NO309153B1 - Fremgangsmåte for ökning ved sekresjon av disulfidbrodannede proteiner - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å øke dannelsen av den naturlige proteinkonformasjonen ved utskilling av disulfidbrodannede proteiner ved hjelp av en prokaryotisk vertsorganisme, som inneholder et rekombinant DNA, som koder for det utskilte proteinet.

Proteinsyntesen, eller translasjonen i prokaryotiske mikroorganismer, foregår på ribosomene i cytoplasma. Ved en ekspresjon av rekombinant DNA i bakterielle vertsorganismer, er det ofte ønskelig at det resulterende rekombinante genproduktet, hhv. proteinet, blir utskilt fra cytoplasma gjennom den indre bakterielle membranen i det periplasmatiske rommet mellom indre og ytre membran. Fra periplasma kan de utskilte proteinene deretter eksempelvis bli frigjort gjennom et osmotisk sjokk i næringsmediet. En ulempe ved denne fremgangsmåten, er at ved utskilling av disulfidbrodannede proteiner, foregår det som regel ingen riktig dannelse av den native, hhv. naturlige konformasjonen, dvs. det oppstår polypeptider med en falsk eller ufullstendig oppbygning av disulfidbroene, som er biologisk inaktive.

Tiolreagensene blir ved fremgangsmåten tilsatt til in vitro renaturering av uoppløselige proteiner, som oppstår ved ekspresjon av rekombinant DNA i prokaryotisk cellecytoplasma som inklusjonslegemer. Fra tiolreagensene er det kjent at de raskt blir oksydert til disulfider i nærvær av oksygen fra luf ten.

En gjenstand ifølge foreliggende oppfinnelse er økning av dannelsen av den naturlige proteinkonformasjonen ved sekresjon av disulfidbrodannede proteiner.

Spesielt kan en understøttelse av dannelsen av den native proteinkonformasjonen erstatte den delvis meget omstendige in vitro-renatureringen av de falske disulfidbrodannede proteinene.

Gjenstand ifølge foreliggende oppfinnelse blir løst ved en fremgangsmåte for økning av dannelsen av den naturlige pro-teinkonf ormas jon ved utskillelse av disulfidbrodannede proteiner, ved hjelp av en prokaryotisk vertsorganisme som inneholder et rekombinant DNA som koder for det utskilte proteinet, hvori man dyrker vertsorganismen i et egnet næringsmedium under egnede betingelser for ekspresjon av rekombinante DNA, idet fremgangsmåten er kjennetegnet ved at man anvender et næringsmedium med et innhold på 0,1 til 20 mmol/1 av én eller flere tiolreagenser.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for økning av dannelsen av naturlig proteinkonformasjon ved sekresjon av disulfidbrodannede proteiner i en prokaryotisk vertsorganisme som inneholder et rekombinant DNA, som koder for det utskilte proteinet, der man dyrker vertsorganismen i et egnet næringsmedium under egnede betingelser for- ekspresjon av rekombinant DNA, kjennetegnet ved at man anvender et næringsmedium med et innhold på 0,1 til 20 mmol/1 av ett eller flere tiolreagenser, hvor det eventuelt tilsettes én eller flere mono- eller/og oligosakkarider som ikke kan metaboliseres av vertsorganismen, og hvor eventuelt nevnte vertsorganisme sammen med ekspresjonen av rekombinant DNA som koder for det disulfidbrodannede proteinet som skal utskilles, gjennomfører en overekspresjon av et proteindisulfidisomerasegen.

Gjennom fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er det overraskende mulig, ved tilsetning av tiolreagenser i fermen-teringsmediet, å øke utbyttet av korrekte disulfidbrodannede proteiner. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes for alle proteiner som inneholder én eller flere disulfidbroer. Spesielt ved behov av små proteinmengder, f.eks. ved produksjon av vekstfaktorer i mg-målestokk (nerve-vekst-faktor, interleukiner eller lignende forbindelse) kan man ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gi avkall på in vitro-renaturering.

