CN100335637C - 采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫 - Google Patents

采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫 Download PDF

Info

Publication number
CN100335637C
CN100335637C CNB998024813A CN99802481A CN100335637C CN 100335637 C CN100335637 C CN 100335637C CN B998024813 A CNB998024813 A CN B998024813A CN 99802481 A CN99802481 A CN 99802481A CN 100335637 C CN100335637 C CN 100335637C
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
nucleic acid
hcv
hepatitis
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB998024813A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1289339A (zh
Inventor
J·万德斯
J·恩克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
General Hospital Corp
Original Assignee
General Hospital Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by General Hospital Corp filed Critical General Hospital Corp
Publication of CN1289339A publication Critical patent/CN1289339A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100335637C publication Critical patent/CN100335637C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种编码丙型肝炎非结构蛋白的核酸分子(包括具体公开的DNA序列)。还公开了药物组合物，它包含编码NS3、NS4和NS5，或它们组合的核苷酸序列的丙型肝炎非结构蛋白的核酸分子，该核酸分子和人体细胞内功能性的调控元件可操作性相连。还公开了对丙型肝炎病毒易感或被感染的个体进行免疫的方法，该方法包括施用这些药物组合物。

Description

采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫
发明领域
本发明涉及重组核酸分子和包含例如与基因免疫方案中抗丙型肝炎病毒的疫苗组分同样有用的药物组合物；涉及诱导抗丙型肝炎病毒感染的免疫应答的方法；并涉及治疗患有丙型肝炎感染的病人的方法。
发明背景
丙型肝炎病毒(HCV)，由输血获得的非甲非乙型肝炎的主要病原体，在美国每年引起了大约150,000起的急性病毒性肝炎的新病例。(Choo，等，科学，1989，244，359-362.)在西方国家，有0.6％至2.0％的流行率，而在世界的一些不发达地区要高达15％。(Heintges，等，Hepathology，1997，26，521-526.)大约一半的此类感染会演变成和肝硬化以及/或肝癌相关的慢性感染。(Alter，等，科学，1992，258，135-140；和alter，等，新英格兰医学杂志，1992，327，1899-1905).此外，抗丙型肝炎病毒抗体的流行显示，丙型肝炎病毒的感染是肝细胞癌发展的一种独立的危险因素(Colombo，等，Lancet，1989，ii，1006-1008；Saito，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87，6547-6549；Simonetti，等，An.Int.Med.，1992，116，97-102；和Tsukuma，等，新英格兰医学杂志，1993，328，1797-1801).
丙型肝炎病毒是一种具有衣壳的正链RNA病毒，长度大约为9,500核苷酸，最近被分类为黄病毒属的一个独立种。(Heinz，Arch.Virol.(Suppl.)，1992，4，163-171.)不同的分离物显示出相当多的核酸序列多样性，导致将HCV的基因组进一步分成八个基因型。(Simmonds，等，J.Gen.Virol.，1993，74，2391-2399.)在所有的基因型中，病毒基因组都包含一个大的开放阅读框(ORF)，编码一条由3010到3033个氨基酸组成的，大约330Kd的多聚蛋白前体。(Choo，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991，88，2451-2455；Inchauspe，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991，88，10292-10296；Kato，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87，9524-9528；Okamoto，等，病毒遗传学杂志，1991，72，2697-704；和Takamizawa，等，J.Gen.Virol.，1991，65，1105-1113.)
通过该多聚蛋白前体的蛋白水解加工产生了核心蛋白(C)，衣壳蛋白(E1，E2)和非结构(NS2-NS5)蛋白，从而产生出各种HCV多肽。(Bartenschlager，等，病毒遗传学杂志，1993，67，3835-3844；Grakoui，等，病毒遗传学杂志杂志，1993，67，2832-2843；及Selby，等，病毒遗传学杂志，1993，74，1103-1113)。这种蛋白水解是联合采用细胞蛋白酶和病毒编码的蛋白酶进行催化反应的。NS3基因编码一种丝氨酸蛋白酶，此酶能在几种功能部位切断转录后的病毒多聚蛋白前体，还可以作为蛋白解旋酶起作用。NS5区域编码此病毒的RNA依赖的RNA聚合酶。
除了转录区域外，HCV基因组还包含一个5’非翻译区域(5’UTR)和一个3’非翻译区域(3’UTR)。该324至341的5’非翻译区域核酸序列代表了迄今为止报道过的所有HCV分离物中最保守的核酸序列。(Han，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991，88，1711-1715；和Bukh，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，4942-4946).该5’非翻译区域被假定包含了HCV RNA复制和/或翻译的重要调控元件。该5’非翻译区域还包含了数个小的开放阅读框(ORF)，但现今尚未有证据提示这些开放阅读框被真实翻译。
在HCV感染期间涉及肝损伤和病毒清除的细胞免疫机制只是部分的被说明。在尝试检测慢性HCV感染病人中肝浸润淋巴细胞的潜在致病作用时，Koziel等检验了细胞毒T淋巴细胞(CTL)对这些细胞的反应，并证明HLA I类限制性的CD8+细胞毒T淋巴细胞应答针对HCV多肽的结构和非结构区域。(Koziel，等，病毒学杂志1993，67，7522-7532；和Koziel，等，免疫学杂志，1992，149，3339-3344).其他研究者也注意到在外周血单核细胞群体中存在细胞毒T淋巴细胞，它能识别慢性HCV感染时的病毒核心上的和其它病毒相关蛋白上的表位。(Kita，等，Heatol.，1993，18，1039-1044；和Cerny，等，Intl.Symp.virol Hepatitis Liver Dis.，1993，83(abstr.).)Botarelli，等，(Botarelli，等，Gastroenterol.，1993，104，580-587)和Ferrari，等，(Ferrari，Hepatol.，1994，19，286-295)发现了针对慢性HCV感染病人体内得到的HCV的不同区域的几种重组蛋白的HLA II类限制性的CD4+T细胞介导的增殖反应。
