JP2004073212A - C型肝炎ウイルスプロテアーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
(関連出願に関する参照事項)
本願は、1990年4月4日出願の米国特許出願第07/505,433号の一部継続出願である。
本願は、1990年4月4日出願の米国特許出願第07/505,433号の一部継続出願である。
(技術分野)
本発明は分子生物学およびC型肝炎ウイルス(HCV)のウイルス学に関する。より詳しくは、本発明は、HCVによって生成される新規のプロテアーゼ、発現方法、組換えプロテアーゼ、プロテアーゼ変異体、およびHCVプロテアーゼのインヒビターに関する。
本発明は分子生物学およびC型肝炎ウイルス(HCV)のウイルス学に関する。より詳しくは、本発明は、HCVによって生成される新規のプロテアーゼ、発現方法、組換えプロテアーゼ、プロテアーゼ変異体、およびHCVプロテアーゼのインヒビターに関する。
(発明の背景)
非A・非B型肝炎(NANBH)は、ウイルスにより誘発されると考えられている伝染性疾病(あるいは疾病フ7ミリー)であり、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、デルタ肝炎ウイルス(HDV)、サイトメガロウイルス(CMV)あるいはエブスタイン−バーウイルス(EBV)などによって引き起こされるようなその他の形態のウイルス関連肝臓疾患と区別される。疫学的証拠によって、NANBHには、飲料水媒介伝染型;血液または注射針関連型;および単独発生(地域獲得)型の3種類があると考えられる。しかし、病原因子の数は未知である。しかし、最近になって、新規のウイルス種であるC型肝炎ウイルス(HCV)が血液関連型NANBH(BB−NANBH)の(唯一ではないにしろ)主要な要因であると見いだされている。例えば、PCT出願第WO89/046699号:1989年12月21日出願の米国特許出願第7/456,637号;および1989年12月21日出願の米国特許出願第7/456,637号を参照のこと。これらは参考のために本明細書に援用する。C型肝炎は、合衆国および日本を含む多くの国において、輸血に伴う肝炎の主要形態であると思われる。また、HCVが肝細胞癌の誘発に関係しているという証拠もある。従って、HCV感染の効果的な治療方法が望まれているが、現在のところそれは存在しない。
非A・非B型肝炎(NANBH)は、ウイルスにより誘発されると考えられている伝染性疾病(あるいは疾病フ7ミリー)であり、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、デルタ肝炎ウイルス(HDV)、サイトメガロウイルス(CMV)あるいはエブスタイン−バーウイルス(EBV)などによって引き起こされるようなその他の形態のウイルス関連肝臓疾患と区別される。疫学的証拠によって、NANBHには、飲料水媒介伝染型;血液または注射針関連型;および単独発生(地域獲得)型の3種類があると考えられる。しかし、病原因子の数は未知である。しかし、最近になって、新規のウイルス種であるC型肝炎ウイルス(HCV)が血液関連型NANBH(BB−NANBH)の(唯一ではないにしろ)主要な要因であると見いだされている。例えば、PCT出願第WO89/046699号:1989年12月21日出願の米国特許出願第7/456,637号;および1989年12月21日出願の米国特許出願第7/456,637号を参照のこと。これらは参考のために本明細書に援用する。C型肝炎は、合衆国および日本を含む多くの国において、輸血に伴う肝炎の主要形態であると思われる。また、HCVが肝細胞癌の誘発に関係しているという証拠もある。従って、HCV感染の効果的な治療方法が望まれているが、現在のところそれは存在しない。
アデノウイルス、バキュロウイルス、コモウイルス、ピコルナウイルス、レトロウイルスおよびトガウイルスを含む多くのウイルスが、ポリペプチドをその当所の翻訳された形態から成熟した活性タンパク質へとプロセシングするための、特異的な、ウイルスにコードされたプロテアーゼに依存している。ピコルナウイルスの場合には、全てのウイルスタンパク質が単一のポリタンパク質の開裂から生じると考えられている(B.D.Korant,CRC Crit Rev Biotech(1988)8:149−57)。
S.Pichuantesらは、「Viral Proteinases As Targets For Chemotherapy」(Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989)pp.215−22において、HIV−1で見られるウイルスプロテアーゼの発現を開示している。このHIVプロテアーゼは、HIVプロテアーゼ前駆体をコードするDNAを、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ(hSOD)をコードするDNAに融合させ、その生成物をE.coliで発現させることによって、融合タンパク質の形態で得られた。形質転換された細胞は、36および10kDaの生成物(hSODプロテアーゼ融合タンパク質およびプロテアーゼのみに対応)を発現したが、これはこのプロテアーゼが自己触媒作用によるタンパク質分解が可能な形態で発現したことを示している。
T.J.McQuadeらは、Science(1990)247:454−56に、特異的にHIV−1プロテアーゼを阻害できる模擬ペプチドの調製を開示した。HIVにおいては、プロテアーゼは当初のp55 gag前駆体転写物の、コア構造タンバク質(p17、p24、p8およびp7)への開裂に関与していると考えられている。1μMのインヒビターを培養中のHIV感染末梢血リンパ球に加えると、プロセシングされたHIV p24の濃度が約70%減少した。ウイルス成熟および感染ウイルスのレベルは、プロテアーゼインヒビターによって減少した。
(発明の開示)
我々は、組換えHCVプロテアーゼ、HCVプロテアーゼ融合タンパク質、切り形および改変されたHCVプロテアーゼ、クローニングおよびそのための発現ベクター、およびHCV治療に効果的な抗ウイルス剤を同定する方法を発明した。
我々は、組換えHCVプロテアーゼ、HCVプロテアーゼ融合タンパク質、切り形および改変されたHCVプロテアーゼ、クローニングおよびそのための発現ベクター、およびHCV治療に効果的な抗ウイルス剤を同定する方法を発明した。
本発明は、C型肝炎ウイルスに由来する、精製されたタンパク質分解ポリペプチドを含有する組成物を包含する。
1つの実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドが、実質的に下記のような部分的内部配列:
であり得る組成物を提供する。
別の実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドが、実質的に下記のような部分的内部配列:
であり得る組成物を提供する。
なお別の実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドが、実質的に以下の部分的内部配列
を有し得る組成物を提供する:
さらに別の実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドが、実質的に図1に示すアミノ酸配列を有し得る組成物を提供する。
さらに別の実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドが、実質的に図1に示すアミノ酸配列を有し得る組成物を提供する。
本発明は、C型肝炎ウイルスに由来するタンパク質分解ポリペプチドと融合された、適切な融合パートナーを含有する融合タンパク質を包含する。
1つの実施形態において、本発明は、上記融合パートナーがヒトスーパーオキシドジスムターゼを含有する融合タンパク質を提供する。
別の実施形態において、本発明は、上記タンパク質分解ポリペプチドが、実質的に下記のような部分的内部配列:
を有し得る融合タンパク質を提供する。
なお別の実施形態において、本発明は、上記タンパク質分解ポリペプチドが、実質的に下記のような部分的内部配列:
を有する融合タンパク質を提供する。
さらに別の実施形態において、本発明は、上記タンパク質分解ポリペプチドが、以下の配列:
を部分的内部配列として有し得る融合タンパク質を提供する。
なお別の実施形態において、上記融合パートナーがユビキチンである融合タンパク質を提供する。
本発明は、HCVプロテアーゼまたは活性HCVプロテアーゼアナログのみをコードするポリヌクレオチドを含有する組成物を包含する。
1つの実施形態において、本発明は、上記ポリヌクレオチドが図1のHCVプロテアーゼをコードする組成物を提供する。
本発明は、HCVプロテアーゼまたはHCVプロテアーゼアナログ、および融合パートナーを含有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する組成物を包含する。
1つの実施形態において、本発明は、上記融合パートナーが、hSOD、酵母α−因子、IL−2S、ユビキチン、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびウレアーゼからなる群より選択される組成物を提供する。
別の実施形態において、本発明は、上記HCVプロテアーゼまたはHCVプロテアーゼアナログが、実質的に以下の配列:
を有するポリペプチドを含有する組成物を提供する。
さらに別の実施形態において、本発明は、上記HCVプロテアーゼまたはアナログが、以下の配列:
を有するポリペプチドを含有する組成物を提供する。
なお別の実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドが以下の配列:
を有する組成物を提供する。
本発明は、C型肝炎ウイルスに対する化合物の活性をアッセイする方法を包含し、この方法は、活性なC型肝炎ウイルスプロテアーゼを提供する工程;このプロテアーゼを、セリンプロテアーゼ活性を阻害することができる化合物と接触させる工程;およびこのC型肝炎ウイルスプロテアーゼのタンパク質分解活性阻害を測定する工程を包含し得る。
本発明は、HCVプロテアーゼまたはHCVプロテアーゼアナログを宿主細胞内で産生するための発現ベクターを包含し、このベクターは、HCVプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能なように連結されたこの宿主細胞内で機能する転写および翻訳制御配列;および選択可能なマーカーを含有する。
1つの実施形態において、本発明は、発現の際に融合タンパク質を形成するために、上記HCVプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される融合パートナーをコードする配列をさらに含有するベクターを提要する。
別の実施形態において、本発明は、上記融合パートナーが、hSOD、酵母α−因子、IL−2S、ユビキチン、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびウレアーゼからなる群より選択されるベクターを提供する。
なお別の実施形態において、上記融合パートナーが、ユビキチン、hSODおよび酵母α−因子からなる群より選択されるベクターを提供する。
さらに別の実施形態において、本発明は、上記HCVプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドが実質的に以下の配列:
を有するポリペプチドをコードするベクターを提供する。
なおさらに別の実施形態において、本発明は、上記HCVプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドが、実質的に以下の配列:
を有するポリペプチドをコードするベクターを提供する。
なおさらに別の実施形態において、本発明は、上記HCVプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドが、実質的に以下の配列:
を有するポリペプチドをコードするベクターを提供する。
本願発明により、C型肝炎ウイルスにおいてポリタンパク質をプロセシングするのに必要なプロテアーゼの同定、クローニング、および発現がもたらされる。プロテアーゼ、切り形プロテアーゼおよび改変プロテアーゼもまたもたらされ、特定のポリペプチドの開裂、およびHCVに特異的な抗ウイルス剤のアッセイおよび設計に有用である。
(発明を実施する方法)
(A.定義)
「C型肝炎ウイルス」および「HCV」という用語は、BB−NANBHの主要な病原因子であるウイルス種のことであり、そのプロトタイプ単離物はPCT第WO89/046699号;EPO公開第318,216号;1989年5月18日出願のUSSN第7/355,008号;およびUSSN第7/456,637号に同定されており、それらの開示を本明細書に参考のために援用する。本明細書で用いられる「HCV」は、C型肝炎を引き起こし得る病原性菌株、および弱毒菌株またはそれに由来する欠陥干渉性粒子をも包含する。HCVゲノムはRNAから成る。RNA含有ウイルスは、取り込まれたヌクレオチドあたり10-3から10-4のオーダーと報告されているように、自然突然変異の速度が比較的速いということが知られている(FieldsおよびKnipe,「Fundamental Virology」(1986,Raven Press,N.Y.))。遺伝子型の不均一性および流動性は、RNAウイルスに固有の特性であるため、HCV種には多数の菌株/単離物があり、これらは毒性でも非毒性でもあり得る。
(A.定義)
「C型肝炎ウイルス」および「HCV」という用語は、BB−NANBHの主要な病原因子であるウイルス種のことであり、そのプロトタイプ単離物はPCT第WO89/046699号;EPO公開第318,216号;1989年5月18日出願のUSSN第7/355,008号;およびUSSN第7/456,637号に同定されており、それらの開示を本明細書に参考のために援用する。本明細書で用いられる「HCV」は、C型肝炎を引き起こし得る病原性菌株、および弱毒菌株またはそれに由来する欠陥干渉性粒子をも包含する。HCVゲノムはRNAから成る。RNA含有ウイルスは、取り込まれたヌクレオチドあたり10-3から10-4のオーダーと報告されているように、自然突然変異の速度が比較的速いということが知られている(FieldsおよびKnipe,「Fundamental Virology」(1986,Raven Press,N.Y.))。遺伝子型の不均一性および流動性は、RNAウイルスに固有の特性であるため、HCV種には多数の菌株/単離物があり、これらは毒性でも非毒性でもあり得る。
様々な異なるHCVの菌株/単離物、特にCDC/HCV1(HCV1とも呼ばれる)菌株または単離物に関する情報を本明細書に開示する。部分ゲノム配列などの、1つの菌株または単離物からの情報は、当業者が標準的な技術を用いて、新たな菌株/単離物を単離し、このような新たな菌株/単離物がHCVであるか否かを同定するのに十分なものである。例えば、様々な菌株/単離物を以下に説明する。これらの菌株は、多くのヒト血清から(そして様々な地理的領域から)得られたものであり、HCV1のゲノム配列から得た惰報を用いて単離された。
本明細書に提供される情報によって、HCVがフラビウイルスの遠縁にあたることが示される。フラビウイルスファミリーには、ヒトの病原体となる小さくてエンベロープを有する多くのウイルスが含まれる。フラビウイルス粒子の形態学および構成は公知であり、M.A.Brinton著「The Viruses:The Togaviridae And F1aviviridae(シリーズ編集、Fraenkel−ConratおよびWagner、本巻編集、SchlesingerおよびSchlesinger,Plenum Press,1986).pp.327−374で論じられている。一般に、形態学に関しては、フラビウイルスは脂質二重層によって囲まれた中心ヌクレオカプシドを含有している。ビリオンは球形であり、約40〜50nmの直径を有している。そのコアの直径は約25〜30nmである。ビリオンのエンベロープの外表面に沿って、長さ約5〜10nmで直径約2nmの末端瘤を有する突起物がある。このファミリーの典型的な例としては、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、およびデング熱ウイルスが挙げられる。これらは、HCVよりわずかに大きく、約3500のアミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする正鎖のRNAゲノム(約11,000のヌクレオチド)を有している。個々のウイルスタンパク質はこの前駆体ポリペプチドから開裂する。
HCVのゲノムは、約10,000のヌクレオチドを有する一本鎖RNAであると思われる。このゲノムは正鎖であり、約3,000個のアミノ酸のポリタンパク質をコードする連続的翻訳オープンリーディングフレイム(ORF)を有している。このORFにおいて、構造タンパク質は、N末端領域の最初の4分の1にコードされており、主たるポリタンパク質は非構造タンパク質に当てられている。すべての既知のウイルス配列と比較すると、小さいが重要な共直線性の相同性が、フラビウイルスファミリーの非構造タンパク質およびペスチウイルス(現在ではフラビウイルスファミリーの一部であると考えられている)との間に見られる。
(例として黄熱病ウイルスを用いた)フラビウイルスポリタンバク質と、HCVゲノムの主要なORFにコードされた推定ポリタンパク質の、可能な領域の記号化した配列を図1に示す。HCVポリタンパク質の可能なドメインを図に示す。黄熱病ウイルスポリタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて、ヌクレオカプシドタンパク質(C)、マトリックスタンパク質(M)、エンベロープタンパク質(E)、および非構造タンパク質1、2(a+b)、3、4(a+b)および5(NS1、NS2、NS3、NS4およびNS5)を含有している。HCV1のヌクレオチド配列にコードされた推定アミノ酸に基づいて、HCVポリタンパク質のN末端の一番端の小さなドメインは、サイズにおいても塩基性残基の含有率が高いことにおいても、フラビウイルスポリタンパク質のN末端に見られるヌクレオカプシドタンパク質(C)に類似しているように思われる。アミノ酸配列は分岐するが、HCVおよび黄熟病ウイルス(YFV)の非構造タンパク質2、3、4および5(NS2−5)は、同様のサイズおよびハイドロパシシティの等価物を有していると思われる。しかし、M、EおよびNS1タンパク質を含有するYFVポリタンパク質の領域に対応するHCVの領域は、配列が異なるのみならず、サイズおよびハイドロパシシティにおいてもかなり異なっているように思われる。従って、HCVゲノムの或ドメインは、本明細書では、例えばNS1またはNS2として言及され得るが、これらの名称は参照の便を図るためのものにすぎず、HCVファミリーとフラビウイルスとの問には、はっきりと認識すべき、かなりの差があり得ることを理解されたい。
HCVの菌株または単離物の進化的関係によって、推定HCV菌株および単離物はポリペプチドのレベルでその相同性によって同定され得る。本明細書に開示される単離物に関しては、新たなHCV菌株または単離物は、少なくとも約40%、いくつかは約70%以上、さらにいくつかは約80%以上相同であることが予測される。いくつかは、ポリペプチドのレベルで約90%以上相同であり得る。アミノ酸配列の相同性を判断する技術は当該分野で公知である。例えば、アミノ酸配列は直接決定され、本明細書に提供される配列と比較され得る。あるいは、推定HCVのゲノム物質のヌクレオチド配列は、(通常はcDNA中間体を介して)決定され得、そこでコードされるアミノ酸配列を決定し、対応する領域を比較することができる。
「HCVプロテアーゼ」という用語は、タンパク質分解活性を示すHCV由来の酵素、特にHCVゲノムのNS3ドメインにコードされているポリペブチドのことである。少なくとも1つのHCVの菌株は、実質的に以下の配列によって、または以下の配列内にコードされていると考えられるプロテアーゼを含有している:
上記NおよびC末端は推定であり、実際の末端は、全NS3ドメインをコードするDNA構築物の適切な宿主内での発現およびプロセシングにより明示される。HCVのようなRNAウイルスは広範囲の多様性を示すことが知られているため、この配列は菌株によって改変すると考えられている。さらに、プロテアーゼは前駆体ポリタンパク質から開裂するため、実際のNおよびC末端は変動し得る:プロテアーゼアミノ酸配列が変動すると、様々な点でのポリタンパク質からの開裂が起こる。従って、アミノ末端およびカルボキシ末端は、HCVの菌株によって異なり得る。上記の最初のアミノ酸は、図1の残基60に対応する。しかし、活性に必要な最小配列は、通常の方法によって決定され得る。この配列は、(コーディング配列の5’または3’末端での開裂の後)あらゆる所望の数の塩基対を除去するためにエキソヌクレアーゼを用いて、適切な発現ベクターを処理することにより、その両端を切断し得る。その後、得られるコーディングポリヌクレオチドが発現され、配列が決定される。このように、得られる生成物の活性は、アミノ酸配列と相関し得る。(徐々により多くの数の塩基対を除去していく)そのような限定された一連の実験は、プロテアーゼ活性に必要な最低限の内部配列を決定する。この配列は、特にカルボキシ末端で実質的に切断され、明らかに十分にプロテアーゼ活性を保持し得ることを我々は見いだした。カルボキシ末端におけるタンパク質の一部がヘリカーゼ活性を示し得ると現在考えられている。しかし、ヘリカーゼ活性は、本発明のHCVプロテアーゼには必要ではない。アミノ末端もまた、プロテアーゼ活性を失うことなくある程度切断され得る。
上記で下線を施したアミノ酸は、推定フラビウイルスのセリンプロテアーゼに対する配列の相同性に基づいて、触媒活性に必要な残基であると考えられている。表1は、HCVプロテアーゼおよび黄熱病ウイルス、西ナイル熱ウイルス、マリーバレー熱ウイルスおよびクンジン(Kunjin)ウイルスから得られるプロテアーゼの3つのセリンプロテアーゼ触媒作用残基の配列を示している。その他の4つのフラビウイルスプロテアーゼ配列は、HCVに対してより、互いに対してより高い相同性を示すが、HCVともある程度の相同性が見られる。しかし、この相同性は、現在得られる配列ソフトウェアによって示すには十分ではない。示されたアミノ酸には、上記の配列において、His79、Asp103およびSer161(図1におけるHis139、Arg163およびSer221)の番号が付されている。
あるいは、構造的相同性に基づいて触媒作用残基配列を作ることも可能である。表2は、構造的研究に基づく、いくつかのよい特性を有するセリンプロテアーゼ:Streptomyces griseusからのプロテアーゼA、α−位分解プロテアーゼ、ウシトリプシン、キモトリプシン、およびエラスターゼの触媒部位に対してのHCVの配列を示す(H.Jamesら、Can J Biochem(1978)56:396)。ここでも、ある程度の相同性が見られる。同定されるHCV残基は、上記配列においてHis79、Asp125、およびSer161の番号が付されている。
活性部位に必須の残基を立証する最も直接的な方法は、各残基をそれぞれステアリンと同等のサイズの残基と置き替えることである。これは、部位特異的変異誘発および当該分野で公知の同様の方法によって、容易に行われ得る。特定の残基を等量寸法の残基と置き替えると活性が失われる場合は、置き替えられた残基の本質的性質が確認される。
「HCVプロテアーゼアナログ」とは、天然プロテアーゼのアミノ酸配列の欠失、改変および/または付加によって全長プロテアーゼ配列から改変しているポリペプチドのことである。HCVプロテアーゼアナログには、上記の切り形プロテアーゼ、およびHCVプロテアーゼ変異タンパク質およびHCVプロテアーゼ、切り形プロテアーゼまたはプロテアーゼ変異タンパク質を含有する融合タンパク質が含まれる。HCVプロテアーゼ変異タンパク質を形成するための改変は、同類アミノ酸置換であることが好ましく、その際アミノ酸は同様の特性を有するその他の天然発生アミノ酸と置換される。例えば、以下の置換が「同類」と考えられる:
非同類的な改変は、一般に、上記のアミノ酸の1つを異なる群からのアミノ酸へ置換することであり(例えば、AsnをGluに置換する)、あるいはCys、Met、HisまたはProを上記のアミノ酸のいずれかと置換することである。天然のアミノ酸を含む置換は、所望のタンパク質をコードする発現ベクターの部位特異的変異誘発によって好ましく行われ、改変された形態の発現が得られる。また、合成または半合成方法によってアミノ酸を改変させることも可能である。例えば、単離されたタンパク質を適切に化学的処理することによって、システインまたはセリン残基をセレノシステインに変換することができる。または、標準的なインビトロのタンパク質合成方法によって、非天然のアミノ酸を組み込むこともできる。一般的には、変異タンパク質の天然配列に対し行われる改変、欠失あるいは付加される残基の合計数は、約20を越えない、あるいは約10を越えないことが好ましく、約5を越えないことが最も好ましい。
一般に、融合タンパク質とは、2つ以上の個別のタンパク質から引き出されたアミノ酸配列を含有するポリペプチドのことである。本発明では、「融合タンパク質」とは、HCVプロテアーゼ、切り形、変異タンパク質またはそれらの機能部分を含有し、非HCVタンパク質またはポリペプチド(「融合パートナー」)に融合したポリペプチドの意味で用いられる。融合タンパク質は、融合遺伝子の発現によって生成することが最も便利であり、この融合遺伝子は、1つのポリペプチドの5’末端部分と、異なるポリペプチドの3’末端部分をコードし、その異なる部分同志は結合されて適切な宿主において発現し得る1つのリーディングフレイムとなる。現在では、HCVプロテアーゼまたはアナログを融合タンパク質のカルボキシ末端に位置させ、機能酵素のフラグメントをアミノ末端に用いることが(必要とされているわけではないが)好ましい。HCVプロテアーゼは通常大きなポリタンパク質内に発現するため、細胞輸送シグナル(例えば輸出または分泌シグナル)を含むことは期待できない。適切な機能酵素フラグメントは、HCVプロテアーゼと融合して発現される時に定量可能な活性を示すポリペプチドである。例としての酵素には、β−ガラクトシダーゼ(β−gal)、β−ラクタマーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、グルコースオキシダーゼ(GO)、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ(hSOD)、ウレアーゼなどが制限なしに挙げられる。生成される融合タンパク質の量が簡単な比色分析によって定量できるため、これらの酵素は便利である。または、融合パートナーに特異的な抗体を用いて、融合タンパク質を簡単に検出および定量するために、抗原タンパク質またはフラグメントを用いることもできる。現在好ましい融合パートナーはhSODである。
(B.一般的な方法)
本発明を実施するにあたっては、一般に、分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来技術を用い、これらは当該分野の技術範囲内のものである。このような技術は文献に詳細に説明されている。例えば、J.Sambrookら、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1989):「DNA Cloning」,Vol.I and
II(D.N Glover編 1985);「Oligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait編 1984);「Nucleic Acid Hybridization」(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編 1984):「Transcription And
Translation」(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編 1984):「Animal Cell Culture」(R.I.Freshney編 1986);「Immobilized Cel1s And
Enzymes」(IRL Press,1986);B.Perbal,「A Practical Guide To Molecular Cloning」(1984);「Methods In Enzymology」のシリーズ(Academic Press,Inc.);「Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells」(J.H.MillerおよびM.P.Calos編 1987,Cold Spring
Harbor Laboratory);Meth Enzymol(1987)154および155(それぞれWuおよびGrossman編,Wu編);MayerおよびWalker編(1987),「Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology」(Academic Press,London);Scopes,「Protein Purification:Principles And Practice」,第2版(Springer−Verlag,N.Y.,1987);および「Handbook Of Experimental Immunology」,volumes I−IV(WeirおよびBlackwell編 1986)などを参照のこと。
本発明を実施するにあたっては、一般に、分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来技術を用い、これらは当該分野の技術範囲内のものである。このような技術は文献に詳細に説明されている。例えば、J.Sambrookら、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1989):「DNA Cloning」,Vol.I and
II(D.N Glover編 1985);「Oligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait編 1984);「Nucleic Acid Hybridization」(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編 1984):「Transcription And
Translation」(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編 1984):「Animal Cell Culture」(R.I.Freshney編 1986);「Immobilized Cel1s And
Enzymes」(IRL Press,1986);B.Perbal,「A Practical Guide To Molecular Cloning」(1984);「Methods In Enzymology」のシリーズ(Academic Press,Inc.);「Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells」(J.H.MillerおよびM.P.Calos編 1987,Cold Spring
Harbor Laboratory);Meth Enzymol(1987)154および155(それぞれWuおよびGrossman編,Wu編);MayerおよびWalker編(1987),「Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology」(Academic Press,London);Scopes,「Protein Purification:Principles And Practice」,第2版(Springer−Verlag,N.Y.,1987);および「Handbook Of Experimental Immunology」,volumes I−IV(WeirおよびBlackwell編 1986)などを参照のこと。
指定された宿主と適合する、適切な制御配列を用いる場合には、原核および真核宿主細胞の両方が、所望のコーディング配列を発現するのに有用である。原核宿主の中で、E.coliが最もよく用いられる。原核細胞の制御配列には、任意にオペレーター部分を含有するプロモーター、およびリボソーム結合部位が含まれる。原核細胞宿主に適合する転移ベクターは、一般に、例えば、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性を付与するオペロンを含有するプラスミドであるpBR322、およびやはり抗生物質耐性マーカーを付与する配列を含有している種々のpUCベクターから由来する。これらのプラスミドは、商業的に入手可能である。これらのマーカーは、選択によって、優れた形質転換体を得るのに用い得る。一般に用いられる原核制御配列には、β−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトースプロモーターシステム(Changら、Nature(1977)198:1056)、トリプトファン(trp)プロモーターシステム(Goeddelら、Nuc Acids Res(1980)8:4057)およびラムダ誘導PLプロモーターおよびN遺伝子リボソーム結合部位(Shimatakeら、Nature(1981)292:128)およびtrpおよびlac UV5プロモーターの配列に由来するハイブリッドtacプロモーター(De Boerら、Proc Nat Acad Sci USA(1983)292:128)が含まれる。上述のシステムは、特にE.coliに適合する:所望の場合には、バシラスまたはシュードモナスの菌株のようなその他の原核宿主を、対応する制御配列と共に用いることもできる。
真核宿主には制限なしに、培養システム中の酵母および哺乳動物細胞を含む。酵母発現宿主には、Saccharomyces、Klebsiella、Piciaなどが含まれる。Saccharomyces cerevisiaeおよびSaccharomyces carlsbergensisおよびK.lactisが最もよく用いられる酵母宿主であり、便利な菌類宿主である。酵母適合ベクターは、原栄養性を栄養要求性突然変異体にまたは野生型菌株に重金属耐性に付与することによって、優れた形質転換体を選択することのできるマーカーを有する。酵母適合ベクターは、2μの複製起点を用い(Broachら、Meth Enzymol(1983)101:307)、複製を確実にするためにCEN3およびARS1の組み合せ、または宿主細胞ゲノムに適切なフラグメントを組み込む配列のような他の手段を活用し得る。酵母ベクターの制御配列は、当該分野では公知であり、3−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター(R.Hitzemanら、J Biol Chem(1980)255:2073)を含む、解糖酵素の合成のためのプロモーターが含まれる(Hessら、J
Adv Enzyme Reg(1968)7:149;Hollandら、Biochem(1978),17:4900)。エノラーゼ遺伝子に由来するもののようなターミネーターも含まれる(Holland,J Biol Chem(1981)256:1385)。特に有用な制御システムは、グリセルアルデヒド−3リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーター、またはアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)調節可能プロモーター、GAPDHにも由来するターミネーター、および分泌が必要な場合には酵母α−因子に由来するリーダー配列を含有するものである(参考までに本明細書に援用する、米国特許第4,870,008号参照)。
Adv Enzyme Reg(1968)7:149;Hollandら、Biochem(1978),17:4900)。エノラーゼ遺伝子に由来するもののようなターミネーターも含まれる(Holland,J Biol Chem(1981)256:1385)。特に有用な制御システムは、グリセルアルデヒド−3リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーター、またはアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)調節可能プロモーター、GAPDHにも由来するターミネーター、および分泌が必要な場合には酵母α−因子に由来するリーダー配列を含有するものである(参考までに本明細書に援用する、米国特許第4,870,008号参照)。
現在のところ、好ましい発現システムは、融合パートナーとしてユビキチン(ubiquitin)リーダーを用いている。1989年8月7日に出願された同時係属中の第USSN 7/390,599号は、酵母ユビキチン融合タンパク質を高率に発現するためのべククーを開示している。酵母ユビキチンは、発現によって自動的に融合タンパク質から開裂する。76アミノ酸ポリペプチドを提供する。ユビキチンのアミノ酸配列は以下のものである:
また、Ozkaynakら、Nature(1984)312:663−66も参照のこと。ユビキチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、Barrら、J Biol Chem(1988)268:1671−78の技術に従い Applied Biosystem 380A DNA合成器を用いるなど、標準的な方法で合成し得る。適切なリンカーを用いると、ユビキチン遺伝子を適当なベクターに挿入し、HCVプロテアーゼまたはそのフラグメントをコードする配列に結合することができる。
さらに、作動可能なように連結された転写調節領域および転写開始領域は、野生型有機体には自然には関連しないものにし得える。これらのシステムは、1984年10月3日公開のEPO第120,551号;1984年8月22日公開のEPO第116,201号:1985年12月18日公開のEPO第164,556号に詳細に説明されており、これらはすべて本発明と同一出願人によるものであるため、参考までに本明細書に詳しく援用される。
発現の宿主として入手可能な哺乳動物細胞系は、当該分野では公知であり、American Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、仔ハムスター腎臓(BHK)細胞および多くのその他の細胞株を含む、多くの不滅細胞系が含まれる。哺乳動物細胞に適当なプロモーターもまた当該分野で公知であり、シミアンウイルス40(SV40)(Fiersら、Nature(1978)273:113)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、アデノウイルス(ADV)およびウシ乳頭腫ウイルス(BPV)などからのウイルスプロモーターが含まれる。哺乳動物細胞は、また、ターミネーター配列およびポリ−A付加配列を必要とすることがある。発現を増大させるエンハンサー配列を含むことも可能であり、遺伝子を増幅する配列もまた望ましい(例えば、メトトレキセート耐性遺伝子)。これらの配列は当該分野では公知である。
哺乳動物細胞における複製に適切なベクターは、当該分野で公知であり、これには、ウイルスレプリコン、またはHCVエピトープを宿主ゲノムにコードするのに適切な配列の宿主ゲノムヘの組み込みを確実にする配列を含み得る。例えば、外来DNAを発現するのに用いられるその他のベクターは、ワクシニアウイルスである。この場合、異種DNAはワクシニアゲノムに挿入される。外来DNAをワクシニアウイルスゲノムに挿入する技術は当該分野では公知であり、例えば、相同組換えを用いることができる。異種DNAは、一般に、ウイルスに必須ではない遺伝子、例えばチミジンキナーゼ遺伝子(tk)に挿入され、これによって選択可能なマーカーがまた提供される。組換えウイルスの構築を大きく促進するプラスミドベクターは、すでに記載されている(例えば、Mackettら、J Virol(1984)49:857;Chakrabartiら、「Mol Cell Biol(1985)5:3403;Moss、Gene TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS(MillerおよびCalos編 Cold Spring Harbor Laboratory,NY,1987),p.10を参照のこと)。その後、活動組換えワクシニアウィルスに感染した細胞または動物中で、HCVポリペプチドが発現する。
HCVポリペプチドがワクシニアベクターから発現するか否かを判断するために、BSC 1細胞を組換えベクターで感染させ、発現可能な条件の下で顕微鏡スライド上に増殖させることもできる。次に細胞をアセトン固定し、組換え発現ベクターのHCVセグメントが由来している、HCVゲノムの領域にコードされたポリペプチドに対する抗HCV抗体を含有するとわかっている血清を用いて、免疫蛍光アッセイが行われる。
真核またはウイルスゲノムの発現のためのその他のシステムには、昆虫細胞およびこれらの細胞で用いるのに適切なベクターが含まれる。これらのシステムは当該分野で公知であり、例えば、バキュロウイルスAutographa ca1ifornica核多角体病ウイルス(AcNPV)に由来する昆虫発現転移ベクターが含まれ、これはヘルパー独立のウイルス発現ベクターである。このシステムに由来する発現ベクターは、通常、異種遺伝子の発現を駆動するための、強いウイルス性のポリヘドリン(polyhedrin)遺伝子プロモーターを用いる。現在、AcNPVに外来遺伝子を導入するために最も一般的に用いられる転移ベクターは、pAc373である(PCT第WO89/046699号およびUSSN第7/456,637号参照)。当業者に公知のその他の多くのベクターも発現を向上させるよう設計されてきた。この中には、例えば、pVL985(これは、ポリヘドリン開始コドンをATGからATTに改変させ、そのATTから32bp下流にBamHIクローニング部位を導入する;LuckowおよびSummers,Virol(1989)17:31参照)が含まれる。非融合外来タンパク質を高度に発現するためのAcNPV転移ベクターは、同時係属中のPCT出願番号第WO89/046699号およびUSSN第7/456,637号に記載されている。唯一のBamHI部位は、ポリヘドリン遺伝子の翻訳開始コドンATGに関して、8位後ろにある。SmaI、PstI、BglII、XbaIまたはSstIについての開裂部位はない。非融合外来タンパク質を良好に発現するためには、通常、理想的には、ATG開始シグナルに先行する、適切な翻訳開始シグナルを含有する短いリーダー配列を持つ外来遺伝子が必要である。このプラスミドもポリヘドリンポリアデニル化シグナルおよびアンピシリン耐性(amp)遺伝子およびE.coliにおける選択および増殖のための複製起点を含有している。
異種DNAをバキュロウイルスの所望の部位に導入する方法は当該分野で公知である。(SummerおよびSmith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555;Smithら、Mol Cell Biol(1983)3:2156−2165:およびLuckowおよびSummers,Virol(1989)17:31参照のこと)。例えば、異種DNAを、相同組換えによってポリヘドリン遺伝子のような遺伝子に、または所望のバキュロウイルス遺伝子内に構築された制限酵素部位に挿入することができる。挿入される配列は、全てのまたは様々なポリタンパク質のセグメントをコードするもの、もしくはウイルスポリペプチドをコードするその他のorfであり得る。例えば、この挿入物は、ポリタンパク質から以下の番号のアミノ酸セグメントをコードすることができた:アミノ酸1−1078;アミノ酸332−662;アミノ酸406−662;アミノ酸156−328およびアミノ酸199−328。
シグナルペプチド開裂、タンパク質分解開裂およびリン酸化などの、翻訳後改変のためのシグナルは、昆虫細胞によって認識される。分泌および核内蓄積に要求されるシグナルも、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間に保存されている。無脊椎動物細胞において効果的な脊椎動物細胞からのシグナル配列の実例は、当該分野では公知であり、例えば、細胞からの分泌をシグナルとして送るヒトインターロイキン−2シグナル(IL2S)が認識され、昆虫細胞内で適切に除去される。
形質転換は、例えば、ウイルス内のポリヌクレオチドをパッケージングして、宿主細胞をそのウイルスで形質導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する公知の方法のいずれによっても、および直接ポリヌクレオチドを取り込むことによっても行われ得る。用いられる形質転換方法は、形質転換される宿主によって異なる。直接取り込みによるバクテリアの形質転換では、一般に、カルシウムまたは塩化ルビジウムによる処理を用いる(Cohen,Proc Nat Acad Sci USA(1972)69:2110;T.Maniatisら、「Molecular Cloning;A Laboratory Manual」(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,1982)。直接取り込みによる酵母の形質転換は、Hinnenら、Proc Nat Acad Sci USA(1978)75:1929の方法を用いて行われ得る。直接取り込みによる哺乳動物細胞の形質転換は、GrahamおよびVan der Eb,Virol(1978)52:546のリン酸カルシウム沈澱方法を用いて、または公知の様々なこの方法の改変を用いて行われ得る。組換えポリヌクレオチドを細胞に、特に哺乳動物細胞に導入するその他の方法としては、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラストフュージョン、電気穿孔法、リポソーム内へのポリヌクレオチドの包み込み、および核へのポリヌクレオチドの直接的マイクロインジェクションが挙げられる。
ベクター構築には当該分野で公知の技術を用いる。部位特異的DNA開裂は、一般にこれらの市販の酵素の製造によって特定される条件の下で、適切な制限酵素で処理することによって行われる。一般に、約1μgのプラスミドまたはDNA配列が、約20μLの緩衝溶液中で1単位の酵素によって、37℃で1〜2時間のインキュベーションを行うことによって、開裂される。制限酵素によるインキュベーションの後、タンパク質をフェノール/クロロホルム抽出によって除去し、DNAをエタノールによる沈澱によって回収する。開裂したフラグメントは、Meth Enzymol(1980)65:499−560に記載されている一般的処理に従って、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動法を用いて分離され得る。
付着末端の開裂フラグメントは、この混合物中に存在する適切なデオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)を用いてE.coli DNAポリメラーゼI(クレノウフラグメント)により平滑末端にされ得る。S1ヌクレアーゼによる処理も用い得、これは、あらゆる一本鎖DNA部分を加水分解することになる。
標準の緩衝液および温度条件の下で、T4 DNAリガーゼおよびATPを用いて、連結反応を行う:付着末端連結反応で必要なATPおよびリガーゼは、平滑末端連結反応より少ない。ベクターフラグメントを連結混合物の一部に用いる場合には、そのベクターフラグメントは細菌アルカリホスファターゼ(BAP)または仔牛腸由来のアルカリホスファターゼによって処理され、5’リン酸基を除去してベクターの再連結を防ぐことが多い。あるいは、不要のフラグメントの制限酵素分解はまた、連結を防ぐのに用いることもできる。
連結混合物を、E.coliなどの適切なクローニング用宿主に形質転換し、組み込まれたマーカー(例えば抗生物質耐性)を用いて優れた形質転換体を選択し、正しい構築物をスクリーニングする。
合成オリゴヌクレオチドは、Warner,DNA(1984)3:401に記載されている自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて調製することができる。必要に応じて、標準的な反応条件の下で、32P−ATPの在在下、ポリヌクレオチドキナーゼで処理することによって、合成鎖を32Pで標識することができる。
cDNAライブラリーから単離されたものも含めて、DNA配列は、公知の技術、例えば、部位指定変異誘発によって、改変することができる(例えば、Zoller,Nuc Acids Res(1982)10:6487)。簡単に言うと、改変すべきDNAを一本鎖配列としてファージ内にパッケージングし、改変すべきDNAの一部に相補的な合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、DNAポリメラーゼを用いて二本鎖DNAに変換し、この時所望の改変はプライマー配列に含まれる。得られる二本鎖DNAで、ファージを保持する宿主バクテリアを形質転換する。このファージの各鎖のコピーを含む形質転換されたバクテリアの培養は、寒天培地にプレートし、プラークが得られる。理論的には、新しいプラークの50%は、変異した配列を有するファージを含有し、そして残りの50%は元々の配列を有する。プラークの複製物は非改変配列をもたない正しい鎖とのハイブリダイゼーションを可能にする温度と条件下で標識した合成プローブとハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションによって同定された配列が回収され、クローニングされる。
DNAライブラリーは、GrunsteinおよびHognessのProc
Nat Acad Sci USA(1975)73:3961の方法を用いて調べることができる。簡単に言えば、この方法では、調べるべきDNAをニトロセルロースフィルターに固定化し、変性させ、0〜50%ホルムアミド、0.75MのNaCl、75mMのクエン酸ナトリウム、0.02%(wt/v)の各ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドンおよびFicoll(登録商標)、50mMのNaH2PO4(pH6.5)、0.1%のSDS、および100μg/mLのキャリア変性DNAを含有する緩衝液で、プレハイブリダイズする。緩衝液内でのホルムアミドのパーセンテージ、およびプレハイブリダイゼーションとそれに続くハイブリダイゼーション工程との時間および温度条件は、必要とされるストリンジェンシーによって改変する。一般に、低いストリンジェンシーを必要とするオリゴマープローブは、低いパーセントのホルムアミド、より低い温度、およびより長いハイブリダイゼーション時間で用いられる。cDNAまたはゲノム配列に由来するものなど、30または40より多いヌクレオチドを含有するプローブは、一般に、例えば約40〜42℃の高い温度、および例えば50%という高いホルムアミドのパーセンテージで用いる。プレハイブリダイゼーションの後、5’−32P標識されたオリゴヌクレオチドプローブを緩衝液に加え、ハイブリダイゼーション条件の下で、この混合物内でフィルターをインキュベートする。洗浄した後、処理されたフィルターをオートラジオグラフィーにかけ、ハイブリダイズしたプローブの位置を示す;当初のアガー培養上の対応する位置にあるDNAを、所望のDNA源として用いる。
Nat Acad Sci USA(1975)73:3961の方法を用いて調べることができる。簡単に言えば、この方法では、調べるべきDNAをニトロセルロースフィルターに固定化し、変性させ、0〜50%ホルムアミド、0.75MのNaCl、75mMのクエン酸ナトリウム、0.02%(wt/v)の各ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドンおよびFicoll(登録商標)、50mMのNaH2PO4(pH6.5)、0.1%のSDS、および100μg/mLのキャリア変性DNAを含有する緩衝液で、プレハイブリダイズする。緩衝液内でのホルムアミドのパーセンテージ、およびプレハイブリダイゼーションとそれに続くハイブリダイゼーション工程との時間および温度条件は、必要とされるストリンジェンシーによって改変する。一般に、低いストリンジェンシーを必要とするオリゴマープローブは、低いパーセントのホルムアミド、より低い温度、およびより長いハイブリダイゼーション時間で用いられる。cDNAまたはゲノム配列に由来するものなど、30または40より多いヌクレオチドを含有するプローブは、一般に、例えば約40〜42℃の高い温度、および例えば50%という高いホルムアミドのパーセンテージで用いる。プレハイブリダイゼーションの後、5’−32P標識されたオリゴヌクレオチドプローブを緩衝液に加え、ハイブリダイゼーション条件の下で、この混合物内でフィルターをインキュベートする。洗浄した後、処理されたフィルターをオートラジオグラフィーにかけ、ハイブリダイズしたプローブの位置を示す;当初のアガー培養上の対応する位置にあるDNAを、所望のDNA源として用いる。
通常のベクター構築のために、結合反応混合物を、E.coliのHB101株またはその他の適切な宿主に形質転換し、優れた形質転換体が抗生物質耐性またはその他のマーカーによって選択される。そして、形質転換体からのプラスミドを、Clewellら、Proc Nat Acad Sci USA(1969)62:1159の方法に従って、通常、クロラムフェニコール増幅(Clewell,J Bacteriol(1972)110:667)に引き続いて調製する。DNAは、通常制限酵素分析および/主たは配列決定法によって、単離され、分析される。配列決定は、Sangerら、Proc Nat Acad Sci USA (1977)74:5463の方法で、さらにMessingら、Nuc Acids Res(1981)9:309によって説明されているジデオキシ法によって、あるいはMaxamら、Meth Enzymol(1980)65:499の方法によって行うことができる。バンド圧縮の問題は、GC豊富領域で見られることがあるが、Barrら、Biotechniques(1986)4:428に従ってT−デアゾグアノシン(deazoguanosine)を用いることによって克服された。
酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)を、抗原または抗体濃度のいずれかを測定するのに用いることができる。この方法は、酵素の、抗原または抗体いずれかへの連結に依存し、定量可能標識として結合酵素活性を用いる。抗体を測定するためには、既知の抗原を固相(例えば、マイクロタイターディッシュ、プラスチックカップ、ディップスティック、プラスチックビーズなど)に固定し、テスト血清希釈物とインキュベートし、洗浄し、酵素で標識された抗イムノグロブリンでインキュベートし、再び洗浄する。標鐵に適切な酵素は、当該分野では公知であり、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)が含まれる。固相に結合した酵素活性は、通常、特定の基質を添加し、物質の生成または比色分折により基質の使用を判断することによって測定される。結合酵素活性は、結合抗体量の直接的関数である。
抗原を測定するためには、既知の特定の抗体を固相に固定し、抗原を含有するテスト物質を添加し、インキュベーションの後、固相を洗浄し、第二の酵素標識抗体を添加する。洗浄した後、基質を添加し、酵素活性を比色的に測定し、抗原濃度と関連づけられる。
本発明のプロテアーゼの活性は、検出可能な開裂生成物を提供する基質を開裂することによってアッセイすることもできる。HCVプロテアーゼは、ゲノムポリタンパク質から開裂すると考えられるため、タンパク質の発現をアッセイし、活性を測定するために、この自己触媒活性を用いることもできる。例えば、HVCプロテアーゼN末端開裂シグナル(Arg−Arg)が含まれるようにプロテアーゼが融合パートナーと結合されると、発現生成物は、融合パートナーおよび活性HCVプロテアーゼに開裂する。生成されたタンパク質がサイズにおいて、融合パートナーおよびプロテアーゼタンパク質に対応することを立証するために、例えばウェスタンブロットによってこの生成物をアッセイすることもできる。現在では、小さなペプチドp−ニトロフェニルエステルまたはメチルクマリンを用いることが好ましい。そうすると、開裂の後、分光光度計測定または蛍光アッセイを行い得るためである。E.D.Matayoshiら、Science(1990)247:231−35に記載された方法に従って、蛍光標識を基質の一端に、クエンチング分子を他端に添加することもできる:そして得られる蛍光の増加を測定することによって開裂が判断される。適切な酵素または抗原を融合パートナーとして用いると、生成されるタンパク質の量は簡単に測定できる。あるいは、HCVプロテアーゼN末端開裂シグナル(自己開裂を抑制する)を排除し、天然のプロセシングシグナルまたは合成アナログを含有するHCV NS3ドメインのフラグメントなどの、別の開裂基質を添加することもできる。
このプロテアーゼ活性がなければ、HCVポリタンパク質はプロセシングされない形態のままであり、そのためウイルスを非感染性にする。従って、プロテアーゼ活性を十分に抑制する成分がウイルス感染性も阻害するため、このプロテアーゼは、HCVの制御のための薬剤アッセイに有用である。このようなインヒビターは有機成分、特にプロテアーゼによって認識されるHCVの開裂部位を模倣する成分の形態をとり得る。HCVポリタンパク質の3つの推定開裂部位は、以下のアミノ酸配列を有する:
これらの部位は、開裂部位の直前に2つの塩基性アミノ酸が存在することによって特徴づけられ、その他のフラビウイルスプロテアーゼによって認識される開裂部位に類似している。従って、HCV開裂部位の塩基性/塩基性/小中性モチーフを模倣し、不安定結合を天然基質において開裂したペプチド結合と置換する、適切なプロテアーゼインヒビターが調製し得る。適切なインヒビターとしては、ペプチドトリフルオロメチルケトン、ペプチドボロン酸、ペプチドα−ケトエスチル、ペプチドジフルオロケト化合物、ペプチドアルデヒド、ペブチドジケトンなどが挙げられる。例えば、ペプチドアルデヒドN−アセチル−フェニルアラニル−グリシンアルデヒドは、プロテアーゼパパインの有力なインヒビターである。参考までに本明細書に援用する、1988年5月2日出願の米国特許出願第7/189,318号(PCT第WO89/10931号として公開)に開示された方法を用いて、ペプチドの大量の混合物を調製し、アッセイすると便利である。この出願は、ペプチドの混合物を、全ての可能なアミノ酸配列を有するヘキサペプチドまで生成する方法を教示しており、さらに、プロテアーゼと結合可能なこれらのペプチドを同定する方法を教示している。
その他のブロテアーゼインヒビターは、タンパク質、特に抗体および抗体誘導体であり得る。組換え発現システムを用いて、このプロテアーゼに特異的なモノクローナル抗体(MAb)を生成するのに十分な量のプロテアーゼを生成することもできる。プロテアーゼを阻害するための適切な抗体は、酵素活性を減少または排除するような様式で、典型的には活性部位をおおい隠すように、このプロテアーゼに結合する。適切なMAbを、当該分野で公知の方法を用いて、Fabフラグメント、キメラ抗体、改変された抗体、一価の抗体およびシングルドメイン抗体などの誘導体を生成するのに用いることもできる。
プロテアーゼインヒビターは、本発明の方法を用いてスクリーニングされる。一般には、酵素の天然基質を模倣し、開裂した時には定量可能なシグナルを提供する基質を用いる。シグナルは比色法または蛍光法によって検出することが好ましい:しかし、HPLCまたはシリカゲルクロマトグラフィ、GC−MS、核磁気共鳴等のその他の方法も有効である。最適な基質および酵素の濃度を決定した後、候補となるプロテアーゼインヒビターを濃度の範囲で反応混合物に添加する。アッセイ条件は、インビボで、プロテアーゼが阻害される条件、つまり生理学的pH、温度、イオン強度等に類似のものであることが理想である。適切なインヒビターは、被験体に毒性副作用を起こさせない濃度で、強いプロテアーゼ阻害を示す。プロテアーゼ活性部位への結合について競合するインヒビターは、基質濃度と同等あるいはそれ以上の濃度を必要とし、他方、プロテアーゼ活性部位に不可逆的に結合することのできるインヒビターは、酵素濃度のオーダーの濃度で添加し得る。
本願の好ましい実施形態においては、活性酵素ではなく、不活性のプロテアーゼ変異タンパク質を用いる。プロテアーゼの活性部位内の重要残基を置き替え(例えば、セリンプロテアーゼの活性部位Serを置き替え)ても、酵素の構造を有意には改変させず、結合特異性が保たれる。改変させられた酵素は、それでも適切な基質を認識し、それに結合するが、開裂を起こさせることはできない。従って、本発明の方法の1つによると、不活性化されたHCVプロテアーゼは固定化され、候補となるインヒビターの混合物が添加される。酵素の好ましい認識配列を詳細に模倣するインヒビターは、その他の候補のインヒビターよりうまく結合のために競合する。うまく結合できない侯捕は、そこで分けられ、結合の強いインヒビターが決定される。例えば、HCVプロテアーゼは、AlaをSer221(図1の)に置き換えて調製され、HCVプロテアーゼ基質に結合は可能であるが、それを開裂させることはできない酵素を提供する。そして、得られたプロテアーゼ変異タンパク質は、例えばSephadex(登録商標)ビーズなどの固体支持物に結合され、カラムに詰められる。そして、候補のプロテアーゼインヒビターの混合液をカラムに通し、画分を集める。溶出する最後の画分は、量も結合の強い化合物を含有し、好ましいプロテアーゼインヒビター候補を提供する。
プロテアーゼインヒビターは、静脈内、経口、筋肉内、腹腔内、鼻腔内など、様々な方法で投与し得る。好ましい投与経路は、インヒビターの性質による。有機化合物として調製されたインヒビターは、吸収性がよい場合には、経ロで投与される(一般にこれが好ましい)。(ほとんどの抗体誘導体などの)タンパク質を基礎とするインヒビターは、一般に、非経口的経路による投与を行わねばならない。
(C.実施例)
下記に示す実施例は当該分野の通常の技術を有する実験者にさらなるガイドとして提供されるものであって、本発明をいかなる点においても限定することを意図するものではない。
下記に示す実施例は当該分野の通常の技術を有する実験者にさらなるガイドとして提供されるものであって、本発明をいかなる点においても限定することを意図するものではない。
(実施例1:HCV cDNAの調製)
HCV cDNAのゲノムライブラリーを、PCT WO89/046699およびUSSN 7/456,637に記載のように調製した。このライブラリー、ATCC受託番号第40394号は、以下に説明するように寄託されている。
HCV cDNAのゲノムライブラリーを、PCT WO89/046699およびUSSN 7/456,637に記載のように調製した。このライブラリー、ATCC受託番号第40394号は、以下に説明するように寄託されている。
(実施例2:クローン5−1−1にコードされたポリペプチドの発現)
(A)クローン5−1−1(実施例1参照)内にコードされたHCVポリペプチドは、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)との融合ポリペプチドとして発現した。これは、下記のように発現ベクターpSODCF1(K.S.Steimerら、J Virol(1986)58:9;EPO138,111)内にクローン5−1−1 cDNA挿入物をサブクローニングすることによって達成した。このSOD/5−1−1発現ベクターを、E.coli D1210細胞に形質変換した。E.coli内のCf1/5−1−1と命名されたこれらの細胞は、以下に説明するように寄託され、ATCC受託番号第67967号を有している。
(A)クローン5−1−1(実施例1参照)内にコードされたHCVポリペプチドは、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)との融合ポリペプチドとして発現した。これは、下記のように発現ベクターpSODCF1(K.S.Steimerら、J Virol(1986)58:9;EPO138,111)内にクローン5−1−1 cDNA挿入物をサブクローニングすることによって達成した。このSOD/5−1−1発現ベクターを、E.coli D1210細胞に形質変換した。E.coli内のCf1/5−1−1と命名されたこれらの細胞は、以下に説明するように寄託され、ATCC受託番号第67967号を有している。
