HU215098B - Eljárás igen nagy tisztaságú, gyógyászatilag alkalmazható, standardizált humán von Willebrand-faktor koncentrátum előállítására nagyüzemi méretekben - Google Patents
Eljárás igen nagy tisztaságú, gyógyászatilag alkalmazható, standardizált humán von Willebrand-faktor koncentrátum előállítására nagyüzemi méretekben Download PDFInfo
- Publication number
- HU215098B HU215098B HU9200767A HU9200767A HU215098B HU 215098 B HU215098 B HU 215098B HU 9200767 A HU9200767 A HU 9200767A HU 9200767 A HU9200767 A HU 9200767A HU 215098 B HU215098 B HU 215098B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- vwf
- column
- willebrand factor
- von willebrand
- fraction
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás nagy tisztaságú, nagy specifikus aktivitású, nagy móltömegű multimerekben gazdag, standard humán von Willebrand-faktor koncentrátum előállítására ipari méretekben. A találmány szerinti eljárással előállított koncentrátum gyógyászati célokra alkalmazható.
A von Willebrand-faktor (vWF) a legnagyobb ismert molekula, amely a plazmában kering. Ez a molekula diszulfid-kötéssel kapcsolódó, nagyméretű multimerek sorozataként fordul elő, amelyek alapegysége körülbelül 260 kilodalton (Kda) móltömegű. A vWF legkisebb formája a plazmában egy dimer, amelynek körülbelül 440-500 Kda a móltömege, míg a dimer multimeijeinek legnagyobb formái a 200 millió dalton móltömeget is elérik. Az összekapcsolódó alegységek sejtspecifikusak lehetnek, a vWF-et a megakarociták és belhámsejtek szintetizálják és polimerizálják.
Ez a faktor alapvető szerepet játszik hemosztázisban két, egymástól elkülönülő funkciója révén: szállítja és stabilizálja a véráramban a VIIL faktort, és mind adhezív protein elősegíti a vérlemezkék szétterülését, kapcsolódását és aggregációját az ér-szubendoteliumban, ezáltal részt vesz a sérült erek gyors gyógyulásában.
Az örökletes vWF-hiány vagy a fenti faktor szerkezeti anomáliája a von Willebrand-betegség kialakulásához vezet, amely kezdetben hemorrágiában (vérzés) nyilvánul meg, különösen a bőrön és a nyálkahártyamembránokon. A fenti betegség klinikai formái rendkívül heterogének és a sebészeti beavatkozás során a legtöbb problémát okozzák. A von Willebrand-betegség kezelése alapvető fontosságú annak érdekében, hogy az elsődleges vérzéscsillapítás (vérzési idő) és a koagulálás (aktivált kefalin idő és VIII. faktor aktivitás) anomáliáit korrigáljuk.
A betegséget vWF-ben dúsított humán plazmaszármazékok (például a plazma krioprecipitált frakciója vagy megfelelő mennyiségű vWF-t tartalmazó VIII. faktor koncentrátumok) helyettesítéses terápiájával kezelik. Azonban ezeket a termékeket nem standardizálták a von Willebrand-betegség kezelésére. Ezenkívül a humán plazma, különösen a krioprecipitátum rosszul tisztított frakciói magukban hordozzák a virális szennyeződés veszélyét, mivel ezeket gyakran nem vetik alá kielégítő vírus-inaktiválási lépésnek. Ezenkívül ezek alkalmazásával túl sok szennyező protein kerül a szervezetbe, ami a beteg számára nem előnyös, és amely több injekció után immunreakciókat okozhat.
A tisztított VIII. faktort ezzel szemben kielégítő vírus-inaktivációs kezelésnek lehet alávetni, de a tisztítási eljárást az A-típusú hemofiliában szenvedő betegek számára optimalizálták, és nem a vWF-deficiensbetegek kezelésére. Valójában a jelenleg kifejlesztett és egyre hatékonyabb eljárások, például az immunaffinitási kromatográfia vagy ioncserélős tisztítás, amelyet a VIII. faktor előállítására használnak, olyan koncentrátumokat eredményeznek, amelyek már nem tartalmaznak elegendő mennyiségű vWF-et ahhoz, hogy a von Willebrand-betegség kezelésére alkalmazhatók lennének.
Tekintettel arra, hogy a von Willebrand-betegség kezelésére hatékony módszert kell találnunk, célunk olyan új, ipari méretű eljárás kifejlesztése volt a vWF tisztítására, amely ugyanakkor optimális hozamot biztosít az egyéb különböző plazmamolekulákból is. Közelebbről, a találmány szerinti eljárás egy lépésben lehetővé teszi a VIII. faktor koncentrátum előállítását (a 0 359 593 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint), és egy elkülönített vWF frakció kinyerését ugyanezen adag krioprecipitátumból, ezáltal biztosítja a humán plazma optimális felhasználását. Az így kapott vWF frakciót további kromatográfiás lépésben tisztítjuk és ezáltal igen nagy tisztaságú vWF koncentrátumot kapunk.
A vWF molekulák komplex volta nagyon megnehezíti azok tisztítását. Analitikai vizsgálatokra kis léptékű módszerekkel például 5-2000 ml-es mennyiségeket már előállítottak [Thorell és munkatársai: Thromb. Rés. 35, 431^450 (1984)], azonban ezeket a módszereket nem lehetett a vWF ipari léptékű előállítására adaptálni. Ezenkívül nem tekintették célnak azt sem, hogy a VIII. faktor mellett állítsák elő a vWF-et a krioprecipitátum lehető legnagyobb mértékű hasznosításával. A vWF-et ismert módon szulfatált vegyületeken differenciális szolubiiizálással tisztítják, glicin [Bemtop és munkatársai: Vox Sang 56, 212 (1989)] és szulfatált vegyületek [Winkelman és munkatársai: Vox Sang. 57, 97 (1989)] jelenlétében, különféle kromatográfiás elválasztási módszerek alkalmazásával, például molekulaméreten alapuló kizárással [Perret és munkatársai: Haemostasis 14, 289 (1984)] és ioncserélő kromatográfiával [Austen és munkatársai: Thromb. Haemostas. 48, 295 (1982)]. Azonban ezekkel a módszerekkel vagy alacsony hozammal kapják a vWF-et, vagy a gél kapacitása alacsony, vagy nem teszik lehetővé a VIII. faktor és a vWF egymás melletti izolálását, ily módon ipari alkalmazás szempontjából nem kielégítőek.
Ezenkívül a Bemtorp és munkatársai módszere szerint előállított vWF [Vow Sang. 56, 212 (1989)] kis tisztaságú, csak 45 egység Ag/mg protein (213. oldal), ugyanakkor a találmány szerinti eljárással előállított vWF 205 egység Ag/mg protein tisztaságú. Hasonlóképpen a Winkelman és munkatársai módszere szerint előállított vWF [Vox Sang. 57, 97 (1989)] is csak 10 egység Ag/ml protein tisztaságú (101. oldal).
Perret és munkatársai [Haemostasis 14, 289 (1984)] a fibrin molekulák formájában lévő fibrinogén eltávolítására egy defibrinációs lépést hajtanak végre kalcium és kígyóméregből származó enzimek alkalmazásával. Emiatt ez a készítmény nyilvánvalóan alkalmatlan gyógyászati célokra. Ezenkívül a gélszűréses rendszerek - mint például az általuk alkalmazott rendszer nem felelnek meg az ipari méretű előállítás céljainak, mivel az átfolyási sebesség ezekben csak 10 cm/óra vagy kevesebb, és igen hajlamosak az eldugulásra, különösen fibrinogén és fibronektin jelenlétében. Ezenkívül a tisztítási faktor is köztudottan rendszerint alacsony, a proteinek rossz szétválasztása miatt ebben a kromatográfiás rendszerben.
Austen és munkatársai [Throm. Haemostas. 48, 46 (1982)] szintén kis tisztaságú koncentrátumot állítanak elő (8 egység Ag/mg protein) és viszonylag ala2
HU 215 098 Β csony hozammal, valószínűleg a drasztikus kromatográfiás körülmények (pH 5,5) következtében.
Harrisson és munkatársa [Thromb. Rés. 50, 295 (1988)] dextrán-szulfát-sepharoset alkalmaznak kromatográfiás mátrixként; ennek az anyagnak igen alacsony a retenciós kapacitása a vWF-re. Ennek eredményeként alacsony specifikus aktivitású vWF készítményt kapnak csak, az aktivitás 2-4 egység/mg protein (301. oldal).
Végül a feníi módon kapoll termékek többsége meglehetősen nagy arányban tartalmaz denaturált és inaktív formában lévő vWF-et, amelyet a risztocetinkokfaktor aktivitás bizonyít (RCo/antigén arány 0,08 és 0,8 között változik) [Lawrie és munkatársai: Br. J. Haematol. 73, 100 (1989)]. Ennek következtében ezek a termékek nem alkalmazhatók elég hatékonyan a von Willebrand-betegség kezelésére. Ezzel szemben a találmány szerinti eljárással a vWF tisztaságára jellemző RCo/antigén arány nagyobb, mint 1 egység, ami összemérhető a normál plazmából kapott natív vWF értékével.
A találmány szerinti eljárás tehát gyógyászati célokra alkalmas vWF koncentrátum ipari méretű előállítására vonatkozik, a nagytisztaságú VIII. faktor előállítására szolgáló eljárás melléktermékeként, amely lehetővé teszi igen nagy plazma-térfogatokból (4000 liter vagy több) nagy móltömegű multimerekben gazdag, standard termék előállítását, és ezáltal lehetővé teszi a krioprecipitátum optimális hasznosítását.
Közelebbről, a találmány szerinti eljárás a vWF koncentrátum előállítására három, egymást követő kromatográfiás lépésből áll, amely lehetővé teszi a vWF biológiai aktivitásával összefüggő, nagy móltömegű multimerekben való feldűsulást. Az eljárás kiindulási anyaga a humán plazma krioprecipitált frakciója, amelyet szokásos előtisztítási lépésként alumínium-hidroxidon való adszorpciónak vetettek alá. Ezt az anyagot ezután vírus-inaktiválásnak vetjük alá, például oldószer-detergens kezeléssel, mielőtt tisztítanánk.
A találmány szerinti eljárás a VIII. faktor előállítási eljárása során melléktermékként kapott frakció három, egymást követő kromatográfiás tisztításából áll. Az első két kromatográfiás tisztítás ioncserélő kromatográfiás lépés, és a harmadik affinitási kromatográfia.
A két ioncserélő kromatográfiás lépést azonos vinilpolimer-gyantán hatjuk végre, amelyen dietil-aminoetil-csoportok (DEAE) vannak kötve, közelebbről DEAE-FractogelR TSK 650 (Merck) oszlopon, amelyet 0,01 mol/1 trinátrium-citrátot, 0,11 mol/1 nátrium-kloridot, 0,001 mol/1 kálcium-kloridot, 0,12 mol/1 glicint és 0,016 mol/1 lizint tartalmazó pufferrel (pH 7) ekvilibráltunk.