在有效HCV感染中，体液和细胞免疫应答已显示是多克隆、多特异性的。很可能在持续HCV感染中产生的宿主免疫应答，部分的引了肝细胞损伤。然而，这些免疫应答不足够广泛或强大，以在慢性HCV感染的病人体内促进病毒清除和保护性免疫力。(Chisari，J.Clin.Invest.，1997，99，1472-1477.)最近显示，那些从急性HCV感染中恢复的病人能产生很强的对非结构蛋白多肽CD4+T细胞增殖反应。(Missale，等，J.Clin.Invest.，1996，98，706-714；和Diepolder，等，Lancet，1995，346，1006-1007.)更重要的是，HCV特异性CTL活性的产生是和慢性肝炎个体体内病毒复制的控制相联系的。(Rehermann，等，J.Clin.Invest.，996，98，1432-1440；和Nelson，等，J.Immunol.，1997，158，1473-1481.)
然而，非结构蛋白NS3，NS4和NS5是否有足够的免疫原性能够在体内产生广泛的、强有力的CTL应答尚不知道。
现今还没有通用的、高效的对慢性HCV感染的治疗方法。HCV疫苗策略的开发是复杂的，不仅是由于HCV分离物的显著的异质性，还由于在一个病毒分离物中混合了异源基因组。(Martell，等，J.Virol.，1992，66，3225.)此外，病毒包含了一个高度可变的衣壳区。有效的治疗仅限于干扰素。(Carithers，et al，Hepatology，1997，26，83S-88S.)事实上，用这种制剂治疗的病人大约8-10％有反应，并有HCV从肝部的扩散。然而，近来的研究显示，和那些获得持续性HCV感染的病人比较，从急性HCV感染中恢复的病人对非结构蛋白产生了充分的CD4+T细胞增殖反应。(Missale，等，J.Clin.Invest.，1996，98，706-714；和Diepolder，等，Lancet，1995，346，1006-1007)
直接将DNA注射入动物体内是免疫接种输送特异免疫抗原的一种有前途的方法。(Barry，等，Bio Techniques，1994，16，616-619；Davis，等，Hum.Mol.Genet.，1993，II，1847-1851；Tang，等，自然科学，1992，356，152-154；Wang，等，J.Virol.，1993，67，3338-3344；和Wolff，等，科学，1990，247，1465-1468.)该方法已被成功的应用于在鼠和鸡中产生对流感病毒、在鼠和小牛中对牛疱疹病毒、在鼠中对狂犬病毒产生保护性免疫。(Cox，等，J.Virol.，1993，67，5664-5667；Fynan，等，DNA和Cell Biol.，1993，12，785-789；Ulmer等，科学，1993，259，1745-1749；和Xiang等，Virol.，1994，199，132-140.)在大多数情况中，强而高度多样的抗体和细胞毒T细胞应答和感染的控制有关。事实上，和那些死病毒的疫苗，不仅能引起抗急性感染的保护力而且能根除持续性病毒感染的CTL应答的方法比较，不使用肝脏载体而产生长而持续性的记忆性CTL的可能性，使这种方法特别具有吸引力。(Wolff，等，科学，1990，247，1465-1468；Wolff，等，Hum.Mol.Genet.，1992，I，363-369；Manthorpe，等，Human Gene Therapy，1993，4，419-431；Ulmer等，科学，1993，259，1745-1749；Yankauckas，etaal.，DNA和细胞生物学，1993，12，777-783；Montgomery，等，DNA和细胞生物学，1993，12，777-783；Fynan，等，DNA和细胞生物学，1993，12，785-789；Wang，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90，4156-4160；Wang，等，DNA和细胞生物学，1993，12，799-805；Xiang，等，Virol.，1994，199，132-140；Davis，等，Hum.Mol.Genet.，1993，II，1847-1851；Donnelly，等，Nat.Med.，1995，I，583-587；Boyer，等，Nat.Med.，1997，3，526-532；Tascon，等，Nat.Med.，1996，2，888-892；和Huygen，等，Nat.Med.1996，2，893-898.)。和融合重组蛋白或多肽相比较，该方法的优点在于能引起强烈的炎症性的CD4+T细胞应答和细胞毒T细胞活性，推测是病毒蛋白在细胞内加工转变成多肽，然后装载在转染细胞的MHC I类分子上，与抗原递呈细胞相互作用而致。相反的是，用融合蛋白免疫接种主要导致由MHC II类途径加工的体液免疫应答。由于只有有限数目的表位能刺激宿主的免疫应答，用合成多肽免疫有几个缺陷之处。相反的，对于感兴趣的DNA构建物编码的每个蛋白，天然存在的B和T细胞表位都可能是为T细胞受体识别而保留的，因此可能会产生广泛的体液和细胞免疫应答。(McDonnell，等，N.Engl.J.Med.，1996，334，42-45.)
疫苗接种和免疫接种通常指引入某种无毒的物质，个体的免疫***能刺激针对该物质的免疫应答，从而能抵抗病原体的攻击。免疫***识别入侵的“外来”组分和物质主要靠识别在个体内正常不存在的蛋白和其它的大分子。外来的蛋白是免疫应答所针对的目标。
PCT专利申请PCT/US90/01348公开了HCV基因组克隆的序列信息，HCV病毒蛋白的氨基酸序列以及制造和使用包括抗-HCV疫苗等组分的方法，该疫苗中含有HCV蛋白及其产生多肽。
美国专利5,830,876，5,593,972，5,739,118和于1994年1月26日提交的PCT专利申请系列号PCT/US94/00899，其内容全部纳入本文以供参考。每专利都包含了基因免疫方案的细节。抗HCV疫苗也包括在各件专利之中。
用于保护个体抵抗HCV感染的疫苗的需求仍然存在，保护个体抵抗HCV感染的方法的需求仍然存在。
发明概述
本发明涉及重组核酸序列分子，其包含编码HCV非结构区域，如NS3，NS4，或NS5，或它们的组合的核苷酸序列。
本发明涉及包含重组核酸分子的药物组合物，该重组的核酸分子含有一段编码HCV非结构蛋白的核苷酸序列。编码HCV非结构蛋白的该核苷酸编码序列和人细胞中的功能性调节元件可操作性相连。该药物组合物还包含有药学上可接受的运载体或稀释剂，和任选的促进剂(facilitator)，比如丁哌卡因。
该发明涉及免疫HCV易感个体的方法，包含向该个体给药，药物组合物含有编码HCV非结构蛋白的核苷酸序列的重组核酸分子。该编码HCV非结构蛋白的核苷酸编码序列与人类细胞中的功能性调节元件可操作性相连。该药物组合物还包含一种药学上可接受的运载体或稀释剂。对个体施用一定量的药物使之有效诱导抗HCV感染的保护性免疫应答。
本发明涉及治疗患有HCV感染个体的方法，包括相该个体歌谣，药物成分含有编码HCV非结构蛋白的核苷酸序列的重组核酸分子。该编码HCV非结构蛋白的核苷酸编码序列序列与人细胞中的功能性调节元件可操作性相连。该药物组分还包含药学上可接受的运载体或稀释剂。给予个体一定量的药物使之有效诱导HCV感染的治疗性免疫应答。
附图简述
图1A是一示意图，显示HCV的单一大开放阅读框，它编码大约3011-3030个氨基酸的多聚蛋白前体。该蛋白前体被宿主信号和病毒蛋白酶切割成不同的结构和非结构蛋白，如箭头所示。图1B显示HuH-7细胞瞬时转染和SP2/0细胞稳定转染后的非结构蛋白表达的示范性放射自显影图。1，3，5泳道是模拟DNA转染的细胞，用作阴性对照(Mock)；2，4和6泳道显示了特异条带，NS3在大约70，NS4在大约30，NS5大约125KD。7-10泳道显示了分别转染了含有NS3，NS4，和NS5基因的核酸构建物的SP2/0细胞。7和9泳道代表由稳定表达HCV-核心蛋白，作为阴性对照(SP2-10)的细胞得到的细胞裂解物，而8和10泳道代表NS3和NS5的特异性表达。
图2A是一柱状图，显示一代表性的以DNA为基础免疫接种引起的对NS3，NS4和NS5的体液免疫应答；血清抗体水平由一ELISA法测定(每组：n＝5).图2B是一柱状图，显示一在体外用特异或非特异性重组蛋白刺激3日后测得的代表性的T细胞增殖。图2C，2D，和2E为柱状图，显示在体外刺激48小时后测得的代表性的细胞因子IFN-γ，IL-2和IL-4分别在上清液中的分泌水平。
图3A和3B是柱状图，显示在不同的效应细胞和靶细胞比例下(100∶1，30∶1，10∶1，3∶1)分别对NS3和NS5作出的代表性的细胞毒T细胞(CTL)反应.图3C是柱状图，显示针对稳定转染靶细胞谱线的代表性铬释放实验。
图4A是一表格，显示评价CTL活性的肿瘤模型的代表性结果。图4B是一照片，自左自右显示接种了1)模拟DNA，并以SP2/NS5-21细胞攻击；2)pApNS5，以SP2/NS5-21细胞攻击；3)pApNS5，以SP2-19细胞攻击；(稳定表达HCV核心蛋白)；以及4)用重组NS5蛋白腹膜接种三次，并被SP2/NS5-21细胞攻击的动物
该发明的优选例描述
