EA022617B1 - Монопегилированный интерферон-альфа разветвленной структуры и фармацевтическая композиция для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины, в частности к монопегилированному интерферону IFN α-2b разветвлённой структуры, в котором фрагмент полиэтиленгликоля присоединен к белку с помощью амидной связи. Технический результат изобретения заключается в создании ковалентного конъюгата IFN α-2b с длительной циркуляцией в кровотоке и улучшенными характеристиками противовирусной активности и иммуногенности, а также фармацевтической композиции для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа.

Description

(57) Изобретение относится к области фармацевтики и медицины, в частности к монопегилированному интерферону ΙΡΝ а-2Ь разветвлённой структуры, в котором фрагмент полиэтиленгликоля присоединен к белку с помощью амидной связи. Технический результат изобретения заключается в создании ковалентного конъюгата ΙΡΝ а-2Ь с длительной циркуляцией в кровотоке и улучшенными характеристиками противовирусной активности и иммуногенности, а также фармацевтической композиции для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферонаальфа.

Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к областям фармацевтики и медицины, в частности к соединению с активностью интерферона-альфа, представляющему собой монопегилированный интерферон ΙΡΝ а-2Ь разветвлённой структуры, в котором фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ) присоединен к белку с помощью амидной связи, как представлено общей формулой (I)

где η - целое число в интервале от 200 до 950; с.] - целое число в интервале от 1 до 5; т - целое число в интервале от 1 до 5 и ΙΡΝ обозначает остаток интерферона а-2Ь. Изобретение также предоставляет фармацевтическую композицию для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа, активным веществом которой является указанный монопегилированный ΙΡΝ а-2Ь.

Предшествующий уровень техники

Интерфероны (ΙΡΝ) - биологически активные белки или гликопротеиды, продуцируемые в организме в ответ на вирусную инфекцию (Ре8(ка 8. ТНе пЛсгГсгснъ: 50 уеаг8 айет ΙΠοιγ йкеоусгу. (Неге 18 тисй тоге !о 1еат. 1. ΒίοΙ. СЬет. Уо1. 282. Νο. 28 (1и1у 2007). Р. 20047-20051. ΙΡΝ взаимодействуют с рецепторами, что индуцирует синтез ряда внутриклеточных белков, которые опосредуют противовирусное, иммуномодулирующее и антипролиферативное действие ΙΡΝ (Рек1ка 8., Кгаи8е С.И., ^айет М.К. ШетГегога, 1п1егГегоп-Пке су1окше8, апй 1Не1г гесер(ог8. ^типок Кеу. Уо1. 202 (2004). Р. 8-32).

Лекарственные средства, содержащие рекомбинантные ΙΡΝ, применяются в лечении вирусных, онкологических и иммунных заболеваний. Наиболее широко препараты ΙΡΝ применяют для лечения вирусных гепатитов, представляющих одну из наиболее значимых социальных и медицинских проблем (СНеуаПе/ 8., Ра\\1о18ку РМ. ЬиегГегснъ апй (Ней и8е ίη рег8181еп1 уиа1 шГесйоп8. НапйЬ. Ехр. Рйагтасо1. 2009. Р. 203-241).

Эффективность препаратов ΙΡΝ ограничена их быстрым выведением, малой стабильностью, большим объемом распределения, коротким периодом циркуляции, а также высокой иммуногенностью и реактогенностью (^1Й8 К.1. Сйшса1 рйаттасок1пейс8 оГ т1етГегоп8. СЬп. РйагтасоктеР 1990. №. 19. Р. 390-399).

Эффективность ΙΡΝ увеличивается при использовании препаратов пролонгированного действия, например ковалентных конъюгатов с полимером (Най/1уапш8 8. е! а1. Апп. йЛегп. Мей. Уо1. 140 (2004). Р. 346).

Полиэтиленоксид или полиэтиленгликоль (ПЭГ) является широко распространенным полимером для ковалентной модификации (пегилирования) биологических макромолекул, например полипептидов, имеющей большое значение в современной фармакологии и медицине. Цель пегилирования - предотвращение деградации белков протеолитическими ферментами и защита от антигенных и иммуногенных эпитопов. Кроме того, пегилирование увеличивает размеры полипептидов, уменьшая почечную фильтрацию, а также изменяет объем биораспределения.

Наибольшее значение в пегилировании полипептидов имеет выбор пегилирующего агента и способа конъюгации, от которых зависит вид и структура конечного конъюгата и, следовательно, его биологическая активность, стабильность и время циркуляции в крови.

Так, например, противовирусная активность пегилированных ΙΡΝ в значительной степени зависит как от размера и геометрии ПЭГ, так и от места прикрепления полимера к молекуле белка, т.е. от функциональной группы ΙΡΝ, с которой непосредственно взаимодействует соответствующий пегилирующий агент (КоЬей8 М.1. е! а1. Сйет18йу Гог рерОйе апй рто1еш РЕОу1айоп. Айу. Итид Эекуегу Кеу. Уо1. 54. (2002). Р. 459-476).

Известны конъюгаты ПЭГ-ΙΡΝ а-2Ь, полученные конъюгацией ΙΡΝ а-2Ь с линейным (КЛ 2311930, опубл. 20.08.2008) или разветвленным (КИ 2382048, опубл. 20.02.2010) производными ПЭГ с молекулярной массой 13-17 кДа, обладающие противовирусной активностью от 29 до 38% от активности немодифицированного ΙΡΝ. Недостатки полученных конъюгатов и способов их синтеза обусловлены применением трезил-производных ПЭГ, имеющих время полужизни в водных растворах не более 20 мин. В результате реакции трезил-производных ПЭГ с аминогруппами белков образуются не только стабильные амиды, но также и нестабильные сульфаматы (Са18 НЛ, Киррей 8. МойШсайоп апй иптоЫН/аОоп оГ рто1еш8 №ЙЬ ро1у8ассйапйе 1те8у1а1е8: е\айепсе 8идде8Йпд а теу18юп оГ 1йе соирйпд тесНаш8т апй 1йе 81гис1иге оГ !йе ро1утег-ро1утег Ипкаде. ТеКайейгоп Ьей. Уо1. 36. №. 22 (1995). Р. 3837-3838).

Известен конъюгат ΙΡΝ а-2Ь, полученный конъюгацией ΙΡΝ а-2Ь с разветвленным триазиновым производным мПЭГ с молекулярной массой 7,5-35 кДа (КИ 2298560, опубл. 10.05.2007), противовирусная активность которого составляет 7% от активности немодифицированного ΙΡΝ. Недостатками данного конъюгата являются низкая противовирусная активность и использование цианурхлоридного производного ПЭГ, способного помимо целевых аминогрупп реагировать с другими функциональными группами

- 1 022617 аминокислот с образованием нестабильных или фармацевтически неактивных соединений. Цианурхлоридные производные также проявляют высокую токсичность (Уегопеке Р., Раки! О. РЕОу1а1юп, киссеккГи1 арргоасй !о бгид бейуегу. Эгид Эщсоуегу Тобау. Уо1. 10. Νο. 21 (2005). Р. 1451-1458), что требует тщательной очистки продукта перед приготовлением медицинского препарата.

Наиболее часто для пегилирования применяют активированные эфиры ПЕГ-производных, которые взаимодействуют с аминогруппами белков. Активированные эфиры представляют собой удобные в обращении ацилирующие агенты с высокой реакционной способностью. Однако им присущ ряд недостатков, к которым, в первую очередь, относятся невысокая стабильность при хранении и способность вызывать рацемизацию субстрата, что в конечном итоге может сказаться на биологической активности полученного конъюгата. Их типичные представители - активированные эфиры, как правило, не являются высокоспецифичными реагентами и помимо аминогрупп способны взаимодействовать с имидазольным фрагментом гистидина, фенольным гидроксилом тирозина, спиртовыми гидроксилами серина и треонина, а также тиольной группой цистеина, что, в свою очередь, снижает долю высокоактивных конъюгатов в общей смеси позиционных изомеров.

В настоящее время наиболее изученными и широко применяемыми в клинике препаратами данной группы являются пегилированные интерфероны-альфа (ΙΡΝ-α). Препарат Пегасис (товарный знак, зарегистрированный фирмой НоГГтапп Ьа КосНе) является монопегилированным ΙΡΝ а-2а, в котором белок ковалентно связан с разветвленной молекулой ПЭГ с молекулярной массой 40 кДа. Препарат получен с применением гидроксисукцинимидных эфиров ПЭГ соответствующей структуры. Препарат ПегИнтрон (товарный знак, зарегистрированный фирмой §сйегтд-Р1оидй) представляет собой монопегилированный ΙΡΝ а-2Ь, ковалентно связанный с линейной молекулой ПЭГ, имеющей молекулярную массу 12 кДа. ПегИнтрон получают взаимодействием линейного сукцинимидилкарбонат-активированного ПЕГ с ΙΡΝ а-2Ь (И8 5951974, опубл. 14.09.1999). Противовирусная активность препарата ПегИнтрон составляет 28% активности немодифицированного белка, время циркуляции - порядка 72 ч.

В качестве ближайшего аналога настоящего изобретения авторы рассматривают монопегилированный ΙΡΝ а-2а, ковалентно связанный с разветвленной молекулой ПЭГ массой 40 кДа - препарат Пегасис, описанный в патенте КИ 2180595 (опубл. 20.03.2002), который получают взаимодействием Νгидроксисукцинимидного эфира дипегилированного лизина с ΙΡΝ а-2а. Масса каждого из двух полимерных фрагментов, которые присоединены к аминогруппам лизина посредством карбаматных связей, оценивается в 20 кДа. Активность полученного конъюгата составляет 1-7% от показателя для немодифицированного ΙΡΝ а-2а, а время циркуляции в крови не превышает 7 дней (Вои1ек1ш А., Катаг Ν., 8аибгек8аиие К., Ьедгапб-АЬгауапе1 Р., А1пс Ь., Уше1 ЕР., КокЕппд Ь., Ι/оре! 1. Т\уеп1у-Гоиг Ноиг ктебск ой Нераббк С У1гик апб апбу1га1 еГГес! оГ а1рЬа-т!егГегоп. 1. Меб. У1го1. Уо1. 78. №. 3 (2006). Р. 365-371).

Недостатками данного конъюгата являются весьма низкие показатели противовирусной активности и времени циркуляции в крови, что, вероятно, обусловлено частичной рацемизацией субстрата и существенной долей легкогидролизуемых сложноэфирных и карбаматных связей с функциональными группами аминокислотных фрагментов. Причиной тому служит применение Ν-гидроксисукцинимидного пегилирующего агента.

Таким образом, задачей изобретения является разработка пегилированного интерферона-альфа, создание содержащей его фармацевтической композиции с улучшенными фармакологическими свойствами и расширение арсенала противовирусных средств на основе интерферона-альфа.

Техническим результатом изобретения является получение ковалентного конъюгата ΙΡΝ а-2Ь с ПЭГ, характеризующегося длительной циркуляцией в кровотоке и улучшенными характеристиками противовирусной активности и иммуногенности, а также получение фармацевтической композиции для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа.

Для достижения указанного технического результата монопегилированный интерферон-альфа (ΙΡΝ а-2Ь) разветвлённой структуры согласно изобретению содержит фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ), присоединенного к белку с помощью амидной связи, как представлено общей формулой (Ι) °^^ο^°^Η2^νη^οη^νη^^ΙΡΝ ₍₁₎ где п - целое число в интервале от 200 до 950; с] - целое число в интервале от 1 до 5; т - целое число в интервале от 1 до 5 и ΙΡΝ обозначает остаток интерферона а-2Ь (ΙΡΝ а-2Ь).

Кроме того, в монопегилированном интерфероне общей формулы (Ι) согласно изобретению т и с| равны 3.

Фармацевтическая композиция для приготовления лекарственного средства, обладающего активно-

- 2 022617 стью интерферона-альфа, содержащая активное вещество и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, согласно изобретению в качестве активного вещества содержит монопегилированный интерферон ΙΡΝ а-2Ь разветвлённой структуры, в котором фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ) присоединен к белку через фенилаланиновый линкер с помощью амидной связи, как представлено общей формулой (I)

где η - целое число в интервале от 200 до 950; с] - целое число в интервале от 1 до 5; т - целое число в интервале от 1 до 5 и ΙΡΝ обозначает остаток интерферона а-2Ь (ΙΡΝ а-2Ь).

Кроме того, в фармацевтической композиции согласно изобретению в соединении общей формулы (I) т и с.] равны 3.

Сущность изобретения

В результате обширных исследований авторы установили, что техническая задача изобретения может быть решена применением азидного метода для образования пептидной связи между полимером и белком. Данный метод не приводит к рацемизации субстрата и не затрагивает гидроксильных групп полипептида (Гринштейн Дж., Винниц М. Химия аминокислот и пептидов. М.: Мир, 1965, с. 446-464).

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает монопегилированный интерферон-альфа (ΙΡΝ а-2Ь) разветвлённой структуры, который содержит фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ), присоединенного к белку с помощью амидной связи, как представлено общей формулой (I)

где η - целое число в интервале от 200 до 950; с] - целое число в интервале от 1 до 5; т - целое число в интервале от 1 до 5 и ΙΡΝ обозначает остаток интерферона а-2Ь (ΙΡΝ а-2Ь).

Изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа, содержащую активное вещество и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, которая в качестве активного вещества содержит монопегилированный интерферон ΙΡΝ а-2Ь разветвлённой структуры, в котором фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ) присоединен к белку с помощью амидной связи, как представлено общей формулой (Ι)

где η - целое число в интервале от 200 до 950; с] - целое число в интервале от 1 до 5; т - целое число в интервале от 1 до 5 и ΙΡΝ обозначает остаток интерферона а-2Ь (ΙΡΝ а-2Ь).

В предпочтительных осуществлениях изобретения в формуле (Ι) т и с| равны 3.

Выбор фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ для целей настоящего изобретения очевиден среднему специалисту в области фармакологии. Например, вспомогательными веществами могут быть натрия гидрофосфат, натрия дигидрофосфат, натрия ацетат, уксусная кислота, лимонная кислота, цитрат натрия, глутамат натрия, сахароза, бензиловый спирт, полисорбаты и др.

За счет отсутствия карбаматных связей в структуре конъюгата в соответствии с изобретением увеличивается его стабильность в биологических средах, таких как кровь, чему дополнительно способствует разветвлённая структура предлагаемого конъюгата ПЭГ-ΙΡΝ-α. Активность конъюгата повышается вследствие применения для его синтеза азидной конденсации, не приводящей к рацемизации субстрата.

- 3 022617

Для получения заявляемого монопегилированного ΙΡΝ а-2Ь разветвлённой структуры (конъюгата) применяют ΙΡΝ а-2Ь и гидразидное производное ПЭГ с молекулярными массами 40 и 60 кДа следующей структуры:

о о

Πο-^'Ύ'ο/ΥνηΥη,Υη-·

Пегилированный ΙΡΝ а-2Ь получают конденсацией азидного производного ПЭГ, приготовленного из гидразида ПЭГ-производного непосредственно перед пегилированием, со свободной аминогруппой белка. Гидразидные производные ПЭГ получают взаимодействием активированных эфиров с избытком гидразингидрата, например, в соответствии с известной общей методикой (Гершкович А., Кибирев В. Химический синтез пептидов. Киев: Наукова Думка, 1992). Состав полученного конъюгата определяют обычными методами обращено-фазовой ВЭЖХ и эксклюзионной ВЭЖХ. Например, для этого можно применять колонку УУЛАС® М8 С18 150x4,6 мм (22°С, расход элюента: 1 мл/мин в линейном градиенте от 0,1% ТФУ/Н₂О до 0,085% ТФУ/МеСN в течение 20 мин) или колонку Зирегоке 6, 10/300 СЬ (22°С, расход элюента (50 ммоль натрия фосфат, 300 ммоль №С1, 10% этанол, рН 6,8): 0,4 мл/мин) соответственно.

Значение индекса п в формуле (I) определяют методами исследования, известными из уровня техники. В частности, ориентировочные значения можно вычислить с помощью метода ΜΑΡΌΙ по молекулярной массе конъюгата.

Фармакологические и медицинские преимущества конъюгата в соответствии с изобретением следуют из результатов определений, выполненных в соответствии с действующими нормативными актами с использованием сертифицированных приборов и/или диагностических наборов, рекомендованных уполномоченными органами к применению в этих целях.

В исследованиях ίη νίνο на беспородных лабораторных белых мышах было показано, что конъюгаты ПЭГ-ΙΡΝ-α в соответствии с изобретением являются нетоксичными при введении максимально переносимой дозы 10 млн МЕ/мышь.

Время циркуляции немодифицированного и монопегилированных ΙΡΝ а-2Ь определяют на мышиной модели по содержанию ΙΡΝ-α в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, например, с помощью набора Нитап ΙΡΝ-α ЕЫЗА Κίΐ (номер в каталоге СК2003-1). Время циркуляции конъюгатов ПЭПо-ΙΡΝ а-2Ь и ПЭГбо-ΙΡΝ а-2Ь в 1,5 раза превосходит аналогичный показатель для известного препарата Пегасис.

Приведённые данные показывают, что заявляемые конъюгаты ΙΡΝ а-2Ь при сопоставимом времени циркуляции в кровотоке превосходят препарат сравнения по биологической активности.

Далее приведены примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретения с достижением технического результата.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1. Получение монопегилированного ΙΡΝ а-2Ь

К охлажденному раствору 5 мкмоль гидразида ПЭГ-производного в 0,1 М СН₃СООН приливают раствор 10 мкмоль ΝαΝΟ₂ и перемешивают в течение 15 мин. Далее избыток ΝαΝΟ₂ удаляют добавлением азида натрия и полученный раствор азида ПЭГ-производного приливают к охлажденному раствору 1 мкмоль ΙΡΝ а-2Ь в фосфатном буфере с рН 8. Реакционную смесь при охлаждении перемешивают в течение 8 ч и через различные промежутки времени из реакционной смеси отбирают аликвоты, которые анализируют обращено-фазовой ВЭЖХ.

По достижении необходимой степени превращения ΙΡΝ а-2Ь (порядка 75-85%) реакцию останавливают прибавлением избытка глицина. Далее реакционную смесь разбавляют в 10 раз, добавляют уксусную кислоту до рН 5,0 и наносят на СМ-сефарозу, предварительно уравновешенную 20 мМ ацетатным буфером с рН 5,0. После нанесения реакционной смеси сорбент промывают уравновешивающим буфером и далее градиентом от 0,1 до 0,8 М №С1. Отбирают фракции, которые далее анализируют обращенофазовой ВЭЖХ на содержание моно-ПЭГ-ΙΡΝ а-2Ь (колонка УУЛАС® М3 С18 150x4,6 мм, 22°С, расход элюента: 1 мл/мин в линейном градиенте от 0,1% ТФУ/Н₂О до 0,085% ТФУ/МеСЛ в течение 20 мин). Целевые фракции объединяют, повторно определяют чистоту и содержание моно-ПЭГ-ΙΡΝ а-2Ь. Выходы очищенного ПЭГ.-μ-ΙΡΝ а-2Ь и ПЭГда-ΙΡΝ а-2Ь (в пересчете на ΙΡΝ а-2Ь) составляют 46 и 39% соответственно. Чистота 98,2% для ПЭГ.-μ-ΙΡΝ а-2Ь и 96,9% для ПЭГда-ΙΡΝ а-2Ь.

Времена удерживания даны в табл. 1.

- 4 022617

Таблица 1

Образец	Время удерживания, мин
Обращенно-фазовая ВЭЖХ	Эксклюзионная ВЭЖХ
ΙΡΝ а-2Ь	13,92±0,07	31,6±0,9
ПЭГ4НГК а-2Ь	13,27±0,10	19,0±0,9
ДИ-ПЭГ40—ΙΡΝ а-2Ъ	13,05±0,10	16,4±0,8
ПЭГбо-ΙΡΝ ц-2Ь	13,19±0,12	17,7±1,0
Ди-ПЭГбо-ΙΡΝ а-2Ь	12,85±0,12	15,6±1,1

Перед проведением последующих исследований проводят стерилизующую фильтрацию водного раствора полученного продукта.

Пример 2. Исследование токсичности Π3Γ₄₀-ΙΡΝ а-2Ь и Π3Γ₆₀-ΙΡΝ а-2Ь

Самцам белых нелинейных мышей массой 20±1 г вводят Π3Γ₄₀-ΙΡΝ а-2Ь и Π3Γ₆₀-ΙΡΝ а-2Ь в дозах от 1 до 10 млн МЕ в объеме 0,1 мл. У животных ежедневно в течение недели регистрируют клинические симптомы, взвешивают, отбирают пробы крови для проведения общего и биохимического анализа. Гибели подопытных животных на протяжении всего исследования выявлено не было, показатели крови были в норме.

В последний день животных подвергают эвтаназии и некропсии с забором органов для последующего гистологического анализа. При патологоморфологическом исследовании органов (печень, почки, сердце, лёгкие) лабораторных животных значимых патологических изменений обнаружено не было.

Таким образом, конъюгаты Π3Γ₄₀-ΙΡΝ а-2Ь и Π3Γ₆₀-ΙΡΝ а-2Ь не обладают токсичностью и реактогенностью и соответствуют требованиям 4 класса опасности вещества малоопасные (ГОСТ 12.1.007-76 Вредные вещества).

йример 3. Исследование времени циркуляции немодифицированного ΙΡΝ и монопегилированных ΙΡΝ а-2Ь

Конъюгаты Π3Γ ₄₀-ΙΡΝ а-2Ь и Π3Γ ₆₀-ΙΡΝ а-2Ь в дозе 1 млн МЕ внутрибрюшинно вводят самцам белых нелинейных мышей массой 20±2 г. Шраллельно другим группам мышей вводят немодифицированный ΙΡΝ а-2Ь и препарат Πегасис. Через каждые 6 ч у животных отбирают пробы крови и стандартным методом готовят из неё сыворотку. Содержание ΙΡΝ-α в образцах сыворотки (нг/мл) определяют с помощью иммуноферментного аналитического набора (ИФА-набора) Нитап ΙΡΝ-α ЕЫ8А Κίΐ (номер в каталоге СК2003-1). Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2

Образец	Время циркуляции. сутки	Активность, млн МЕ/мг	% остаточной активности немодифицированного ΙΡΝ сх-2Ь. МЕ/мг
ΙΡΝ а-2Ь	0,5	200	100
Π'ΛΚ,, ΙΓΝ а-2Ъ	7	44	22
ПЭГбо-ΙΓΝ а-2Ь	9	32	16
«Пегасис»	7	2-14*	1-7*

- литературные данные йример 4. Исследование уровня бактериальных эндотоксинов

Уровень бактериальных эндотоксинов в образцах конъюгатов Π3Γ₄₀-ΙΡΝ а-2Ь и Π3Γ₆₀-ΙΡΝ а-2Ь определяют с помощью ЛАЛ-теста в соответствии с ОФС Бактериальные эндотоксины (42-000-2-00). Используют диагностический набор фирмы Л55оаа1е5 оГ Саре Соб, Ιηο. . Содержание эндотоксинов в пробах конъюгата не превышает 0,03 ЕЭ/мкг, что значительно ниже значения 0,25 ЕЭ/мкг, допустимого для пегилированных интерферонов.

йример 5. Исследование антипролиферативной активности ΠЭΓ₄₀-IΡN а-2Ь и ΠЭΓ₆₀-IΡN а-2Ь

Антипролиферативную активность определяют на человеческих клетках линии Иаиб1 колориметрическим тестом с бромидом 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразола. Πрепаратом сравнения служит международный стандарт ΙΡΝ а-2Ь (код 95/566). Клетки (2х10⁴) в 100 мкл среды ΡΡΜΙ 1540, содержащей 10%-ную сыворотку эмбриона теленка и 2 мМ глутамина, вносят в лунки планшетов для микротитрования. В лунки добавляют серии разведений объемом 100 мкл, содержащие различные концентрации ΠЭΓ₄₀-IΡN а-2Ь и ΠЭΓ₆₀-IΡN а-2Ь, а также стандарта ΙΡΝ а-2Ь. Шаншеты инкубируют при 37°С в 5% СО₂ в течение 72 ч, после чего добавляют раствор МТТ (5 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации 0,5 мг/мл и инкубируют в течение 3 ч в тех же условиях. Среду удаляют, к клеткам добавляют по 100 мкл ДМСО и измеряют поглощение при 570 и 620 нм. Относительные активности ΙΡΝ а-2Ь и исследуемых конъюгатов определяют, сравнивая дозы, вызывающие 50% снижение пролиферации для стандартного и испытуемых препаратов. Антипролиферативная активность Π3Γ₄₀-ΙΡΝ а-2Ь составляет

- 5 022617

39%, а конъюгата Π3Γ₆₀-ΙΡΝ а-2Ь равна 24% от активности стандарта.

Пример 6. Определение специфической противовирусной активности конъюгатов Π3Γ₄₀-ΙΡΝ а-2Ь и Π3Γ₆₀-ΙΡΝ а-2Ь

Противовирусную активность конъюгатов определяют микрометодом в 96-луночных планшетах с плоским дном по подавлению цитопатического действия тест-вируса везикулярного стоматита в диплоидной культуре клеток ΜΌΒΚ, чувствительных к интерферону-альфа. Для этого используют тест-вирус в дозе 100 ЦПД₅₀ и питательную среду Игла ΜΕΜ с добавлением 10% сыворотки КРС. В качестве стандарта применяют международный стандарт ΙΡΝ а-2Ь. Результаты приведены в табл. 2.

Пример 7. Исследование иммуногенности конъюгатов ΙΡΝ а-2Ь

Конъюгаты ПЗГ^-ΙΡΝ а-2Ь и Π3Γ₆₀-IΡN а-2Ь, полученные в соответствии с примером 1, в дозе 1 млн ΜΕ в объеме 0,1 мл внутримышечно вводят мышам СВА с массой тела 18-22 г 1 раз в неделю в течение 8 недель. Аналогично вводят немодифицированный ΙΡΝ-α. По прошествии 8 недель у животных отбирают пробы крови и готовят сыворотку стандартным методом. Титр антител определяют прямым методом твердофазного иммуноферментного анализа. В лунки микропланшета вносят по 100 мкл раствора немодифицированного ΙΡΝ а-2Ь в концентрации 0,2 мкг/100 мкл. Антисыворотки от разных групп животных вносят в лунки планшета в серии из последовательных разведений в два раза. Иммунный комплекс обнаруживают антимышиными иммуноглобулинами, конъюгированными с пероксидазой. Иммуногенность конъюгатов ПЗГ.-μ-ΙΡΝ а-2Ь и ПЗЕ-,,-ΙΡΝ а-2Ь в 4 раза ниже, чем у немодифицированного ΙΡΝ-α.

Пример 8. Приготовление фармацевтической композиции, содержащей конъюгаты П3Г40-ШЛ а-2Ь и ПЗГбо-ΙΡΝ а-2Ь

Все операции проводят в стерильных условиях. В мерный стакан вместимостью 100 мл, снабжённый комбинированным потенциометрическим электродом 3КОМ рН ком, соединённым с рН-метром 3котест-2000 при перемешивании магнитной мешалкой последовательно вносят стерильные растворы 550 мг моногидрата лимонной кислоты в 10 мл воды, 400 мг ЫаН₂РО₄<Н₂О в 10 мл, 2,00 г сорбита в 10 мл воды, 500 мг Ь-глутамата натрия в 10 мл воды и 10 мг полисорбата 20 в 10 мл воды.

К полученной смеси при перемешивании по каплям прибавляют 5% ΝαΟΗ до установления величины рН 6,5-6,7 и приливают 50 мл раствора соответствующего П3Г-ИНФ а-2Ь с концентрацией 1 мг/мл. Значение рН полученного раствора корректируют прибавлением 5% ΝαΟΗ и общий объем смеси доводят до 100 мл водой для инъекций. Раствор фильтруют через стерилизующий фильтр с размером пор 0,22 мкм и в асептических условиях разливают в стерильные флаконы по 100 мл с содержанием конъюгата ПЗГ^-ΙΡΝ а-2Ь или ПЗЕ-,,-ΙΡΝ а-2Ь 0,5 мг/мл. На флаконы наносят маркировку для целей идентификации и дальнейшего применения.

Таким образом, приведенные примеры подтверждают достижение технического результата изобретения, заключающегося в создании монопегилированного ΙΡΝ а-2Ь с длительной циркуляцией в кровотоке и улучшенными характеристиками противовирусной активности и иммуногенности, а также композиции для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа.

Claims (4)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Монопегилированный интерферон-альфа (ΙΡΝ а-2Ь) разветвлённой структуры, отличающийся тем, что содержит фрагмент полиэтиленгликоля (ПЗГ), присоединенного к белку с помощью амидной связи, как представлено общей формулой (Ι) где η - целое число в интервале от 200 до 950; с] - целое число в интервале от 1 до 5; т - целое число в интервале от 1 до 5 и ΙΡΝ обозначает остаток интерферона а-2Ь (ΙΡΝ а-2Ь).
2. 2. Монопегилированный интерферон по п.1, отличающийся тем, что в соединении общей формулы (Ι) т и д равны 3.
3. 3. Фармацевтическая композиция для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа, содержащая активное вещество и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества содержит монопегилированный интерферон ΙΡΝ а-2Ь разветвлённой структуры, в котором фрагмент полиэтиленгликоля (ПЗГ) присоединен к белку с помощью амидной связи, как представлено общей формулой (Ι)

   - 6 022617

   О

   О

   ΝΗ ,-ΙΕΝ (I) где η - целое число в интервале от 200 до 950;

   с.| - целое число в интервале от 1 до 5;

   т - целое число в интервале от 1 до 5 и

   ΙΡΝ обозначает остаток интерферона а-2Ь (ΙΡΝ а-2Ь).
4. 4. Фармацевтическая композиция по п.3, отличающаяся тем, что в соединении общей формулы (I) т и с.| равны 3.