A DEAE-FractogelR TSK 650 szintetikus, hidrofil gélközeg. Hordozója oligo-etilénglikol, glicidin-metakrilát és pentaeritrit-dimetakrilát kopolimer, amelyhez dietil-amino-etil-csoportok, például -O-CH2-CH2N+ (C2H5)2HC1 csoportok vannak kapcsolva, ezáltal enyhén lúgos anioncserélő jellegű. A DEAE-FractogelR TSK 650 két részecskeméret-tartományban kerül forgalomba (vízzel nedvesítve): S típus (0,025-0,050 mm) és
M típus (0,045-0,090 mm). Mind a két típus alkalmazható a találmány szerinti eljárásban.
Az előzetesen tisztított és virális inaktivációs kezelésen keresztülment krioprecipitátum plazmafrakciót felvisszük az első kromatográfiás oszlopra, amely a vWF fő tömegét visszatartja. A vWF-t ezután eluáljuk oly módon, hogy a puffer-oldatban a nátrium-klorid koncentrációját 0,14-0,15 mol/l-re növeljük.
A vWF-ben feldúsult, fenti módon eluált frakciót ezután a második kromatográfiás oszlopra visszük, az elsővel azonos körülmények között. Mivel ebből a frakcióból az első kromatográfiás lépésben már eltávolítottuk a proteinek nagy részét (különösen a VIII. faktort és a fibronektint), amelyek az adszorpciós helyekért versenyeznek, a vWF adszorpciós kapacitása a második oszlopon előnyösen sokkal nagyobb. A szűrlet eltávolítása és az oszlop ekvilibráló pufferoldattal való átöblítése után az adszorbeált vWF-et a pufferoldat nátrium-klorid koncentrációjának 0,15-0,17 mol/li-re növelésével eluáljuk. A DEAE-FractogelR gyanta vWF-el szembeni kiváló kapacitásának és hatékonyságának köszönhetően az oszlopról igen magas aktivitású vWF eluálódik (>50 egység RCo/ml). Ezáltal az ultraszűréssel járó mechanikus stresszt, amely a termék koncentrálására szükséges lenne, elkerülhetjük.
A fenti módon eluált frakciót affinitási kromatográfiának vetjük alá zselatinból származó gélen, azonos ekvilibrációs pufferoldatban, ezáltal elkerüljük a dialízist, vagy ultraszűréses lépést a sóösszetétel változtatására; ez az oszlop alapvetően arra a célra szolgál, hogy a vWF-et szennyező maradék fibronektin molekulákat visszatartsa. A zselatin-alapú gél megválasztása nem kritikus, azonban a fenti célra általában megfelel a GelatinSepharose, a Gelatin-UltrogelR, a Gelatin-SpherodexR és a Gelatin-FractogelR. A Gelatin-Sepharose a legelőnyösebb, mivel a találmány szerinti eljárásban alkalmazott körülmények között mintegy 5-10 mg fibronektin megkötésére alkalmas 1 ml gélre vonatkoztatva.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott körülmények között a nagytisztaságú vWF nem kötődik a gélen, és így a szűrletben eluálódik; mivel a zselatin-affinitási kromatográfiás lépés nem jár a vWF frakció nagymértékű tágulásával, a terméket közvetlenül kiszerelhetjük koncentrálási lépés, például ultraszűrés szükségessége nélkül. Mivel a végtermékben nincsenek proteolitikus enzimek, igen stabil a sterilre szűrés és a fagyasztva szárítás során, így nem szükséges stabilizálószert alkalmazni.
A találmány szerinti eljárással előállított von Willebrand-faktor koncentrátum tisztítási faktora kiemelkedően magas, 10000-szeresnél nagyobb a kiindulási plazmához viszonyítva, és specifikus aktivitása 345 egység CBA/mg protein (kollagénkötő aktivitás egységben meghatározva), illetve 100 egység RCo/mg proteinnél nagyobb (risztocetin-kofaktor aktivitás egységben). Az egyes kromatográfiás lépések szerepét a vWF tisztításában az 1. ábrán mutatjuk be.
Igen jelentős, hogy a termék minőségének javulását az egymást követő tisztítási lépésekben a magas móltömegű multimerek (a vWF nagy biológiai aktivitású
HU 215 098 Β molekuláris formái) függvényében ábrázoltuk, amelyet elektroforetikus analízissel detektáltunk.
Meglepő módon a fenti analízis szerint a > 4 multimerekben progresszív dúsulás figyelhető meg (2. ábra), ami a vWF polimerek 79%-át jelenti, noha a krioprecipitálás során ezek fele elveszik. Meglepő módon a DEAE-FractogelR TSK 650-en végzett kromatográfia az a lépés, amely elősegíti az igen nagy multimerek szelektív retencióját és a szűrletben eltávolítja a kisméretű, abnormális szerkezetű (részleges proteolízisen átesett) és kis aktivitású formákat.
A találmány szerinti eljárással előállított standardizált vWF koncentrátum nagy tisztaságú, nagy specifikus aktivitású és nagy molekulatömegű multimerekben gazdag, ezáltal különösen alkalmas gyógyászati célokra, a von Willebrand-betegség különféle formái kezelésére, előzetes klinikai vizsgálataink szerint.
Az előzetes klinikai vizsgálatok azt mutatják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított koncentrátum megfelelő mértékben csökkenti a vérzési időt különféle vérzések esetében.