根据本发明，提供了对HCV感染进行预防性/或治疗性免疫，或治疗个体的方法。重组核酸分子被接种入个体内，该重组核苷酸分子包含编码HCV非结构蛋白，如NS3，NS4，或NS5，或它们的组合的核苷酸编码序列。由该重组核酸基因构建物编码的蛋白由个体的细胞表达，并作为免疫原性靶子，诱导针对它的抗HCV的免疫应答。引起的免疫应答是广泛的，除体液免疫应答外，细胞免疫的两个途径都被激活。该发明的方法可用来赋予预防性和治疗性免疫力。该发明的方法除用于人类外，亦可用于哺乳动物以进行生物医学研究。因此，该发明的方法既可用于个体免疫抵抗HCV攻击，亦可用于治疗HCV感染个体。
本文所用的词组“HCV非结构蛋白”是指HCV非结构蛋白NS3，NS4和NS5，以及它们的等价物。等价蛋白包括保留本文所述的生物活性的NS3，NS4和NS5肽链片段。此外，术语HCV非结构蛋白意指相应的来自其它的HCV分离物，(序列上可能有变化)的HCV非结构蛋白。该领域一般技术人员能容易的鉴定其它HCV分离物的非结构蛋白。需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中的核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生的保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。需理解的是，词组“HCV非结构蛋白”也包括了融合蛋白，该融合蛋白包括非结构蛋白，以及它的治疗和预防性的活性片段。
本文所用的词组“基因构建物”指包含编码HCV非结构蛋白的核苷酸编码序列的重组核酸分子，以及起始和终止信号，它们和包括启动子、聚腺苷酸化信号，能指导在疫苗接种个体细胞中表达的调控元件可操作性相连。在某些实施例中，基因构建物更包含有增强子，Kozak序列(GCCGCCATG；SEQ IDNO：1)，和至少一个HCV 5’UTR片段。
本文所用的词组“基因疫苗”指包括有一个基因构建物的药物制剂。基因疫苗包含有用于刺激对HCV的预防性和/或治疗性免疫应答的药物制剂。
本文所用的词组“核酸”指DNA，RNA，或由它们形成的嵌合体。
根据本发明，将基因构建物引入个体细胞中并在其中表达，从而产生至少一种HCV非结构蛋白。更好的是，本发明的基因构建物的调控元件能指导哺乳动物细胞中的表达，尤其是人类细胞中的表达。该调控元件包括启动子和聚腺苷酸信号。此外，其它元件，如增强子和Kozak序列，亦可包含在基因构建物中。
当被细胞摄取后，本发明的基因构建物可以在细胞中作为染色体外功能性分子存在或整合入细胞的染色体DNA中。核酸，例如DNA，可以被引入细胞，在细胞中以质粒的形式作为独立的基因材料存在。另外，可以整合到染色体中的线状核酸分子也可导入细胞。当将核酸引入细胞时，可加入促进核酸整合到染色体上的试剂。在DNA分子中亦可加入有助于促进整合的DNA序列。此外，RNA也可以接种入细胞。也可考虑将基因构建物以线状微型染色体包括着丝粒、端粒和复制起始点的形式提供。
根据本发明，基因构建物包含具有编码HCV非结构蛋白的核苷酸编码序列的重组核酸分子。在一些优选例中，重组核酸分子包括了编码NS3的核苷酸编码序列。在另一些优选例中，重组核酸分子包括了编码包括NS4在内的HCV非结构蛋白的核苷酸编码序列。在另一些优选例中，重组核酸分子包括了编码包括NS5在内的HCV非结构蛋白的核苷酸编码序列。在另一些优选例中，重组核酸分子包括了编码包括NS3，NS4，和NS5在内的任一HCV非结构蛋白组合的核苷酸编码序列。
在一些优选例中，该重组核酸分子包括了编码包括HCV NS3，NS4，NS5蛋白的片段或它们的组合的HCV非结构蛋白的核苷酸编码序列。这些片段包括，但不限于，含有相应非结构蛋白的10，25，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，或1000个氨基酸的片段。此外，这些片段可以包含蛋白羧基端一部分、胺基端一部分、或它们两者之间的任一部分。该领域技术熟练的研究人员可以容易地制备HCV非结构蛋白的免疫原性片段、或含有任一组合的非结构蛋白的免疫原性片段的融合蛋白。因此，可以考虑，使含有编码HCV非结构蛋白的核苷酸编码序列的重组核酸分子含有比整个HCV非结构基因产物少的序列，而基本上不改变疫苗效率。还可考虑，在该核苷酸编码序列中替换至少一个或多个核苷酸而不影响该蛋白的氨基酸序列。此外还可考虑可在整段蛋白中制造至少一个或多个保守性的氨基酸替代，而不实质减弱HCV非结构蛋白的免疫原性的活力。
在本发明的一些优选例中，重组核酸分子包含具有HCV 5’UTR最后9个核苷酸，HCV 5’UTR最后25个核苷酸，HCV 5’UTR最后50个核苷酸，HCV5’UTR最后75个核苷酸，HCV 5’UTR最后100个核苷酸，HCV 5’UTR最后150个核苷酸，HCV 5’UTR最后200个核苷酸，HCV 5’UTR最后250个核苷酸，以及HCV 5’UTR最后300个核苷酸的5’UTR片段。在一些优选例中，基因构建物含有整个HCV 5’UTR。在一些优选例中，基因构建物含有HCV5’UTR的最3’端的9个核苷酸。一个优选例中的整个HCV 5’UTR是：GCCAGCCCCC GATTGGGGGC GACACTCCAC CATAGATCAC TCCCCTGTGA GGAACTACTGTCTTCACGCA GAAAGCGTCT AGCCATGGCG TTAGTATGAG TGTCGTGCAG CCTCCAGGACCCCCCCTCCC GGGAGAGCCA TAGTGGTCTG CGGAACCGGT GAGTACACCG GAATTGCCAGGACGACCGGG TCCTTTCTTG GATCAACCCG CTCAATGCCT GGAGATTTGG GCGTGCCCCCGCGAGACTGC TAGCCGAGTA GTGTTGGGTC GCGAAAGGCC TTGTGGTACT GCCTGATAGGGTGCTTGCGA GTGCCCCGGG AGGTCTCGTA GACCGTGCAC C(SEQ ID NO：2)
DNA分子的基因表达所需的调控元件包括：启动子，初始密码子，终止密码子，聚腺苷酸信号。此外，基因表达常需增强子。这些元件需和编码HCV非结构蛋白的的序列可操作性连接，还需要在接种的个体中具操作性。起始密码子和终止密码子通常被视为编码HCV非结构蛋白的核苷酸序列的一部分。
使用的启动子和聚腺苷酸信号必须在个体细胞中具有功能性。为使蛋白的生产达到最大，可选择给予该构建物的细胞中非常适合基因表达的调控元件。此外，可选择能在细胞中最有效转录的密码子。在本领域具有一般技能的研究人员能构建在哺乳动物，尤其是人类细胞中具有功能性的DNA构建物。
用于实现本发明的启动子的实例，尤其是生产人类用的基因疫苗的启动子的实例，包括但不限于：猿猴病毒40(SV40)的启动子，鼠***瘤病毒(MMTV)的启动子，人类免疫缺陷病毒(HIV)，例如HIV的长最后重复序列(LTR)的启动子，白血病(moloney)病毒，ALV(禽白血病(moloney)病毒)，巨细胞病毒(CMV)，如CMV的立即早期启动子，EB病毒(EBV)，Rous肉瘤病毒(RSV)，以及来自人类基因的启动子，如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血色素、人肌酸素以及人金属硫蛋白的启动子。
用于实现本发明的聚腺苷酸信号的实例，尤其是生产人类用的基因疫苗的聚腺苷酸信号的实例，包括但不限于：猿猴病毒40(SV40)和LTR的聚腺苷酸信号。具体使用的SV40聚腺苷酸信号是在pCEP4质粒(Invitrogen，SanDiego CA)中的SV40聚腺苷酸信号。除基因表达所需的调控元件外，在基因构建物中还可含有其它的元件。这些其它的元件包括增强子。增强子可从下列组中选择但不限于：人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血色素、人肌酸素以及病毒增强子如CMV，RSV和EBV的增强子。
可向基因构建物提供哺乳动物复制起始点，以使之保持染色体外的状态，从而在细胞中产生此构建物的多个拷贝。质粒pCEP4，pREP4(San Diego，CA)包含有EB病毒的复制起始点和无需整合，能产生高拷贝游离型复制的核酸抗原EBNA-1编码区。
接种途径包括，但不限于：肌内，腹膜内，真皮内，皮下，静脉注射，动脉内，眼内和口服，以及透皮或采用吸入法或栓剂。优选给药途径包括肌内，腹膜内，真皮内和皮下注射。在采用和粘膜免疫力相关组织中存在的物质免疫接种后，编码HCV非结构蛋白的基因构建物的输送能赋予粘膜免疫力。因此，在一些实施例中，此基因构建物通过在个体口腔中的口腔前庭接种来输送。
基因构建物可通过包括，但不限于：传统注射，无针注射设备，或“显微粒子轰击基因枪”(microprojectile bombardment gene guns)给予。此外，基因疫苗亦可用多种方法导入从个体上取出的细胞中。这些方法包括：比如，体外转染，电穿孔法，显微注射以及显微粒子轰击。在基因构建物被细胞摄取后，可将细胞重新植回个体。可考虑，本来无免疫原性的细胞掺入了基因构建物后可以植入个体，即使被接种的细胞原来来自另一个个体。
根据本发明的一些优选例，基因构建物采用无针注射器接种入个体。根据另一些优选例，基因构建物同时用无针注射器通过真皮内，皮下注射和肌肉注射来接种入个体。无针注射器是广为人知并广泛可得的。该领域的一般技术人员能够按照本文的指导，用无针注射器来将基因物质传递给个体的细胞。无针注射器非常适合向所有的组织传递基因物质。它们尤其对相皮肤和肌肉细胞传递遗传物质有效。在一些优选例中，无针注射器可以用来将含有DNA分子的液体推至个体的皮肤表面。该液体以足够的速度推动，由于对皮肤的冲击力，液体穿透皮肤表面，渗入到下面的皮肤和肌肉组织。因此，基因构建物同时被接种入真皮，皮下和肌肉。在一些优选例中，为了向器官细胞引入核酸分子，无针注射器可用来将基因物质传递给其它器官的组织。
根据本发明，基因疫苗含有1纳克至1000毫克的核酸，宜选是DNA。在一些优选例中，该疫苗含有10纳克至大约800毫克的核酸。在一些优选例中，该疫苗含有0.1至大约500毫克的核酸。在一些优选例中，该疫苗含有1至大约350毫克的核酸。在一些优选例中，该疫苗含有25至大约250毫克的核酸。在一些优选例中，该疫苗含有大约100毫克的核酸。该领域熟练技术人员能容易地配制所需量核酸的疫苗。
按照接种模式来配置本发明的基因疫苗。该领域中一般技术人员可以容易地配制含有基因构建物的药物组合物。本发明的药物组合物包含有的编码NS3，NS4，或NS5，或它们的组合的单一基因构建物。另外，本发明的药物组合物包含有编码NS3，NS4，或NS5，或它们的组合的多个基因构建物。另外，本发明的药物组合物包含有编码NS3，NS4，或NS5的片段，或它们的组合的单一或多个基因构建物。此外，本发明的药物组合物包含编码所有或任一NS3，NS4，或NS5蛋白片段的融合蛋白的单一基因构建物。在某些例子中，等渗的配方被采用。通常，等渗添加剂可包括氯化钠，葡聚糖，甘露糖醇，山梨醇和乳糖。在某些例子中，可采用等渗溶液例如磷酸缓冲液。稳定剂包括凝胶和白蛋白。在一些优选例中，在配方中添加血管收缩剂。本发明的药物制备需是无菌无热源质提供的。
本发明的基因构建物可以用能提高基因构建物的吸收和/或表达的药剂配制或联合接种，该药剂本文称为促进剂(facilitator)，它与基因构建物的摄取和表达有关的细胞，以及当在缺少这些药剂时接种相同的基因疫苗时出现的细胞有关。这些药剂和将它们与基因构建物联合接种的方案在美国专利5,830,876，5,593,972，5,739,118和与1994年1月26日PCT专利申请系列号PCT/US94/00899中有描述。这类药剂的例子包括：CaPO4，DEAE，葡聚糖，脂质，胞外基质活性酶；皂角苷；凝集素；***化合物和类固醇激素；羰化低级烷，二甲基亚砜(DMSO)；尿素；苯甲酸酯酰替苯胺；脒；氨基甲酸乙酯和局部***家族的盐酸盐。此外，基因构建物可包裹在脂质/聚阳离子复合物中或与该复合物联合接种。一种优选的促进剂(facilitator)是丁哌卡因。这些组分可以方便的以单位剂量给予，并可用药学领域中熟知的任何方法制备。例如Remington’s PhamaceuticalSciences(Mack Pub.Co.，Easton，PA，1980)，所描述的方法。该文公开的内容全部纳入本文作参考。
在实施例中，提供了以下的用编码HCV三种不同非结构蛋白的质粒作DNA疫苗接种，显示能刺激免疫***二部分能强烈抗原特异性免疫应答。三次免疫接种后，所有动物都产生了可检测的抗体反应。在这点上，这些非结构蛋白和以前用结构性HCV核心结构蛋白的研究相比，是好得多的刺激体液免疫应答的抗原。(Tokushige，等，Hepatology，1996，24，14-20；和Geissler，等，J.Immunol.，1997，158，1231-1237.)在优选例中，对非结构蛋白的体液免疫可以用加入能活化抗原递呈细胞的化合物来增强，比如，表达细胞因子的质粒，如IL-2和GM-CSF。(Geissler，等，J.Immunol.，1997，158，1231-1237；和Xiang，Immunity，1995，2，129-135.)所有的三种编码NS3，NS4，NS5的质粒都证明了产生了具有优势THI表型的炎症性CD4+T细胞。此外，产生强而特异的CD8+CTL应答主要是针对裂解病毒产生的NS3，NS5。以前已显示能在动物模型***中诱导抵抗各种病原体的保护力。(Tascon，等，Nat.Med.，1996，2，888-892；和Huygen，等，Nat.Med.，1996，2，893-898.)而且，要确定DNA疫苗产生的CTL应答是否能保护动物，防止以编码NS5蛋白的cDNA稳定转染的同系SP2/0肿瘤细胞的肿瘤形成。结果大约60％的小鼠受到保护避免了肿瘤形成，表明该免疫接种方式在体内产生了高水平的CTL活性，另外，与用模拟DNA或重组NS5蛋白免疫接种的动物相比，在患肿瘤的那些动物中，肿瘤重量显著下降。这个模型也证明了在动物模型中评估抗黄病毒非结构蛋白的高水平细胞免疫应答作为衡量抑制肿瘤生长的指标的能力。
本文公开的结果证明，用编码HCV非结构蛋白的基因构建物来进行DNA为基础的免疫接种，如本文所述，可用于患有HCV感染的个体的治疗性处理，以及可用与抗HCV预防性疫苗。
本发明将通过以下实施例作进一步描述，以试图阐明本发明。这些实施例并不意味，或被解释成，限制所公开述的范围。
实施例
实施例1：设计并构建HCV表达载体
将编码单个非结构蛋白的基因与采用工程改造后的起始和终止密码子克隆入一表达质粒，由CMV启动子和RSV增强子(pApO31)驱动。包括选择性标记的该表达载体(pcDNA3)也被用来产生稳定的SP2/0转染细胞系。(见图1A)。
作为病毒基因的来源，采用命名为pBRTM/HCV1，覆盖全长HCV开放阅读框的质粒克隆入本发明的表达载体中。(Grakoui，等，J.Viol.，1993，67，1385-1395)此文公开内容全部纳入本文以供参考。另外，编码HCV的核酸序列可从基因文库(GenBank)的登录号X61596和D 16435来获得，其公开内容全部纳入本文。构建物pApO31-NS3，pApO31-NS4，pApO31-NS5是在***了工程化的起始和终止密码子以及限制性酶切位点后的PCR克隆，采用以下引物：对NS3：5’-GGTCTAGATT GATGGCGCCC ATCACGGC-3’(Xba I)(SEQ IDNO：3)，5’-CACACGCGTT CACGTGACGA CCTCCAGGT-3’(Mlu I)(SEQ ID NO：4)，对于NS4：5’GGTCTAGATG AGCACCTGGG TGCTC-3’(Xba I)(SEQ ID NO：5)，5’-CCAGGATCCT CAGCATGGAG TGGTACA-3’(BamH1)(SEQ ID NO：6)，以及对NS5：5’-TCAGTCTAGA ATGTCCGGCT CCGGCTCCTG GCTAAGGGA-3’(Xba I)(SEQ ID NO：7)，5’-AGCTACGCGT TCACCGGTTG GGGAGGAGGT-3’(Mlu I)(SEQ ID NO：8)。在使用高精度的PCR***(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)进行PCR扩增后，将cDNA片段***含有RSV增强子元件的质粒表达载体pApO31中，由CMV启动子(Apollon，Malvern，PA)驱动。使构建物在DH5α细胞中生长，而后质粒DNA用2x氯化铈离心或使用无内切酶的缓冲液***(Santa Clara，CA)的Qiagen Giga试剂盒纯化。非结构基因的***物的检验可用标准方法来进行序列分析。
要建立作为CTL试验的靶细胞的NS3，NS4，NS5的稳定表达细胞系，将非结构蛋白编码基因片段克隆入带有新霉素选择性标记的pcDNA3和pcDNA3.I Zeo(-)表达载体中(Invitrogen，San Diego)。首先，NS3和NS5的Xba I和Mlu I片段被亚克隆至Litmus-38载体(New，England Biolabs，MA)的Nhe I/Mlu I位点，然后用EcoR I和Sal I切开，分别重新连接入pcDNA3和pcDNA3.I Zeo(-)的EcoR I/Xho I多重克隆位点。含有NS4的Xba I和BamH1片段被重新连接入Litmus-20(New，England Biolabs)，用Kpn I和EcoR I再次切开，然后重新连入pcDNA3载体。质粒被命名为：pcDNA3-NS3，pcDNA3-NS4和pcDNA3.1/Zeo(1)-NS5。
该领域技术人员，若有编码任一HCV非结构蛋白的DNA顺序，就能设计引物来制备本发明的任一基因构建物。另外，可进行核苷酸碱基替代，而不影响引物的结合。另外，为了克隆或连接目的，可制备带有内切核酸酶限制性位点的引物，已为本领域熟练技术人员所知道。因此该领域熟练技术人员能通过设计适当的引物，并进行PCR扩增来制备本发明的基因构建物。将PCR产物连入一表达载体中。
包含HCV非结构蛋白的核苷酸编码序列的质粒如上所述，将各自含有的HCV非结构蛋白的核苷酸编码序列置于CMV启动子和RSV增强子元件的转录控制下。
实施例2：体外表达
测定此质粒构建物横跨基因***物的序列，分别在体外瞬时转染后的HuH-7细胞中，和稳定转染后的SP2/0靶细胞中确认蛋白质的表达。发现NS3为70，NS4为30，而NS5为125kD的蛋白条带在细胞内被表达，但未分泌入培养基。
对HuH-7人肝癌细胞系，通过磷酸钙方式以多种构建物瞬时转染，以评估HCV非结构蛋白的表达水平。简单的说，用35硫-甲硫氨酸和半胱氨酸以代谢法标记4小时后，以改良过的RIPA缓冲液(0.15M NaCl，1％NP-40，50mMTris，0.5％DOC和1％SDS)配制细胞裂解液。细胞裂解液先用马血清预澄清，然后，通过与多克隆抗血清WU 110(NS3)，W148/151(NS4)和WU 115(NS5)预温育过夜使之与琼脂糖凝胶A结合。(Grakoui，等，J.Virol.，1993，67，1385-1395，全部纳入本文以供参考)在用SDS-PAGE分离蛋白后，将电泳胶晾干，然后放射自显影。NS5蛋白表达亦可用蛋白印迹和用鼠单克隆抗体进行免疫荧光分析来确定(Biogenesis，Sandown，NH)。要产生表达NS3，NS4和NS5的稳定转染细胞系，用含有感兴趣的病毒基因***物的pcDNA3质粒电穿孔转染同系的BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0。将在G418选择下能生长的细胞用有限稀释(0.3细胞/孔)法克隆，并用上述的方法筛选。
pcD3和pcD3.1质粒分别含有新霉素或叶霉素(Zeomycin)抗性基因，被用来克隆HCV非结构基因和产生稳定的同系的靶细胞系。用这些构建物瞬时转染HuH-7细胞，并用β-半乳糖苷酶试验控制转化效率后，在无甲硫氨酸和胱氨酸的培养基中饥饿细胞30分钟，并用35硫-甲硫氨酸和胱氨酸标记4小时。用对非结构蛋白特异性的多克隆兔血清免疫沉淀细胞裂解物，使之被琼脂糖凝胶A珠捕获，用SDS-PAGE电泳，然后放射自显影分析。1，3，5泳道是模拟DNA转染的细胞，作为阴性对照(模拟)。2，4和6显示了约NS3 70，NS4 30，NS5 125kD的特异性条带。(7-10泳道)：SP2/0细胞被pcD3为基础的含有NS3，NS4和NS5的构建物转染，在抗生素选择后，将细胞经有限稀释(0.3细胞/孔)法克隆，扩增，用放射性标记或免疫沉淀对NS3分析，或如上所述用蛋白印迹法对NS5进行分析。第7和第9泳道代表作为阴性对照(SP2-19)的稳定表达HCV-核心蛋白的细胞中得到的细胞裂解液，，8和10泳道为NS3和NS5的特异表达。这些细胞被用作体外刺激和作为CTL试验的靶细胞。
实施例3：免疫方案
雌性BALB/c(h-2d)小鼠在标准无病原体条件下在麻省总医院(Massachusertts General Hospital)的动物设施中培养。小鼠从CharlesRiver实验室(Wilmington，MA)获得，在6至20周龄时用于体内研究。将总量为100μg的质粒DNA(以100μl的0.9％的氯化钠溶液配制)注射2和3次，在5个不同位点上注射入小鼠的股四头肌。每隔14天，在另一条腿上加强注射。作为所有免疫学实验的阳性对照，将5μg的配于完全弗氏佐剂(CFA)的重组NS3，NS4，和NS5非结构蛋白(Mikrogen，Munich)在第0日经腹膜注射入小鼠，并用等量的以0.05％的SDS配的蛋白在4周和8周后作加强注射。作为这些实验的阴性对照，使用空白质粒载体和重组的乙型肝炎病毒表面抗原(HbsAg)(Energix，Smith Kline Beecham，Philadelphia)。所有小鼠在最后一次免疫后10日后被处死。
实施例4：体液免疫应答的测定
用已建立的ELISA法测定每只免疫动物血清中的抗NS3，NS4和NS5的抗体水平。简单的说，用上述的重组蛋白包裹微量滴定板(Falcon，MicrotestIIIM Flexible Assay Plate)，4℃过夜。(0.5μg/孔)。20℃用胎牛血清封闭2小时后，在板中加入1∶50的鼠血清，20℃培养另一小时。用含有0.05％的Tween-20的磷酸缓冲液(PBS)洗涤4次后，加入1∶2000稀释度的，用辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体(Amersham，Arlington Heights，IL)。培养1小时后，洗涤滴定板，加入底物显色，在自动阅读机上读数。
三次免疫接种后，用ELISA试验在所有免疫动物中发现了针对所有3种非结构蛋白的特异性抗体反应。用模拟DNA(见图2A)免疫的小鼠中未检测到抗原特异性免疫应答。作为阳性对照，小鼠用与完全弗氏佐剂(CFA)结合的重组NS3，NS4和NS5非结构蛋白三次腹腔内接种后，如预料的，显示了强烈的体液免疫应答(数据未显示)。
图2A显示了对以DNA为基础的免疫产生的对NS3，NS4和NS5的体液免疫应答。用ELISA法(每组：n＝5)测定血清抗体水平。对照包括用BSA和模拟免疫小鼠的血清包裹的孔。作为阳性对照的小鼠用重组蛋白腹膜内免疫(数据未显示)。图2B显示在用特异性或非特异性的重组蛋白体外刺激3日后测定的T细胞增殖情况。细胞与H3-胸苷一起培育18小时然后收集。Δcpm用扣除背景活性(如：不加抗原培养)的方法测定。和1μg的重组NS3蛋白培育的细胞有毒性，因此未见增殖。用和CFA联合的重组蛋白免疫的小鼠有5到10倍的更强反应(数据未显示)。
实施例5：淋巴细胞增殖以及细胞因子释放分析
用异氟烷(Aerrane，Anaquest，NJ)麻醉小鼠，并收集脾细胞。用0.83％的NH4Cl/0.17M Tris pH7.4，25℃培养5分钟，以除去红细胞。脾细胞洗涤两次，用96孔圆底滴定板以每孔5×105细胞，200μl含有10％FBS和2-巯基乙醇的完全DMEM(极限必须培养基)(Mediatech，Washington，DC)-式3份培养。用重组非结构蛋白(NS3，NS4和NS5)(Mikrogen，Munich)在不同浓度下0，0.01，0.1和1μg/ml)刺激。作为阴性对照，用重组HCV-核心蛋白或HbsAg蛋白(Energix)在相同浓度下刺激效应细胞。在刺激3日后，加入3H-胸苷(1μgCi/孔)。再培养细胞18小时，收集后测定掺入DNA的3H-胸苷。掺入的放射活性用背景活性修正(Δcpm)。为检测细胞因子的释放，将效应细胞按上述培养，用商业试剂盒按照厂商说明(Endogen，Boston，MA)测定培养上清液中的IL-2，IL-4以及干扰素γ水平。
为了检查对非结构蛋白的细胞介导的免疫应答，收集脾细胞并用重组抗原或用体外稳定转染的细胞系表达的抗原再刺激。如用3H-胸苷掺入法所测定(见图2B)的那样，不同抗原浓度的所有非结构蛋白都诱导了实质性的淋巴细胞增殖。用重组蛋白腹膜免疫，作为产生最大刺激的方法，对所有三种蛋白产生了强至5到10倍的淋巴细胞增殖速率(数据未显示)。DNA为基础的免疫后测定的细胞因子分布图显示具有高水平y-干扰素(图2C)和IL-2(图2D)分泌入细胞培养基的T1应答。相反的，在用编码HCV非结构蛋白的基因进行基因免疫后，只检测到很少的IL-4产生(图2E)。
图2C，2D以及2E显示了体外刺激48小时后检测到的分泌入培养上清液中的细胞因子。编码NS3，NS4和NS5的DNA构建物诱导了TH1-型的细胞因子分布。为了比较，显示了用重组蛋白(n＝4)腹膜免疫小鼠三次的结果。作为阴性对照，用重组HbsAg免疫小鼠。
实施例6：细胞毒T-淋巴细胞活性
将免疫小鼠脾细胞以含有10％FCS和2-巯基乙醇的完全DMEM悬浮(5×10-5M)并在体外刺激5日后分析细胞毒活性。以5U/ml的浓度一次加入重组小鼠IL-2，将反应细胞(4×107)与2×106个经照射的(10,000rad)同系的稳定表达全长NS3或NS5蛋白(SP2/NS3-3，SP2/NS5-21)的SP2/0细胞共培养。5日后，收集细胞毒效应淋巴细胞群，用51Cr标记的SP2/NS3-3或SP2/NS5-21，在96孔圆底滴定板中进行4小时51Cr释放试验。亲代SP2/0或表达HCV核心蛋白的SP2-19被用作裂解液的抗原特异性和背景活性的对照。CTL活性试验以效应淋巴细胞对靶细胞(E∶T)分别为100∶1，30∶1，10∶1以及3∶1的比例进行。用含有杂交瘤上清液GK1.5(抗CD4，大鼠)；3.155(抗CD8，大鼠)的抗CD4+或CD8+单克隆抗体，在4℃，培育效应细胞30分钟，洗涤，然后37℃与补体(1∶5稀释度的低毒性兔补体(Cedarlane Laboratories，Ontario，Cananda))一起培育，进行T细胞缺损试验。
