DK157815B - Pulverformig substratkomposition til reaktion med enzym og anvendelse af substratkompositionen - Google Patents

Description

DK 157815B

Den foreliggende opfindelse angår en pulverformig substratkomposition til reaktion med enzym, hvilken komposition foruden eventuelle tilsætninger, såsom tensid, består af vanduopløseligt, hydrofobt substrat adsorberet 5 på en partikelformig bærer. Opfindelsen angår også anvendelsen af en sådan substratkomposition som substratkomponent i en tid-temperatur-integrerende indikatoranordning af enzymatisk type.

Definitionsmæssigt menes der med et substrat et 10 stof, på hvilket et enzym virker.

Enzymatiske reaktioner, dvs. reaktion mellem substrat og enzym, udnyttes inden for vidt forskellige områder af teknikken. Sædvanligvis foreligger såvel substratet som enzymet i form af en vandopløsning.

15 I de senere år har man gjort sig store anstrengelser for at forbedre enzymsiden. Som et led heri har man bundet enzymet til en bærer og derigennem øget enzymets stabilitet, håndterbarhed og genanvendelighed. Forholdsvis små anstrengelser er imidlertid ofret på udform-20 ningen af substratsiden, trods det at der foreligger betydelige problemer, når substratet f.eks. er i form af et vanduopløseligt stof, såsom en med vand ikke-blandbar væske. Således benyttes til bestemmelse af lipaser bl.a. olivenolie eller forskellige synte-25 tiske triglycerider i form af med vand ikke-blandbare, olieagtige væsker. For at udføre lipaseanalysen er det praksis at emulgere det olieagtige substrat i vand ved hjælp af overfladeaktive stoffer og andre emulsionsstabilisatorer. For at analysen skal blive repro-30 ducerbar, sker emulgeringen af substratet under standardiserede betingelser. Trods dette er anvendelsen af emulsioner forbundet med betydelige ulemper. Således er det næsten umuligt at opnå ensartet dråbestørrelse hos emulsionen, hvilket resulterer i udefineret 35 overflade hos substratet med påfølgende dårlig reproducerbarhed for den enzymatiske reaktion. Endvidere er emulsionerne ikke lagringsbare i længere tid, men er instabile, navnlig ved indvirkning af lave tempera-

DK 157815 B

2 turer. På grund af disse ulemper har det derfor været vanskeligt at studere enzymatisk aktivitet med en acceptabel grad af nøjagtighed og reproducerbarhed, f.eks. ved enzymanalyse. Et andet specifikt område, 5 hvor disse ulemper gør sig gældende, er enzymatiske tid-temperaturindikatoranordninger, som er beregnet til at kontrollere behandlingen af følsomme varer, såsom frosne og nedkølede næringsmidler, vacciner, blodprodukter, lægemidler, fotografiske film osv.

10 Den principielle opbygning af sådanne tid-temperatur-indikatoranordninger fremgår af det amerikanske patentskrift nr. 2.671.028. Vanskeligheden i denne sammenhæng er bl.a., at indikatoranordningen udsættes for temperaturer under frysepunktet, hvorfor anvendelsen 15 af et væskeformigt substrat i form af en emulsion er udelukket, eftersom emulsionen brydes på grund af den lave temperatur.

For at råde bod på ovenstående ulemper er det blevet foreslået i det amerikanske patentskrift nr.

20 4.043.871 at bringe såvel flydende som faste, vand-uopløselige substrater i fast pulverform ved kombination med en partikelformig bærer. Karakteristisk for bæreren er, at den har et stort specifikt overflade- 2 areal på mere end 50 m /g, og specielt anførte, fore-25 trukne bærematerialer er uorganiske bærere af silicat-typen, såsom siliciumdioxidaerogel med et overflade-areal på over 200 m /g. Substratet er adsorberet på bæreren, og gennem kombinationen af substrat og bærer med stort overfladeareal opnås forøget enzymatisk 30 aktivitet og reproducerbarhed sammenlignet med tidligere anvendte substratemulsioner, samtidig med at de ovennævnte ulemper ved substratemulsioner, såsom instabilitet, formindskes væsentligt.

Imidlertid har det nu ifølge den foreliggende 35 opfindelse vist sig, at der kan opnås yderligere væsentlige fordele, hvis man i stedet for den foretrukne uorganiske bærer af silicattypen ifølge det amerikanske patentskrift benytter en organisk polymer og nærmere

DK 157815 B

3 bestemt polyvinylchlorid som bærer. Således opnår man herved substratmætning, dvs. maksimal og konstant enzymaktivitet ved reaktion med enzym, allerede ved en meget lav substratkoncentration, som er betydeligt lave-5 re end hvad der kan opnås ifølge den kendte teknik.

Dette indebærer et stort og overraskende fremskridt, som det vil indses af enhver fagmand på området.

Opfindelsen, hvis nærmere kendetegn fremgår af patentkravene, omhandler således en pulverformig substrat-10 komposition til reaktion med enzym, hvilken komposition foruden eventuelle tilsætninger, såsom tensid, består af vanduopløseligt, hydrofobt substrat adsorberet på en partikelformig bærer, og substratkompositionen er ejendommelig ved, at bæreren udgøres af blødgørings-15 middelfrit polyvinylchlorid med en middelkornstørrelse på højst 0,5 mm, og at substratet udgør 1-30 vægt% af kompositionen.

Fortrinsvis omfatter kompositionen tillige 0,1-3 og helst 1-2 vægt% tensid.

20 Andre valgfrie tilsætningsmidler, som kan anven des til f.eks. at fortynde substratfasen eller modificere dens smeltepunkt, er forbindelser, som (a) har en opløselighed på mindre 0,1 vægt% i vand ved 20°C, (b) er blandbare med den organiske substratfase, (c) har 25 et lavere smeltepunkt end substratet, (d) har et kogepunkt, som er mindst lige så højt som substratets, og (e) ikke virker som en inhibitor over for substratets enzym.

Bæreren har en middelkorn- 30 størrelse på op til 0,5 mm, beroende på at bærerkorn med en størrelse over 0,5 mm er vanskelige at suspendere stabilt. Nogen kritisk nedre gramse for bærerkornenes størrelse foreligger der ikke, men som en praktisk nedre grænse kan sættes ca. 0,5 ym, eftersom 35 mindre korn er vanskelige at fremstille.

Endvidere skal bæreren have en giastemperatur (Tg) på mere end ca. 80°C, for at bæreren ved anvendelse altid kan bibeholde sin adskilte partikelform og ikke

DK 157815 B

4 blive blød og smelte sammen med substratet.

Et yderligere krav er, at bæreren skal være inert over for det enzymatiske system, dvs. den skal ikke udøve nogen negativ indvirkning på hverken substrat, 5 enzym eller det produkt, som dannes ved den enzymatiske reaktion. Bæreren skal desuden være inert over for det opløsningsmiddel, som anvendes ved belægning af substrat på bæreren, og ikke blødgøres eller opløses deri.

Endelige skal bæreren have en vis porøsitet for 10 at kunne opsuge og tilbageholde substratet. Bærerens porøsitet er en funktion af dens overflade. Nogle skarpe grænser for bærerens porøsitet er vanskelige at opstille, men alment kan det siges, at en porøsitet o svarende til en overflade på mindre end ca. 25 m /g 15 foretrækkes, og at en porøsitet svarende til ca. 5-10 2 m /g er mest foretrukken.

Ovenstående almene kriterier opfyldes på udmærket måde af polyvinylchlorid (PVC). En speciel foretrukken PVC-bærer udgøres af PVC, som er fremstillet ved 20 emulsionspolymerisation, og som her betegnes PVC af emulsionstypen eller emulsions-PVC. Sådant PVC har en middelkornstørrelse inden for det angivne område, fra 0,5 ym til 0,5 mm, men kornene udgøres af agglomerater af mindre primærpartikler med en middel-25 partikelstørrelse på ca. 0,1-1 ym, sædvanligvis ca.

0,2-0,6 ym.

Selvom PVC af emulsionstypen specielt foretrækkes til substratkompositionen ifølge opfindelsen, udelukkes ikke andre typer PVC, såsom PVC, der er fremstillet ved 30 massepolymerisation eller suspensionspolymerisation.

Alment er alle typer PVC anvendelige til substratkompositionen ifølge opfindelsen. PVC-bærematerialet bør endvidere være så rent som muligt, dvs. fri for blødgø-ringsmiddel og andre konventionelle tilsætningsmidler, 35 for at undgå indvirkning på det enzymatiske system.

Ofte omfatter PVC'et et vist mindre tensidindhold på ca. 1-2 vægt%, som hidrører fra tilvirkningen af PVC'et.

For at undgå eventuel forstyrrende indvirkning af sådant

DK 157815B

5 tensid vaskes bærematerialet, i de tilfælde det omfatter tensid, for at fjerne tensidet inden bærematerialet anvendes .

Som det fremgår ovenfor er den foreliggende op-5 findelse begrænset til væskeformige og faste substrater, som er hydrofobe og uopløselige i vand. Med "uopløselig i vand" menes, at substratet har en opløselighed på mindre end 0,1 vægt% i vand ved 25°C. Grunden hertil er, at vandopløselige substrater frigøres fra 10 bæreren i vandmedium, medens hydrofile, ikke-vandopløse-lige substrater bindes dårligt til PVC-bæreren.

Substrater, som specielt foretrækkes, er ikke-vandopløselige estere.

Blandt sådanne estere foretrækkes navnlig trigly-15 cerider, som afhængig af carbonkædens længde og mætningsgrad i den indgående fedtsyredel er væsker eller faste stoffer. For at betingelsen om, at substratet skal være uopløseligt i vand, skal være opfyldt, skal fedtsyredelen herved for mættede fedtsyrers vedkommende 20 have mindst 4 carbonatomer, hvilket svarer til en vandopløselighed på mindre end 0,01 vægt%. Således kan triacetin og tripropionin ikke anvendes, medens derimod tributyrin fungerer godt.

Et foretrukket substrat af triglyceridtypen er tri-25 caproin (glyceryltricapronat), som undergår enzymatisk reaktion med lipaseenzymer. Blandt øvrige foretrukne substrater af triglyceridtypen kan der nævnes: tributyrin, tricaprylin, triolein og olivenolie.

Blandt øvrige foretrukne substrater af ester-30 typen må fremhæves diglycerider, såsom 1,3-dicaproin og 1,3-dioleinj monoglycerider, såsom 1-monoolein eller 1-monostearin; sorbitanestere, såsom sorbitan-monooleat og sorbitanmonostearat; cholesterolestere, såsom cholesterolacetat og cholesterolhexanoat; 33 methyl-, ethyl- og propylestere af ethylentetra-carboxylsyre, adipinsyre og 2,4-dioxovalerianesyre.

Blandt ikke-vandopløselige substrater, som ikke tilhører gruppen estere, kan der nævnes steroider, 6

DK 15 7 815 B

såsom cholesterol, cortisol og prednisolon.

I forhold til tidligere anvendte substratbærere, og fremfor alt de ovennævnte silicatbærere, udviser PVC-bæreren flere væsentlige fordele, som det skal be-5 lyses nærmere nedenfor.

PVC-bæreren er neutral, dvs. den påvirker ikke pH-værdien, og synes ikke at have nogen indvirkning på den enzymatiske reaktion eller det dannede reaktionsprodukt. Endvidere er PVC-bæreren hydrofob, hvilket er en stor fordel ved hydrofobe substrater af f.eks. triglyceridtypen, eftersom substratet let adsorberes på bæreren og forbliver fast forankret til denne. Den hydrofobe indbyrdes reaktion mellem bæreren og substratet sikrer en fast forankring

1 K

af substratet til bæreren. Denne gode forankring medfører, at substratkompositionen er meget stabil, såvel i tør tilstand ved oplagring som i vandmedium, og der sker ikke nogen spontan frigørelse af substrat fra bæreren. En meget stor fordel ved substratkompositio-20 nen ifølge opfindelsen er, at substratet, trods dets faste forankring på PVC-bæreren, er meget let tilgængeligt for enzymatisk reaktion. Hvis man udfører forsøg med konstant enzymkoncentration, men med stigende substratkoncentration, finder man, at konstant, 25 maksimal reaktionshastighed opnås allerede ved meget ringe substratkoncentration. Dette kan forklares ved, at det på bæreren påførte substrat byder enzymmoleky-1erne en meget større tilgængelig substratoverflade end en tilsvarende mængde substrat uden bærer, f.eks.

30 i form af en emulsion. For hydrofobe, ikke-vandopløselige substrater er det nemlig det substrat, som er tilgængeligt for enzymet ved grænsefladen (mellem vandfasen og substratfasen), som udgør den "virkelige" substratkoncentration (se H. Brockerhoff og R.G. Jensen, 35 Lipolytic Enzymes, Academic Press, New York (1974)).

Selv ved sammenligning med substratkompositionen ifølge det tidligere diskuterede amerikanske patentskrift nr. 4.043.871 opnår kompositionen ifølge opfindelsen substratmætning ved væsentligt lavere sub-

DK 157815B

7 stratindhold. Dette må anses for uventet og overraskende under hensyn til den ovenfor antydede sammenhæng mellem substratmætning og tilgængelig substratoverflade, thi bæreren ifølge det amerikanske patentskrift har 2 5 et overfladeareal på mindst 50 m /g og sædvanligvis mindst 200 m2/g, medens bæreren anvendt til den foreliggende opfindelse har en overflade, som fortrinsvis ligger 2 2 under 25 m /g, og som normalt er kun 5-10 m /g. Det er altså tydeligt, at stort overfladeareal hos bæreren 10 ikke umiddelbart medfører stor tilgængelig substratoverflade.

Da maksimal reaktionshastighed opnås allerede ved meget lave substratkoncentrationer, er det ikke nødvendigt at benytte høje substratindhold i substratkomposi-15 tionen ifølge opfindelsen, hvilket er gunstigt, da substratet udgør den dyre komponent, medens PVC-bæreren er billig. Almindeligvis udgør substratindholdet ved substratkompositionen ifølge opfindelsen ca. 1-30 vægt%, beregnet på den totale komposition. 1 Vægt% substrat udgør her-20 ved en praktisk nedre grænse, eftersom lavere indhold giver en alt for lav enzymatisk reaktionshastighed. Den øvre grænse 30 vægt% bestemmes, foruden af omkostningsmæssige og andre praktiske overvejelser, også af, at substratindhold over 30 vægt% ikke giver et helt 2 5 tørt produkt.

Et i det væsentlige tørt, fritstrømmende pulver er vigtigt for at lette formaling og størrelsesseparation af partiklerne og for at muliggøre i det væsentlige ensartet fordeling af pulveret i det væskesystem, 30 hvori pulveret anvendes.

Et foretrukket mængdeområde for substratet er 5-25 vægt%, beregnet på den totale komposition.

Nedenfor beskrives forskellige fremgangsmåder til fremstilling af substratkompositionen ifølge opfin-35 delsen.

Nærmere bestemt foregår fremstillingen på den

DK 157815B

8 måde, at substratet sættes til et opløsningsmiddel, eller en opløsningsmiddelblanding, som har god opløsningsevne over for substratet, men ikke opløser bæreren. Passende opløsningsmidler af denne art kan let udvælges 5 af fagmanden på området, og som eksempel kan nævnes lavere alkoholer, såsom methanol og ethanol. Til opløsningen sættes fortrinsvis også 0,1-3 vægt% tensid, beregnet på den endelige komposition, for at forbedre substratkompositionens dispergerbarhed i vandmedium.

10 Herefter tilsættes den ønskede mængde af den pulver-formige PVC-bærer, og blandingen inddampes, fortrinsvis ved formindsket tryk og moderat forhøjet temperatur, under omrøring, f.eks. i en rotationskolbeinddamper.

Efter at alt opløsningsmidlet er afdampet, udtages 15 det færdige produkt og formales og sigtes i påkommende tilfælde til et pulver med den ønskede kornstørrelse.

En anden fremstillingsmåde består i at holde bærerpulveret i et tørblandingsapparat med højhastighedsomrører og under omrøring tilsætte en fin stråle 20 flydende substrat. Gennem den kraftige omrøring i blanderen fordeles derved substratet på bærerkornene og der opnås en substratkomposition med ensartet belægning af bærerkornene.

Det skal fremhæves, at selv om de ovenfor angivne 25 fremstillingsmåder er de for nærværende foretrukne, er det selvsagt muligt at fremstille substratkompositionen ifølge opfindelsen efter andre fremgangsmåder. Ifølge en alternativ, mindre foretrukken fremgangsmåde tilberedes der således en opløsning af substrat i opløs-30 ningsmiddel, PVC-bærer tilsættes, og blandingen ud-portioneres successivt i en vandmasse, hvorved substratet fælder ud som en belægning på bærerkornene.

Substratkompositionen ifølge den foreliggende opfindelse er i princippet anvendelig til alle formål, 35 .som omfatter reaktion mellem substrat og enzym. Specielle områder, hvor opfindelsen med fordel er anvendelig, er analyse og standardisering af enzymer, ved kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af enzymer inden for

DK 157815 B

9 området klinisk kemi, samt som substratkomponent i de tidligere nævnte enzymatiske tid-temperaturindikatoranordninger.

Den store tilgængelige overflade hos substrat-5 kompositionen ifølge opfindelsen indebærer optimale betingelser for bestemmelse af små mængder enzym.

Derved at PVC-bæreren endvidere har en defineret overflade, får også substratet en defineret overflade med det resultat, at den enzymatiske reaktion bliver re-10 producerbar. Disse egenskaber indebærer, at man med substratkompositionen ifølge opfindelsen såvel kvalitativt som kvantitativt kan bestemme små enzymmængder, hvilket er værdifuldt ved diagnosticering inden for det medicinske område, eftersom forekomsten af små 15 enzymmængder eller variationer i en enzymkoncentration i f.eks. blod ofte udgør indikation på en sygdomstilstand. Ved hjælp af den foreliggende opfindelse er det således muligt på et tidligt stadium og med pålidelighed at diagnosticere forskellige sygdomstilstande.

20 Et vigtigt aspekt af opfindelsen er dens anven delse i enzymatiske tid-temperaturindikatoranordninger.

En udførelsesform for en sådan indikatoranordning består af to små lukkede glasampuller, som er adskilt af en fælles, bristbar skillevæg. I den ene plastampul findes 25 der en vandholdig opløsning af enzym, medens den anden plastampul indeholder substrat suspenderet i vandmedium. For at indikere det reaktionsprodukt, som frembringes af den enzymatiske reaktion, når indikatoranordningen aktiveres, omfatter en af plastampul-30 lerne, fortrinsvis den som indeholder substratet, en pH-indikator. Når indikatoranordningen aktiveres, dvs. når tid-temperaturindikeringen skal starte, ødelægges den bristbare skillevæg ved, at sammenpressende tryk udøves mod den ene plastampul. Herved kommer t 35 plastampullernes indhold i forbindelse med hinanden, således at indholdet i ampullerne blandes, og en enzymatisk reaktion sættes i gang. Den enzymatiske reaktion skrider frem under dannelse af et reaktions-

DK 157815 B

10 .. produkt, såsom capronsyre hvis substratet er tricaproin, og enzymet er en lipase, afhængig af temperatur og tid. Den tilstedeværende pH-indikator er beregnet til ved farveomslag at indikere overskridelsen af en vis 5 mængde reaktionsprodukt, såsom syre. Vanskelighederne ved at skabe en pålidelig enzymatisk tid-temperatur-indikatoranordning er meget store. Man må bl.a. kunne manipulere den enzymatiske reaktion på en sikker og reproducerbar måde. Disse vanskeligheder øges væsent-10 ligt ved, at de indgående enzym- og substratmængder må være små af hensyn til indikatoranordningens størrelse og pris. Ved, som tidligere omtalt, at reaktionshastigheden ved substratkompositionen ifølge opfindelsen allerede ved meget små substratkoncentrationer udeluk-15 kende er afhængig af enzymkoncentrationen og ikke af substratkoncentrationen, elimineres en af de største hindringer for at tilvejebringe en tid-temperatur-indikatoranordning med tilfredsstillende reproducerbar funktion. De øvrige omtalte fordele ved substratkompo-20 sitionen ifølge opfindelsen er selvsagt også nyttige i denne sammenhæng.

For at lette forståelsen af opfindelsen skal den 1 det følgende beskrives nærmere ved hjælp af nogle belysende udførelseseksempler.

25 Eksempel 1

Fremstilling af PVC-bærer belagt med tricaproinsubstrat.

100 g emulsions-PVC (Pevikon® PE 712 fra Kema Nord, Sverige? partikels tørrelse: 0,2 % >63 μτη) , som var vasket med ethanol, hældtes langsomt under omrøring 30 ned i en opløsning bestående af 20 g tricaproin (TC) og 300 ml ethanol, som var fortempereret til 60°C i en 2 liters inddampningskolbe. Efter fuldstændig suspendering af polyvinylchloridet tilsluttedes kolben til .en inddamper (Rotovapor, Buehi Laboratorium - Technik AG, 35 Flawil, Schweiz). Temperaturen bibeholdtes ved 60°C ved hjælp af et vandbad, og ethanolet afdampedes i løbet af 60 minutter ved formindsket tryk (ca. 20 mm Hg,

DK 157815B

11 vandsug). Herved opnåedes der et tørt og lugtefrit pulver bestående af aggregater af forskellig størrelse. Aggregaterne var meget sprøde, og efter formaling i en kværn (Alpine - Augsburg, Vesttyskland) opnåedes 5 der et pulver med lignende partikelstørrelsesfordeling som udgangsmaterialet.For at fjerne større aggregater sigtedes pulveret gennem en sigte med maskevidde 70 ym.

Eksempel 2 10 Eksempel 1 blev gentaget, men med den forskel, at der sattes 2 g tensid ("Brij" 72 Atlas Chemical Industries, Inc. Wilmington, Delaware, USA) til etha-nolopløsningen før belægningen.

Eksempel 3 15 Fremstilling af PVC-bærer belagt med tributyrinsubstrat. Eksempel 1 blev gentaget, men med den forskel, at tricaproinet erstattedes med 20 g tributyrin (TB).

Sammenl’ignxngseksempel 4

Fremstilling af PVC-bærer belagt med triacetinsubstrat.

20 Eksempel 1 blev gentaget, men med den forskel, at tricaproinet erstattedes med 20 g triacetin (TA).

Sammenligningseksempel 5

Fremstilling af PVC-bærer belagt med tripropioninsub-strat.

25 Eksempel 1 blev gentaget, men med den forskel, at tricaproinet erstattedes med 20 g tripropionin (TP).

Eksempel 6

Fremstilling af PVC-bærer belagt med olivenoliesubstrat. Eksempel 1 blev gentaget, men med den forskel, 30 at tricaproinet erstattedes med 20 g olivenolie, og etha-nolet erstattedes med en blanding bestående af 80% ethanol og 20% chloroform.

DK 157815B

12

Eksempel 7

Eksempel 6 blev gentaget, men med den forskel, at der sattes 2 g tensid ("Brij"72) til ethanol-chloro-formopløsningen før belægningen.

5 Eksempel 8

Fremstilling af PVC-bærer belagt med trioleinsubstrat.

Eksempel 6 blev gentaget, men med den forskel, at olivenolien erstattedes med 20 g triolein.

Eksempel 9 10 Substrategenskaberne hos substratkompositionerne ifølge eksempel 1-8 studeredes ved hjælp af pancreas-lipase i en pH-stat ved 25°C. Den principielle fremgangsmåde findes beskrevet i Marchis-Mouren et al.(1959),

Arch. Biochem. Biophys., vol. 83, p. 309-319. Målingerne 15 udførtes under nitrogengasatmosfære og kraftig omrøring.

9 ml 0,1 M vandopløsning af natriumchlorid sattes til en med termostat forsynet målebeholder og derefter tilførtes en indvejet mængde substratkomposition. pH indstilledes på 8,0, og der tilsattes 1 ml enzymopløsning.

20 Enzymopløsningen havde følgende sammensætning: glycerol 45 vol% albumin 1 mg/ml calciumchlorid 10 mM panereaslipase (0,04-1,2 yg/ml) 25 Forbruget på 0,02 M natriumhydroxid, som krævedes for at bibeholde pH 8,0, registreredes automatisk på en skriver. Enzymaktiviteten målt som umol forbrugt natriumhydroxid/min. beregnedes ud fra det opnåede skriverdiagram. Skriverdiagrammet viste et lineært 30 forbrug af natriumhydroxid i løbet af den tid, som målingen udførtes. En afvigelse fra lineært forbrug ville have vist stigende alternativt aftagende enzym-.reaktion.

Resultatet af målinger med tricaproinpræparatet 35 ifølge eksempel 2 er vist i tabel 1 og fig. 1.

Resultatet af målinger med tributyrinpræparatet

DK 157815 B

13 ifølge eksempel 3 er vist i tabel 2.

Af tabel 1 og 2 fremgår det, at maksimal og· konstant enzymaktivitet (substratmætning) opnås ved tilsætning af en vis, meget lille mængde substratkompo-5 sition. En yderligere forøgelse af substratmængden øgede ikke enzymaktiviteten. Den substratkoncentration, ved hvilken substratmætning indtræffer, afhænger af enzymkoncentrationen. Jo højere enzymkoncentration, des højere substratkoncentration kræves til substrat-10 mætning.

Sammenligningseksempel 10 I dette eksempel sammenlignedes substratkompositionen ifølge eksempel 2 (med PVC-bærer) og frit emulgeret TC (dvs. uden bærer) ved hjælp af den i 15 eksempel 9 angivne metode. Tabel 3 viser de målte enzymaktiviteter for forskellige koncentrationer TC, henholdsvis frit og belagt på bærer, ved en enzymkoncentration på 0,4 yg/ml. Dette forsøg viser en speciel fordel ved substratkompositionen ifølge opfindelsen, 20 nemlig at substratmætning opnås allerede ved meget lav substratkoncentration.

DK 157815B

14

O

m i i i o III* o o

o i <n J

r- I »II

o o m o o i cm m v£> to I “ * *

O O O

o o i cs i j

<1- I »II

o tn

o I I CO I

<n il * i o o c

•r-f O O

g in Η CM I I

CM ««Il z: o o o rt _

in O

o i i <n to r-ι cm I 1 * o o o «-Ι g W o CTv

i in *—i '—^ I I

9 u i—i ««II

P3 cj O O

< 4->

H *H

j> i—i r~- i—i cN

-W O r-t r-1 CO O

- JJ —I « « * *

V O O O O

cj . !

Ρ» CO

N O ·—* I I

c m ««II

w o o I /

Id ^ /to η λ n ^ -P O* *—1 / r-t CM <n Sl" S'li 4 /n *" rn ω ω <υ g-Gj / g 'H £ S m ^ “otS/rt'CP ΟΡΡΟ rt O. / U bD a ^ M £4 Όο/ια^Φ - _ _

&vy / go > -j- O O O

rt/xop p Or-ICSIMT

S/ncoo « « « * s/ c O --I .M oooo *y w x 4J t-'

DK 157815B

15

/-S

P

•rH.

.6 w o cd 53 I—l 0 cm 6 3- w .

»J

W u

pq O

< 4J _ C_j 'r-t H ►> o co ·« ^ 0"

4- 1 U

1 ·* s g ω cn O oo cm «

O

CO

O CO Η Λ o cn

cM

m *

O

+> (d n ^ ' .

jj ίΛ / tn O H /

I-- A

3 -ri ts / h ω -λ ε /i ε O — / d "~~ m c. / Μ ω . tn ^ <o go o fl / S u c: h ft! / n c o · g/ d o -H o

,yK f£] 4J

/

DK 157815B

16 O r-t

» N I

O » I

C o o

* 1—4 I

O * ·

co O

o VO O

- r—I vO

O ·> “

/-> cn O O

c: •ri

p-* O

O O vO

ci ·> I ·* ;a m i o I—i

cn r-t o S

π a. - jj w

P3 O ri O

<; jj o c-ι vo E—t <J O * *

U t-4 O O

> •r-l

4J

v: oo cn ri O O m

0 * *H

ιΛ O O

N

c; * pa o

m I

» i *

oj I O

Uh / H ‘ / 4J h 0) ffl / (D φ rr) 6 / M a « / s e 5 §

1/4 ΰ I i- S

/ M 0) <H HH

DK 157815 B

17 •<r

0 I I

O vO i i o ·> o CM o 5 \o O <t S o <r vo i lo »ir o - - i p-j H O O o o C3 :z _» . 00 o o

^ *7 m η vo vo I

9 r- « - « I

h3 5. O O O

rj ^ pq C *-> H 2 n o <r r' , o cn vn m3 -c Γ m ·> ·» » “ .μ o o O o u ca

§ CO vO vO

N tn CM MT VO I

pi CM ·> ·> *> I

W O O O

O CM CM

O cm cn cn I

Η * Λ Λ Ϊ

O O O

O CM

1 CM r-t I

LO I «o I

o o

' -H

« , tf 2-Se / § ω O -S / +J Η H r-j .S&/, s 11 i S / 'SI 'dcntnm 1/ O P o I Μ M ^

y m mw wWWW

DK 157815 B

18

Sammenligningseksempel 11 I dette eksempel sammenlignedes substratkompositionen ifølge eksemplerne 6-8 (med PVC-bærer ) og fri emulgeret olivenolie (dvs. uden bærer) ved hjælp af 5 den i eksempel 9 angivne metode. Tabel 4 viser de målte enzymaktiviteter for forskellige substratkoncentrationer ved en enzymkoncentration på 0,4 yg/ml. Tabel 4 viser, at substratmætning opnås ved opfindelsen allerede ved meget lav substratkoncentration.

10 Eksempel 12

Reproducerbarheden ved belægningsmetoden studeredes ved hjælp af tre forskellige belægninger udført ifølge eksempel 2 ved hjælp af den i eksempel 9 angivne pH-statmetode. Substratkoncentrationen var i dette 15 tilfælde 100 mg/ml, og enzymkoncentrationen varierede fra 0,1 til 1,2 yg/ml. Den gode reproducerbarhed mellem de tre forskellige belægninger fremgår af tabel 5.

Tabel 5 20 Enzymaktivitet (ymol NaOH/min.)

Enzymkoncentration Belægning Belægning Belægning (yg/ml) 123 0,10 0,26 0,29 0,27 0,40 0,64 0,64 0,64 25 0,80 1,10 1,12 1,14 1,00 1,39 1,40 1,37 1,20 1,56 1,62 1,64

Sammenligningseksempel 13 I dette eksempel undersøgtes bindingen mellem 30 bæreren og forskellige triglycerider. Følgende triglyce-rider studeredes: triacetin (TA), tripropionin (TP), tributyrin (TB) og tricaproin (TC). Belægningerne udførtes ifølge eksempel 1, 3, 4 og 5. De forskellige substratprøver opdeltes hver i to portioner. Den første

DK 157815 B

19 portion af hver substratprøve anvendtes for at bestemme den oprindelige enzymaktivitet ved hjælp af den i eksempel 9 angivne pH-statmetode. Mængden af substratkomposition var i hvert enkelt tilfælde 100 mg/ml, og 5 enzymkoncentrationen var 1,0 yg/ml, undtagen for tri-butyrin, hvor der anvendtes en lavere enzymkoncentration (0,4 ug/ml).

Den anden portion (2 g) af hver substratprøve vaskedes i 3 timer med et stort overskud af destilleret 10 vand for at fjerne eventuelt opløseligt substrat.

Derefter tørredes substratprøverne og undersøgtes med hensyn til enzymaktiviteten i overensstemmelse med det ovenstående.

Tabel 6 viser enzymaktiviteten før og efter 15 vaskning til fjernelse af opløseligt substrat. Af tabel 6 fremgår det, at vandopløseligheden hos triacetin og tripropionin gør, at de slipper forbindelsen med den hydrofobe bærer og går over i vandfasen.

Tabel 6 20 Substrat Enzymaktivitet Enzymaktivitet før vaskning efter vaskning _(ymol NaOH/min) (jmtol NaOH/min)_ TC 2,24 2,30 TB 1,50 1,50 25 TP 1,74 0,28 TA 0,14 0,00

Sammenligningseksémpel 14 I dette eksempel sammenlignedes substratkompositionen ifølge eksempel 2, dels med på "Fluosil" 200 (som 30 er et pyrogent silica med et overfladeareal på ca.

200 m /g fra Nynås Petroleum, Sverige) belagt TC, dels med frit emulgeret TC (dvs. uden bærer) ved hjælp af den i eksempel 9 angivne metode med en enzymkoncentration på 0,2 yg/ml. Belægningen af TC på "Fluosil" 200 udførtes 35 efter den i eksempel 1 beskrevne metode. To belægninger

DK 157815B

20 med TC på "Pluosil” 200 udførtes dels med 20 vægt% TC, dels med 50 vægt% TC. Resultaterne af målingerne med de ovennævnte præparationer af bærerbundet substrat respektive emulsion er der redegjort for i tabel 7 og 5 fig. 2.

DK 157815 B

21 CJ\ lA I ! i i - I «

O

-sf CM r-iI

o i ^ -3- ^ 1 o cT o r- in o 0 m I tn « 1 ~ ! o*· cT o r---4 »-*-

O

Cw 55 ° I I 1 ^ -i s n ! ! . ! - § ο- α.

P3 *-> < o H -s s i i : .5 o

U

c3 ^ cn r'. CO *-* C O ^ ^ W ,H o" o“ o" o' s . . ° - O 1

CM

03 ° ^ O O fl) S , CM ω

°. / E M

, »- , » / £ tH i—I

t0 α r;± ’e / -rt CO MM

M TJ 2 t= / Μ O ·Η jj c| E'' / O ø w 2 ° £> / * £ u η o , i / 1-1 ¢=1 > ·§ m s / p r„ = ^ w 2 ’j / H In £.-J VO r- «.-3 O0 M / i} /-v o. fl* 0 fB ‘V ¢)0) 0 0 0 V A / I U>u>u>^>> tn. / i, au Hu i-· u £-< w

« / ja S M j? M f-i .3 N: ^ SM X

V |W O ^ O o / [il CM in —<

DK 157815 B

22

Af tabel 7 fremgår det, at maksimal og konstant enzymaktivitet (substratmætning) opnås ved tilsætning af en vis, meget lille mængde substratkomposition bestående af TC belagt på PVC ifølge eksempel 2.

5 Ved de to belægninger på "Fluosil" 200 og emulsionen af TC opnåedes der ikke denne hurtige substratmætning. Enzymaktiviteten steg ved hver tilsætning af substrat.

Den substratkoncentration, ved hvilken substrat-10 mætning indtræder, afhænger af enzymkoncentrationen.

Jo højere enzymkoncentration, desto højere substratkoncentration kræves til substratmætning.

Sammenligningseksémpel 15 I dette eksempel sammenlignedes bærematerialet 15 PVC (PE 712, Kema Nord) med følgende bærematerialer: polymethylmethacrylat (FP 4000 Bofors Nobel Kemi,

Karlskoga), Polyacrylonitril (Lonza Schweiz), HD-poly-ethylen (Unifoss, Stenungsund).

Belægninger udførtes ifølge den i eksempel 1 20 angivne fremgangsmåde. Substrategenskaberne afprøvedes efter den i eksempel 9 angivne metode ved en enzymkoncentration på 1,0 yg/ml. Resultatet af prøven er anført i tabel 8.

Tabel 8

Enzymaktivitet (ymol NaOH/min)

25 Mængde 16 % TC 16 % TC 16 % TC 16 % TC

bærerbundet på PVC på poly- på poly- på poly- substrat ifølge methyl- acrylo- ethylen (mg/ml)_eks. 2 methacrylat nitril_ 35 1,30 0,045 0,57 0,21 30 . Resultaterne viser, at PVC giver den i særklasse højeste reaktionshastighed. Polyacrylonitril og polymethylmethacrylat giver krumme aktivitetskurver, som tyder på inaktivering af enzymet ved substratoverfladen. Polyethylen udviser en stigende enzymaktivitet, 35 som kan tyde på, at tricaproin løsner sig fra bæreren.

Indfarvning af i vandopløsning suspenderede substratpræparationer med det i vandopløsning uopløse-

DK 157815 B

23 lige farvestof sudanrødt gav følgende resultat: PVC-belægningen farvedes svagt, polymethylmethacrylatbelæg-ningen farvedes ikke, polyacrylonitrilbelægningen farvedes svagt, og polyethylenbelægningen farvedes 5 kraftigt. Den kraftige indfarvning af polyethylenbelægningen viser, at der findes en stor mængde frit caproin på overfladen af belægningen. Den svage indfarvning af PVC og polyacrylonitril viser, at der findes en mindre mængde fri tricaproin på overfladen, 10 medens fraværelsen af indfarvning hos polymethylmetha-crylat tyder på fraværelse af frit tricaproin på overfladen. Resultaterne af indfarvningen med sudanrødt stemmer godt overens med resultaterne af enzymaktivitetsbestemmelserne .

Claims (9)

1. Pulverformig substratkomposition til reaktion med enzym, hvilken komposition foruden eventuelle tilsætninger, såsom tensid, består af vanduopløseligt, hydrofobt substrat adsorberet på en partikelformig 5 bærer, kendetegnet ved, at bæreren udgøres af blødgøringsmiddelfrit polyvinylchlorid med en middelkorns tørre Ise på højst 0,5 mm, og at substratet udgør 1-30 vægt% af kompositionen.

2. Substratkomposition ifølge krav 1, kende- 10. e g n e t ved, at substratet udgør 5-25 vægt% af kompositionen.

3. Substratkomposition ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den omfatter 0,1-3 vægt% tensid.

4. Substratkomposition ifølge krav 3, k ende- tegnet ved, at kompositionen indeholder 1-2 vægt% tensid.

5. Substratkomposition ifølge et vilkårligt af kravene 1-4, kendetegnet ved, at bærerkor- 20 nene udgøres af agglomerater af primærpartikler med en middelkornstørrelse på 0,1 til 1 μιη.

6. Substratkomposition ifølge et vilkårligt af kravene 1-5, kendetegnet ved, at bæreren udgøres af ved emulsionspolymerisation fremstillet 25 polyvinylchlorid.

7. Substratkomposition ifølge et vilkårligt af kravene 1-6, kendetegnet ved, at substratet er valgt blandt flydende og faste triglycerider.

8. Substratkomposition ifølge krav 7, k ende- 30 tegnet ved, at substratet er glyceryltricapronat.

9. Anvendelse af en substratkomposition ifølge et vilkårligt af kravene 1-8 som substratkomponent i en tid-temperatur-integrerende indikatoranordning af enzymatisk type.