DE69133402T2 - Protease von hepatitis-c-virus - Google Patents

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    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Description

  • Kreuzreferenz auf verwandte Anmeldungen
  • Diese Anmeldung ist eine Teilfortsetzungs-Anmeldung der U.S. lfd. Nr. 07/505.433, eingereicht am 4. April 1990.
  • Technisches Gebiet
  • Diese Erfindung betrifft die Molekularbiologie und Virologie des Hepatitis C-Virus (HCV). Spezieller betrifft diese Erfindung eine neuartige Protease, die von HCV produziert wird, Expressionsverfahren, rekombinante Protease, Protease-Mutanten und Inhibitoren von HCV-Protease.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Nicht-A, Nicht-B-Hepatitis (NANBH) ist eine übertragbare Krankheit (oder Familie von Krankheiten), von der angenommen wird, dass sie viral verursacht ist, und die von anderen Formen Virus-assoziierter Leberkrankheiten unterscheidbar ist, wie zum Beispiel denjenigen, welche von Hepatitis A-Virus (HAV), Hepatitis B-Virus (HBV), Delta Hepatitis-Virus (HDV), Cytomegalovirus (CMV) oder Epstein-Barr-Virus (EBV) verursacht werden. Epidemiologische Evidenz legt nahe, dass drei Typen von NANBH existieren: den aus Wasser stammenden epidemischen Typ; den Blut- oder Nadel-assoziierten Typ; und den sporadisch auftretenden (gesellschaftlich erworbenen) Typ. Jedoch ist die Anzahl ursachlicher Agenzien unbekannt. Kürzlich wurde jedoch eine neue virale Spezies, das Hepatitis C-Virus, als die primäre (wenn nicht einzige) Ursache Blut-assoziierter NANBH (BB-NANBH) identifiziert. Siehe beispielsweise PCT WO89/046699; U.S. Patentanmeldung lfd. Nr. 7/456.637, eingereicht am 21. Dezember 1989; und U.S. Patentanmeldung lfd. Nr. 7/456.637, eingereicht am 21. Dezember 1989, die hierin durch Referenz aufgenommen wurden. Hepatitis C scheint die Hauptform Transfusions-assoziierter Hepatitis in vielen Ländern, einschließlich den Vereinigten Staaten und Japan, zu sein. Es gibt auch Hinweise, dass HCV mit der Verursachung von primärem Leberzellkarzinom in Verbindung steht. Daher besteht Bedarf an einem wirksamen Verfahren zur Behandlung von HCV-Infektionen: gegenwärtig gibt es keines.
  • Viele Viren, einschließlich Adenoviren, Baculoviren, Comoviren, Picornaviren, Retroviren und Togaviren sind auf spezifische, viral codierte Proteasen zur Prozessierung von Polypeptiden aus deren ursprünglich translatierten Formen in reife, aktive Proteine angewiesen. Im Fall von Picornaviren wird angenommen, dass alle viralen Proteine durch Spaltung eines einzigen Polyproteins entstehen (B. D. Korant, CRC Crit Rev Biotech (1988) 8: 149–57).
  • S. Pichuantes et al, in „Viral Proteinases As Targets For Chemotherapy" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) S. 215–22, haben die Expression einer in HIV-1 gefundenen, viralen Protease offenbart. Die HIV-Protease wurde in Form eines Fusionsproteins durch Fusion von DNA, die für einen Vorläufer der HIV-Protease codiert, mit DNA, die für menschliche Superoxid-Dismutase (hSOD) codiert, und Expression des Produktes in E. coli, erhalten. Transformierte Zellen haben 36 und 10 kD große Produkte exprimiert (was dem hSOD-Protease-Fusionsprotein und der Protease alleine entspricht), was nahe legt, dass die Protease in einer Form exprimiert wurde, die in der Lage war, autokatalytische Proteolyse durchzuführen.
  • T. J. McQuade et al, Science (1990) 247: 454–56, haben die Herstellung einer Peptidnachahmenden Verbindung, die zur spezifischen Hemmung der HIV-1-Protease in der Lage ist, offenbart. Es wird angenommen, dass die Protease in HIV für die Spaltung des anfänglichen p55 gag-Vorläufer-Transkripts in die Kern-Strukturproteine (p17, p24, p8 und p7) verantwortlich ist. Zugabe von 1 μM Inhibitor zu HIV-infizierten peripheren Blut-Lymphozyten in Kultur verminderte die Konzentration von prozessiertem HIV-p24 um ungefähr 70%. Die Reifung der Virenpartikel und die Mengen an infektiösem Virus wurden durch den Protease-Inhibitor vermindert.
  • R. H. Miller and R. H. Purcell, Proc Nat Acad Sci USA (1990) 87: 2057–61, berichten über die Verwandtschaft von HCV mit Mitgliedern der Gruppe der Pestiviren.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Wir haben nun ein Verfahren zur Untersuchung von Verbindungen auf Aktivität gegen HCV bereit gestellt, wobei das Verfahren umfasst:
    • – Bereitstellen einer Zusammensetzung, die eine gereinigte HCV-NS3-Domänen-Protease, die in der NS3-Domäne des HCV-Genoms codiert ist, oder Verkürzungen davon, die Proteaseaktivität haben, umfasst;
    • – Inkontaktbringen der Protease mit einer Verbindung, die fähig ist, Proteaseaktivität zu inhibieren; und
    • – Messen der Inhibierung der proteolytischen Aktivität der Protease.
  • Kurzbeschreibung der Abbildungen
  • 1 zeigt die Sequenz von HCV-Protease
  • 2 zeigt die Polynukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz des Klons C20c.
  • 3 zeigt die Polynukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz des Klons C26d.
  • 4 zeigt die Polynukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz des Klons C8h.
  • 5 zeigt die Polynukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz des Klons C7f.
  • 6 zeigt die Polynukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz des Klons C31.
  • 7 zeigt die Polynukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz des Klons C35.
  • 8 zeigt die Polynukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz des Klons C33c.
  • 9 stellt den Aufbau des Vektors C7fC20cC300C200 schematisch dar.
  • 10 zeigt die Sequenz des Vektors cf1SODp600.
  • Ausführungsformen der Erfindung
  • A. Definitionen
  • Die Begriffe „Hepatitis C-Virus" und „HCV" beziehen sich auf die Virus-Spezies, die das hauptsächliche etiologische Agens von BB-NANBH darstellt, dessen Prototyp-Isolat in PCT WO89/046699; EPO Veröffentlichung 318.216; USSN 7/355.008, eingereicht am 18. Mai 1989; und USSN 7/456.637, deren Offenbarungen hierin durch Referenz aufgenommen sind, identifiziert ist. Der Begriff „HCV", wie er hierin verwendet wird, schließt die pathogenen Stämme, die in der Lage sind, Hepatitis C zu verursachen, und abgeschwächte Stämme oder davon abgeleitete defekte Störpartikel ein. Das HCV-Genom schließt RNA ein. Es ist bekannt, dass RNA-einschließende Viren eine relativ hohe Rate an spontanen Mutationen aufweisen, Berichten zufolge in der Größenordnung von 10–3 bis 10–4 pro eingebautem Nukleotid (Fields & Knipe, „Fundamental Virology" (1986, Raven Press, N.Y.)). Da Heterogenität und ein sich im Fluss befindliches Genom inhärente Eigenschaften von RNA-Viren sind, wird es innerhalb der HCV-Spezies eine Vielzahl von Stämmen/Isolaten geben, die virulent oder avirulent sein können.
  • Information über mehrere verschiedene HCV-Stämme/-Isolate wird hierin offenbart, im besonderen über den Stamm oder das Isolat CDC/HCV1 (auch mit HCV1 bezeichnet). Information über einen Stamm oder ein Isolat, wie zum Beispiel eine Teilgenom-Sequenz, reicht aus, dass ein Fachmann, der Standardverfahren anwendet, neue Stämme/Isolate isolieren kann, und entscheiden kann, ob es sich bei den neuen Stämmen/Isolaten um HCV handelt. Zum Beispiel werden im Folgenden mehrere unterschiedliche Stämme/Isolate beschrieben. Diese Stämme, die aus einer Anzahl menschlicher Sera (und aus unterschiedlichen geographischen Gebieten) erhalten wurden, wurden unter Verwendung der genomischen Sequenz-Information von HCV1 isoliert.
  • Die hierin bereitgestellte Information legt nahe, dass HCV entfernt mit den Flaviviridae verwandt sein könnte. Die Familie der Flaviviren schließt eine große Zahl Viren ein, die kleine, umhüllte Pathogene für den Menschen sind. Die Morphologie und Zusammensetzung von Flaviviren-Partikel sind bekannt und werden in M. A. Brinton, in „The Viruses: The Togaviridae And Flaviviridae" (Serie Hrsg. Fraenkel-Conrat and Wagner, Bd. Hrsg. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press, 1986), S. 327–374, diskutiert. Hinsichtlich ihrer Morphologie schließen Flaviviren im Allgemeinen ein von einer Lipid-Doppelschicht umgebenes zentrales Nukleokapsid ein. Die Virionen sind rund und haben einen Durchmesser von ungefähr 40–50 nm. Deren Kernpartikel sind ungefähr 25–30 nm im Durchmesser. Entlang der äußeren Oberfläche der Virion-Hülle befinden sich Auswüchse einer Länge von 5–10 nm mit endständigen Knubbeln mit einem Durchmesser von ungefähr 2 nm. Typische Beispiele der Familie schließen das Gelbfieber-Virus, West-Nil-Virus und Dengue-Fieber-Virus ein. Sie besitzen Positivstrang-RNA-Genome (ungefähr 11.000 Nukleotide), welche etwas größer als das des HCV sind und codieren ein Vorläufer-Polypeptid von ungefähr 3.500 Aminosäuren. Einzelne virale Proteine werden von diesem Vorläufer-Polypeptid abgespalten.
  • Das HCV-Genom scheint aus Einzelstrang-RNA, die ungefähr 10.000 Nukleotide einschließt, zu bestehen. Das Genom besteht aus einem Positiv-Strang und besitzt einen durchgehenden translationellen offen Leserahmen (ORF), der ein Polyprotein mit ungefähr 3.000 Aminosäuren codiert. In dem ORF scheinen die Struktur-Proteine näherungsweise im ersten Viertel des N-terminalen Bereichs codiert zu sein, wobei der größere Teil des Polyproteins Nicht-Struktur-Proteinen zugeordnet ist. Verglichen mit allen bekannten viralen Sequenzen werden kleine aber signifikante co-lineare Homologien zu den Nicht-Struktur-Proteinen der Flavivirus-Familie und zu den Pestiviren (die gegenwärtig auch als Teil der Flavivirus-Familie angesehen werden) beobachtet.
  • Ein schematischer Abgleich möglicher Bereiche eines flaviviralen Polyproteins (unter Verwendung von Gelbfieber-Virus als Beispiel) und eines vermeintlichen Polyproteins, das im Haupt-ORF des HCV-Genoms codiert ist, ist in 1 dargestellt. Mögliche Domänen des HCV-Polyproteins sind in der Abbildung dargestellt. Das Gelbfieber-Virus-Polyprotein enthält, vom Amino-Ende zum Carboxy-Ende, das Nucleocapsid-Protein (C), das Matrix-Protein (M), das Hüllen-Protein (E) und die Nicht-Struktur-Proteine 1,2 (a + b), 3, 4 (a + b) und 5 (NS1, NS2, NS3, NS4 und NS5). Basierend auf den vermeintlichen Aminosäuren, die in der Nukleotid-Sequenz von HCV 1 codiert sind, erscheint eine kleine Domäne am extremen N-Terminus des HCV-Polyproteins sowohl in Bezug auf Größe als auch auf einen hohen Gehalt an basischen Resten zu dem Nucleocapsid-Protein (C), das sich am N-Terminus flaviviraler Polyproteine befindet, ähnlich zu sein. Die Nicht-Struktur-Proteine 2, 3, 4 und 5 (NS2–5) von HCV und Gelbfieber-Virus (YFV) scheinen Entsprechungen ähnlicher Größe und Hydrophobizität zu haben, obgleich die Aminosäure-Sequenzen voneinander abweichen. Jedoch weicht der Bereich des HCV, der den Bereichen des YFV-Polyproteins, die das M-, E- und NS1-Protein einschließen, entsprechen würde, nicht nur in seiner Sequenz ab, sondern scheint ebenfalls in Bezug auf Größe und Hydrophobizität ziemlich verschieden zu sein. Während auf bestimmte Domänen des HCV-Genoms hierin beispielsweise mit NS1 oder NS2 Bezug genommen wird, muss das daher dahingehend verstanden werden, dass diese Bezeichnungen nur der Hinweisfreundlichkeit dienen; es mag erhebliche Unterschiede zwischen der HCV-Familie und den Flaviviren geben, die noch berücksichtigt werden müssen.