由于CTL应答是从感染细胞中消除病毒，因此用51Cr释放实验来分析免疫小鼠脾细胞裂解稳定转染并表达NS3和NS5蛋白的同系SP2/0小鼠骨髓瘤靶细胞的能力。体外刺激5日后，NS3和NS5免疫的小鼠显示了强而特异性的细胞毒T细胞应答，而对作为靶细胞特异性对照的SP2/0或SP2-19(稳定表达HCV核心蛋白)只观察到低活性(表3A和表3B)。为说明产生特异性裂解的细胞的表型，将脾细胞和CD8+或CD4+反应活性的单克隆抗体(mAbs)在补体存在下共培养，CD8+细胞介导的细胞毒活性见表3C。我们无法建立稳定表达NS4蛋白的SP2/0细胞系，因此对该HCV非结构蛋白未测量CTL活性。
图3显示了细胞毒T细胞(CTL)在不同的效应细胞对靶细胞的比例(100∶1，30∶1，10∶1，3∶1)的情况下对NS3(A)和NS5(B)的反应。脾细胞与被照射的稳定的NS3和NS5表达的小鼠骨髓瘤细胞在体外共培养5天(n＝5)。然后，进行4小时51Cr释放实验来测定对稳定转染的靶细胞系的CTL活性。扣除对SP2/0或SP2-19(表达HCV核心蛋白)的背景活性以揭示特异性裂解值。图3C显示了T细胞缺损实验(n＝3)，将细胞与抗CD8+或CD4+单克隆抗体一起在冰上培育30分钟，然后与补体37℃培育30分钟。对照细胞不和补体以及抗CD8+或抗CD4+的单克隆抗体一起培育。测定了作为非相关阴性对照细胞系，即稳定转染了HCV核心蛋白表达构建物的SP2-19细胞的背景活性。
实施例7：体内细胞毒T淋巴细胞活性的评估
CTL实验极难进行，因为直到现在也无人能够建立用于CTL活性测定的，表达非结构蛋白的稳定细胞系。将小鼠用模拟DNA或pApNS5载体肌肉(i.m.)免疫三次。一些动物还用重组NS5蛋白或两者的组合腹膜免疫。重组蛋白(5μg腹膜内注射)作为NS5-4(aa2622-2868)和NS5-12(aa2007-2268)的大肠杆菌表达蛋白(Mikogen，Munich，Germany)，涵盖了HCV-NS5a和HCV-NS5b部分区域(大约NS5全长的50％)的混合物提供。用多种质粒构建物或重组蛋白最后一次免疫的一周后，洗涤2×106的稳定表达NS5的同系SP2/0衍生细胞，在200μl的PBS中重悬浮，并作右侧皮下接种。SP2/0细胞表达HCV NS5(SP2/NS5-21)或HCV核心蛋白SP2/19。在这个动物模型中，在皮下接种15天后评价肿瘤形成，测定患肿瘤的动物数和肿瘤的重量。
只有40％的用模拟DNA免疫，并用表达NS5的小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/NS5-21)攻击的小鼠在15日后生成了肿瘤。另外，以肿瘤重量的测定来确定肿瘤的大小，与用模拟DNA或重组NS5蛋白免疫的小鼠，或用同样的表达不同的HCV结构蛋白(HCV核心蛋白)的，作为对照的同系SP2/0细胞系免疫的小鼠比较，肿瘤尺寸要小些(图4A和4B)。事实上，90-100％的用模拟DNA免疫，并用SP2-19细胞攻击的小鼠显示出肿瘤的形成，因此显示了在该小型动物模型中的CTL活性的特异性。强调用完全弗氏佐剂配的重组NS5蛋白来免疫不能保护动物避免形成肿瘤，这一点很重要。为了评估DNA为基础的免疫和重组蛋白疫苗联合的效果，用二者同时免疫一组动物，产生了防御存在对肿瘤形成的部分保护力，但这种方法不如用编码NS5蛋白的DNA免疫动物三次那样有效。
图4A显示用评价CTL活性的一种肿瘤模型获得的代表性结果。小鼠用pApNS5或模拟DNA(100μg)肌肉注射，或用重组NS5蛋白腹膜内注射(5μg)免疫三次。最后一组动物接受了联合DNA免疫和重组蛋白。用SP2NS5-21或SP2-10细胞进行肿瘤攻击15日后，长出肿瘤的小鼠的数量以及肿瘤的重量被测定。图4B，自左至右，显示了用模拟DNA免疫，并用SP2/NS5-21细胞攻击的动物；用pApNS5免疫，并用SP2/NS5-21攻击的动物；用pApNS5免疫，并用SP2-19(稳定表达HCV核心)攻击的动物；以及用重组NS5蛋白腹膜内注射三次，并用SP2/NS5-21细胞攻击的动物。在第一、三和第四组动物的右体侧上有大肿瘤形成，而第二组没有，它是用pApNS5免疫，并用稳定表达NS5的小鼠骨髓瘤细胞系攻击的。
                          序列表
<110>Wands，Jack R.
     Encke，Jens
<120>采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫
<130>mgh-0002
<140>未指定
<141>1999-01-28
<150>60/073,156
<151>1998-01-30
<160>8
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<220>
<223>人工序列的描述：合成序列
<400>1
gccgccatg                                                          9
<210>2
<211>341
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<220>
<223>人工序列的描述：合成序列
<400>2
gccagccccc gattgggggc gacactccac catagatcac tcccctgtga ggaactactg  60
tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag cctccaggac 120
cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag 180
gacgaccggg tcctttcttg gatcaacccg ctcaatgcct ggagatttgg gcgtgccccc 240
gcgagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg 300
gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac c                     341
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<220>
<223>人工序列的描述：合成序列
<400>3
ggtctagatt gatggcgccc atcacggc                                    28
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<220>
<223>人工序列的描述：合成序列
<400>4
cacacgcgtt cacgtgacga cctccaggt                                   29
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<220>
<223>人工序列的描述：合成序列
<400>5
ggtctagatg agcacctggg tgctc                                       25
<210>6
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<220>
<223>人工序列的描述：合成序列
<400>6
ccaggatcct cagcatggag tggtaca                                        27
<210>7
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<220>
<223>人工序列的描述：合成序列
<400>7
tcagtctaga atgtccggct ccggctcctg gctaaggga                           39
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<220>
<223>人工序列的描述：合成序列
<400>8
agctacgcgt tcaccggttg gggaggaggt                                     30

Claims (19)

1.一种重组核酸分子，其特征在于，它包含编码丙型肝炎非结构蛋白NS3的核苷酸序列，其中所述重组核酸不编码NS2蛋白。
2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列和人类细胞中有功能性的调控元件可操作性相连，所述有功能性的调控元件选自启动子、增强子、聚腺苷酸序列以及任选的丙型肝炎病毒5’UTR。
3.如权利要求2所述的重组核酸分子，其特征在于，所述启动子是巨细胞病毒启动子，所述增强子是Rous肉瘤病毒增强子。
4.一种包含权利要求1中所述核酸分子的重组宿主细胞。
5.一种药物组合物，其特征在于，包含：
a)如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列和人类细胞中功能性的调控元件可操作性相连，所述有功能性的调控元件选自启动子、增强子、聚腺苷酸序列以及任选的丙型肝炎病毒5’UTR；以及
b)药物接受载体或稀释剂。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述启动子是巨细胞病毒启动子，所述增强子是Rous肉瘤病毒增强子。
7.如权利要求5所述的药物组合物，它还包含促进剂。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述促进剂是丁哌卡因。
9.权利要求1所述的重组核酸分子的用途，用于制备在未感染丙型肝炎病毒的人体中诱导对丙型肝炎病毒的免疫应答的药物。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述免疫应答包括细胞应答。
11.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述免疫应答包括体液应答。
12.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述重组核酸分子存在于包含有药物接受载体或稀释剂的药物组合物里。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述药物组合物还包含促进剂。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述促进剂是丁哌卡因。
15.权利要求5所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备对丙型肝炎病毒易感的人免疫的药物。
16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，在给予所述药物组合物的部位给予丁哌卡因。
17.权利要求1所述的重组核酸分子的用途，其特征在于，用于制备对丙型肝炎病毒易感的人免疫的药物。
18.权利要求5所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备治疗丙型肝炎病毒感染的药物。
19.如权利要求18所述用途，其特征在于，在给予所述药物组合物的部位给予所述人丁哌卡因。
CNB998024813A 1998-01-30 1999-01-28 采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫 Expired - Fee Related CN100335637C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7315698P 1998-01-30 1998-01-30
US60/073,156 1998-01-30