In vitro vizsgálatok szerint biokémiai és fiziológiai tulajdonságai azonosak a natív molekuláéval, különösen azon képességét tekintve, hogy képes a vérlemezkék fixálására a perfúziós eszközben és in vivő képes endogén VIII. faktor megkötésére.
Nagy tisztaságának következtében a találmány szerinti eljárással előállított vWF alkalmas különféle laboratóriumi alkalmazásokra is (például finomszerkezeti elemzésekre, funkcionális vizsgálatokra, diagnózisokra), valamint specifikus antitestek termelésére.
A találmány szerinti eljárással előállított koncentrátumot stabilizálószerként is alkalmazhatjuk a VIII. faktor géntechnológiailag transzformált sejtek általi előállítása, valamint az így előállított VIII. faktor tisztítása során.
A mellékelt ábrák jelentése az alábbi:
1. ábra:
Tisztított vWF frakciók SDS-poli(akril-amid)-gél elektroforézise
1. sáv: krioprecipitátum;
2. sáv: SD-kezelt krioprecipitátum;
3. sáv: DEAE-fraktogélen nem kötődő frakció;
4. sáv: első vWF eluátum;
5. sáv: második vWF eluátum;
6. sáv: zselatinon nem kötődő frakció;
7. sáv: standardok, Fbn = fibronektin; IgG = immunoglobulin; Alb = albumin.
2. ábra:
Multimerek megoszlása a vWF tisztítási frakciókban
1. sáv: normál plazma;
2. sáv: krioprecipitátum;
3. sáv: SD-kezelt krioprecipitátum;
4. sáv: DEAE-fraktogélen nem kötődő frakció;
5. sáv: első vWF eluátum;
6. sáv: második vWF eluátum;
7. sáv: zselatinon nem kötődő frakció.
A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példával kívánjuk szemléltetni.
Példa
Kiindulási anyag
A krioprecipitátumot friss plazmából állítjuk elő, amelyet 4%-os nátrium-citrát-oldat vagy CPD (citrát, foszfát, dextróz) antikoaguláns oldat jelenlétében gyűjtünk, és legfeljebb 6 órán keresztül fagyasztunk, miután megkaptuk. A plazmát -60 °C-on mélyhűtjük, majd -35 °C-on tartósítjuk. Az egyes plazmaadagok 1800-2000 litert tartalmaznak, ezeket 4000 literes adagokká egyesítjük minden egyes találmány szerinti alkalmazás esetén. A felolvasztást úgy végezzük, hogy a plazmát szabályozott hőmérsékletű kamrába helyezzük 12 órára, amely lassú, szabályos felmelegedést biztosít -7 °C-ra, majd termosztáttal szabályozott fürdőn 0-2 °C-on állandó keverés közben felolvasztjuk. A krioprecipitátumot (amely mintegy 9 g/ml plazmát jelent) hidegen való centrifugálással nyerjük ki.
Centrifugálás után a krioprecipitátumot újra szolibilizáljuk, és alumínium-hidroxidon adszorbeáljuk bizonyos szennyeződések, vagyis a protrombin-komplex komponensei (főleg a VII. faktor) és a ΧΠ. faktor eltávolítása céljából. A felülúszót ezután 15 °C-ra hűtjük (ezzel részben eltávolítjuk a fibrinogent és a fibronektint).
A fenti kezeléssel 80-86% hozammal kapjuk a VIII. faktor - vWF elegyet a krioprecipitátumból; a VIII. faktor specifikus aktivitása 0,7 nemzetközi egység/mg, a vWF-é 0,6 egység RCo/mg (risztocetin kofaktor aktivitás), illetve 1,2 egység CBA/mg (kollagénkötő aktivitás).
Vírus-inaktiválás
A VIII. faktor és a vWF elegyét tartalmazó oldatot oldószer-detergens kezelésnek vetjük alá, amely ismert módon hatékonyan alkalmazható a lipidburokkal rendelkező vírusok megsemmisítésére [Horowitz és munkatársai: Transfusion, 25, 516 (1985)], amely kezelés abból áll, hogy az oldatot 0,3% tri(n-butil)-foszfát (TnBP) és 1% Tween 80 jelenlétében 8 órán keresztül, 25 °C-on inkubáljuk.
A fenti kezelés után az előző lépésben mért VIII. faktor és vWF aktivitás 95%-át visszanyerjük. Elektroforézist alkalmazhatunk annak megerősítésére, hogy a vWF még mindig multimer formában van jelen.
Kromatográfiás elválasztási eljárás
A vWF tisztítását a 0 359 593 számú európai szabadalmi bejelentésünk szerinti eljárásból fejlesztettük ki, amely a VIII. faktor tisztítására vonatkozik.
Az első kromatográfiás lépést DEAE-FractogelR TSK 650 (S vagy M típus) (Merck) oszlopon végezzük. Az ekvilibráló pufferoldat 0,02 mol/1 trinátriumcitrátot, 0,001 mol/1 kalcium-kloridot, 0,12 mol/1 glicint, 0,016 mol/1 L-lizint és 0,11 mol/1 nátrium-kloridot tartalmaz. Az oszlopon megkötődik a vWF, a VIII. faktor és a fibronektin; a szennyező proteinek (főleg fibrinogén és valamennyi IgG) lazán kötődik vagy nem kötődik az oszlopon és a vírus-sterilizáló szerek ugyanezzel a pufferoldattal való néhány egymást követő mosással eltávolíthatók.