まず始めに、pSODCF1から単離されたDNAを、BamHIおよびEcoRIで処理し、下記のリンカーを、制限酵素によって生じた直鎖状DNAに連結した:
クローニングした後、この挿入物を有するプラスミドを単離した。
この挿入物を有するプラスミドをEcoRIで消化した。クローン5−1−1内のHCV cDNA挿入物を、EcoRIで切り出し、このEcoRI直鎖化したプラスミドDNAに連結した。このDNA混合物を、E.coli株D1210(Sadlerら,Gene(1980)8:279)を形質転換するために使用した。図1に示したORFを発現するための適切な配向にある5−1−1
cDNAの組み換え体を、制限地図の作成およびヌクレオチド配列決定によって同定した。
cDNAの組み換え体を、制限地図の作成およびヌクレオチド配列決定によって同定した。
1つのクローン由来の組み換え体バクテリアを、IPTGの存在下でバクテリアを増殖させて、SOD−HCV5-1-1ポリペプチドを発現するよう誘導した。
3つの新たなリンカー(AB、CD、およびEF)を、ベクターpSODCF1をEcoRIおよびBamHIで完全に消化し、その後アルカリホスファターゼで処理して得られたBamHI−EcoRIフラグメントに連結して、3つの異なる発現ベクター(pcf1AB、pcf1CD、およびpcf1EF)を作成した。これらのリンカーは、6つのオリゴマー、A、B、C、D、E、およびFから作成した。その相補的オリゴマーにアニーリングする前に、各オリゴマーを、ATP存在下でキナーゼ処理し、リン酸化した。合成リンカーの配列は、下記の通りであった:
3つのリンカーの各々は、本来のEcoRI部位を破壊し、リンカー内(但し別のリーディングフレーム内)に、新しいEcoRI部位を形成する。従って、クローンから単離されたHCV cDNA EcoRIフラグメンは、発現ベクターに挿入された後、3つの異なるリーディングフレーム内に存在していた。
指定のgt11クローン内のHCV cDNAフラグメントを、EcoRIで消化して切り出した;各フラグメントを、pcf1AB、pcf1CD、およびpcf1EF内に挿入した。その後、これらの発現構築物をD1210 E.coli細胞に形質転換し、この形質転換体をクローニングし、ポリペプチドを以下のB項に記載するように発現させた。
(B)指定されたHCV cDNAの発現生成物の抗原性を、Helfmanら、Proc Nat Acad Sci USA(1983),80:31に記載の方法の改変を用い、コロニーの直接的免疫学的スクリーニングによって、試験した。簡潔に述べると、アンピシリンプレートを覆ったニトロセルロースフィルター上にバクテリアをプレートし、フィルター当り約40コロニーを得た。コロニーを、ニトロセルロースフィルター上にレプリカプレートし、このレプリカを一晩2mM IPTGおよびアンピシリン共存下で再増殖させた。CHCl3蒸気の飽和雰囲気中で約15から20分間ニトロセルロースフィルターを懸濁し、バクテリアのコロニーを溶解した。その後、各フィルターを、10mLの50mM Tris HCl,pH7.5、150mM NaCl、5mM MgCl2、3%(w/v)BSA、40μg/mL リゾチーム、および0.1μg/mL DNaseを含む別々の100mmペトリ皿に入れた。このプレートを、室温で少なくとも8時間穏やかに攪拌した。このフィルターをTBST(50 mM Tris HCl、pH8.0、150mM NaCl、0.005% Tween(登録商標)20)で洗浄した。インキュベートの後、細胞残渣を洗浄し、10%ヒツジ血清を含むTBS(Tween(登録商標)を除いたTBST)中で1時間インキュベートした。その後、フィルターを、NANBHを有する個体からのTBS中の前処理された血清でインキュベートした。これらの個体は、チンパンジー3匹;HCV C100−3ポリペプチド(C100とも呼ばれる)に対する抗体に陽性を示す血清を持つ、慢性NANBHを有する患者8人;抗C100抗体に対して陰性を示す血清を持つ、慢性NANBHを有する患者8人:抗C100抗体に対して陰性を示す血清を持つ、回復期患者1人:および抗C100抗体に対して強い陽性を示す血清を有する1人、抗C100抗体に対してぎりぎりの陽性を示す血清を有する1人を含む、地域獲得性NANBHを有する患者6人を含む。TBSで希釈された血清を、37℃で少なくとも30分間hSODで前吸収することにより、前処理した。インキュベーションの後、フィルターをTBSTで30分間ずつ2回洗浄した。血清中で抗体と結合した発現タンパク質を、125I−標識されたヒツジ抗ヒト抗体で2時間にわたってインキュベートして、標識した。洗浄の後、フィルターをTBSTで30分間ずつ2回洗浄し、乾燥し、オートラジオグラフィーを行った。
(実施例3:SOD−プロテアーゼ融合タンパク質全長のクローニング)
(A)pBR322−C200:
以下で使用したHCV cDNAのヌクレオチド配列は、これらのファージから切り出されたcDNAをクローン5−1−1から単離したcDNAで置換したこと以外は、実質的に上記で記載したようにして決定した。
(A)pBR322−C200:
以下で使用したHCV cDNAのヌクレオチド配列は、これらのファージから切り出されたcDNAをクローン5−1−1から単離したcDNAで置換したこと以外は、実質的に上記で記載したようにして決定した。
クローンC33cを、下記の配列:
を有するハイブリダイゼーションプローブを用いて、単離した。クローンC33c内のHCV cDNAの配列を、図8に示す。図8は、その中にコードされているアミノ酸も示す。
クローン35を、配列
を有する合成ポリヌクレオチドでスクリーニングして、単離した。50,000個のクローン中約1個が、プローブとハイブリダイズした。C35のポリヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、図7に示す。
クローンC31を、図6に示す。図6は、その中にコードされているアミノ酸も示す。C200カセットを、クローンC33c DNAをEcoRIおよびHinfIで消化して得られた718bpフラグメント、クローンC31 DNAをHinfIおよびBglIで消化して得られた179bpフラグメント、およびクローンC35 DNAをBglIおよびEcoRIで消化して得られた377bpフラグメントを連結することにより、構築した。フラグメントを連結して得たこの構築物を、pBR322のEcoRI部位に挿入し、プラスミドpBR322−C200を生成した。
(B)C7f+C20c:
クローン7fを、配列:
クローン7fを、配列:
を有するプローブを用いて、単離した。クローン7f内のHCV cDNAの配列、およびその中にコードされたアミノ酸を、図5に示す。
クローンC20cを、下記の配列:
を用いて単離する。
クローンC20c内のHCV cDNAの配列、およびその中にコードされたアミノ酸を、図2に示す。
クローン7fおよびC20cをEcoRIおよびSfaNIで消化し、400bpおよび260bpフラグメントをそれぞれ形成した。その後、これらのフラグメントをpBR322のEcoRI部位にクローニングし、ベクターC7f+C20cを形成し、HB101細胞に形質変換した。
(c)C300:
クローン8hを、クローン33c中のヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は、
クローン8hを、クローン33c中のヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は、
であった。クローン8h内のHCV cDNAの配列、およびその中にコードされたアミノ酸を、図4に示す。
クローンC26dを、下記の配列:
を有するプローブを用いて単離する。
クローンC26dの配列およびアミノ酸配列を、図3に示す。
クローンC26dおよびC33c(上記A項を参照)を、メチル化マイナスE.coli株GM48に形質変換した。クローンC26dをEcoRIIおよびDdeIで消化し、100bpフラグメントを得た。クローンC33cをEcoRIIおよびEcoRIで消化し、700bpフラグメントを得た。クローンC8hをEcoRIおよびDdeIで消化し、208bpフラグメントを得た。その後、これらの3つのフラグメントを、pBR322のEcoRI部位に連結し、E.coli HB101に形質変換し、ベクターC300を得た。
(D)クローン全長の調製
EcoRIおよびNaeIで消化してC7f+C20cから600bpフラグメントを得、C300からの945bp NaeI/EcoRIフラグメントに連結して、この構築物をpGEM4Z(Promegaから市販で入手可能)のEcoRI部位に挿入して、ベクターC7fC20cC300を形成した。
EcoRIおよびNaeIで消化してC7f+C20cから600bpフラグメントを得、C300からの945bp NaeI/EcoRIフラグメントに連結して、この構築物をpGEM4Z(Promegaから市販で入手可能)のEcoRI部位に挿入して、ベクターC7fC20cC300を形成した。
C7fC20cC300を、NdeIおよびEcoRIで消化し、892bpフラグメントを得た。これは、C200をNdeIおよびEcoRIで消化して得られた1160bpフラグメントに連結した。得られた構築物を、pBR322のEcoRI部位に挿入し、ベクターC7fC20cC300C200を得た。このベクターの構造を、図9に図式的に示す。
(実施例4:E.coli発現ベクターの調製)
(A)cf1SODp600
このベクターは、機能性hSODリーダーに融合した、全長のHCVプロテアーゼコーディング配列を含んでいる。ベクターC7fC20cC300C200を、EcoRIで開裂して2000bpフラグメントを得た。これを、その後プラスミドcf1CDのEcoRI部位に連結した(実施例2A)。得られたベクターは、hSODのアミノ酸1−151およびHCVのアミノ酸946−1630(図1のアミノ酸1−686に対応して、ポリプロテインの始めから番号付けされている)をコードする。このベクターは、Cf1SODp600と明示され(しばしばP600と呼ばれる)、E.coli D1210細胞に形質転換された。これらの細胞(ATCC受託番号第68275号)を以下で説明するように寄託した。
(A)cf1SODp600
このベクターは、機能性hSODリーダーに融合した、全長のHCVプロテアーゼコーディング配列を含んでいる。ベクターC7fC20cC300C200を、EcoRIで開裂して2000bpフラグメントを得た。これを、その後プラスミドcf1CDのEcoRI部位に連結した(実施例2A)。得られたベクターは、hSODのアミノ酸1−151およびHCVのアミノ酸946−1630(図1のアミノ酸1−686に対応して、ポリプロテインの始めから番号付けされている)をコードする。このベクターは、Cf1SODp600と明示され(しばしばP600と呼ばれる)、E.coli D1210細胞に形質転換された。これらの細胞(ATCC受託番号第68275号)を以下で説明するように寄託した。
(B)P190:
切り形のSODプロテアーゼ融合ポリヌクレオチドを、C7f+C20cから600bp EcoRl/NaeIフラグメントを切り出し、このフラグメントをクレノウフラグメントで平滑にし、cf1EFのクレノウで平滑にされたEcoRI部位にこの平滑フラグメントを連結して、調製した(実施例2A)。このポリヌクレオチドは、hSODのアミノ酸1−151およびHCVプロテアーゼのアミノ酸1−199を有する融合タンパク質をコードする。
切り形のSODプロテアーゼ融合ポリヌクレオチドを、C7f+C20cから600bp EcoRl/NaeIフラグメントを切り出し、このフラグメントをクレノウフラグメントで平滑にし、cf1EFのクレノウで平滑にされたEcoRI部位にこの平滑フラグメントを連結して、調製した(実施例2A)。このポリヌクレオチドは、hSODのアミノ酸1−151およびHCVプロテアーゼのアミノ酸1−199を有する融合タンパク質をコードする。
(C)P300:
さらに長い切り形のSODプロテアーゼ融合ポリヌクレオチドを、C7fC20cC300から892bp EcoRI/NaeIフラグメントを切り出し、このフラグメントをクレノウフラグメントで平滑にし、cf1EFのクレノウで平滑にされたEcoRI部位にこの平滑フラグメントを連結して、調製した。このポリヌクレオチドは、hSODのアミノ酸1−151およびHCVプロテアーゼのアミノ酸1−299を有する融合タンパク質をコードする。
さらに長い切り形のSODプロテアーゼ融合ポリヌクレオチドを、C7fC20cC300から892bp EcoRI/NaeIフラグメントを切り出し、このフラグメントをクレノウフラグメントで平滑にし、cf1EFのクレノウで平滑にされたEcoRI部位にこの平滑フラグメントを連結して、調製した。このポリヌクレオチドは、hSODのアミノ酸1−151およびHCVプロテアーゼのアミノ酸1−299を有する融合タンパク質をコードする。
(D)P500:
さらに長い切り形のSODプロテアーゼ融合ポリヌクレオチドを、C7fC20cC300から1550bp EcoRI/EcoRIフラグメントを切り出し、このフラグメントをcf1CDのEcoRI部位に連結して調製し、P500を形成した。このポリヌクレオチドは、hSODのアミノ酸1−151およびHCVプロテアーゼのアミノ酸946−1457を有する融合タンパク質をコードする(図1のアミノ酸1−513)。
さらに長い切り形のSODプロテアーゼ融合ポリヌクレオチドを、C7fC20cC300から1550bp EcoRI/EcoRIフラグメントを切り出し、このフラグメントをcf1CDのEcoRI部位に連結して調製し、P500を形成した。このポリヌクレオチドは、hSODのアミノ酸1−151およびHCVプロテアーゼのアミノ酸946−1457を有する融合タンパク質をコードする(図1のアミノ酸1−513)。
(E)FLAG/プロテアーゼ融合物
このベクターは、Hoppら(1988)Biotechnology 6:1204−1210のFLAG配列に融合した全長のHCVプロテアーゼコーディング配列を含んでいる。PCRを用いて、クローニングを容易にするための特定の制限末端を有する、HCVプロテアーゼ遺伝子を生成した。プラスミドp500を、EcoRIおよびNdeIで消化し、900bpフラグメンントを生成した。このフラグメントおよび2つのプライマーをポリメラーゼ連鎖反応に使用し、1990年10月4日公開のWO90/11089の図17に示されるように、HCV−1のアミノ酸1009位で固有のBglII部位を有し、アミノ酸1262位でSalI部位を有する停止コドンを有するものを導入した。このプライマーの配列は下記のとおりである:
このベクターは、Hoppら(1988)Biotechnology 6:1204−1210のFLAG配列に融合した全長のHCVプロテアーゼコーディング配列を含んでいる。PCRを用いて、クローニングを容易にするための特定の制限末端を有する、HCVプロテアーゼ遺伝子を生成した。プラスミドp500を、EcoRIおよびNdeIで消化し、900bpフラグメンントを生成した。このフラグメントおよび2つのプライマーをポリメラーゼ連鎖反応に使用し、1990年10月4日公開のWO90/11089の図17に示されるように、HCV−1のアミノ酸1009位で固有のBglII部位を有し、アミノ酸1262位でSalI部位を有する停止コドンを有するものを導入した。このプライマーの配列は下記のとおりである:
PCRの30サイクルの後、反応物をBglIIおよびSalIで消化し、710bpフラグメントを単離した。このフラグメントをアニールし、下記の二本鎖に連結した。
この二本鎖は、FLAG配列、イニシエーターであるメチオニン、および5’NcoI制限部位をコードする。得られたNcoI/SalIフラグメントをpCF1の誘導体に連結した。
その後、この構築物をE.coli D1210細胞に形質転換し、IPTGを加えてプロテアーゼの発現を誘発した。
FLAG配列をHCVプロテアーゼに融合し、精製を促した。FLAGでコードされたペプチドに結合するカルシウム依存性モノクローナル抗体を、厳しい溶離条件を用いずに融合タンパク質を精製するために使用する。
(実施例5:SOD−プロテアーゼ融合タンパク質のE.coli発現)
(A)E.coli D1210細胞を、cf1SODp600で形質転換し、100μg/mLアンピシリンを含むルリア液(Luria broth)中で、ODを0.3−0.5まで増殖させた。その後、IPTGを2mMの濃度まで加え、細胞を培養して、0.9から1.3の最終ODにした。その後、この細胞を溶解し、USSN 7/456,637に記載のように抗HCV血清を用いてウェスタンブロット法により、溶解物を分析した。
(A)E.coli D1210細胞を、cf1SODp600で形質転換し、100μg/mLアンピシリンを含むルリア液(Luria broth)中で、ODを0.3−0.5まで増殖させた。その後、IPTGを2mMの濃度まで加え、細胞を培養して、0.9から1.3の最終ODにした。その後、この細胞を溶解し、USSN 7/456,637に記載のように抗HCV血清を用いてウェスタンブロット法により、溶解物を分析した。
全長(理論的にはMr 93 kDa)の生成物はゲル上に現れなかったので、その結果、開裂の発生が示された。hSOD融合パートナーおよび分離したHCVプロテアーゼに対応するバンドは、約34、53、66kDaの相対分子量で現れた。34kDaバンドは、NS3ドメインの一部分のhSODパートナー(約20kDa)に対応し、53および66kDaのバンドは、(恐らくバクテリアによる)プロセシングの種々の程度のHCVプロテアーゼに対応する。
(B)E.coli D1210細胞を、P500で形質転換し、100μg/mLアンピシリンを含むルリア液中で0.3−0.5のODまで増殖させた。その後、IPTGを2mMの濃度まで加え、細胞を培養して、0.8から1.0の最終ODにした。その後、この細胞を溶解し、溶解物を上記のように分析した。
全長(理論的にはMr 73kDa)の生成物はゲル上に現れなかったので、その結果、ここでも開裂の発生が示された。hSOD融合パートナーおよび切り形のHCVプロテアーゼに対応するバンドは、約34および45kDaの分子量でそれぞれ現れた。
(C)E.coli D1210細胞を、ベクターP300およびP190で形質転換し、上記のように増殖させた。
全長(理論的にはMr 51kDa)の生成物はゲル上に現れなかったので、P300発現の結果は開裂の発生を示した。hSOD融合パートナーに対応するバンドは、約34の相対分子量で現れた。NS3ドメインのこの部分は生成物を検出するために使用される血清によって認識されないので、対応するHCVプロテアーゼバンドは目視により確認されなかった。しかし、hSODバンドが51kDaではなく、34kDaで現れているので、開裂が生じていることがわかる。
P190発現産物は、開裂のない全長の(コードされた)生成物としてのみ現れ、約40kDaのバンドを形成した。これは、開裂していない生成物の理論的分子量に対応する。これは、HCVプロテアーゼの最小必須配列が、アミノ酸の199位と299位との間の領域にわたることを示している。
(実施例6:E.coli発現プロテアーゼの精製)
実施例5で発現したHCVプロテアーゼおよびフラグメントは、下記のように精製され得る。
実施例5で発現したHCVプロテアーゼおよびフラグメントは、下記のように精製され得る。
ポリペプチドが発現したバクテリア細胞を、浸透圧ショックおよび機械分断にかけ、プロテアーゼを含む不溶性画分を単離し、アルカリ性−NaCl溶液により分離抽出し、この抽出物中のポリペプチドを、S−Sepharose(登録商標)およびQ−Sepharose(登録商標)のカラム上でクロマトグラフィーにかげて精製した。
浸透圧ショックおよび機械分断によって得られた粗製の抽出物を、0.02M
Tris HCl,pH7.5、10mM EDTA、20% スクロースを含む10mLの溶液中で1gの充填細胞を懸濁し、氷上で10分間インキュベートして調製する。その後、この細胞を4°Gで4,000×gで15分間遠心し、ペレット化する。上清を除去した後、10mLの緩衝液A1(0.01M Tris HCl,pH7.5、1mM EDTA、14mM β−メルカプトエタノール「βME」)中に、この細胞ペレットを再懸濁し、10分間氷上でインキュベートする。この細胞を、4°Gで4,000×gで15分間再びペレット化する。透明な上清(ペリプラズム画分1)を除去した後、この細胞ペレットを緩衝液A1中で再懸濁し、10分間氷上でインキュベートし、再び4°Gで4,000×gで15分間遠心する。透明な上清(ペリプラズム画分II)を除去し、この細胞ペレットを5mLの緩衝液T2(0.02M Tris HCI、pH7.5、14mM βME、1mM EDTA、1mM PMSF)中に再懸濁する。細胞を破壊するために、懸濁液(5mL)および7.5mLの鉛を含有しない酸性洗浄されたDyno−millガラスビーズ(直径0.10−0.15mm)(Glen−Mills,Inc.より入手可能)をFalconチューブに入れ、トップスビードで2分間回転させた後、氷上で少なくとも2分間冷却する。この回転冷却工程を、さらに4回繰り返す。回転の後、スラリーを、弱い吸引を用いて、焼結したガラス漏斗を介して濾過し、このガラスビーズを緩衝液A2で2回洗浄し、濾液と洗浄液とを合わせた。
Tris HCl,pH7.5、10mM EDTA、20% スクロースを含む10mLの溶液中で1gの充填細胞を懸濁し、氷上で10分間インキュベートして調製する。その後、この細胞を4°Gで4,000×gで15分間遠心し、ペレット化する。上清を除去した後、10mLの緩衝液A1(0.01M Tris HCl,pH7.5、1mM EDTA、14mM β−メルカプトエタノール「βME」)中に、この細胞ペレットを再懸濁し、10分間氷上でインキュベートする。この細胞を、4°Gで4,000×gで15分間再びペレット化する。透明な上清(ペリプラズム画分1)を除去した後、この細胞ペレットを緩衝液A1中で再懸濁し、10分間氷上でインキュベートし、再び4°Gで4,000×gで15分間遠心する。透明な上清(ペリプラズム画分II)を除去し、この細胞ペレットを5mLの緩衝液T2(0.02M Tris HCI、pH7.5、14mM βME、1mM EDTA、1mM PMSF)中に再懸濁する。細胞を破壊するために、懸濁液(5mL)および7.5mLの鉛を含有しない酸性洗浄されたDyno−millガラスビーズ(直径0.10−0.15mm)(Glen−Mills,Inc.より入手可能)をFalconチューブに入れ、トップスビードで2分間回転させた後、氷上で少なくとも2分間冷却する。この回転冷却工程を、さらに4回繰り返す。回転の後、スラリーを、弱い吸引を用いて、焼結したガラス漏斗を介して濾過し、このガラスビーズを緩衝液A2で2回洗浄し、濾液と洗浄液とを合わせた。
粗製の抽出物の不溶性画分を、4℃で20,000×gで15分間遠心して集め、緩衝液A2 10mLで2回洗浄し、5mLのMlLLI−Q水中に再懸濁する。
この懸濁液にNaOH(2M)およびNaCl(2M)を加えてそれぞれが20mMとなる最終濃度物を生成し、この混合物を1分間回転し、これを4℃で20,000×gで20分間遠心し、上清を維持することにより、HCVプロテアーゼを含む画分を不溶性物質から単離する。
その後、この部分的に精製されたプロテアーゼを、SDS−PAGEにかけて精製する。このプロテアーゼは、ウエスタンブロット法により同定され得、このバンドはゲルから切り出される。その後、プロテアーゼをこのバンドから溶出し、アミノ酸配列を確認するために分析する。N末端配列は自動アミノ酸シークエンサーを使用して分析され得、C末端配列は一連のトリプシン消化フラグメントの自動アミノ酸シークエンシングにより分析され得る。
(実施例7:酵母発現ベクターの調製)
(A)650(SOD/プロテアーゼ融合物)
このベクターは、5’末端でSODコーディング配列と融合した野生型全長HCVプロテアーゼのコーディング配列を含んでいるHCV配列を有する。2つのフラグメント(クローン11b由来の441bp EcoRI/BglIIフラグメントおよび発現ベクターP500由来の1471bp BglII/EcoRIフラグメント)を、野生型全長HCVプロテアーゼコーディング配列を再構築するために使用する。これらの2つのフラグメントは、pS356ベクターをEcoRIで消化したベクターに連結して、発現カセットを生成した。この発現カセットは、ADH2/GAPDHハイブリッド酵母プロモーター、ヒトSOD、HCVプロテアーゼ、およびGAPDH転写ターミネーターをコードする。得られたベクターを、BamHIで消化し、4052bpフラグメントを単離した。このフラグメントを、pAB24をBamHIで消化したベクターに連結して、p650を生成した。p650は、1990年10月4日公開のWO90/11089の図17に示されるように、アミノ末端から、hSODのアミノ酸1−154、オリゴペプチド−Asn−Leu−Gly−Ile−Arg−、およびHCV−1のアミノ酸819から1458までを含む、ポリプロテインを発現する。
(A)650(SOD/プロテアーゼ融合物)
このベクターは、5’末端でSODコーディング配列と融合した野生型全長HCVプロテアーゼのコーディング配列を含んでいるHCV配列を有する。2つのフラグメント(クローン11b由来の441bp EcoRI/BglIIフラグメントおよび発現ベクターP500由来の1471bp BglII/EcoRIフラグメント)を、野生型全長HCVプロテアーゼコーディング配列を再構築するために使用する。これらの2つのフラグメントは、pS356ベクターをEcoRIで消化したベクターに連結して、発現カセットを生成した。この発現カセットは、ADH2/GAPDHハイブリッド酵母プロモーター、ヒトSOD、HCVプロテアーゼ、およびGAPDH転写ターミネーターをコードする。得られたベクターを、BamHIで消化し、4052bpフラグメントを単離した。このフラグメントを、pAB24をBamHIで消化したベクターに連結して、p650を生成した。p650は、1990年10月4日公開のWO90/11089の図17に示されるように、アミノ末端から、hSODのアミノ酸1−154、オリゴペプチド−Asn−Leu−Gly−Ile−Arg−、およびHCV−1のアミノ酸819から1458までを含む、ポリプロテインを発現する。
クローン11bを、上記実施例3Aに記載のように下記の配列:
を有するハイブリダイゼーションプローブを用いて、HCV cDNA(ATCC受託番号第40394号)のゲノムライブラリーから単離した。この工程もまた、EPO公報第318216号、実施例IV.A.17に記載されている。
pBR322からの誘導体であるベクターpS3EFは、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)の遺伝子の上流にADH2/GAPDHハイブリッド酵母プロモーター、アダプター、および下流に酵母機能性転写ターミネーターを含む。これらのコントロールエレメントおよびスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子を含む同様の発現ベクターは、Cousensら(1987)Gene 61:265、および1986年10月1日に公開された同時係属中の出願EPO196,056に記載されている。しかし、pS3EFは、異種プロインシュリン遺伝子およびイムノグロブリンヒンジを欠失しており、SODのGln154がEcoRI部位を有するアダプター配列に続いている点で、Cousensらのものとは異なっている。このアダプターの配列は:
である。このEcoRI部位は異種配列の挿入を促進し、一度pS3EFに挿入されると、SODが異種配列に結合しているオリゴペプチドを含むSOD融合物が発現する。pS3EFは、pS356が異なるアダプターを有する点を除いてpS356と全く同じである。このアダプターの配列を以下に示す:
pS356(ATCC受託番号第67683号)は、下記に説明されるように寄託される。
プラスミドpAB24は酵母用シャトルベクターであり、pBR322配列、酵母のDNA複製のための完全な2μ配列(Broach(1981):Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces,Vol.1,p.445,Cold Spring Harbor
Pressに記載)、およびEPO公報第116201に記載のプラスミドpC1/1に由来する酵母LEU2d遺伝子を含んでいる。プラスミドpAB24を、部分的な2ミクロン配列を除去するようYEp24をEcoRIで消化し、このベクターに再連結して、構築した。得られたプラスミドであるYEp24デルタRIを、ClaIで直鎖化し、ClaIで直鎖化された完全な2ミクロンプラスミドに連結した。その後、得られたプラスミドであるpCBouをXbaIで消化し、8605bpベクターフラグメントをゲル上で単離した。この単離されたXbaIフラグメントを、pC1/1から単離されたLEU2d遺伝子を含む4460bp XbaIフラグメントと連結した;LEU2d遺伝子の配向は、URA3遺伝子と同じである。
Pressに記載)、およびEPO公報第116201に記載のプラスミドpC1/1に由来する酵母LEU2d遺伝子を含んでいる。プラスミドpAB24を、部分的な2ミクロン配列を除去するようYEp24をEcoRIで消化し、このベクターに再連結して、構築した。得られたプラスミドであるYEp24デルタRIを、ClaIで直鎖化し、ClaIで直鎖化された完全な2ミクロンプラスミドに連結した。その後、得られたプラスミドであるpCBouをXbaIで消化し、8605bpベクターフラグメントをゲル上で単離した。この単離されたXbaIフラグメントを、pC1/1から単離されたLEU2d遺伝子を含む4460bp XbaIフラグメントと連結した;LEU2d遺伝子の配向は、URA3遺伝子と同じである。
S.cerevisae,2150−2−3(pAB24−GAP−env2)(受託番号第20827号)は、下記に説明するようにAmerican Type Culture Collectionに寄託されている。このプラスミドpAB24−GAP−env2は、酵母細胞から周知の技術で回収され得る。GAP−env2発現カセットは、pAB24−GAP−env2をBamHIで消化して除去され得る。pAB24を、このBamHI挿入物を持たないベクターに再連結して回収する。
(実施例8:SOD−プロテアーゼ融合タンパク質の酵母発現)
p650をS.cerevisae株JSC310,Mata,leu2,ura3−52,prb1−1122,pep4−3,prc1−407,cir°:DM15(g418耐性)中に、形質転換した。この形質転換は、Hinnenら(1978)Proc Natl Acad Sci USA 75:1929によって記載されているように行なった。形質転換された細胞を、8%グルコースのura−プレート上で選択した。このプレートを30℃で4−5日間インキュベートした。この形質転換体を、多数のp650プラスミドを推定して、さらに8%グルコースのleu−プレート上で選択した。leu−プレートからのコロニーを、3%グルコースのleu−培地に接種した。この培養物を30℃で2日間振とうし、その後、2%グルコースのYEPD溶媒中に1/20に希釈し、30℃でさらに2日間振とうした。
p650をS.cerevisae株JSC310,Mata,leu2,ura3−52,prb1−1122,pep4−3,prc1−407,cir°:DM15(g418耐性)中に、形質転換した。この形質転換は、Hinnenら(1978)Proc Natl Acad Sci USA 75:1929によって記載されているように行なった。形質転換された細胞を、8%グルコースのura−プレート上で選択した。このプレートを30℃で4−5日間インキュベートした。この形質転換体を、多数のp650プラスミドを推定して、さらに8%グルコースのleu−プレート上で選択した。leu−プレートからのコロニーを、3%グルコースのleu−培地に接種した。この培養物を30℃で2日間振とうし、その後、2%グルコースのYEPD溶媒中に1/20に希釈し、30℃でさらに2日間振とうした。
S.cerevisae JSC310は、1989年11月8日公開のEPO公報第340986号に記載のDM15 DNAを含む。このDM15 DNAは、異種タンパク質のADH2統制発現を強化する。pDM15(受託番号第40453号)は、下記に説明されるようにAmerican Type Culture Collectionに寄託されている。
(実施例9:成熟HCVプロテアーゼの酵母ユビキチン発現)
成熟HCVプロテアーゼを、ベクターC7fC20cC300C200をEcoRIで開裂して2Kbコーディング配列を得、ここに参考として援用されている1988年4月7日公開のWO88/02406または1989年8月7日出願のUSSN 7/390,599に記載のように、適切なリンカーを用いて、この配列をユビキチン発現ベクターに挿入することにより、調製する。成熟HCVプロテアーゼを、適切な宿主、特に酵母中のベクターでの発現により回収する。特に、実施例8に記載の酵母発現プロトコールを、ユビキチン/HCVプロテアーゼベクターを発現するために使用する。
成熟HCVプロテアーゼを、ベクターC7fC20cC300C200をEcoRIで開裂して2Kbコーディング配列を得、ここに参考として援用されている1988年4月7日公開のWO88/02406または1989年8月7日出願のUSSN 7/390,599に記載のように、適切なリンカーを用いて、この配列をユビキチン発現ベクターに挿入することにより、調製する。成熟HCVプロテアーゼを、適切な宿主、特に酵母中のベクターでの発現により回収する。特に、実施例8に記載の酵母発現プロトコールを、ユビキチン/HCVプロテアーゼベクターを発現するために使用する。
(実施例10:インビトロ発現ベクターの調製)
(A)pGEM(登録商標)−3Z/黄熱病リーダーベクター
4つの合成DNAフラグメントをアニールし、連結して**EcoRI/SacI黄熱病リーダーをつくり、Promega(登録商標)からのEcoRI/SacI消化したpGEM(登録商標)−3Zベクターに連結した。この4つのフラグメントの配列を以下に挙げる:
(A)pGEM(登録商標)−3Z/黄熱病リーダーベクター
4つの合成DNAフラグメントをアニールし、連結して**EcoRI/SacI黄熱病リーダーをつくり、Promega(登録商標)からのEcoRI/SacI消化したpGEM(登録商標)−3Zベクターに連結した。この4つのフラグメントの配列を以下に挙げる:
HCVプロテアーゼのインビトロ翻訳のために、新しいpGEM(登録商標)−3Z黄熱病リーダーベクターを、BamHIで消化し、クレノウで平滑にした。
(B)p6000からのPvuII構築物
クローンp6000を、ATCC受託番号第40394号であるHCV cDNAのゲノムライブラリーから入手可能な配列から構築した。p6000のDNA配列をコードするHCVは、1990年10月4日公開のWO90/11089の図17のヌクレオチド−275からヌクレオチド6372と同一である。p6000をPvuIIで消化して、この消化物から2,864bpフラグメントを単離した。この2,864bpフラグメントを、上記のように、調製されたpGEM(登録商標)−3Z黄熱病リーダーベクターフラグメントに連結した。
クローンp6000を、ATCC受託番号第40394号であるHCV cDNAのゲノムライブラリーから入手可能な配列から構築した。p6000のDNA配列をコードするHCVは、1990年10月4日公開のWO90/11089の図17のヌクレオチド−275からヌクレオチド6372と同一である。p6000をPvuIIで消化して、この消化物から2,864bpフラグメントを単離した。この2,864bpフラグメントを、上記のように、調製されたpGEM(登録商標)−3Z黄熱病リーダーベクターフラグメントに連結した。
(実施例11:HCVプロテアーゼのインビトロ発現)
(A)転写
pGEM(登録商標)−3Z/黄熱病リーダー/PvuIIベクターを、XbaIで直鎖化し、PromegaのRiboprobe(登録商標)Gemini II Coreシステムからの材料およびプロトコールを用いて転写した。
(A)転写
pGEM(登録商標)−3Z/黄熱病リーダー/PvuIIベクターを、XbaIで直鎖化し、PromegaのRiboprobe(登録商標)Gemini II Coreシステムからの材料およびプロトコールを用いて転写した。
(B)翻訳
上記のプロトコールにより生成されたRNAを、Promegaのウサギ網状赤血球溶解産物、マイナスメチオニン、イヌ膵臓ミクロソーム膜、および他の必要な材料およびPromegaからの指示に基づいて翻訳した。
上記のプロトコールにより生成されたRNAを、Promegaのウサギ網状赤血球溶解産物、マイナスメチオニン、イヌ膵臓ミクロソーム膜、および他の必要な材料およびPromegaからの指示に基づいて翻訳した。
(寄託された生物体:)
下記の物質を、メリーランド州、ロックビル、パークローンドライブ12301のAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託した:
下記の物質を、メリーランド州、ロックビル、パークローンドライブ12301のAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託した:
上記の生物体は、示された受託番号でATCCに寄託されている。これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下で維持される。これらの寄託物は、当業者の利用のために提供され、米国特許法第112条で要求されているものではない。寄託された生物体内に維持されるポリヌクレオチド配列、およびこれによりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列は、ここに参考のために援用されており、ここに記載されている配列に関するいかなる争議の事態も規制する。この寄託された生物体の製造、使用、または販売には、ライセンスが必要であり、いかなるそのようなライセンスもここでは与えられない。
C型肝炎ウイルスにおいてポリタンパク質をプロセシングするのに必要なプロテアーゼを、同定し、クローニングし、発現させる。特定のポリペプチドの開裂、およびHCVに特異的な抗ウイルス剤のアッセイおよび設計に有用な、プロテアーゼ、切り形プロテアーゼおよび改変プロテアーゼを開示する。
本発明の組換えHCVプロテアーゼ、HCVプロテアーゼ融合タンパク質、切り形および改変されたHCVプロテアーゼ、クローニングおよびそのための発現ベクター、およびHCV治療に効果的な抗ウイルス剤を同定する方法により、HCV感染の効果的な治療に役立つ。
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