SE414509B - Pulverformig substratkomposition i vilken ingar hydrofobt enzymsubstrat adsorberat pa en partikelformig bevare jemte anvendning av kompositionen i tid-temperatur integrerande indikatoranordning av enzymatisk typ - Google Patents

Description

79fl-læ320-h 10 15 20 25 30 35 2 indikatoranordningar, som är avsedda att kontrollera hanteringen av känsliga varor, såsom frysta och kylda livsmedel, vacciner, blodprodukter, läkemedel, foto- grafisk film, osv. Den principiella uppbyggnaden av dy- lika tid-temperaturindikatoranordningar framgår av den amerikanska patentskriften 2 671 028. Svårigheten i detta sammanhang är bla att indikatoranordningen utsätts för temperaturer under fryspunkten, varför användning av vätskeformigt substrat i form av emulsion är utesluten, eftersom emulsionen bryts på grund av den låga tempera- turen. I d För att råda bot på ovanstående nackdelar har det föreslagits i den amerikanska patentskriften 4 043 871 att bringa såväl flytande som fasta, vattenolösliga sub- strat till fast pulverform genom kombination med en par- tikulär bärare. Utmärkande för bäraren är att den har en hög specifik ytarea av mer än 50 m2/g och särskilt an- givna, föredragna bärarmaterial är oorganiska bärare av silikattyp, såsom kiseldioxidaerogel med en ytarea av över 200 m2/g- Substratet är adsorberat på bäraren och genom kombinationen av substrat och bärare med hög yt- area uppnås ökad enzymatisk aktivitet och reproducerbar- het jämfört med tidigare använda substratemulsioner sam- tidigt som de ovannämnda nackdelarna med substratemul- sioner, såsom instabilitet, väsentligt reduceras.

Emellertid har det nu enligt föreliggande uppfinning visat sig att ytterligare väsentliga fördelar står att vinna om man istället för den föredragna oorganiska bäraren av silikattyp enligt den amerikanska patentskriften ut- nyttjar en organisk polymer och närmare bestämt polyvinyl- klorid, som bärare. Sålunda uppnår man härvid substrat- mättnad, dvs maximal och konstant enzymaktivitet vid reak- tion med enzym, redan vid en mycket låg substratkoncen- tration, som är avsevärt lägre än vad som kan uppnås enligt den kända tekniken. Detta innebär ett stort och överras- kande framsteg, såsom inses av varje fackman på området.

Enligt uppfinningen, vars närmare kännetecken framgår av patentkraven åstadkommes sâlundaenlpulverformigsubstrat- 10 20 25 30 35 790432044 3 komposition för reaktion med enzym, vilken komposition förutom eventuella tillsatser, såsom tensid, består av vattenolösligt, hydrofobt substrat adsorberat på en par- tikulär bärare, och uppfinningen utmärkes av att bäraren utgöres av mjukningsmedelsfri polyvinylkloridmedennædel- kornstorlek av högst 0,5 mm, och att substratet utgör l-30 vikt% av kompositionen.

Företrädesvis inbegriper kompositionen även O,l-3 vikt% tensid.

Bäraren enligt uppfinningen har en medelkornstorlek av upp till 0,5 mm, beroende på att bärarkorn med en storlek över 0,5 mm är svåra att suspendera stabilt.

Någon kritisk undre gräns för bärarkornens storlek före- ligger ej, men som en praktisk undre gräns kan sättas ca 0,5 pm, eftersom mindre korn är svåra att framställa.

Vidare skall bäraren ha en glastemperatur (Tg) av mer än cirka lOO°C för att bäraren vid användning all- tid skall bibehålla sin diskreta partikelform och inte mjukna och sammansmälta med substratet.

Ett ytterligare krav är att bäraren skall vara inert gentemot det enzymatíska systemet, dvs den skall inte utöva någon negativ påverkan på vare sig substrat, enzym eller den produkt som bildas vid den enzymatíska reaktionen. Bäraren skall även vara inert mot de lös- ningsmedel som används vid beläggning av substrat på bäraren och inte mjukas upp eller lösa sig däri.

Slutligen skall bäraren ha en viss porositet för att kunna suga upp och kvarhâlla substratet. Bärarens porositet är en funktion av dess yta. Några skarpa grän- ser för bärarens porositet är svåra att uppställa, men allmänt kan sägas att en porositet motsvarande en yta av mindre än cirka 25 m2/g föredrages och att en porositet motsvarande cirka 5-10 m2/g är mest föredragen.

Ovanstående allmänna kriterier uppfylles på ett ut- märkt sätt av polyvinylklorid (PVC).

En särskilt föredraqen PVC-bärare utgöres av PVC av emulsionstyp. Dyïik PVC har en modulkornstorlek inom det angivna området, från O,5.Fm till 0,5 mm, men kornen i79o4z2o-4 10 15 20 25 30 35 4 utgöres av agglomerat av mindre primärpartiklar med en medelpartikelstorlek av cirka O,l-1 um, vanligen cirka 0,2-0,6 pm. Även om PVC av emulsionstyp särskilt föredrages vid uppfinningen uteslutes inte andra typer av PVC, såsom mass-PVC och suspensions-PVC. Allmänt är alla typer av PVC användbara vid uppfinningen. PVC-bärarmaterialet enligt uppfinningen bör vidare vara så rent som möjligt dvs fritt från mjukningsmedel och andra konventionella tillsatsmedel, för att undvika inverkan på det enzyma- tiska systemet. Ofta inbegriper PVC:n en viss mindre tensidhalt av cirka l-2 vikt% som härrör från tillverk- ningen av PVC:n. För att undvika enventuell störande in- verkan av dylik tensid tvättas bärarmaterialet, i de fall det inbegriper tensid, för att avlägsna tensiden innan bärarmaterialet används vid uppfinningen.

Såsom framgått ovan, är föreliggande uppfinning be- gränsad till vätskeformiga och fasta substrat, som är hydrofoba och olösliga i vatten. Med “olöslig i vatten" avses att substratet har en löslighet av mindre än 0,1 vikt% i vatten vid 25°C. Anledningen härtill är att Vattenlösliga substrat frigöres från bäraren i vatten- medium medan hydrofila icke vattenlösliga substrat binds dåligt till PVC-bäraren.

Substrat, som särskilt omfattas av uppfinningen) är icke vattenlösliga estrar.

Bland dylika estrar föredrages särskilt triglycerider, vilka beroende på kolkedjans längd och mättnadsgrad i den ingående fettsyradelen är vätskor eller fastämnen. För att villkoret att substratet skall vara olösligt i vatten skall* vara uppfyllt skall härvid fettsyradelen, för mättade fettsyror ha minst 4 kolatomer, vilket motsvarar en vatten- löslighet av mindre än 0,01 vikt%. Sålunda utgör inte tri- acetin och tripropionin substrat enligt uppfinningen medan däremot tributyrin fungerar väl. Ett föredraget substrat av triglyceridtyp är trikaproin (glyceryltrikapronat), som undergår enzymatisk reaktion med lipasenzymer. Bland övriga föredragna substrat av triglyceridtyp kan nämnas: 10 15 20 gzs 30 35 7904320-4 5 tributyrin, trikaprylin, triolein och olivolja.

Bland övriga föredragna substrat av estertyp må framhållas diglycerider, såsom 1,3-dikaproin och 1,3- -diolein; monoglycerider, såsom l-monoolein eller l~mono- stearin; sorbitanestrar, såsom sorbitanmonooleat och sorbitanmonostearat; kolesterolestrar, såsom kolesterol- acetat och kolesterolhexanoat; metyl-, etyl- och propyl- estrar av etylentetrakarboxylsyra, adipinsyra och 2,4- -dioxovaleriansyra.

Bland icke vattenlösliga substrat, som ej tillhör gruppen estrar, kan nämnas steroider, såsom kolesterol, kortisol och prednisilon.

I förhållande till tidigare använda substratbärare, och framför allt de ovan nämnda silikatbärarna, uppvisar PVC-bäraren enligt föreliggande uppfinning flera väsent- liga fördelar, såsom skall belysas närmare nedan.

PVC-bäraren enligt uppfinningen är neutral, dvs den påverkar ej pH-värdet, och synes inte ha någon inverkan på.den enzymatiska reaktionen eller den bildade reaktions- produkten. Vidare är PVC-bäraren hydrofob, vilket är en stor fördel vid hydrofoba substrat av exempelvis triglyce- ridtyp, eftersom substratet lätt adsorberas på bäraren och förblir fast förankrat till denna. Den hydrofoba inter- aktionen mellan bäraren och substratet säkerställer en fast förankring av substratet till bäraren. Denna goda förankring medför att substratkompositionen är mycket stabil, såväl i torrt tillstånd vid lagring som i vatten- medium, och någon spontan frigörelse av substrat från bäraren sker ej. En mycket stor fördel med substratkom- positionen med PVC-bärare enligt uppfinningen är att substratet, trots sin fasta förankring på bäraren, är mycket lätt tillgängligt för enzymatisk reaktion. Om försök utföres med konstant enzymkoncentration, men med ökande substratkoncentration finner man att konstant, maximal reaktionshastighet uppnås redan vid mycket ringa substratkoncentration. Detta kan förklaras så, att det på bärare belagda substratet erbjuder enzymmolekylerna en mycket större tillgänglig substratyta än motsvarande fv9o432o-4 10 15 20 25 .3O ,3S 6 mängd substrat utan bärare, t ex i form av emulsion. För hydrofoba, icke vattenlösliga substrat är det nämligen det substrat som är tillgängligt för enzymet vid gränsytan (melbm vattenfas och substratfas) som utgör den "verkliga" substratkoncentrationen (se B. Brockerhoff och R.G, Jensen, Lipolytic Enzymes, Academic Press, New York (1974)). Även vid jämförelse med substratkompositionen enligt den tidigare diskuterade amerikanska patentskriften 4 043 871 uppnår kompositionen enligt uppfinningen sub- stratmättnad vid väsentligt lägre substrathalt. Detta får anses oväntat och överraskande med hänsyn till det ovan antydda sambandet mellan substratmättnad och till- gänglig substratyta, ty bäraren enligt-den amerikanska patentskriften har en ytarea av minst 50 m2/g och vanli- gen minst 200 mz/g, medan bäraren enligt föreliggande uppfinning har en yta som företrädesvis understiger 25 m2/g och som normalt är endast 5-10 m2/g. Det är alltså tydligt att stor ytarea hos bäraren icke omedelbart medför stor tillgänglig subsratyta. , En följd av att maximal reaktionshastighet uppnås redan vid mycket låga substratkoncentrationer är att det inte är nödvändigt att utnyttja höga substrathalter i sub- stratkompositionen enligt uppfinningen, vilket är gynnsamt, eftersom substratet utgör den dyrbara komponenten medan PVC-bäraren är billig. Allmänt utgör substrathalten vid substratbärarkompositionen enligt uppfinningen cirka l-30 vikt%, räknat på den totala kompositionen. l vikt% substrat utgör härvid en praktisk undre gräns, eftersom lägre halter ger en alltför låg enzymaktívitet. Den övre gränsen 30 vikt%, bestäms, förutom av kostnadsmässiga och andra praktiska överväganden, även av att substrathalter över 30 vikt% inte ger en helt torr produkt. Ett vid upp- finningen föredraget haltområde för substratet är 5-'25 vikt%, räknat på den totala kompositionen.

Nedan beskrivs olika metoder för framställning av substratkompositionen enligt uppfinningen.

Närmare bestämt tillgâr framställningen så, att sub- stratet sättes till ett lösningsmedel, eller en lös- 10 15 20 25 30 35 7904320-4 7 ningsmedelsblandning,som har god upplösande förmåga för substratet men ej upplöser bäraren. Lämpliga lösnings- medel av detta slag kan lätt utväljas av fackmannen på omrâdet och som exempel kan nämnas lägre alkoholer, såsom metanol och etanol. Till lösningen sättes företrädesvis även 0,1-3 vikt% tensid räknat på den slutliga komposi- tionen, för att förbättra substratkompositionens disper- gerbarhet i vattenmedium. Därefter tillsättes önskad mängd av den pulverformiga PVC-bäraren och blandningen indunstas, företrädesvis vid reducerat tryck och måttligt förhöjd temperatur, under agitering, t ex i en rotations- kolvindunstare. Sedan allt lösningsmedel avdrivits uttages den färdiga produkten och males och siktas vid behov till ett pulver med önskad kornstorlek.

Ett annat framställningssätt är att hälla bärarpulv- ret i en torrblandningsapparat med höghastighetsomrörare och under omröring tillsätta en fin stråle flytande sub- strat. Genom den kraftiga omröringen i blandaren för- delas därvid substratet på bärarkornen och en substrat- komposition med enhetlig beläggning av bärarkornen er- hålles.

Det skall framhållas att även om de ovan angivna framställningssätten är de för närvarande föredragna, är det givetvis möjligt att framställa substratkomposi- tionen enligt uppfinningen enligt andra metoder. Enligt ett alternativt, mindre föredraget sätt beredes sålunda en lösning av substrat i lösningsmedel, PVC-bärare till- sättes och blandningen utportioneras successivt i en vattenmassa, varvid substratet faller ut som en belägg- ning på bärarkornen.

Substratkompositionen enligt föreliggande uppfinning är i princip användbar för alla ändamål, som inbegriper reaktion mellan substrat och enzym. Särskilda områden där uppfinningen med fördel är användbar är analys och standardisering av enzym, vid kvalitativ och kvantitativ bestämning av enzym inom omrâdet klinisk kemi, samt som substratkomponent i de tidigare nämnda enzymatiska tid- -temperaturindikatoranordningarna. -gvsouzzo-4 10 15 20 25 30 35 8 Den stora tillgängliga ytan hos substratkompositionen enligt uppfinningen innebär optimala betingelser för bestämning av små mängder enzym. Genom att vidare PVC-bäraren har en definierad yta ges även substratet endefinierad ytamedföljdattdenenzymatiskareaktionen blirrepoducerbar.Dessaegenskaperinnebärattmanmedsub- stratkompositionen enligt uppfinningen såväl kvalitativt som kvantitativt kan bestämma små enzymmängder vilket är värdefullt vid diagnosticering inom det medicinska om- rådet, eftersom uppträdandet av små enzymmängder eller variationer i en enzymkoncentration i exempelvis blod ofta utgör indikation på ett sjukdomstillstånd. Med till- hjälp av föreliggande uppfinning är det sålunda möjligt att på ett tidigt stadium och med tillförlitlighet diag- nosticera olika sjukdomstillstånd.

En viktig aspekt av uppfinningen är dess användning i enzymatiska tid-temperaturindikatoranordningar. En utföringsform av en sådan indikatoranordning består av två små slutna plastampuller, som är åtskilda av en gemensam, bristbar skiljevägg. I den ena plast- ampullen finns en vattenhaltig lösning av enzym och pH- indikator, medan den andra plastampullen innehåller sub- strat suspenderat i vattenmedium. När indikatoranord- ningen aktiveras, dvs när tid-temperaturindikeringen skall starta, förstöres den bristbara skiljeväggen genom att sammanpressande tryck utövas mot den ena plastampul- len. Härvid kommer plagstampullernas innehåll att stå i förbin- delse meá varandra så att innehållet i ampullerna blan- das och en enzymatisk reaktion igângsättes. Den enzyma- tiska reaktionen fortskrider under alstring av reaktions- produkt, såsom kapronsyra om substratet är trikaproin och enzymet är ett lipas, i beroende av temperatur och tid. Den närvarande pH-indikatorn är avsedd att genom färgomslag indikera överskridandet av en viss mängd reak- tionsprodukt, såsom syra. Svårigheterna att skapa en till- förlitlig enzymatisk tid-temperaturindikatoranordning är mycket stora. Man måste bl a kunna manipulera den enzymatiska reaktionen på ett säkert och reproducerbart sätt. Dessa svårigheter ökas väsentligt genom att de 10 15 20 25 30 35 7904320-4 9 ingående enzym- och substratmängderna måste vara små med hänsyn till indikatoranordningens storlek och pris.

Mycket beroende på dessa svårigheter har såvitt bekant ingen enzymatisk tid-temperaturindikator hittills vunnit kommersiell framgång. Genom att, såsom tidigare omtalats, reaktionshastigheten vid substratkompositionen enligt uppfinningen redan vid mycket små substratkoncentrationer enbart är beroende av enzymkoncentrationen och ej av substratkoncentrationen, elimineras ett av de största hindren för att åstadkomma en tid-temperaturindikator- anordningmedtillfredsställande,reproducerbarfunktion.De övrigaomtaladefördelarnamedsubstratkompositionenenligt uppfinningen är givetvis även till nytta i detta sammanhang.

För att underlätta förståelsen av uppfinningen skall den i det följande beskrivas närmare genom några belysan- de utföringsexempel, EXEMPEL 1 Framställning av PVC-bärare belagt med trikaproinsub- strat. 100 g emulsions-PVC (Pevikon() PE 712 från Kema Nord, Sverige; partikelstorlek: 0,2 % >63 Pm), som tvättats med etanol, hälldes långsamt under omröring ner i en lösning bestående av 20 g trikaproin (TC) och 300 ml etanol som förtempererats till 60°C i en 2 liters indunstningskolv.

Efter fullständig suspendering av polyvinylkloriden an- slöts kolven till en indunstare (Rotovapor, Büchi Labo- ratorium - Technik AG, Flawil, Schweiz) . Temperaturen bi- behölls vid 60°C med hjälp av ett vattenbad och etanolen avdrevs under 60 min vid reducerat tryck (ca 20 mm Hg, vattensug).Härvhierhöllsetttorrt och luktfritt pulver beståendeavaggregatavolikastorlek.Aggregatenvarmycket sprödaochefter malningi.en kvarn (Alpine-Augsburg, Väst- tyskland)erhöllsett pulvermedliknande partikelstorleks- fördelningsomutgångsmaterialet.Föratt avlägsna större aggregatsiktadespulvretgenmnensiktnæd maskvidden70 pm.

EXEMPEL 2 Exempel 1 upprepades, men med den skillnaden att 2 g tensid (Brijc>72 Atlas Chemical Industries, Inc. Wilmington, Delaware, USA) tillfördes etanollösningen före beläggningen. 7904320-4 lO 15 20 25 30 35 MD EXEMPEL 3 Framställning av PVC-bärare belagd med tributyrinsub- strat.

Exempel l upprepades, men med den skillnaden att tri- kaproin ersattes med 20 g tributyrin (TB).

ExEnpEL 4 I Framställning av PVC-bärare belagd med triacetinsub- strat. l Exempel l upprepades, men med den skillnaden att tri- kaproin ersattes med 20 g triacetin (TA).

EXEMPEL 5 t A Framställning av PVC-bärare belagd med tripropionin- substrat. , Exempel 1 upprepades, men med den skillnaden att tri- kaproin ersattes med 20 g tripropionin (TP).

EXEMPEL 6 Framställning av PVC-bärare belagd med olivolja- substrat.

Exempel l upprepades men med den skillnaden att trikaproinersattes med 20 g olivolja och etanol ersat- tes med en blandning bestâende av 80 % etanol och 20 % kloroform.

EXEMPEL 7 Exempel 6 upprepades men med den skillnaden att 2 g tensid (Brij 72) tillfördes etanol-kloroformlös- ningen före beläggningen.

EXEMPEL 8 Framställning av PVC-bärare belagd med triolein- substrat.

Exempel 6 upprepades men med den skillnaden att olivolja ersattes med 20 g triolein.

EXEMPEL 9 Substrategenskaperna hos substratkompositionerna en- ligt exempel l-8 studerades med hjälp av pankreaslipas i en pH-stat vid 25°C. Det principiella förfarandet finns beskrivet i Marchis~Mouren et al (1959), Arch Biochem Biophys,vol.83,p.309-319.Mätningarnautfördesunderkväv- gasatmosfär och kraftig omrörning. 9 ml O,l M vattenlös- 10 15 20 25 30 35 79043204: ll ning av natriumklorid sattes till ett termostaterat mät- kärl och därefter tillfördes en invägd mängd substratkom- position. pH justerades till 8,0 och l ml enzymlösning tillfördes. Enzymlösningen hade följande sammansättning. glycerol 45 vol% albumin l mg/ml kalciumklorid lO mM pankreaslipas (0,04-1,2 pg/ml) Förbrukningen av 0,02 M natriumhydroxid som krävdes för att bibehålla pH 8,0 registrerades automatiskt på en skrivare. Enzymaktiviteten, mätt som umol förbrukad natri- umhydroxid/minut, beräknades ur det erhållna skrivardia- grammet. Skrivardiagrammet visade en lineär förbrukning av natriumhydroxid under den tid som mätningen utfördes.

En avvikelse från lineär förbrukning skulle visat ökande alternativt avtagande enzymreaktion. d Resultatet av mätningar med trikaproinpreparatet enligt exempel 2 visas i tabell l och fig 1.

Resultatet av mätningar med tributyrinpreparatet enligt exempel 3 visas i tabell 2.

Av tabell l och 2 framgår att maximal och konstant enzym- aktivitet (substratmättnad)erhölls vid tillsatts av en viss, mycket liten mängd substratkomposition. En ytter- ligare ökning av substratmängden ökade inte enzymaktiviw teten. Den substratkoncentration, vidvilkensubstratmätt- nad inträffar, är beroende av enzymkoncentrationen. Ju högre enzymkoncentration desto högre substratkoncentra~ tion krävs för substratmättnad.

EXEMPEL 10 Vid detta exempel jämfördes substratkompositionen enligt Exempel.2(med PVC-bärare)och fritt emulgerat TC (dvs utan bärare) medelst den i exempel 9 angivna metoden.

Tabell 3 visar de uppmätta enzymaktiviteterna för olika koncentrationer TC, fritt respektive belagt på bärare, vid en enzymkoncentration av 0,4 pg/ml. Detta försök visar en speciell fördel med substratkompositionen enligt upp- finningen, nämligen att substratmättnad erhålles redan vid mycket låg substratkoncentration. 7904320-4 1.2 mm.o ~«.ø mm.o w~.o «~.o °H.o om mm om ofi m ^HE\wäv øofiu Lwnufluucox Anwaxmomz Hoäav uou«>«uxwEænGm ^HE\wEv dowuflwomäox Iumuumnnm wmcw ^d«E\m0mz Hoav umu«>muMmE>uøm H qqmm ._ N @qmm o@.° || [email protected] || 1- || Q@.ø 1» ~m.ø 11 Åq «>»=~V o«.ø -I vn m~.o || m~.o || mm.o 11 Hm.ø || ^m ~>~=¥v o~.o || o~.o o~.o o~.o 1» o~.o || m~.o >H.o «fi.o ^~ ~>»=xv oH.o || -I || 1- vn oH.o || oH.o flH.o wo.o ^H ~>»=xv «o.° »N o~ om o« om m~_. ON ma OH m wflu A nu m>u:xv u .

./:.^HE\w>v coflu f. lwuuøwufiox //lähufim ^Ha\mev fiofiu«momEm%1/f/ luæuumnsm wwcmfl/I 7904320-4 13 «m.0 «m.O |I ß«.O ll || || w ammämkm |« |« [email protected] «@.ov @@.o ~m.o ~H.o ß flwmsuxw || °@.o [email protected] øm.o @«.° ~m.o o~.o w Hwmamxm [email protected] @«.o w~.ø «».o w~.o o~.o |» ~fi~°>«~° w«»@wH=aw cow oofi mß om m~ øfi m apow luflhuw løflm ^Ha\mav dowuwwomäox uumuuwnflm wwcm ^flH8\=Owz floänv uou«>wuxmEhNfim < Q4mm || [email protected] °@.o [email protected] mm.o om.o . N Hmmamxm H~.o wH.o @H.o 1» mH.o wø.o |»| ua u«~@wH=au o.o« o.om o.o~ o.mH o.o~ o.m m.~ afiow ^Ha\w=G ua ¶w=mz m AAmm ^d«E\momz Hcäav uou«>wuMwahNøm vsonzzo-4 10 15 20 25 30 35 14 EXEMPEL ll Vid detta exempel jämfördes substratkompcsitionen enligt exemplen 6-8 (med PVC-bärare) och fri emulgerad olivolja (dvs utan bärare) medelst den i exempel 9 angivna metoden. Tabell 4 visar de uppmätta enzymaktivi- teternaför olika substratkoncentrationer vid en enzym- koncentration av 0,4 pg/ml. labell 4 visar att substrat- mättnad erhålles vid uppfinningen redan vid mycket lâg substratkoncentration. I EXEMPEL 12 _ Reproducerbarheten hos beläggningsmetoden studerades med hjälp av tre olika beläggningar utförda enligt exem- pel 2 med hjälp av den i exempel 9 angivna pH-statmetoden.

Substratkoncentrationen var i detta fall 100 mg/ml och enzymkoncentrationen varierades från 0,1-1,2 ng/ml. Den goda reproducerbarheten mellan de tre olika beläggningarna framgår av tabell 5.

TABELL 5 Enzymaktivitet (umol Na0H/min) Enzymkoncentration Beläggning Beläggning Beläggning (ug/ml) 1 2 3 0,10 0,26 »0,29 0,27 0,40 0,64 0,64 0,64 0,80 1,10 1,12 1,14 1,00 1,39 -1,40' 1,37 1,20 1,56 1,62 1,64 EXEMPEL 13 i \ Vid detta exempel undersöktes bindningen mellan bära- ren och olika triglycerider. Följande triglycerider stu- derades: Triacetin (TA), Tripropionin (TP), Tributyrin (TB) och Trikaproin (TC). Beläggningarna utfördes enligt exem- pel 1, a, 4, s. ' De olika substratproverna uppdelades i två portioner vardera. Den första portionen av varje substratprov an- 10 l5 20 25 >30 35 °' 7904320-4 15 vändes för att bestämma den ursprungliga enzymaktiviteten medelst den i exempel 9 angivna pH-statmetoden. Mängden substratkomposition var i vart och ett av fallen 100 mg/ml och enzymkoncentrationen var 1,0 ug/ml, utom för tri- butyrin, där en lägre enzymkoncentration (0,4 ng/ml) an- vändes.

Den andra portionen (2 g) av varje substratprov tvät- tades under 3 h med ett stort överskott av destillerat vatten för att avlägsna eventuellt lösligt substrat. Där- efter torkades substratproverna och undersöktes med av- seende på enzymaktiviteten enligt ovan.

Tabell 6 visar enzymaktiviteten före och efter tvätt- ning för avlägsnande av lösligt substrat. Av tabell 6 framgår att vattenlösligheten hos triacetin och tripropi- onin gör att de släpper från den hydrofoba bäraren och går över till vattenfasen.

TABELL 6 Substrat Enzymaktivitet Enzymaktivitet före tvättning efter tvättning (umol Na0H/min) (umol NaOH/min) 'rc 2,24 2,30 TB 1,50 1,50 TP 1,74 0,28 TA 0,14 o,oo EXEMPEL l4 Vid detta exempel jämfördes substratkompositionen enligt exempel 2, dels med på Fluosifä 200 belagt TC, dels med fritt emulgerat TC (dvs utan bärare) medelst den i exempel 9 angivna metoden med en enzymkoncentration 200 utfördes enligt den i exempel l beskrivna metoden. Två beläggningar med wc på F1ueei1® zoo utfördes, dels med zo vikta; Tc, dels med 50 vikt% TC. Resultaten av mätningarna med de ovan nämnda preparationerna av bärarbundet substrat respek- tive emulsion redovisas i tabell 7 och fig 2. av 0,2 pg/ml. Beläggningen av TC på Fluosil 7904320-4 16 Am m>u=xv å 3.0 3.0 I f S6 26 N ä dä 25 få 2.. N 3 ll un.O m~.o ln la æ~.o in oø~nuH«mo=Hm^wmm%%=@vom me.0 «<.O ~n.o || l| ßN.O || OoNAVHflmo=fim^mmmw%:%voN || || ll _ . Am m>u:xv o~ o 3.0 2 o 36 8 »mäfišø mß Om mw ON ma OH m Snow numuum |n:w Afiåmowz Hoaå »unäämuxmahuam ß Aflmmdfi ^HE\wEv Acowwfissm uwfifiw umwfiønumumnv. umuuwnsm wwcwz 10 15 20 25 30 35 797043204: 17 Av tabell 7 framgår att maximal och konstant enzym- aktivitet (substratmättnad) erhålles vid tillsats av en viss, mycket liten mängd substratkomposition bestående av TC belagt på PVC enligt exempel 2.

Vid de båda beläggningarna på FluosilC>2OO och emulsionen av TC erhölls ej denna snabba substratmätt- nad. Enzymaktiviteten ökade med varje tillsats av sub- strat. I Den substratkoncentration, vid vilken substratmätt- nad inträffar, är beroende av enzymkoncentrationen. Ju högre enzymkoncentration, desto högre substratkoncentra- tion krävs för substratmättnad.

EXEMPEL 15 Vid detta exempel jämfördes bärarmaterialet PVC (PE 712, Kema Nord) med följande bärarmaterial: Polymetyl- metakrylat (FP 4000 Bofors Nobel Kemi, Karlskoga), Poly- akrylnitril (Lonza Schweiz), HD-polyeten (Unifoss, Stenungsund).

Beläggningar utfördes enligt den i exempel l angivna metoden. Substrategenskaperna testades enligt den i exem- pel 9 angivna metoden vid en enzymkoncentrationav lA)ug/ml.

Resultatet av testen redovisas i tabell 8.

TABELL 8 Enzymaktivitet (pmol NaOH/min) Mängd 16 % TC 16 % TC 16 % TC 16 % TC bärarbundet på PVC på poly- på poly- på substrat enligt ex 2 metyl- akryl- polyeten (mg/ml) metakrylat nitril 35 1,30 0,045 0,57 0,21 Resultaten visar att PVC ger den i särklass högsta reaktionshastigheten. Polyakrylnitril och polymetylmet- akrylat ger krokiga aktivitetskurvor som tyder på inakti- vering av enzymet vid substratytan. Polyeten uppvisar en ökande enzymaktivitet som kan tyda på att trikaproin lossnar från bäraren. .'790lr320f4 10 18 Infärgning av i vattenlösning suspenderade substrat- preparationer med det i vattenlösning olösliga färgämnet sudanrött gav följande resultat: PVC-beläggningen färga- des svagt, polymetylmetakrylatbeläggningen färgades ej, polyakrylnitrilbeläggningen färgades svagt och polyeten- beläggningen färgades kraftigt. Den kraftiga infärgningen av polyetenbeläggningen visar att det finns en stor mängd fritt trikaproin på ytan av beläggningen. Den svaga in- färgningen av PVC och polyakrylnitril visar att det finns en mindre mängd fri trikaproin på ytan medan frånvaron av infärgning hos polymetylmetakrylat tyder på frånvaro av fri trikaproin på ytan. Resultaten av infärgningen med sudanrött överensstämmer väl med resultaten av enzym- aktivitetsbestämningarna.

Claims (9)

1. '10 15 20 25 30 79043204» 19 PATENTKRAV l. Pulverformig substratkomposition för reaktion med enzym, vilken komposition förutom eventuella till- satser, såsom tensid, består av vattenolösligt, hydro- fobt substrat adsorberat på en partikulär bärare, k ä n n e t e c k n a d därav, att bäraren utgöres av mjukningsmedelsfri polyvinylklorid med en medelkornstor- lek av högst 0,5 mm och att substratet utgör l-30 vikt% av kompositionen.

2. Substratkomposition enligt kravet l, t e c k n a d därav, att substratet utgör 5-25 vikt% k ä n n e - av kompositionen.

3. Substratkomposition enligt kravet l eller 2, k ä n n e t e c k n a d därav, att den inbegriper 0,1-3 vikt% tensid.

4. Substratkomposition enligt kravet 3, t e c k n a d därav, att kompositionen innehåller k ä n n e - l-2 vikt% tensid.

5. Substratkomposition enligt något av kraven 1-4, k ä n n e t e c k n a d därav, att bärarkornen utgöres av agglomerat av primärpartiklar med en medelpartikel- storlek av 0,1-l pm.

6. Substratkomposition enligt något av kraven 1-5, k ä n n e t e c k n a d därav, att bärarcn utgöres av polyvinylklorid av emulsionstyp. _

7. Substratkomposition enligt något av kraven 1-6, k ä n n e t e c k n a d därav, att substratol väljas bland flytande och fasta tríglyccrider.

8. Substratkomposition enligt kravet 7, t e c k n a d därav, att substratet är glyceryltrika- k ä n n e - pronat.

9. Användning av en substratkomposition enligt något av kravvn 1-8 som suhslratkomponent i en tid"Lvmpu~ raklur-intvgrurandv indikaloranordning av enzymatisk typ.