DK171239B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af aprotinin eller homologer deraf, vektor der er i stand til at replicere i gær samt gærstamme - Google Patents
Fremgangsmåde til fremstilling af aprotinin eller homologer deraf, vektor der er i stand til at replicere i gær samt gærstamme Download PDFInfo
- Publication number
- DK171239B1 DK171239B1 DK051990A DK51990A DK171239B1 DK 171239 B1 DK171239 B1 DK 171239B1 DK 051990 A DK051990 A DK 051990A DK 51990 A DK51990 A DK 51990A DK 171239 B1 DK171239 B1 DK 171239B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- aprotinin
- yeast
- sequence
- ser
- dna sequence
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
i DK 171239 B1
Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af aprotinin og homologer deraf i gær, ekspressionsvektorer og transformerede gærceller.
Aprotinin (oksepancreastrypsininhibitor, BPTI) er et 5 polypeptid, som udskilles af adskillige okseorganer og -væv, såsom lymfeknuder, bugspytkirtel, lunger, ørespytkirtel, milt og lever. Det er et enkeltkædet polypeptid, som består af 58 aminosyrerester tværbundet med tre disulfidbroer med følgende sekvens: 10 Arg-Pro-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Lys-Ala-Arg-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Leu-Cys-Gln-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-Lys-Arg-15 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42
Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Arg-Thr-Cys-Gly-43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56
Gly-Ala 57 58 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
De tre disulfidbroer er beliggende mellem henholdsvis 2
Cys(5)-Cys(55), Cys(14)-Cys(38) og Cys(30)-Cys(51).
3
Aprotinin anvendes i behandlingen af akut bugspyt- 4 kirtelbetændelse, forskellige choktilstande, hyperfibrinoly- 5 tisk blødning og hjerteinfarkt. Indgift af aprotinin i høje 6 doser reducerer blodtab i forbindelse med hjertekirurgi 7 væsentligt.
8
Aprotinin kan ekstraheres fra forskellige okseorganer 9
eller -væv, såsom lunger, bugspytkirtel og ørespytkirtel. I
10 den foreliggende beskrivelse betegnes aprotinin, der er 11 fremkommet på denne måde, som naturligt aprotinin. Ekstraktion 12 fra dyrevæv er en besværlig process og kræver store mængder 13 okseorganer eller -væv. En meget mere egnet metode til kom 14 merciel produktion vil være en fermenteringsprocess, hvorved 15 et gen, der koder for aprotinin, inkorporeres i en egnet mi- 16 kroorganisme ved hjælp af rekombinante DNA-teknikker og mikroorganismen dyrkes i et egnet næringsmedium til fremstilling af det ønskede produkt, som det secernerer i mediet i moden form.
DK 171239 B1 2
Et gen for aprotinin er blevet sat sammen med den sekvens, der koder for signalpeptidet for alkalisk fosfatase i E. coli og udtrykt i E. coli under kontrol af alkalisk fosfa-tasepromoteren (Marks, C.B. et al., The Journal of Biological 5 Chemistry 261 (1986) 7115-7118). Desuden er et syntetisk gen, der koder for proteinsekvensen af Met-aprotinin, blevet klonet i en E. coli ekspressionsvektor (von Wilcken-Bermann, B. et al., The EMBO Journal 5 (1986) 3219-3225). Fremstilling af aprotinin og aprotininhomologer er også beskrevet i den 10 offentliggjorte europæiske patentbeskrivelse nr. 238,993 og i engelsk patentansøgning nr. 2,188,933.
Imidlertid er et problem med fremstillingen af små fremmede proteiner i E. coli, at sådanne proteiner er tilbøjelige til at blive nedbrudt af værtens proteaser. Etableringen 15 af korrekte disulfidbroer og korrekt foldning kan også være et problem i E. coli.
Det er blevet påvist, at gær er i stand til at udtrykke og modne små proteiner på ca. samme størrelse som aprotinin. I EP-patentansøgning nr. 0163529A beskrives frem-20 stilling af insulinprecursorer med korrekt anbragte disulfid-broer, og i EP-patentansøgning nr. 0189998A beskrives fremstilling af glucagon, et enkeltkædet polypeptid på 29 aminosyrerester.
Ved disse metoder udtrykkes et primært produkt 25 bestående af det ønskede protein bundet til et gærleaderpeptid i gær. Under secernering spaltes det primære produkt med enzymet Kex2 (Julius, D. et al., Cell 32 (1983) 839-852) og det spaltede produkt, som også betegnes det modne eller modnede produkt, secerneres derpå i mediet. Spaltning af det ud-30 trykte primære produkt sker ved et par basiske aminosyrer (Lys-Arg) ved det modne produkts N-terminale ende.
Ved aprotinin, som har en basisk aminosyre (Arg) som den N-terminale aminosyre, kunne der opstå problemer, hvis Kex2 behandlingsstedet Lys-Arg indskydes før den første Arg 35 rest i aprotininsekvensen, eftersom et "tredobbelt basisk" spaltningssted ville være til stede i det udtrykte fusionsprodukt. Desuden kunne det basiske aminosyrepar i aprotinin- DK 171239 B1 3 molekylet (Lys(41)-Arg(42)) være et potentielt spaltningssted for Kex2 enzymet inde i gærcellerne.
Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af aprotinin 5 eller homologer deraf i gær, hvorved store mængder af korrekt foldet og modnet protein secerneres i mediet.
Opfindelsen er baseret på den overraskende opdagelse, at aprotinin og visse homologer deraf kan fremstilles i høje udbytter med korrekt anbragte disulfidbroer ved dyrkning af en 10 gærstamme, der er transformeret med en DNA-sekvens, der koder for sådanne produkter.
Ved produktion af heterologe proteiner i gær transporteres disse i flere trin fra det sted i cytoplasmaet, hvor de dannes, gennem det endoplasmatiske reticulum og Golgi-ap-15 paratet og ud i dyrkningsmediet. Under denne proces bliver signal/leaderpeptidet inden sekretion af proteinet spaltet fra af et proteolytisk enzym, der - i lighed med trypsin - spalter ved to nabostillede basiske aminosyrer. Da aprotinin er en bredspektret proteaseinhibitor, der bl.a. inhiberer trypsin, 20 var det på ingen måde givet på forhånd, at sekretion af korrekt spaltet aprotinin ikke ville blive forhindret ved, at den nævnte proteolytiske fraspaltning af signal/leaderpeptidet ville blive forhindret af selve det producerede aprotinin. Det er således overraskende, at en sådan inhibering ikke finder 25 sted.
Det skal desuden anføres, at selv om det fra dansk patent nr. 157938 er kendt at udskifte en af to nabostillede aminosyrer med en ikke-basisk aminosyre for at undgå proteolytisk spaltning, er det overraskende, at det modificerede apro-30 tininmolekyle bevarer sin biologiske aktivitet.
Ifølge et første aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en fremgangsmåde til fremstilling af høje udbytter af aprotinin eller homologer deraf i gær ved dyrkning af en gærstamme indeholdende en replicerbar 35 udtrykkelsesvektor med et syntetisk gen, der koder for aprotinin eller homologer deraf bundet til en DNA-sekvens, der koder for en signalpeptidsekvens og en leaderpeptidsekvens, som tilvejebringer secernering af aprotininet eller aprotinin- DK 171239 B1 4 homologen, i et egnet næringsmedium efterfulgt af udvinding af aprotinin eller aprotininhomologer fra dyrkningsmediet.
Ifølge et andet aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en replicerbar udtrykkelsesvektor omfat-5 tende en DNA-sekvens, der koder for aprotinin eller en aproti-ninhomolog bundet til en DNA-sekvens, der koder for en signal-peptidsekvens og en leaderpeptidsekvens, som tilvejebringer secernering af aprotininet eller aprotinenhomologen, som tillader udtrykkelse af aprotinin eller dets homolog i gær.
10 Ifølge et tredje aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en gærstamme transformeret med denne replicerbare udtrykkelsesvektor.
Aprotininer, der fremstilles ifølge den foreliggende opfindelse kan karakteriseres ved den følgende formel (I) 15 X-aprotinin(3-40)-Y-Z-aprotinin(43-58) (I) hvor X betyder Arg-Pro, Pro eller hydrogen, aprotinin(3-40) betyder aminosyresekvensen fra aminosyrerest 3 til 40 i naturligt aprotinin, Y er Lys, Z kan være Arg eller Ser, og aprotinin(43-58) betyder aminosyresekvensen fra aminosyrerest 20 43 til 58 i naturligt aprotinin.
Den foreliggende opfindelse skal yderligere illustreres under henvisning til tegningen, hvor
Fig. 1 viser et syntetisk gen, der koder for aprotinin(3-58); 25 Fig. 2 viser konstruktionen af plasmiderne pKFN374 og PKFN375;
Fig. 3 viser konstruktionen af plasmid pMT 636?
Fig. 4 viser et syntetisk gen, der koder for aprotinin(3-58,42 Ser); 30 Fig. 5 viser konstruktionen af plasmiderne pKFN414 og PKFN416; DK 171239 B1 5
Fig. 6 viser et syntetisk gen, der koder for aprotinin(l-58); og
Fig. 7 viser et syntetisk gen, der koder for aprotinin(l-58,42 Ser).
5 Med henblik på secernering bindes den DNA-sekvens, der koder for det ønskede aprotinin eller den ønskede aproti-ninhomolog til en DNA-sekvens, der koder for en signalpeptids-ekvens og en leader-peptidsekvens. Signalpeptiderne og leader-peptiderne fraspaltes af den transformerede mikroorganisme 10 under secerneringen af det udtrykte proteinprodukt fra cellerne, hvilket sikrer en mere enkel isoleringsprocedure for det ønskede produkt. Et velegnet leader-peptidsystem for gær er MFal gær-leadersekvensen eller en del deraf (Kurjan, J. og Herskowitz, I., Cell 30 (1982) 933-943) eller en leader, der 15 er beskrevet i dansk patentansøgning nr. 4638/87. Imidlertid kan en hvilken som helst signalsekvens eller leadersekvens, der tilvejebringer secernering i gær, anvendes, og den foreliggende opfindelse tænkes ikke begrænset til et bestemt secerneringssystem .
20 Til ekspressionsformål anbringes en promotersekvens oven for DNA-sekvensen for det ønskede proteinprodukt. Der anvendes fortrinsvis en promoter fra et gen, der naturligt findes i gærværtsorganismen, f.eks. en promoter fra TPI-genet (triosephosphatisomerase). DNA-sekvensen for det ønskede 25 produkt efterfølges af en transkriptionsterminatorsekvens, fortrinsvis en terminatorsekvens fra et gen, der naturligt findes i værtsgærorganismen, f.eks. terminatoren fra TPI-genet eller MFal-genet.
DNA-sekvensen, der koder for aprotinin eller aproti-30 ninhomologen, bundet til en passende promoter-, signal-, leader- og terminatorsekvenser, indsættes i en ekspressionsvektor til ekspression af aprotinin eller aprotininhomologen i gær.
Ekspressionsvektoren kan være et plasmid, der kan replikere uafhængigt i gær eller kan integreres i gærkromoso-35 met. Plasmidet kan fortrinsvis stabiliseres mod plasmidtab fra DK 171239 B1 6 værtsorganismen ved indføring af et gen, der er essentielt for værtscellernes levedygtighed eller normale vækst, f.eks. et gen, der koder for celledeling, cellevægsbiosyntese, proteinsyntese, etc.
5 Som anvendt i den foreliggende ansøgning betyder aprotinin(l-58) aprotinin med det naturlige aprotinins amino-syresekvens, hvorimod aprotinin(3-58) betyder en aprotinin-homolog, der mangler de første to N-terminale aminosyrerester. Aprotinin(1-58,42 Ser) betyder en aprotininhomolog, hvor Arg i 10 position 42 er erstattet af Ser, og aprotinin(3-58,42 Ser) betyder en aprotininhomolog, der mangler de første to N-terminale aminosyrerester og endvidere har fået Arg i position 42 erstattet af Ser.
De fremgangsmåder til transformering af gær og 15 dyrkning af transformerede gærstammer, soro kan anvendes ved udøvelsen af opfindelsen, er allerede kendt teknik som f.eks. beskrevet i nævnte EP patentansøgninger nr. 0163529A og 0189998A.
For at minimere mulige komplikationer under secerne-20 ring forårsaget af et "tredobbelt basisk" spaltningssted ved den N-terminale ende af aprotiningenet fremstilledes en aprotininhomolog, der mangler de første to N-terminale aminosyrerester (Arg-Pro).
Endvidere kan der for at undgå eller minimere eventu-25 el Kex2 spaltning af aprotinin ved Lys(41)-Arg(42) fremstilles en aprotininhomolog, i hvilken den ene eller begge aminosyre-resterne Lys(41) og Arg(42) er erstattet med en ikke-basisk aminosyrerest. En foretrukket aprotininhomolog af denne type er en sådan, der har Ser i position 42 i stedet for Arg.
30 Det viste sig overraskende, at uanset at det naturlige aprotinin indeholder en N-terminal basisk aminosyrerest og indeholder en dibasisk sekvens, er gær stadig i stand til at udtrykke og secernere et produkt, der er identisk med naturligt aprotinin uden modifikation af aprotiningenet.
35 De foreliggende hidtil ukendte aprotininhomologer har den samme specifikke inhibitoreffekt mod oksetrypsin som naturligt aprotinin og kan som følge deraf anvendes som erstatning for naturligt aprotinin.
DK 171239 B1 7
Den specifikke inhibitoreffekt af forbindelserne blev målt ved at følge inhiberingen af trypsinhydrolyse af benzoyl-arginin-p-nitroanilid (ΒΑΡΝΑ) ved spektrometrisk analyse som beskrevet af Erlanger, B.F., Kokonski, N., og Cohen, W., 5 Arch.Biochem.Biophys. 95» (1961) 271.
DNA-sekvenserne, der koder for de foreliggende aprotininhomologer, er fortrinsvis fremstillet ved oligonu-cleotidsyntese ifølge kendt teknik, fordi dette gør det muligt af udvælge kodoner, som vides at være foretrukne til udtryk-10 kelse i gær.
Følgende syntetiske gener er konstrueret:
AspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArgllelleArg
GATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATCATCAGA
CTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAGTAGTCT
15 TyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGlyGlyCys TACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGC ATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCACCGACG
ArgAlaLysArgAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThrCysGly AGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGT 2 0 TCTCGATTCTCTTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGAACACCA
GlyAla
GGTGCC
CCACGG der koder for aprotinin(3-58) ,
AspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArgllelleArg 25 GATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATCATCAGA CTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAGTAGTCT
TyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGlyGlyCys
TACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGC
ATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCACCGACG
DK 171239 B1 8
ArgAlaLysSerAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThrCysGly
AGAGCTAAGTCCAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGT
TCTCGATTCAGGTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGAACACCA
GlyAla 5 GGTGCC
CCACGG der koder for aprotinin(3-58,42 Ser),
ArgProAspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArglle
AGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATC
TCCGGACTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAG
10 IleArgTyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGly ATCAGATACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGT TAGTCTATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCA
GlyCysArgAlaLysArgAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThr GGCTGCAGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACT 15 CCGACGTCTCGATTCTCTTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGA
CysGlyGlyAla
TGTGGTGGTGCC
ACACCACCACGG der koder for aprotinin(l-58), og
ArgProAspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArglle 2 0 AGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATC TCCGGACTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAG
IleArgTyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGly
ATCAGATACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGT
TAGTCTATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCA
25 GlyCysArgAlaLysSerAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThr GGCTGCAGAGCTAAGTCCAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACT CCGACGTCTCGATTCAGGTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGA
DK 171239 B1 9
CysGlyGlyAla
TGTGGTGGTGCC
ACACCACCACGG der koder for aprotinin(l-58,42 Ser).
Eksempel 1 5 Fremstilling af aprotinin(3-58)
Det syntetiske gen for aprotinin(3-58) blev konstrueret ud fra et antal oligonucleotider ved ligering.
Oligonucleotiderne blev syntetiseret på en automatisk DNA syntesemaskine under anvendelse af phosphoramiditkemi på 10 en bærer af glas med veldefineret porestørrelse (Beaucage, S.L. og Caruthers, M.H., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859- 1869).
Følgende 10 oligonucleotider blev syntetiseret:
I: AAAGAGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCC
15 37-mer
II: TTACATGGACCAGTGTATGGAGGTTCCAAACAGAAACT
38- mer
III: ATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACG
35-mer
20 IV: CTTGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATTCTAGCT
34-mer
V: CCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCT
39- mer
VI: CTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC
25 40-mer
VII: GCAGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGT
DK 171239 B1 10 27-mer
VIII: AGCAGACTTGAAGTTGTTTCTCTTAG
26-mer
IX: CTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAAT
5 39-mer
X: CTAGATTAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTC
38-mer 5 duplexer A - E blev dannet ud fra ovenstående 10 oligonucleotider som vist i fig. 1.
10 20 pmol af hver duplex A - E blev dannet ud fra de tilsvarende par af 51-phosphorylerede oligonucleotider I - X ved opvarmning i 5 minutter til 90*C efterfulgt af nedkøling til stuetemperatur over en periode på 75 minutter. De fem duplexer blev blandet og behandlet med T4 ligase. Det synte-15 tiske gen blev isoleret som et 176 bp bånd efter elektroforese af ligationsblandingen på en 2% agarosegel. Det fremkomne syntetiske gen er vist i fig. 1.
Det syntetiske gen blev ligeret til et 330 bp EcoRI-Hgal fragment fra plasmid pKFN9, der koder for MFal signal og 20 leadersekvens (1-85) og til det store EcoRI-Xbal fragment fra pUC19. Konstruktionen af pKFN9, der indeholder et Hgal site umiddelbart efter MFal leadersekvensen, er beskrevet i EP patentansøgning nr. 0214826.
Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere 25 en kompetent E. coli stamme (r”, m+), idet der blev selekteret for ampicillinresistens. Sekvensbestemmelse af et 32P-XbaI-EcoRI fragment (Maxam, A. og Gilbert, W., Methods Enzymol. 65 (1980) 499-560) viste, at plasmider fra de fremkomne kolonier indeholdt den korrekte DNA-sekvens for aprotinin(3-58).
30 Et plasmid pKFN305 blev udvalgt til videre anvendel se. Konstruktion af plasmid pKFN305 er vist i fig. 2.
DK 171239 B1 11 pKFN305 blev skåret med EcoRI og Xbal og 0,5 kb fragmentet blev ligeret til 9,5 kb Ncol-Xbal fragmentet fra pMT636 og 1,4 kb NcoI-EcoRI fragmentet fra pMT636, hvilket resulterede i plasmid pKFN374, se fig. 2. Plasmid pMT636 blev 5 fremstillet ud fra pMT608 efter deletion af LEU-2 genet og ud fra pMT479, se fig. 3. pMT608 er beskrevet i EP patentansøgning nr. 195691. pMT479 er beskrevet i EP patentansøgning nr. 163529. pMT479 indeholder Schizo. pombe TPI genet (POT), S. cerevisiae triosephosphate isomerasepromoteren og -termina-10 toren, TPIp og TPIT (Alber, T. og Kawasaki, G. J.Mol.Appl.Gen.
1 (1982) 419-434). Plasmid pKFN374 indeholder følgende sekvens:
TPIp-MFal-signal-leader(1-85)-aprotinin(3-58)-TPIT
hvor MFal er den parringsfaktor al kodende sekvens fra S.
15 cerevisiae (Kurjan, J. og Herskowitz, I., Cell 20, (1982) 933-943), signal-leader(1-85) betyder, at sekvensen indeholder de første 85 aminosyrerester fra MFal signal-leadersekvensen og aprotinin(3-58) er den syntetiske sekvens, der koder for et aprotininderivat, som mangler de første to aminosyrerester.
20 S. cerevisiae stamme MT663 (E2-7B XE11-36 a/α, åtpi
Atpi, pep 4-3/pep 4-3) blev dyrket på YPGaL (1% Bacto gærekstrakt, 2% Bacto pepton, 2% galactose, 1% lactat) til en optisk densitet ved 600 nm på 0,6.
100 ml kulturmedium blev høstet ved centrifugering, 25 vasket med 10 ml vand, centrifugeret igen og atter suspenderet i 10 ml opløsning indeholdende 1,2 M sorbitol, 25 mM Na2EDTA pH = 8,0, og 6,7 mg/ml dithiotreitol. Opløsningen blev inkuberet ved 30*C i 15 minutter, centrifugeret, og cellerne blev resuspenderet i 10 ml af en opløsning indeholdende 30 1,2 M sorbitol, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M natriumcitrat, pH = 5,8 og 2 mg Novozym*234. Opløsningen blev inkuberet ved 30°C i 30 minutter, cellerne isoleret ved centrifugering, vasket i 10 ml 1,2 M sorbitol og 10 ml CAS (1,2 M sorbitol, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris HC1 (Tris = Tris(hydroxymethyl)aminomethan) pH = 7,5) 35 og resuspenderet i 2 ml CAS. Til transformering blev 0,1 ml CAS-resuspenderede celler blandet med ca. 1 Mg plasmid pKFN374 DK 171239 B1 12 og henstillet ved stuetemperatur i 15 minutter. 1 ml (20% po-lyethylenglycol 4000, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris HC1, pH = 7,5) blev tilsat, og blandingen henstod yderligere 30 minutter ved stuetemperatur. Blandingen blev centrifugeret, og pillen 5 resuspenderet i 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitol, 33% v/v YPD, 6,7 mM CaCl2, 14 Mg/ml leucin) og inkuberet ved 30’C i to timer.
Oplosningen blev derpå centrifugeret, og pillen blev resuspenderet i 0,5 ml 1,2 M sorbitol. Derpå blev 6 ml topagar (SC medium ifølge Sherman et al., (Methods in Yeast Genetics, Cold 10 Spring Harbor Laboratory, 1981) indeholdende 1,2 M sorbitol plus 2,5% agar) tilsat ved 52'C og opløsningen hældt på plader indeholdende det samme sorbitolholdige medium, der var gjort stift med agar. Transformante kolonier blev opsamlet efter tre dage ved 30°C, genisoleret og anvendt til at starte flydende 15 kulturer med. En sådan transformant KFN322 blev valgt til yderligere karakterisering.
Gærstamme KFN322 blev dyrket på YPD medium (1% gærekstrakt, 2% pepton (fra Difco Laboratories) og 2% glucose). En 10 ml kultur af stammen blev rystet ved 30°C til 20 en optisk densitet ved 600 nm på 32. Efter centrifugering blev supernatanten analyseret ved FPLC ionbytterkromatografi. Gær-supernatanten blev filtreret gennem en 0,22 μια Millex*GV filterenhed, og 1 ml blev sat på en MonoS kationbyttersøjle (0,5 x 5 cm), der var ækvilibreret med 20 mM Bicin, pH 8,7. Efter 25 vask med ækvilibreringspuffer blev søjlen elueret med en lineær NaCl gradient (0-1 M) i ækvilibreringspuffer. Trypsin-inhibitoraktivitet blev bestemt kvantitativt i de eluerede fraktioner ved spektrofotometrisk bestemmelse og yderligere ved integration af absorption ved 280 nm fra 30 Ejg^aprotinin) =8,3
Udbyttet af aprotinin(3-58) var ca. 3 mg/liter.
Med henblik på aminosyreanalyse og N-terminal 35 sekvensbestemmelse blev gærsupernatanten (7 ml) indstillet til pH 8,7 med 0,1 M NaOH og filtreret (0,22 μια) . Effluenten fra en Q-Sepharose anionbyttersøjle (1x4 cm) ækvilibreret med 20 DK 171239 B1 13 itiM Bicin, pH 8,7, blev sat på en MonoS kationbyttersøjle (0,5 x 5 cm). Kationbytterkromatograferingen blev udført som beskrevet ovenfor. Opkoncentrering af det gradienteluerede aprotinin(3-58) blev udført ved gentagen kromatografering på 5 MonoS og eluering med en stejl NaCl-gradient. De opsamlede fraktioner blev yderligere koncentreret ved vakuumcentrifugering til ca. 100 μΐ og sat på en RP-HPLC søjle (Vydac C4, 4,6 x 250 mm). Eluering blev udført med CH3CN gradient i 0,1% TFA.
De opsamlede fraktioner blev koncentreret til ca. 100 μΐ ved 10 vakuumcentrifugering, og prøver blev udtaget med henblik på N-terminal sekvensbestemmelse og aminosyreanalyse.
Ved N-terminal sekvensbestemmelse fandtes følgende sekvens:
Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-Ala-Arg-15 Ile-Ile-Arg hvilket bekræftede, at den N-terminale ende er korrekt.
Aminosyreanalysen er vist i den følgende tabel 1. Af denne tabel fremgår, at produktet har den forventede amino-syresammensætning, d.v.s. mindre Arg og Pro. Det let formind-20 skede indhold af Ile kan højst sandsynligt tilskrives ufuldstændig hydrolyse af Ile(18)-Ile(19) (dette er et velkendt fænomen i sådanne tilfælde) . Pro og Arg er lidt højere end forventet. Dette ses imidlertid også hos aprotinin (tabel 1, anden spalte).
25 Ved sammenligning ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde ifølge Erlanger et al., fandtes den specifikke aktivitet hos aprotinin(3-58) at være identisk inden for den eksperimentelle usikkerhed med naturligt aprotinins specifikke aktivitet.
DK 171239 B1 14
Eksempel 2
Fremstilling af aprotinin(3-58.42 Ser)
Et syntetisk gen for aprotinin(3-58, 42 Ser) blev konstrueret som beskrevet i eksempel 1. Med det formål at 5 erstatte Arg(42) med Ser blev følgende oligonucleotider Vila og villa anvendt i stedet for VII og VIII:
Vila: GCAGAGCTAAGTCCAACAACTTCAAGT
27-mer
Villa: AGCAGACTTGAAGTTGTTGGACTTAG
10 26-mer
Det fremkomne syntetiske gen er vist i fig. 4. Dette gen bundet til MFal signal-leader(1-85) sekvensen blev klonet ind i et pUC19-afledt plasmid pKFN306 (se fig. 2).
Ved at følge fremgangsmåden beskrevet i eksempel 1 15 fremkom et plasmid pKFN375 indeholdende følgende konstruktion
TPIp-MFal-signal-leader(1-85)-aprotinin(3-58,42 Ser)-TPIT
hvor aprotinin(3-58,42 Ser) er det syntetiske gen, der koder for et aprotininderivat, der mangler de første to aminosyre-rester og indeholder Ser i stedet for Arg i position 42.
20 Gærstammen MT663 blev transformeret med plasmid pKFN375 som beskrevet ovenfor, og dyrkning af den transformerede stamme KFN324 gav ca. 12 mg/liter af aprotinin (3-58, 42 Ser).
N-terminal sekvensbestemmelse udført som ovenfor 25 beskrevet bekræftede den følgende N-terminale sekvens
Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-Ala-Arg-
Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe d.v.s. den korrekte sekvens.
DK 171239 B1 15
Aminosyreanalysen er vist i tabel 1 og bekræfter den forventede aminosyresammensætning, d.v.s. mindre Pro og Arg og mere Ser (se også ovenstående bemærkninger i eksempel 1).
Ved sammenligning ved ovenfor nævnte fremgangsmåde 5 ifølge Erlanger et al. fandtes den specifikke aktivitet hos aprotinin(3-58,42 Ser) at være identisk inden for den eksperimentelle usikkerhed med naturligt aprotinins specifikke aktivitet.
Eksempel 3 10 Fremstilling af aprotinin(1-58Ϊ
Den syntetiske duplex vist i fig. 5 blev ligeret til 330 bp EcoRI-Hgal fragmentet fra plasmid pKFN9, der koder for MFal signal- og leadersekvens, og til 144 bp Avall-Xbal fragmentet fra pKFN305 og til det store EcoRI-Xbal fragment fra 15 pUC19.
Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere en egnet E. coli stamme (r“ m+), der selekterer for ampi-cillinresistens. Sekvensbestemmelse af et 32P-mærket Xbal-EcoRI fragment viste, at plasmider fra de resulterende 20 kolonier indeholdt den korrekte DNA sekvens for aprotinin(1-58) .
Et plasmid pKFN414 blev selekteret til yderligere anvendelse. Konstruktionen af plasmid pKFN414 er vist i fig.
5.
25 Ved at følge fremgangsmåden ifølge eksempel 1 fremkom et gærplasmid pKFN418 indeholdende følgende konstruktion: TPIp-MFal-signal-leader (1-85) -aprotinin (1-58) -TPIrp Gærstammen MT633 blev transformeret med plasmid pKFN418 som beskrevet ovenfor. Dyrkning af den transformerede 30 stamme KFN385 gav ca. 1-13 mg/1 af aprotinin(1-58).
Ved sammenligning ved den ovennævnte fremgangsmåde ifølge Erlanger et al. fandtes den specifikke aktivitet af aprotinin(1-58) fremstillet ifølge dette eksempel at være identisk inden for den eksperimentelle usikkerhed med natur ligt aprotinins specifikke aktivitet.
16 DK 171239 B1
Eksempel 4
Fremstilling af aprotininf1-58.42 Seri 5 Et plasmid pKFN416 indeholdende et gen for aprotinin(l-58,42 Ser) blev konstrueret fra pKFN306 som beskrevet i eksempel 3. Ved at følge fremgangsmåden fra eksempel 1 fremkom et gaerplasmid pKFN420 indeholdende følgende konstruktion:
10 TPIp-MFal-signal-leader(1-85)-aprotinin(1-58,42 Ser)-TPIT
Gærstamme MT663 blev transformeret med plasmid pKFN420 som beskrevet ovenfor. Dyrkning af den transformerede stamme KFN387 gav ca. 1-13 mg/1 af aprotinin(l-58,42 Ser).
Ved sammenligning ved den ovenfor nævnte fremgangs-15 måde ifølge Erlanger et al. fandtes den specifikke aktivitet af aprotinin(l-58,42 Ser) at være identisk inden for den eksperimentelle usikkerhed med naturligt aprotinins specifikke aktivitet.
DK 171239 B1 17
Tabel 1
Aminosyre Aprotinin Aprotinin Aprotinin Aprotinin (teore- (3-58) (3-58,42 Ser) _tisk)_(fundet) (fundet) (fundet)_ 5 Asx 5 5,00 4,96 5,02
Thr 3 2,86 2,83 2,85
Ser 1 0,94 0,97 1,78
Glx 3 3,04 3,01 3,02
Pro 4 4,18 3,15 3,19 10 Gly 6 5,95 6,00 5,99
Ala 6 5,85 5,93 6,01
Cys 6 5,20 5,03 5,41
Val 1 0,99 0,98 0,98
Met 1 0,83 0,85 0,96 15 Ile 2 1,39 1,41 1,50
Leu 2 1,97 1,98 2,03
Tyr 4 3,84 3,80 3,82
Phe 4 3,98 3,92 3,96
Lys 4 3,92 4,02 3,93 20 Arg_6_6.39_5.20_4,28_
Total_58_56.33_54.04_54.73_
Claims (8)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af aprotinin eller homologer deraf, kendetegnet ved, at en gærstamme indeholdende en replicerbar ekspressionsvektor dyrkes i 5 et egnet næringsmedium og det udtrykte aprotinin eller den udtrykte aprotininhomolog udvindes, idet vektoren omfatter en DNA-sekvens, der koder for aprotinin eller en aprotininhomolog bundet til en DNA-sekvens, der koder for en signalpeptid- sekvens og en leaderpeptidsekvens, som tilvejebringer secerne- 10 ring af aprotininet eller aprotininhomologen.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen koder for aprotinin(3-58).
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen koder for aprotinin(3-58,42
15 Ser).
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen koder for aprotinin(1-58).
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen koder for aprotinin(1-58,42
20 Ser).
6. Vektor, der er i stand til at replicere i gær, kendetegnet ved, at den omfatter en DNA-sekvens, der koder for aprotinin eller en aprotininhomolog bundet til en DNA-sekvens, der koder for en signalpeptidsekvens og en 25 leaderpeptidsekvens, som tilvejebringer secernering af aprotininet eller aprotininhomologen.
7. Vektor ifølge krav 6, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen koder for aprotinin(3-58) og har følgende sekvens
30 AspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArgllelleArg 19 DK 171239 Bl GATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATCATCAGA CTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAGTAGTCT TyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGlyGlyCys TACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGC 5 ATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCACCGACG ArgAlaLysArgAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThrCysGly AGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGT TCTCGATTCTCTTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGAACACCA GlyAla 10 GGTGCC CCACGG; eller koder for aprotinin(3-58,42 Ser) og har følgende sekvens AspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArgllelleArg GATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATCATCAGA 15 CTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAGTAGTCT TyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGlyGlyCys TACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGC ATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCACCGACG ArgAlaLysSerAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThrCysGly 2 0 AGAGCTAAGTCCAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGT TCTCGATTCAGGTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGAACACCA GlyAla GGTGCC CCACGG; 25 eller koder for aprotinin(l-58) og har følgende sekvens ArgProAspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArglle AGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATC TCCGGACTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAG DK 171239 B1 20 IleArgTyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGly ATCAGATACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGT TAGTCTATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCA G1yCysArgAlaLysArgAsnAsnPheLysSerAlaG1uAspCysMetArgThr 5 GGCTGCAGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACT CCGACGTCTCGATTCTCTTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGA CysGlyGlyAla TGTGGTGGTGCC ACACCACCACGG; 10 eller koder for aprotinin(l-58,42 Ser) og har følgende sekvens ArgProAspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArglle AGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATC TCCGGACTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAG IleArgTyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGly 15 ATCAGATACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGT TAGTCTATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCA GlyCysArgAlaLysSerAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThr GGCTGCAGAGCTAAGTCCAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACT CCGACGTCTCGATTCAGGTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGA
20 CysGlyGlyAla TGTGGTGGTGCC ACACCACCACGG eller hermed funktionelt ækvivalente sekvenser.
8. Gærstamme, kendetegnet ved, at den 25 er transformeret med en vektor ifølge krav 7.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK051990A DK171239B1 (da) | 1987-08-28 | 1990-02-28 | Fremgangsmåde til fremstilling af aprotinin eller homologer deraf, vektor der er i stand til at replicere i gær samt gærstamme |
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK450187A DK450187D0 (da) | 1987-08-28 | 1987-08-28 | Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner |
DK450187 | 1987-08-28 | ||
DK8800138 | 1988-08-26 | ||
PCT/DK1988/000138 WO1989001968A1 (en) | 1987-08-28 | 1988-08-26 | Aprotinin homologues and process for the production of aprotinin and aprotinin homologues in yeast |
DK51990 | 1990-02-28 | ||
DK051990A DK171239B1 (da) | 1987-08-28 | 1990-02-28 | Fremgangsmåde til fremstilling af aprotinin eller homologer deraf, vektor der er i stand til at replicere i gær samt gærstamme |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK51990D0 DK51990D0 (da) | 1990-02-28 |
DK51990A DK51990A (da) | 1990-04-27 |
DK171239B1 true DK171239B1 (da) | 1996-08-05 |
Family
ID=26064145
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK051990A DK171239B1 (da) | 1987-08-28 | 1990-02-28 | Fremgangsmåde til fremstilling af aprotinin eller homologer deraf, vektor der er i stand til at replicere i gær samt gærstamme |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DK (1) | DK171239B1 (da) |
-
1990
- 1990-02-28 DK DK051990A patent/DK171239B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK51990A (da) | 1990-04-27 |
DK51990D0 (da) | 1990-02-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5514585A (en) | Yeast processing system | |
EP0339942B1 (en) | Aprotinin analogues and process for the production thereof | |
IE66387B1 (en) | Insulin precursors process for their preparation and process for preparing human insulin from such insulin precursors | |
NO177009B (no) | Analogifremgangsmåte ved fremstilling av insulinanaloger | |
EP0375718B1 (en) | Process for the production of aprotinin and aprotinin homologues in yeast | |
DK171239B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af aprotinin eller homologer deraf, vektor der er i stand til at replicere i gær samt gærstamme | |
US5972698A (en) | Tryptase inhibitor | |
US5741674A (en) | Recombinant production of proteins in yeast | |
NO178870B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av modifisert Eglin B eller C samt DNA, ekspresjonsvektor og vertsmikroorganisme | |
AU701136B2 (en) | Novel inhibitor | |
DK171417B1 (da) | Aprotininalaloger med Ala eller Gly i position 17 og fremgangsmåde til fremstilling deraf | |
IE950351L (en) | Insulin percursors | |
DK164874B (da) | Syntetiske gaer-leader-peptider, dna-sekvens, der indkoder saadanne leader-peptider, vektorer og transformerede gaerstammer samt en fremgangsmaade til fremstilling af proteiner i gaer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
B1 | Patent granted (law 1993) | ||
PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |