NO151012B - Substratpreparat og anvendelse derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et pulverformig substratpreparat for omsetning med enzym, hvilket preparat foruten eventuelle tilsetninger slik som tensid, består av vannuoppløselig, hydrofobt substrat adsorbert på en partikkelformig bærer. Oppfinnelsen angår også anvendelse av et slikt substratpreparat i en enzymatisk tid-temperaturindikatoranordning.

Definisjonsmessig menes med et substrat et stoff på

hvilket et enzym eller ferment virker.

Enzymatiske reaksjoner, dvs. reaksjon mellom substrat

og enzym, utnyttes innen vidt forskjellige områder innen tek-nikken. Vanligvis foreligger såvel substrat som enzym i form av en vannoppløsning. I løpet av de senere år har store anstrengelser vært gjort for å forbedre enzymsiden. Som et ledd derved har man bundet enzymet til en bærer og derved øket en-zymets stabilitet, håndterbarhet og gjenanvendelse. Forholds-vis små anstrengelser er imidlertid blitt gjort på utformingen på substratsiden, tiltross for at betydelige problemer foreligger når substratet f.eks. har form av et vannuoppløselig stoff, slik som en vannublandbar væske. Slike utnyttes for bestemmelse av lipaser, blant annet olivenolje eller forskjellige syntetiske triglycerider i form av vannublandbare, oljeaktige væsker. For å utføre lipaseanalysen er det praksis å emulge-

re det oljeaktige substrat i vann ved hjelp av overflateakti-

ve stoffer og andre emulsjonsstabilisatorer. For at analysen skal bli reproduserbar skjer emulgeringen av substratet under standardiserte betingelser. Til tross for dette er anvendel-

se av emulsjoner forbundet med betydelige ulemper. Således er det nesten umulig å oppnå enhetlig dråpestørrelse på emulsjonen, hvilket resulterer i udefinert overflate på substra-

tet med påfølgende dårlig reproduserbarhet for den enzymati-

ske reaksjon. Videre er emulsjonene ikke lagringsbare i len-

ger tid, men er ustabile, særlig ved innvirkning av lave temperaturer. På grunn av disse ulemper har det derfor vært vanskelig å studere enzymatisk aktivitet med en akseptabel grad av nøyaktighet og reproduserbarhet, f.eks. ved enzymana-lyse. Et annet spesifikt område hvor disse ulemper gjør seg gjeldende er enzymatiske tid-temperaturindikatoranordninger som er beregnet på å kontrollere håndteringen av følsomme va-

rerf slik som fryste og kjølede næringsmidler, vaksiner, blodprodukter, legemidler, fotografisk film osv. Den prinsip-pielle oppbygning.av slike tidTtemperaturindikatoranordninger fremgår av US patentskrift 2.671.028. Vanskeligheten i denne sammenheng er blant annet at indikatoranordningen utsettes for temperaturer under frysepunktet, hvorved anvendelse av væskeformig substrat i form av emulsjon er utelukket, eftersom emulsjonen brytes på grunn av den lave temperatur.

For å råde bot på de ovenfor angitte ulemper har det vært foreslått i det amerikanske patentskrift 4.043.871 å bringe såvel flytende som faste vannuoppløselige substrater i fast pulverform ved kombinasjon med en partikkelformig bærer. Be-tegnende for bæreren er at den har et høyt spesifikt overflateareal på mer enn 50 m 2/g og spesielt angitte, foretrukne bærermaterialer er uorganiske bærere av silikattype, slik som kiseldioxydaerogel med et overflateareal på over 200 m 2/g. Substratet er adsorbert på bæreren, og ved kombinasjonen av substrat og bærer med høyt overflateareal oppnåes øket enzymatisk aktivitet og reproduserbarhet sammenlignet med tidligere anvendte substratemulsjoner, samtidig som de ovenfor angitte ulemper med substratemulsjoner, slik som ustabilitet, vesentlig reduseres.

Imidlertid har det nu ifølge oppfinnelsen vist seg at ytterligere vesentlige fordeler kan oppnåes hvis man i stedet for den foretrukne uorganiske bærer av silikattype ifølge det amerikanske patentskrift utnytter en organisk polymer, og nærmere bestemt polyvinylklorid, som bærer. Således oppnår man herved substratmetning, dvs. maksimal og konstant enzymaktivitet ved omsetning med enzym, allerede ved en meget lav substratkonsentrasjon, som er betydelig lavere enn hva som kan oppnåes ifølge den kjente teknikk. Dette innebærer et stort og overraskende fremskritt som innsees av enhver fagmann på området.

Ifølge oppfinnelsen hvis nærmere kjennetegn fremgår av patentkravene, tilveiebringes således et pulverformig substratpreparat for omsetning med enzym, hvilket preparat foruten eventuelle tilsetninger slik som tensid, består av vannuopp-løselig, hydrofobt substrat adsorbert på en partikkelformig bærer, og substratpreparatet kjennetegnes ved at bæreren ut-gjøres av mykningsmiddelfritt polyvinylklorid med en midlere kornstørrelse på høyst 0,5 mm, og at substratet utgjør 1 -

30 vekt% av preparatet.

Fortrinnsvis innbefatter sammensetningen også 0,1 - 3, og helst 1-2 vekt% tensid.

Andre valgfrie tilsetningsmidler som kan anvendes, eksempelvis for å utspe substratfasen eller modifisere dens smeltepunkt, er forbindelser som (a) har en oppløselighet på mindre enn 0,1 vekt% i vann ved 20°C, (b) er blandbare med den organ-iske substratfase, (c) har et lavere smeltepunkt enn substratet, (d) har et kokepunkt som er minst like høyt som substratets, og (e) ikke virker som inhibitor mot substratets enzym.

Bæreren har en midlere kornstørrel-

se på opp til 0.5 mm, på grunn av at bærerkorn med en stør-relse over 0,5 mm er vanskelig å suspendere stabilt. Noen kritisk nedre grense for bærerkornenes størrelse foreligger ikke, men som en praktisk nedre grense kan settes ca. 0,5 yum, eftersom mindre korn er vanskelig å fremstille.

Videre skal bæreren ha en glasstemperatur (Tg) på mer enn ca. 80°C for at bæreren ved anvendelse alltid skal bibe-holde sin adskilte partikkelform, og ikke mykne og smelte sam-men med substratet.

Et ytterligere krav er at bæreren skal være inert mot det enzymatiske system, dvs. den skal ikke utøve noen negativ påvirkning på hverken substrat, enzym eller det produkt som dannes ved den enzymatiske reaksjon. Bæreren skal også være inert overfor de oppløsningsmidler som anvendes ved belegning av substrat på bæreren, og ikke myknes opp eller oppløse seg deri.

Endelig skal bæreren ha en viss porøsitet for å kunne suge opp og holde tilbake substratet. Bærerens porøsitet er en funksjon av dens overflate. Noen skarpe grenser for bærerens porøsitet er vanskelig å stille, men generelt kan sies at en porøsitet tilsvarende en overflate på mindre enn ca. 25 m 2/g foretrekkes, og at en porøsitet tilsvarende ca. 5 - 10 m 2/g er mest foretrukket .

De ovenfor angitte generelle kriterier oppfylles på en utmerket måte av polyvinylklorid (PVC).,

En særlig foretrukken PVC-bærer utgjøres av PVC som er

frems tLlt ved emulsjonspolymerisasjon og som her benevnes PVC av emulsjonstype eller emulsjons^PVC. Slik PVC har en midlere kornstørrelse innen det angitte område, fra 0,5 nm til 0,5 mm, men kornene utgjøres av agglomerat av mindre primærpartikler med en midlere partikkelstørrelse på ca. 0,1 - 1 , vanligvis ca. 0,2 - 0,6 ^m.

Selvom PVC av emulsjonstype særlig foretrekkes,

utelukkes ikke andre typer PVC, slik som PVC som er fremstilt ved massepolymerisasjon eller suspensjonspolyme-risas jon. Generelt er alle typer PVC anvendbare. PVC-bærermaterialet bør videre

være så rent som mulig, dvs. fritt for mykningsmiddel og andre konvensjonelle tilsetningsmidler, for å unngå innvirkning på det enzymatiske system. Ofte innbefatter PVC et visst mindre tensidinnhold på ca. 1 - 2 vekt% som stammer fra fremstilling av PVC. For å unngå eventuell forstyrrende innvirkning av slikt tensid vaskes bærermaterialet i de tilfeller det innbefatter tensid, for å fjerne tensidet innen bærermaterialet anvendes.

Som ovenfor angitt er substratpreparatet begren-

set til væskeformige og faste substrater som er hydrofobe og uoppløselige i vann. Med "uoppløselig i vann" menes at substratet har en oppløselighet på mindre enn 0,1 vekt% i vann ved 2 5°C. Grunnen til dette er at vannoppløselige substrater frigjøres fra bæreren i vannmedium, mens hydrofile ikke vann-oppløselige substrater bindes dårlig til PVC-bæreren.

Substrater som særlig foretrekkes, er ikke-vannoppløselige estre.

Blant slike estre foretrekkes særlig triglycerider, hvilke,avhengig av carbonkjedens lengde og metningsgrad i den inngående fettsyredel, er væsker eller faste stoffer. For at vilkåret at substratet skal være uoppløselig i vann skal være oppfyllt, skal herved fettsyredelen for mettede fettsyrer ha minst 4 carbonatomer, hvilket, tilsvarer en vannoppløselighet på mindre enn 0,01 vekt%. Således kan ikke triacetin-og

tripropionin-substratar anvendes, mens derimot tri-

butyrin fungerer bra,. Et foretrukket substrat av triglyceridtype er tricaproin (glyceryltricapronat), som gjennomgår enzymatisk reaksjon med lipaseenzymer. Blant øvrige foretrukne substrater av triglyceridtype kan nevnes: tributyrin, tricaprylin, triolein og olivenolje.

Blant de andre foretrukne substrat av estertype må fremheves diglycerider, slik som 1,3-dicaproin og 1,3-diole-in; monoglycerider, slik som 1-monoolein eller 1-monostea-rin; sorbitanestre, slik som sorbitanmonooleat og sorbitan-monostearat; cholesterolestre, slik som cholesterolacetat og cholesterolhexanoat; methyl-, ethyl- og propylestre av ethylentetracarboxylsyre, adipinsyre og 2,4-dioxovalerian-syre.

Blant ikke vannoppløselige substrater som ikke tilhører gruppen estre, kan nevnes steroider, slik som cholesterol, cortisol og prednisilon.

I forhold til tidligere anvendte substratbærere, og fremfor alt de ovennevnte silicatbærere, oppviser PVC-bæreren flere vesentlige fordeler som skal

belyses nærmere i det efterfølgende.

PVC-bæreren er nøytral, dvs. den

påvirker ikke pH-verdien, og synes ikke å ha noen innvirkning på den enzymatiske reaksjon eller det dannede reaksjonsprodukt. Videre er PVC-bæreren hydrofob, hvilket er en stor fordel ved hydrofobe substrater av f.eks. triglyceridtype, eftersom substratet lett adsorberes på bæreren og forblir fast forankret til denne. Den hydrofobe interaksjon mellom bæreren og substratet sikrer en fast forankring av substratet til bæreren. Denne gode forankring medfører at substratpreparatet er meget stabilt, såvel i tørr tilstand ved lagring som i vannmedium, og noen spontan frigjørelse av substrat fra bæreren skjer ikke. En meget stor fordel med substratpre-paratet med PVC-bærer ifølge oppfinnelsen er at substratet, tiltross for sin faste forankring på bæreren, er meget lett tilgjengelig for enzymatisk reaksjon. Hvis forsøk utføres med konstant enzymkonsentrasjon, men med økende substratkonsentrasjon, finner man at konstant, maksimal reaksjonshastig-

het oppnåes allerede ved meget lav substratkonsentrasjon. Dette kan forklares slik at de på bærer belagte substrater til-byr enzymmolekylene en meget større tilgjengelig substratover-flate enn tilsvarende mengde substrat uten bærer, f.eks. i form av emulsjon. For hydrofobe, ikke vannoppløselig substrater er det nemlig det substrat som er tilgjengelig for enzymet ved grenseoverflaten (mellom vannfase og substratfase) som utgjør den "virkelige" substratkonsentrasjon (se H. Brockerhoff og R.G. Jensen, Lipolytic Enzymes, Academic Press, New York . (1974)).

Selv ved sammenligning med substratpreparatet iføl-

ge det tidligere diskuterte US patentskrift 4.043.871 oppnår

preparatet ifølge oppfinnelsen substratmétning ved vesentlig lavere substratinnhold. Dette må ansees som uventet og overraskende med hensyn til den ovenfor antydede forbindelse mellom substratmétning og tilgjengelig substratoverfla-te, da bæreren ifølge det amerikanske patentskrift har et overflateareal på minst 50 m 2 /g og vanligvis minst 200 m 2/g, mens bæreren ifølge foreliggende oppfinnelse har en overflate som fortrinnsvis er under 25 m 2/g, og som normalt er bare 5 - 10 m 2/g. Det er altså tydelig at stort overflateareal hos

bæreren ikke umiddelbart medfører stor tilgjengelig substrat-overf late .

En følge av at maksimal reaksjonshastighet oppnåes allerede ved meget lave substratkonsentrasjoner er at det ikke er nødvendig å utnytte høye substratinnhold i substratpreparatet ifølge oppfinnelsen, hvilket er fordelaktig da substratet utgjør den kostbare komponent mens PVC-bæreren er billig. Generelt utgjør substratinnholdet i substratpreparatet ifølge oppfinnelsen 1-30 vekt% av preparatet. 1 vekt% substrat utgjør herved en praktisk nedre grense, da lavere innhold gir en altfor lav enzymatisk reaksjonshastighet. Den øvre grense på 30 vekt% bestemmes, foruten av kostnadsmessige og andre praktiske overveielser, også av at substratinnhold over 30 vekt% ikke gir et helt tørt produkt.

Et vesentlig tørt, frittstrømmende pulver er viktig for

å lette maling og størrelseseparering av partiklene og for å muliggjøre vesentlig enhetlig fordeling av pulveret i det væ-skesystem hvori pulveret anvendes.

Et foretrukket innholdområde for substratet er 5 - 25 vekt%, beregnet på den totale sammensetning av preparatet.

I det etterfølgende beskrives forskjellige metoder for fremstilling av substratpreparatet ifølge oppfinnelsen.

Nærmere bestemt skjer fremstillingen ved at substratet tilsettes til et oppløsningsmiddel, eller en oppløsningsmid-delblanding som har god oppløsende evne for substratet, men som ikke oppløser bæreren. Egnede oppløsningsmidler av denne type kan lett velges av fagmannen på området, og som eksempler kan nevnes lavere alkoholer slik som methanol og ethanol. Til oppløsningen tilsettes fortrinnsvis også 0,1 - 3 vekt% tensid beregnet på den endelige sammensetning av preparatet, for å forbedre substratpreparatets dispergerbarhet i vannmedium. Derefter tilsettes ønsket mengde av den pulverformige PVC-bærer, og blandingen inndampes, fortrinnsvis ved redusert trykk og rimelig forhøyet temperatur under omrøring, f.eks. i en rotasjonsinndamper. Når alt oppløsningsmiddel er avdrevet, taes det ferdige produkt ut og males og siktes efter behov til et pulver med ønsket kornstørrelse.

En annen fremstillingsmetode er å helle bærerpulveret i et tørrblandingsapparat med høyhastighetsomrører og under om-røring å tilsette en fin stråle flytende substrat. Ved den kraftige omrøring i blanderen fordeles derved substratet på bærerkornene, og et substratpreparat med enhetlig belegning av bærerkornene erholdes.

Det skal fremholdes at selvom de ovenfor angitte frem-stillingsmåter er de fortiden foretrukne, er det selvsagt mulig å fremstille substratpreparatet ifølge oppfinnelsen efter andre metoder. Ifølge en alternativ, mindre foretrukken metode tilberedes således en oppløsning av substrat i opp-løsningsmiddel, PVC-bærer tilsettes, og blandingen utporsjone-res suksessivt i en vannmasse, hvorved substratet faller ut som et belegg på bærerkornene.

Substratpreparatet ifølge, foreliggende oppfinnelse er i prinsipp anvendbart for alle formål som innbefatter reaksjon mellom substrat og enzym. Særskilte områder hvor oppfinnelsen med fordel er anvendbar er analyse og standardiser-ing av enzym, ved kvalitativ og kvantitativ bestemmelse av enzym innen området klinisk kjemi, samt som substratkomponent i de tidligere nevnte enzymatiske tid-temperaturindikatoranordninger.

Den store tilgjengelige overflate hos substratpreparatet ifølge oppfinnelsen innebærer optimale betingelser for bestemmelse av små mengder enzym. Ved at PVC-bæreren enn-videre har en definert overflate, gis også substratet en definert overflate med den følge at den enzymatiske reaksjon blir reproduserbar. Disse egenskaper innebærer at man med substratpreparatet ifølge oppfinnelsen såvel kvalitativt som kvantitativt kan bestemme små enzymmengder, hvilket er verdifullt ved diagnostisering innen det medisinske område,

da tilstedeværelse av små enzymmengder eller variasjoner i en enzymkonsentrasjon i eksempelvis blod, ofte utgjør indikasjon på en sykdomstilstand. Ved hjelp av foreliggende oppfinnelse er det således mulig på et tidlig stadium og med pålitelig-het å diagnostisere forskjellige sykdomstilstander.

Et viktig aspekt ved oppfinnelsen er dens anvendelse i enzymatiske tid-temperaturindikatoranordninger. En utførel-sesform av en slik indikatoranordning består av to små lukkede plastampuller som er adskilt av en felles, bristbar skillevegg. I den ene plastampulle finnes en vannholdig oppløsning av enzym, mens den annen plastampulle inneholder substrat suspendert i vannmedium. For å indikere det reaksjonsprodukt som dannes av den enzymatiske reaksjon når indikatoranordningen aktiveres, innbefatter en av plastampullene, fortrinnsvis den som inneholder substratet, en pH-indikator. Når indikatoranordningen aktiveres, dvs. når tid-temperaturindikeringen skal starte, ødelegges den bristbare skillevegg ved at sammenpres-sende "trykk utøves mot den ene plastampulle. Herved kommer plastampullenes innhold til å stå i forbindelse med hverandre slik at innholdet i ampullene blandes og en enzymatisk reaksjon settes igang. Den enzymatiske reaksjon forløper under dannelse av reaksjonsprodukt, slik som caprons.yre hvis substratet er tricaproin og enzymet er en lipa.ser avhengig av tid og temperatur. Den tilstedeværende. pH-i.ndikator er beregnet til ved farveomslag å indikere overskridelse av en viss mengde reaksjonsprodukt, slik som syre. Vanskelighetene med å skape en pålitelig enzymatisk tid-temperaturindikatoranordning er meget store. Man må blant annet kunne, manipulere den enzymatiske reaksjon på en sikker og reproduserbar måte. Disse van-skeligheter økes vesentlig ved at de inngående enzym- og sub-stratmengder må være små med hensyn til indikatoranordningens størrelse og pris. Ved at, som tidligere omtalt, reaksjons-hastigheten ved substratpreparatet ifølge oppfinnelsen allerede ved meget små substratkonsentrasjoner bare er avhengig av enzymkonsentrasjonen og ikke av substratkonsentrasjonen, elimineres ett av de største hindre for å tilveiebringe en tid-temperaturindikatoranordning med tilfredsstillende, reproduserbar funksjon. De øvrige omtalte fordeler med substratpreparatet ifølge oppfinnelsen er selvsagt til nytte også i denne sammenheng.

For å lette forståelsen av oppfinnelsen skal den i det følgende beskrives nærmere ved noen belysende utførelseseksem-pler.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av PVC-bærer belagt med tricaproinsubstrat. 100 g emulsjons-PVC (Pevikon<®>PE 712

partikkelstørrelse: 0,2 % <>> 63 jum) , som ble vasket med ethanol, ble under omrøring helt langsomt ned i en oppløsning bestående av 20 g tricaproin (TC) og 300 ml ethanol som ble forvarmet til 60°C i en 2 liters inndampningskolbe. Efter fullstendig suspendering av polyvinylkloridet ble kolben kob-let til en inndamper("Rotovapor").

Temperaturen ble holdt ved 60°C ved hjelp av et vannbad, og ethanolen ble avdrevet i løpet av 60 minutter under redusert trykk (ca. 20 mm Hg, vannsug). Herved ble der erholdt et tørt og luktfritt pulver bestående av aggregat av forskjellig størrelse. Aggregatene var meget sprøde, og efter maling i en kvern ble der erholdt et pulver med lignende pa,rtikkelstørrelsesfor-deling som utgangsmaterialet, For å fjerne større aggregat ble pulveret siktet gjennom en sikt med maskevidde 70 /-<-m.

EKSEMPEL 2

Eksempel 1 ble gjentatt, men med den forskjell at 2 g tensid ( "Brij 72") ble tilført ethanoloppløsningen for belegningen.

EKSEMPEL 3

Fremstilling av PVC-bærere belagt med tributyrinsub-strat.

Eksempel 1 ble gjentatt, men med den forskjell at tricaproin ble erstattet med 20 g tributyrin (TE).

EKSEMPEL 4

Fremstilling av PVC-bærer belagt med triacetinsubstrat.

Eksempel 1 ble gjentatt, men med den forskjell at tricaproin ble erstattet med 20 g triacetin (TA).

EKSEMPEL 5

Fremstilling av PVC-bærer belagt med tripropioninsub-strat.

Eksempel 1 ble gjentatt, men med den forskjell at tricaproin ble erstattet med 20 g tripropionin (TP),

EKSEMPEL 6

Fremstilling av PVC-bærer belagt med olivenoljesubstrat.

Eksempel 1. ble gjentatt, men med den forskjell at tricaproin ble erstattet med 20 g olivenolje og ethanol erstattet med en blanding bestående av 80 % ethanol og 20 % kloroform.

EKSEMPEL 7

Eksempel 6 ble gjentatt, men med den forskjell at 2 g tensid ("Brij 72") ble tilført ethanol-kloroformoppløsningen før belegningen.

EKSEMPEL 8

Fremstilling av PVC-bærer bela,gt med trioleinsubstrat.

Eksempel 6 ble gjentatt, men med den forskjell at olivenolje ble erstattet med 20 g triolein,

EKSEMPEL 9

Substrategenskapene hos substratpreparatet ifølge eksempler 1-8 ble studert ved hjelp av pankreaslipase i en pH-stat ved 25°C. Den prinsipielle fremgangsmåte finnes beskrevet i Marchis-Mouren et al (1959), Arch Biochem Biophys, vol. 83, sider 301 - 319. Målingene ble utført under nitrogen-atmosfære og kraftig omrøring. 9 ml 0,1 M vannoppløsning av natriumklorid ble tilsatt til et termostatregulert målekar og derefter tilført en innveiet mengde substratpreparat. pH

ble justert til 8,0, og 1 ml enzymoppløsning ble tilført, En-zymoppløsningen hadde følgende sammensetning:

Forbruket av 0,02 M natriumhydroxyd som kreves for å opprettholde pH 8,0 ble registrert automatisk på en skriver.

Enzymaktiviteten målt som /<mol forbrukt natriumhydroxyd/minutt ble beregnet fra det erholdte skriverdiagram. Skriverdiagram-met viste et lineært forbruk av natriumhydroxyd i løpet av den tid som målingen ble utført. En avvikelse fra lineært forbruk ville vist økende alternativt avtagende enzymreaksjon.

Resultatet av målinger med tricaproinpreparatet ifølge, eksempel 2 vises i tabell 1 og fig. 1.

Resultatet av målinger med tributyrinpreparatet ifølge eksempel 3 vises i tabell 2.

Av tabell 1 og 2 fremgår det at maksimal og konstant enzymaktivitet (substratmétning) oppnåes ved tilsetning av en viss, meget liten mengde substratpreparat. En ytterligere økning av substratmengden øket ikke enzymaktiviteten. Den

substratkonsentrasjon ved hvilken substratmétning inntreffer, er avhengig av enzymkonsentrasjonen. Jo høyere enzymkonsentrasjon, desto høyere substratkonsentrasjon kreves for substratmétning .

EKSEMPEL 10

Ved dette eksempel sammenlignes substratpreparatet ifølge eksempel 2 (med PVC-bærer) og fritt emulgert TC (dvs. uten bærer), ifølge den i eksempel 9 angitte metode. Tabell 3 viser de målte enzymaktiviteter for forskjellige konsentra-sjoner TC, fritt henholdsvis belagt på bærere, ved en enzym-konsentras jon på 0,4 yug/ml. Dette forsøk viser en spesiell fordel med substratpreparatet ifølge oppfinnelsen, nemlig at substratmétning erholdes allerede ved meget lav substratkonsentrasjon.

EKSEMPEL 11

Ved dette eksempel sammenlignes substratpreparatet ifølge eksempler 6-8 (med PVG-bærer) og fri emulgert olivenolje (dvs. uten bærer) ved hjelp av den i eksempel i angitte metode. Tabell 4 viser de oppmålte enzymaktiviteter for forskjellige sub-stratkonsentras joner ved en enzymkonsentrasjon på 0,4 jug/ ml. Tabell 4 viser at substratmétning erholdes ved oppfinnelsen allerede ved meget lav substratkonsentrasjon.

EKSEMPEL 12

Reproduserbarheten av belegningsmetoden ble studert

ved hjelp av tre forskjellige belegninger utført ifølge eksempel 2 ved hjelp av den i eksempel 9 angitte pH-statmetode. Substrat-konsentras jonen var i dette tilfelle 100 mg/ml og enzymkonsentrasjonen ble variert fra 0,1 til 1,2 yug/ml. Den gode reproduserbarhet mellom de tre forskjellige belegninger fremgår av tabell 5.

EKSEMPEL 13

Ved dette eksempel ble bindingen mellom bæreren og forskjellige triglycerider undersøkt. Følgende triglycerider ble studert: Triacetin (TA), Tripropionin (TP), Tributyrin (TB) og Tricaproin (TC). Belegningene ble utført ifølge eksempler 1, 3, 4 og 5.

De forskjellige substratprøver ble oppdelt i to porsjo-ner hver. Den første porsjon av hver substratprøve ble anvendt for å bestemme den o<p>prinnelige enzymaktivitet ved hjelp av den i eksempel 9 angitte pH-statmetode. Mengden av substratpreparatet var i hver og ett av tilfellene 100 mg/ml, og enzymkonsentrasjonen var 1,0 ^g/ml, unntagen for tributyrin, hvor en mindre enzymkonsentrasjon (0,4 /<g/ml) ble anvendt.

Den annen porsjon (2 g) av hver substratprøve ble vasket 3 timer med et stort overskudd av destillert vann for å fjerne eventuelt oppløselig substrat. Derefter ble substratprø-vene tørket og undersøkt med hensyn til enzymaktivitet som ovenfor angitt.

Tabell 6 viser enzymaktiviteten før og efter vaskning for fjerning av oppløselig,substrat. Av tabell 6 fremgår det at vannoppløseligheten hos triacetin og tripropionin gjør at de slipper fra den hydrofobe bærer og går over til vannfasen.

EKSEMPEL 14

Ved dette eksempel sammenlignes substratpreparatet ifølge eksempel 2, dels med TC belagt med "Fluosil 200" (som er et pyrogen silica med et overflateareal på ca. 200 m 2/g

, dels med fritt emulgert TC (dvs. uten bærer) ved hjelp av den i eksempel 9 angitte metode med en enzymkonsentrasjon på 0,2 ^ug/ml. Belegningen av TC på "Fluosil

200" ble utført efter den i eksempel 1 beskrevne metode. To belegninger med TC på "Fluosil 200" ble utført, dels med 20 vekt% TC, dels med 50 vekt% TC. Resultatene av målingene med de ovennevnte preparater av bærerbundet substrat henholdsvis emulsjon er angitt i tabell 7 og fig. 2.

Av tabell 7 fremgår at maksimal og konstant enzymaktivitet (substratmétning) erholdes ved tilsetning av en viss, meget liten mengde substratpreparat bestående av TC belagt på PVC ifølge eksempel 2.

Ved begge belegninger på "Fluosil 200" og emulsjonen av TC ble der ikke erholdt denne hurtige substratmétning. Enzymaktiviteten øket med hver tilsetning av substrat.

Den substratkonsentrasjon ved hvilken substratmétning inntreffer er avhengig av enzymkonsentrasjonen. Jo høyere enzymkonsentrasjon, desto høyere substratkonsentrasjon kreves for substratmétning.

EKSEMPEL 15

Ved dette eksempel sammenlignes bærermaterialet PVC (PET712), med følgende bærermateriale: Polymethylmet-acrylat (FP^4000 ), Polyacrylnitril, HD<®->polyethen.

Belegninger ble utført ifølge den i eksempel 1 angitte metode. Substrategenskapene ble testet ifølge den i eksempel 9 angitte metode ved en enzymkonsentrasjon på 1,0 yug/ml. Resultatet av testen er angitt i tabell 8.

Resultatene viser at PVC gir den i særklasse høyeste reaksjonshastighet. Polyacrylnitril og polymethylmethacrylat gir bøyede aktivitetskurver som tyder på inaktivering av enzymet ved substratoverflaten. Polyethen utviser en økende enzymaktivitet som kan tyde på at tricaproin løsner fra bæreren.

Innfarvning av substratpreparater suspendert i vannopp-løsning i det i vannoppløsning uoppløselige farvestoff sudanrødt ga følgende resultat: PVC-belegningen ble svakt farvet, poly-methylmethacrylatbelegningen ble. ikke farvet, polyacrylnit^ rilbele.gni.ngen ble svakt farvet og polyethenbelegningen ble kraftig farvet, Den kraftige innfarvning av polyethenbe-

legningen viser at der finnes en stor mengde fritt tricapro-

in på belegningens overflate. Den svake innfarvning av PVC

og polyacrylnitril viser at der finnes en mindre mengde fritt tricaproin på overflaten, mens fravær a<y> innfarvning hos polymethylmethacrylat tyder på fravær av fritt tricaproin på over-

flaten. Resultatet av innfarvningen med sudanrødt stemmer godt overens med resultatene av enzymaktivitetsbestemmelsene.

Claims (9)

1. Pulverformig substratpreparat for omsetning med enzym, hvilket preparat foruten eventuelle tilsetninger slik som tensid, består av vannuoppløselig, hydrofobt substrat adsorbert på en partikkelformig bærer, karakterisert ved at bæreren utgjøres av mykningsmiddelfritt polyvinylklorid med en midlere kornstørr-else på høyst 0,5 mm, og at substratet utgjør 1-30 vekt% av preparatet.

2. Substratpreparat ifølge krav 1, karakterisert ved at substratet utgjør 5 - 25 vekt% av preparatet.

3. Substratpreparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det inneholder 0,1 - 3 vekt% tensid.

4. Substratpreparat ifølge krav 3, karakterisert ved at det inneholder 1 - 2 vekt% tensid.

5. Substratpreparat ifølge hvilket som helst av krav 1 - 4, karakterisert ved at bærerkornene ut-gjøres av agglomererte primærpartikler med en midlere par-tikkelstørrelse på 0,1 - l^um.

6. Substratpreparat ifølge hvilket som helst av krav kravene 1-5, karakterisert ved at bæreren utgjøres av polyvinylklorid fremstilt ved emulsjonspolymerisasjon.

7. Substratpreparat ifølge hvilket som helst av kravene 1-6, karakterisert ved at substratet er valgt blant flytende og faste triglycerider.

8. Substratsammensetning ifølge krav 7, karakterisert ved at substratet er glyceryltricapronat.

9. Anvendelse av et substratpreparat ifølge hvilket som helst av kravene 1-8 som substratkomponent i en tid-temperatur-integrerende indikatoranordning av enzymatisk type.