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007101398938A Division CN101126095A (zh) 1998-01-30 1999-01-28 采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫
CNA2007101384653A Division CN101126094A (zh) 1998-01-30 1999-01-28 采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1289339A CN1289339A (zh) 2001-03-28
CN100335637C true CN100335637C (zh) 2007-09-05

Family

ID=22112053

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007101398938A Pending CN101126095A (zh) 1998-01-30 1999-01-28 采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫
CNB998024813A Expired - Fee Related CN100335637C (zh) 1998-01-30 1999-01-28 采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫
CNA2007101384653A Pending CN101126094A (zh) 1998-01-30 1999-01-28 采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007101398938A Pending CN101126095A (zh) 1998-01-30 1999-01-28 采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007101384653A Pending CN101126094A (zh) 1998-01-30 1999-01-28 采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP1056762A4 (zh)
JP (1) JP2002501737A (zh)
KR (2) KR20060057653A (zh)
CN (3) CN101126095A (zh)
AU (1) AU746258B2 (zh)
BR (1) BR9908540A (zh)
CA (1) CA2318744A1 (zh)
IL (1) IL137458A0 (zh)
WO (1) WO1999038880A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001030812A2 (en) * 1999-10-27 2001-05-03 Chiron Corporation Activation of hcv-specific t cells
CA2390082C (en) * 1999-11-24 2010-06-29 Chiron Corporation Novel hcv non-structural polypeptide
US6986892B1 (en) 1999-11-24 2006-01-17 Chiron Corporation Immunogenic Hepatitis C virus non-structural polypeptides
AU2002337840B2 (en) 2001-10-11 2007-08-09 Msd Italia S.R.L. Hepatitis C virus vaccine
FR2855758B1 (fr) 2003-06-05 2005-07-22 Biomerieux Sa Composition comprenant la polyproteine ns3/ns4 et le polypeptide ns5b du vhc, vecteurs d'expression incluant les sequences nucleiques correspondantes et leur utilisation en therapeutique
KR101913674B1 (ko) * 2011-10-24 2018-10-31 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 개선된 hcv 백신 및 이것을 사용하는 방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5371017A (en) * 1990-04-04 1994-12-06 Chiron Corporation Hepatitis C virus protease
WO1996037606A1 (en) * 1995-05-22 1996-11-28 Bionova Corporation Compositions and methods for the diagnosis of, and vaccination against, hepatitis c virus (hcv)
US5593972A (en) * 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
WO1997047358A1 (en) * 1996-06-11 1997-12-18 Merck & Co., Inc. Synthetic hepatitis c genes

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69434469T2 (de) * 1993-01-26 2006-06-14 Univ Pennsylvania Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von genetischem material
DE69734776T2 (de) * 1996-05-24 2006-08-17 Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville Fusionsprotein mit multiplen Epitopen
CA2312484A1 (en) * 1997-12-11 1999-06-17 Smithkline Beecham Corporation Hepatitis c virus ns5b truncated protein and methods thereof to identify antiviral compounds

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5371017A (en) * 1990-04-04 1994-12-06 Chiron Corporation Hepatitis C virus protease
US5593972A (en) * 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
WO1996037606A1 (en) * 1995-05-22 1996-11-28 Bionova Corporation Compositions and methods for the diagnosis of, and vaccination against, hepatitis c virus (hcv)
WO1997047358A1 (en) * 1996-06-11 1997-12-18 Merck & Co., Inc. Synthetic hepatitis c genes

Also Published As

Publication number Publication date
EP1056762A4 (en) 2003-07-23
IL137458A0 (en) 2001-07-24
WO1999038880A1 (en) 1999-08-05
BR9908540A (pt) 2000-11-28
CN101126095A (zh) 2008-02-20
KR20010086226A (ko) 2001-09-10
CA2318744A1 (en) 1999-08-05
KR20060057653A (ko) 2006-05-26
AU2478699A (en) 1999-08-16
EP1056762A1 (en) 2000-12-06
CN1289339A (zh) 2001-03-28
CN101126094A (zh) 2008-02-20
JP2002501737A (ja) 2002-01-22
AU746258B2 (en) 2002-04-18
KR100628411B1 (ko) 2006-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU746965B2 (en) Cloned genomes of infectious hepatitis C viruses and uses thereof
US7989425B2 (en) Vaccine enhancing the protective immunity to hepatitis c virus using plasmid DNA and recombinant adenovirus
CN1446102A (zh) 模仿天然病毒感染并诱导对病原体的持久免疫力的遗传疫苗
US20150252084A1 (en) Compositions and methods that enhance an immune response
US20070141668A1 (en) Cloned genome of infectious hepatitis C virus of genotype 2A and uses thereof
CN100335637C (zh) 采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫
Park et al. Codelivery of IL-7 augments multigenic HCV DNA vaccine-induced antibody as well as broad T cell responses in cynomolgus monkeys
Torresi et al. Neutralising antibody, CTL and dendritic cell responses to hepatitis C virus: a preventative vaccine strategy
Leroux-Roels Development of prophylactic and therapeutic vaccines against hepatitis C virus
US20070032444A1 (en) Genetic immunization with nonstructural proteins of hepatitis C virus
CN1717416A (zh) 丙型肝炎病毒非结构蛋白4a(ns4a)是增强子元件
EP0789563B1 (en) Hepatitis virus b and c vaccines
CN1241644C (zh) 被dna和抗原组合增效的疫苗制剂
KR100902817B1 (ko) 플라스미드 ｄｎａ 및 재조합 아데노 바이러스를 이용한ｃ형 간염 바이러스에 대한 방어면역력을 증진시키는 백신
CN1249240C (zh) 表达载体pBVTB及其构建方法和在HCV疫苗研究中的应用
CN1809584A (zh) 含有阳离子微粒和hcv e1e2 dna的组合物及其使用方法
Kang et al. Synthetic antigens representing the antigenic variation of human hepatitis C virus
US20160215023A1 (en) Simple vaccines from dna launched suicidal flaviviruses
Frelin Development of vaccines and experimental models for chronic infections caused by the hepatitis C virus
CN1365286A (zh) 治疗慢性乙型肝炎病毒感染的方法
Inchauspé Gene vaccination for hepatitis C
JP2008508890A6 (ja) 組換え生鶏痘ウィルスベクター及びｃ型肝炎ウィルスに対する薬剤組成物中でのそれらの使用
JP2008508890A (ja) 組換え生鶏痘ウィルスベクター及びｃ型肝炎ウィルスに対する薬剤組成物中でのそれらの使用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20070905

Termination date: 20100128