NO309153B1 - Fremgangsmåte for ökning ved sekresjon av disulfidbrodannede proteiner - Google Patents
Fremgangsmåte for ökning ved sekresjon av disulfidbrodannede proteiner Download PDFInfo
- Publication number
- NO309153B1 NO309153B1 NO921574A NO921574A NO309153B1 NO 309153 B1 NO309153 B1 NO 309153B1 NO 921574 A NO921574 A NO 921574A NO 921574 A NO921574 A NO 921574A NO 309153 B1 NO309153 B1 NO 309153B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- protein
- thiol reagents
- recombinant dna
- expression
- nutrient medium
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 title claims description 6
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 3
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 claims abstract description 36
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 26
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 49
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 43
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 claims description 25
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 19
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 18
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 12
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 claims description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 6
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 5
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 5
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 claims description 4
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 229940045883 glutathione disulfide Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 3
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 claims description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 claims description 2
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 claims description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 33
- 101001003194 Eleusine coracana Alpha-amylase/trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 description 16
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 101150070377 PDI gene Proteins 0.000 description 6
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 244000078127 Eleusine coracana Species 0.000 description 3
- 235000007349 Eleusine coracana Nutrition 0.000 description 3
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 3
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101710172128 Alpha-amylase/trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122816 Amylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000702208 Shigella phage SfX Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003392 amylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å øke dannelsen av den naturlige proteinkonformasjonen ved utskilling av disulfidbrodannede proteiner ved hjelp av en prokaryotisk vertsorganisme, som inneholder et rekombinant DNA, som koder for det utskilte proteinet.
Proteinsyntesen, eller translasjonen i prokaryotiske mikroorganismer, foregår på ribosomene i cytoplasma. Ved en ekspresjon av rekombinant DNA i bakterielle vertsorganismer, er det ofte ønskelig at det resulterende rekombinante genproduktet, hhv. proteinet, blir utskilt fra cytoplasma gjennom den indre bakterielle membranen i det periplasmatiske rommet mellom indre og ytre membran. Fra periplasma kan de utskilte proteinene deretter eksempelvis bli frigjort gjennom et osmotisk sjokk i næringsmediet. En ulempe ved denne fremgangsmåten, er at ved utskilling av disulfidbrodannede proteiner, foregår det som regel ingen riktig dannelse av den native, hhv. naturlige konformasjonen, dvs. det oppstår polypeptider med en falsk eller ufullstendig oppbygning av disulfidbroene, som er biologisk inaktive.
Tiolreagensene blir ved fremgangsmåten tilsatt til in vitro renaturering av uoppløselige proteiner, som oppstår ved ekspresjon av rekombinant DNA i prokaryotisk cellecytoplasma som inklusjonslegemer. Fra tiolreagensene er det kjent at de raskt blir oksydert til disulfider i nærvær av oksygen fra luf ten.
En gjenstand ifølge foreliggende oppfinnelse er økning av dannelsen av den naturlige proteinkonformasjonen ved sekresjon av disulfidbrodannede proteiner.
Spesielt kan en understøttelse av dannelsen av den native proteinkonformasjonen erstatte den delvis meget omstendige in vitro-renatureringen av de falske disulfidbrodannede proteinene.
Gjenstand ifølge foreliggende oppfinnelse blir løst ved en fremgangsmåte for økning av dannelsen av den naturlige pro-teinkonf ormas jon ved utskillelse av disulfidbrodannede proteiner, ved hjelp av en prokaryotisk vertsorganisme som inneholder et rekombinant DNA som koder for det utskilte proteinet, hvori man dyrker vertsorganismen i et egnet næringsmedium under egnede betingelser for ekspresjon av rekombinante DNA, idet fremgangsmåten er kjennetegnet ved at man anvender et næringsmedium med et innhold på 0,1 til 20 mmol/1 av én eller flere tiolreagenser.
Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for økning av dannelsen av naturlig proteinkonformasjon ved sekresjon av disulfidbrodannede proteiner i en prokaryotisk vertsorganisme som inneholder et rekombinant DNA, som koder for det utskilte proteinet, der man dyrker vertsorganismen i et egnet næringsmedium under egnede betingelser for- ekspresjon av rekombinant DNA, kjennetegnet ved at man anvender et næringsmedium med et innhold på 0,1 til 20 mmol/1 av ett eller flere tiolreagenser, hvor det eventuelt tilsettes én eller flere mono- eller/og oligosakkarider som ikke kan metaboliseres av vertsorganismen, og hvor eventuelt nevnte vertsorganisme sammen med ekspresjonen av rekombinant DNA som koder for det disulfidbrodannede proteinet som skal utskilles, gjennomfører en overekspresjon av et proteindisulfidisomerasegen.
Gjennom fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er det overraskende mulig, ved tilsetning av tiolreagenser i fermen-teringsmediet, å øke utbyttet av korrekte disulfidbrodannede proteiner. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes for alle proteiner som inneholder én eller flere disulfidbroer. Spesielt ved behov av små proteinmengder, f.eks. ved produksjon av vekstfaktorer i mg-målestokk (nerve-vekst-faktor, interleukiner eller lignende forbindelse) kan man ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gi avkall på in vitro-renaturering.
Det har for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen vist seg egnet å anvende et næringsmedium med et innhold på 0,1 til 20 mmol/1 av én eller flere tiolreagenser. Anvender man et næringsmedium med et innhold på mindre enn 0,1 mmol/1 tiolreagenser, forekommer ingen nevneverdig økning av dannelsen av den naturlige proteinkonformasjonen. Overgrensen av tiolkonsentrasjonen ligger omtrent på 20 mmol/1 og manifesterer seg både ved en tydelig reduksjon av utbyttet av utskilte, funksjonale proteiner og også i en sterk til-bakegang av celleveksten. Man anvender fortrinnsvis næringsmedium med et innhold på 1 til 15 mmol/1, og spesielt foretrukket med et innhold på 3 til 12 mmol/1 av én eller flere tiolreagenser. Ved anvendelse av glutation som tiolréagens har det vist seg omtrent 5 mmol/1 som optimal konsentrasj on.
Det i foreliggende beskrivelse anvendte begrepet "tiolréagens", betyr enten et redusert tiolréagens med SH-grupper eller en blanding av reduserte tiolreagenser med SH-grupper" og oksiderte tiolreagenser med disulfidgrupper.
Som reduserte tiolreagenser er spesielt slike egnede som oppviser en eneste SH-gruppe pr. molekyl. Spesielt foretrukne forbindelser er redusert glutation (GSH), cystein, N-acetylcystein, cysteamin, p-merkaptoetanol og lignende forbindelser. Mest foretrukket er N-acetylcystein og redusert glutation (GSH). Tiolreagensene kan anvendes både enkeltvis og i blandinger.
Til tross for at bare anvendelse av reduserte tiolreagenser generelt er foretrukket, bringer også anvendelsen av en blanding av det reduserende og oksiderende tiolreagenset et forbedret utbytte av korrekte disulfidbrodannede proteiner. Ved anvendelse av en slik blanding av reduserte og oksiderte tiolreagenser utgjør det molare forholdet mellom reduserte og oksiderte tiolreagenser, fortrinnsvis 2:1 til 20:1, spesielt foretrukket 5:1 til 10:1. En blanding av et redusert og et oksidert tiolréagens er eksempelvis redusert glutation (GSH) og glutationdisulfid (GSSG).
Et eksempel på fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er den heterologe ekspresjonen av den bifunksjonale cx-amylase/- trypsin-inhibitoren fra Eleusine coracana Gaertneri (RBI) i E. coli. Inhibitoren ble karakterisert av Shivaraj og Pattabiraman (Shivaraj B. & Pattabiraman, T.N. , Indian J. Biochem. Biophys. 17 (1980), 181-193; Shivara B. & Pattabiraman, T.N., Biochem. J. 193 (1981), 29-36). Aminosyresekvensen til inhibitoren ble bestemt av Campos og Richardson (Campos, F. A.P. & Richardson, NI., FEBS Letters 152 (1983), 300-304 ). Dette proteinet består av 122 aminosyrer, inneholder 5 intramolekylære disulfidbroer og hører til en ny a-amylase/- trypsin-inhibitorklasse (Halford et al., Biochem. Biophys. Acta 950 ( 1988), 435-440), idet det er deres eneste bi-funksjonelle forløper. Det er derimot å bemerke at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen også kan anvendes for isolering av andre disulfidbrodannede rekombinante proteiner (f.eks. antistoff-fragmenter) i prokaryote vertsorganismer som blir utskilt.
For isolering av det sekretoriske RBI-proteinet i funksjonell form i E.coli, ble et syntetisk RBI-gen fusjonert ved hjelp av genteknologiske midler på signal sekvensen til den ytre membranen til protein A (OmpA) fra E.coli og fusjonen på et rekombinant plasmid under kontroll av en lac-promoter ble uttrykt i E.coli. På denne måten blir polypeptidkjeden til det rekombinante proteinet transportert i periplasma til prokaryotiske vertsceller, der de etter avspaltning av signalsekvensen på grunn av de oksiderende egenskapene til denne celledelen under dannelse av de intramolekylære disulfidbroene kan folde seg til nativt protein. Ved denne foldingen kan derimot bare små mengder av funksjonelt protein oppnås. Ved nærværet av tiolreagensene ifølge oppfinnelsen i næringsmediet, er det derimot mulig å øke utbyttet av funksjonelt protein betraktelig (med en faktor på 5). Vertsorganismen for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er en prokaryotisk vertsorganisme. Ekspresjonene av det rekombinante proteinet foregår fortrinnsvis i en gram-negativ prokaryotisk vertsorganisme, spesielt foretrukket i E.coli.
I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det generelt gunstig at det for det utskilte proteinkodende rekombinante DNA står i operativ binding med et DNA-fragment, som koder for et signalpeptid for gjennombringing gjennom den indre, bakterielle membranen. Begrepet "operativt bundet" betyr i foreliggende oppfinnelse at det oppstår en translasjonen fusjon mellom det heterologe proteinet og signalpeptidet. Signalpeptidet danner da eventuelt den N-terminale delen av den translasjonene fusjon. Type signalpeptid er ikke kritisk for foreliggende oppfinnelse, bortsett fra at det skal muliggjøre sekresjon av det rekombinante proteinet. Et stort antall av slike signalpeptider er kjent for fagfolk innenfor området molekylær biologi. En rekke signalpeptider er f.eks. beskrevet av Winnacker (Gene und Klone, Eine Einfilring in die Gentechnologie, Verlag Chemie Weinheik (1985), s. 256). Dersom fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir gjennomført i E.coli som vertsorganisme, har signalpeptidet fra E.coli OmpA-proteinet vist seg å være meget egnet.
For ekspresjon i en prokaryotisk vertsorganisme må det rekombinante DNA, som koder for det utskilte proteinet, stå under kontroll av et av transkripsjonssystemet til verten kjente ekspresjonssignaler hhv. promotere. I prokaryotiske vertsceller aktive ekspresjonssignaler, er kjent for fagfolk innen området molekylær biologi. I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes fortrinnsvis et induserbart ekspresjonssignal. Eksempler på en induserbar E.coli-promoter er lac-promoteren, som er induserbar gjennom isopropyl-p<->D-galaktosid (IPTG) samt syntetiske derivater av lac-promotere (f.eks. tac- eller trc-promoteren).
Rekombinante DNA som koder for det disulfidbrodannede, utskilte proteinet, blir generelt innført gjennom transformasjon i den prokaryotiske vertscellen. Teknikker for transformasjon av forskjellige prokaryotiske vertsorganismer er kjent for fagfolk, og behøver ikke å bli forklart her. Rekombinant DNA som foreligger i den transformerte vertscellen, befinner seg på en rekombinant vektor som i vertscellen enten kan foreligge ekstrakromosomalt (f.eks. plasmid) eller integrert i genomet til vertscellen (f.eks. bakteriofag X). Det er foretrukket å anvende et plasmid som vektor. Det er derfor ikke kritisk ifølge fremgangsmåten i oppfinnelsen hvilket spesielt plasmid blir anvendt som ekspresjonsvektor. Det kommer bare an på at det rekombinante DNA som koder for det ønskede proteinet, i tilstrekkelig grad blir transkribert og translatert av vertscellen. Translasjonsproduktet til rekombinant DNA må foreligge i en form som muliggjør sekresjon gjennom den indre, bakterielle membranen i periplasmaet.
Som angitt ovenfor, blir vanligvis et rekombinant protein som er fusjonert med en signalsekvens, transportert inn i periplasma til en prokaryotisk vertscelle. Dette gir også en foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse. Ved anvendelse av bestemte vertsstammer, foregår derimot ikke bare en sekresjon i per iplasmaet, men også en massiv proteinsekresjon i næringsmediet. EP-A 0.338.410 beskriver E.coli-stammer som er istand til en massiv proteinsekresjon i næringsmediet og beskriver også en fremgangsmåte for fremstilling av disse stammene. Som utgangsstammer for fremstilling av disse sekresjonsmutantene anvendes fortrinnsvis de i EP-A 0.338.410 nevnte E.coli-stammer DS410 (DSM 4513), hhv. BW7261 (DSM 5231).
Som næringsmedium for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, anvendes fortrinnsvis et fullmedium, spesielt et medium som inneholder forbindelser eller forbindelsesblandinger av celleekstrakter. Et eksempel på et slikt medium er LB-mediet, som inneholder substansblandinger av enzymatisk fordøyet celleekstrakt (Bacto-Trypton og gjærekstrakt).
pH-veriden til næringsmediet ligger fortrinnsvis i et området på mellom pH 5 og pH 9. Spesielt foretrukket ligger pH-verdien til næringsmediet mellom 6 og 8. Anvender man LB-medium som næringsmedium, har det vist seg gunstig å innstille en pH-verdi på 7,4 ved fremstilling av mediet. I løpet av celleveksten, synker deretter pH-verdien til mediet, og ligger ifølge oppfinnelsen ved stasjonær overnattkulturer (tidspunkt ved cellehøstning) på omtrent 6,8.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir fortrinnsvis gjennomført i en ristekultur i et fullmedium. Det er derimot mulig å dyrke vertsorganismen i en meget luftet fermentor eller/og i nærvær av et minimalmedium.
En ytterligere utførelsesform ifølge fremgangsmåten i oppfinnelsen, består i at næringsmediet tilsettes ytterligere ett eller flere mono- eller/og oligosakkarider som ikke kan bli metabolisert av den anvendte prokaryotiske vertsmikro-organismen. Fra et arbeid til Bowden og Georgiou (J. Biol. Chem. 265 (1990), 16760-16766) er det nemlig kjent at tilsetning av ikke-metaboliserbare sukkerforbindelser kan føre til dannelsen av den native proteinkonformasjon. Den ytterligere anvendelsen av denne ikke-metaboliserbare sukkerforbindelsen ifølge fremgangsmåten i oppfinnelsen, utviser en ytterligere understøttende effekt ved dannelsen av den native proteinkonformasjonen av utskilte proteiner. Eksempler på ikke-metaboliserbare sukkere, er sorbose (et monosakkarid), sakkarose (et disakkarid) og raffinose (et trisakkarid). Konsentrasjonen av det ikke-metaboliserbare mono- eller/og oligosakkaridet i næringsmediet ligger i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis mellom 0,1 mol/l og 1 mol/l, fortrinnsvis mellom 0,3 mol/l og 0,7 mol/l. En ytterligere spesiell utførelsesform ifølge fremgangsmåten i oppfinnelsen, består i at man i en vertsorganisme sammen med ekspresjonen av det rekombinante DNA som koder for di-sulf idbrodannet protein som skal utskilles, gjennomfører en overekspresjon av et protein disulfidisomerasegen. Man anvender fortrinnsvis et proteindisulfidisomerasegen fra gram-negative bakteriearter, og spesielt foretrukket er et protein disulfidisomerasegen fra E.coli. DNA-sekvensen av et slik gen er vist i SEK ID nr.: 3.
Det ble overraskende fastslått at en koekspresjon og kosekresjon av et vertseget proteindisulfidisomerasegen i kombinasjon med tilsetning av tiolreagenser i næringsmediet bevirker en økning av utbyttet av funksjonelt, utskilt protein, som overgår virkningen av tilsetningene av tiolreagenser alene. Derimot har bare koekspresjon av pro-teindisulf idisomerase (PDI) uten tilsetning av tiolreagenser ingen utbytteøkning.
Begrepet "overekspresjon" ifølge foreliggende oppfinnelse, betyr en stigning av proteindisulfidisomerase-ekspresjonen sammenlignet med en vildtype av den anvendte prokaryote vertsorganismen. En slik overekspresjon lar seg eksempelvis oppnå ved at proteindisulfidisomerasegenet befinner seg under kontroll av et sterkt, fortrinnsvis induserbart ekspresjonssignal (f.eks. en lac-promoter eller derivater derav). Overekspresjonen av PDI-genet foregår fortrinnsvis i "operativ kobling" med et signalpeptid for gjennomtrengning av den bakterielle membranen. Spesielt foretrukket blir det derfor anvendt den naturlige PDI-signalsekvensen.
I en utførelsesform ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan eksempelvis rekombinante DNA som koder for proteinet som skal bli utskilt og proteindisulfidisomerasegenet foreligge på en enkelt ekspresjonsvektor i vertscellen. Denne ekspresjonsvektoren er fortrinnsvis en ekstrakromosomal vektor, dvs. et plasmid, men kan også være integrert i kromosomet til vertscellen (f.eks. lambda-fag). Ved anvendelse av en enkelt ekspresjonsvektor, er det foretrukket at rekombinant DNA og proteindisulfidisomerasegenet befinner seg under kontroll av et enkelt ekspresjonssignal, dvs. i form av et decistronisk operon.
På en annen side er det derimot det rekombinante DNA som koder for proteinet som skal bli utskilt og proteindisulfidisomerasegenet befinner seg på to for hverandre kompatible ekstrakromosomale ekspresjonsvektorer som står under kontroll av et eget ekspresjonssignal (promotere).
Oppfinnelsen skal videre bli beskrevet ved hjelp av følgende eksempler i forbindelse med figurene 1 og 2 samt SEK ID nr.: 1-5. Fig. 1 viser et immunoblot for å bevise opplø-selig, prosessert RBI etter tilsetning av forskjellige mengder glutation i næringsmediet . Fig. 2 viser en skjematisk fremstilling av
ekspresjonsplasmidet pRBlal-PDI.
SEK ID nr.: 1 viser DNA-sekvensen fra koekspresjon av RBI
og proteindisulfidisomerase (PDI) fra E.coli W3110 anvendte plasmider.
SEK ID nr.2 viser sekvensen til OmpA/RBI-genet.
Dobbelttrådet DNA blir sammensatt av 14 syntetiske oligonukleotider og begrenset gjennom restriksjonsspaltesetene Xbal og Hindlll. Den i sekvensprotokollen viste DNA-tråden er sammensatt av 7 oligonukleotider som tilsvarer følgende områder: Mottråden dannes likeledes fra 7 oligonukleotider som er komplementær med følgende områder av den viste DNA-tråden:
SEK ID nr: 3 viser sekvensen til proteindisulfidisomerasegenet med signalsekvensen og det ribosomale bindingssetet.
SEK ID nr.: 4 viser den N-terminale primeren for
amplifisering av PDI-genet.
SEK ID nr.: 5 viser den C-terminale primeren for
amplifisering av PDI-genet.
EKSEMPEL 1
Gensyntese
Forbemerkning:
De molekylærgenetiske teknikkene er basert på Maniatis et.al.
(Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, New York), oligonukleotidene ble fremstilt ifølge fosforamiditfremgangsmåten (Sinha et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 4539-4557; Kaplan, B.E., Trends Biotechnol. 3
(1985), 253-256) på et automatisk synteseapparat, type 380A fra firmaet Applied Biosystems GmbH. Det syntetiske genet som koder for fusjonen mellom OmpA-signalsekvensen og RBI, ble sammensatt av 14 syntetiske oligonukleotider (SEK ID nr.: 2). 01igonukleotidene ble renset gjennom polyakrylamid/urinstoff-gelelektroforese og med unntak av begge ovenstående oligonukleotider fosforylert ved 5'- og ved 3'-enden av genet ved deres 5'-ender. Deretter ble alle olIgonukleotidene renset i ekvimolare forhold og hybridisert i en enkelt blanding og ligert. Genet blir begrenset med restriksjonssetene Xbal og Hindlll. Aminosyrene til OmpA-signalsekvensen er angitt med negative fortegn.
EKSEMPEL 2
Konstruksjon av ekspres. ionsplasmidet pRBIa 1
Det ifølge eksempel 1 oppnådde syntetiske genet ble klonet over restriksjonssete Xbal og Hindlll i ekspresjonsplasmidet pASK40 (Skerra et al., B10/TECHNOLOGY 9 (1991), 273-278). Sekvensen til det syntetiske genet ble bestemt ved didesoksy-sekvensering. Det resulterende plasmidet ble betegnet pRBIal.
EKSEMPEL 3
Funksjonell ekspresjon av RBI i periplasma til E. coli
En stasjonær overnattkultur av E.coli JM83 (Yannish-Perron et al., Gene 33 (1985), 103-119) som var blitt transformert med pRBIal, ble fortynnet i forholdet 1:100 i 2,5 1 LB-medium (1 1 LB-medium inneholder 10 g bakto-trypton (Difco Factories, Detroit, Michigan, USA), 5 g (Yast-ekstrakt (Difco Factories) og 5 g NaCl, pH 7,4) med ampicillin (100 ug/ml) og ristet ved 26°C frem til en OD550 på 1,0. Deretter fordelt i 9 identiske 250 ml-porsjoner, og hver kultur ble indusert med IPTG (isopropyl-p<->D-galaktosid; sluttkonsentrasjon 1 mmol/1), men omsatt med forskjellige mengder glutation (GSH). Cellene ble videre ristet overnatt ved 26° C og høstet ved sentrifugering (Sorvall SS34, 4°C, 5000 Upm, 15 minutter). Deretter ble cellene tatt opp ved 4°C i 100 mmol/1 Tris/HCl pH 7,5, 20 mmol/1 Na-EDTA, slik at celletetthet på 200 (OD550) ble oppnådd. Cellene ble deretter lysert i en Frensch presse-cellepresse (Aminco) lysert ved 12411o KPa. Lysatet ble sentrifugert (Sorvall SS34, 4°C, 15000 Upm, 30 minutter) og innholdet av oppløselig, funksjonell RBI ble undersøkt i de oppløselige supernatantene. 5 pl av innholdet av oppløselig supernatant ble separert på en 15$ polyakrylamid/SDS-gel (Fling & Gregerson, Anal. Biochem. 155 (1986) 83-88). De separerte proteinene ble overført ved elektroeluering på en nitrocellulosemembran, og RBI-båndene ble immunspesifikt farvet ved hjelp av et anti-RBI-kaninantistoff. Immunoblottingen ble gjennomført ifølge Blake et al., Anal. Biochem. 136 (1984), 175-179.
Fig. 1 viser en analyse av'ekspresjonsutbyttet av oppløselig RBI ved hjelp av immunblotting. Spor 1 viser en molekylær vekststandard. I spor 2 ble 0,8 pg RBI renset fra eleusin coracana Gaertneri. I spor 3 til 6 ble ekvivalente mengder av celleekstraktet applisert med forskjellige tilførselsmengder av glutation. I spor 3 er en GSH-tilførsel til kulturmediet. I spor 4, 5 og 6 blir kulturmediet tilsatt 1 mmol/1, 5 mmol/1 hhv. 10 mmol/1 GSH.
Som antistoff ble det anvendt et polyklonalt anti-RBI-antiserum, som ble fremstilt ifølge standardmetoder (se f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kapitel 18), ved hjelp av to ganger immuniser ing av en new Zealand-kanin med renset RBI fra Eleusine coracana Gartneri.
Figuren viser at tilsetning av GSH forsterker intensiteten til de immunspesifikt farvede båndene. Dette er spesielt synlig ved konsentrasjoner på 5 mmol/1 og 10 mmol/1 GSH.
Ved bestemmelse av den inhibitoriske aktiviteten i forhold til trypsin fra storfebukspyttkjertel, ble RBI-mengden i den oppløselige andelen av det oppnådde celleekstraktet bestemt kvantitativt. Det var mulig å vise at mengde av intracellu-lær, funksjonell inhibitor kunne bli øket 5-ganger i forhold til ekspresjonen uten de beskrevne mediumtilsetningene (tabell 1).
Det fremgår videre fra tabell 1 at det er mulig ved tilsetning av en blanding av redusert glutation (GSH) og glutationdisulfid (GSSG) å forbedre utbyttet av funksjonell inhibitor.
I alle de gjennomførte testene ble 5 pg trypsin fra storfebukspyttkjertel inkubert i 1 ml 100 mmol/1 NaCl, 50 mmol/1 Tris/HCl pH 8,0, 10 mmol/1 CaCl2, 0,005$ (v/v) Triton X-100 med den bestemte mengden RBI i 30 minutter ved 25° C. Etter tilsetning av 20 pl/10 mmol/1 N-a-benzoyl-L-arginin-4-nitranilid (kromogent testsubstrat), ble restaktiviteten til ' trypsinet bestemt ved registrering av økningen av absorpsjon ved 405 nm. Inhibitorkonsentrasjonen i testen ble bestemt ut i fra forskjellen mellom aktiviteten til det frie enzymet (uten tilsetning av en inhibitor) og den målte restaktiviteten .
Tabell 1 viser ekspresjonsøkningen av funksjonelt RBI ved tilsetning av GSH hhv. en blanding av GDH og GSSG.
EKSEMPEL 4
Anvendelse av N- acetvl- L- cvstein som ytterligere tiolréagens Som beskrevet i eksempel 3, blir kulturer av E.coli JM83, som var blitt transformert med plasmidet pRBIal, transformert ved 26° C i LB-medium med ampicillin (100 ug/ml) og indusert ved en OD550 = 1 med IPTG (sluttkonsentrasjon: 1 mmol/1). Samtidig foregår tilsetningen av N-acetyl-L-cystein i fast form (sluttkonsentrasjon: 5 og 10 mmol/1). Kulturen ble deretter videre omrørt overnatt og, som beskrevet i eksempel 3, innholdet av funksjonelt RBI ble bestemt ved tyrpsin-inhibisjonstester. Resultatene er ført opp i tabell 2 og viser at konsentrasjonsområdet, der N-acetyl-L-cystein virker, at dette er meget likt det reduserte glutationet.
TABELL 2
Ekspresjon av funksjonell RBI ved tilsetning av N- acetylcystein.
EKSEMPEL 5
Koekspresjon og kosekresjon av periplasmatisk proteindisulfidisomerase (PDI) og samtidig tilsetning av tiolreagenser i kulturmediet.
For koekspresjon av vertsegen, periplasmatisk proteindisulfidisomerase (PDI) ble først PDI-genet amplifisert av genomet til E.coli K12 vildtypestammen W3110 (Bachmann, B.J. (1972), Bacteriol, Rev. 36, 525-557) gjennom polymerasekjedereaksjon (PCR). Her virket den kjente basesekvensen til genet (Bardwell, J.C.A., McGovern, K. & Beckwith, J., "Identifica-tion of a Protein Required for Disulfide Bond Formation in vivo", Cell, 67, (1991), 581-589) som utgangspunkt for bestemmelse av den tilsvarende oligonukleotidprimeren.
For amplifisering av PDI-genet ble følgende oligonukleotid anvendt som primer:
Det amplifiserte DNA-fragmentet som inneholder det fullstendige genet til PDI inklusiv signalsekvens og ribosomalt bindingssete, ble isolert og spaltet med restriksjonsenzymene Hindlll og BamHI. Plasmidet pRBIal ble fordøyd med det samme enzymet, vektorfragmentet ble isolert og ligert med PDI-genet. Det resulterende plasmidet pRBIal-PDI inneholder genet for OmpA/RBI og PDI som disistronisk operon under kontrollen av lac-promoteren (fig. 3). Den fullstendige nukleotid-sekvensen til plasmidet er dokumentert i SEK ID nr.: 1.
For ananlyse av virkningen av koekspresjonen og kosekresjon av PDI, ble E.coli JM83 transformert med plasmidet pRBI-PDI.
Dyrkningen og bestemmelsen av den dannete intracellulære RBI-mengden foregår som beskrevet i eksemplene 3 og 4. Analysen viste at koekspresjonen og kosekresjon av PDI bare fører til en utbytteøkning ved samtidig tilsetning av redusert glutation som ligger langt over den ved generell tilsetning av glutation oppdagete utbytteøkningen, mens den generelle ekspresjonen av PDI overhodet ikke har noen innvirkning på mengden av funksjonell, periplasmatisk RBI (tabell 3).
TABELL 3
Ekspresjonsøkning av funsjonell RBI ved koekspresjon av PDI fra E. coli.
Claims (13)
1.
Fremgangsmåte for økning av dannelsen av naturlig proteinkonformasjon ved sekresjon av disulfidbrodannede proteiner i en prokaryotisk vertsorganisme som inneholder et rekombinant DNA, som koder for det utskilte proteinet, der man dyrker vertsorganismen i et egnet næringsmedium under egnede betingelser for ekspresjon av rekombinant DNA, karakterisert ved at man anvender et næringsmedium med et innhold på 0,1 til 20 mmol/1 av ett eller flere tiolreagenser, hvor det eventuelt tilsettes én eller flere mono- eller/og oligosakkarider som ikke kan metaboliseres av vertsorganismen, og hvor eventuelt nevnte vertsorganisme sammen med ekspresjonen av rekombinant DNA som koder for det disulfidbrodannede proteinet som skal utskilles, gjennomfører en overekspresjon av et proteindisulfidisomerasegen.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man anvender et næringsmedium med et innhold på 1 til 15 mmol/1 av et eller flere tiolreagenser.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at man anvender et næringsmedium med et innhold på 3 til 12 mmol/1 av ett eller flere tiolreagenser.
4 .
Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 3, karakterisert ved at man anvender reduserte tiolreagenser med SH-grupper.
5.
Fremgangsmåte ifølge krav et av kravene 1 til 4, karakterisert ved at man anvender reduserte tiolreagenser med en SH-gruppe pr. molekyl.
6.
Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at man som redusert tiolréagens anvender glutation (GSH), cystein, N-acetylcystein, cysteamin, P-merkaptoetanol eller blandinger derav.
7.
Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 3, karakterisert ved at man anvender en blanding av reduserte tiolreagenser med SH-grupper og oksiderte tiolreagenser med disulfidgrupper.
8.
Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at det molare forholdet av reduserte til oksiderende tiolreagenser utgjør 2:1 til 20:1.
9.
Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 7 til 8, karakterisert ved at man anvender en blanding av redusert glutation (GSH) og glutationdisulfid (GSSG).
10.
Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at det rekombinante DNA som koder for det utskilte proteinet, står i operativ kobling med et DNA-f ragment, som koder for et signalpeptid for gjennombringing gjennom den indre bakterielle membranen.
11.
Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at signalpeptidet stammer fra E.coli OmpA-proteinet.
12.
Fremgangsmåte ifølge krav ett av kravene 1 til 11, karakterisert ved at det rekombinante DNA som koder for det utskilte proteinet, står under kontroll av et induserbart ekspresjonssignal.
13.
Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at man anvender ett eller flere mono- eller/og oligosakkarider valgt fra gruppen bestående av sorbose, sakkarose, raffinose eller blandinger derav.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4113750A DE4113750A1 (de) | 1991-04-26 | 1991-04-26 | Verbesserung der renaturierung bei der sekretion von disulfidverbrueckten proteinen |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO921574D0 NO921574D0 (no) | 1992-04-23 |
NO921574L NO921574L (no) | 1992-10-27 |
NO309153B1 true NO309153B1 (no) | 2000-12-18 |
Family
ID=6430469
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO921574A NO309153B1 (no) | 1991-04-26 | 1992-04-23 | Fremgangsmåte for ökning ved sekresjon av disulfidbrodannede proteiner |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6333175B1 (no) |
EP (1) | EP0510658B1 (no) |
JP (1) | JPH0753118B2 (no) |
KR (1) | KR960002869B1 (no) |
AT (1) | ATE109205T1 (no) |
AU (1) | AU636537B2 (no) |
CA (1) | CA2066370C (no) |
DE (2) | DE4113750A1 (no) |
DK (1) | DK0510658T3 (no) |
ES (1) | ES2057944T3 (no) |
FI (1) | FI104262B1 (no) |
IE (1) | IE65792B1 (no) |
IL (1) | IL101686A (no) |
NO (1) | NO309153B1 (no) |
NZ (1) | NZ242492A (no) |
ZA (1) | ZA922971B (no) |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2119779T3 (es) * | 1990-09-05 | 1998-10-16 | Southern Cross Biotech Pty Ltd | Solubilizacion de proteinas en formas activas. |
US6291205B1 (en) * | 1992-06-12 | 2001-09-18 | Merck & Co., Inc. | Method of increasing production of disulfide bonded recombinant proteins by saccharomyces cerevisiae |
US5789199A (en) * | 1994-11-03 | 1998-08-04 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
US5639635A (en) * | 1994-11-03 | 1997-06-17 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
WO1997038123A1 (en) * | 1996-04-05 | 1997-10-16 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells |
US6083715A (en) * | 1997-06-09 | 2000-07-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells |
AU751898B2 (en) | 1997-07-14 | 2002-08-29 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins |
US6753165B1 (en) | 1999-01-14 | 2004-06-22 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
US20080076706A1 (en) | 1997-07-14 | 2008-03-27 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of Growth Hormone and Related Proteins, and Methods of Use Thereof |
US7153943B2 (en) | 1997-07-14 | 2006-12-26 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof |
US7495087B2 (en) | 1997-07-14 | 2009-02-24 | Bolder Biotechnology, Inc. | Cysteine muteins in the C-D loop of human interleukin-11 |
IL144259A0 (en) * | 1999-01-14 | 2002-05-23 | Bolder Biotechnology Inc | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
US8288126B2 (en) | 1999-01-14 | 2012-10-16 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
EP1048732A1 (de) | 1999-04-26 | 2000-11-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen |
EP1077263A1 (de) * | 1999-07-29 | 2001-02-21 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen durch Co-Sekretion von Chaperonen |
US20040203132A1 (en) | 2003-02-28 | 2004-10-14 | Cognetix, Inc. | Conus protein disulfide isomerase |
US7244616B2 (en) | 2003-06-27 | 2007-07-17 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Use of molecular chaperones for the enhanced production of secreted, recombinant proteins in mammalian cells |
KR20050070512A (ko) * | 2003-12-30 | 2005-07-07 | 삼성정밀화학 주식회사 | 재조합 단백질의 생산성을 증가시키는 무혈청 배지 및동물세포 배양방법 |
NZ554520A (en) | 2004-10-22 | 2010-03-26 | Amgen Inc | Methods for refolding of recombinant antibodies |
WO2007136463A2 (en) * | 2006-04-07 | 2007-11-29 | Dow Global Technologies Incorporated | Processes for improved disulfide bond formation in recombinant systems |
KR100743973B1 (ko) * | 2006-04-27 | 2007-07-30 | 한국과학기술원 | 목적단백질 및 코펙터를 재생시키는 효소를 동시에 세포표면에 표면발현시키는 방법 |
GB201101794D0 (en) | 2011-02-02 | 2011-03-16 | Fermentas Uab | Protein production |
US9944960B2 (en) * | 2015-11-17 | 2018-04-17 | Premier Research Labs, Lp | Process for microbial production of dihydrolipoic acid and extraction of dihydrolipoic acid with edible oils |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3537708A1 (de) * | 1985-10-23 | 1987-04-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten |
US4904602A (en) * | 1985-11-27 | 1990-02-27 | Repligen Corporation | Thioredoxin shufflease and use thereof |
IL86455A0 (en) * | 1987-06-01 | 1988-11-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Polypeptide and production thereof |
ES2064336T3 (es) * | 1987-10-13 | 1995-02-01 | Thomae Gmbh Dr K | Procedimiento para la preparacion de proteinas. |
DE3813107A1 (de) | 1988-04-19 | 1989-11-02 | Consortium Elektrochem Ind | Sekretormutante von escherichia coli |
CA2099876C (en) * | 1991-01-21 | 2002-03-26 | Michael L. Hayes | Production of enzymatically active glucocerebrosidase from recombinant cells |
-
1991
- 1991-04-26 DE DE4113750A patent/DE4113750A1/de not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-04-16 CA CA002066370A patent/CA2066370C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-22 IE IE921291A patent/IE65792B1/en not_active IP Right Cessation
- 1992-04-23 DK DK92106978.7T patent/DK0510658T3/da active
- 1992-04-23 NO NO921574A patent/NO309153B1/no unknown
- 1992-04-23 IL IL10168692A patent/IL101686A/xx unknown
- 1992-04-23 ES ES92106978T patent/ES2057944T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-23 EP EP92106978A patent/EP0510658B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-23 AT AT92106978T patent/ATE109205T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-04-23 DE DE59200312T patent/DE59200312D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-24 FI FI921838A patent/FI104262B1/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-04-24 NZ NZ242492A patent/NZ242492A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-04-24 ZA ZA922971A patent/ZA922971B/xx unknown
- 1992-04-24 AU AU15159/92A patent/AU636537B2/en not_active Ceased
- 1992-04-25 KR KR1019920007039A patent/KR960002869B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-04-27 JP JP4107284A patent/JPH0753118B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-07-27 US US08/097,621 patent/US6333175B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE109205T1 (de) | 1994-08-15 |
CA2066370C (en) | 1996-04-02 |
IL101686A0 (en) | 1992-12-30 |
FI921838A0 (fi) | 1992-04-24 |
NO921574L (no) | 1992-10-27 |
EP0510658A3 (en) | 1993-05-26 |
EP0510658A2 (de) | 1992-10-28 |
DE59200312D1 (de) | 1994-09-01 |
NO921574D0 (no) | 1992-04-23 |
FI104262B (fi) | 1999-12-15 |
NZ242492A (en) | 1993-09-27 |
DE4113750A1 (de) | 1992-10-29 |
IE921291A1 (en) | 1992-11-04 |
IE65792B1 (en) | 1995-11-29 |
JPH0753118B2 (ja) | 1995-06-07 |
AU636537B2 (en) | 1993-04-29 |
FI104262B1 (fi) | 1999-12-15 |
JPH05268983A (ja) | 1993-10-19 |
ZA922971B (en) | 1992-12-30 |
ES2057944T3 (es) | 1994-10-16 |
FI921838A (fi) | 1992-10-27 |
AU1515992A (en) | 1992-11-19 |
IL101686A (en) | 2001-08-26 |
KR920019818A (ko) | 1992-11-20 |
DK0510658T3 (da) | 1994-11-28 |
EP0510658B1 (de) | 1994-07-27 |
KR960002869B1 (ko) | 1996-02-27 |
CA2066370A1 (en) | 1992-10-27 |
US6333175B1 (en) | 2001-12-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO309153B1 (no) | Fremgangsmåte for ökning ved sekresjon av disulfidbrodannede proteiner | |
KR100378325B1 (ko) | 분자 샤프론을 공동분비시켜 자연적으로 폴딩되고분비되는 단백질을 생산하는 방법 | |
US8148494B2 (en) | Signal peptide for the production of recombinant proteins | |
WO2020069011A1 (en) | Protein purification methods | |
JP4239412B2 (ja) | トランスグルタミナーゼの製造方法 | |
Ray et al. | Production of salmon calcitonin by direct expression of a glycine-extended precursor in Escherichia coli | |
KR100361049B1 (ko) | 천연적으로 폴딩 및 분비되는 단백질의 제조방법 | |
Koller et al. | Recombinant Streptomyces lividans secretes a fusion protein of tendamistat and proinsulin | |
Malik et al. | Periplasmic production of native human proinsulin as a fusion to E. coli ecotin | |
US7572884B2 (en) | Method for making acylated polypeptides | |
US20150064744A1 (en) | Modified enterokinase light chain | |
Schneider et al. | Manipulating the aggregation and oxidation of human SPARC in the cytoplasm of Escherichia coli | |
US7034119B2 (en) | Method for recombinant production of polypeptides | |
Yazdani et al. | Overexpression of streptokinase using a fed-batch strategy | |
EP0695359B1 (en) | A method for enhancing the production of biologically active recombinant proteins | |
KR100714116B1 (ko) | 췌장의 프로카복시펩티다제 b를 사용한 인슐린의 제조 | |
Wu et al. | Design, production, and characterization of an engineered biotin ligase (BirA) and its application for affinity purification of staphylokinase produced from Bacillus subtilis via secretion | |
Walker et al. | The Tat pathway as a biotechnological tool for the expression and export of heterologous proteins in Escherichia coli | |
KR100754235B1 (ko) | 수성 용매에 저장하는 동안 복합 혼합물중 단백질을안정화시키는 방법 | |
EP1421102A2 (en) | Method for making acylated polypeptides | |
Nataraj et al. | Evaluating various Promoters for increased expression of Proinsulin | |
KR20210079235A (ko) | Whep 도메인 융합에 의한 목적 단백질의 수용성 증진 방법 | |
Malik | A novel strategy for the periplasmic production of heterologous proteins in E. coli | |
MXPA01009979A (en) | Production of pancreatic procarboxy-peptidase b, isoforms and muteins thereof, and their use |