Az oszlopot 100 cm/óra lineáris átfolyási sebességgel üzemeltetjük. Ilyen körülmények között az alkalmazott oszlop vWF retenciós kapacitása közelítőleg 75%-a
HU 215 098 Β a beinjektált mennyiségnek (amelyet antigén Ag-ként mérünk), a maradék a szűrlettel elveszik. Ez a kötőkapacitás 45 egység vWF Ag/ml gélnek felel meg.
A vWF-t az oszlopról úgy deszorbeáljuk, hogy a pufferoldatban a nátrium-klorid koncentrációját 0,15 mol/l-re növeljük. A vWF-t tartalmazó frakció 30-35%-át tartalmazza a kiindulási vWF-nek, míg 40%-a a Vili. faktorral együtt adszorbeálva marad, és amelyet azzal együtt eluálunk oly módon, hogy a pufferoldatban a nátrium-klorid koncentrációját 0,25 mol/li-re növeljük, majd együttes tisztítást végzünk.
Az első oszlopról eluált vWF-t tartalmazó frakciót az ekvilibráló pufferrel kismértékben hígítjuk, majd egy második, azonos töltetű oszlopra visszük fel újra, abból a célból, hogy a vWF frakció ionerősségét újra 0,11 mol/1 nátrium-kloridnak megfelelő értékre csökkentsük.
Mivel a szennyeződéseket és a VIII. faktort, - amelyek az első oszlopon a vWF-el versenyeznek az adszorpciós helyekért - szinte teljesen eltávolítottuk az első kromatográfiás lépésben, a második oszlop kötőkapacitása sokkal nagyobb: 320 egység vWF Ag/ml gél.
A vWF-t az oszlopról a pufferoldat nátrium-klorid koncentrációjának 0,17 mol/l-re emelésével deszorbeáljuk.
Ebben a második kromatográfiás lépésben a koncentráció 8-10-szer nagyobb lehet, mint az előzőben, ezáltal a további koncentrálási lépések - például ultraszűrés - elhagyható. Standard módszerek szerint meghatározva az eluátum a következő vWF mennyiségeket (vagy aktivitásokat) tartalmazza:
- Antigén (Ag) 88 ± 9 NE/ml
- Risztocetin kofaktor (RCo) 97 ± 19 NE/ml
- Kollagénkötő aktivitás (CBA) 149 ± 13 NE/ml
- Nagy móltömegű multimerek (>4 multimer) 79%
A CBA egységeket (kollagénkötő aktivitást) ELISA módszerrel határozzuk meg Brown és Bosak módszere szerint [Thromb. Rés. 43, 303 (1986)]. Az értékek nemzetközi egységben való kifejezésére összehasonlító anyagként a második British Standard (86/717) szerint kalibrált standard plazmát alkalmazunk.
A CBA/Ag arány - amely 1,69 - azt mutatja, hogy a vWF aktivitása jól megőrződik. Ez összhangban van a nagy móltömegű multimerek magas százalékos értékével (79%) és előnyösen összehasonlítható a plazmából származó natív vWF 70%-os értékével.
A vWF eluátum elektroforetikus analízisével kimutatható, hogy szennyeződésként kevés fibronektint és inter-alfa-tripszin inhibitort (egy szerin-proteáz inhibitor) tartalmaz.
A második vWF eluátumot ezután egy harmadik tisztítási lépésben a fibronektin eltávolítása céljából Gelatin-Sepharose CL4B (Pfarmacia) oszlopon tisztítjuk, amelyet az előző oszlopon eluáló pufferként használt oldattal ekvilibráltunk.
Ennek az affinitási kromatográfiás gélnek a fibronektin - visszatartó kapacitása >5 mg/ml, ezáltal lehetővé válik, hogy a vWF frakcióban ezt a szennyeződést a kimutathatóság határa alá (<4 mg/ml) csökkentsük.
A találmány szerinti eljárással tisztított vWF ezen utolsó tisztítási lépéssel kapott szűrletben található és közvetlenül szétmérhető és fagyasztva szárítható.
A végtermék elektroforetikus analízise szerint nem 5 mutatható ki semmiféle szennyeződés. A vWF tartalom 205 egység Ag/ml protein és specifikus aktivitása 345 egység CBA/mg protein, illetve 186-220 egység
RCO/mg protein.
A végső tisztítási fok a kiindulási plazmához viszo10 nyitva > 10 000-szeres.
A fenti tisztítási eljárással kapott vWF-t SDSagarózon elektroforetikus analízisnek alávetve és a sávokat megvizsgálva azt találjuk, hogy az 65-80%-ban tartalmaz nagy móltömegű multimereket, vagyis ez az arány összehasonlítható a kiindulási plazma fenti értékével (70%).
A koncentrátum stabilitását cseppfolyós halmazállapotban, szobahőmérsékleten 24 órán keresztül vizsgáljuk: nem tapasztalunk proteolitikus aktivitást és nem mu20 tatható ki semmiféle változás a specifikus aktivitásban.
A koncentrátum trombogén aktivitásának hiányát szokásos vizsgálati módszerekkel mutattuk ki, például meghatároztuk a nem aktivált részleges tromboplasztin időt (NAPTT). PKA és kallikrein nem volt detektálható.
Fentiek miatt nem szükséges stabilizálószert adni a találmány szerinti vWF koncentrátumhoz.
Mivel sikerült olyan tisztítási eljárást találnunk, amely specifikusan alkalmas a VIII. faktor előállítási eljárása során melléktermékként keletkezett vWF ki30 nyerésére, először sikerült olyan nagy tisztaságú, nagy hatású, gyógyászatilag alkalmazható koncentrátumot előállítani, amely a von Willebrand-féle betegség kezelésére alkalmas.
Claims (8)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás standardizált, nagy tisztaságú, magas móltömegű multimerekben gazdag humán von40 Willebrand-faktor koncentrátum előállítására, azzal jellemezve, hogy a plazma krioprecipitált frakcióját három egymást követő kromatográfiás lépéssel tisztítjuk, az első két lépésben ioncserélő kromatográfíát alkalmazunk DEAE csoportokat tartalmazó, nagy pórusú45 vinil polimer-gyantán, míg a harmadik lépésben affinitási kromatográfíát végzünk zselatin-Sepharose oszlopon.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként alumínium-hidroxidon elő50 zetesen tisztított, krioprecipitált plazma-frakciót alkalmazunk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első és második oszlop tölteteként DEAEFractogelR TSK 650 ioncserélő gyantát alkalmazunk,55 amelyet 0,01 mol/1 trinátrium-citrátot, 0,11 mol/1 nátrium-kloridot, 0,001 mol/1 kálcium-kloridot, 0,12 mol/1 glicint és 0,016 mol/1 L-lizint tartalmazó puffer-oldattal ekvilibráltunk.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,60 hogy az előzetesen tisztított krioprecipitált plazma-frak5HU 215 098 Β ciót az első ioncserélő kromatográfiás oszlopra visszük, és a von Willebrand-faktort tartalmazó frakciót a puffer nátrium-klorid koncentrációjának 0,14-0,15 mol/l-re növelésével eluáljuk.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első kromatográfiás oszlopról kapott, von Willebrand-faktort tartalmazó eluátumot egy második ioncserélő kromatográfiás oszlopra visszük fel, és a von Willebrand-faktort a puffer nátrium-klorid koncentrációjának 0,15-0,17 mol/l-re növelésével eluáljuk.
- 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második kromatográfiás oszlopról kapott eluátumot egy zselatin-Sepharose kromatográfiás oszlopra visszük, amelyet az előző kromatográfiás lépésben al5 kalmazott eluáló pufferrel ekvilibráltunk, így a maradék fibronektin az oszlopon szelektíven adszorbeálódik.
- 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a zselatin-Sepharose oszlopon átfolyt, von Willebrand-faktort tartalmazó szűrletet összegyűjtjük,
- 10 szétmérjük, és fagyasztva szárítjuk.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9102804A FR2673632A1 (fr) | 1991-03-08 | 1991-03-08 | Procede de preparation de concentre de facteur von willebrand humain de tres haute purete, approprie a un usage therapeutique. |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9200767D0 HU9200767D0 (en) | 1992-05-28 |
HUT63176A HUT63176A (en) | 1993-07-28 |
HU215098B true HU215098B (hu) | 1998-09-28 |
Family
ID=9410505
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9200767A HU215098B (hu) | 1991-03-08 | 1992-03-06 | Eljárás igen nagy tisztaságú, gyógyászatilag alkalmazható, standardizált humán von Willebrand-faktor koncentrátum előállítására nagyüzemi méretekben |
Country Status (29)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5408039A (hu) |
EP (1) | EP0503991B1 (hu) |
JP (1) | JP3435668B2 (hu) |
AT (1) | AT407115B (hu) |
AU (1) | AU645172B2 (hu) |
BE (1) | BE1004178A3 (hu) |
BR (1) | BR9200770A (hu) |
CA (1) | CA2062340C (hu) |
CZ (1) | CZ283633B6 (hu) |
DE (2) | DE122009000034I2 (hu) |
DK (1) | DK0503991T3 (hu) |
EE (1) | EE03057B1 (hu) |
EG (1) | EG20300A (hu) |
ES (1) | ES2121830T3 (hu) |
FI (1) | FI106721B (hu) |
FR (1) | FR2673632A1 (hu) |
HU (1) | HU215098B (hu) |
IL (1) | IL101043A (hu) |
IT (1) | IT1256692B (hu) |
LT (1) | LT3175B (hu) |
NL (1) | NL300394I1 (hu) |
NO (1) | NO301278B1 (hu) |
NZ (1) | NZ241701A (hu) |
PL (1) | PL168353B1 (hu) |
RU (1) | RU2088590C1 (hu) |
SA (1) | SA92120446B1 (hu) |
SK (1) | SK279533B6 (hu) |
UA (1) | UA27732C2 (hu) |
ZA (1) | ZA921430B (hu) |
Families Citing this family (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4435485C1 (de) * | 1994-10-04 | 1996-03-21 | Immuno Ag | Verfahren zur Gewinnung von hochreinem von Willebrand-Faktor |
DE4435392B4 (de) * | 1994-10-04 | 2008-02-07 | Immuno Ag | Verfahren zur Trennung von vWF in hochmolekularen vWF und niedermolekularen vWF |
DE4437544A1 (de) * | 1994-10-20 | 1996-04-25 | Behringwerke Ag | Einsatz von vWF-enthaltenden Konzentraten als Kombinationstherapie bei Therapie mit Antithrombotika und Fibrinolytika |
US5659017A (en) * | 1995-11-07 | 1997-08-19 | Alpha Therapeutic Corporation | Anion exchange process for the purification of Factor VIII |
US6005077A (en) * | 1995-11-10 | 1999-12-21 | Immuno Aktiengesellschaft | Use of von willebrand factor and pharmaceutical formulation |
DE19616540A1 (de) * | 1995-11-10 | 1997-05-15 | Immuno Ag | Verwendung von von Willebrand-Faktor und pharmazeutische Zubereitung |
AT403764B (de) | 1996-03-15 | 1998-05-25 | Immuno Ag | Stabiler faktor viii/vwf-komplex |
US6068838A (en) * | 1996-04-29 | 2000-05-30 | Baxter Aktiengesellschaft | Purified multimerase |