  • Aufgrund der evolutionären Verwandtschaft der HCV-Stämme oder -Isolate sind die vermeintlichen HCV-Stämme und -Isolate aufgrund ihrer Homologie auf Polypeptid-Ebene identifizierbar. In Bezug auf die hierin offenbarten Isolate sind neue HCV-Stämme oder -Isolate erwartungsgemäß wenigstens ungefähr 40% homolog, manche mehr als ungefähr 70% homolog und manche sogar mehr als ungefähr 80% homolog: manche können auf Polypeptid-Ebene sogar mehr als ungefähr 90% homolog sein. Die Verfahren zur Bestimmung von Aminosäure-Sequenz-Homologie sind dem Fachmann geläufig. Zum Beispiel kann die Aminosäure-Sequenz direkt bestimmt und zu den hierin bereit gestellten Sequenzen verglichen werden. Alternativ kann die Nukleotid-Sequenz des genomischen Materials des vermeintlichen HCV bestimmt werden (gewöhnlich durch eine cDNA-Zwischenform), die darin codierte Aminosäure-Sequenz kann bestimmt werden, und die entsprechenden Bereiche können verglichen werden.
  • Der Begriff „HCV-Protease" bezieht sich auf ein von HCV stammendes Enzym, das proteolytische Aktivität aufweist, speziell auf das in der NS3-Domäne des HCV-Genoms codierte Polypeptid. Wenigstens ein HCV-Stamm schließt eine Protease ein, von der angenommen wird, dass sie im Wesentlichen durch die folgende Sequenz oder innerhalb der folgenden Sequenz codiert wird:
  • Figure 00050001
  • Bei den obigen N- und C-Termini handelt es sich um die vermeintlichen N- und C-Termini, wobei die tatsächlichen Termini durch Expression und Prozessierung in einem geeigneten Wirt eines DNA-Konstrukts, das die gesamte NS3-Domäne codiert, definiert werden. Es ist selbstverständlich, dass diese Sequenz von Stamm zu Stamm variieren kann, wie auch RNA-Viren wie HCV dafür bekannt sind, große Variationen aufzuweisen. Weiterhin können die tatsächlichen N- und C-Termini dadurch variieren, dass Protease von einem Vorläufer-Polypeptid abgespalten wird: Variationen in der Aminosäure-Sequenz der Protease können Abspaltungen von dem Polyprotein an verschiedenen Stellen zur Folge haben. Daher können die Amino- und Carboxy-Termini von HCV-Stamm zu HCV-Stamm verschieden sein. Die erste oben gezeigte Aminosäure entspricht dem Rest 60 in 1. Jedoch kann die Sequenz, die mindestens für die Aktivität benötigt wird, durch Routineverfahren bestimmt werden. Die Sequenz kann an beiden Enden durch Behandlung eines geeigneten Expressionsvektors mit einer Exonuklease (nach Spaltung am 5'- oder 3'-Ende der codierenden Sequenz) verkürzt werden, um jede gewünschte Anzahl von Basenpaaren zu entfernen. Das daraus hervorgehende codierende Polynukleotid wird dann exprimiert, und die Sequenz wird bestimmt. Auf diese Weise kann die Aktivität des daraus hervorgegangenen Produktes mit der Aminosäure-Sequenz korreliert werden: eine begrenzte derartige Versuchsreihe (fortschreitende Entfernung von immer mehr Basenpaaren) bestimmt die minimale interne Sequenz, die für die Protease-Aktivität benötigt wird. Wir haben herausgefunden, dass die Sequenz wesentlich verkürzt werden kann, speziell am Carboxy-Terminus, wobei offensichtlich die Protease-Aktivität in vollem Umfang beibehalten wird. Gegenwärtig wird angenommen, dass ein Teil des Proteins am Carboxy-Terminus Helikase-Aktivität aufweisen könnte. Jedoch wird Helikase-Aktivität von den HCV-Proteasen der Erfindung nicht benötigt. Der Amino-Terminus kann ebenfalls zu einem gewissen Grad verkürzt werden, ohne dass ein Verlust von Protease-Aktivität eintritt.
  • Aktivität benötigt werden, basierend auf Sequenz-Homologie zu vermeintlichen Flavivirus-Serinproteasen. Tabelle 1 zeigt den Abgleich der drei katalytischen Serinprotease-Reste für HCV-Protease und die aus Gelbfieber-Virus, West Nil-Fieber-Virus, Murray Valley-Fieber-Virus und Kunjin-Virus erhaltene Protease. Obwohl die anderen vier Flavivirus-Protease-Sequenzen eine höhere Homologie miteinander aufweisen, als mit HCV, ist dennoch ein gewisser Grad Homologie mit HCV zu beobachten. Diese Homologie war jedoch nicht ausreichend für eine Hervorhebung durch momentan erhältliche Abgleichs-Software. Die hervorgehobenen Aminosäuren sind in der obig aufgelisteten Sequenz mit His79, Asp103 und Ser161 nummeriert (His139, Asp163 und Ser221 in 1).
  • Tabelle 1: Abgleich der aktiven Reste nach Sequenz
    Figure 00060001
  • Alternativ können katalytische Reste auch aufgrund struktureller Homologie zugewiesen werden. Tabelle 2 zeigt einen Abgleich von HCV mit den katalytischen Zentren mehrerer gut charakterisierter Serinproteasen basierend auf struldurellen Erwägungen: Protease A aus Streptomyces griseus, -Lytische Protease, Rinder-Trypsin, Chymotrypsin und Elastase (M. James et al, Can J Biochem (1978) 56: 396). Wiederum wird ein gewisser Grad an Homologie beobachtet. Die identifizierten HCV-Reste sind in der oben aufgelisteten Sequenz mit His79, Asp125 und Ser161 nummeriert.
  • Tabelle 2: Vergleich der aktiven Reste nach Struktur
    Figure 00060002
  • Die direkteste Art und Weise, die für das aktive Zentrum essentiellen Reste zu bestätigen, ist es, jeden Rest einzeln durch einen Rest von gleichwertiger sterischer Größe zu ersetzen. Dies kann leicht durch Position-spezifische Mutagenese und ähnliche dem Fachmann geläufige Verfahren bewerkstelligt werden. Bewirkt der Austausch eines bestimmten Restes durch einen Rest gleichwertiger Größe einen Aktivitätsverlust, ist die essentielle Beschaffenheit des ausgetauschten Restes bestätigt.
  • Der Begriff „HCV-Protease-Analoga" bezieht sich auf Polypeptide, die von der Volllängen-Protease-Sequenz durch Entfernung, Veränderung und/oder Hinzufügung zur Aminosäure-Sequenz der nativen Protease abweichen. HCV-Protease-Analoga schließen die obig beschriebenen verkürzten Proteanen, sowie HCV-Protease-Muteine und Fusionsproteine, die HCV-Protease, verkürzte Protease oder Protease-Muteine einschließen, ein. Änderungen, die dazu dienen, HCV-Protease-Muteine zu bilden, sind vorzugsweise konservative Aminosäure-Austausche, bei denen eine Aminosäure durch eine andere natürlicherweise vorkommende Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt wird. Beispielsweise werden die folgenden Austausche als „konservativ" angesehen:
    Gly ↔ Ala;
    Val ↔ Ile ↔ Leu;
    Asp ↔ Glu;
    Lys ↔ Arg;
    Asn ↔ Gln und
    Phe ↔ Trp ↔ Tyr.
  • Nicht-konservative Veränderungen sind im Allgemeinen Ersetzungen einer der obig angeführten Aminosäuren durch eine Aminosäure aus einer anderen Gruppe (z. B. Ersetzen von Asn durch Glu), oder Ersetzen von Cys, Met, His oder Pro durch irgendeine der oben aufgeführten Aminosäuren. Ersetzungen, die herkömmliche Aminosäuren einschließen, werden zweckmäßig durch Position-spezifische Mutagenese eines Expressions-Vektors, der das gewünschte Protein codiert, und darauf folgende Expression der veränderten Form, durchgeführt. Man kann Aminosäuren auch durch synthetische oder semi-synthetische Verfahren verändern. Zum Beispiel kann man Cystein- oder Serin-Reste durch geeignete chemische Behandlung des isolierten Proteins in Selenocystein umwandeln. Alternativ kann man ungewöhnliche Aminosäuren in Standard-in vitro-Proteinsynthese-Verfahren einbauen. Typischerweise wird die Gesamtzahl der Reste, die in den Muteinen verändert, entfernt oder zur nativen Sequenz hinzugefügt werden, nicht mehr als ungefähr 20 betragen, vorzugsweise nicht mehr als ungefähr 10, am vorzugswürdigsten nicht mehr als ungefähr 5.
  • Der Begriff Fusionsprotein bezieht sich im Allgemeinen auf ein Polypeptid, das eine durchgehende Aminosäure-Sequenz bestehend aus zwei oder mehr individuellen Proteinen besitzt. In der vorliegenden Erfindung wird der Begriff „Fusionsprotein" zur Bezeichnung eines Polypeptids, das die HCV-Protease, Verkürzungen, Mutein oder einen funktionsfähigen Teil davon einschließt, der an ein nicht-HCV-Protein oder -Polypeptid („Fusionspartner") fusioniert ist, verwendet. Die zweckmäßigste Art und Weise, Fusionsproteine herzustellen, geschieht durch Expression eines fusionierten Gens, welches einen Teil eines Polypeptids am 5'-Ende und einen Teil eines anderen Polypeptid am 3'-Ende codiert, wobei die unterschiedlichen Teile zu einem Leserahmen verbunden sind, der in einem geeigneten Wirt exprimiert werden kann. Gegenwärtig wird es bevorzugt (wenn es auch nicht notwendig ist), die HCV-Protease oder das Analogon am Carboxy-Terminus des Fusionsproteins zu positionieren, und am Amino-Terminus ein funktionsfähiges Enzym-Fragment einzusetzen. Da die HCV-Protease normalerweise innerhalb eines großen Polyproteins exprimiert wird, wird nicht angenommen, dass sie Zelltransport-Signale einschließt (z. B. Expon- oder Sekretions-Signale). Geeignete, funktionelle Enzym-Fragmente sind diejenigen Polypeptide, welche eine quantifizierbare Aktivität aufweisen, wenn sie fusioniert an die HCV-Protease exprimiert werden. Beispielhafte Enzyme schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein: -Galaktosidase (-Gal), -Laktamase, Meerettich-Peroxidase (HRP), Glukose-Oxidase (GO), menschliche Superoxid-Dismutase (hSOD), Urease und dergleichen. Diese Enzyme sind günstig, weil die Menge an hergestelltem Fusionsprotein mithilfe einfacher colorimetrischer Testverfahren quantifiziert werden kann. Alternativ können antigene Proteine oder Fragmente verwendet werden, um einfachen Nachweis und Quantifizierung von Fusionsproteinen unter Verwendung für den Fusionspartner spezifischer Antikörper zu erlauben. Der gegenwärtig bevorzugte Fusionspartner ist hSOD.
  • B. Allgemeines Verfahren
  • Die Ausführung der vorliegenden Erfindung bringt generell herkömmliche Verfahren der Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA und Immunologie zum Einsatz, die einem Fachmann geläufig sind. Derartige Verfahren sind in der Literatur vollständig erklärt. Siehe zum Beispiel J. Sambrook et al, „Molecular Cloning; A Laboratory Manual" (1989); „DNA Cloning"; Bde. I und II (D. N. Glover Hrsg. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait Hrsg. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. 1984); "Transcription and Translation" (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney Hrsg. 1986); "Immobilized Cells And Enzymes" (IRL Press, 1986); B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984); die Reihe "Methods In Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells" (J. H. Miller and M. P. Calos Hrsg. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Meth Enzymol (1987) 154 und 155 (Hrsg. jeweils Wu and Grossman, und Wu); Mayer & Walker, Hrsg. (1987), "Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology" (Academic Press, London); Scopes, "Protein Purification: Principles And Practice"; 2. Aufl. (Springer-Verlag, N.Y., 1987); und "Handbook Of Experimental Immunology" Bände I–IV (Weir and Blackwell, Hrsg. 1986).
  • Sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Wirtszellen sind für die Expression erwünschter codierender Sequenzen von Nutzen, wenn geeignete Regulations-Sequenzen verwendet werden, die mit dem vorgesehenen Wirt verträglich sind. Von den prokaryontischen Wirten wird E. coli am häufigsten verwendet. Regulations-Sequenzen für Expression für Prokaryonten schließen Promotoren, die gegebenenfalls Operator-Anteile und Ribosomen-Bindungsstellen enthalten, ein. Transfer-Vektoren, die mit prokaryontischen Wirten verträglich sind, stammen gewöhnlich von beispielsweise pBR322, einem Plasmid, das Operons enthält, welche Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz übertragen, und den verschiedenen pUC-Vektoren, welche ebenfalls Sequenzen enthalten, die Antibiotika-Resistenz-Marker übertragen, ab. Diese Plasmide sind im Handel erhältlich. Die Marker können dazu verwendet werden, erfolgreiche Transformanten durch Selektion zu erhalten. Herkömmlich verwendete prokaryontische Regulations-Sequenzen schließen die -Lactamase (Penicillinase) und Lactose-Promotor-Systeme (Chang et al, Nature (1977) 198: 1056), das Tryptophan (trp)-Promotor-System (Goeddel et al, Nuc Acids Res (1980) 8: 4057) und den vom Phagen lambda abstammenden PL-Promotor und die N-Gen-Ribosomen-Bindungsstelle (Shimatake et al, Nature (1981) 292: 128) und den hybriden tac-Promotor (De Boer et al, Proc Nat Acad Sci USA (1983) 80: 21–5), der von Sequenzen der trp und lac UV5-Promotoren abstammt, ein. Die vorangehenden Systeme sind besonders verträglich mit E. coli; je nach Wunsch können andere prokaryontische Wirte wie zum Beispiel Stämme von Bacillus oder Pseudomonas mit den entsprechenden Regulations-Sequenzen verwendet werden.
  • Eukaryontische Wirte schließen ohne Einschränkung Hefe und Säugerzellen in Zellkultursystemen ein. Hefe-Expressions-Wirte schließen Saccharomyces, Klebsiella, Picia und dergleichen ein. Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces carlsbergensis und K. lactis sind die am häufigsten verwendeten Hefe-Wirte und sind geeignete Pilz-Wirte. Mit Hefe verträgliche Vektoren tragen Marker, die eine Selektion erfolgreicher Transformanten durch Übertragung von Prototrophie auf auxotrophe Mutanten oder Schwermetall-Resistenz auf Wildtyp-Stämme erlauben. Mit Hefe verträgliche Vektoren können den 2μ-Replikationsursprung (Broach et al, Meth Enzymol (1983) 101: 307), die Kombination von CEN3 und ARS1 oder andere Mittel zur Sicherstellung der Replikation wie zum Beispiel Sequenzen, welche den Einbau eines geeigneten Fragments in das Genom der Wirtszelle zur Folge haben, verwenden. Regulations-Sequenzen für Hefe-Vektoen sind dem Fachmann geläufig und schließen Promotoren für die Synthese glykolytischer Enzyme ein (Hess et al, J Adv Enzyme Reg (1968) 7: 149; Holland et al, Biochem (1978), 17: 4900), einschließlich des Promotors für 3-Phosphoglycerat-Kinase (R. Hitzeman et al, J Biol Chem (1980) 255: 2073). Terminatoren können ebenfalls mit eingeschlossen werden, wie zum Beispiel die vom Enolase-Gen abstammenden (Holland, J Biol Chem (1981), 256: 1385). Besonders nützliche Regulations-Systeme sind diejenigen, welche den Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)-Promotor oder den regulierbaren Alkohol-Dehydrogenase (ADH)-Promotor, Terminatoren, die ebenfalls von GAPDH stammen, und, falls Sekretion erwünscht ist, eine vom – Faktor aus Hefe abstammende Signal-Sequenz einschließen (siehe U.S. Pat. Nr. 4.870.008, hierin durch Referenz aufgenommen).
  • Ein gegenwärtig bevorzugtes Expressions-System verwendet die Ubiquitin-Signalsequenz als Fusionspartner. Die Parallelanmeldung USSN 7/390.599 eingereicht am 7. August 1989, hat Vektoren zur starken Expression von Hefe-Ubiquitin-Fusionsproteinen offenbart. Ubiquitin aus Hefe stellt ein 76 Aminosäuren-Polypeptid bereit, das bei Expression automatisch von dem fusionierten Protein abgespalten wird. Die Ubiquitin-Sequenz lautet wie folgendermaßen:
  • Figure 00090001
  • Siehe auch Ozkaynak et al, Nature (1984) 312: 663–66. Polynukleotide, die das Ubiquitin-Polypeptid codieren, können durch Standard-Verfahren synthetisiert werden, zum Beispiel gemäß dem Verfahren von Barr et al, J Biol Chem (1988) 268: 1671–78 unter Verwendung eines Applied Biosystem 380A DNA-Synthetisier-Geräts. Bei Verwendung geeigneter Linker-DNAs kann das Ubiquitin-Gen in einen geeigneten Vektor eingesetzt werden und mit einer Sequenz verbunden werden, die für HCV-Protease oder ein Fragment davon codiert.
  • Zusätzlich können der transkriptionell regulatorische Bereich und der Bereich der transkriptionellen Initiation, die funktionell verknüpft sind, so beschaffen sein, dass sie im Wildtyp-Organismus nicht natürlicherweise assoziiert sind. Diese Systeme sind im Detail in EPO 120.551, veröffentlicht am 3. Oktober 1984; EPO 116.201, veröffentlicht am 22. August 1984; und EPO 164.556, veröffentlicht am 18. Dezember 1985, beschrieben, von denen alle gemeinsam mit der vorliegenden Erfindung besessen werden, und hierdurch durch Referenz vollständig hierin aufgenommen werden.
  • Säugerzelllinien, die als Wirte zur Expression zur Verfügung stehen, sind dem Fachmann geläufig und schließen viele immortalisierte Zelllinien ein, die von der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich sind, einschließlich HeLa-Zellen, Eierstockzellen vom chinesischen Hamster (CHO), Nierenzellen vom Baby-Hamster (BHK) und eine Reihe anderer Zelllinien. Geeignete Promotoren für Säugerzellen sind dem Fachmann ebenfalls geläufig und schließen virale Promotoren wie zum Beispiel den des Simian-Virus 40 (SV40) (Fiers et al, Nature (1978) 273: 113), Rous Sarkom-Virus (RSV), Adenovirus (ADV) und Rinder Papilloma-Virus (BPV) ein. Säugerzellen können ebenfalls Terminator-Sequenzen und poly-A-Anhang-Sequenzen benötigen. Verstärker-Sequenzen, welche die Expression erhöhen, können ebenfalls mit eingeschlossen werden, und Sequenzen, welche die Vervielfältigung des Gens befördern, können ebenfalls wünschenswert sein (zum Beispiel Methotrexat-Resistenzgene). Diese Sequenzen sind dem Fachmann geläufig.
  • Vektoren, die für die Replikation in Säugerzellen geeignet sind, sind dem Fachmann geläufig und können virale Replikons einschließen, oder Sequenzen, welche die Integration der geeigneten HCV-Epitope codierenden Sequenzen in das Genom des Wirts sicherstellen. Zum Beispiel ist ein anderer Vektor, der dazu verwendet wird, fremde DNA zu exprimieren, das Vaccinia-Virus. In diesem Fall wird die heterologe DNA in das Vaccinia-Genom eingesetzt. Verfahren für das Einfügen fremder DNA in das Genom des Vaccinia-Virus sind dem Fachmann geläufig und können beispielsweise homologe Rekombination nutzbar machen. Die heterologe DNA wird im Allgemeinen in ein Gen eingesetzt, das für das Virus nicht essentiell ist, zum Beispiel das Thymidin-Kinase-Gen (tk), welches auch einen selektierbaren Marker bereit stellt. Plasmid-Vektoren wurden beschrieben, die die Herstellung rekombinanter Viren beträchtlich erleichtern (siehe beispielsweise Mackett et al, J. Virol (1984) 49: 857; Chakrabarti et al, Mol Cell Biol (1985) 5: 3403; Moss, in GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (Miller und Calos, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1987), S. 10). Expression des HCV-Polypeptids findet dann in Zellen oder Tieren statt, die mit dem lebenden rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert sind.
  • Um nachzuweisen, ob das HCV-Polypeptid von dem Vaccinia-Vektor exprimiert wird oder nicht, können BSC 1-Zellen mit dem rekombinanten Vektor infiziert werden und unter Bedingungen, die Expression zulassen, auf Mikroskop-Objektträgern angezogen werden. Die Zellen können dann mit Aceton fixiert werden, und Immunofluoreszenz-Testverfahren können durchgeführt werden, bei denen Serum verwendet wird, welches bekanntermaßen anti-HCV-Antikörper gegen (ein) Polypeptid(e) enthält, welches in dem Bereich des HCV-Genoms codiert ist, von dem das HCV-Segment in dem rekombinanten Expressions-Vektor abstammt.
  • Andere Systeme für die Expression eukaryontischer oder viraler Genome schließen Insektenzellen und Vektoren, die für die Verwendung in diesen Zellen geeignet sind, ein. Diese Systeme sind dem Fachmann geläufig und schließen zum Beispiel Insekten-Expressions-Transfervektoren abstammend von dem Baculovirus Autographa californica Nuclear Polyhedrosis-Virus (AcNPV), welcher einen Helfer-unabhängigen viralen Expressionsvektor darstellt, ein. Expressions-Vektoren, die von diesem System abstammen, verwenden gewöhnlich den starken viralen Polyhedrin-Gen-Promotor, um die Expression heterologer Gene anzutreiben. Gegenwärtig ist pAc373 der meistverwendete Transfer-Vektor für die Einführung fremder Gene in AcNPV (siehe PCT WO89/046699 und USSN 7/456.637). Viele andere dem Fachmann geläufige Vektoren wurden ebenfalls für eine verbesserte Expression entworfen. Diese schließen zum Beispiel pVL985 ein (welcher das Polyhedrin-Startcodon von ATG zu ATT verändert und eine BamHI-Klonierungsstelle 32 by flussabwärts von dem ATT einführt; siehe Luckow and Summers, Virol (1989) 17: 31). AcNPV-Transfervektoren für die Expression nicht-fusionierter fremder Proteine auf hoher Ebene sind in den Teilanmeldungen PCT WO89/046699 und USSN 7/456.637 beschrieben. Eine einmalig vorkommende BamHI-Stelle befindet sich direkt nachfolgend von Position –8 in Bezug auf das Translations-Initiations-Codon ATG auf dem Polyhedrin-Gen. Es exisitieren keine Spaltstellen für SmaI, PstI, BglII, XbaI oder SstI. Eine gute Expression nicht-fusionierter fremder Proteine benötigt gewöhnlich fremde Gene, die im Idealfall eine kurze Leitsequenz besitzen, welche geeignete Translations-Initiations-Signale, die einem ATG Startsignal vorangehen, enthält. Das Plasmid enthält ebenfalls das Polyhedrin-Polyadenylierungs-Signal und das Ampicillin-Resistenz (amp)-Gen und einen Replikations-Ursprung für die Selektion und Verbreitung in E. coli.
  • Verfahren zur Einführung heterologer DNA an die gewünschte Stelle im Baculovirus sind dem Fachmann geläufig. (Siehe Summer and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555; Smith et al, Mol Cell Biol (1983) 3: 2156–2165; und Luckow and Summers, Virol (1989) 17: 31). Die heterologe DNA kann zum Beispiel in ein Gen wie zum Beispiel das Polyhedrin-Gen durch homologe Rekombination eingesetzt werden, oder in eine Restriktionsenzym-Schnittstelle, die in das erwünschte Bacoluvirus-Gen eingebaut wurde. Die eingesetzten Sequenzen können diejenigen sein, die alle oder unterschiedliche Segmente des Polyproteins codieren, oder andere ORFs, die virale Polypeptide codieren. Zum Beispiel könnte das Insert die folgende Anzahl an Aminosäure-Segmenten des Polyproteins codieren: Aminosäuren 1–1078; Aminosäuren 332–662; Aminosäuren 406–662; Aminosäuren 156–328, und Aminosäuren 199–328.
  • Die Signale für post-translationale Modifikationen wie zum Beispiel Signalpeptid-Abspaltung, proteolytische Spaltung und Phosphorylierung scheinen von Insektenzellen erkannt zu werden. Die Signale, die für die Sekretion und Anhäufung im Kern benötigt werden, scheinen ebenfalls zwischen Invertebraten-Zellen und Vertebraten-Zellen konserviert zu sein. Beispiele für die Signalsequenzen von Vertebraten-Zellen, die in Invertebraten-Zellen wirkungsvoll sind, sind dem Fachmann geläufig, zum Beispiel wird das menschliche Interleukin-2-Signal (IL2S), das ein Signal für die Sekretion aus der Zelle darstellt, in Insektenzellen erkannt und auf richtige Weise entfernt.
  • Transformation kann durch irgendein bekanntes Verfahren zur Einführung von Polynukleotiden in eine Wirtszelle stattfinden, einschließlich beispielsweise Verpackung der Polynukleotide in ein Virus und Transduktion einer Wirtszelle mit dem Virus, und durch direkte Aufnahme der Polynukleotide. Das verwendete Transformationsverfahren hängt von dem Wirt ab, der transformiert werden soll. Bakterielle Transformation durch direkte Aufnahme bedient sich im Allgemeinen der Behandlung mit Calcium- oder Rubidiumchlorid (Cohen, Proc Nat Acad Sci USA (1972) 69: 2110; T. Maniatis et al, „Molecular Cloning; A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Hefe-Transformation durch direkte Aufnahme kann unter Verwendung des Verfahrens von Hinnen et al, Proc Nat Acad Sci USA (1978) 75: 1929 durchgeführt werden. Säuger-Transformationen durch direkte Aufnahme können unter Verwendung des Calciumphosphat-Fällungs-Verfahrens von Graham and Van der Eb, Virol (1978) 52: 546, oder den verschiedenen bekannten Abwandlungen davon, durchgeführt werden. Andere Verfahren zur Einführung rekombinanter Polynukleotide in Zellen, speziell in Säuger-Zellen, schließen Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphat-vermittelte Transfektion, Polybren-vermittelte Transfektion, Protoplasten-Fusion, Elektroporation, Einschluss der Polynukleotide in Liposomen und direkte Mikroinjektion der Polynukleotide in Kerne ein.
  • Bei der Herstellung von Vektoren werden Verfahren verwendet, die dem Fachmann geläufig sind. Positions-spezifische DNA-Spaltung wird durch Behandlung mit geeigneten Restriktionsenzymen unter Bedingungen, welche im Allgemeinen von dem Hersteller dieser im Handel erhältlichen Enzyme spezifiziert werden, durchgeführt. Im Allgemeinen wird ungefähr 1 μg Plasmid oder DNA-Sequenz mit 1 Einheit Enzym in ungefähr 20 μl Puffer-Lösung durch Inkubation für 1–2 h bei 37°C gespalten. Nach Inkubation mit dem Restriktionsenzym werden Proteine durch Phenol/Chloroform-Extraktion entfernt und die DNA wird durch Ethanol-Fällung rückgewonnen. Die gespaltenen Fragmente können unter Verwendung von Polyacrylamid- oder Agarose-Gelelektrophorese-Verfahren gemäß den allgemeinen in Meth Enzymol (1980) 65: 499–560 beschriebenen Verfahren, aufgetrennt werden.
  • Spaltfragmente mit überhängenden Enden können unter Verwendung von E. coli DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) mit den passenden in dem Gemisch vorhandenen Deoxynukleotid-Triphosphaten (dNTPs) in glatte Enden überführt werden. Behandlung mit S1-Nuklease kann ebenfalls eingesetzt werden, was die Hydrolyse aller einzelsträngigen DNA-Anteile zur Folge hat.
  • Ligationen werden unter Standard-Puffer- und -Temperatur-Bedingungen unter Verwendung von T4 DNA-Ligase und ATP durchgeführt; Ligationen überhängender Enden benötigen weniger ATP und weniger Ligase als Ligationen glatter Enden. Wenn Vektor-Fragmente als Teil eines Ligations-Gemischs verwendet werden, wird das Vektor-Fragment häufig mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) oder intestinaler alkalischer Phosphatase vom Kalb behandelt, um das 5'-Phosphat zu entfernen und dadurch die Religation des Vektors zu verhindern. Alternativ kann Restriktionsenzym-Verdau unerwünschter Fragmente eingesetzt werden, um Religation zu verhindern.
  • Ligations-Gemische werden in geeignete Klonierungs-Wirte wie zum Beispiel E. coli transformiert und erfolgreiche Transformanten werden unter Verwendung der eingebauten Marker (z. B. antibiotische Resistenz) selektiert und in Reihenuntersuchungen auf das richtige Konstrukt getestet.
  • Synthetische Oligonukleotide können unter Verwendung eines automatischen Oligonukleotid-Synthetisier-Geräts, wie von Warner, DNA (1984) 3: 401 beschrieben, hergestellt werden. Wenn es erwünscht ist, können die synthetischen Stränge durch Behandlung mit Polynukleotidkinase in Gegenwart von 32P-ATP unter Standard-Reaktionsbedingungen mit 32P markiert werden.
  • DNA-Sequenzen, einschließlich der aus cDNA-Bibliotheken isolierten, können durch bekannte Verfahren, zum Beispiel durch Positions-gerichtete Mutagenese (siehe z. B. Zoller, Nuc Acid Res (1982) 10: 6487), modifiziert werden. In Kürze beschrieben wird die DNA, die modifiziert werden soll, als Einzelstrang-Sequenz in einen Phagen verpackt und mit DNA-Polymerase in doppelsträngige DNA überführt, wobei als Primer ein synthetisches Oligonukleotid, das komplementär zu dem Anteil der DNA ist, der modifiziert werden soll, verwendet wird, und wobei die gewünschte Modifikation in der Primer-Sequenz enthalten ist. Die daraus hervorgehende doppelsträngige DNA wird in ein Wirts-Bakterium, das einen Phagen tragen kann, transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien, die Kopien von jedem Strang des Phagen enthalten, werden auf Agar plattiert, um Plaques zu erhalten. Theoretisch enthalten 50% der neuen Plaques Phagen mit der mutierten Sequenz, und die verbleibenden 50% Phagen mit der ursprünglichen Sequenz. Replika-Kopien der Plaques werden an eine markierte synthetische Sonde bei Temperaturen und Bedingungen, welche die Hybridisierung mit dem richtigen Strang, aber nicht mit der unmodifizierten Sequenz gestatten, hybridisiert. Die Sequenzen, die durch Hybridisierung identifiziert wurden, werden rückgewonnen und kloniert.
  • DNA-Bibliotheken können unter Verwendung des Verfahrens von Grunstein und Hogness Proc Nat Acad Sci USA (1975) 73: 3961 untersucht werden. In Kürze beschrieben wird bei diesem Verfahren die DNA, die getestet werden soll, auf Nitrocellulose-Filtern immobilisiert, denaturiert, und mit einem Puffer aus 0–50% Formamid, 0,75 M NaCl, 75 mM Na-Citrat, 0,02% (G/V) von jeweils Rinderserum-Albumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll®, 50 mM NaH2PO4 (pH 6,5), 0,1% SDS und 100 μg/ml denaturierter Träger-DNA prähybridisiert. Der Prozentsatz Formamid im Puffer, sowie die Zeit- und Temperatur-Bedingungen der Prähybridisierung und darauf folgenden Hybridisierungs-Schritte hängen von der erforderlichen Stringenz ab. Oligomere Sonden, bei denen weniger stringente Bedingungen benötigt werden, werden im Allgemeinen bei niedrigen Prozentsätzen Formamid, niedrigeren Temperaturen und längeren Hybridisierungs-Zeiten verwendet. Sonden, die mehr als 30 oder 40 Nukleotide enthalten, wie zum Beispiel diejenigen, die von cDNA oder genomischen Sequenzen abstammen, benötigen im Allgemeinen höhere Temperaturen, z. B. ungefähr 40–42°C und einen hohen Prozentsatz Formamid, z. B. 50%. Nach der Prähybridisierung wird dem Puffer 5'-32P-markierte Oligonukleotid-Sonde zugegeben, und die Filter werden in dem Gemisch unter Hybridisierungs-Bedingungen inkubiert. Nach dem Waschen werden die behandelten Filter einer Autoradiographie unterzogen, um die Stelle der hybridisierten Sonde anzuzeigen; DNA an entsprechenden Positionen auf den ursprünglichen Agar-Platten wird als Ausgangsmaterial der erwünschten DNA verwendet.
  • Bei routinemäßigen Vektor-Konstruktionen werden Ligations-Gemische in den E. coli-Stamm HB101 oder andere geeignete Wirte transformiert, und erfolgreiche Transformanten werden durch Antibiotika-Resistenz oder andere Marker selektiert. Plasmide von den Transformanten werden dann gemäß dem Verfahren von Clewell et al, Proc Nat Acad Sci USA (1969) 62: 1159 hergestellt, gewöhnlich nach Chloramphenicol-Vervielfältigung (Clewel, J Bacteriol (1972) 110: 667). Die DNA wird isoliert und analysiert, gewöhnlich durch Restriktionsenzym-Analyse und/oder Sequenzierung. Eine Sequenzierung kann mit dem Dideoxy-Verfahren von Sanger et al, Proc Nat Acad Sci USA (1977) 74: 5463, wie es darüber hinaus von Messing et al, Nuc Acids Res (1981) 9: 309 beschrieben wurde, oder mit dem Verfahren von Maxam et al, Meth Enzymol (1980) 65: 499 durchgeführt werden. Probleme mit Banden-Kompression, wie sie zuweilen in GC-reichen Bereichen beobachtet werden, wurden durch Verwendung von T-Deazoguanosin gemäß Barr et al, Biotechniques (1986) 4: 428 überwunden.
  • Das Enzym-gekoppelte Immuno-Sorptionsmittel-Testverfahren (ELISA) kann zur Messung von entweder Antigen- oder Antikörper-Konzentrationen verwendet werden. Dieses Verfahren hängt von der Konjugation eines Enzyms an entweder ein Antigen oder einen Antikörper ab, und verwendet die gebundene Enzymaktivität als eine quantitative Markierung. Zur Antikörper-Messung wird das bekannte Antigen an eine Festphase fixiert (z. B. eine Mikrotiter-Platte, ein Plastikgefäß, einen Messstab, ein Plastik-Kügelchen oder dergleichen), mit Verdünnungen des zu testenden Serums inkubiert, gewaschen, mit Enzym-markiertem anti-Immunoglobulin inkubiert und erneut gewaschen. Enzyme, die sich zur Markierung eigenen, sind dem Fachmann geläufig und schließen zum Beispiel Meerettich-Peroxidase (HRP) ein. Die an die Festphase gebundene Enzymaktivität wird gewöhnlich durch Zugabe eines spezifischen Substrats und colorimetrischer Bestimmung von Produktbildung oder Substratverbrauch gemessen. Die gebundene Enzymaktivität stellt eine direkte Funktion der Menge an gebundenem Antikörper dar.
  • Zur Antigen-Messung wird ein bekannter spezifischer Antikörper an die Festphase fixiert, das Antigen enthaltende Untersuchungsmaterial wird zugegeben, nach Inkubation wird die Festphase gewaschen und ein zweiter Enzym-markierter Antikörper wird zugegeben. Nach dem Waschen wird Substrat zugegeben, und die Enzymaktivität wird colorimetrisch gemessen und in Zusammenhang zur Antigen-Konzentration gebracht.
  • Proteasen der Erfindung können durch Spaltung eines Substrats, welches nachweisbare Spaltprodukte bereitstellt, auf Aktivität untersucht werden. Da von der HCV-Protease angenommen wird, dass sie sich selbst von dem genomischen Polyprotein abspaltet, kann man diese autokatalytische Aktivität verwenden, um sowohl die Expression des Proteins zu testen, als auch um die Aktivität zu bestimmen. Wenn zum Beispiel die Protease so mit ihrem Fusionspartner verbunden ist, dass das N-terminale Spaltungssignal (Arg-Arg) der HCV-Protease mit eingeschlossen ist, wird sich das Expressions-Produkt selbst in Fusionspartner und aktive HCV- Protease spalten. Man kann dann die Produkte zum Beispiel durch Western-Blot untersuchen um sicherzustellen, dass die hergestellten Proteine in ihrer Größe dem separaten Fusionspartner- und Protease-Proteinen entsprechen. Es wird gegenwärtig bevorzugt, kleine Peptid-p-Nitrophenylester oder Methylcoumarine zu verwenden, da dann auf die Spaltung spektralphotometrische oder fluoreszierende Testverfahren folgen können. Gemäß dem von E. D. Matayoshi et al, Science (1990) 247: 231–35 beschriebenen Verfahren, kann an das eine Ende des Substrats eine fluoreszierende Markierung und an das andere Ende ein die Fluoreszenz auslöschendes Molekül angehängt werden: Spaltung wird dann durch Messung der daraus resultierenden Fluoreszenz-Zunahme gemessen. Wenn ein geeignetes Enzym oder Antigen als Fusionspartner verwendet wurde, kann die Menge an hergestelltem Protein leicht bestimmt werden. Alternativ kann das N-terminale Spaltungs-Signal der HCV-Protease ausgeschlossen werden (Vermeidung der Selbst-Spaltung) und ein separates Spaltungs-Substrat zugegeben werden, wie zum Beispiel ein Fragment der HCV-NS3-Domäne einschließlich dem nativen Prozessierungs-Signal oder eines synthetischen Analogons.
  • In Abwesenheit dieser Protease-Aktivität sollte das HCV-Polyprotein in seiner unprozessierten Form verbleiben und so das Virus in einer nicht-infektiösen Form belassen. Daher ist die Protease für die Untersuchung pharmazeutischer Mittel zur Kontrolle von HCV von Nutzen, da Verbindungen, welche die Protease-Aktivität in ausreichendem Maße hemmen, ebenso die Infektiosität des Virus hemmen werden. Derartige Inhibitoren können die Form organischer Verbindungen annehmen, speziell von Verbindungen, welche die von der Protease erkannte Spaltstelle des HCV nachahmen. Drei der vermeintlichen Spaltstellen des HCV-Polyproteins besitzen die folgenden Aminosäure-Sequenzen:
    Val-Ser-Ala-Arg-Arg//Gly-Arg-Glu-lle-Leu-Leu-Gly
    Ala-Ile-Leu-Arg-Arg//His-Val-Gly-Pro-
    Val-Ser-Cys-Gln-Arg//Gly-Tyr-
  • Diese Stellen sind durch das Vorhandensein zweier basischer Aminosäuren unmittelbar vor der Spaltstelle charakterisiert, und sind den Spaltstellen ähnlich, die von anderen Flavivirus-Proteasen erkannt werden. Daher können geeignete Protease-Inhibitoren hergestellt werden, die das Motiv basisch/basisch/klein neutral der HCV-Spaltstellen nachahmen, aber bei denen die Peptidbindung, die in dem natürlichen Substrat gespalten wird, durch eine nicht-labile Verknüpfung ersetzt ist. Geeignete Inhibitoren schließen Peptid-Trifluoromethylketone, Peptid-Borsäuren, Peptid-Ketoester, Peptid-Difluoroketo-Verbindungen, Peptid-Aldehyde, Peptid-Diketone und dergleichen ein. Zum Beispiel ist das Peptid-Aldehyd N-acetyl-phenylalanyl-glycinaldehyd ein potenter Inhibitor der Protease Papain. Unter Verwendung der in U.S.-Patentanmeldung lfd. Nr. 7/189.318, eingereicht am 2. Mai 1988 (veröffentlicht als PCT WO89/10931), hierin durch Referenz aufgenommen, offenbarten Verfahren können große Peptid-Gemische bequem hergestellt und getestet werden. Diese Anmeldung lehrt Verfahren zur Herstellung von Gemischen aus Peptiden bis hin zu Hexapeptiden mit allen möglichen Aminosäure-Sequenzen, und lehrt weiterhin Testverfahren zur Identifikation derjenigen Peptide, die in der Lage sind, an Proteanen zu binden.
  • Andere Protease-Inhibitoren können Proteine sein, speziell Antikörper und Antikörper-Derivate. Rekombinante Expressionssysteme können zur Herstellung solcher Mengen an Protease, wie sie zur Herstellung für die Protease spezifischer monoklonaler Antikörper (MAbs) ausreichend sind, verwendet werden. Geeignete Antikörper für die Protease-Hemmung werden so an die Protease binden, dass die enzymatische Aktivität vermindert oder ausgeschaltet wird, typischerweise durch Verdecken des aktiven Zentrums. Geeignete MAbs können unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, zur Erzeugung von Derivaten wie zum Beispiel Fab-Fragmenten, chimärer Antikörper, veränderter Antikörper, einwertiger Antikörper und Einzel-Domänen-Antikörper verwendet werden.
  • Protease-Inhibitoren werden unter Verwendung von Verfahren der Erfindung in Reihenuntersuchungen getestet. Im Allgemeinen wird ein Substrat verwendet, welches das natürliche Substrat des Enzyms nachahmt, aber das ein quantifizierbares Signal bereitstellt, wenn es gespalten wird. Das Signal wird vorzugsweise durch colorimetrische oder fluorometrische Mittel nachweisbar gemacht: Dennoch können andere Verfahren wie zum Beispiel HPLC- oder Silikongel-Chromatographie, GC-MS, Kernspin-Magnet-Resonanz und dergleichen ebenfalls von Nutzen sein. Nachdem die optimalen Substrat- und Enzym-Konzentrationen bestimmt sind, wird ein Protease-Inhibitor-Anwärter dem Reaktionsgemisch in einem bestimmten Konzentrationsbereich zugesetzt. Idealerweise sollten die Testbedingungen den Bedingungen ähneln, bei denen die Protease in vivo inhibiert werden soll, d. h. bei physiologischem pH, Temperatur, Ionenstärke etc. Geeignete Inhibitoren werden starke Protease-Inhibition in Konzentrationen, die keine toxischen Nebeneffekte in der Testperson hervorrufen, aufweisen. Inhibitoren, die um Bindung an das aktive Zentrum der Protease konkurrieren, können Konzentrationen benötigen, die der Substratkonzentration gleichen, oder größer sind als diese, während Inhibitoren, die in der Lage sind, irreversibel an das aktive Zentrum der Protease zu binden, in Konzentrationen in der Größenordnung der Enzymkonzentration zugesetzt werden können.
  • Protease-Inhibitor-Anwärter unter Verwendung eines inaktiven Protease-Muteins anstelle eines aktiven Enzyms durchgemustert werden. Es wurde herausgefunden, dass Ersetzen eines entscheidenden Rests innerhalb des aktiven Zentrums einer Protease (z. B. Ersetzen des Ser im aktiven Zentrum einer Serin-Protease) die Struktur des Enzyms nicht signifikant ändert, und daher die Bindungs-Spezifität bewahrt. Das veränderte Enzym erkennt immer noch sein richtiges Substrat und bindet es, aber kann es nicht spalten.
  • Daher wird in einem Verfahren der Erfindung eine inaktivierte HCV-Protease immobilisiert, und ein Gemisch von Inhibitor-Anwärtern wird zugegeben. Inhibitoren, welche die bevorzugte Erkennungssequenz des Enzyms genau nachahmen, werden erfolgreicher um Bindung konkurrieren, als andere Inhibitor-Anwärter. Die schwach bindenden Anwärter können dann abgetrennt werden, und die Identität der stark bindenden Inhibitoren kann bestimmt werden. Zum Beispiel kann eine HCV-Protease hergestellt werden, bei der das Ser221 (1) durch ein Ala ersetzt ist, wobei ein Enzym bereitgestellt wird, das in der Lage ist, das HCV-Protease-Substrat zu binden, aber nicht, es zu spalten. Das daraus hervorgehende Protease-Mutein wird dann an ein festes Trägermaterial gebunden, zum Beispiel an Sephadex®-Kügelchen, und in eine Säule gepackt. Ein Gemisch aus Protease-Inhibitor-Anwärtern in Lösung wird dann durch die Säule durchgeleitet und Teilmengen werden gesammelt. Die letzte Teilmenge die eluiert, wird die Verbindungen enthalten, die am stärksten binden, und die bevorzugten Protease-Inhibitor-Anwärter bereitstellen.
  • Protease-Inhibitoren können durch eine Vielzahl von Verfahren verabreicht werden, wie zum Beispiel intravenös, oral, intramuskulär, intraperitoneal, bronchial, intranasal und so weiter. Die bevorzugte Art der Verabreichung wird von der Beschaffenheit des Inhibitors abhängen. Als organische Verbindungen hergestellte Inhibitoren können oft oral verabreicht werden (was allgemein bevorzugt wird), wenn sie gut adsorbiert werden. Protein-basierende Inhibitoren (wie zum Beispiel die meisten Antikörper-Derivate) müssen im Allgemeinen auf parenteralen Wegen verabreicht werden.
  • C. Beispiele
  • Die im Folgenden dargestellten Beispiele werden als weitere Anleitung für den Fachmann bereitgestellt, und dürfen nicht so ausgelegt werden, dass sie die Erfindung in irgendeiner Weise einschränken.
  • Beispiel 1
  • Herstellung von HCV-cDNA
  • Eine genomische Bibliothek von HCV-cDNA wurde wie in PCT WO89/046699 und USSN 7/456.637 beschrieben hergestellt. Diese Bibliothek, ATCC-Zugangs-Nr. 40394 wurde wie im Folgenden dargelegt hinterlegt.
  • Beispiel 2
  • Expression des in Klon 5-1-1 codierten Polypeptids)
  • (A) Das in Klon 5-1-1 codierte HCV-Polypeptid (siehe Beispiel 1) wurde als Fusionsprotein mit menschlicher Superoxid-Dismutase (SOD) exprimiert. Dies wurde durch Subklonierung des cDNA-Klon 5-1-1-Inserts in den Expressionsvektor pSODCF1 (K. S. Steimer et al, J Virol (1986) 58: 9; EPO 138.111) wie folgendermaßen erreicht: Der SOD/5-1-1-Expressionsvektor wurde in E. coli D1210-Zellen transformiert. Diese Zellen, die Cf1/5-1-1 in E. coli benannt wurden, wurden wie im Folgenden dargelegt hinterlegt und haben die ATCC-Zugangs-Nr. 67967.
  • Zuerst wurde aus pSODCF1 isolierte DNA mit BamHI und EcoRI behandelt, und die folgende Linker-DNA wurde in die durch die Restriktionsenzyme geschaffene lineare DNA ligiert:
    GAT CCT GGA ATT CTG ATA AGA CCT TAA GAC TAT TTT AA
  • Nach Klonierung wurde das Plasmid, das das Insert enthält, isoliert.
  • Das Insert enthaltende Plasmid wurde mit EcoRI geschnitten. Das HCV-cDNA-Insert in Klon 5-1-1 wurde mit EcoRI ausgeschnitten und in die mit EcoRI linearisierte Plasmid-DNA ligiert. Das DNA-Gemisch wurde zur Transformation des E. coli-Stamms D1210 (Sadler et al, Gene (1980) 8: 279) verwendet. Rekombinanten mit der 5-1-1-cDNA in der richtigen Orientierung zur Expression des in 1 gezeigten ORFs wurden durch Restriktions-Kartierung und Nukleotid-Sequenzierung identifiziert.
  • In rekombinanten Bakterien eines Klons wurde die Expression des SOD-HCV5-1-1-Polypeptids durch Anzucht der Bakterien in Gegenwart von IPTG induziert.
  • Drei separate Expressions-Vektoren, pcf1AB, pcf1CD und pcf1EF wurden durch Ligation dreier neuer Linker-DNAs, AB, CD und EF, mit einem BamHI-EcoRI-Fragment, das aus einem vollständigen Verdau des Vektors pSODCF1 mit EcoRI und BamHI gefolgt von Behandlung mit alkalischer Phosphatase stammt, geschaffen. Die Linker-DNAs wurden aus sechs Oligomeren, A, B, C, D, E und F, geschaffen. Jedes Oligomer wurde vor Anlagerung an sein komplementäres Oligomer durch Behandlung mit Kinase in Gegenwart von ATP phosphoryliert. Die Sequenzen der synthetischen Linker-DNAs waren die Folgenden:
  • Figure 00180001
  • Jede der drei Linker-DNAs zerstört die ursprüngliche EcoRI-Stelle und schafft eine neue EcoRI-Stelle innerhalb der Linker-DNA, aber in einem anderen Leserahmens. Daher befanden sich die aus den Klonen isolierten HCV-cDNA-EcoRI-Fragmente, wenn sie in den Expressions-Vektor eingesetzt waren, in drei unterschiedlichen Leserahmen.
  • Die HCV-cDNA-Fragmente in den vorgesehenen gt11-Klonen wurden durch Verdau mit EcoRI ausgeschnitten; jedes Fragment wurde in pcf1AB, pcf1CD und pcf1EF eingesetzt. Diese Expressions-Konstrukte wurden dann in E. coli D1210-Zellen transformiert, die Transformanten wurden kloniert, und Polypeptide wurden wie im Folgenden in Teil B beschrieben exprimiert.
  • (B) Expressions-Produkte der angegeben HCV-cDNAs wurden durch direkte immunologische Reihenuntersuchungen der Kolonien auf Antigenität untersucht, wobei eine Modifikation des in Helfman et al, Proc Nat Acad Sci USA (1983) 80: 31 beschriebenen Verfahrens angewendet wurde. In Kürze beschrieben wurden die Bakterien auf Nitrocellulose-Filter, die auf Ampicillin-Platten aufgelegt waren, plattiert, so dass ungefähr 40 Kolonien pro Filter erhalten wurden. Die Kolonien wurden als Replika-Kopien auf Nitrocellulose-Filter plattiert, und die Replika-Kopien wurden über Nacht in Gegenwart von 2 mM IPTG und Ampicillin erneut angezogen. Die Bakterien-Kolonien wurden lysiert, indem die Nitrocellulose-Filter für ungefähr 15 bis 20 min in eine mit CHCl3-Dampf gesättigte Atmosphäre gebracht wurden. Jeder Filter wurde dann in eine einzelne 100 mm-Petrischale mit 10 ml 50 mM Tris HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 3% (w/v) BSA, 40 μg/ml Lysozym und 0,1 μg/ml DNase gelegt. Die Platten wurden wenigstens 8 Stunden bei Raumtemperatur vorsichtig bewegt. Die Filter wurden in TBST (50 mM Tris HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,005% Tween® 20) gespült. Nach der Inkubation wurden die Zellrückstände gespült und eine Stunde lang in TBS (TBST ohne Tween®) mit 10% Schafserum inkubiert. Die Filter wurden dann mit vorbehandelten Sera in TBS von Personen mit NANBH inkubiert, einschließlich: 3 Schimpansen; 8 Patienten mit chronischer NANBH, deren Sera positiv für Antikörper gegen HCV-C100-3-Polypeptid (auch mit C 100 bezeichnet) waren; 8 Patienten mit chronischer NANBH, deren Sera negativ für anti-C100-Antikörper waren; ein genesender Patient, dessen Serum negativ für anti-C100-Antikörper war; und 6 Patienten mit gesellschaftlich erworbener NANBH, einschließlich einem, dessen Serum stark positiv für anti-C100-Antikörper war und einem, dessen Serum geringfügig positiv für anti-C100-Antikörper war. Die in TBS verdünnten Sera wurden durch Präadsorption mit hSOD für mindestens 30 Minuten bei 37°C vorbehandelt. Nach Inkubation wurden die Filter zweimal 30 min lang mit TBST gewaschen. Die exprimierten Proteine, die Antikörper in den Sera gebunden haben, wurden durch zweistündige Inkubation mit 125I-markiertem anti-Mensch-Antikörper vom Schaf markiert. Nach dem Waschen wurden die Filter zweimal 30 Minuten lang mit TBST gewaschen, getrocknet, und ein Autoradiogramm wurde angefertigt.
  • Beispiel 3
  • Klonierung von Volllängen-SOD-Protease-Fusionsproteinen
  • (A) pBR322-C200
  • Die Nukleotid-Sequenzen der im Folgenden verwendeten HCV-cDNAs wurden im Wesentlichen wie oben beschrieben bestimmt, außer dass die aus diesen Phagen ausgeschnittene cDNA die aus Klon 5-1-1 isolierte cDNA ersetzt hat.
  • Klon C33c wurde als Hybridisierungs-Sonde isoliert und besitzt die folgende Sequenz:
    5' ATC AGG ACC GGG GTG AGA ACA ATT ACC ACT 3'
  • Die Sequenz der HCV-cDNA in Klon C33c ist in 8 dargestellt, die auch die darin codierten Aminosäuren zeigt.
  • Klon 35 wurde durch eine Reihenuntersuchung mit einem synthetischen Polynukleotid isoliert, das die folgende Sequenz besaß:
    5' AAG CCA CCG TGT GCG CTA GGG CTC AAG CCC 3'
  • Ungefähr einer von 50.000 Klonen hat mit der Sonde hybridisiert. Die Polynukleotide und die abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen für C35 sind in 7 dargestellt.
  • Klon 31 ist in 6 dargestellt, die ebenfalls die darin codierten Aminosäuren zeigt. Eine C200-Kassette wurde durch Ligation eines durch Verdau von Klon C33c-DNA mit EcoRI und HinfI erhaltenes 718 bp-Fragment mit einem durch Verdau von Klon C31-DNA mit HinfI und BglI erhaltenen 179 bp-Fragment und einem durch Verdau von Klon C35-DNA mit BglI und EcoRI erhaltenen 377 bp-Fragment, erstellt. Das Konstrukt aus den ligierten Fragmenten wurde in die EcoRI-Stelle von pBR322 eingesetzt, wobei das Plasmid pBR322-C200 erhalten wurde.
  • (B) C7f+C20c
  • Klon 7f wurde unter Verwendung einer Sonde isoliert, die folgende Sequenz besaß:
    5'-AGC AGA CAA GGG GCC TCC TAG GGT GCA TAA T-3'
  • Die Sequenz der HCV-cDNA in Klon 7f und die darin codierten Aminosäuren sind in 5 dargestellt.
  • Klon C20c wird mit einer Sonde isoliert, die folgende Sequenz besitzt:
    5'-TGC ATC AAT GGG GTG TGC TGG-3'
  • Die Sequenz der HCV-cDNA in Klon C20c und die darin codierten Aminosäuren sind in 2 dargestellt.
  • Die Klone 7f und C20c wurden mit EcoRI und SfaNI verdaut, wobei jeweils ein 400 bp- und ein 260 bp-Fragment gebildet wurde. Die Fragmente wurden dann in die EcoRI-Stelle von pBR322 kloniert, wobei der Vektor C7f+C20c gebildet wurde, und in HB101-Zellen transformiert.
  • (C) C300
  • Klon 8h wurde unter Verwendung einer Sonde basierend auf der Nukleotid-Sequenz in Klon 33c isoliert. Die Nukleotid-Sequenz der Sonde lautete:
    5'-AGA GAC AAC CAT GAG GTC CCC GGT GTT C-3'
  • Die Sequenz der HCV-cDNA in Klon 8h und die darin codierten Aminosäuren sind in 4 dargestellt.
  • Klon C26d wird unter Verwendung einer Sonde isoliert, die folgende Sequenz besitzt:
    5'-CTG TTG TGC CCC GCG GCA GCC-3'
  • Die Sequenz und Translation in Aminosäuren von Klon C26d ist 3 dargestellt.
  • Die Klone C26d und C33c (siehe Teil A oben) wurden in den Methylierungs-negativen E. coli-Stamm GM48 transformiert. Klon C26d wurde mit EcoRII und DdeI verdaut, wobei ein 100 bp-Fragment bereitgestellt wurde. Klon C33c wurde mit EcoRII und EcoRI verdaut, wobei ein 700 bp-Fragment bereitgestellt wurde. Klon C8h wurde mit EcoRI und DdeI verdaut, wobei ein 208 bp-Fragment bereitgestellt wurde. Diese drei Fragmente wurden dann in die EcoRI-Stelle von pBR322 ligiert und in den E. coli-Stamm HB101 transformiert, wobei der Vektor C300 bereitgestellt wurde.
  • (D) Herstellung von Volllängen-Klonen
  • Ein 600 bp-Fragment wurde durch Verdau mit EcoRI und NaeI aus C7f+C20c erhalten und mit einem 945 bp-NaeI/EcoRI-Fragment aus C300 ligiert, und das Konstrukt wurde in die EcoRI-Stelle von pGEM4Z (im Handel erhältlich von Promega) eingesetzt, wobei der Vektor C7fC20cC300 gebildet wurde.
  • C7fC20cC300 wurde mit NdeI und EcoRI verdaut, wobei ein 892 bp-Fragment bereitgestellt wurde, welches mit einem durch Verdau von C200 mit NdeI und EcoRI erhaltenen 1160 bp-Fragment ligiert wurde. Das daraus hervorgegangene Konstrukt wurde in die EcoRI-Stelle von pBR322 eingesetzt, wobei der Vektor C7fC20cC300C200 bereitgestellt wurde. Die Konstruktion dieses Vektors ist schematisch in 9 veranschaulicht.
  • Beispiel 4
  • Herstellung von E. coli-Expressions-Vektoren
  • (A) cf1SODp600
  • Dieser Vektor schließt die codierende Sequenz einer Volllängen-HCV-Protease fusioniert an eine funktionelle hSOD-Signalsequenz ein. Der Vektor C7fC20cC300C200 wurde mit EcoRI gespalten, wobei ein 2000 bp-Fragment bereitgestellt wurde, welches dann in die EcoRI-Stelle des Plasmids cf1CD (Beispiel 2A) ligiert wurde. Der daraus hervorgegangene Vektor codiert die Aminosäuren 1–151 der hSOD, und Aminosäuren 946–1630 von HCV (Nummerierung beginnt am Anfang des Polyproteins, entsprechend Aminosäuren 1–686 in 1). Der Vektor wurde mit cf1SODp600 bezeichnet (manchmal wird auf ihn mit p600 Bezug genommen), und wurde in E. coli D1210-Zellen transformiert. Diese Zellen, ATCC-Zugangs-Nr. 68275, wurden wie im Folgenden dargelegt hinterlegt.
  • (B) P190
  • Ein verkürztes SOD-Protease-Fusions-Polynukleotid wurde hergestellt, indem ein 600 by EcoRI/NaeI-Fragment aus Cf7+C20c ausgeschnitten wurde, die Enden des Fragments mit Klenow- Fragment in glatte Enden überführt wurden, und dieses Fragment mit den glatten Enden in die EcoRI-Stelle von cf1EF (Beispiel 2A), dessen Enden mit Klenow-Fragment in glatte Enden überführt wurden, ligiert wurde. Dieses Polynukleotid codiert ein Fusionsprotein, das die Aminosäuren 1–151 der hSOD und Aminosäuren 1–199 der HCV-Protease besitzt.
  • (C) P300
  • Ein längeres verkürztes SOD-Protease-Fusions-Polynukleotid wurde hergestellt, indem ein 892 by EcoRI/NdeI-Fragment aus Cf7C20cC300 ausgeschnitten wurde, die Enden des Fragments mit Klenow-Fragment in glatte Enden überführt wurden und dieses Fragment mit den glatten Enden in die EcoRI-Stelle von cf1EF, dessen Enden mit Klenow-Fragment in glatte Enden überführt wurden, ligiert wurde. Dieses Polynukleotid codiert ein Fusionsprotein, das die Aminosäuren 1–151 der hSOD und Aminosäuren 1–299 der HCV-Protease besitzt.
  • (D) P500
  • Ein längeres verkürztes SOD-Protease-Fusions-Polynukleotid wurde hergestellt, indem ein 1150 by EcoRI/EcoRI-Fragment aus Cf7C20cC300 ausgeschnitten wurde, und das Fragment in die EcoRI-Stelle von cf1CD ligiert wurde, wobei P500 gebildet wurde. Dieses Polynukleotid codiert ein Fusionsprotein, das die Aminosäuren 1–151 der hSOD und Aminosäuren 946–1457 der HCV-Protease besitzt (Aminosäuren 1–513 in 1).
  • (E) FLAG/Protease-Fusion
  • Dieser Vektor schließt die codierende Sequenz einer Volllängen-HCV-Protease fusioniert an die FLAG-Sequenz, Hopp et al. (1988) Biotechnology 6: 1204–1210, ein. PCR wurde zur Herstellung eines HCV-Protease-Gens mit speziellen Restriktions-Enden zur Erleichterung der Klonierung verwendet. Plasmid P500 wurde mit EcoRI und NdeI verdaut, wobei ein 900 bp-Fragment erhalten wurde. Dieses Fragment und zwei Primer wurden in einer Polymerase-Kettenreaktion verwendet, um eine einmalig vorkommende BglII-Stelle bei Aminosäure 1009 und ein Stop-Codon mit einer SalI-Stelle bei Aminosäure 1262 des HCV-1 einzuführen, wie in 17 in WO90/11089, veröffentlicht am 4. Oktober 1990, dargestellt ist. Die Sequenz der Primer lautet wie folgt:
  • Figure 00210001
  • Nach 30 PCR-Zyklen wurde die Reaktion mit BglII und SalI verdaut, und das 710 bp-Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment wurde an das folgende Duplex angelagert und ligiert:
  • Figure 00210002
  • Das Duplex codiert die FLAG-Sequenz und ein Initiator-Methionin und eine 5'NcoI-Restriktionsschnittstelle. Das daraus hervorgegangene NcoI/SalI-Fragment wurde in ein Derivat von pCF1 ligiert.
  • Dieses Konstrukt wird dann in E. coli D1210-Zellen transformiert, und Expression der Protease wird durch Zugabe von IPTG induziert.
  • Die FLAG-Sequenz wurde an die HCV-Protease fusioniert, um die Reinigung zu ermöglichen. Ein Calcium-abhängiger monoklonaler Antikörper, der an das FLAG-codierte Peptid bindet, wird für die Reinigung des Fusionsproteins ohne raue Elutions-Bedingungen verwendet.
  • Beispiel 5
  • E. coli-Expression von SOD-Protease-Fusionsproteinen
    • (A) E. coli D1210-Zellen wurden mit cf1SODp600 transformiert und in Luria-Nährlösung mit 100 μg/ml Ampicillin bis zu einer OD von 0,3–0,5 angezogen. Anschließend wurde IPTG für eine Konzentration von 2 mM zugegeben, und die Zellen auf eine endgültige OD von 0,9 bis 1,3 angezogen. Die Zellen wurden dann lysiert, und das Lysat wurde mit Western-Blot unter Verwendung von HCV-Sera getestet, wie in USSN 7/456.637 beschrieben. Die Ergebnisse haben auf das Auftreten von Spaltung gedeutet, da kein Volllängen-Produkt (theoretisch Mr 93 kDa) auf dem Gel ersichtlich war. Banden, die dem hSOD-Fusionspartner und der separaten HCV-Protease entsprechen, sind bei den relativen Molekulargewichten von ungefähr 34, 53 und 66 kDa aufgetreten. Die 34 kDa-Bande entspricht dem hSOD-Partner (ungefähr 20 kDa) mit einem Teil der NS3-Domäne, während die 53 und 66 kDa-Banden der HCV-Protease in unterschiedlichen (wahrscheinlich bakteriellen) Prozessierungsgraden entsprechen.
    • (B) E. coli D1210-Zellen wurden mit P500 transformiert und in Luria-Nährlösung mit 100 μg/ml Ampicillin bis zu einer OD von 0,3–0,5 angezogen. Anschließend wurde IPTG für eine Konzentration von 2 mM zugegeben, und die Zellen auf eine endgültige OD von 0,8 bis 1,0 angezogen. Die Zellen wurden dann lysiert, und das Lysat wurde wie oben beschrieben getestet. Die Ergebnisse haben wiederum auf das Auftreten von Spaltung gedeutet, da kein Volllängen-Produkt (theoretisch Mr 73 kDa) auf dem Gel ersichtlich war. Banden, die dem hSOD-Fusionspartner und der verkürzten HCV-Protease entsprechen, sind bei den Molekulargewichten von jeweils ungefähr 34 und 45 kDa aufgetreten.
    • (C) E. coli D1210-Zellen wurden mit den Vektoren P300 und P190 tansformiert und wie oben beschrieben angezogen. Die Ergebnisse der P300-Expression haben auf das Auftreten von Spaltung gedeutet, da kein Volllängen-Produkt (theoretisch Mr 51 kDa) auf dem Gel ersichtlich war. Eine Bande, die dem hSOD-Fusionspartner entspricht, ist bei einem relativen Molekulargewicht von ungefähr 34 aufgetreten. Die entsprechende HCV-Protease-Bande war nicht sichtbar, da dieser Bereich der NS3-Domäne von den Sera, die zur Produkterkennung verwendet werden, nicht erkannt wird. Dennoch hat das Auftreten der hSOD-Bande bei 34 kDa anstatt 51 kDa darauf hingedeutet, dass Spaltung aufgetreten ist.
  • Das P190-Expressionsprodukt ist lediglich als Voll(codiertes)längen-Produkt ohne Spaltung aufgetreten und bildete eine Bande bei ungefähr 40 kDa, was dem theoretischen Molekulargewicht des ungespaltenen Produkts entspricht. Das könnte darauf hindeuten, dass sich die mindestens erforderliche Sequenz für HCV-Protease bis zum Bereich zwischen Aminosäuren 199 und 299 erstreckt.
  • Beispiel 6
  • Reinigung von in E. coli exprimierter Protease
  • Die HCV-Protease und in Beispiel 5 exprimierte Fragmente können folgendermaßen gereinigt werden:
  • Die Bakterienzellen, in denen das Polypeptid exprimiert wurde, werden einem osmotischen Schock und einem mechanischen Aufschluss unterzogen, der unlösliche Anteil, der die Protease einschließt, wird isoliert und einer differentiellen Extraktion mit einer alkalischen NaCl-Lösung unterzogen, und das Polypeptid in dem Extrakt wird durch Chromatographie auf S-Sepharose®- und Q-Sepharose®-Säulen gereinigt.
  • Der aus osmotischem Schock und mechanischem Aufschluss hervorgehende Rohextrakt wird durch Aufnahme von 1 g komprimierter Zellen in 10 ml einer 0,02 M Tris HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 20% Saccharose enthaltenden Lösung und zehnminütige Inkubation auf Eis hergestellt. Die Zellen werden anschließend durch Zentrifugation bei 4.000 × g für 15 min bei 4°C pelletiert. Nach Entfernung des Überstands wird das Zell-Pellet in 10 ml Puffer A1 (0,01 M Tris HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 14 mM -Mercaptoethanol – „-ME") aufgenommen und 10 min auf Eis inkubiert. Die Zellen werden erneut bei 4.000 × g für 15 min bei 4°C pelletiert. Nach Entfernung des klaren Überstands (periplasmatische Fraktion I) werden die Zell-Pellets erneut in Puffer A1 aufgenommen, 10 min auf Eis inkubiert, und erneut bei 4.000 × g für 15 min bei 4°C pelletiert. Der klare Überstand (periplasmatische Fraktion II) wird entfernt, und das Zell-Pellet wird in 5 ml Puffer T2 (0,02 M Tris HCl, pH 7,5, 14 mM -ME, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF) aufgenommen. Um die Zellen aufzuschließen werden die Suspension (5 ml) und 7,5 ml Dyno-Mill bleifreie Säure-gewaschene Glaskügelchen (0,10–0,15 mm Durchmesser) (erhältlich von Glenn-Mills, Inc.) in ein Falcon-Gefäß gegeben und zwei Minuten lang bei höchster Geschwindigkeit gevortext, gefolgt von mindestens zweiminütigem Kühlen auf Eis. Der Vortexen-Kühlen-Vorgang wird weitere viermal wiederholt. Nach dem Vortexen wird der Brei unter Verwendung von niedrigem Ansaugdruck durch einen gesinterten Glastrichter gefiltert, die Glaskügelchen werden zweimal mit Puffer A2 gewaschen, und die Filtrate und Waschrückstände vereinigt.
  • Der unlösliche Anteil des Rohextrakts wird durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 15 min bei 4°C gesammelt, zweimal mit 10 ml Puffer A2 gewaschen, und in 5 ml MILLI-Q-Wasser aufgenommen.
  • Eine die HCV-Protease einschließende Fraktion wird aus dem unlöslichen Material durch Zugabe von NaOH (2 M) und NaCl (2 M) zu der Suspension, so dass eine Endkonzentration von jeweils 20 mM erreicht wird, Vortexen des Gemischs für 1 Minute, Zentrifugation des Gemischs bei 20.000 × g für 20 min bei 4°C, und Zurückbehalten des Überstands, isoliert.
  • Die teilgereinigte Protease wird dann durch SDS-PAGE gereinigt. Die Protease kann durch Western-Blot identifiziert werden, und die Bande kann aus dem Gel ausgeschnitten werden. Die Protease wird dann aus der Bande eluiert und analysiert, um deren Aminosäure-Sequenz zu bestätigen. N-teminale Sequenzen können unter Verwendung eines automatisierten Aminosäure-Sequenzier-Geräts analysiert werden, während C-terminale Sequenzen durch automatisierte Aminosäure-Sequenzierung einer Reihe tryptischer Fragmente analysiert werden können.
  • Beispiel 7
  • Herstellung eines Hefe-Expressionsvektors
  • (A) P650 (SOD/Protease-Fusion)
  • Dieser Vektor schließt HCV-Sequenz ein, welche die codierende Sequenz der Wildtyp-Volllängen-HCV-Protease fusioniert an das 5'-Ende einer codierenden Sequenz der SOD einschließt. Zwei Fragmente, ein 441 by EcoRI/BglII-Fragment des Klons 11b und ein 1471 by BglII/EcoRI-Fragment des Expressionsvektors P500 wurden zur Wiederherstellung einer codierenden Sequenz der Wildtyp-Volllängen-HCV-Protease verwendet. Diese zwei Fragmente wurden zusammen mit einem EcoRI-verdauten pS356-Vektor ligiert, um eine Expressions-Kassette herzustellen. Die Expressions-Kassette codiert den hybriden ADH2/GAPDH Hefepromotor, menschliche SOD, die HCV-Protease und einen GAPDH-Transkriptions-Terminator. Der daraus hervorgegangene Vektor wurde mit BamHI verdaut, und ein 4052 bp-Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment wurde an den BamHI-verdauten pAB24-Vektor ligiert, wodurch p650 hergestellt wurde. p650 exprimiert ein Polyprotein, das ausgehend von seinem Amino-terminalen Ende einschließt: Aminosäuren 1–154 der hSOD, ein Oligopeptid -Asn-Leu-Gly-Ile-Arg-, und Aminosäuren 819 bis 1458 von HCV-1, wie in 17 in WO 90/11089, veröffentlicht am 4. Oktober 1990, dargestellt.
  • Klon 11b wurde aus der genomischen Bibliothek von HCV-cDNA, ATCC-Zugangs-Nr. 40394, wie oben in Beispiel 3A beschrieben, hergestellt, wobei eine Hybridisierungs-Sonde mit der folgenden Sequenz verwendet wurde:
    5' CAC CTA TGT TTA TAA CCA TCT CAC TCC TCT 3'.
  • Dieses Verfahren ist ebenfalls in EPO Pub. Nr. 318 216, Beispiel IV.A.17 beschrieben.
  • Der Vektor pS3EF, der ein Derivat von pBR322 ist, schließt den hybriden ADH2/GAPDH-Hefepromotor flussaufwärts des menschlichen Superoxid-Dismutase-Gens, einen Adaptor und einen flussabwärts gelegenen wirkungsvollen Transkriptions-Terminator aus Hefe ein. Ein ähnlicher Expressionsvektor, der diese Kontrollelemente und das Superoxid-Dismutase-Gen enthält, ist in Cousens et al. (1987) Gene 61: 265 und in der Teilanmeldung EPO 196.056, veröffentlicht am 1. Oktober 1986, beschrieben. pS3EF unterscheidet sich jedoch von demjenigen in Cousens et al. darin, dass das heterologe Proinsulin-Gen und die Immunoglobulin-Hinge-Region entfernt sind, und dass Gln154 der SOD von einer eine EcoRI-Stelle enthaltenden Adaptor-Sequenz gefolgt wird. Die Sequenz des Adaptors lautet:
  • Figure 00240001
  • Die EcoRI-Stelle ermöglicht das Einsetzen heterologer Sequenzen. Eine SOD-Fusion, ist sie einmal in pS3EF eingesetzt, wird exprimiert, die ein Oligopeptid enthält, das SOD mit den heterologen Sequenzen verknüpft. pS3EF ist genau gleich wie pS356, außer das pS356 einen anderen Adaptor enthält. Die Sequenz des Adaptors ist im Folgenden dargestellt:
  • Figure 00240002
  • pS356, ATCC-Zugangs-Nr. 67683, wurde hinterlegt wie im Folgenden dargelegt.
  • Plasmid pAB24 ist ein Hefe-Shuttle-Vektor, der pBR322-Sequenzen, die vollständige 2μ-Sequenz für DNA-Replikation in Hefe (Broach (1981) in: Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Band 1, S. 445, Cold Spring Harbor Press.) und das von Plasmid pC1/1 stammende LEU2d-Gen aus Hefe, beschrieben in EPO Pub. Nr. 116 201, enthält. Plasmid pAB24 wurde durch Verdau von Yep24 mit EcoRI und erneuter Ligation des Vektors zur Entfernung von Teilen der 2 Micron-Sequenzen konstruiert. Das daraus hervorgegangene Plasmid, Yep24deltaRI, wurde mit ClaI linearisiert und mit dem vollständigen mit ClaI linearisierten 2 Micron-Plasmid ligiert. Das daraus hervorgegangene Plasmid pCBou wurde dann mit XbaI verdaut, und das 8605 bp-Vektorfragment wurde aus einem Gel isoliert. Das isolierte XbaI-Fragment wurde mit einem 4460 bp-XbaI-Fragment, welche das aus pC1/1 isolierte LEU2d-Gen einschließt, ligiert; die Orientierung des LEU2d-Gens ist in der selben Richtung wie das URA3-Gen.
  • S. cervisiae, 2150-2-3 (pAB24-GAP-env2), Zugangs-Nr. 20827, ist in der American Type Culture Collection hinterlegt, wie im Folgenden dargestellt. Das Plasmid pAB24-GAP-env2 kann aus den Hefezellen durch bekannte Verfahren rückgewonnen werden. Die GAP-env-2-Expressions-Kassette kann durch Verdau von pAB24-GAP-env2 mit BamHI entfernt werden. pAB24 wird durch erneute Ligation des Vektors ohne das BamHI-Insert rückgewonnen.
  • Beispiel 8
  • Hefe-Expression von SOD-Protease-Fusionsproteinen)
  • p650 wurde in den S. cerevisiae-Stamm JSC310, Mata, leu2, ura3-52, prb1-1122, pep4-3, prc1-407, cir°: DM15 (g418-Resistenz) transformiert. Transformation findet wie von Hinnen et al. (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75: 1929 beschrieben statt. Die transformierten Zellen wurden auf ura–-Platten mit 8% Glukose selektiert. Die Platten wurden bei 30°C für 4–5 Tage inkubiert. Die Transformanten wurden weiterhin auf leu–-Platten mit 8% Glukose selektiert, vermutlich um eine hohe Anzahl p650-Plasmid zu erzielen. Kolonien von den leu–-Platten wurden in leu–-Nährlösung mit 3% Glukose angeimpft. Diese Kulturen wurden bei 30°C für 2 Tage geschüttelt und dann 1/20 in YEPD-Närlösung mit 2% Glukose verdünnt und für 2 weitere Tage bei 30°C geschüttelt.
  • S. cerevisiae JSC310 enthält DM 15-DNA, beschrieben in EPO Pub. Nr. 340 986, veröffentlicht am 8. November 1989. Diese DM 15-DNA verstärkt die durch ADH2 regulierte Expression heterologer Proteine. pDM15, Zugangs-Nr. 40453 ist in der American Type Culture Collection hinterlegt, wie im Folgenden dargestellt.
  • Beispiel 9
  • Hefe-Ubiquitin-Expression reifer HCV-Protease
  • Reife HCV-Protease wird durch Spaltung des Vektors C7fC20cC300C200 mit EcoRI hergestellt, wobei eine 2 kb lange codierende Sequenz erhalten wird, und durch Einsetzen der Sequenz mit geeigneten Linker-DNAs in einen Ubiquitin-Expressionsvektor, wie zum Beispiel den, der in WO 88/02406, veröffentlicht am 7. April 1988, oder USSN 7/390.599, eingereicht am 7. August 1989, hierin durch Referenz aufgenommen, beschrieben ist. Reife HCV-Protease wird nach Expression des Vektors in geeigneten Wirten, speziell Hefe, gewonnen. Speziell das Hefe-Expressions-Protokoll, beschrieben in Beispiel 8, wird für die Expression eines Ubiquitin/HCV-Protease-Vektors verwendet.
  • Beispiel 10
  • Herstellung eines In-Vitro-Expressions-Vektors
  • (A) pGEM®-3Z/Gelbfieber-Signalsequenz-Vektor
  • Vier synthetische DNA-Fragmente wurden aneinander angelagert und miteinander ligiert, wobei eine EcoRI/SacI-Gelbfieber-Signalsequenz geschaffen wurde, die an einen mit EcoRI/SacI verdauten pGEM®-3Z-Vektor von Promega® ligiert wurde. Die Sequenz der vier Fragmente ist im Folgenden aufgelistet:
  • Figure 00260001
  • Für die in-vitro-Translation der HCV-Protease wurde der neue pGEM®-3Z/Gelbfieber-Signalsequenz-Vektor mit BamHI verdaut und die Enden mit Klenow in glatte Enden überführt.
  • (B) PvuII-Konstrukt aus p6000
  • Ein Klon p6000 wurde aus Sequenzen, die aus der genomischen Bibliothek der HCV-cDNA, ATCC-Zugangs-Nr. 40394 erhältlich sind, konstruiert. Die HCV-codierende DNA-Sequenz von p6000 ist identisch zu Nukleotid –275 bis Nukleotid 6372 der 17 aus WO 90/11089, veröffentlicht am 4. Oktober 1990. p6000 wurde mit PvuII verdaut, und aus dem Verdau wurde ein 2.864 bp-Fragment isoliert. Dieses 2.864 bp-Fragment wurde an das oben beschriebene hergestellte pGEM®-3Z/Gelbfieber-Signalsequenz-Vektorfragment ligiert.
  • Beispiel 11
  • In-Vitro-Expression von HCV-Protease)
  • (A) Transkription
  • Der pGEM®-3Z/Gelbfieber-Signalsequenz/PvuII-Vektor wurde mit XbaI linearisiert und unter Verwendung der Materialien und Protokolle aus Promegas Riboprobe® Gemini II Core-System transkribiert.
  • (B) Translation
  • Die durch das obige Protokoll hergestellte RNA wurde unter Verwendung von Promegas Kaninchen-Retikulozyten-Lysat, ohne Methionin, pankreatische mikrosomale Membranen aus Hund, sowie anderen erforderlichen Materialien und Anleitungen von Promeage translatiert.
  • Hinterlegte Biologische Materialien
  • Die folgenden Materialien wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland, hinterlegt:
  • Figure 00270001
  • Die obigen Materialien wurden bei der ATCC unter den angegebenen Zugangs-Nummern hinterlegt. Diese Hinterlegungen werden unter den Bedingungen des „Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for purposes of Patent Procedure" aufrecht erhalten. Diese Hinterlegungen sind als Erleichterung für den Fachmann bereitgestellt und stellen kein Eingeständnis, dass eine Hinterlegung gemäß 35 U.S.C. §112 erforderlich ist, dar. Die in den hinterlegten Materialien eingeschlossenen Polynukleotid-Sequenzen sowie die Aminosäure-Sequenzen der davon codierten Polypeptide werden hierin durch Referenz aufgenommen und sind maßgebend im Falle irgendeines Widerspruchs mit den hierin beschriebenen Sequenzen. Zu Herstellung, Verwendung oder Verkauf der hinterlegten Materialien kann eine Lizenz erforderlich sein, und keine solche Lizenz wird hierdurch gewährt.
  • SEQUENZ-PROTOKOLL
    Figure 00280001
  • Figure 00290001
  • Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001
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  • Figure 00400001
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  • Figure 00660001
  • Figure 00670001

Claims (8)

  1. Verfahren zur Untersuchung von Verbindungen auf Aktivität gegen Hepatitis C-Virus (HCV), wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Zusammensetzung, die eine gereinigte HCV-NS3-Domänen-Protease, die in der NS3-Domäne des HCV-Genoms codiert ist, oder Verkürzungen davon, die Proteaseaktivität haben, umfasst; (b) Inkontaktbringen der Protease mit einer Verbindung, die fähig ist, Proteaseaktivität zu inhibieren; und (c) Messen der Inhibierung der proteolytischen Aktivität der Protease.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Protease eine partielle interne Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID. NO. 63 dargestellt ist, umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Protease eine partielle interne Aminosäuresequenz umfasst, wie sie in SEQ ID. NO. 64 dargestellt ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Protease die Aminosäuresequenz umfasst, die in SEQ ID. NO. 69 dargestellt ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Protease eine partielle interne Aminosäuresequenz umfasst, die in SEQ ID. NO. 65 dargestellt ist.
  6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Protease einen Histidin-, Aspartat- und Serinrest in den Positionen, die der Aminosäure 139, 163 bzw. 221 der SEQ ID. NO. 69 Aminosäuresequenz entsprechen, oder in äquivalenten Positionen umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Protease eine Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID. NO. 67 dargestellt ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Protease eine Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID. NO. 66 dargestellt ist.
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