Det har for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen vist seg egnet å anvende et næringsmedium med et innhold på 0,1 til 20 mmol/1 av én eller flere tiolreagenser. Anvender man et næringsmedium med et innhold på mindre enn 0,1 mmol/1 tiolreagenser, forekommer ingen nevneverdig økning av dannelsen av den naturlige proteinkonformasjonen. Overgrensen av tiolkonsentrasjonen ligger omtrent på 20 mmol/1 og manifesterer seg både ved en tydelig reduksjon av utbyttet av utskilte, funksjonale proteiner og også i en sterk til-bakegang av celleveksten. Man anvender fortrinnsvis næringsmedium med et innhold på 1 til 15 mmol/1, og spesielt foretrukket med et innhold på 3 til 12 mmol/1 av én eller flere tiolreagenser. Ved anvendelse av glutation som tiolréagens har det vist seg omtrent 5 mmol/1 som optimal konsentrasj on.

Det i foreliggende beskrivelse anvendte begrepet "tiolréagens", betyr enten et redusert tiolréagens med SH-grupper eller en blanding av reduserte tiolreagenser med SH-grupper" og oksiderte tiolreagenser med disulfidgrupper.

Som reduserte tiolreagenser er spesielt slike egnede som oppviser en eneste SH-gruppe pr. molekyl. Spesielt foretrukne forbindelser er redusert glutation (GSH), cystein, N-acetylcystein, cysteamin, p-merkaptoetanol og lignende forbindelser. Mest foretrukket er N-acetylcystein og redusert glutation (GSH). Tiolreagensene kan anvendes både enkeltvis og i blandinger.

Til tross for at bare anvendelse av reduserte tiolreagenser generelt er foretrukket, bringer også anvendelsen av en blanding av det reduserende og oksiderende tiolreagenset et forbedret utbytte av korrekte disulfidbrodannede proteiner. Ved anvendelse av en slik blanding av reduserte og oksiderte tiolreagenser utgjør det molare forholdet mellom reduserte og oksiderte tiolreagenser, fortrinnsvis 2:1 til 20:1, spesielt foretrukket 5:1 til 10:1. En blanding av et redusert og et oksidert tiolréagens er eksempelvis redusert glutation (GSH) og glutationdisulfid (GSSG).

Et eksempel på fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er den heterologe ekspresjonen av den bifunksjonale cx-amylase/- trypsin-inhibitoren fra Eleusine coracana Gaertneri (RBI) i E. coli. Inhibitoren ble karakterisert av Shivaraj og Pattabiraman (Shivaraj B. & Pattabiraman, T.N. , Indian J. Biochem. Biophys. 17 (1980), 181-193; Shivara B. & Pattabiraman, T.N., Biochem. J. 193 (1981), 29-36). Aminosyresekvensen til inhibitoren ble bestemt av Campos og Richardson (Campos, F. A.P. & Richardson, NI., FEBS Letters 152 (1983), 300-304 ). Dette proteinet består av 122 aminosyrer, inneholder 5 intramolekylære disulfidbroer og hører til en ny a-amylase/- trypsin-inhibitorklasse (Halford et al., Biochem. Biophys. Acta 950 ( 1988), 435-440), idet det er deres eneste bi-funksjonelle forløper. Det er derimot å bemerke at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen også kan anvendes for isolering av andre disulfidbrodannede rekombinante proteiner (f.eks. antistoff-fragmenter) i prokaryote vertsorganismer som blir utskilt.