AT404358B (de) * | 1997-02-04 | 1998-11-25 | Immuno Ag | Verfahren zur chromatographischen reinigung bzw. fraktionierung von von willebrand-faktor aus einem vwf-hältigen ausgangsmaterial |
AT405403B (de) | 1997-02-27 | 1999-08-25 | Immuno Ag | Reinigung von von willebrand-faktor durch kationenaustauscherchromatographie |
AT405485B (de) * | 1997-05-28 | 1999-08-25 | Immuno Ag | Eine das vwf-propeptid enthaltende pharmazeutische präparation |
CZ300547B6 (cs) | 1999-02-22 | 2009-06-10 | University Of Connecticut | Nové formulace faktoru VIII prosté albuminu |
EP1148063A1 (de) * | 2000-04-18 | 2001-10-24 | Octapharma AG | Haemostatisch aktives vWF enthaltendes Präparat und Verfahren zu seiner Herstellung |
EP1593388A1 (en) * | 2004-05-05 | 2005-11-09 | ZLB Behring GmbH | Therapeutic plasma protein-concentrates containing von willebrand factor as high molecular weight multimers |
FR2874216B1 (fr) * | 2004-08-16 | 2006-11-03 | Lab Francais Du Fractionnement | Procede de preparation d'un concentre de facteur von willebrand (fvw) par voie chromatographique et concentre de fvw susceptible d'etre ainsi obtenu |
DE102004044429B4 (de) * | 2004-09-14 | 2009-04-30 | Biotest Ag | Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung enthaltend von Willebrand Faktor |
DE102004044419B4 (de) | 2004-09-14 | 2010-04-15 | Biotest Ag | Verfahren zur Aufreinigung eines von Willebrand Faktors mittels Hydroxylapatit-Durchlaufchromatographie |
ITLU20070007A1 (it) * | 2007-05-07 | 2008-11-08 | Kedrion Spa | Processo cromatografico per l'ottenimento di un complesso fviii/vwf con differenti rapporti tra le due proteine da utilizzare nella terapia della emofilia a e nella malattia di von willebrand. |
CA2690218C (en) | 2007-06-13 | 2017-02-28 | Csl Behring Gmbh | Use of vwf stabilized fviii preparations and of vwf preparations without fviii for extravascular administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders |
FR2920429B1 (fr) * | 2007-08-30 | 2012-10-05 | Lfb Biotechnologies | Procede de purification du facteur viii et du facteur von willebrand |
EP2073015A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-06-24 | CSL Behring GmbH | Diagnostic in vitro method for assessing Von Willebrand Disease and bleeding risk associated with Von Willebrand Disease and acquired or congenital disorders of platelet function |
US20100273206A1 (en) * | 2007-12-21 | 2010-10-28 | Manfred Rauh | Diagnostic in vitro method for assessing von willebrand disease and increased bleeding risk associated with von willebrand disease and acquired or congenital disorders of platelet function |
KR101507718B1 (ko) | 2008-06-24 | 2015-04-10 | 체에스엘 베링 게엠베하 | 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 viii, 폰 빌레브란트 인자 또는 이들의 복합체 |
WO2010054238A1 (en) * | 2008-11-07 | 2010-05-14 | Baxter International Inc. | Factor viii formulations |
IT1396528B1 (it) | 2009-01-19 | 2012-12-14 | Kedrion Spa | Nuovo processo di purificazione altamente selettivo di due proteine plasmatiche: von willebrand factor (vwf) e fibronectina (fn). |
AU2010284977A1 (en) | 2009-08-20 | 2012-03-29 | Csl Behring Gmbh | Albumin fused coagulation factors for non-intravenous administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders |
US9488625B2 (en) | 2010-12-15 | 2016-11-08 | Baxalta GmbH | Purification of factor VIII using a conductivity gradient |
AU2012318279B2 (en) | 2011-10-18 | 2015-06-04 | Csl Behring Gmbh | Use of sulfated glycosaminoglycans for improving the bioavailability of Factor VIII |
WO2013057171A1 (en) | 2011-10-18 | 2013-04-25 | Csl Behring Gmbh | Combined use of a sulfated glycosaminoglycan and a hyaluronidase for improving the bioavailability of factor viii |
ES2651523T3 (es) | 2012-02-15 | 2018-01-26 | Csl Behring Gmbh | Variantes del Factor de von Willebrand que tienen afinidad de unión al Factor VIII mejorada |
DK2796145T3 (da) | 2013-04-22 | 2018-01-29 | Csl Ltd | Et kovalent kompleks af von Willebrand-faktor og faktor VIII linket af en disulfidbro |
AU2014346343B2 (en) | 2013-11-08 | 2018-05-10 | Csl Ltd. | New method to concentrate von Willebrand factor or complexes thereof |
DK3164150T3 (da) | 2014-07-02 | 2021-02-08 | CSL Behring Lengnau AG | Modificeret von willebrand-faktor |
US10626164B2 (en) | 2014-07-25 | 2020-04-21 | Csl Limited | Purification of VWF |
FR3034669B1 (fr) | 2015-04-07 | 2020-02-14 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Nouvelle utilisation du facteur von willebrand |
WO2017066683A1 (en) * | 2015-10-15 | 2017-04-20 | Plasma Technologies, Llc | Methods for extracting proteins from blood plasma |
RU2018128582A (ru) | 2016-01-07 | 2020-02-11 | Цсл Беринг Ленгнау Аг | Мутированный укороченный фактор фон виллебранда |
SG10201912857XA (en) | 2016-01-07 | 2020-02-27 | CSL Behring Lengnau AG | Mutated von willebrand factor |
CN105622746A (zh) * | 2016-02-04 | 2016-06-01 | 江西博雅生物制药股份有限公司 | 一种从冷沉淀提取凝血因子ⅷ的废料中提取人血管性血友病因子的制备工艺 |
CN105541997A (zh) * | 2016-02-04 | 2016-05-04 | 江西博雅生物制药股份有限公司 | 一种高纯度和高活性血管性血友病因子的制备工艺 |
CN105622747A (zh) * | 2016-02-04 | 2016-06-01 | 江西博雅生物制药股份有限公司 | 一种vWF活性保护液 |
EP3488858A1 (en) | 2017-11-27 | 2019-05-29 | Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies | A von willebrand factor composition for use in treating a pathology mediated by angiogenesis |
CN114249812B (zh) * | 2020-09-22 | 2023-09-15 | 四川远大蜀阳药业有限责任公司 | 一种降低vWF制品中IgM含量的方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61166542A (ja) * | 1985-01-18 | 1986-07-28 | Hitachi Chem Co Ltd | 感光性組成物 |
US4970300A (en) * | 1985-02-01 | 1990-11-13 | New York University | Modified factor VIII |
US5006642A (en) * | 1987-06-29 | 1991-04-09 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Purification of von Willebrand Factor by affinity chromatography |
FR2632309B1 (fr) * | 1988-06-07 | 1990-08-24 | Lille Transfusion Sanguine | Procede de purification par voie chromatographique de proteines, notamment de facteur viii, et les produits obtenus |
-
1991
- 1991-03-08 FR FR9102804A patent/FR2673632A1/fr active Granted
-
1992
- 1992-02-19 AU AU11131/92A patent/AU645172B2/en not_active Expired
- 1992-02-24 NZ NZ241701A patent/NZ241701A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-02-24 IL IL10104392A patent/IL101043A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-02-26 CZ CS92568A patent/CZ283633B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-02-26 SK SK568-92A patent/SK279533B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-02-26 ZA ZA921430A patent/ZA921430B/xx unknown
- 1992-02-27 ES ES92400505T patent/ES2121830T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-27 EP EP92400505A patent/EP0503991B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-27 DE DE122009000034C patent/DE122009000034I2/de active Active
- 1992-02-27 DK DK92400505T patent/DK0503991T3/da active
- 1992-02-27 DE DE69227055T patent/DE69227055T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-03 JP JP08030592A patent/JP3435668B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-04 BE BE9200215A patent/BE1004178A3/fr not_active IP Right Cessation
- 1992-03-05 CA CA002062340A patent/CA2062340C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-05 NO NO920867A patent/NO301278B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-03-06 AT AT0043692A patent/AT407115B/de not_active IP Right Cessation
- 1992-03-06 BR BR929200770A patent/BR9200770A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-03-06 US US07/846,852 patent/US5408039A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-06 FI FI920992A patent/FI106721B/fi active
- 1992-03-06 RU SU925011041A patent/RU2088590C1/ru active
- 1992-03-06 HU HU9200767A patent/HU215098B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-03-06 PL PL92293738A patent/PL168353B1/pl unknown
- 1992-03-06 IT ITTO920189A patent/IT1256692B/it active IP Right Grant
- 1992-03-07 EG EG13192A patent/EG20300A/xx active
- 1992-04-18 SA SA92120446A patent/SA92120446B1/ar unknown
- 1992-12-30 LT LTIP266A patent/LT3175B/lt not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-05-21 UA UA93002713A patent/UA27732C2/uk unknown
-
1994
- 1994-05-23 EE EE9400004A patent/EE03057B1/xx not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-07-07 NL NL300394C patent/NL300394I1/nl unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU215098B (hu) | Eljárás igen nagy tisztaságú, gyógyászatilag alkalmazható, standardizált humán von Willebrand-faktor koncentrátum előállítására nagyüzemi méretekben | |
CA2201714C (en) | Method for isolation of highly pure von willebrand factor | |
US5872099A (en) | High molecular and low molecular fractions of von Willebrand Factor | |
AU2003244850B2 (en) | Processes for the preparation of fibrinogen | |
SI9012034A (en) | Process for preparing a concentrate of blood coagulation factor viii - von willebrand factor complex from total plasma | |
US7888476B2 (en) | Process for the preparation of a von Willebrand (FvW) factor concentrate by chromatography and a FvW concentrate thus obtainable | |
CA2749902C (en) | New process for highly selective purification of two plasma proteins: von willebrand factor (vwf) and fibronectin (fn) | |
EP0245875A2 (en) | Method of purifying factor VIII | |
EP0052874A1 (en) | Method for synthesizing procoagulant factor VIII activity | |
de Lille | Burnouf-Radosevich et a1. | |
JP2931319B2 (ja) | 血液凝固第▲viii▼因子の製造法 | |
JPS59167519A (ja) | 不活化トロンビンゲルにより血漿タンパク質混合液からフイブリノ−ゲンを除去する方法 | |
LV10193B (en) | Highly clean and therapeutically usable standardized method for producing Willebrand factor concentrate for industrial production |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |