PL168353B1 - Sposób wytwarzania zatezonego, standaryzowanego ludzkiego c z y n n i k a von Willebranda o wysokiej czystosci PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents
Sposób wytwarzania zatezonego, standaryzowanego ludzkiego c z y n n i k a von Willebranda o wysokiej czystosci PL PL PL PL PL PL PLInfo
- Publication number
- PL168353B1 PL168353B1 PL92293738A PL29373892A PL168353B1 PL 168353 B1 PL168353 B1 PL 168353B1 PL 92293738 A PL92293738 A PL 92293738A PL 29373892 A PL29373892 A PL 29373892A PL 168353 B1 PL168353 B1 PL 168353B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- vwf
- chromatography
- factor
- fraction
- column
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 101000782195 Homo sapiens von Willebrand factor Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 229940034998 human von willebrand factor Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 claims description 74
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 claims description 73
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 22
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 10
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 4
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 claims description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 3
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 claims description 3
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical group CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 18
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 abstract description 12
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 abstract description 3
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 24
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 24
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 23
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 22
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 9
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 7
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 5
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- 239000012541 Fractogel® Substances 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- -1 diethylaminoethyl groups Chemical group 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IKCLCGXPQILATA-UHFFFAOYSA-N 2-chlorobenzoic acid Chemical group OC(=O)C1=CC=CC=C1Cl IKCLCGXPQILATA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010080865 Factor XII Proteins 0.000 description 1
- 102000000429 Factor XII Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 108010081391 Ristocetin Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- GQPVFBDWIUVLHG-UHFFFAOYSA-N [2,2-bis(hydroxymethyl)-3-(2-methylprop-2-enoyloxy)propyl] 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC(CO)(CO)COC(=O)C(C)=C GQPVFBDWIUVLHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N chembl1095986 Chemical compound C1[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]1C(N[C@H](C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3C=4C=C(C(=C(O)C=4)C)OC=4C(O)=CC=C(C=4)[C@@H](N)C(=O)N[C@@H](C(=O)N3)[C@H](O)C=3C=CC(O4)=CC=3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1)=CC=C1OC1=C(O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]5[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O5)O)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C4=CC2=C1 BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N glycidyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC1CO1 VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229950004257 ristocetin Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000002885 thrombogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001026 thromboplastic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania zatezonego, standaryzowanego ludzkiego czynnika von Willebranda o wysokiej czystosci, wzbogaconego w multimery o wysokiej, masie czaste- czkowej, znamienny tym, ze krioprecypitowana frakcje osocza poddaje sie trzem kolejnym etapom chromatografii, przy czym w pierwszych dwóch etapach stosuje sie chromatografie jonowymienna na zywicy z polimeru winylowego o duzych porach z przylaczonymi grupami DEAE, a w trzecim etapie stosuje sie chromatografie powino- wactwa na zelu zelatyna-sefaroza. PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zaSężnnegn, standaryzowanego ludzkiego czynnika von W^^bran^ o wysokiej czystości. Produkt wytworzony sposobem według wynalazku cechuje bardzo wysoka aktywność właściwa i wysoka zawartość sulStsdrów o wysokiej masie cząsteczkowej. Jest on szczególnie przydatny do użycia terapeutycznego.
Czynnik von W^^bran^ /vWF/ jest największą znaną cząsteczką krążącą w osoczu. Występuje on jako zespół połączonych mostkami łousiαrozknwysi sulStsdrów, których pnłjełnnstaa podstawowa ma masę cząsteczkową około 260 kilzdaltonóo /kDa/. Najmniejszą pztSαcin vWF w osoczu jest dimer o masie około 440-500 kDa, a największą są sulSisdry dimeru o masie ccntteockooee osiągającej 20 milionów łalSoiów. Zespoły połączonych ze sobą pzłeełnzsSdk mogą być komórkowo swoiste, vWF ulega syntezie i polimeryzacji w segakarizcySach i komórkach nabłonka.
Czynnik ten odgrywa ważną rolę w homeostazie organizmu dzięki dwóm ważnym funkcjom: transportuje on i stabilizuje we krwi czynnik VIII i jako białko przylepne, pozwala on na pokrycie, przyczepienia się i agregację płytek krwi na tkance pzłśródbłznkzoee naczyń, b^rąc w ten sposób udział w szybkim gojeniu się uszkodzonych naczyń.
Wrodzony niedobór vWF lub strukturalne anomalie tego czynnika powodują rozwój choroby von Wtllebraida, która początkowo przyjmuje postać krwotoków, szczególnie skórnych i błon śluzowych. Kliiiccna postać tej choroby jest bardzo różnorodna i stwarza wiele problemów w chirurgii. Leczenie choroby von Willebranda jest niezbędna do przywrócenia pierwotnej homeostazy organizmu /czasu krwawienia/ i anomalii krzepnięcia /aktywowanego czasu keaaliizoegz i aktywności czynnika VIII/.
168 353
Chorobę leczy się w terapii zastępczej pochodnymi plazmy wzbogaconymi w ludzki vWF /na przykład, krioprecypitowaną frakcję osocza lub zatęZonym czynnikiem VIII zawierającym odpowiednią ilość vWF/. Jednakże te produkty nie są standaryzowane do celów leczenia choroby von Willebranda. Ponadto, istnieje ryzyko zanieczyszczenia wirusami słabo oczyszczonych frakcji osocza krwi, szczególnie krioprecypitatów, ponieważ często nie poddaje się ich żadnemu skutecznemu etapowi inaktywacji wirusów. Co więcej, zawierają one nadmiar zanieczyszczających białek, niepotrzebnych pacjentowi, które mogą wywołać reakcje immunologiczne po wielokrotnych wstrzyknięciach.
Oczyszczony czynnik VIII, można poddać wydajnemu procesowi inaktywacji wirusów, ale sposób jego oczyszczania jest optymalny do leczenia pacjentów z hemofilią A, a nie dla pacjentów z niedoborem czynnika vWF. Rzeczywiście, udoskonalone ostatnio i coraz wydajniejsze sposoby oczyszczania czynnika VIII, takie jak, oczyszczanie z zastosowaniem immunopowinowactwa lub jonowymienne, dają koncentraty, które nie zawierają wystarczająco dużo vWF, aby mogły być skuteczne do leczenia choroby von Willebranda.
W celu umożliwienia efektywnego leczenia choroby von Willebranda opracowano nowy, przemysłowy sposób oczyszczania vWF, dający możliwość ciągłej izolacji innych cząsteczek z osocza. Szczególnie pozwala on na otrzymanie zatężonego czynnika VIII w jednym etapie /według sposobu opisanego w Europejskim zgłoszeniu patentowym Nr EP 0 359 593/ i odzyskanie oddzielnej frakcji vWF z tej samej porcji krioprecypitatu, tak więc sposób ten pozwala na optymalne wykorzystanie ludzkiego osocza. Otrzymaną frakcję vWF oczyszcza się chromatograficznie w dwóch dodatkowych etapach, w których otrzymuje się zatężony vWF o bardzo wysokiej czystości.
Złożoność cząsteczki vWF czyni ją bardzo trudną do oczyszczenia. Sposoby oczyszczani a na małą skalę, to znaczy, 5 do 0000 mi do celów badań anaalttcznych zosttay wwcześiej ooissne /Thorell i wsp. , Thromb. Res. 1984, 35: 431-450/, ale nie znaleziono możliwości przystosowania tych sposobów do otrzymywania vWF na skalę przemysłową. Ponadto nie była tam rozważana idea jak najlepszego wykorzystania krioprecypitatu przez jednoczesne wytwarzanie vWF i czynnika VIII.
vWF oczyszcza się przez rozpuszczanie różnicujące w związkach siarczanowych w obecności glicyny /Berntorp i wsp., Vox Sang. 1989, 56: 112/, w związkach siarczanowych /Winkelman i wsp., Vox Sang. 1989, 57: 97/ i przy użyciu różnych sposobów rozdzielania chromatograficznego, takich jak, wyłączanie cząsteczek o określonej wielkości /Perret i wsp., CadtoαStsis 8484, 14: 189/ i chromatografia jonowymienna /Austen i wsp., Thrombi Haemostat. 1981, 48: 195/. Jednak że, te sposoby dają małą wydajność dτrzymywayia vWF, lub małą zdolność do tworzenia żelu, lub uniemożliwiają jednoczesne izolowanie czynnika VIII i vWF, co czyni je mniej przydatnymi do zastosowania w przemyśle.
Ponadto, Berntorp i wsp., /Vox Sang. 1989, 56: 111/ otrzymują vWF o niskiej czystości: 45 jednostek Ag/mg białka /str. 113, natomiast sposobem według wynalazku otrzymuje się 105 jednostek Ag/mg białka. Podobnie Winkelman i wsp., /Vox Sang 1989, 57: 97/ otrzymują 10 jednostek Ag/mg białka /str. 101/.
Perret i wsp., /Haemostasis 1984, 14: 189/ stosują etap defiarcnacji /w celu wyeliminowania fibryndgeyu jako cząsteczek fibryny/ przy użyciu wapnia, a także enzymów z jadu węża. Czyni to preparaty zupełnie nieprzydatnymi do celów terapeutycznych. Ponadto, stosowany przez nich system filtracji na żelu jest trudny do użycia na skalę p^zem^łow, ppoytcad ppozaal m prrdkość przepływu tylko 10 cm/godzinę lub mniej i wykazuje duże prawdopodobieństwo zatykania, szczególnie w obecności fibrynogenu lub fibronektyny. Ponadto, wiadomo, że wskaźnik oczyszczenia jest przeważnie niski z powodu złego rozdzielania białek w tym układzie chromatograficznym.
Austen, i wsp., /Thn^omb. Had^slas. 19t^^, 48: 46/ także otrzymują koncentrat o niskiej czystości /8 jednostek Ag/mg białka/ i ze stosunkowo niską wydajnością, prawdopodobnie z powodu drastycznych warunków chromatografii /pH 5,5/.
Harrison i wsp., /Thromb. Res. 1988, 50: 195/ stosują podłoże dextrαy-ttαrcnαn scfardny w charakterze podłóż do chromatografii, podłoże to ma małą zdolność zatrzymywania vWF. W rezultacie otrzymują oni preparat vWF o niskiej aktywności włłaśiieć : 21- jeedydtkitmg baidya /str. 301/.
Większość z tych produktów zawiera raczej dużą ilość zacnaturdłayej lub nieaktywnej postaci vWF, na co wskazuje stosunek aktywności kofaktora rystocetyny /RCo/ /antygen wynoszący od 0,08 do 0,8 /Lawrie i wsp., Br. J. Haemdtol. 1989, 73: 100/. Czyni to je mniej wydajnymi w
168 353 leczeniu choroby von Willebranda. Natomiast sposób według wynalazku pozwala uzyskać vWF o stosunku RCo/antygen wyższym od jedności, który jest porównywalny z natywnym vWF z normalnego osocza.
Opis figur rysunku. Figura 1. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z SOS /SDS-PAGE/ oczyszczonych frakcji vWF. Linia 1: krioprecypitat, linia 2: krioprecypitat traktowany SD, linia 3: niezwiązana frakcja z chromatografii na DEAE-Fractogel, linia 4: pierwszy eluat z vWF, linia 5: drugi eluat z vWF, linia 6: niezwiązana frakcja żelatynowa, linia 7: standardy. Fbn = fibronektyna, IgG = immunoglobulina, Alb = albumina.
Figura 2. Rozmieszczenie multimerów we frakcjach oczyszczania vWF. Linia 1: normalne osocze, linia 2: krioprecypitat, linia 3: krioprecypitat traktowany SD, linia 4: niezwiązana frakcja z chromatografii na DEAE-Fractogel, linia 5: pierwszy eluat z vWF, linia 6: drugi eluat z vWF. linia 7: niezwiązana frakcja żelatynowa.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zatężonego standaryzowanego ludzkiego czynnika von Willebranda o wysokiej czystości, wzbogaconego w multimery o wysokiej masie cząsteczkowej, polegający na tym, że krioprecypitowaną frakcję osocza poddaje się trzem kolejnym etapom /chromatografii/, przy czym w pierwszych dwóch etapach stosuje się chromatografię jonowymienną na żywicy z polimeru winylowego o dużych porach z przyłączonymi grupami DEAE, a w trzecim etapie stosuje się chromatografię powinowactwa na żelu żelatyna-sefaroza.
Przemysłowy sposób według wynalazku pozwala na otrzymanie zatężonego ludzkiego czynnika von Willebranda do użycia terapeutycznego, jako produktu ubocznego w procesie wytwarzania czynnika VIII o wysokiej czystości i umożliwia standaryzację porcji o wysokiej zawartości multimerów o dużej masie cząsteczkowej, przy czym w sposobie według wynalazku stosuje się bardzo duże objętości plazmy /4OOO litrów lub więcej/ i osiąga się optymalne wykorzystanie krioprecypitatu.
Bardziej szczegółowo, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zatężonego vWF, w którym stosuje się trzy kolejne etapy chromatografii, co pozwala na wzbogacenie frakcji w multimery o wysokiej masie cząsteczkowej, od których zależy aktywność biologiczna vWF. Materiałem wyjściowym jest krioprecypitat ludzkiego osocza, poddany tradycyjnym etapom oczyszczania, włączając adsorpcję na wodorotlenku glinowym.
Materiał ten poddaje się przed oczyszczaniem procesowi inaktywacji wirusów, na przykład, działając rozpuszczalnikiem i detergentem.
Tak więc sposób według wynalazku obejmuje zastosowanie trzech kolejnych etapów chromatograficznych, którym poddaje się produkt uboczny procesu wytwarzania czynnika VIII, z których pierwsze dwa wykorzystują chromatografię jonowymienną, a trzeci chromatografię powinowactwa.
Dwa etapy chromatografii jonowymiennej prowadzi się na tym samym podłożu z polimeru winylowego, który ma przyłączone grupy dwuetyloaminoetylowe /DEAE/, na kolumnach DEAE-Fractogel TSK 650 /Merck/, zrównoważonych buforem zawierającym O,01 M cytrynian trójsodowy, 0,11 M chlorek sodowy, 0,001 M chlorek wapniowy, 0,12 M >glicynę i 0,016 M lizynę, pH 7.
DEAE-Fractogel ® TSK 650 jest syntetycznym, hydrofilowym podłożem żelowym. Jego podstawę stanowi kopolimer oligoetylenoglikolu, glicydylometakrylanu i pentaerytrytodwumetakrylanu, do którego przyłączone sa gruDy dwuetyloaminoetylowe, to znaczy, -O-Ch2-CH~2+ /C„ H HCL, co daje lekko , , , „ , „ TSK 650 jest dostępny w dwóch wielkościach cząsteczek /po namoczeniu w wodzie/: Typ S /O,O 25-0,050 mm/ i typ M /0,045-0,090 mm/. Oba typy są przydatne do prowadzenia sposobu według wynalazku.
Krioprecypitowaną frakcję osocza, wstępnie oczyszczoną i poddaną procesowi inaktywacji wirusów według tradycyjnych metod, podaje się na pierwszą kolumnę chromatograficzną, która zatrzymuje większą część vWF. Następnie vWF eluuje się buforem o zwiększonym do 0,14-0,15 M stężeniu chlorku sodowego.
Tak wyeluowaną frakcję, wzbogaconą w vWF, podaje się na drugą kolumnę chromatograficzną w takich samych warunkach, jak w przypadku pierwszej. Ponieważ wiele białek /szczególnie czynnik VIII i fibronektyna/, które współzawodniczą o miejsca adsorpcji zostało już usuniętych z tej frakcji w pierwszym etapie chromatografii, zdolność adsorbcji vWF drugiej kolumny jest dużo większa. Po usunięciu filtratu i przemyciu kolumny buforem równoważącym, zaadsorbowany vWF eluuje się zwiększonym do 0,15-0,17 M stężeniem chlorku sodowego w buforze. Dzięki wspaniałej pojemności
168 353 i wydajności żywicy DEAE-Fractogel Θ. z kolumny mnana wymyć fWF o barOzo dujej aktnoncści /> 150 jednostek RCo/ml/. W tun sposób modna uniknąć mechanicznego nacisku związanego r ultrafiltracją, niezbędną do zatężenia produktu.
Wyeluowaną frakcję poddaje się chromatografii powinowactwa na żelu pochodnym żelatyny w tym samym buforze równoważącym, tak więc unika się etapu dializy lub ultrafiltracji w celu zmiany składu soli. Kolumna ta jest niezbędna do zatrzymania fibronektyny, która ciągle zanieczyszcza vWF. Wybór pochodnego żelatyny żelu nie jest najważniejszy, jednakże, odpowiednie do prowadzenia sposobu według wynalazku są Gelatiu-SephaΓose, Gelatin-Ultragel® , Gelatiu-Spheroaex Gela tin-Fractogel ® . Najkorzystniej stosuje się Gelatiu-Supharosu, ponieważ zatrzymuje on w warunkach stosowanych w sposobie według wynalazku, 5 do 10 mg fibronektyny/ml żelu.
W takich warunkach wysoko oczyszczony vWF nie wiąże się z żelem i eluuje w filtracie. Ponieważ etap chromatografii powinowactwa na żelatynie nie wywołuje znacznego rozcieńczenia frakcji vWF, produkt można natychmiast rozdzielać, bez potrzeby stosowania etapu zatężenia, na przykład, ultrafiltracji. Brak enzymów proteolitycznych w produkcie końcowym, czyni go bardzo trwałym w trakcie sterylizowania przez filtrację i podczas liofilizacji, bez potrzeby dodawania związków stabilizujących.
Zatężony czynnik von Willebranda uzyskany sposobem według wynalazku ma wyjątkowo wysoki współczynnik czystości, większy niż llOOfO-krotny w stosunku do wyjściowego osocza, a jego aktywność właściwa wynosi 345 jednostek CBA/mg białka /jednostki dla pomiaru aktywności wiązania kolagenu/ i więcej niż 100 jednostek RCo/mg białka /jednostki dla pomiaru aktywności kofaktora rystocetyny/. Udział poszczególnych etapów chromatografii w oczyszczaniu vWF przedstawiono 'na fig. 1.
Poprawę jakości produktu w czasie kolejnych etapów oczyszczania kontroluje się jako funkcję zawartości multimerów o wysokiej masie cząsteczkowej /formy cząsteczkowe vWF mające wysoką aktywność biologiczną/, oznaczonej elektroforetycznie.
Taka analiza wykazała wzrastające wzbogacenie w multimery JZ 4 /fig. 1/, co stanowi 79% polimerów vWF, chociaż połowa została wyeliminowana przez krioprecypitację. Nieoczekiwanie okazało się, że chromatografia na kolumnie DEAE-Fractogel ® TSK 650 faworyzuje selektywne zatrzymywanie bardzo dużych multimerów i eliminuje formy o małej wielkości, nienormalnej strukturze /takie, które uległy częściowej proteolize//, i o niskiej aktywności.
Standardowy koncentrat vWF o wysokiej czystości, wysokiej aktywności właściwej i wysokiej zawartości multimerów o dużej masie cząsteczkowej wytworzony sposobem według wynalazku jest szczególnie przydatny do leczenia różnych postaci choroby von Willebranda, jak to potwierdziły wstępne badania kliniczne.
Wstępne testy kliniczne wykazały, że taki koncentrat daje wyraźne skrócenie czasu krwawienia w czasie krwotoków.
Testy in vitro potwierdziły, że jego biochemiczne i fizjologiczne właściwości są identyczne jak właściwości natywnej cząsteczki, a zwłaszcza takie właściwości jak jego zdolność do unieruchamiania płytek krwi w urządzeniu do perfuzji i jego zdolności do wiązania in vivo endogennego czynnika VIII.
Dzięki swojej wysokiej czystości, vWF wytworzony sposobem według wynalazku można brać pod uwagę w różnych zastosowaniach laboratoryjnych /subtelnej analizie strukturalnej, badaniach funkcyjności, diagnostyce i tak dalej/ i do wytwarzania swoistych przeciwciał.
Koncentratu wytworzonego sposobem według wynalazku można użyć także jako stabilizatora w czasie wytwarzania czynnika VIII przez komórki transformowane metodą inżynierii genetycznej, a także w czasie oczyszczania czynnika VIII tak wytworzonego.
Następujący przykład ilustruje jeden z korzystnych sposobów wykonania sposobu według wynalazku bez ograniczenia jego zakresu.
Przykłd.. Materiał wyjściowy. Krioprecypitat wytworzono ze świeżego osocza zebranego w obecności roztworu antykoagulanta w postaci cytrynianu sodowego /4%/ lub CPD /cytrynian, fosforan, dekstroza/ przez zamrożenie, najczęściej na 6 godzin po otrzymaniu. Plazmę zamrożono głęboko do temperatury -6O°C i przechowywano w temperaturze -35°C. Porcja plazmy zawierała od 1800 do 2000 litrów, które dia potrzeb sposobu według wynalazku zbierano w porcje 4000-litrowe. W celu rozmrożenia, ' laniuę lmUszϋczono n a 12 odzziπ w oornorze z eeuulowaną UlmueaatuΓą dla
168 353 zapewnienia powolnego, stałego podgrzewania do temperatury -7°C, następnie rozmrażano w kontrolowanej termostatowo osłonie do temperatury 0° do 2°C, stale mieszając. Krioprecypitat /który stanowi około 9 g/litr plazmy/ oddzielono przez wirowanie w obniżonej temperaturze.
Po wirowaniu, odzyskany krioprecypitat rozpuszczono i poddano adsorbcji na wodorotlenku glinowym w celu usunięcia zanieczyszczeń, na przykład, składników kompleksu protrombiny /szczególnie czynnika VII/ i czynnika XII. Następnie nadsącz oziębiono do temperatury 15°C, przez co częściowo usunięto fibrynogen i fibronektynę/. Takie traktowanie pozwoliło odzyskać z krioprecypitatu 80 do 86% mieszaniny czynnik VIII/vWF, aktywność właściwa czynnika VIII stanowiła 0,7 jednostek/mg a aktywność właściwa vWF 0,6 RCo/mg /aktywność kofaktora rystocetyny/ i 1,2 jednostek CBA/mg /aktywność wiązania kolagenu/.
Inaktywacja wirusów. Roztwór zawierający mieszaninę czynnik VIII/vWF poddano działaniu rozpuszczalnika/detergentu, znanemu ze swojej skuteczność i w niszczenLu lipidowej otoczki wirusowej /Horowitz i wsp., TTaiisfusion, 1185, 22: 551/, ppprzez innubowanie w cżąąg 8 goCznn w temperaturze 25°C w obecności 0,3% roztworu fosforanu tri-n-butylu /TnBP/ i 1% roztworu Tweenu 80.
Po takim traktowaniu odzyskano 85% aktywności czynnika VIII i vWF, zmierzonej w poprzednim etapie. Dla potwierdzenia, że vWF znajduje się ciągle w formie mul0imeryczneW można użyć elektroforezy.
Etap rozdzielania chromatograficznego. Etap oczyszczania vWF oparto na sposobie oczyszczania czynnika VIII opisanego w Europejskim zgłoszeniu patentowym Nr EP 0358583.
Pierwszą chromatografię prowadzono na Loldlnie LEAEAE-Fctogel ® flt L56 L^yp S lub M /Merck/. Bufor równoważący kolumnę zawierał cytrynian trójsodowy /0,01 M/, chlorek wapniowy /0,001 M/, glicynę /0,12 M/, L-lizynę /0,016 M/ i chlorek sodowy /0,11 M/. Kolumna zatrzymywała vWF , czynnik VIII i fibctnektynę, a zaniezzysnznające białka /głównie fibryetgen i niektóre IgG/ słabo związane lub wcale niezwiązane oraz związki ieak0ywbWąze wirusy wyeluowano dzięki kilku kolejnym przemywaniom tym samym buforem.
Elucję prowadzono przy szybkości przepływu 100 cm/godzinę. W tych warunkach, używana kolumna miała zdolność zatrzymania około 75¾ wstrzykniętej objętości /mierzonej jako antygeL, Ag/, pozostałą część tracono w filtracie. Taka zdolność wiązania odpowiada 45 jednostkom vWF Ag/ml żelu. Zaadsorbowany vWF wyeluowano z kolumny buforem o zwiększonym do 0,15 M stężeniu chlorku sodowego. Zebrana frakcja vWF zawierała od 30 do 35% początkowego vWF, podczas gdy 40% pozostało zaadsorbowane razem z czynnikiem VIII, i wyeluowano przy drugim zwiększeniu stężenia NaCl w buforze, do 0,25 M, a następnie razem oczyszczono. Frakcję zawierającą vWF, wyeluowaną z pierwszej kolumny podano na drugą identyczną kolumnę, po lekkim rozcieńzneeib buforem do równoważenia, w celu obniżenia siły jonowej frakcji vWF poniżej siły jonowej 0,11 M chlorku sodowego.
Ponieważ zanieczyszczenia i czynnik VIII, które współzawodniczą o miejsca adsorpcji na pierwszej kolumnie zostały usunięte w pierwszym etapie chromatografii, zdolność wiązania drugiej kolumny jest dużo większa: 320 jednostek vWF Ag/ml żelu.
Zaadsorbowany vWF wyeluowano z kolumny buforem o zwiększonym do 0,17 M stężeniu chlorku sodowego.
Druga chromatografia dała współczynnik zatężenia 8 do 10 razy większy niż pierwsza, co wyeliminowało konieczność dodatkowego zatężania przez, na przykład, ultcαfiltrację. Przy użyciu standardowych technik, stwierdzono, że eltLt zawćerLł πastęwuZeLθ ilości lub aktywności vWF.
-Antygen /Ag/ 88 ± 9 jednostek/mj
- ^faktor rystocetyny /RCo/ °7 ± 1-19 jednostek/mj
- aktywność wiązania kolagenu CB8// 144 ± 13 jednostek/ml
- multimery o wysokiej masie cząsteczkowej / multimerów/
Jednostki CBA /aktywność wiązania kolagenu/ określono testem ELISA tak, jak opisał Brown i Bosak /Thromb. Res. 1986, 43: 303/. W celu wyrażenia wartości CBA w jednostkach międzynarodowych, jako wzorca użyto standardowego osocza, kalibrowanego według-.2nd British Standard /86/717/.
Stosunek CBA/Ag wynoszący 1,69 wskazuje, że aktywność vWF została dobrze zachowana. Jest to w zgodzie z wysokim procentem multimerów o wysokiej masie cząsteczkowej /79%/ i jest porównywalne z natywnym vWF /70%/ z osocza.
160 353
Analiza elektroforetyczna takiego eluatu vWF wykazała niewielkie zanieczyszczenie fibronektyną i inhibitorami inter-alfa trypsyny i proteazy seryny.
Następnie drugi eluat, w celu wyeliminowania fibronektyny, poddano trzeciemu etapowi oczyszczania na kolumnie Gelatin-Sepharose CL4B /Pharmacia/ zrównoważonej takim buforem jak poprzednia kolumna.
Żel do chromatografii powinowactwa ma zdolność zatrzymywania fibronektyny wynoszącą więcej niż 5 mg/ml, co umożliwia zmniejszenie stężenia tego zanieczyszczenia we frakcji vWF poniżej granicy wykrywania /<T4 mg/1/.
vWF oczyszczony sposobem według wynalazku zbiera się w filtracie z tego etapu i można go odrazu rozlewać i liofilizować.
Analiza elektroforetyczna produktu końcowego nie wykazała jakichkolwiek zanieczyszczeń. Zawartość vWF wynosiła 205 jednostek Ag/ml białka, a aktywność właściwa 345 jednostek CBA/mg białka i 106-220 jednostek RCo/mg białka.
Całkowity współczynnik oczyszczania w stosunku do wyjściowego osocza wynosił więcej niż 10000 razy.
Analiza elektroforetyczna /SDS-agaroza i skanning prążków/ wykazała, że VWF otrzymany takim sposobem oczyszczania składa się w 65 do 00% z multimerów o dużej masie cząsteczkowej, to znaczy w proporcji porównywalnej z wyjściowym osoczem, dla którego zawartość multimerów wynosi 70%.
Trwałość koncentratu badano w postaci ciekłej, w temperaturze pokojowej w ciągu 24 godzin i nie stwierdzono żadnej zauważalnej aktywności proteolitycznej, ani zmian aktywności właściwej.
Brak aktywności wywoływania tworzenia skrzeplin koncentratu sprawdzono tradycyjnymi testami, takimi jak, częściowy, nieaktywowany czas tromboplastyczny. Nie wykryto trombiny, PKA i kalikreiny.
Nie trzeba więc dodawać do końcowego koncentratu vWF żadnych związków stabilizujących.
Zaprojektowanie sposobu oczyszczania, specjalnie pod kątem uzyskania vWF, jako produktu ubocznego w procesie otrzymywania czynnika VIII daje, po raz pierwszy, możliwość wytworzenia koncentratu o wysokiej czystości i bardzo wydajnego w leczeniu choroby von Willebranda.
168 353 1 »Μ« « | 1 »ΠίΙ I |
Fig. 2
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł
Claims (7)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania zatężonego, standaryzowanego ludzkiego czynnika von Willebranda o wysokiej czystości, wzbogaconego w multimery o wysokiej masie cząsteczkowej, znamienny tym, że krioprecypitowaną frakcję osocza poddaje się trzem kolejnym etapom chromatografii, przy czym w pierwszych dwóch etapach stosuje się chromatografię jonowymienną na żywicy z polimeru winylowego o dużych porach z przyłączonymi grupami DEAE, a w trzecim etapie stosuje się chromatografię powinowactwa na żelu żelatyna-sefaroza.
- 2. SSpoób wedłuu zzsttz. 1, znamienny tyra, że jako materiał wyjściowy stosuje się krioprecypitowaną raaceją ssocza, ssępniee ocysszczoną aa wddrrotdekku giinowym.
- 3. Sposób wwtiług astrzz. 1, znamienny ty m, że w póezwseym d druąie etepie stosuje się żywicę jonowymienną DtAE-FrαoSngel w TSK 650, zrównoważoną roztworem buforu zawierającym 0,01 M cytrynian trójsodowy, 0,11 M chlorek sodowy, 0,001 M chlorek wapniowy, 0,12 M glicynę i 0,016 M L-lizynę.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wstępnie oczyszczoną kriopreoypiSowαią frakcję osocza podaje się na pierwszą kolumnę chromatografii jonowymiennej, a pierwszą frakcję zawierającą czynnik von Willebranda eluuje się buforem o zwiększonym do 0,14-0,15 M stężeniu chlorku sodowego.
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że eluat zawierający frakcję czynnika von Willdbrαnłα z pierwszej chromatografii podaje się na drugą kolumnę chromatografii jonowymiennej, a czynnik von Willebranda eluuje się buforem o zwiększonym do 0,15-0,17 M stężeniu chlorku sodowego.
- 6. Sposób wweług zza-trz. 1, znamienny tym, Ze z drugijj chromatografi i poddaje się chromatografii na żdlatynie-seaaΓozie, zrównoważonej buforem elucyjnym z poprzedniego etapu chromatografii uzyskując selektywną adsorpcję pozostałej atbrnnektyny na kolumnie.
- 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zbiera się czynnik von Willebranda obecny w filtracie z kolumny żelatyna-sefaroza, rozlewa się, zamraża i wysusza.* * *
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9102804A FR2673632A1 (fr) | 1991-03-08 | 1991-03-08 | Procede de preparation de concentre de facteur von willebrand humain de tres haute purete, approprie a un usage therapeutique. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL293738A1 PL293738A1 (en) | 1992-09-21 |
| PL168353B1 true PL168353B1 (pl) | 1996-02-29 |
Family
ID=9410505
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL92293738A PL168353B1 (pl) | 1991-03-08 | 1992-03-06 | Sposób wytwarzania zatezonego, standaryzowanego ludzkiego c z y n n i k a von Willebranda o wysokiej czystosci PL PL PL PL PL PL PL |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5408039A (pl) |
| EP (1) | EP0503991B1 (pl) |
| JP (1) | JP3435668B2 (pl) |
| AT (1) | AT407115B (pl) |
| AU (1) | AU645172B2 (pl) |
| BE (1) | BE1004178A3 (pl) |
| BR (1) | BR9200770A (pl) |
| CA (1) | CA2062340C (pl) |
| CZ (1) | CZ283633B6 (pl) |
| DE (2) | DE69227055T2 (pl) |
| DK (1) | DK0503991T3 (pl) |
| EE (1) | EE03057B1 (pl) |
| EG (1) | EG20300A (pl) |
| ES (1) | ES2121830T3 (pl) |
| FI (1) | FI106721B (pl) |
| FR (1) | FR2673632A1 (pl) |
| HU (1) | HU215098B (pl) |
| IL (1) | IL101043A (pl) |
| IT (1) | IT1256692B (pl) |
| LT (1) | LT3175B (pl) |
| NL (1) | NL300394I1 (pl) |
| NO (1) | NO301278B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ241701A (pl) |
| PL (1) | PL168353B1 (pl) |
| RU (1) | RU2088590C1 (pl) |
| SA (1) | SA92120446B1 (pl) |
| SK (1) | SK279533B6 (pl) |
| UA (1) | UA27732C2 (pl) |
| ZA (1) | ZA921430B (pl) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4435392B4 (de) * | 1994-10-04 | 2008-02-07 | Immuno Ag | Verfahren zur Trennung von vWF in hochmolekularen vWF und niedermolekularen vWF |
| DE4435485C1 (de) * | 1994-10-04 | 1996-03-21 | Immuno Ag | Verfahren zur Gewinnung von hochreinem von Willebrand-Faktor |
| DE4437544A1 (de) * | 1994-10-20 | 1996-04-25 | Behringwerke Ag | Einsatz von vWF-enthaltenden Konzentraten als Kombinationstherapie bei Therapie mit Antithrombotika und Fibrinolytika |
| US5659017A (en) * | 1995-11-07 | 1997-08-19 | Alpha Therapeutic Corporation | Anion exchange process for the purification of Factor VIII |
| DE19616540A1 (de) * | 1995-11-10 | 1997-05-15 | Immuno Ag | Verwendung von von Willebrand-Faktor und pharmazeutische Zubereitung |
| US6005077A (en) * | 1995-11-10 | 1999-12-21 | Immuno Aktiengesellschaft | Use of von willebrand factor and pharmaceutical formulation |
| AT403764B (de) | 1996-03-15 | 1998-05-25 | Immuno Ag | Stabiler faktor viii/vwf-komplex |
| US6068838A (en) * | 1996-04-29 | 2000-05-30 | Baxter Aktiengesellschaft | Purified multimerase |
| AT404358B (de) | 1997-02-04 | 1998-11-25 | Immuno Ag | Verfahren zur chromatographischen reinigung bzw. fraktionierung von von willebrand-faktor aus einem vwf-hältigen ausgangsmaterial |
| AT405403B (de) | 1997-02-27 | 1999-08-25 | Immuno Ag | Reinigung von von willebrand-faktor durch kationenaustauscherchromatographie |
| AT405485B (de) * | 1997-05-28 | 1999-08-25 | Immuno Ag | Eine das vwf-propeptid enthaltende pharmazeutische präparation |
| BR0008405B1 (pt) | 1999-02-22 | 2014-04-22 | Baxter Int | Composição de fator viii formulada sem a adição de albumina, uso de uma composição de fator viii, e, método de liofilizar uma formulação farmacêutica aquosa |
| EP1148063A1 (de) * | 2000-04-18 | 2001-10-24 | Octapharma AG | Haemostatisch aktives vWF enthaltendes Präparat und Verfahren zu seiner Herstellung |
| EP1593388A1 (en) * | 2004-05-05 | 2005-11-09 | ZLB Behring GmbH | Therapeutic plasma protein-concentrates containing von willebrand factor as high molecular weight multimers |
| FR2874216B1 (fr) | 2004-08-16 | 2006-11-03 | Lab Francais Du Fractionnement | Procede de preparation d'un concentre de facteur von willebrand (fvw) par voie chromatographique et concentre de fvw susceptible d'etre ainsi obtenu |
| DE102004044419B4 (de) | 2004-09-14 | 2010-04-15 | Biotest Ag | Verfahren zur Aufreinigung eines von Willebrand Faktors mittels Hydroxylapatit-Durchlaufchromatographie |
| DE102004044429B4 (de) * | 2004-09-14 | 2009-04-30 | Biotest Ag | Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung enthaltend von Willebrand Faktor |
| ITLU20070007A1 (it) * | 2007-05-07 | 2008-11-08 | Kedrion Spa | Processo cromatografico per l'ottenimento di un complesso fviii/vwf con differenti rapporti tra le due proteine da utilizzare nella terapia della emofilia a e nella malattia di von willebrand. |
| DK2167117T3 (da) | 2007-06-13 | 2012-11-19 | Csl Behring Gmbh | Anvendelse af VWF-stabiliserede FVIII-præparater til ekstravaskulær administration til terapeutisk og profylaktisk behandling af blødningsforstyrrelser |
| FR2920429B1 (fr) * | 2007-08-30 | 2012-10-05 | Lfb Biotechnologies | Procede de purification du facteur viii et du facteur von willebrand |
| EP2073015A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-06-24 | CSL Behring GmbH | Diagnostic in vitro method for assessing Von Willebrand Disease and bleeding risk associated with Von Willebrand Disease and acquired or congenital disorders of platelet function |
| US20100273206A1 (en) * | 2007-12-21 | 2010-10-28 | Manfred Rauh | Diagnostic in vitro method for assessing von willebrand disease and increased bleeding risk associated with von willebrand disease and acquired or congenital disorders of platelet function |
| KR101648734B1 (ko) | 2008-06-24 | 2016-08-18 | 체에스엘 베링 게엠베하 | 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 ｖｉｉｉ, 폰 빌레브란트 인자 또는 이들의 복합체 |
| US20100168018A1 (en) * | 2008-11-07 | 2010-07-01 | Baxter International Inc. | Factor viii formulations |
| IT1396528B1 (it) | 2009-01-19 | 2012-12-14 | Kedrion Spa | Nuovo processo di purificazione altamente selettivo di due proteine plasmatiche: von willebrand factor (vwf) e fibronectina (fn). |
| US20120148557A1 (en) | 2009-08-20 | 2012-06-14 | Ulrich Kronthaler | Albumin fused coagulation factors for non-intravenous administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders |
| WO2012082933A1 (en) | 2010-12-15 | 2012-06-21 | Baxter International, Inc. | Eluate collection using conductivity gradient |
| US9393289B2 (en) | 2011-10-18 | 2016-07-19 | Csl Behring Gmbh | Use of sulfated glycosaminoglycans for improving the bioavailability of factor VIII |
| DK2768521T3 (en) | 2011-10-18 | 2016-10-24 | Csl Behring Gmbh | Combined use of a sulfated glykosamin glycan and a Hyaluronidase to improve bio-availability of factor VIII |
| EP2814502B1 (en) | 2012-02-15 | 2017-09-13 | CSL Behring GmbH | Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity |
| EP2796145B1 (en) | 2013-04-22 | 2017-11-01 | CSL Ltd. | A covalent complex of von willebrand factor and faktor viii linked by a disulphide bridge |
| AU2014346343B2 (en) * | 2013-11-08 | 2018-05-10 | Csl Ltd. | New method to concentrate von Willebrand factor or complexes thereof |
| DK3164150T3 (da) | 2014-07-02 | 2021-02-08 | CSL Behring Lengnau AG | Modificeret von willebrand-faktor |
| US10626164B2 (en) | 2014-07-25 | 2020-04-21 | Csl Limited | Purification of VWF |
| FR3034669B1 (fr) | 2015-04-07 | 2020-02-14 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Nouvelle utilisation du facteur von willebrand |
| WO2017066683A1 (en) * | 2015-10-15 | 2017-04-20 | Plasma Technologies, Llc | Methods for extracting proteins from blood plasma |
| SG10201912857XA (en) | 2016-01-07 | 2020-02-27 | CSL Behring Lengnau AG | Mutated von willebrand factor |
| SG11201805497QA (en) | 2016-01-07 | 2018-07-30 | Csl Behring Recombinant Facility Ag | Mutated truncated von willebrand factor |
| CN105622747A (zh) * | 2016-02-04 | 2016-06-01 | 江西博雅生物制药股份有限公司 | 一种vWF活性保护液 |
| CN105622746A (zh) * | 2016-02-04 | 2016-06-01 | 江西博雅生物制药股份有限公司 | 一种从冷沉淀提取凝血因子ⅷ的废料中提取人血管性血友病因子的制备工艺 |
| CN105541997A (zh) * | 2016-02-04 | 2016-05-04 | 江西博雅生物制药股份有限公司 | 一种高纯度和高活性血管性血友病因子的制备工艺 |
| EP3488858A1 (en) | 2017-11-27 | 2019-05-29 | Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies | A von willebrand factor composition for use in treating a pathology mediated by angiogenesis |
| CN114249812B (zh) * | 2020-09-22 | 2023-09-15 | 四川远大蜀阳药业有限责任公司 | 一种降低vWF制品中IgM含量的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61166542A (ja) * | 1985-01-18 | 1986-07-28 | Hitachi Chem Co Ltd | 感光性組成物 |
| US4970300A (en) * | 1985-02-01 | 1990-11-13 | New York University | Modified factor VIII |
| US5006642A (en) * | 1987-06-29 | 1991-04-09 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Purification of von Willebrand Factor by affinity chromatography |
| FR2632309B1 (fr) * | 1988-06-07 | 1990-08-24 | Lille Transfusion Sanguine | Procede de purification par voie chromatographique de proteines, notamment de facteur viii, et les produits obtenus |
-
1991
- 1991-03-08 FR FR9102804A patent/FR2673632A1/fr active Granted
-
1992
- 1992-02-19 AU AU11131/92A patent/AU645172B2/en not_active Expired
- 1992-02-24 NZ NZ241701A patent/NZ241701A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-02-24 IL IL10104392A patent/IL101043A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-02-26 SK SK568-92A patent/SK279533B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-02-26 ZA ZA921430A patent/ZA921430B/xx unknown
- 1992-02-26 CZ CS92568A patent/CZ283633B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-02-27 ES ES92400505T patent/ES2121830T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-27 DK DK92400505T patent/DK0503991T3/da active
- 1992-02-27 DE DE69227055T patent/DE69227055T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-27 DE DE122009000034C patent/DE122009000034I2/de active Active
- 1992-02-27 EP EP92400505A patent/EP0503991B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-03 JP JP08030592A patent/JP3435668B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-04 BE BE9200215A patent/BE1004178A3/fr not_active IP Right Cessation
- 1992-03-05 CA CA002062340A patent/CA2062340C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-05 NO NO920867A patent/NO301278B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-03-06 IT ITTO920189A patent/IT1256692B/it active IP Right Grant
- 1992-03-06 PL PL92293738A patent/PL168353B1/pl unknown
- 1992-03-06 US US07/846,852 patent/US5408039A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-06 FI FI920992A patent/FI106721B/fi active
- 1992-03-06 BR BR929200770A patent/BR9200770A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-03-06 AT AT0043692A patent/AT407115B/de not_active IP Right Cessation
- 1992-03-06 HU HU9200767A patent/HU215098B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-03-06 RU SU925011041A patent/RU2088590C1/ru active
- 1992-03-07 EG EG13192A patent/EG20300A/xx active
- 1992-04-18 SA SA92120446A patent/SA92120446B1/ar unknown
- 1992-12-30 LT LTIP266A patent/LT3175B/lt not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-05-21 UA UA93002713A patent/UA27732C2/uk unknown
-
1994
- 1994-05-23 EE EE9400004A patent/EE03057B1/xx not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-07-07 NL NL300394C patent/NL300394I1/nl unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL168353B1 (pl) | Sposób wytwarzania zatezonego, standaryzowanego ludzkiego c z y n n i k a von Willebranda o wysokiej czystosci PL PL PL PL PL PL PL | |
| US5880265A (en) | Method for isolation of highly pure von willebrand factor | |
| US4495175A (en) | Preparation of highly purified human antihemophilic factor | |
| EP0144957B1 (en) | Process for purifying factor viii:c | |
| CA2024667C (en) | Process for preparing a concentrate of blood coagulation factor viii-von willebrand factor complex from total plasma | |
| CA2159702C (en) | High molecular and low molecular fractions of von willebrand factor | |
| JP2013047273A (ja) | 可溶化血漿フラクションから蛋白質フィブリノーゲン、第ｘｉｉｉ因子および生物学的グルーを分離し、そして該蛋白質の凍結乾燥濃縮物を調製するための方法 | |
| AU2003244850B2 (en) | Processes for the preparation of fibrinogen | |
| TW200918145A (en) | Method for purifying factor VIII and von willebrand factor | |
| JP4250771B2 (ja) | カチオン交換クロマトグラフィーによる因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の精製方法 | |
| JPH06511018A (ja) | 血漿分画精製法 | |
| US4774323A (en) | Purification of von Willebrand Factor solutions using gel permeation chromatography | |
| AU2005203243A1 (en) | Process for the preparation of a Von Willebrad (FvW) factor concentrate by chromatography and a FvW concentrate thus obtainable | |
| US6034222A (en) | Method for the separation of recombinant pro-factor IX from recombinant factor IX | |
| JPH06505494A (ja) | Ｉｘ因子の調製 | |
| US4406886A (en) | Purification of antihemophilia factor VIII by precipitation with zinc ions | |
| US20020019036A1 (en) | Von willebrand factor derivatives and methods of isolating proteins that bind to von willebrand factor | |
| JP2931319B2 (ja) | 血液凝固第▲ｖｉｉｉ▼因子の製造法 | |
| JPS59167519A (ja) | 不活化トロンビンゲルにより血漿タンパク質混合液からフイブリノ−ゲンを除去する方法 | |
| JP2931655B2 (ja) | 全血漿から血液疑固▲ｖｉｉｉ▼因子―フオン・ビルブラント因子複合体濃縮物の製造方法 | |
| de Lille | Burnouf-Radosevich et a1. | |
| LV10193B (en) | Highly clean and therapeutically usable standardized method for producing Willebrand factor concentrate for industrial production |