For isolering av det sekretoriske RBI-proteinet i funksjonell form i E.coli, ble et syntetisk RBI-gen fusjonert ved hjelp av genteknologiske midler på signal sekvensen til den ytre membranen til protein A (OmpA) fra E.coli og fusjonen på et rekombinant plasmid under kontroll av en lac-promoter ble uttrykt i E.coli. På denne måten blir polypeptidkjeden til det rekombinante proteinet transportert i periplasma til prokaryotiske vertsceller, der de etter avspaltning av signalsekvensen på grunn av de oksiderende egenskapene til denne celledelen under dannelse av de intramolekylære disulfidbroene kan folde seg til nativt protein. Ved denne foldingen kan derimot bare små mengder av funksjonelt protein oppnås. Ved nærværet av tiolreagensene ifølge oppfinnelsen i næringsmediet, er det derimot mulig å øke utbyttet av funksjonelt protein betraktelig (med en faktor på 5). Vertsorganismen for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er en prokaryotisk vertsorganisme. Ekspresjonene av det rekombinante proteinet foregår fortrinnsvis i en gram-negativ prokaryotisk vertsorganisme, spesielt foretrukket i E.coli.

I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det generelt gunstig at det for det utskilte proteinkodende rekombinante DNA står i operativ binding med et DNA-fragment, som koder for et signalpeptid for gjennombringing gjennom den indre, bakterielle membranen. Begrepet "operativt bundet" betyr i foreliggende oppfinnelse at det oppstår en translasjonen fusjon mellom det heterologe proteinet og signalpeptidet. Signalpeptidet danner da eventuelt den N-terminale delen av den translasjonene fusjon. Type signalpeptid er ikke kritisk for foreliggende oppfinnelse, bortsett fra at det skal muliggjøre sekresjon av det rekombinante proteinet. Et stort antall av slike signalpeptider er kjent for fagfolk innenfor området molekylær biologi. En rekke signalpeptider er f.eks. beskrevet av Winnacker (Gene und Klone, Eine Einfilring in die Gentechnologie, Verlag Chemie Weinheik (1985), s. 256). Dersom fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir gjennomført i E.coli som vertsorganisme, har signalpeptidet fra E.coli OmpA-proteinet vist seg å være meget egnet.

For ekspresjon i en prokaryotisk vertsorganisme må det rekombinante DNA, som koder for det utskilte proteinet, stå under kontroll av et av transkripsjonssystemet til verten kjente ekspresjonssignaler hhv. promotere. I prokaryotiske vertsceller aktive ekspresjonssignaler, er kjent for fagfolk innen området molekylær biologi. I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes fortrinnsvis et induserbart ekspresjonssignal. Eksempler på en induserbar E.coli-promoter er lac-promoteren, som er induserbar gjennom isopropyl-p<->D-galaktosid (IPTG) samt syntetiske derivater av lac-promotere (f.eks. tac- eller trc-promoteren).

Rekombinante DNA som koder for det disulfidbrodannede, utskilte proteinet, blir generelt innført gjennom transformasjon i den prokaryotiske vertscellen. Teknikker for transformasjon av forskjellige prokaryotiske vertsorganismer er kjent for fagfolk, og behøver ikke å bli forklart her. Rekombinant DNA som foreligger i den transformerte vertscellen, befinner seg på en rekombinant vektor som i vertscellen enten kan foreligge ekstrakromosomalt (f.eks. plasmid) eller integrert i genomet til vertscellen (f.eks. bakteriofag X). Det er foretrukket å anvende et plasmid som vektor. Det er derfor ikke kritisk ifølge fremgangsmåten i oppfinnelsen hvilket spesielt plasmid blir anvendt som ekspresjonsvektor. Det kommer bare an på at det rekombinante DNA som koder for det ønskede proteinet, i tilstrekkelig grad blir transkribert og translatert av vertscellen. Translasjonsproduktet til rekombinant DNA må foreligge i en form som muliggjør sekresjon gjennom den indre, bakterielle membranen i periplasmaet.

Som angitt ovenfor, blir vanligvis et rekombinant protein som er fusjonert med en signalsekvens, transportert inn i periplasma til en prokaryotisk vertscelle. Dette gir også en foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse. Ved anvendelse av bestemte vertsstammer, foregår derimot ikke bare en sekresjon i per iplasmaet, men også en massiv proteinsekresjon i næringsmediet. EP-A 0.338.410 beskriver E.coli-stammer som er istand til en massiv proteinsekresjon i næringsmediet og beskriver også en fremgangsmåte for fremstilling av disse stammene. Som utgangsstammer for fremstilling av disse sekresjonsmutantene anvendes fortrinnsvis de i EP-A 0.338.410 nevnte E.coli-stammer DS410 (DSM 4513), hhv. BW7261 (DSM 5231).

Som næringsmedium for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, anvendes fortrinnsvis et fullmedium, spesielt et medium som inneholder forbindelser eller forbindelsesblandinger av celleekstrakter. Et eksempel på et slikt medium er LB-mediet, som inneholder substansblandinger av enzymatisk fordøyet celleekstrakt (Bacto-Trypton og gjærekstrakt).

pH-veriden til næringsmediet ligger fortrinnsvis i et området på mellom pH 5 og pH 9. Spesielt foretrukket ligger pH-verdien til næringsmediet mellom 6 og 8. Anvender man LB-medium som næringsmedium, har det vist seg gunstig å innstille en pH-verdi på 7,4 ved fremstilling av mediet. I løpet av celleveksten, synker deretter pH-verdien til mediet, og ligger ifølge oppfinnelsen ved stasjonær overnattkulturer (tidspunkt ved cellehøstning) på omtrent 6,8.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir fortrinnsvis gjennomført i en ristekultur i et fullmedium. Det er derimot mulig å dyrke vertsorganismen i en meget luftet fermentor eller/og i nærvær av et minimalmedium.

En ytterligere utførelsesform ifølge fremgangsmåten i oppfinnelsen, består i at næringsmediet tilsettes ytterligere ett eller flere mono- eller/og oligosakkarider som ikke kan bli metabolisert av den anvendte prokaryotiske vertsmikro-organismen. Fra et arbeid til Bowden og Georgiou (J. Biol. Chem. 265 (1990), 16760-16766) er det nemlig kjent at tilsetning av ikke-metaboliserbare sukkerforbindelser kan føre til dannelsen av den native proteinkonformasjon. Den ytterligere anvendelsen av denne ikke-metaboliserbare sukkerforbindelsen ifølge fremgangsmåten i oppfinnelsen, utviser en ytterligere understøttende effekt ved dannelsen av den native proteinkonformasjonen av utskilte proteiner. Eksempler på ikke-metaboliserbare sukkere, er sorbose (et monosakkarid), sakkarose (et disakkarid) og raffinose (et trisakkarid). Konsentrasjonen av det ikke-metaboliserbare mono- eller/og oligosakkaridet i næringsmediet ligger i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis mellom 0,1 mol/l og 1 mol/l, fortrinnsvis mellom 0,3 mol/l og 0,7 mol/l. En ytterligere spesiell utførelsesform ifølge fremgangsmåten i oppfinnelsen, består i at man i en vertsorganisme sammen med ekspresjonen av det rekombinante DNA som koder for di-sulf idbrodannet protein som skal utskilles, gjennomfører en overekspresjon av et protein disulfidisomerasegen. Man anvender fortrinnsvis et proteindisulfidisomerasegen fra gram-negative bakteriearter, og spesielt foretrukket er et protein disulfidisomerasegen fra E.coli. DNA-sekvensen av et slik gen er vist i SEK ID nr.: 3.

Det ble overraskende fastslått at en koekspresjon og kosekresjon av et vertseget proteindisulfidisomerasegen i kombinasjon med tilsetning av tiolreagenser i næringsmediet bevirker en økning av utbyttet av funksjonelt, utskilt protein, som overgår virkningen av tilsetningene av tiolreagenser alene. Derimot har bare koekspresjon av pro-teindisulf idisomerase (PDI) uten tilsetning av tiolreagenser ingen utbytteøkning.

Begrepet "overekspresjon" ifølge foreliggende oppfinnelse, betyr en stigning av proteindisulfidisomerase-ekspresjonen sammenlignet med en vildtype av den anvendte prokaryote vertsorganismen. En slik overekspresjon lar seg eksempelvis oppnå ved at proteindisulfidisomerasegenet befinner seg under kontroll av et sterkt, fortrinnsvis induserbart ekspresjonssignal (f.eks. en lac-promoter eller derivater derav). Overekspresjonen av PDI-genet foregår fortrinnsvis i "operativ kobling" med et signalpeptid for gjennomtrengning av den bakterielle membranen. Spesielt foretrukket blir det derfor anvendt den naturlige PDI-signalsekvensen.

I en utførelsesform ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan eksempelvis rekombinante DNA som koder for proteinet som skal bli utskilt og proteindisulfidisomerasegenet foreligge på en enkelt ekspresjonsvektor i vertscellen. Denne ekspresjonsvektoren er fortrinnsvis en ekstrakromosomal vektor, dvs. et plasmid, men kan også være integrert i kromosomet til vertscellen (f.eks. lambda-fag). Ved anvendelse av en enkelt ekspresjonsvektor, er det foretrukket at rekombinant DNA og proteindisulfidisomerasegenet befinner seg under kontroll av et enkelt ekspresjonssignal, dvs. i form av et decistronisk operon.

På en annen side er det derimot det rekombinante DNA som koder for proteinet som skal bli utskilt og proteindisulfidisomerasegenet befinner seg på to for hverandre kompatible ekstrakromosomale ekspresjonsvektorer som står under kontroll av et eget ekspresjonssignal (promotere).

Oppfinnelsen skal videre bli beskrevet ved hjelp av følgende eksempler i forbindelse med figurene 1 og 2 samt SEK ID nr.: 1-5. Fig. 1 viser et immunoblot for å bevise opplø-selig, prosessert RBI etter tilsetning av forskjellige mengder glutation i næringsmediet . Fig. 2 viser en skjematisk fremstilling av

ekspresjonsplasmidet pRBlal-PDI.

SEK ID nr.: 1 viser DNA-sekvensen fra koekspresjon av RBI

og proteindisulfidisomerase (PDI) fra E.coli W3110 anvendte plasmider.

SEK ID nr.2 viser sekvensen til OmpA/RBI-genet.

Dobbelttrådet DNA blir sammensatt av 14 syntetiske oligonukleotider og begrenset gjennom restriksjonsspaltesetene Xbal og Hindlll. Den i sekvensprotokollen viste DNA-tråden er sammensatt av 7 oligonukleotider som tilsvarer følgende områder: Mottråden dannes likeledes fra 7 oligonukleotider som er komplementær med følgende områder av den viste DNA-tråden:

SEK ID nr: 3 viser sekvensen til proteindisulfidisomerasegenet med signalsekvensen og det ribosomale bindingssetet.

SEK ID nr.: 4 viser den N-terminale primeren for

amplifisering av PDI-genet.

SEK ID nr.: 5 viser den C-terminale primeren for

amplifisering av PDI-genet.

EKSEMPEL 1

Gensyntese

Forbemerkning:

De molekylærgenetiske teknikkene er basert på Maniatis et.al.

(Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, New York), oligonukleotidene ble fremstilt ifølge fosforamiditfremgangsmåten (Sinha et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 4539-4557; Kaplan, B.E., Trends Biotechnol. 3

(1985), 253-256) på et automatisk synteseapparat, type 380A fra firmaet Applied Biosystems GmbH. Det syntetiske genet som koder for fusjonen mellom OmpA-signalsekvensen og RBI, ble sammensatt av 14 syntetiske oligonukleotider (SEK ID nr.: 2). 01igonukleotidene ble renset gjennom polyakrylamid/urinstoff-gelelektroforese og med unntak av begge ovenstående oligonukleotider fosforylert ved 5'- og ved 3'-enden av genet ved deres 5'-ender. Deretter ble alle olIgonukleotidene renset i ekvimolare forhold og hybridisert i en enkelt blanding og ligert. Genet blir begrenset med restriksjonssetene Xbal og Hindlll. Aminosyrene til OmpA-signalsekvensen er angitt med negative fortegn.

EKSEMPEL 2

Konstruksjon av ekspres. ionsplasmidet pRBIa 1

Det ifølge eksempel 1 oppnådde syntetiske genet ble klonet over restriksjonssete Xbal og Hindlll i ekspresjonsplasmidet pASK40 (Skerra et al., B10/TECHNOLOGY 9 (1991), 273-278). Sekvensen til det syntetiske genet ble bestemt ved didesoksy-sekvensering. Det resulterende plasmidet ble betegnet pRBIal.

EKSEMPEL 3

Funksjonell ekspresjon av RBI i periplasma til E. coli

En stasjonær overnattkultur av E.coli JM83 (Yannish-Perron et al., Gene 33 (1985), 103-119) som var blitt transformert med pRBIal, ble fortynnet i forholdet 1:100 i 2,5 1 LB-medium (1 1 LB-medium inneholder 10 g bakto-trypton (Difco Factories, Detroit, Michigan, USA), 5 g (Yast-ekstrakt (Difco Factories) og 5 g NaCl, pH 7,4) med ampicillin (100 ug/ml) og ristet ved 26°C frem til en OD550 på 1,0. Deretter fordelt i 9 identiske 250 ml-porsjoner, og hver kultur ble indusert med IPTG (isopropyl-p<->D-galaktosid; sluttkonsentrasjon 1 mmol/1), men omsatt med forskjellige mengder glutation (GSH). Cellene ble videre ristet overnatt ved 26° C og høstet ved sentrifugering (Sorvall SS34, 4°C, 5000 Upm, 15 minutter). Deretter ble cellene tatt opp ved 4°C i 100 mmol/1 Tris/HCl pH 7,5, 20 mmol/1 Na-EDTA, slik at celletetthet på 200 (OD550) ble oppnådd. Cellene ble deretter lysert i en Frensch presse-cellepresse (Aminco) lysert ved 12411o KPa. Lysatet ble sentrifugert (Sorvall SS34, 4°C, 15000 Upm, 30 minutter) og innholdet av oppløselig, funksjonell RBI ble undersøkt i de oppløselige supernatantene. 5 pl av innholdet av oppløselig supernatant ble separert på en 15$ polyakrylamid/SDS-gel (Fling & Gregerson, Anal. Biochem. 155 (1986) 83-88). De separerte proteinene ble overført ved elektroeluering på en nitrocellulosemembran, og RBI-båndene ble immunspesifikt farvet ved hjelp av et anti-RBI-kaninantistoff. Immunoblottingen ble gjennomført ifølge Blake et al., Anal. Biochem. 136 (1984), 175-179.

Fig. 1 viser en analyse av'ekspresjonsutbyttet av oppløselig RBI ved hjelp av immunblotting. Spor 1 viser en molekylær vekststandard. I spor 2 ble 0,8 pg RBI renset fra eleusin coracana Gaertneri. I spor 3 til 6 ble ekvivalente mengder av celleekstraktet applisert med forskjellige tilførselsmengder av glutation. I spor 3 er en GSH-tilførsel til kulturmediet. I spor 4, 5 og 6 blir kulturmediet tilsatt 1 mmol/1, 5 mmol/1 hhv. 10 mmol/1 GSH.

Som antistoff ble det anvendt et polyklonalt anti-RBI-antiserum, som ble fremstilt ifølge standardmetoder (se f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kapitel 18), ved hjelp av to ganger immuniser ing av en new Zealand-kanin med renset RBI fra Eleusine coracana Gartneri.

Figuren viser at tilsetning av GSH forsterker intensiteten til de immunspesifikt farvede båndene. Dette er spesielt synlig ved konsentrasjoner på 5 mmol/1 og 10 mmol/1 GSH.

Ved bestemmelse av den inhibitoriske aktiviteten i forhold til trypsin fra storfebukspyttkjertel, ble RBI-mengden i den oppløselige andelen av det oppnådde celleekstraktet bestemt kvantitativt. Det var mulig å vise at mengde av intracellu-lær, funksjonell inhibitor kunne bli øket 5-ganger i forhold til ekspresjonen uten de beskrevne mediumtilsetningene (tabell 1).

Det fremgår videre fra tabell 1 at det er mulig ved tilsetning av en blanding av redusert glutation (GSH) og glutationdisulfid (GSSG) å forbedre utbyttet av funksjonell inhibitor.

I alle de gjennomførte testene ble 5 pg trypsin fra storfebukspyttkjertel inkubert i 1 ml 100 mmol/1 NaCl, 50 mmol/1 Tris/HCl pH 8,0, 10 mmol/1 CaCl2, 0,005$ (v/v) Triton X-100 med den bestemte mengden RBI i 30 minutter ved 25° C. Etter tilsetning av 20 pl/10 mmol/1 N-a-benzoyl-L-arginin-4-nitranilid (kromogent testsubstrat), ble restaktiviteten til ' trypsinet bestemt ved registrering av økningen av absorpsjon ved 405 nm. Inhibitorkonsentrasjonen i testen ble bestemt ut i fra forskjellen mellom aktiviteten til det frie enzymet (uten tilsetning av en inhibitor) og den målte restaktiviteten .

Tabell 1 viser ekspresjonsøkningen av funksjonelt RBI ved tilsetning av GSH hhv. en blanding av GDH og GSSG.

EKSEMPEL 4

Anvendelse av N- acetvl- L- cvstein som ytterligere tiolréagens Som beskrevet i eksempel 3, blir kulturer av E.coli JM83, som var blitt transformert med plasmidet pRBIal, transformert ved 26° C i LB-medium med ampicillin (100 ug/ml) og indusert ved en OD550 = 1 med IPTG (sluttkonsentrasjon: 1 mmol/1). Samtidig foregår tilsetningen av N-acetyl-L-cystein i fast form (sluttkonsentrasjon: 5 og 10 mmol/1). Kulturen ble deretter videre omrørt overnatt og, som beskrevet i eksempel 3, innholdet av funksjonelt RBI ble bestemt ved tyrpsin-inhibisjonstester. Resultatene er ført opp i tabell 2 og viser at konsentrasjonsområdet, der N-acetyl-L-cystein virker, at dette er meget likt det reduserte glutationet.

TABELL 2

Ekspresjon av funksjonell RBI ved tilsetning av N- acetylcystein.

EKSEMPEL 5

Koekspresjon og kosekresjon av periplasmatisk proteindisulfidisomerase (PDI) og samtidig tilsetning av tiolreagenser i kulturmediet.

For koekspresjon av vertsegen, periplasmatisk proteindisulfidisomerase (PDI) ble først PDI-genet amplifisert av genomet til E.coli K12 vildtypestammen W3110 (Bachmann, B.J. (1972), Bacteriol, Rev. 36, 525-557) gjennom polymerasekjedereaksjon (PCR). Her virket den kjente basesekvensen til genet (Bardwell, J.C.A., McGovern, K. & Beckwith, J., "Identifica-tion of a Protein Required for Disulfide Bond Formation in vivo", Cell, 67, (1991), 581-589) som utgangspunkt for bestemmelse av den tilsvarende oligonukleotidprimeren.

For amplifisering av PDI-genet ble følgende oligonukleotid anvendt som primer:

Det amplifiserte DNA-fragmentet som inneholder det fullstendige genet til PDI inklusiv signalsekvens og ribosomalt bindingssete, ble isolert og spaltet med restriksjonsenzymene Hindlll og BamHI. Plasmidet pRBIal ble fordøyd med det samme enzymet, vektorfragmentet ble isolert og ligert med PDI-genet. Det resulterende plasmidet pRBIal-PDI inneholder genet for OmpA/RBI og PDI som disistronisk operon under kontrollen av lac-promoteren (fig. 3). Den fullstendige nukleotid-sekvensen til plasmidet er dokumentert i SEK ID nr.: 1.

For ananlyse av virkningen av koekspresjonen og kosekresjon av PDI, ble E.coli JM83 transformert med plasmidet pRBI-PDI.

Dyrkningen og bestemmelsen av den dannete intracellulære RBI-mengden foregår som beskrevet i eksemplene 3 og 4. Analysen viste at koekspresjonen og kosekresjon av PDI bare fører til en utbytteøkning ved samtidig tilsetning av redusert glutation som ligger langt over den ved generell tilsetning av glutation oppdagete utbytteøkningen, mens den generelle ekspresjonen av PDI overhodet ikke har noen innvirkning på mengden av funksjonell, periplasmatisk RBI (tabell 3).

TABELL 3

Ekspresjonsøkning av funsjonell RBI ved koekspresjon av PDI fra E. coli.

Claims (13)

1. Fremgangsmåte for økning av dannelsen av naturlig proteinkonformasjon ved sekresjon av disulfidbrodannede proteiner i en prokaryotisk vertsorganisme som inneholder et rekombinant DNA, som koder for det utskilte proteinet, der man dyrker vertsorganismen i et egnet næringsmedium under egnede betingelser for ekspresjon av rekombinant DNA, karakterisert ved at man anvender et næringsmedium med et innhold på 0,1 til 20 mmol/1 av ett eller flere tiolreagenser, hvor det eventuelt tilsettes én eller flere mono- eller/og oligosakkarider som ikke kan metaboliseres av vertsorganismen, og hvor eventuelt nevnte vertsorganisme sammen med ekspresjonen av rekombinant DNA som koder for det disulfidbrodannede proteinet som skal utskilles, gjennomfører en overekspresjon av et proteindisulfidisomerasegen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man anvender et næringsmedium med et innhold på 1 til 15 mmol/1 av et eller flere tiolreagenser.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at man anvender et næringsmedium med et innhold på 3 til 12 mmol/1 av ett eller flere tiolreagenser.

4 . Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 3, karakterisert ved at man anvender reduserte tiolreagenser med SH-grupper.

5. Fremgangsmåte ifølge krav et av kravene 1 til 4, karakterisert ved at man anvender reduserte tiolreagenser med en SH-gruppe pr. molekyl.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at man som redusert tiolréagens anvender glutation (GSH), cystein, N-acetylcystein, cysteamin, P-merkaptoetanol eller blandinger derav.

7. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 3, karakterisert ved at man anvender en blanding av reduserte tiolreagenser med SH-grupper og oksiderte tiolreagenser med disulfidgrupper.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at det molare forholdet av reduserte til oksiderende tiolreagenser utgjør 2:1 til 20:1.

9. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 7 til 8, karakterisert ved at man anvender en blanding av redusert glutation (GSH) og glutationdisulfid (GSSG).

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at det rekombinante DNA som koder for det utskilte proteinet, står i operativ kobling med et DNA-f ragment, som koder for et signalpeptid for gjennombringing gjennom den indre bakterielle membranen.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at signalpeptidet stammer fra E.coli OmpA-proteinet.

12. Fremgangsmåte ifølge krav ett av kravene 1 til 11, karakterisert ved at det rekombinante DNA som koder for det utskilte proteinet, står under kontroll av et induserbart ekspresjonssignal.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at man anvender ett eller flere mono- eller/og oligosakkarider valgt fra gruppen bestående av sorbose, sakkarose, raffinose eller blandinger derav.