met Arg.

   ★ * *