OA10488A - Conjugué peg-ifn alpha physiologiquement actif procédé pour sa préparation compositions pharmaceutiques le contenant et leur utilisation - Google Patents

Conjugué peg-ifn alpha physiologiquement actif procédé pour sa préparation compositions pharmaceutiques le contenant et leur utilisation Download PDF

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OA10488A
OA10488A OA70015A OA70015A OA10488A OA 10488 A OA10488 A OA 10488A OA 70015 A OA70015 A OA 70015A OA 70015 A OA70015 A OA 70015A OA 10488 A OA10488 A OA 10488A
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Description

0 1 0488
Conjugué PEG-IFNcc physiologiquement actif, procédé pour sa préparation, compositions pharmaceutiques le contenant et leur utilisation L'interféron, en particulier l'interféron a2a, est 5 une protéine pharmaceutiquement active qui a une activitéantivirale et antiproliférative. Par exemple, l'interféronest utilisé pour traiter la leucémie à tricholeucocytes etle sarcome de Kaposi, et est actif contre l'hépatite. Afind'améliorer la stabilité et la solubilité, et de réduire 10 1'immunogénicité, des protéines pharmaceutiquement actives telles que l'interféron peuvent être conjugées au polymèrepolyéthylèneglycol (PEG).
La biodisponibilité d'agents thérapeutiques pro-téiques est fréquemment limitée par leur courte durée de vie 15 dans le plasma, les empêchant ainsi d'atteindre leur acti-vité clinique maximale. Ces dernières années, des bio-molécules conjuguées au PEG se sont révélées avoir des pro-priétés cliniquement utiles [Inada et coll., J. BioacC. andCompatible Polymers 5, 343 (1990); Delgado et coll., 20 Critical Reviens in Therapeutic Drug Carrier Systems 9, 249(1992); Katre, Advanced Drug Delivery Systems 10, 91(1993)]. Celles-ci comprennent une meilleure stabilité phy-sique et thermique, une meilleure protection contre la sen-sibilité à la dégradation enzymatique, une solubilité 25 accrue, une plus longue demi-vie de circulation in vivo, une 010488 2 clairance diminuée et une activité accrue. Il a été reportéque des conjugués de PEG ramifié présentent une stabilitéaccrue à l'égard de la température et du pH, et une plusgrande stabilité à l'égard de la digestion protéolytique quedes conjugués de PEG linéaire [Monfardini et coll., Bio-conjugate Chem. 6, 62 (1995)] . D'autres propriétés de pro-téines conjuguées au PEG sont une immunogénicité et uneantigénicité réduites, ainsi qu'une toxicité réduite. Unautre effet de la conjugaison au PEG (également dénomméeci-après PEGylation) de certaine protéines peut être uneactivité in vivo réduite accompagnée d'une activité in vivoaccrue. Cela a été constaté, entre autres, pour le G-CSF(facteur de croissance des granulocytes) (Satake-Ishikawa etcoll., Cell, Structure and Function 17, 157-160 (1992)], .l'IL-2 [Katre et coll., Proc. Natl. Acad.' Sci. USA 84, 1487(1987)], le TNF-oc [Tsutsumi et coll., Jpn. J. Cancer Res. 85, 9 (1994)], l'IL-6 [Inoue et coll., J. Lab. Clin. Med. 124, 529 (1994)] et la CD4-IgG [Chamow et coll., Bioconj.Chem. 5, 133 (1994)].
Il a été montré à présent que dans le cas de l'inter-féron, la PEGylation réduit l'activité antivirale in vitromais augmente l'activité antiproliférative dans des cellulestumorales humaines. Toutefois, le nouveau conjuguéinterféron-PEG de la présente invention a des propriétéssurprenantes, en ce que l'activité antiproliférative de1'interféron-PEG est bien supérieure à celle non seulementde l'interféron mais également d'autres conjuguésinterféron-PEG. Bien que l'activité antiproliférative duconjugué soit grandement augmentée par rapport à celled'autres conjugués PEG-interféron ce, la diminution de l'ac-tivité antivirale est similaire. En outre, le conjugué PEG-interféron ce de l'invention est non immunogène, il ne sus-cite pratiquement pas de formation d'anticorps. Par contre,d'autres conjugués PEG-interf éron ce suscitent une formationlimitée d'anticorps. 010488 3
En conséquence, l'invention concerne une nouvelleclasse de dérivés PEG d'interféron a (IFNa) . Le conjugué dela présente invention a une structure de PEG ramifiée, commeon peut le voir ci-dessous. La structure ramifiée offrel'avantage de permettre l'attachement de deux molécules dePEG linéaires en un seul site, ce qui double la masse de PEGattachée sans multiples sites de PEGylation.
Par comparaison avec l'IFNa non modifié (c'est-à-direl'IFNa sans PEG attaché), le conjugué a une demi-vie accrueen circulation et un temps de séjour accru dans le plasma,une immunogénicité réduite, une clairance diminuée et uneactivité antiproliférative accrue, en même temps qu'uneactivité antivirale in vitro diminuée. Par comparaison avecd'autres conjugués PEG-IFNa, le conjugué de la présenteinvention a une beaucoup plus forte activité anti- proliférative, hors de proportion avec l'augmentation ou ladiminution se produisant pour ses autres caractères, et n'apratiquement pas d'immunogénicité.
Le conjugué PEG-IFNcc physiologiquement actif de laprésente invention correspond à la formule:
O
II ROCH2CH2(OCH2CM2)n—O—C — NH j (CH2)„
CH ROCH2CH2(OCH2CH2)n‘—O—C—-NH Ç—X— IFNtt
O O
Le conjugué de la présente invention a les mêmes uti-lisations que l'IFNa, par exemple, des utilisations anti-prolifératives. En particulier, les conjugués PEG-interféron a de la présente invention peuvent être utiliséspour traiter des troubles immunomodulateurs tels que des 010488 4 maladies néoplasiques, par exemple la leucémie à tricho-leucocytes, la leucémie myéloïde chronique (LMC) et le sar-come de Kaposi, et des maladies infectieuses, de la mêmefaçon que les IFNa (en particulier l'IFNoc2a) sont utiliséspour le traitement de ces maladies. Cependant, le conjuguéde la présente invention a des propriétés améliorées, com-prenant une plus grande stabilité, une plus grande solubi-lité, une demi-vie prolongée en circulation et des temps deséjour accrus dans le plasma. En outre, ces conjugués ontune activité proliférative qui est supérieure à celle del'IFNa. Comme il a été indiqué, le conjugué présente égale-ment une surprenante dissociation des effets antiviraux etantiprolifératifs. Cette propriété est en outre utile pourstimuler une activité désirée d'un conjugué, tout en dimi-nuant ou éliminant une activité indésirable. Par exemple, siun effet secondaire indésirable est associé à l'activitéantivirale, l'élimination de cette activité élimineraitl'effet secondaire, tout en conservant l'activité anti-proliférative. En conséquence, la présente invention com-prend également les compositions pharmaceutiques à base descomposés de formule I ou de leurs sels, et des procédés pourleur préparation.
Les compositions pharmaceutiques de la présenteinvention, utilisées pour combattre ou prévenir des mala-dies, comprennent un conjugué d'interféron de formule géné-rale I et un véhicule thérapeutiquement inerte, non toxiqueet thérapeutiquement acceptable. Les compositions pharmaceu-tiques à utiliser peuvent être formulées et dosées d'unefaçon en accord avec la bonne pratique médicale, en prenanten considération le trouble à traiter, l'état du patientindividuel, le site où est amené le conjugué de protéine, lemode d'administration et d'autres facteurs connus du prati-cien.
Le conjugué revendiqué est un conjugué PEG-IFNa phy-siologiquement actif, de formule 5 010488
II
HOCI l2CH2(OCH2CH2)n—O—C—Nl-I
CH
— X— IFNoc
II R'OCH2CH2(OCH2CH2)n'—O—C—K..
O dans laquelle R et R' représentent chacun, indépendammentl'un de l'autre, un groupe alkyle inférieur; X est NH ou O(X est au moins l'un des groupes fonctionnels, dans la molé-cule d'IFNa, choisi parmi NH^ et OH); n et n' sont desnombres entiers dont la somme va de 600 à 1 500; et la massemoléculaire moyenne des motifs polyéthylèneglycol dans leditconjugué va d'environ 26 000 Da à environ 60 000 Da. Le con-jugué de formule I a une structure ramifiée, étant donné quedeux fragements PEG sont reliés à la protéine par un seulchaînon de liaison.
Les nombres n et n' sont choisis de manière que leconjugué résultant de formule I ait une activité physiolo-gique d'IFNa, laquelle activité peut être la même que l'ac-tivité de l'IFNa non modifié, ou peut être supérieure àcelle-ci ou représenter une fraction de celle-ci. n et n' (net n' peuvent être identiques ou différents) représentent lenombre de motifs éthylèneglycol dans le PEG. Un seul motifOCH2CH2 de PEG a une masse moléculaire d'environ 44 Da. Lamasse moléculaire du conjugué (à l'exclusion de la massemoléculaire de l'IFNa) dépend des nombres n et n'. La sommede n et n' pour le conjugué de formule I va de 600 à 1 500,pour donner un conjugué ayant une masse moléculaire moyennetotale de motifs PEG allant d'environ 26 000 à 66 000, depréférence d'environ 35 000 à 45 000 Da, et en particulierd'environ 39 000 à 45 000 Da, la masse moléculaire de40 000 Da étant particulièrement préférée. La somme préféréede*· n et n' va d'environ 800 à 1 200, la somme moyenne allant 010488 6 d'environ 850 à 1 000 et la somme préférée étant d'environ910. n ou n' peuvent représenter individuellement 420 ou520, ou les deux peuvent représenter 420 ou 520, ou les deuxpeuvent représenter chacun 455. Le rapport préféré de n à n'va d'environ 0,5 à 1,5, un rapport particulièrement préféréallant d'environ 0,8 à environ 1,2. Une masse moléculaired'"environ" un certain nombre signifie que celle-ci est com-prise dans une plage raisonable autour de ce nombre, commedéterminée par des techniques analytiques classiques.
On préfère également un conjugué de formule I danslequel l'IFNa est l'IFNa2a, un conjugué dans lequel R et R'représentent le groupe méthyle, un conjugué dans lequel Xest NH, et un conjugué dans lequel n et n' représententindividuellement ou l'un et l'autre 420 ou 520. Un tel con-jugué présentant toutes les caractéristiques ci-dessus estparticulièrement préféré. R et R' peuvent être un groupe alkyle inférieur quel-conque, par lequel on entend un groupe alkyle ayant de 1 à6 atomes de carbone, tel que le groupe méthyle, éthyle, iso-propyle, etc. Les groupes alkyle ramifiés sont inclus. Ungroupe alkyle préféré est le groupe méthyle. En ce qui con-cerne les deux groupes PEG de formule I, R et R' peuventêtre identiques ou différents.
Par IFNa (interféron oc) , et en particulier IFNa2a, onentend la protéine naturelle ou recombinante, de préférencehumaine, telle qu'obtenue à partir d'une source classiquequelconque telle que des tissus, une synthèse de protéine,une culture de cellules naturelles ou recombinantes. Touteprotéine ayant l'activité de l'IFNa, telle qu'une mutéine ouune protéine modifiée d'une autre façon, est englobée. L'ob-tention et l'isolement d'IFNa à partir de sources naturellesou recombinantes sont bien connus [Pestka, Arch. Bïochcm.Biophys. 221, 1 (1983)]. Un IFNa préféré est l'IFNa2a qui,comme indiqué plus haut, est obtenu par des méthodes connues[Pestka, Sci. Am. 249, 36 (1983); EP-B-43 980)]. 01 0488 7
Le conjugué physiologiquement actif de formule I aune activité IFNa, par laquelle on entend une fraction ou unmultiple de toute activité d'IFNa connue, telle que détermi-née par divers essais connus dans la technique. En particu-lier, les conjugués de la présente invention ont une acti-vité d'IFNa, telle qu'indiquée par une activité anti-proliférative contre des cellules tumorales, et une activitéantivirale contre des cellules infectées par un virus. Cesont des activités connues de l'IFNa. Une telle activitédans un conjugué peut être déterminée par des essais bienconnus dans la technique/ par exemple, les essais décritsci-dessous [voir également Rubinstein et coll., J. Virol. 37, 755 (1981); Borden et coll., Cane. Res. 42, 4948(1982)]. Une partie de la présente invention est un conjuguéde formule I ayant une plus forte activité antiproliférativeet une activité antivirale moindre que l'IFNa non modifié.
Le conjugué de formule I est obtenu par attachementpar liaison convalente d'IFNa au PEG, qui a été activé parremplacement d'un groupe hydroxy du PEG par un groupe deliaison, pour donner un réactif qui est un dérivé N-hydroxy-ester succinimidique de PEG (en particulier monométhoxy-PEG)de formule II. Le réactif peut être obtenu par des méthodesclassiques (Monfardini et coll., réf. cit.). L'attachements'effectue par une liaison amide ou ester. Dans un conjuguépréféré, l'attachement se fait par une liaison amide (X estNH). L'invention concerne également un procédé pouraccroître l'activité antiprolifératrive d'IFNa, tout enréduisant l'activité antivirale de l'IFNa, par attachementde l'IFNa, tel que décrit plus haut, à un réactif de for-mule II, pour l'obtention d'un conjugué PEG-IFN. X représente le site d'attachement sur l'IFNa, parlequel le réactif PEG de formule II est lié par covalence àl'IFNa. Les réactifs se lient aux groupes amino primaires(XH = NH2), par exemple, sur la lysine, ou à l'extrémitéN-terminale de l'IFNa. Les réactifs peuvent également s'at- 010488 8 tacher à un groupe hydroxy (XH = OH) présents par exemplesur la sérine.
O
II
ROCH2CH2(OCH2CII2)u— O—C—NH (CU2)., 11 R'OCH2CH2(OCH2CH2)n· eu •O—C—NH ,Ç
IIO
+ XH-IFNa
O
II
ROCI I2Cl 12(OC I l2CI I2)„ —ο —C —NH O. (CU2)4
+ HON
Cil R OCI HCl I2(OCI12CI I2)n--O—C—Nil
II
O Y—x—. iFNcr.
O
Le réactif de formule II (PEG2-NHS), dans lequel deuxchaînes monométhoxy-PEG (m-PEG) au total sont liées à lalysine, chacune au niveau des groupes amino a et c, par desliaisons carbamate (uréthanne) et dont le groupe carboxy dela lysine est activé en un ester de succinimidyle, peut êtreobtenu par des méthodes classigues, selon des procédés con-nus (Monfardini et coll., réf. cit.) applicables à un réac-tif dans lequel R représente un groupe alkyle inférieur, etn est un nombre désiré. Le réactif peut être obtenu auprèsde Shearwater Polymers Inc. (Huntsville, Alabama, USA). Lamasse moléculaire moyenne préférée du PEG obtenu est d'envi-ron 20 000 Da, ce qui donne une masse de PEG totale d'envi-ron 40 000 Da dans le PEG2-NHS (on peut obtenir d'autresmasses moléculaires en faisant varier n pour les produits de 9 010488 départ PEG-alcool pour le réactif de formule II, par desméthodes classiques.
Le réactif de formule II peut être conjugué à l'IFNapar des méthodes classiques. En particulier, le réactif deformule II réagit principalement avec un ou plusieurs desgroupes amino primaires (par exemple l'extrémité N-terminaleet les chaînes latérales de la lysine) de l'IFNa (parexemple l'IFNa2a), pour former une liaison amide entrel'IFNa et le squelette polymère du PEG. La réaction dePEGylation peut également avoir lieu entre PEG2-NHS et lesgroupes hydroxy libres (s'ils existent) (par exemple de lasérine) de l'IFNa pour former une liaison ester. Le méca-nisme de réaction est indiqué ci-dessus. Les conditionsréactionnelles sont classiques pour l'homme de métier etsont données en détail ci-dessous. Le réactif PEG est com-biné avec l'IFNa dans des conditions modérément basiques, àbasse température, dans des conditions appropriées à unesubstituation nucléophile, conduisant à la formation du con-jugué de formule I. Cela est également indiqué dans le méca-nisme de réaction ci-dessus. L'attachement des réactifs à l'IFNa peut être effec-tué par des méthodes classiques. On peut utiliser des PEG àtoute masse moléculaire choisie de la présente invention.
Les conditions réactionnelles peuvent être choisies pourdonner le conjugué revendiqué avec un réactif attaché. Leconjugué de formule I, auquel est attaché un seul réactif deformule II, est séparé, par des méthodes classiques, del'IFNa non modifié et des conjugués auxquels sont attachéesplusieurs molécules de réactif. On peut utiliser desméthodes de purification, telles que la chromatographied'échange de cations, pour séparer des conjugués par la dif-férence de charge, qui sépare efficacement les conjuguésselon leurs diverses masses moléculaires. Le contenu desfractions obtenues par chromatographie d'échange de cationspeut être identifié par la masse moléculaire, au moyen de 010488 10 méthodes classiques, par exemple la spectroscopie de masse,l'électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE) oud'autres méthodes connues pour la séparation d'entités molé-culaires en fonction de la masse moléculaire. On identifiealors par conséquent une fraction qui contient le conjuguéde formule I purifié, exempt d'IFNcc non modifié et de conju-gués auxquels est attaché plus d'un réactif. En outre, lesréactifs de formule II libèrent un résidu lysine par réac-tif, lors de l'hydrolyse acide, de sorte que le nombre derésidus lysine dans l'hydrolyse indique le nombre de PEGattachés à la protéine, ce qui permet de vérifier le nombrede molécules de réactif attachées à un conjugué. L'invention est illustrée à l'aide des exemples des-criptifs et non limitatifs ci-après. L'IFNa2a est utilisédans ces exemples. D'autres espèces d'IFNa peuvent égalementêtre conjuguées au PEG par les méthodes données en exemple.
DESCRIPTION DES DESSINS
Figure 1: activité antitumorale du conjugué PEG2-IFNa2a chez des souris nude auxquelles ont été implantéespar voie sous-cutanée des cellules rénales A498 humaines.Tous les animaux ont reçu un implant sous-cutané de g 2x10 cellules rénales A498 humaines au jour -33 de l'étude. Au jour zéro de l'étude, on a commencé le traite-ment par le conjugué PEG-IFNa2a. On a administré par voiesous-cutanée la quantité indiquée (30, 60, 120 ou 300 pg) dePEG2-IFNa2a, sous le flanc opposé à la tumeur, une fois parsemaine pendant une période de 4 semaines.
Figure 2: activité antitumorale d'IFNa2a chez dessouris nude auxquelles ont été implantées par voie sous-cutanée des cellules rénales A498 humaines. Tous les animauxont reçu un implant sous-cutané de 2x10° cellules rénalesA498 humaines au jour -33 de l'étude. Au jour zéro del'étude, on a commencé le traitement par l'IFNa2a. La quan-tité indiquée (10, 20, 40 ou 100 ug) d'IFNa2a a été adminis-trée par voie sous-cutanée sous le flanc opposé à la tumeur, 11 010488 trois fois par semaine pendant une période de 4 semaines.
Figure 3: activité antitumorale de PEG2-IFNa2a chez des souris nude auxquelles ont été implantées par voie sous- cutanée des cellules rénales ACHN humaines. Tous les animaux6 ont reçu un implant sous-cutané de 2x10 cellules rénalesACHN humaines au jour -25 de l'étude. Au jour zéro del'étude, on a commencé le traitement par le PEG2-IFNa2a. Laquantité indiquée (30, 60, 120 ou 300 ug) de PEG2-IFNa2a aété administrée par voie sous-cutanée sous le flanc opposé àla tumeur, une fois par semaine pendant une période de5 semaines.
Figure 4: activité antitumorale d'IFNa2a chez dessouris nude auxquelles ont été implantées par voie sous-cutanée des cellules rénales ACHN humaines. Tous les animauxont reçu un implant sous-cutané de 2x10^ cellules rénalesACHN humaines au jour -25 de l'étude. Au jour zéro del'étude, on a commencé le traitement par l'IFNa2a. La quan-tité indiquée (10, 20, 40 ou 100 pg) d'IFNa2a a été adminis-trée par voie sous-cutanée sous le flanc opposé à la tumeur,trois fois par semaine pendant une période de 5 semaines.
Figure 5: activité antitumorale de PEG2-IFNa2a chezdes souris nude auxquelles ont été implantées par voie sous-cutanée des cellules rénales G402 humaines. Tous les animaux g ont reçu un implant sous-cutané de 2x10 cellules rénalesG402 humaines au jour -45 de l'étude. Au jour zéro del'étude, on a commencé le traitement par le PEG2-lFNa2a. Laquantité indiquée (30, 60, 120 ou 300 pg) de PEG2-IFNa2a aété administrée par voie sous-cutanée sous le flanc opposé àla tumeur, une fois par semaine pendant une période de5 semaines.
Figure 6: activité antitumorale d'IFNa2a chez dessouris nude auxquelles ont été implantées par voie sous-cutanée des cellules rénales G402 humaines. Tous les animauxont reçu un implant sous-cutané de 2x10^ cellules rénalesG402 humaines au jour -45 de l'étude. Au jour zéro de 12 010488 l'étude, on a commencé le traitement par l'IFNa2a. La quan-tité indiquée (10, 20, 40 ou 100 Mg) d'IFNa2a a été adminis-trée par voie sous-cutanée sous le flanc opposé à la tumeur,trois fois par semaine pendant une période de 5 semaines.
Exemple 1
Préparation du conjugué de formule I
Matériels L'interféron a2a a été préparé par des méthodes con-nues (Petska, réf. cit.). Le réactif polyéthylèneglycol(PEG) de formule II a été acquis auprès de ShearwaterPolymers Inc. (Huntsville, Ala, USA). La résineFractogel® EMD CM 650(S), à tailles de particules de25-40 jum, a été fournie par EM Séparations (Gibbstown, MA,USA). La solution salée tamponné au phosphate (STP) concen-trée (10x), pH 7,3, a été acquise auprès de BioWhittaker(Walkersville, MD, USA). Les gels précoulés pour électro-phorèse en gel de polyacrylamide/dodécyl{lauryl)suifate desodium (SDS-PAGE) et les unités d'électrophorèse ont étéobtenus auprès de NOVEX (San Diego, CA, USA). Le colorantrapide concentré pour la coloration de protéines de conju-gués de PEG sur SDS-PAGE a été acquis auprès de ZoionResearch Inc. (Newton, MA, USA). Le nécessaire d'essaid'endotoxines LAL a été acquis auprès d'Associates of CapeCod Inc. (Woods Hole, MA, USA). Tous les autres réactifsutilisés étaient de la meilleur qualité disponible. Les sou-ris BDF-1 et les rats porteurs de canules jugulaires ont étéfournis par Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA) . Méthodes expérimentales
A. Préparation à petite échelle du conjugué de formule I
On a ajouté 208 mg (5,2 pmoles) du réactif de for-mule II (masse moléculaire moyenne: 40 000 Da) à 50 mg(2,6 Moles) d'IFNa dans 10 ml de tampon borate 100 mM,pH 8,0. Le rapport molaire final protéine/réactif était 1:2.Le mélange réactionnel a été agité à 4°C pendant 2 heures. 010488 13
On a mis fin à la réaction en ajustant le pH à 4,5 à l'aided'acide acétique glacial.
On a dilué le mélange réactionnel par le facteur 50avec de l'eau, on a filtré la dilution à travers un filtrede 0,2 pm et on a injecté le filtrat dans une colonne Amicon(3,2 x 13 cm) garnie de Fractogel EMD CM 650(S), à un débitde 20 ml/min. La colonne était précédemment équilibrée avecde l'acétate d'ammonium 10 mM, pH 4,5. L'effluent de lacolonne a été contrôlé par absorption UV à 280 nm. On aensuite lavé la colonne avec le tampon d'équilibrage, jus-qu'à ce que l'absorption UV revienne à la ligne de base. Lesconjugués PEG-IFN comportant plus d'un réactif de formule IIattaché (oligomères PEG-IFN) ont été élués avec de l'acétated'ammonium 40 mM, pH 4,5, et le conjugué de formule I a étéélue avec NaCl 0,12 M dans le tampon acétate d'ammonium40 mM. L'IFN non modifié restant dans la colonne a été éluéavec NaCl 0,5 M dans le même tampon. La colonne a été régé-nérée par un lavage avec NaCl 1,0 M, suivi d'un lavage avecle tampon d'équilibrage. Les fractions réunies du conjuguéde formule I ont été concentrées à environ 1 mg/ml dans unconcentrateur à cellules agité Amicon muni d'une membraneYM10 .
La résine échangeuse de cations Fractogel CM 650 (S),utilisée pour la purification, adsorbait efficacement le PEGet l'IFN non modifié. La force d'adsorption dépendait dudegré de PEGylation. Les conjugués étaient fixés moins for-tement que l'IFN non modifié. Les oligomères PEG-IFN ont étéélués avec de l'acétate d'ammonium 40 mM, tandis que le con-jugué de formule I a été élué avec NaCl 0,12 M. L'IFN nonmodifié a été élué avec NaCl 0,5 M. Toutes les préparationscontenaient moins de 5 UE/mg d'endotoxine. La préparationrésultante contenait plus de 99 % de conjugué de formule Iet était exempte d'IFN non modifié. 010488 14
B. Préparation à grande échelle du conjugué de formule I
On a dissous 6,24 g (156 umoles) du réactif de for-mule II (masse moléculaire moyenne: 40 000 Da) dans 63 ml deHCl 1 mM, à 4°C, et on les a ajoutés rapidement à 125 mld'une solution contenant 1 g (52 umoles) d'interféron dansdu tampon borate 50 mM, pH 9,0. Le rapport final protéine/réactif était de 1:3, et la concentration finale de protéinedans le mélange réactionnel était de 5,3 mg/ml. Le mélangeréactionnel a été agité pendant 2 heures à 4°C. On a mis finà la réaction en ajustant le pH à 4,5 avec de l'acide acé-tique glacial.
On a dilué le mélange réactionnel par un facteur de10 avec de l'eau, et on l'a injecté dans un colonne garnieavec 600 ml de Fractogel EMD CM 650(M), équilibrée précédem-ment avec de l'acétate de sodium 20 mM, pH 4,5, à unevitesse linéaire de 1,3 cm/min. On a lavé la colonne avec letampon d'équilibrage puis avec NaCl 10 mM, pour éliminer leréactif en excès, les sous-produits de réaction et lesoligomères PEG-IFN. Le conjugué de formule I a été élué avecle tampon d'équilibrage contenant NaCl 200 mM. L'interféronnon modifié, encore adsorbê sur la colonne, a été éliminépar lavage avec NaCl 0,75 M dans le tampon d'équilibrage. Leconjugué de formule I, qui a été élué à 0,3-0,5 mg/ml, a étéconcentré davantage et soumis à une diafiltration dans letampon de formulation final, composé d'acétate de sodium20 mM, pH 5,0, contenant NaCl 150 mM. Le rendement global enle conjugué de formule I était de 40-45 %.
Le PEG-IFN purifié provenant de la préparation àgrande échelle consiste en plus de 99 % de conjugué de for-mule I. La masse moléculaire moyenne du conjugué de for-mule I de cet exemple est de 62 000 Da, comprenant la massemoléculaire de l'IFNa2a, qui est de 19 241 Da, et la massemoléculaire moyenne du réactif, qui est comprise entre40 000 et 45 000 Da, soit environ 43 000 Da. 15 010488
Exemple 2
Caractérisation du conjugué de formule IDosage de protéines
On a déterminé les concentrations de protéines enutilisant une valeur A28q. de 1,0 pour une solution à 1 mg/mld'IFNa2a.
Analyse par SDS-PAGE
On a analysé le conjugué par électrophorèse en gel depolyacrylamide/dodécyl(lauryl)sulfate de sodium (à 8-16 %),dans des conditions réductrices, selon la méthode de Laemmli[Nature 227, 680 (1970)]. Pour la détermination des pro-téines, on a coloré les gels de SDS-PAGE contenant les con-jugués de PEG à l'aide du colorant Fast Stain (ZoionResearch Inc.) conformément aux directives du fournisseur.Détermination des taux d'endotoxines
Les taux d'endotoxines ont été déterminés à l'aide dela méthode LAL, selon les directives du fournisseur. Toutesles préparations contenaient moins de 5 UE/mg d'endotoxine.
Exemple 3
Activités biologiques in vitro du conjugué de formule I
Activité antivirale dans des cellules rénales bovines
On a déterminé l'activité antivirale in vitro del'IFNa2a et du conjugué de formule I, tel que préparé dansl'exemple IA, dans un essai biologique en culture cellu-laire, en utilisant des cellules rénales bovines Madin-Darby(MDBK) infectées avec le virus de la stomatite vésiculeuse(Rubinstein et coll., réf. cit.). Les activités antiviralessont données dans le tableau I, en même temps que leursactivités résiduelles correspondantes, en pourcentage del'IFN de départ. 010488 16
Tableau 1
Activités antivirales
Echantillons Type dePEG Massetotalede PEG(kDa) Nombrede rési-dus Lysmodifiés Activité spécifique (U/mg) Activité résiduelle (%) IFNa2a - - - 2,OOxlO8 100 Conjugué deformule I ramifié 40 1 1,40xl07 7
Activité antiproliférative in vitro sur des cellules tumo-rales humaines
Les activités antiprolifératives in vitro ont ététestées sur des cellules Daudi (lymphome de Burkitt)humaines, comme décrit par Borden et coll. Les cellulesDaudi humaines ont été maintenues sous forme de cultures ensuspension stationnaire dans du milieu RPMI 1640 additionnéde 10 % de sérum bovin foetal et de glutamine 2 mM (GrandIsland Biologicals, Grand Island, NY, USA). Les cellules ontété analysées et se sont révélées être exemptes de myco-plasmes. Dans chaque puits de plaques de microtitrage 4 (Costar, MA) , on a introduit 2x10 cellules dans 100 pl demilieu. On a introduit dans les puits diverses concentra-tions d'IFN et du conjugué de formule I, tel que préparédans l'exemple IA, dans un volume de 100 pl. On a mis lesplaques à incuber pendant 72 heures à 37°C dans une atmos-phère contenant 5 % de CO^· Seize heures avant la récoltedes cellules, on a marqué les cellules avec 0,25 pCi/puitsde 3H-thymi’dine (New England, Boston, MA, USA) . Les cellulesont été récoltées sur des filtres en verre et soumises à uncomptage dans un compteur de scintillation en milieuliquide. Les résultats ont été exprimés en pourcentaged'inhibition, calculé à l'aide de la formule suivante: inhibition, % = [(A - B/A)] x 100, où: A = cpm dans la culture témoin (cellules mises àincuber dans le milieu seul) 010488 17 10 B = cpm dans la culture expérimentale.
Les échantillons ont été soumis à 4 essais en paral-lèle, et l'écart-type était inférieur à 20 % de la moyennede tous les cas. Les essais ont été effectués au moins deuxfois, avec des résultats comparables.
Les activités antiprolifératives (ΩΙ^θ) de l'IFN etdu conjugué sont données dans le tableau 2. Les donnéesindiquent une augmentation par le facteur 28 de l'activitéantiproliférative pour le conjugué de formule I, par compa-raison avec celle de l'IFN.
Tableau 2
Activités antiprolifératives in vitrosur la lignée cellulaire Daudi (lymphome de Burkitt) humaine
Activité antiproliférative 15
Echantillon IFNa2a
Conjugué de formule £Iso- (ng/ml) 0,56 0,02
Augmentation
Ix 28x 20 25 30
Exemple 4Pharmacocinétique
Des rates Sprague-Dawley, pesant en moyenne 240-260 g, sur lesquelles avaient été implantées chirurgicale-ment des canules jugulaires, ont été maintenues dans descages individuelles, avec un cycle d'éclairement-obscuritéde 12 heures, et avec libre accès à la nourriture et àl'eau. En l'espace de 4-6 heures après leur arrivée, on afait passer de la STP dans les canules jugulaires des rates.Le lendemain, après avoir fait passer dans les canules 0,ΙΞ-Ο, 2 ml de STP, on a injecté 2x10^ unités d'IFNa dans 0,2-0,4 ml de STP, puis on a injecté 0,15-0,2 ml de STP pourgarantir que la totalité du médicament avait été injectéeaux animaux. Chaque animal a donc reçu une dose de8χ10δ unités d'IFNa/.kg de poids corporel.
On a prélevé des échantillons de sang 5, 15 et 30 minutes ainsi que 1, 3, 5, 12 et 24 heures après l'injec- tion d'IFN et du conjugué de formule I. A tous les instants, 35 010488 18 après avoir éliminé les premiers 0,15-0,2 ml de sang, on aprélevé 0,5 ml de sang en utilisant une seringue neuve, parla canule jugulaire. Les échantillons ont été transférésdans des tubes à séparation de sérum, à la températureambiante. Après avoir recueilli tous les échantillons cor-respondant aux différents instants, on a centrifugé lestubes à 14 000 g pendant 10 minutes dans une centrifugeuseréfrigérée Eppendorf. Le sérum séparé a été transféré dansdes tubes pour microcentrifugeuse de 4,5 ml, et congelé à-80°C, jusqu'à l'emploi pour l'essai biologique,. Les échan-tillons de sérum ont été convenablement dilués, et l'acti-vité antivirale a chaque instant a été déterminée commedécrit. D'après la courbe de la variation de l'activité enfonction du temps, on a déterminé les demi-vies maximales duconjugué de formule I et de l'IFNa, et elles sont donnéesdans le tableau 3, qui donne également les temps de séjourplasmatiques.
Tableau 3
Demi-vies maximales (t ) 1/2 et temps de séjour plasmatiques moyens
Echantillon t (heures)—1/2—---
Temps de séjourplasmatique (heures) IFNa2a 2,1 1,0
Conjugué de formule I
La valeur t maximale1/2 aire logarithmique. 15,0 20,0 a été évaluée par régression liné-
Exemple 5Immunogénicité
Cinq fois par semaine, on a injecté une fois par jourpar voie intrapéritonéale à des souris BDF-1 normales (10par groupe) diverses préparations d'interféron contenant300 000 unités d'activité antivirale. On a également injectéà certaines souris une forme agrégée d'IFNa2a, plus immuno-gène que la forme monomère. On a prélevé des échantillons desang 19 jours après la dernière injection, et on a dosé les 010488 19 anticorps neutralisants dans le sérum. Comme on peut le voirdans le tableau 4, les souris auxquelles avait été injectéde l'IFN«2a ont produit des anticorps neutralisants, etcette réponse était fortement accrue chez les souris aux-quelles avaient été injectés des agrégats d'interféron.
Aucun anticorps n'était décelable chez la majorité des ani-maux auxquels avait été injecté le conjugué de la présenteinvention.
Tableau 4Immunogénicité
Anticorps (UNI/ml)*
Traitement
Plage 217 - 8 5338 000 - 768 0000-1 133
Moyenne 2 40042 6670 IFNa2a
Agrégats d'IFNa:2aConjugué de formule I* Unités de neutralisation d'interféron/ml.
Exemple 6
Activité antitumorale in vivo
On a évalué l'activité antitumorale in vivo d'un con-jugué de formule I (PEG2-IFNa2a) et d'IFNa2a non modifié endéterminant leur aptitude à réduire la taille de diversescellules tumorales humaines implantées par voie sous-cutanéeà des souris. Les résultats sont représentés sur lesfigures 1 à 6.
Mode opératoire: des souris nude athymiques (Harlan)ont reçu sous le flanc arrière gauche un implant sous-cutanéde 2xl06 cellules rénales A498 humaines (figures 1 et 2), decellules rénales ACHN humaines (figures 3 et 4) ou de cel-lules rénales G402 humaines (figures 5 et 6}. On a laisséles tumeurs se développer pendant 3 à 6 semaines, comme indiqué. Le critère de taille pour l'acceptation dans3 . l'étude était de 0,05 à 0,50 cm . On a administre aux souris des doses hebdomadaires totales de 30, 60, 120 ou 300 pg de PEG2-IFNa2a ou d'IFNa2a non modifié. Dans le cas de PEG2- IFNa2a, les souris ont été traitées une fois par semaine (le 010488 20 lundi) par 30, 60, 120 ou 300 ug de PEG2 FNa2a par traite-ment. Dans le cas de l'IFNa2a non modifié, les souris ontété traitées trois fois par semaine (lundi, mercredi, ven-dredi) par 10, 20, 40 ou 100 ug d'IFNa2a par traitement. Ladurée du traitement était de 4 à 5 semaines, en fonction del'agressivité des tumeurs. Les volumes des tumeurs ont étémesurés tous les lundis, avant le traitement. Résultats: le conjugué PEG2-IFNa2a a manifesté uneréduction marquée de la taille des tumeurs A498, par compa-raison avec l'IFNa2a non modifié, pour toutes les doses heb-domadaires testées, 7 jours, 14 jours, 21 jours et 28 joursaprès le début du traitement (figures 1 et 2) . Le traitementa été poursuivi pendant 4 semaines. Sept jours après l'arrêtdu traitement, on a sacrifié trois souris dans chaquegroupe. Chez les trois souris traitées par PEG2-IFNa2a,aucune tumeur résiduelle n'a été constatée. Chez les souristraitées par l'IFNa2a non modifié, le poids des tumeurs A498était de 1,28 g, 0,62 g et 1,60 g, respectivement, chez cha-cune des trois souris. Le poids des tumeurs A498 était de2,32 g, 2,37 g et 1,94 g chez chacune des trois souristémoins. Quatre-vingt jours après le début de la période detraitement de 4 semaines, on a examiné la présence detumeurs par palpation chez sept souris. Les sept sourisétaient toutes dépourvues de tissu tumoral à la palpation.
Le conjugué PEG2-IFNa2a a manifesté une réductionsignificative de la taille des tumeurs ACHN, par comparaisonavec l'IFNa2a non modifié, pour les doses hebdomadaires de60, 120 et 300 ug, au bout de 14, 21, 28 et 35 jours(figures 3 et 4).
Le conjugué PEG2-IFNa2a a manifesté une réduction significative de la taille des tumeurs G402, par comparaison avec l'IFNc<2a non modifié, pour les doses hebdomadaires de 60 et 120 pg, au bout de 14, 21, 28 et 35 jours (figures 5 et 6) .

Claims (16)

  1. 010488 21 REVENDICATIONS
    1. Conjugué PEG-IFNa physiologiquement actif, de formule O II ROC! I2CI !2(OCf I2C! I2)n—0 ~C - NH (CII2)4 eu R OCH2CU2(OCH2CH2)n—o-C~NH II O C—X— IPNa O dans laquelle R et R' représentent chacun, indépendammentl'un de l'autre, un groupe alkyle inférieur,· X est NH ou O;n et n' sont des nombres entiers dont la somme va de 600 à1 500, et la masse moléculaire moyenne des fragments poly-éthylèneglycol dans ledit conjugué va d'environ 26 000 Da àenviron 66 000 Da.
  2. 2. Conjugué de formule I, caractérisé en ce que lamasse moléculaire des fragments polyéthylèneglycol va d'en-viron 35 000 à environ 45 000 Da.
  3. 3. Conjugué selon la revendication 2, caractérisé ence que la masse moléculaire des fragments polyéthylèneglycolest d'environ 40 000 Da.
  4. 4. Conjugué selon la revendication 1, caractérisé ence que R et R' représentent le groupe méthyle.
  5. 5. Conjugué selon la revendication 1, caractérisé ence que X est NH.
  6. 6. Conjugué selon la revendication 1, caractérisé ence que l'IFNcc est l'IFNa2a.
  7. 7. Conjugué selon la revendication 1, caractérisé ence que la somme moyenne de n et n' va de 850 à 1 000.
  8. 8. Conjugué selon la revendication 1, caractérisé ence" que R et R' représentent le groupe méthyle; X est NH; 010488 22 l'IFNa est l'IFNa2a; et n et/ou n' représente(nt) 420.
  9. 9. Conjugué selon la revendication 1, caractérisé ence que R et R' représentent le groupe méthyle; X est NH;l'IFNa et l'IFNa2a; et n et/ou nz représente (nt) 520.
  10. 10. Conjugué selon la revendication l, caractériséen ce qu'il a une plus forte activité antiproliférative quel'IFNa et une plus faible activité antivirale que l'IFNa.
  11. 11. Procédé pour la production d'un conjugué PEG-IFNa, ayant une activité antiproliférative accrue et uneactivité antivirale diminuée par comparaison avec l'IFNa,caractérisé en ce qu'il consiste à attacher par liaisoncovalente un réactif de formule II à l'IFNa, pour donnerledit conjugué PEG-IFNa.
  12. 12. Compositions pharmaceutiques, caractérisées ence qu'elles comprennent un conjugué PEG-IFNa selon l'unequelconque des revendications 1 à 10 et un véhicule théra-peutiquement inerte.
  13. 13. Compositions pharmaceutiques pour le traitementet la prophylaxie de troubles immunomodulateurs, tels quedes maladies néoplasiques ou des maladies infectieuses,caractérisées en ce qu'elles comprennent un conjugué PEG-IFNa selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, et unvéhicule thérapeutiquement inerte.
  14. 14. Utilisation d'un conjugué PEG-IFNa selon l'unequelconque des revendications 1 à 10, pour la fabrication demédicaments destinés à être utilisés dans le traitement oula prophylaxie de maladies.
  15. 15. Conjugué PEG-IFNa selon l'une quelconque desrevendications 1 à 10, produit conformément au procédé selonla revendication 11.
  16. 16. Conjugué PEG-IFNa selon l'une quelconque desrevendications 1 à 10, pour la fabrication de médicamentsdestinés à être utilisés dans le traitement ou la prophyla-xie de maladies.
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