DE69133095T2

DE69133095T2 - Cyclosporin-Immunoassay

Info

Publication number: DE69133095T2
Application number: DE69133095T
Authority: DE
Inventors: Svetlana Alexander; Maureen H. Beresini; Dariush Davalian; Mae W. Hu; Edwin F. Ullman
Original assignee: Dade Behring Marburg GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Priority date: 1990-11-20
Filing date: 1991-11-19
Publication date: 2003-03-27
Anticipated expiration: 2011-11-20
Also published as: EP0487289A2; DE69133095D1; DE69121844D1; DE69121844T2; ATE142344T1; US6410696B1; EP0674178B1; EP0487289B1; JPH04316599A; EP0674178A2; JP2003201298A; US6054303A; CA2055813A1; EP0487289A3; ES2091301T3; US6190873B1; EP0674178A3; JP3936285B2; ES2181734T3; JP3433952B2

Description

Der Körper ist auf ein komplexes Immunantwort-System angewiesen, um Eigenes von Nicht-Eigenem zu unterscheiden. Die ordnungsgemäße Funktion des Immunsystems ist entscheidend für die langfristige Gesundheit des Körpers.
Unzureichende Immunantwort kann dazu führen, dass der Körper nicht mehr fähig ist, sich selbst vor nicht-eigenen Stoffen zu schützen. Übermäßige Immunantwort kann zur Überreaktion des Körpers auf ansonsten harmlose Stoffe führen.
Bisweilen muss das Immunsystem des Körpers gesteuert werden, um entweder unzureichende Antwort zu verstärken oder übermäßige Antwort zu unterdrücken. Wenn Menschen beispielsweise Organe, wie z. B. Niere, Herz, Herz-Lunge, Knochenmark und Leber, transplantiert bekommen, stößt der Körper das transplantierte Gewebe manchmal durch einen als Transplantatabstoßung bezeichneten Prozess ab.
Bei der Behandlung von Transplantatabstoßung wird das Immunsystem häufig durch Medikamententherapie auf kontrollierte Weise unterdrückt. Immunsuppressiva werden umsichtig an Transplantat-Empfänger verabreicht, um die Verhinderung von Transplantatabstoßung zu unterstützen.
Eines der Cyclosporin-Medikamente, das in den Vereinigten Staaten und anderen Ländern als Immunsuppressivum Anwendung findet, ist Cyclosporin A (CsA). CsA ist ein zyklisches Undecapeptid der allgemeinen Formel:
worin alle diejenigen α-Aminosäurereste, die das zyklische Gerüst von Cyclosporin A bilden von der L-Konfiguration sind, mit Ausnahme von α-Aminosäure 8, die D-Konfiguration besitzt. Aminosäurerest 1 stammt von einer ungewöhnlichen 9-Kohlenstoff-Aminosäure, nämlich [2S,3R,4R,6E]-3-Hydroxy-4-methylamino-6-octensäure. Die Aminosäurereste 1, 3, 4, 6, 9, 10 und 11 sind an den Amid-Stickstoffatomen des zyklischen Gerüsts von Cyclosporin A N-methyliert. Cyclosporin A wird beschrieben in den US-Patenten Nr. 4.117.118 (1978) und Nr. 4.396.542 (1983).
CsA kann andere nützliche Eigenschaften aufweisen, wie z. B. Antibiotikum-, Anti-Arthritis- und Anti-Entzündungs-Aktivität, und kann zur Behandlung anderer Affektionen, wie z. B. Diabetes, Malaria und Autoimmunerkrankungen, Anwendung finden.
Eine große Anzahl von CsA-Stoffwechselprodukten, in denen der Undecapeptid-Ring erhalten ist, ist identifiziert und beschrieben worden (siehe G. Maurer, H. R. Loosli, E. Schreier und B. Keller, Drug Metabolism and Disposition 12(1), 120-126 (1984), die Strukturen, Nomenklaturen und analytischen Daten der Stoffwechselprodukte sind hierin durch Verweis aufgenommen). Es ist nicht bekannt, welche Rolle - wenn überhaupt - diese Stoffwechselprodukte sowohl in der gewünschten Immunsuppressiv-Aktivität als auch bei unerwünschten, negativen Reaktionen spielen, wenn CsA zur Verhinderung der Transplantatabstoßung verwendet wird.
Obwohl CsA ein höchst effektives Immunsuppressivum ist, muss seine Verwendung umsichtig gehandhabt werden, weil der effektive Dosisbereich schmal ist und Überdosierung zu ernsthaften Nebenwirkungen führen kann. Nierendysfunktion, Hypertonie, kardiovaskuläre Krampte, Hirsutismus, Akne, Tremor, Konvulsionen, Kopfschmerz, Zahnfleisch-Hyperplasie, Diarrhöe, Übelkeit, Erbrechen, Hepatotoxizität, Bauchbeschwerden, Parästhesie, Wallungen, Leukopenie, Lymphom, Sinusitis und Gynäkomastie sind in Nieren-, Herz- oder Lebertransplantat-Patienten beobachtet worden, die CsA-Behandlung unterzogen wurden. Zu wenig CsA kann zu Transplantatabstoßung führen.
Die Handhabung der CsA-Dosierung beinhaltet die sorgfältige Kontrolle des Medikamentenspiegels im Patienten. Weil die Verteilung und der Stoffwechsel von CsA zwischen Patienten stark variiert und wegen des weiten Bereichs und der Schwere der Nebenreaktionen, wird die genaue Beobachtung des Medikamentenspiegels als essentiell angesehen.
Laborverfahren zur Detektion von Cyclosporin sind entwickelt worden. Diese Techniken umfassen typischerweise Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), Radioimmungssay (RIA) oder Fluoreszenzpolarisations-Immungssay (FPIA). Siehe beispielsweise B. A. Wolf et al., Clinical Chem. 35(1), 120-124 (1989); L. Vernilleet et al., Clinical Chem. 35(4), 608-611 (1989); P. E. Ball et al., Clinical Chem. 34(2), 257-260 (1988); H. F. Schran et al., Clinical Chem. 33(12), 2225-2229 (1987); A. Sanghvy et al., Clinical Chem. 34(9), 1904-1906 (1988); J. H. McBride et al., Clinical Chem. 35(8), 1726-1730 (1989); V. Quesniaux et al., Clinical Chem. 33(1), 32-37 (1987).
Jede dieser Techniken unterliegt bestimmten Einschränkungen bezüglich Sicherheit und Komplexität des Verfahrens und dem Grad der Spezifität für Cyclosporine von Interesse. Beispielsweise erfordert HPLC lange Probenvorbereitungs- und/oder Laufzeiten und verwendet teure, arbeitsintensive Verfahren; mit RIA gehen die allgemein bekannten Gefahren des Umgangs mit radioaktiven Stoffen einher, und FPIA kann, wenn auf unspezi fischen mono- oder polyklonalen Antikörpern basierend, häufig nicht zwischen CsA und dessen Stoffwechselprodukten unterscheiden.
Eine einfaches Analyseverfahren, das für die ausgewählten Cyclosporine spezifisch ist, wird für die Handhabung der Cyclosporin-Behandlung benötigt.
Der Immungssay ist eine den Erfordernissen eines einfachen Verfahrens entsprechende Technik zur Messung der Menge von Cyclosporin in einer Probe, in der Cyclosporin vermutet wird. Jedoch gilt für die meisten verfügbaren Antikörper, die Cyclosporine von Interesse erkennen können, dass sie auch nahe verwandte Verbindungen, wie z. B. Cyclosporin-Stoffwechselprodukte, erkennen und mit ihnen kreuzreagieren. Wegen dieser Kreuzreaktivität sind von diesen Antikörpern abhängige Immungssays für Cyclosporine von Interesse weniger spezifisch als wünschenswert wäre. Cyclosporin-Immungssays, die von Antikörpern abhängen, die mit anderen Verbindungen als den Cyclosporinen von Interesse kreuzreagieren, können verbessert werden, wenn die kreuzreagierenden Substanzen in Bezug auf die Erkennung durch Antikörper, die die Cyclosporine von Interesse erkennen, im Wesentlichen inaktiviert werden.
Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung betreffen ein einfaches, spezifisches Immungssay-Verfahren für Cyclosporine. Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung betreffen auch ein Verfahren zur Inaktivierung kreuzreaktiver Substanzen in Immungssay-Verfahren auf Cyclosporin.
Die WO-Anmeldung Nr. 8.602.080 (1986) beschreibt monoklonale Antikörper, die für bestimmte Cyclosporine selektiv sind. Diese Antikörper werden als Reaktion auf Cyclosporine produziert, die über einen modifizierten Aminosäurerest, wie z. B. ein (D)-Lysin an Position 8 oder ein (L)-Threonin an Position 2, an antigene Träger gebunden sind.
Die EP-A-283.801 (1988) beschreibt eine Fluoreszenz-Immungssay-Verfahren und zur Herstellung von Antikörpern verwendete Cyclosporin A-Derivate. Cyclosporin A wird über die Aminosäure-Seitenkette am Aminosäurerest Nr. 1 an einen immunogenen Träger gebunden.
N. A. Cacalano, W. L. Cleveland und B. F. Erlanger, J. Immunol. Meth. 118, 257-263 (1989), beschreiben die - vermutlich, jedoch nicht mit Bestimmtheit - statistische photochemische Aufpfropfung von Cyclosporin A-Alkylseitenketten auf 4-Benzoylbenzoesäure. Diese Pfropfprodukte werden zur Kopplung an immunogene Träger für die Antikörperherstellung verwendet.
Die US-A-4.727.035 (1988) beschreibt ein Immungssay-Verfahren für Cyclosporine. Das Verfahren umfasst entweder Radioiod- oder Fluoreszenz-Immungssays.
V. F. J. Quesniaux, R. Tees, M. H. Schreier, R. M. Wenger und M. H. V. Van Regenmortel, Molecular Immunology 24(11), 1159-1168 (1987), beschreiben als Reaktion auf Cyclosporin-Immunogen-Konjugate gezüchtete Antikörper. Die Konjugate werden über eine modifizierte Seitenkette den Aminosäuren 2 oder 8 an Cyclosporin angeknüpft.
Die US-A-4.764.503 (1988), 4.639.434 (1987) und 4.384.996 (1983) beschreiben an Aminosäurerest Nr. 8 modifizierte Cyclosporine. Diese Cyclosporine sind an der Aminosäure-Seitenkette hydroxyliert und als Immunsuppressiva nützlich.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren, die sich zur Inaktivierung eines Metaboliten von Cyclosporin in einem Assay zur Messung der Menge an Cyclosporin in einer Probe eignen, von der vermutet wird, dass sie Cyclosporin enthält. Das Verfahren umfasst den Schritt des Kombinierens eines die Probe enthaltenden Assaymediums mit einem Antikörper, der zur Bindung des Cyclosporin-Metaboliten fähig, den Assays zur Messung der Menge an Cyclosporin aber im Wesentlichen nicht stören kann.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Reagentien, die sich zur Durchführung eines Assayverfahrens gemäß vorliegender Erfindung eignen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Reagentien, die sich zur Durchführung der Verfahren zur Inaktivierung eines Metaboliten von Cyclosporin in einem Assay auf Cyclosporin eignen.
Verfahren, Zusammensetzungen, Reagenzien und Sets werden bereitgestellt, die für Cyclosporin-Immungssays nützlich sind. Vor der Fortsetzung der Beschreibung spezifischer Ausführungsformen wird eine Reihe von Begriffen definiert.

Definitionen

Linkergruppe - Eine Linkergruppe ist ein Teil einer Struktur, die 2 oder mehrere Unterstrukturen verbindet. Eine Linkergruppe besitzt zumindest 1 ununterbrochene Kette von Atomen, die nicht Wasserstoff (oder andere einwertige Atome) sind, die sich zwischen den Unterstrukturen erstreckt. Die Atome einer Linkergruppe und die Atome einer Kette innerhalb der Linkergruppe sind ihrerseits über chemische Bindungen verbunden.
Die Anzahl an Atomen in einer Linkergruppe wird durch Abzählen der Atome bestimmt, die nicht Wasserstoff sind. Die Anzahl an Atomen in einer Kette innerhalb einer Linkergruppe wird durch Abzählen der Atome, die nicht Wasserstoff sind, entlang der kürzesten Strecke zwischen den verbundenen Unterstrukturen bestimmt. Beispielsweise besitzt Diphenylmethan zwei Benzolringe, die durch eine 1-Atom-Linkergruppe, die eine 1-Atom-Kette enthält, verbunden sind; Stilben besitzt zwei Benzolringe, die durch eine 2-Atom-Linkergruppe, die eine 2-Atom-Kette enthält, verbunden sind; 1,2-Diphenyl-3-ethylcyclohexan besitzt 2 Benzolringe, die durch eine 8-Atom-Linkergruppe, die eine 2-Atom-Kette enthält, verbunden sind.
Carboxamidgruppe - Eine Carboxamidgruppe ist ein Teil einer Struktur, die eine Unterstruktur der folgenden Formel beinhaltet:
worin X Wasserstoff, Alkyl (mit weniger als etwa 9 Kohlenstoffatomen) oder Hydroxyalkyl (mit weniger als etwa 9 Kohlenstoffatomen) ist. Vorzugsweise ist X Wasserstoff oder eine gegebenenfalls mit Hydroxylgruppen substituierte, lineare oder verzweigte Alkylgruppe, die außer Wasserstoff in erster Linie weniger als etwa 9 Kohlenstoffatome, vorzugsweise weniger als etwa 7 Kohlen Stoffatome, mehr bevorzugt weniger als etwa 5 Kohlenstoffatome, enthält. Carboxamidgruppen sind typischerweise durch Alkylenketten miteinander verbunden, um Polycarboxamide, auch als Polypeptide bezeichnet, zu bilden. Die Alkylenketten sind vorzugsweise lineare oder verzweigte, gegebenenfalls mit Hydroxygruppen substituierte Alkylketten, die außer Wasserstoff weniger als etwa 11 Kohlenstoffatome, vorzugsweise weniger als etwa 9 Kohlenstoffatome, noch bevorzugter weniger als etwa 7 Kohlenstoffatome enthalten.
Non-Oxocarbonyl - Eine Gruppe mit der allgemeinen Struktur der Formel:
die kein Keton oder Aldehyd ist, in welcher T&sub1; ein Chalcogen (Sauerstoff oder Schwefel) oder substituierter Stickstoff ist, worin der Stickstoffsubstituent beispielsweise H oder Alkyl sein kann. Beispiele für Non-Oxocarbonylgruppen sind Carboxylsäuren, Ester, Amide, Carbamate, Carbonate, Harnstoffe usw. und umfassen deren Schwefel- und Stickstoff-Analoge.
Cyclosporin - Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist eine Cyclosporin-Gruppe ein natürliches oder synthetisches Cyclosporin oder Derivat. Cyclosporin-Gruppen sind zyklische Undecapeptide der allgemeinen Formel:
worin R eine gegebenenfalls mit Hydroxygruppen substituierte, lineare oder verzweigte Alkylgruppe ist, die außer Wasserstoff in erster Linie weniger als etwa 9 Kohlenstoffatome, vorzugsweise weniger als etwa 7 Kohlenstoffatome, enthält. Beispielsweise ist R in Cyclosporin A -CH&sub2;CH&sub3;, R in Cyclosporin B -CH&sub3;, R in Cyclosporin C -CH(OH)CH&sub3; und R in Cyclosporin D -CH(CH&sub3;)&sub2;. Geeignete Cyclosporine umfassen Cyclosporin A, Cyclosporin B, Cyclosporin C, Cyclosporin D, Cyclosporin E, Cyclosporin F, Cyclosporin G, Cyclosporin H und Cyclosporin I.
Die genauen Strukturen von Cyclosporin können von Beispiel zu Beispiel in geringem Ausmaß variieren. Zum Beispiel sind Veränderungen der Struktur von Seitenketten der Aminosäurereste 2-6 und 9-11 im Schutzumfang der Erfindung enthalten. Weiters sind Veränderungen des an den Amid-Stickstoffatomen der Aminosäurereste 2-6 und 9-11 hängenden Substituenten im Schutzumfang der Erfindung enthalten. Weiters sind Änderungen der absoluten stereochemischen Konfiguration des α-Kohlenstoffatoms der Aminosäurereste 2-11 im Schutzumfang der Erfindung enthalten.
Im Schutzumfang der Erfindung bleibt der Aminosäurerest Nr. 1 im Wesentlichen unverändert. Weiters ist einer oder beide der Aminosäurereste Nr. 7 und 8 ein d-Alanin, l-Alanin oder ein Gemisch davon.
Alanin-Stickstoffatom von Cyclosporin - jede der zyklischen Peptideinheiten eines Cyclosporinmoleküls enthält ein Amin-Stickstoffatom als Teil des Gerüstes des Cyclosporin- Rings. Im Kontext der vorliegenden Erfindung sind die Amid-Stickstoffatome von Alaninresten Alanin-Stickstoffatome von Cyclosporin. Beispielsweise sind diese Stickstoffatome der Aminosäurereste Nr. 7 und 8 in Cyclosporin A, C und D, sowie die Reste Nr. 2, 7 und 8 in Cyclosporin B.
Kohlenstoffatom Nr. 6 von Cyclosporin-Aminosäurerest Nr. 1 - Der Aminosäurerest an Position Nr. 1 von Cyclosporin A (CsA) ist eine kondensierte Form der freien Aminosäure [2S,3R,4R,6E]-3-Hydroxy-4-methyl-2-methylamino-6-octensäure. Siehe R. Wenger, US-A-4.396.542 (1993); R. M. Wenger, Helvetica Chim. Acta 66(7), 2308-2321 (1983). Diese Aminosäure wird auch bezeichnet als N-Methyl-(4R)-4-but-2E-en-1-yl-4-methyl- (L)threonin (MeBmt). Siehe R. Wenger et al., US-A-4.639.434 (1987). Die Struktur und das verwendete Nummerierungssystem für sowohl die kondensierte als auch die freie Form von Meßmt ist in folgender Formel gezeigt:
Atiocyclosporin - In einem ihrer Zusammensetzungsaspekte betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen, hergestellt durch Spaltung des Cyclosporin-Aminosäurerests Nr. 1 an der Bindung oder den Bindungen, die die beiden Kohlenstoffatome Nr. 6 und 7 verbindet oder verbinden und Konjugation des resultierenden Spaltungsprodukts, gegebenenfalls über eine Linkergruppe, an einen Marker, immunogenen Träger, an ein kleines organisches Molekül oder dergleichen. Wenn die Seitenkette von Aminosäure Nr. 1 an der Bindung zwischen Kohlenstoffatom Nr. 6 und Kohlenstoffatom Nr. 7 gespalten wird, werden die Kohlenstoffatome Nr. 7 und 8 entfernt und eine Funktionalität am Kohlenstoffatom Nr. 6 eingeführt.
Die neue funktionelle Gruppe am Kohlen stoffatom Nr. 6 ist jede beliebige funktionelle Gruppe, welche die Anknüpfung von Kohlenstoffatom Nr. 6 an eine Linkergruppe, einen Marker, immunogenen Träger, oder ein kleines organisches Molekül oder dergleichen ermöglicht. Solche funktionelle Gruppen können Heteroatom-enthaltende Gruppen, vorzugsweise Oxocarbonyle oder Nicht-Oxocarbonyle, umfassen.
Das resultierende Cyclosporin, worin die Kohlenstoffatome Nr. 7 und 8 von Cyclosporin-Aminosäurerest Nr. 1 entfernt worden sind und worin am Kohlenstoffatom Nr. 6 eine funktionelle Gruppe eingeführt worden ist, wird als Atiocyclosporin bezeichnet.
Atiocyclosporin-Carboxaldehyd - Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt, dass die Seitenkette von Cyclosporin-Aminosäurerest Nr. 1 an der olefinischen Bindung, die die Kohlenstoffatome Nr. 6 und 7 verbindet, oxidativ gespalten wird, um zu einem Cyclosporin zu führen, worin die Kohlenstoffatome Nr. 7 und 8 der Seitenkette von Aminosäurerest Nr. 1 entfernt worden und durch ein Sauerstoffatom ersetzt worden sind, um eine Aldehydfunktion am Kohlen Stoffatom Nr. 6 des Cyclosporin- Aminosäurerestes Nr. 1 zu bilden.
Die oben beschriebene, bevorzugte Verbindung wird als Atiocyclosporin-Carboxaldehyd bezeichnet, deren Struktur in folgender Formel gezeigt ist:
R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; sind 1-1 oder Hydroxyl, und zumindest eines davon ist Hydroxyl. R&sub4; ist H oder Methyl. R&sub5; ist Hydroxyl, Trialkylsilyl oder Acyloxy, und R&sub6; ist H. Bevorzugter sind R&sub1; und R&sub5; Hydroxyl, sind R&sub2;, R&sub3; und R&sub6; H und R&sub4; Methyl. Die am meisten bevorzugte Ausführungsform ist der aus Cyclosporin A-Metabolit M-1 gebildete Atiocyclosporin- Carboxaldehyd.
Störendes, kreuzreaktives Material - Andere Materialien als die Cyclosporine von Interesse, die von Antikörpern erkannt werden könnten, die fähig sind, die Cyclosporine von Interesse zu erkennen, sind störendes, kreuzreaktives Material. Solche Materialien können Verbindungen umfassen, die mit den Cyclosporinen von Interesse verwandt sind. Insbesondere sind Cyclosporin-Metaboliten mit beibehaltenem Undecapaptid-Ring störendes, kreuzreaktives Material. Die oben eingeschlossene Arbeit von Maurer et al. beschreibt eine Anzahl von Cyclosporin-Metaboliten. Die Strukturen von 8 üblichen Metaboliten sind unten gezeigt. Diese 8 Metaboliten sind veranschaulichende, jedoch nicht einschränkende Beispiele für störendes, kreuzreaktives Material. In einer ihrer am meisten bevorzugten Aspekte umfasst die vorliegende Erfindung den Cyclosporin A-Metaboliten M-1 als störendes, kreuzreaktives Material.
* R&sub5; und R&sub6; bilden zusammen mit einem Sauerstoffatom einen Tetrahydrofuranyl-Ring, und die Diefinil-Bindung ist gesättigt.
Organischer Rest - Ein organischer Rest ist ein Rest eines großen organischen Moleküls, oder es ist ein Rest eines kleinen organischen Moleküls. Vorzugsweise bestehen organische Reste aus immunogenen Trägern und Markern, gemeinsam mit jeglichen Linker gruppen. Ein organischer Rest kann jede Anzahl von Atomen besitzen, vorzugsweise enthält der organische Rest zumindest 5 Atome (einschließlich Wasserstoff).
Rest eines kleinen organischen Moleküls - Ein Rest eines kleinen organischen Moleküls ist eine Gruppe, die von der Anknüpfung eines kleinen organischen Moleküls herrührt. Ein kleines organisches Molekül ist eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 2.000 und vorzugsweise etwa 100 bis 1.000, noch bevorzugter etwa 300 bis 600, wie z. B. Biotin, Fluorescein, Rhodamin und andere Farbstoffe, Tetracycline und andere proteinbindende Moleküle, sowie Haptene und dergleichen. Das kleine organische Molekül ist zur Anknüpfung (Konjugation) fähig, gegebenenfalls über eine Linkergruppe, und zwar an ein Cyclosporin an einem der Alanin-Stickstoffatome des Cyclosporins. Wenn ein kleines organisches Molekül auf diese Weise angeknüpft wird, wird es zu einem Rest eines kleinen organischen Moleküls.
Rest eines großen organischen Moleküls - Ein Rest eines großen organischen Moleküls ist eine Gruppe mit einem Molekulargewicht über 2000 und umfasst Polyaminosäuren, Lipopolysaccharide, Teilchen und dergleichen. Eine solche Gruppe kann unter anderem ein Marker oder ein immunogener Träger sein.
Polyaminosäure - Eine Polyaminosäure ist ein Polyamid, das aus Aminosäuren gebildet ist. Polyaminosäuren werden auch als Polypeptide bezeichnet und liegen gewöhnlich im Molekulargewichtsbereich von etwa 2.000, ohne Molekulargewichtseinschränkung nach oben hin, normalerweise unter 10,000.000, gewöhnlich bei nicht mehr als etwa 600.000 Dalton. Die Bereiche sind gewöhnlich in Abhängigkeit davon, ob ein antigener Träger oder ein Enzym beteiligt ist, unterschiedlich.
Immunogener Träger - Ein immunogener Träger ist eine Gruppe die, wenn sie an ein Alanin-Stickstoffatom von Cyclosporin, gegebenenfalls über eine Linkergruppe, konjugiert ist und in ein Säugetier injiziert wird, eine Immunantwort induziert und die Produktion von Antikörpern, die an Cyclosporin binden, hervorruft. Immunogene Träger werden auch als antigene Träger und mit anderen, in der Wissenschaft üblichen Synonymen bezeichnet.
Das Molekulargewicht von antigenen Trägern liegt im Bereich von etwa 2.000 bis 107, gewöhnlich von etwa 20.000 bis 600.000, und noch häufiger von etwa 25.000 bis 250.000. Gewöhnlich liegt zumindest etwa eine Cyclosporin-Gruppe pro 150.000 Molekulargewichtseinheiten vor, häufiger zumindest eine Gruppe pro 50.000 Molekulargewichtseinheiten, vorzugsweise zumindest eine Gruppe pro 25.000 Molekulargewichtseinheiten.
Verschiedenste Proteintypen können als antigenes Polyaminosäurematerial angewendet werden. Diese Typen umfassen Albumine, Serumproteine, z. B. Globuline, Augenlinsenproteine, Lipoproteine, usw. Veranschaulichende Proteine umfassen Rinderserumalbumin (BSA), Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH), Ei-Ovalbumin, Rinder- Gammaglobulin (BGG), usw. Alternativ dazu können synthetische Polyaminosäuren verwendet werden.
Der immunogene Träger kann auch ein Polysaccharid sein, das ein hochmolekulares Polymer ist, welches aus wiederholten Kondensationen von Monosacchariden aufgebaut ist. Beispiele für Polysaccharide sind Stärken, Glykogen, Cellulose, Kohlenhydrat- Gele, wie z. B. Gummiarabicum, Agar, usw. Das Polysaccharid kann auch Polyaminosäurereste und/oder Lipidreste enthalten.
Der immunogene Träger kann auch eine Polynukleinsäure sein, entweder alleine oder konjugiert an eine der oben erwähnten Polyaminosäuren oder Polysaccharide.
Der immunogene Träger kann auch ein Teilchen sein. Der Durchmesser der Teilchen beträgt im Allgemeinen zumindest etwa 0,02 um und nicht mehr als etwa 100 um, gewöhnlich zumindest etwa 0,05 um und weniger als etwa 20 um, vorzugsweise etwa 0,3 bis 10 um. Das Teilchen kann organisch oder anorganisch, quellbar oder nichtquellbar, porös oder nichtporös, vorzugsweise von einer Dichte ähnlich Wasser, im Allgemeinen etwa 0,7 bis etwa 1,5 g/l und aus einem Material zusammengesetzt sein, das transparent, teilweise transparent oder lichtundurchlässig sein kann. Die Teilchen können biologische Materialien sein, wie z. B. Zellen oder Mikroorganismen, z. B. Erythrozyten, Leukozyten, Lymphozyten, Hybridome, Streptococcus, Staphylococcus aureus, E. coli, Viren und dergleichen sein. Die Teilchen können auch aus organischen und anorganischen Polymeren, Liposomen, Latex-Teilchen, Phospholipidvesikeln, Chylomikrons, Lipoproteinen und dergleichen bestehen.
Die Polymere können entweder Additions- oder Kondensationspolymere sein. Davon abgeleitete Teilchen sind in einem wässrigen Medium leicht dispergierbar und können in einer Weise adsorptiv oder funktionalisierbar sein, dass sie entweder direkt oder über eine Linkergruppe an eine Cyclosporin-Gruppe binden (konjugieren).
Die Teilchen können von natürlich auftretenden Materialien, die synthetisch modifiziert werden, oder von synthetischen Materialien abgeleitet sein. Unter den organischen Polymeren von besonderem Interesse sind Polysaccharide, wie z. B. Agarose, die als Sephadex und Sephacryl erhältlich ist, Cellulose, Stärke und dergleichen; Additionspolymere, wie z. B. Polystyrol, Polyvinylalkohol, Homopolymere und Copolymere von Derivaten von Acrylat und Methacrylat, insbesondere Ester und Amide mit freien Hydroxylfunktionalitäten und dergleichen.
Die Teilchen sind gewöhnlich polyfunktionell und binden sich an oder haben die Fähigkeit zur Bindung (Konjugation), gegebenenfalls über eine Linkergruppe, an eine Cyclosporin-Gruppe. Eine breite Vielzahl von funktionellen Gruppen ist verfügbar oder kann eingebaut sein. Funktionelle Gruppen umfassen Carbonsäuren, Aldehyde, Aminogruppen, Cyanogruppen, Ethylengruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen und dergleichen. Die Art und Weise der Bindung einer breiten Vielzahl von Verbindungen an Teilchen ist gut bekannt und in der Literatur reichlich veranschaulicht. Siehe beispielsweise Cautrecasas, J. Biol. Chem. 245, 3059 (1970), dessen Bindungsmethoden hierin durch Verweis aufgenommen sind.
Marker - Ein Marker ist jedes Molekül, das ein Signal erzeugt oder dazu angeregt werden kann. Der Marker kann an einen Analyten oder an einen Antikörper konjugiert sein, oder an ein anderes Molekül, wie z. B. einen Rezeptor oder ein Molekül, das an einen Rezeptor binden kann, wie z. B. einen Liganden, insbesondere ein Hapten. In der vorliegenden Erfindung kann der Marker ein Teil des unten definierten signalproduzierenden Systems sein, das ein Mittel der Signalproduktion beinhaltet.
Der Marker kann ein isotopischer oder ein nicht-isotopischer sein, vorzugsweise ist er nicht-isotopisch. Beispielsweise und nicht einschränkend kann der Marker Teil eines katalytischen Reaktionssystems sein, wie z. B. Enzyme, Enzymfragmente, Enzymsubstrate, Enzyminhibitoren, Coenzyme oder Katalysatoren; Teil eines chromogenen Systems, wie z. B. Fluorophore, Farbstoffe, Chämolumineszierer, Lumineszierer oder Sensibilisatoren; ein dispergierbares Teilchen, das nichtmagnetisch oder magnetisch sein kann, ein fester Trägerstoff, ein Liposom, ein Ligand, ein Rezeptor, ein Hapten, radioaktive Isotope usw.
Enzyme, Enzymfragmente, Enzyminhibitoren, Enzymsubstrate und andere Komponenten enzymatischer Reaktionssysteme können als Marker verwendet werden. Wenn eine dieser Komponenten als Marker verwendet wird, ist eine chemische Reaktion, die eine der Komponenten beinhaltet, Teil des signalproduzierenden Systems.
Wenn Enzyme angewendet werden, liegen die Molekulargewichte des Markers im Bereich von etwa 10.000 bis 600.000, häufiger von etwa 10.000 bis 300.000 und die beteiligten Reaktionen sind meist Hydrolyse- oder Redoxreaktionen.
Gekoppelte Katalysatoren können auch ein Enzym mit einem nichtenzymatischen Katalysator beinhalten. Das Enzym kann einen Reaktanten produzieren, der eine Reaktion eingeht, die durch einen nichtenzymatischen Katalysator katalysiert wird, oder der nichtenzymatische Katalysator kann ein Substrat (einschließlich Coenzyme) für das Enzym produzieren. Eine breite Vielzahl von anwendbaren, nichtenzymatischen Katalysatoren findet sich in US-A-4.160.645 (1979).
Zur gewünschten Amplifizierung führt das angewendete Enzym oder Coenzym durch die Bildung eines Produkts, das Licht absorbiert, z. B. ein Farbstoff, oder das bei Bestrahlung Licht emittiert, z. B. ein Fluoreszierer. Alternativ dazu kann die katalytische Reaktion zu direkter Lichtemission, z. B. Chämolumineszenz, führen. Eine große Anzahl von Enzymen und Coenzymen, die zu solchen Produkten führen, sind in US-A-4.275.149, Spalten 19 bis 23; und US-A-4.318.980, Spalten 10 bis 14; angeführt, deren Offenbarungen hierin durch Verweis aufgenommen sind.
Eine Anzahl von Enzymkombinationen ist in US-A-4.275.149, Spalten 23 bis 28 dargestellt und diese Kombinationen können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese Offenbarung ist hierin durch Verweis aufgenommen.
Von besonderem Interesse sind Enzyme, die die Produktion von Wasserstoffperoxid und die Nutzung von Wasserstoffperoxid zur Oxidation eines Farbstoffvorläufers zu einem Farbstoff beinhalten. Spezielle Kombinationen umfassen Saccharidoxidasen, z. B. Glucose- und Galactose-Oxidase, oder heterozyklische Oxidasen, wie z. B. Uricase und Xanthin-Oxidase, gekoppelt an ein Enzym, das Wasserstoffperoxid verwendet, um einen Farbstoffvorläufer zu oxidieren, d. h. eine Peroxidase, wie z. B. Meerrettich-Peroxidase, Lactoperoxidase oder Microperoxidase. Zusätzliche Enzymkombinationen können im durch Verweis aufgenommenen Gegenstand gefunden werden.
Wenn ein einzelnes Enzym als Marker verwendet wird, sind Enzyme, die verwendet werden können Hydrolasen, Transferasen, Lyasen, Isomerasen, Ligasen oder Synthetasen und Oxidoreduktasen, vorzugsweise Hydrolasen. Alternativ dazu können Luciferasen, wie z. B. Leuchtkäfer-Luciferase und bakterielle Luciferase, verwendet werden. Enzyme der Wahl, basierend auf der I.U.B.-Klassifizierung, sind in erster Linie: Klasse 1- Oxidoreduktasen und Klasse 3-Hydrolasen; insbesondere sind die Enzyme von Interesse in Klasse 1-Dehydrogenasen der Klasse 1.1, spezieller 1.1.1, 1.1.3 und 1.1.99, und Peroxidasen in Klasse 1.11. Von den Hydrolasen insbesondere Klasse 3.1, spezieller 3.1.3 und Klasse 3.2, spezieller 3.2.1,
Veranschaulichende Dehydrogenasen umfassen Malat-Dehydrogenase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und Lactat-Dehydrogenase. Unter den Oxidasen ist Glucose-Oxidase beispielgebend. Unter den Peroxidasen ist Meerrettich-Peroxidase beispielgebend. Unter den Hydrolasen sind alkalische Phosphatase, β-Glucosidase und Lysozym beispielgebend.
Jene Enzyme, die Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) oder dessen Phosphat (NADP), insbesondere ersteres, als Cofaktor benützen, können verwendet werden. Ein bevorzugtes Enzym ist Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, vorzugsweise NAD-abhängige Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase.
Der Marker kann auch fluoreszierend sein, entweder direkt oder mit Hilfe fluoreszierender Verbindungen oder fluoreszierender Stoffe, die üblicherweise an ein Teilchen oder ein anderes Molekül gebunden sind. Die fluoreszierenden Marker werden, gegebenenfalls über eine Linkergruppe, an Cyclosporin oder Antikörper oder Rezeptoren für Cyclosporin gebunden (konjugiert) oder zu diesem Zweck vorher funktionalisiert.
Der Fluoreszierer von Interesse emittiert im Allgemeinen Licht bei einer Wellenlänge von über etwa 350 nm, gewöhnlich über etwa 400 nm und vorzugsweise über etwa 450 nm. Wünschenswerterweise besitzen die Fluoreszierer eine hohe Quantenausbeute, eine hohe Stokes-Verschiebung und sind unter der Bedingungen ihrer Konjugation und Verwendung chemisch stabil. Der Begriff lumineszenter Marker umfasst auch Verbindungen, die bei Aktivierung durch elektromagnetische Strahlung, elektrochemische Anregung oder chemische Aktivierung Licht emittieren und umfassen fluoreszierende und phosphoreszierende Substanzen, Szintillatoren und chämolumineszierende Substanzen.
Fluoreszierer von Interesse unterteilen sich in eine Reihe von Kategorien mit bestimmten Hauptfunktionalitäten. Diese Hauptfunktionalitäten umfassen 1- und 2-Aminonaphthalin, p/p-Diaminostilbene, Pyrene, quaternäre Phenanthridin-Salze, 9-Aminoacridine, p,p'-Diaminostilbenimine, Anthracene, Oxacarboxyanin, Merocyanin, 3-Aminoequilenin, Perylen, Bisbenzoxazol, Bis-p-oxazolylbenzol, 1,2-Benzophenazin, Retinol, Bis-3- aminopyridinium-Salze, Hellebrigenin, Tetracyclin, Sterophenol, Benzimidazolylphenylamin, 2-Oxo-3-chromen, Indol, Xanthen, 7-Hydroxycumann, 4,5-Benzimidazole, Phenoxazin, Salicylat, Strophanthidin, Porphyrine, Triarylmethane, Flavin und Chelate, Oxide und Salze seltener Erden. Beispielhafte Fluoreszierer sind aufgezählt in der US-A- 4.318.707, Spalten 7 und 8, deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist.
Energieabsorbierer oder -quencher können entweder getrennt von - oder in Verbindung miteinander eingesetzt werden. Der Absorber oder Quencher kann zusätzlich an ein festes, unlösliches Teilchen von zumindest 50 nm Durchmesser gebunden sein. Wenn der Abstand zwischen Absorber und Quencher sich aus spezifischen Bindungsvorgängen (wie z. B. Antikörper-Antigen-Bindung) ergibt, wird die Fluoreszenz des Absorbers durch den Quencher gequencht. Die Quencher kann identisch mit oder verschieden vom Absorber sein, üblicherweise ist er unterschiedlich.
Eine alternative Lichtquelle als detektierbares Signal ist eine chämolumineszierende Quelle und daher kann ein Marker eine chämolumineszierende Verbindung sein. Die chämolumineszierende Quelle involviert eine Verbindung, die durch eine chemische Reaktion elektronisch angeregt wird und dann Energie an einen fluoreszierenden Akzeptor weitergibt oder Licht emittieren kann, das als detektierbares Signal dient.
Eine mannigfaltige Anzahl von Verbindungsfamilien ist gefunden worden, die unter einer Vielzahl von Bedingungen zu Chämolumineszenz führen. Eine Familie von Ver bindungen ist 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion. Die am weitesten verbreitete Verbindung ist Luminol, welches das 5-Amino-Analog der obigen Verbindung ist. Andere Mitglieder der Familie umfassen das 5-Amino-6,7,8-trimethoxy- und das Dimethylamin- [ca]benzo-Analog. Diese Verbindungen können mit alkalischem Wasserstoffperoxid oder Caiciumhypochlorit und Base zu Lumineszierern umgesetzt werden. Eine weitere Familie von Verbindungen sind die 2,4,5-Triphenylimidazole, mit Lophin als Trivialname für die Stammverbindung, Chämolumineszierende Analoge umfassen p-Dimethylamino- und p-Methoxy-Substituenten. Chämolumineszenz kann auch mit Geridiniumestern, Dioxetanen und Oxalaten, für gewöhnlich aktive Oxalylester, z. B. p-Nitrophenyl, und einem Peroxid, z. B. Wasserstoffperoxid, unter basischen Bedingungen erhalten werden. Alternativ dazu können Luciferine in Verbindung mit Luciferase oder Lucigeninen verwendet werden.
Konjugat - Ein Konjugat ist ein Molekül, das aus zwei oder mehreren, gegebenenfalls über eine Linkergruppe verbundenen, Untereinheiten besteht, um eine einzige Struktur zu bilden. Die Bindung kann entweder durch direkte Verbindung (z. B. chemische Bindung) zwischen den Untereinheiten oder durch Verwendung einer Linkergruppe hergestellt werden. Beispielsweise ist im Kontext der vorliegenden Erfindung ein Cyclosporin- Enzymkonjugat ein Cyclosporin, welches - gegebenenfalls über eine Linkergruppe - an einem Alanin-Stickstoffatom von Cyclosporin an ein Enzym konjugiert ist. Eine Verbindung, die so beschrieben wird, dass sie Untereinheit A umfasst, die - gegebenenfalls über eine Linkergruppe - mit Untereinheit B konjugiert ist, ist eine Verbindung, worin Untereinheit A, gegebenenfalls über eine Linkergruppe, an Untereinheit B gebunden ist.
Konjugation - Konjugation ist jeglicher Vorgang, worin zwei Untereinheiten miteinander verbunden werden, um ein Konjugat zu bilden. Der Konjugationsvorgang kann aus einer beliebigen Anzahl von Schritten bestehen.
Rezeptor - Ein Rezeptor ist jede Verbindung oder Zusammensetzung, die fähig ist, eine bestimmte räumliche und polare Anordnung eines Moleküls zu erkennen. Diese ange ordneten Bereiche eines Moleküls werden als Epitop- oder Determinanten-Stellen bezeichnet. Beispielhafte natürlich auftretende Rezeptoren umfassen Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Polynukleinsäuren, Komplement-Komponente, z. B. Thyroxin-bindendes Globulin, Lectine, Protein A und dergleichen. Es existiert ein natürlicher Rezeptor, der spezifisch an Cyclosporin bindet.
Ligand - Ein Ligand ist jedes organische Molekül, für das ein natürlicher Rezeptor existiert oder hergestellt werden kann. Beispielsweise ist in einem Kontext der vorliegenden Erfindung Cyclosporin ein Ligand und die vorliegende Erfindung stellt Rezeptor-Antikörper für Cyclosporine bereit. In einem weiteren Kontext der vorliegenden Erfindung kann Cyclosporin an einem Alanin-Stickstoffatom von Cyclosporin, gegebenenfalls über eine Linkergruppe, an einen zweiten Liganden gebunden werden. Wenn Cyclosporin auf diese Weise mit einem zweiten Liganden (Cyclosporin-Ligand-Konjugat) verbunden wird, erkennen Rezeptoren, die fähig sind, den zweiten Rezeptor zu erkennen, das Cyclosporin-Ligand-Konjugat.
Hapten - Haptene sind fähig, spezifisch an die entsprechenden Antikörper zu binden, wirken jedoch selbst nicht als Immunogene (oder Antigene) zur Herstellung der Antikörper. Antikörper, die ein Hapten erkennen, können gegen Verbindungen hergestellt werden, die aus dem Hapten bestehen, das an einen immunogenen (antigenen) Träger gebunden ist. Haptene sind eine Untergruppe von Liganden.
Beispielsweise ist in einem Kontext der vorliegenden Erfindung Cyclosporin ein Hapten. Wenn Cyclosporin an eines der Alanin-Stickstoffatome von Cyclosporin, gegebenenfalls über eine Linkergruppe, an einen antigenen Träger konjugiert ist, können Antikörper hergestellt werden, die fähig sind, Cyclosporin zu erkennen. In einem weiteren Kontext der vorliegenden Erfindung wird Cyclosporin an eines der Alanin-Stickstoffatome von Cyclosporin, gegebenenfalls über eine Linkergruppe an ein zweites Hapten konjugiert. Wenn Cyclosporin auf diese Weise mit einem zweiten Hapten konjugiert ist (Cyclosporin-Hapten-Konjugat), werden Antikörper, die fähig sind, das zweite Hapten zu erken nen, und Antikörper, die fähig sind, Cyclosporin zu erkennen, an das Cyclosporin-Hapten-Konjugat binden.
Element eines spezifischen Bindungspaares - Ein Element eines spezifischen Bindungspaares (sbp-Element) ist eines von zwei verschiedenen Molekülen mit einem Bereich an der Oberfläche oder in einem Hohlraum, der spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Anordnung des anderen Moleküls bindet und dadurch als zu dieser Anordnung komplementär definiert wird. Die Elemente des spezifischen Bindungspaares werden als Ligand und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Diese sind gewöhnlich Elemente eines immunologischen Paares, wie z. B. Antigen-Antikörper, obwohl andere spezifische Bindungspaare, wie z. B. Biotin-Avidin, Hormon-Hormon-Rezeptoren, Nukleinsäure-Duplexe, IgG-Protein A, DNA-DNA, DNA-RNA und dergleichen, keine immunologischen Paare, aber spezifische Bindungspaare sind.
Trägerstoff oder Oberfläche - Ein Trägerstoff oder eine Oberfläche ist ein poröses oder nichtporöses, wasserunlösliches Material. Der Trägerstoff kann hydrophil sein oder hydrophiliert werden und umfasst anorganische Pulver, wie z. B. Silicamaterial, Magnesiumsulfat und Tonerde; natürliche polymere Materialien, insbesondere Cellulose-Materialien und von Cellulose abgeleitete Materialien, wie z. B. Faser enthaltende Papiere, z. B. Filterpapier, Chromatographiepapier usw.; synthetische oder modifizierte, natürlich vorkommende Polymere, wie z. B. Nitrocellulose, Celluloseacetat, Polyvinylchlorid, Polyacrylamid, quervernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Polyethylenterephthalat, Nylon, Polyvinylbutyrat usw.; entweder alleine oder in Verbindung mit anderen Materialien verwendet; als Bioglas erhältliches Glas, Keramiken, Metalle und dergleichen. Natürliche oder synthetische Assemblierungen, wie z. B. Liposomen, Phospholipidvesikeln und Zellen, können auch verwendet werden. Andere Materialien, die angewendet werden können, sind oben in der Definition immunogener Trägerteilchen und unten in der Definition eines signalproduzierenden Systems beschrieben.
Bindung der sbp-Elemente an der Trägerstoff oder an die Oberfläche kann durch gut bekannte Verfahren, die für gewöhnlich aus der Literatur verfügbar und oben in der Definition immunogener Trägerteilchen beschrieben sind, erzielt werden. Die Oberfläche kann jede einer Vielzahl von Formen, wie z. B. Streifen, Stäbchen, Teilchen, einschließlich Kügelchen und dergleichen, besitzen.
Die Oberfläche ist gewöhnlich polyfunktionell oder kann polyfunktionalisiert werden oder ist fähig, über spezifische oder nicht-spezifische, kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen an einen sbp-Element zu binden. Eine breite Vielzahl von funktionellen Gruppen zur Verknüpfung wird in der Definition immunogener Trägerteilchen beschrieben.
Die Länge der Linkergruppe zu einem sbp-Element kann breit variieren, und zwar in Abhängigkeit von der Natur der zu verknüpfenden Verbindung, der Auswirkung des Abstands zwischen der zu verknüpfenden Verbindung und dem Trägerstoff auf den Assay und dergleichen. Das sbp-Element ist im Wesentlichen an der äußeren Oberfläche des Trägerstoffs gebunden.
Signalproduzierendes System - Die Funktion des signalproduzierenden Systems ist die Produktion eines Produkts, das zu einem detektierbaren Signal führt, das in Beziehung zur Menge des gebundenen/ungebundenen Markers steht.
Das signalproduzierende System kann aus einer oder mehreren Komponenten bestehen, wobei zumindest eine Komponente der Marker ist. Das signalproduzierende System umfasst alle benötigten Reagenzien zur Produktion eines messbaren Signals, einschließlich signalproduzierende Mittel, die fähig sind, mit dem Marker wechselzuwirken, um das Signal zu produzieren.
Das signalproduzierende System führt zu einem mit externen Mitteln detektierbaren Signal, normalerweise durch Messung elektromagnetischer Strahlung, wünschenswerter weise durch visuelle Untersuchung. Meistens umfasst das signalproduzierende System ein chromophores Substrat und Enzym, wobei chromophore Substrate enzymatisch zu Farbstoffen umgesetzt werden, die Licht im ultravioletten oder sichtbaren Bereich absorbieren, phosphoreszieren oder fluoreszieren.
Das signalproduzierende Mittel ist fähig, mit dem Marker wechselzuwirken, um ein detektierbares Signal zu produzieren. Solche Mittel umfassen beispielsweise elektromagnetische Strahlung, Wärme, chemische Reagenzien und dergleichen. Wenn chemische Reagenzien angewendet werden, können einige der chemischen Reagenzien als Teil einer Entwicklerlösung vorliegen. Die chemischen Reagenzien können Substrate, Coenzyme, Enhancer, Zweit-Enzyme, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Fänger, Metallionen, für die Bindung von signalerzeugenden Substanzen benötigte spezifische Bindungssubstanzen und dergleichen sein. Einige der chemischen Reagenzien, wie z. B. Coenzyme, mit enzymatischen Produkten reagierende Substanzen, andere Enzyme oder Katalysatoren und dergleichen, können von anderen Molekülen oder an einen Trägerstoff gebunden werden.
Das signalproduzierende System, einschließlich des Markers, kann ein oder mehrere Teilchen umfassen, die unlösliche Teilchen mit zumindest etwa 50 nm und nicht mehr als etwa 50 um, für gewöhnlich zumindest 100 nm und weniger als etwa 25 um, vorzugsweise 0,2 bis 0,5 um, Durchmesser sind. Das Teilchen kann organisch oder anorganisch, porös oder nichtporös, vorzugsweise mit einer Dichte ähnlich dem Wasser, im Allgemeinen von etwa 0,7 bis etwa 1,5 g/ml sein und aus einem Material bestehen, das transparent, teilweise transparent oder lichtundurchlässig ist. Im Allgemeinen besitzen die als Marker verwendeten Teilchen ähnliche Eigenschaften wie jene, die oben in der Definition eines immunogenen Trägers und eines Trägerstoffes oder einer Oberfläche beschrieben wurden.
Viele unterschiedliche Arten von Teilchen können zur Modulation von Lichtemission angewendet werden. Von besonderem Interesse sind Kohlenstoffteilchen, wie z. B. Holz kohle, Lampenruß, Graphit, kolloidaler Kohlenstoff und dergleichen. Neben Kohlenstoffteilchen können Metallkolloide verwendet werden, insbesondere die Edelmetalle Gold, Silber und Platin. Andere von Metallen hergeleitete Kolloide umfassen Metallsulfide, wie z. B. Blei-, Silber- und Kupfersulfide, oder Metalloxide, wie z. B. Eisen- oder Kupferoxide.
Fluoreszierende Latexteilchen sind in US-A-3.853.987 beschrieben und im Handel von Covalent Technology Corp. als Covaspheres erhältlich.
Messung der Menge an Cyclosporin - Quantitative, halbquantitative und qualitative Verfahren wie auch alle anderen Cyclosporin-Messmethoden werden als Methoden zur Messung der Menge an Cyclosporin in Betracht gezogen. Beispielsweise wird ein Verfahren, das lediglich die An- oder Abwesenheit von Cyclosporin in einer Probe mit vermutetem Cyclosporin-Gehalt delektiert, als im Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen betrachtet.
Synonyme für den Ausdruck "Messung der Menge an Cyclosporin", die im Schutzumfang der Erfindung enthalten sind umfassen, sind jedoch nicht bbegeschränkt auf die Detektion, Messung oder den Nachweis von Cyclosporin; Detektion, Messung oder Nachweis der Gegenwart von Cyclosporin; und Detektion, Messung oder Bestimmung der Menge an Cyclosporin.
"Im Wesentlichen fähig zur oder im Wesentlichen unfähig zur Bindung oder Erkennung" - betrifft eine Menge von Bindung oder Erkennung, oder deren Fehlen in einem Testgemisch unter bestimmten Testbedingungen. Im weitesten Sinne ist die Unterscheidung zwischen der Unfähigkeit eines Moleküls zur Bindung oder Erkennung eines anderen Moleküls und Fähigkeit zur Bindung oder Erkennung eines dritten Moleküls ausreichend für einen aussagekräftigen Test, der unter einem bestimmten Satz von Testbedingungen durchgeführt wird, der die relativen Konzentrationen der Moleküle beinhaltet. In einem weiteren Aspekt ist ein Molekül im Wesentlichen unfähig zur Bindung oder Er kennung eines anderen Moleküls im Sinne einer Kreuzreaktion, wobei das erste Molekül eine Reaktivität für ein zweites Molekül zeigt, die weniger als 25%, vorzugsweise weniger als 5%, der Reaktivität für ein drittes Molekül beträgt, und zwar unter einem bestimmten Satz von Testbedingungen, der die relativen Konzentrationen der Moleküle beinhaltet.
Probe mit vermutetem Cyclosporin-Gehalt - Jegliche Probe, in der Cyclosporin vermutet werden kann, kann mit einem Verfahren der vorliegenden Erfindung analysiert werden. Solche Proben können menschliche, tierische oder künstliche Proben sein. Die Probe kann in jedem geeigneten Medium vorbereitet werden, das den Test nicht stört. Typischerweise ist die Probe eine wässrige Lösung oder eine natürliche Flüssigkeit, vorzugsweise Urin, Gesamtblut, Serum, Plasma oder Speichel, noch bevorzugter Gesamtblut.
Probenvorbehandlung - Gegebenenfalls kann die Probe mit vermutetem Cyclosporin- Gehalt vorbehandelt werden. Vorbehandlung ist jeder Schritt, der dazu bestimmt ist, den Zielanalyten für ein oder mehrere Testreagenzien leichter zugänglich zu machen. Vorzugsweise werden Proben zur Analyse durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung vorbehandelt, um möglicherweise vorliegende Zellen zu lysieren, um möglicherweise vorliegende Proteine zu fällen und um möglicherweise vorliegendes Cyclosporin zu solubilisieren. Eine solche Vorbehandlung kann die Behandlung der Probe mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem Alkohol, noch bevorzugter Methanol umfassen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die ein Cyclosporin beinhalten, das an einem Alanin-Stickstoffatom, gegebenenfalls über eine Linkergruppe, mit einem organischen Rest konjugiert ist. Vorzugsweise ist Cyclosporin am Alanin- Stickstoffatom von Cyclosporin A-Aminosäurerest Nr. 7 und/oder 8, gegebenenfalls über eine Linkergruppe mit weniger als etwa 50, vorzugsweise weniger als etwa 35, noch bevorzugter weniger als etwa 25 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, mit einer Kette von nicht mehr als etwa 35, vorzugsweise nicht mehr als 25, noch bevorzugter nicht mehr als 15 Atomen Länge, konjugiert. Der organische Rest kann eine Gruppe mit einem Molekulargewicht von über etwa 2.000, vorzugsweise über etwa 5.000, oder ein Rest eines kleinen organischen Moleküls, wie z. B. ein Ligand, Hapten oder Biotin, sein. Vorzugsweise ist die Gruppe mit einem Molekulargewicht von über 2.000 eine Polyaminosäure. Noch bevorzugter ist die Polyaminosäure ein immunogener Träger, wie z. B. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) oder Rinder-Gammaglobulin (BBG), oder sie ist ein Enzym, wie z. B. Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PDH).
Die Linkergruppe besteht, falls vorhanden, aus einer Hydroxyalkankette der folgenden Formel -(CH&sub2;)nO-, worin das Alanin-Stickstoffatom von Cyclosporin an ein Kohlenstoffatom des Hydroxyalkans konjugiert ist und der organische Rest an das Sauerstoffatom konjugiert ist und n eine ganze Zahl im Bereich von etwa 1-6 ist, vorzugsweise 2 bis 4, noch bevorzugter ist n = 2. Noch bevorzugter wird die Hydroxyalkan-Linkergruppe am Sauerstoffatom verlängert, und zwar durch etwa 1 bis etwa 3 Carboxamidgruppen, die über Alkylengruppen miteinander verknüpft sind. Im Verlängerungsfall ist der organische Rest an ein Ende der Carboxamid-Verlängerungsgruppe gebunden und das Sauerstoffatom der Hydroxyalkangruppe ist an das andere Ende der Carboxamid-Verlängerungsgruppe gebunden. Alternativ dazu besteht die Linkergruppe, falls vorhanden, aus einer Carboxybenzylgruppe der folgenden Formel:
worin das Alanin-Stickstoffatom von Cyclosporin an das benzylische Kohlenstoffatom und der organische Rest an ein Sauerstoffatom der Carboxygruppe konjugiert ist. Die Carboxygruppe befindet sich vorzugsweise in ortho- oder para-Stellung, noch bevorzugter para zum benzylischen Kohlenstoff. Noch bevorzugter wird die Carboxybenzylgruppe an einem Sauerstoffatom der Carboxygruppe um etwa 1 bis etwa 3 Carboxamidgruppen verlängert, die über Alkylenketten miteinander verbunden sind. Im Verlängerungs fall ist der organische Rest an einem Ende der Carboxamid-Verlängerungsgruppe gebunden, und das Sauerstoffatom der Carboxygruppe ist an das andere Ende der Carboxamid- Verlängerungsgruppe gebunden. Noch bevorzugter wird die Linkergruppe aus folgender Gruppe ausgewählt:
Da Cyclosporine cyclische Undecapeptide sind, ist der Alanin-Stickstoff Teil eines Aminosäurerests. Vorzugsweise ist der Alanin-Stickstoff Teil der Aminosäurereste Nr. 7 und 8. Noch bevorzugter ist der Alanin-Stickstoff im Falle, dass die Linkergruppe aus einer gegebenenfalls mit Carboxamid verlängerten Hydroxyalkankette besteht, Teil von Cyclosporin-Aminosäurerest Nr. 7 und im Falle, dass die Linkergruppe aus einer gegebenenfalls mit Carboxamid verlängerten Carboxybenzylgruppe besteht, Teil von einem Cyclosporin-Aminosäurerest, der aus den Resten Nr. 7 oder 8 gewählt ist.
Wenn der organische Rest ein immunogener Träger ist, kann er geeigneterweise antigene Polyaminosäuren, Lipopolysaccharide und Teilchen sein. Es wird bevorzugt, dass er eine Polyaminosäure ist. Noch bevorzugter ist er Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) oder Rinderserumalbumin (BSA). Wenn der organische Rest ein immunogener Träger ist, wird weiters bevorzugt, dass die Linkergruppe eine Carboxybenzylgruppe ist. Noch bevorzugter wird die Carboxybenzylgruppe durch etwa 1 bis etwa 3 Carboxamidgruppen verlängert, die durch Alkylenketten miteinander verbunden sind.
Eine der bevorzugten, von der vorliegende Erfindung umfassten Zusammensetzungen ist eine Gemisch von Cyclosporin A, das am Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerests Nr. 7, und Cyclosporin A, das am Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerests Nr. 8 mit Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocycanin konjugiert ist und zwar über eine Linkergruppe der Formel (XIX).
Wenn der organische Rest ein Marker ist, hängt die Art des Markers von der Art des durchzuführenden Tests ab. Für Enzymimmungssays ist der Marker ein Enzym. Vorzugsweise ist es für homogene Enzymimmungssays Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase.
Wenn der organische Rest ein Marker ist, wird weiters bevorzugt, dass die Linkergruppe eine Hydroxyalkangruppe ist. Noch bevorzugter wird die Hydroxyalkangruppe um etwa 1 bis etwa 3 Carboxamidgruppen verlängert.
Eine weitere der bevorzugten, von der vorliegende Erfindung umfassten Zusammensetzungen ist Cyclosporin A, das am Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 über die Linkergruppe der Formel (II) an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase gebunden ist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Cyclosporin, das gegebenenfalls über eine Linkergruppe an einem der Alanin-Stickstoffatome, die Teil des zyklischen Gerüsts von Cyclosporin sind, an einen organischen Rest konjugiert ist. Das Verfahren beinhaltet die folgenden Schritte:
a) Reaktion eines gegebenenfalls geschützten Cyclosporins mit einer Base, die ausreichend basisch ist, um ein sekundäres Amid zu deprotonieren,
b) Reaktion der Verbindung aus a) mit einem Alkylierungsmittel, um ein Cyclosporin zu bilden, das an einem seiner Amid-Stickstoffatome seines zyklischen Gerüsts mit einer Linkergruppe konjugiert ist,
c) gegebenenfalls die Verlängerung der Linkergruppe der Verbindung aus b) durch Addition von Carboxamidgruppen, um ein Cyclosporin zu bilden, das an einem seiner Amid- Stickstoffatome seines zyklischen Gerüsts mit der Carboxamid verlängerten Linkergruppe konjugiert ist,
d) Entfernung jeglicher Schutzgruppen von den Verbindungen aus b) und c), um ein Cyclosporin zu bilden, das an einem seiner Amid-Stickstoffatome seines zyklischen Gerüsts mit einer Linkergruppe oder Carboxamid verlängerten Linkergruppe (Cyclosporin- Linkergruppe-Konjugat) konjugiert ist,
e) gegebenenfalls die Aktivierung einer funktionellen Gruppe am Cyclosporin-Linkergruppe-Konjugat aus d), um ein Cyclosporin zu bilden, das an einem seiner Amid-Stickstoffatome seines zyklischen Gerüsts mit einer aktivierten Linkergruppe (Cyclosporin-Aktivlinkergruppe-Konjugat) konjugiert ist und
f) gegebenenfalls die Reaktion des Cyclosporin-Aktivlinkergruppe-Konjugats aus e) mit einem kleinen organischen Molekül oder einer Verbindung mit einem Molekulargewicht über 2.000, um ein Cyclosporin zu bilden, das an einem seiner Amid-Stickstoffatome seines zyklischen Gerüsts, gegebenenfalls über eine Linkergruppe mit einem organischen Rest konjugiert ist, worin der organische Rest ein Rest eines kleinen organischen Moleküls oder eine Gruppe mit einem Molekulargewicht über 2.000 ist.
Vorzugsweise ist die Schutzgruppe in a) eine Hydroxyschutzgruppe, die unter stark basischen Bedingungen stabil, jedoch unter anderen, schonenden Bedingungen leicht entfernbar ist. Solche Gruppen sind gut fachbekannt und werden nicht im Detail angeführt. Eine detaillierte Rezitation solcher Gruppen und die notwendigen Bedingungen für deren Darstellung und spätere Entfernung finden sich bei T. W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley-Intersciences, NY (1981), Seite 1, Absatz 1 und Seiten 10- 72 sowie J. F. W. McOmie (Hrsg.), "Protective Groups in Organic Synthesis", Plenum Press, NY (1973), Seiten 96-120. Solche Gruppen umfassen Methyl, t-Butyl, Allyl, Benzyl, Triarylmethyl, Silyl und Tetrahydropyranylether; Acetale, Ketale, Acetate, Benzoate, p-Nitrobenzoate, Formiate; Trifluor-, Chlor-, Methoxy- und Phenoxyacatate; Carbonate und dergleichen. Noch bevorzugter basiert die Schutzgruppe auf einem Alkylsilan. Noch bevorzugter ist es ein Trimethylsilyl. Trimethylsilyl-(TMS-)geschütztes CsA (TMS- CsA) ist in Formel (XXV) gezeigt.
Silylierungsreaktionen (im Detail beschrieben im eingeschlossenen Material von Greene auf den Seiten 39-50) werden typischerweise in Lösungsmittelgemischen, wie z. B. einem Amin/Haloalkan-Gemisch durchgeführt. Vorzugsweise ein Trialkylamin oder Pyridin, vermischt mit Dichlormethan, noch bevorzugter Pyridin/Dichlormethan. Die Reaktion wird in inerter Atmosphäre, wie z. B. Stickstoff, Argon, Helium oder dergleichen, durchgeführt. Die Reaktion benötigt typischerweise zwischen 1 Minute und 24 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 18 Stunden. Die Reaktionstemperaturen liegen zwischen -10ºC und 100ºC, vorzugsweise 0ºC und 50ºC, noch bevorzugter 20ºC und 25ºC.
Vorzugsweise ist die Base in Schritt a) von ausreichender Basenstärke, um ein sekundäres Amin zu deprotonieren, das Teil einer Polyaminosäure ist. Solche Basen sind gut fachbekannt und werden nicht im Detail angeführt. Vorzugsweise ist die Base ein Alkalimetallanion (Gruppe 1A-Salz eines Hydrids oder organischen Anions), wie z. B. ein Metallhydrid, -alkyl oder -amid, einschließlich Methyllithium, Butyllithium, Lithiumhydrid, Lithiumdiisopropylamid, Lithiumcyclohexylisopropylamid oder dergleichen. Noch bevorzugter ist die Base eine Metallhydridbase, wie z. B. Natrium- oder Kaliumhydrid.
Die Deprotonierungsreaktion wird bei -78ºC bis 100ºC, vorzugsweise -10ºC bis 40ºC, noch bevorzugter 0ºC bis 20ºC, durchgeführt. Das Lösungsmittel für solche Reaktionen ist ein inertes organisches Lösungsmittel, wie z. B. aliphatische Kohlenwasserstoffe und aromatische Kohlenwasserstoffe, z. B. Benzol, Toluol oder Hexan. Gegebenenfalls wird dem Lösungsmittel ein geeigneter Metallionen-Chelatbildner zur Komplexierung der Gruppe 1A-Kationen zugesetzt, wie z. B. ein Kronenether, eine β-Dicarbonylverbindung oder ein Polyalkylenoxid. Vorzugsweise wird ein Kronenether, wie z. B. 18-Krone-6 oder 15-Krone-5, in einem aromatischen Lösungsmittel verwendet, noch bevorzugter wird 15-Krone-5-Ether in Toluol verwendet. Die Reaktion wird typischerweise in inerter Atmosphäre durchgeführt, und zwar zwischen 1 Minute und 24 Stunden, vorzugsweise 10 Minuten und 12 Stunden, noch bevorzugter 10 Minuten und 2 Stunden, lang.
Vorzugsweise ist die Alkylierungsgruppe von b) ein α-Haloalkylbenzoesäureester oder ein Epoxid.
Noch bevorzugter hat die Alkylierungsgruppe, falls die herzustellende Verbindung eine Carboxybenzyl-Linkergruppe besitzt, die Formel (XXVI).
R&sub1; und R&sub2; in Formel (XXVI) sind beide unabhängig voneinander H oder Alkyl mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise H oder Methyl, noch bevorzugter H.
G&sub1; in Formel (XXVI) ist ein Halogenatom, vorzugsweise Brom, Chlor oder Iod, noch bevorzugter ein Bromatom.
T&sub2; in Formel (XXVI) ist O, S oder NR&sub3;, worin R&sub3; H oder Alkyl mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen ist, vorzugsweise O oder S, noch bevorzugter O.
Der Wert von k&sub1; in Formel (XXVI) beträgt 1 bis etwa 4, vorzugsweise bis etwa 2, noch bevorzugter ist k&sub1; = 1.
G&sub2; in Formel (XXVI) ist OR&sub4; oder SR&sub5;, worin R&sub4; und R&sub5; Schutzgruppen für die entsprechenden Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefel-Carbonylfunktionen sind, die abhängig von der Natur von T- und G gewählt werden. Schutzgruppen für diese funktionellen Gruppen werde beschrieben in T. W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley-Interscience, NY (1981), Seite 1, Absatz 1, Seiten 154-192, 209-210 und 249- 278, und sind hierin durch Verweis aufgenommen; sowie J. F. W. McOmie (Hrsg.), "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, NY (1973), Seiten 183-210, 286- 295 und 404-412, hierin durch Verweis aufgenommen; und werden hier nicht im Detail angeführt. Vorzugsweise ist G&sub2; OR&sub4;, worin R&sub4; Alkyl mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen ist, noch bevorzugter ist R&sub4; Methyl.
Noch bevorzugter ist das Alkylierungsmittel, falls die herzustellende Verbindung eine Carboxybenzyl-Linkergruppe besitzt, ein o- oder p-α-Halomethylbenzoesäurealkyl- (mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen) Ester. Vorzugsweise ist das Produkt der Alkylierung mit dem α-Halomethylbenzoesäurealkylester ein Cyclosporin, das an einem der Alanin-Aminosäureatome der Aminosäurereste Nr. 7 und 8 von Cyclosporin mit einer o- oder p-Carboxybenzylalkylester-Gruppe konjugiert ist.
Noch bevorzugter hat die Alkylierungsgruppe, falls die herzustellende Verbindung eine Hydroxyalkan-Linkergruppe besitzt, die Formel (XXVII).
R&sub6;, R&sub7;, R&sub7; und R&sub9; in Formel (XXVII) sind alle unabhängig voneinander H, Alkyl mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise H oder Methyl, noch bevorzugter H.
Noch bevorzugter ist das Alkylierungsmittel, falls die herzustellende Verbindung eine Hydroxyalkan-Linkergruppe besitzt, ein Alkylepoxid mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Etylenoxid, Propylenoxid und dergleichen. Vorzugsweise ist das Produkt der Alkylierung mit Ethylenoxid ein Cyclosporin, das an einem der Alanin-Aminosäureatome des Aminosäurerestes Nr. 7 mit einer Kette von zwei Kohlenstoffatomen, terminiert von einer Hydroxylgruppe, konjugiert ist.
Das Alkylierungsreagens wird dem Reaktionsgemisch typischerweise nach der oben für die Deprotonierung beschriebenen Zeit zugesetzt. Nach Zusatz des Alkylierungsmittels wird die Reaktion zwischen 1 Minute und 48 Stunden, vorzugsweise 1 Stunde und 36 Stunden, noch bevorzugter 12 Stunden und 24 Stunden, lang fortgesetzt.
Vorzugsweise ist der optionale Carboxamid-Kettenverlängerungsschritt c) ein Standardverfahren der Polyaminosäuresynthese. Solche Schritte sind im Fach allgemein üblich und werden nicht im Detail angeführt. Eine Zusammenfassung solcher Schritte findet sich bei A. White et al., "Principles of Biochemistry", McGraw-Hill, NY (1978), Seiten 92-95, die hierin durch Verweis aufgenommen ist.
Im Allgemeinen werden jegliche Amino-, Hydroxyl-, Carboxyl- oder anderen Gruppen, die nicht umgesetzt werden, geschützt (wie in den oben zitierten Arbeiten von Greene und McOmie beschrieben). Schutzgruppen umfassen Benzyloxycarbonyl, Triphenylmethyl, tert-Butyloxycarbonyl, Phthaloyl, Trifluoracetyl, Benzyl, p-Toluolsulfonyl, gesättigtes Niederalkyl, Benzylester, tert-Butylester, Acetyl und dergleichen. Die umzusetzende, ungeschützte Carboxylgruppe wird durch Reaktion mit einem Kopplungsreagens aktiviert, um eine aktivierte Estergruppe zu bilden. Solche Kopplungsreagenzien umfassen Dicyclohexylcarbodiimid (DDC), Isobutylchlorformiat, N,N'-Carbonyldiimidazol, p- Nitrophenol/DDC und dergleichen. Der aktivierte Ester wird dann mit einer Aminoverbindung zur Reaktion gebracht, um die Carboxamid-kettenverlängerte Verbindung von c) zu bilden.
Noch bevorzugter beinhaltet der Carboxamid-Kettenverlängerungsschritt die Reaktion der Verbindung aus b) mit einem Isocyanat oder Thioisocyanat. Typischerweise wird die Verbindung, bei der die Kette verlängert werden soll, mit einem organometallischen Katalysator zur Reaktion gebracht, wie z. B. mit einem Alkylmetallalkoxid in einem aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, und ein gesättigter Alkyl- (mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen) Ester von Isocyanat oder Thioisocyanat wird zugesetzt. Vorzugsweise ist der Katalysator ein Trialkylzinn-Komplex, noch bevorzugter Tributylzinnethoxid. Die bevorzugten Lösungsmittel sind aromatische Kohlenwasserstoffe, noch bevorzugter Toluol. Vorzugsweise ist das Carboxamid-kettenverlängernde Reagens ein Isocyanatmethylester, wie z. B. β-Alaninisocyanatmethylester, Methylglykonatisocyanat und dergleichen.
Ein alternativer, noch bevorzugterer Carboxamid-Kettenverlängerungsschritt beinhaltet die Reaktion der Verbindung von b) unter den unten beschriebenen Bedingungen für den Konjugationsschritt. Vorzugsweise wird die Verbindung, bei der die Kette verlängert werden soll, mit einem unten beschriebenen, aktivierenden Reagens zur Reaktion gebracht, und der aktivierte Ester wird mit oder ohne Reinigung mit der Carboxamid-kettenverlängernden Einheit, vorzugsweise einer Aminosäure oder Polyaminosäure, noch bevorzugter einer unsubstituierten Aminosäure, wie z. B. Glycin, Alanin, Valin, Leucin oder Isoleucin, oder daraus aufgebauten Polyaminosäuren mit etwa 2 bis 10 Resten zur Reaktion gebracht, noch bevorzugter ist die kettenverlängernde Einheit aus der 2-Aminosäuren-Einheit von Glycyl-Glycin aufgebaut.
Es kann jede beliebige Anzahl von geeigneten Kettenverlängerungsschritten nacheinander durchgeführt werden, um verschiedenste Längen von Carboxamid verlängerten Ketten zu erhalten.
Der Schutzgruppenentfernungsschritt von d) wird basierend auf der oben im Detail beschriebenen Schutzgruppe gewählt. Die oben zitierte und aufgenommene Literatur beschreibt die Bedingungen und Reagenzien zur Entfernung der bevorzugten Schutzgruppen.
Typischerweise beinhaltet die Schutzgruppenentfernung wässrige Hydrolyse bei einem pH von etwa 2-12, vorzugsweise 3-11, noch bevorzugter 4-10, in Wasser bei etwa 5- 95ºC, vorzugsweise 10-40ºC, noch bevorzugter 20-25ºC. Optionale Hydrolysekatalysatoren umfassen Säuren oder Basen, vorzugsweise HCl, H&sub2;SO&sub4;, K&sub2;CO&sub3; oder KHCO&sub3;, noch bevorzugter HCl oder K&sub2;CO&sub3;. Gegebenenfalls kann ein organisches Co-Lösungsmittel verwendet werden, typischerweise ein protisches Lösungsmittel, vorzugsweise ein Alkohol, noch bevorzugter Methanol.
Eine alternative bevorzugte Reaktion der Schutzgruppenentfernung beinhaltet die Behandlung mit einer Quelle von Fluoridionen, wie z. B. HF oder ein organisches Fluoridsalz, vorzugsweise ein quaternäres Ammoniumfluorid, noch bevorzugter ein Tetraalkylammoniumfluorid. Die Reaktion wird bei den oben beschriebenen Temperaturen in einem inerten organischen Lösungsmittel durchgeführt, vorzugsweise einem Ether, noch bevorzugter Diethylether oder Tetrahydrofuran.
Die Verfahren der Carboxamid-Kettenverlängerung, wie sie oben beschrieben sind, sind auch für die Aktivierungs- und Konjugationsschritte von e) und f) von Nutzen.
Vorzugsweise werden die Aktivierungs- und Konjugationsschritte von e) und f) wie im Fach üblich durchgeführt. Beispielsweise enthält E. T. Maggio, "Enzyme-Immunoassay", CRC-Press, Boca Rota, FL (1980), Kapitel 4, eine Zusammenstellung solcher Techniken; die Seiten 81-86 sind hierin durch Verweis hierin aufgenommen.
Noch bevorzugter wird das Cyclosporin-Linkergruppe-Konjugat durch eine Reaktion mit einem Aktivierungsreagens aktiviert, wie z. B. Alkyl- (mit weniger als etwa 9 Kohlenstoffatomen) chlorformiat, z. B. Isobutylchlorformiat; Dialkylcarbodiimid, z. B. Dicyclohexylcarbodiimid; 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC), 1-Cyclohexyl-3-(2- morpholino-4-ethyl)carbodiimid-methyl-p-toluolsulfonat (CMC), N-Hydroxysuccinimid (NHS)/EDAC, N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS)/EDAC und dergleichen, in einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. DMF und dergleichen. Die Aktivierungsreaktion wird typischerweise bei -10 bis 100ºC, vorzugsweise bei 0-30ºC, noch bevorzugter bei 0-10ºC durchgeführt, vorzugsweise unter einer Atmosphäre von Stickstoff, Helium, Argon und dergleichen. Die Aktivierungsreaktion wird 1 Minute bis 10 Tage, vorzugsweise 1 Stunde bis 2 Tage, noch bevorzugter 6-18 Stunden, lang durchgeführt. Nach der Aktivierungsreaktion wird die aktive Verbindung einer Lösung des kleinen organischen Moleküls oder der Verbindung mit einem Molekulargewicht über 2.000 in einem organischen oder organischen/wässrigen Lösungsmittel, wie z. B. DMF oder DMF/Borat-Puffer und dergleichen, zugegeben. Die Zugabe kann über einen Zeitraum erfolgen und dauert typischerweise 1 Minute bis 12 Stunden, vorzugsweise 10 Minuten bis 8 Stunden und noch bevorzugter 30 Minuten bis 3 Stunden. Nach der Zugabe wird die Lösung 1 Minute bis 2 Tage, vorzugsweise 10 Minuten bis 1 Tag, noch bevorzugter 1 bis 18 Stunden, lang gerührt.
Das Produkt wird dann gegebenenfalls - falls erforderlich - gereinigt. Die Reinigung und Charakterisierung von Polyaminosäure-Hapten-Konjugaten ist im Detail beschrieben worden: Maggio et al., "Enzyme-immunoassay", CRC-Press, Boca Rota, FL (1980), Kapitel 4; die Seiten 86-88 sind hierin durch Verweis aufgenommen. Beispielsweise kann, falls das Konjugat ein Cyclosporin-immunogener-Träger-Konjugat oder ein Cyclosporin- Enzym-Konjugat ist, die Reinigung durch Dialyse gegen wässrig/organische und wässrige Lösungen, wie z. B. Wasser/DMF oder Wasser, oder durch Gelfiltrationschromatographie auf Trägerstoffen, wie z. B. Sephadex und dergleichen, erfolgen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst Antikörper, die als Reaktion auf ein Immunogen erzeugt werden, das Cyclosporin ist, welches an einem Alanin-Stickstoffatom des zyklischen Gerüsts von Cyclosporin mit einem immunogenen Träger konjugiert ist. Darüber hinaus umfasst die vorliegende Erfindung Konjugate solcher Antikörper mit einem Marker.
Vorzugsweise werden die Antikörper gegen Cyclosporin A hergestellt, das gegebenenfalls über eine Linkergruppe mit weniger als etwa 50 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, vorzugsweise weniger als etwa 35 Atome, die nicht Wasserstoff sind, noch bevorzugter weniger als etwa 20 Atome, die nicht Wasserstoff sind, und einer Kette von nicht mehr als etwa 35, vorzugsweise etwa 25, noch bevorzugter etwa 15 Atomen Länge, an den Alanin-Stickstoffatomen der Cyclosporin A-Aminosäurereste Nr. 7 und/oder 8 mit einem immunogenen Träger konjugiert ist.
Ein Antikörper ist ein Immunglobulin, das spezifisch bindet und dadurch als komplementär zu einer bestimmten räumlichen und polaren Anordnung eines anderen Moleküls definiert ist. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und kann mittels gut fachbekannter Verfahren hergestellt werden, wie z. B. durch Immunisierung eines Wirts und Gewinnung von Seren, aus denen Immunglobulin mittels bekannter Verfahren isoliert werden können (polyklonal), durch Herstellung kontinuierlicher Hybridzelllinien und Gewinnung des sekretierten Proteins (monoklonal) oder durch Klonierung und Expression von Nukleotidsequenzen oder mutagenisierter Versionen davon, die zumindest für die zur spezifischen Bindung von natürlichen Antikörpern benö tigten Aminosäuresequenzen kodieren. Antikörper können ein vollständiges Immunglobulin oder ein Fragment davon umfassen, wobei solche Immunglobuline die verschiedenen Klassen und Isotypen umfassen, wie z. B. IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3, IgM usw. Fragmente davon können Fab, Fv und F(ab')&sub2;, Fab' und dergleichen umfassen.
Monoklonale Antikörper können durch den von Milstein und Kohler diskutierten und in Nature 256, 495-7 (1995), berichteten Prozess hergestellt werden. Die Einzelheiten dieses Prozesses sind gut bekannt und werden hier nicht beschrieben. Grundsätzlich jedoch beinhaltet er die Injektion eines Immunogens in einen Wirt, für gewöhnlich eine Maus oder ein anderes Tier. Zellen werden dann der Milz des Tieres entnommen. Alternativ dazu kann der Wirt aus unsensibilisierten Milzzellen bestehen, die in vitro gegen ein Immunogen sensibilisiert werden. Die resultierenden Zellen werden mit Myelomzellen fusioniert. Das Ergebnis ist eine Hybridzelle, die als "Hybridem" bezeichnet wird und in vitro kultiviert werden kann. Die Population von Hybridomen wird gescreent und manipuliert, so dass einzelne Klone isoliert werden können, wovon jeder einen eigenen Antikörper gegen das Antigen sekretiert.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung ist fähig, Cyclosporin und nahe verwandte Verbindungen, welche die unmodifizierte 9-Kohlenstoff-Aminosäure an Position 1 (CsA- Nummerierung) enthalten, spezifisch zu erkennen.
Konjugate der Antikörper der vorliegenden Erfindung mit einem Marker können durch bereits oben beschriebene Verfahren für die Konjugation von Polyaminosäuren an Cyclosporin-Gruppen hergestellt werden. Die Aktivierung des Cyclosporin-Linkergruppe- Konjugats wird wie oben beschrieben durchgeführt.
Vorzugsweise ist der pH eines Marker-Konjugat-Reagens optimiert, um mit der Aktivität und Stabilität des Markerkonjugats und jeglichen anderen Betrachtungen zu harmonisieren.
In einer ihrer bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Cyclosporin-G6PDH-Konjugat-Reagenzien, worin der pH 6-10, vorzugsweise 7-9, noch bevorzugter 7,5-8,5, beträgt.
Vorzugsweise ist der pH des Antikörper-Reagens optimiert, um die Stabilität und Präzision der Testreagenskomponenten zu maximieren.
In einer ihrer bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Cyclosporinantiköper-Reagenzien, worin der pH 4-7, vorzugsweise 5-6, noch bevorzugter 5,25-5,85, beträgt.
Oberflächenaktive Additive, einschließlich Volumsfüller, wie z. B. BLG und PEG; Entschäumer und Tenside, wie z. B. Tween 20, Plurafax A38, Triton X-100, Pluronic 25R2, RSA, BSA, Mod-u-cyte, Sol-u-pro oder dergleichen, und andere Materialien, die für gewöhnlich im Fach verwendet werden, können sowohl Antikörper-, als auch Markerkonjugat-Reagenzien zugesetzt werden. Oberflächenaktive Additive können zugesetzt werden, um hydrophobe oder weniglösliche Verbindungen in Lösung zu halten, Testreagens-Komponenten zu stabilisieren oder Testreagens-Aktivität zu optimieren.
Vorzugsweise werden oberflächenaktive Additive den Antikörper-Reagenzien zugesetzt, um Cyclosporin in Lösung zu halten, wenn das Antikörper-Reagens zur Probe zugegeben wird, in der Cyclosporin vermutet wird.
In einer ihrer bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Cyclosporinantikörper-Reagenzien, die ein(en) oder mehrere Volumsfüller, Tenside und/oder Entschäumer enthalten.
Vorzugsweise werden oberflächenaktive Additive den Markerkonjugaten zugesetzt, um Markerkonjugate während Lagerung und Verwendung in Lösung zu halten.
In einer ihrer bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Cyclosporin-G6PDH-Konjugat-Reagenzien, die ein oder mehrere Volumsfüller, Tenside und/ oder Entschäumer enthalten.
Antimikrobielle Mittel können den Testreagenzien zugesetzt werden, um die Lagerhaltbarkeit der Reagenzien zu verlängern. Im Fach gebräuchliche antimikrobielle Agenzien sind zweckdienlich. In einer ihrer insbesondere bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Cyclosporin-Testreagenzien, die antimikrobielle Mittel enthalten.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur Messung der Menge von Cyclosporin in Proben, in denen Cyclosporin vermutet wird. Die Antikörper und das Markerkonjugat der vorliegenden Erfindung können zur Messung der Menge von Cyclosporin in einer Probe, in der Cyclosporin vermutet wird, genützt werden. Der Test kann die Schritte von gegebenenfallser Behandlung der Probe, gefolgt von Kombinieren der Probe mit Antikörpern für Cyclosporin und Messung der Menge von Immunkomplexen der Antikörper mit Cyclosporin, entweder direkt oder indirekt, umfassen. Die Verbesserung, die dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert, ist die Nutzung der vorliegenden Antikörper als Antikörper für Cyclosporin. Die Immunkomplexe werden direkt oder indirekt delektiert, beispielsweise, wenn die angewendeten Antikörper an einen Marker konjugiert sind. Der Immunkomplex wird durch Untersuchung der Wirkung von Immunkomplexbildung in einem Testmedium auf ein signalproduzierendes System oder durch Anwendung eines markierten Rezeptors, der spezifisch an einen Antikörper der Erfindung bindet, direkt oder indirekt delektiert.
In einer weiteren Konfiguration eines Tests zur Bestimmung von Cyclosporin in einer gegebenenfalls vorbehandelten Probe, in der Cyclosporin vermutet wird, wird die Probe mit Antikörpern für Cyclosporin und einem Markerkonjugat dieser Erfindung, das von den Antikörpern erkannt wird, kombiniert. Das Verfahren umfasst weiters die entweder direkte oder indirekte Messung der Menge von Immunkomplexen des Markerkonjugats und der Antikörper. Cyclosporin, das gegebenenfalls über eine Linkergruppe mit weniger als etwa 50, vorzugsweise 35, noch bevorzugter 20 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, mit einer Kette von nicht mehr als etwa 35, vorzugsweise 25, noch bevorzugter 15 Atomen Länge, an einen Marker konjugiert ist, kann als Markerkonjugat verwendet werden.
Der Test der Erfindung findet Anwendung auf alle Immuntests für Cyclosporin. Der Test kann entweder ohne Abtrennung (homogen) oder mit Abtrennung (heterogen) jeglicher der Testkomponenten oder Produkte durchgeführt werden. Beispiele für heterogene Tests sind enzymgebundene Immuntests, wie z. B. Enzym-gebundene Immunosorptions- Assays (ELISA), siehe "Enzyme-Immungssay" von Edward T. Maggio, CRC-Press Incorporated, Boca Raton, Florida (1980). Beispielgebend für homogene Immuntests sind Mehrfach-Enzym-Immungssay-Tests (siehe z. B. US-A-3.817.837), Immunfluoreszenzverfahren, wie z. B. jene, die in US-A-3.993.345 offenbart sind, Enzym-Channeling-Techniken, wie z. B. jene, die in US-A-4.233.402 offenbart sind und andere Immuntests, wie sie von Maggio, s.o., beschrieben werden.
Die zu analysierende Probe kann vorbehandelt werden, um möglicherweise vorhandene Zellen zu lysieren, möglicherweise vorhandene Proteine zu fällen und/oder möglicherweise vorhandenes Cyclosporin zu solubilisieren. Es wird bevorzugt, dass die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu analysierenden Proben durch Kombinieren der Probe mit einem organischen Lösungsmittel vorbehandelt werden, vorzugsweise mit einem Alkohol, noch bevorzugter mit einem Alkohol mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methanol.
Der Test für den Analyten wird normalerweise in einem gepufferten wässrigen Medium bei mäßigem pH durchgeführt, im Allgemeinen jenem, der optimale Testempfindlichkeit ergibt.
Das wässrige Medium kann nur Wasser sein oder kann 0 bis 40 Vol.-% eines Co-Lösungsmittels enthalten. Der pH für das Medium liegt gewöhnlich im Bereich von etwa 4 bis 11, noch üblicher im Bereich von etwa 5 bis 10 und vorzugsweise im Bereich von etwa 6,5 bis 9,5. Der pH ist gewöhnlich ein Kompromiss zwischen optimaler Bindung der Bindungspartner jeglicher spezifischen Bindungspaare und dem optimalen pH für andere Reagenzien des Tests, wie z. B. Teile des signalproduzierenden Systems.
Verschiedenste Puffer können verwendet werden, um den gewünschten pH während der Bestimmung zu erzielen und beizubehalten. Veranschaulichende Puffer umfassen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dergleichen. Der jeweils eingesetzte Puffer ist nicht entscheidend für diese Erfindung, jedoch kann in einem bestimmten Test der eine oder andere Puffer bevorzugt werden.
Gemäßigte Temperaturen werden normalerweise angewendet, um den Test auszuführen und für gewöhnlich konstante Temperaturen während des Messzeitraums, insbesondere bei Ratenbestimmungen. Inkubationstemperaturen liegen normalerweise im Bereich von etwa 5ºC bis 45ºC, häufiger von etwa 15ºC bis 40ºC. Die Temperaturen während der Messungen liegen im Allgemeinen im Bereich von etwa 10ºC bis 50ºC, häufiger von etwa 15ºC bis 40ºC.
Die Konzentration des zu analysierenden Cyclosporins variiert im Allgemeinen von etwa 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;¹³ M, häufiger von etwa 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;&sup8; M. Betrachtungen, wie z. B. ob der Test qualitativ, semiquantitativ oder quantitativ ist (in Bezug auf die in der Probe vorhandenen Cyclosporinmenge), das jeweilige Detektionsverfahren und die Konzentration des Cyclosporins legen normalerweise die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien fest.
Während die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien im Testmedium im Allgemeinen durch den Konzentrationsbereich von Interesse des Cyclosporins bestimmt werden, wird die endgültige Konzentration jedes der Reagenzien normalerweise empirisch ermittelt, um die Empfindlichkeit des Tests über diesen Bereich zu optimieren. Das heißt, eine Variation der Konzentration von Cyclosporin, die von Signifikanz ist, sollte zu einer genau messbaren Signaldifferenz führen.
Obwohl die Reihenfolge des Zugabe breit variiert werden kann, bestehen bestimmte Bevorzugungen in Abhängigkeit von der Art des Tests. Die einfachste Reihenfolge der Zugabe ist das gleichzeitige Zugeben aller Materialien, um den Effekt zu bestimmen, den das Testmedium auf das Signal hat, wie in einem homogenen Test. Alternativ dazu können die Reagenzien nacheinander vereinigt werden. Gegebenenfalls kann im Anschluss an jede Zugabe ein Inkubationsschritt erfolgen, im Allgemeinen im Bereich von etwa 30 Sekunden bis 6 Stunden, häufiger von etwa 1 Minute bis 1 Stunde.
In einem homogenen Test wird, nachdem alle Reagenzien entweder gleichzeitig oder nacheinander vereinigt worden sind, das Signal bestimmt. Das Signal wird zur Menge von Cyclosporin in der Probe in Beziehung gesetzt. Beispielsweise wird in der Mehrfach-Enzym-Immungssay-Technik, wie in US-A-3.817.837 (1974) für die Bestimmung von Cyclosporin beschrieben, eine Probe, in der Cyclosporin vermutet wird, in einer wässrigen Lösung entweder gleichzeitig oder nacheinander mit einem Antikörper der vorliegenden Erfindung und einem Cyclosporin-Enzymkonjugat der vorliegenden Erfindung vereinigt.
Im Allgemeinen wird ein Substrat für das Enzym zugesetzt, was im Zuge der enzymkatalysierten Reaktion zur Bildung eines chromogenen oder fluorogenen Produkts führt. Vorzugsweise ist das Cyclosporin-Enzymkonjugat Cyclosporin A, das gegebenenfalls über eine Linkergruppe mit weniger als etwa 50 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, vorzugsweise weniger als etwa 35 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, noch bevorzugter weniger als etwa 20 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, mit einer Kette von nicht mehr als etwa 35, vorzugsweise 25, noch bevorzugter 15 Atomen Länge, am Alanin- Stickstoffatom von Cyclosporin-Aminosäurerest Nr. 7 an ein Enzym konjugiert ist. Ein besonders bevorzugtes Enzym ist Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase. Das Cyclosporin in der Probe und das Cyclosporin-Enzymkonjugat konkurrieren um Stellen am Antikörper. Die Enzymaktivität im Medium wird dann für gewöhnlich auf spektralphotometrische Weise bestimmt und mit der Enzymaktivität verglichen, die bestimmt wird, wenn eine Eich- oder Vergleichsprobe getestet wird, in der eine bekannte Menge an Cyclosporin vorliegt. Typischerweise wird die Eich- oder Vergleichsprobe im Wesentlichen auf dieselbe Weise getestet wie die Probe, in der Cyclosporin vermutet wird. Im Allgemeinen kann ein Vergleich des Ergebnisses einer unbekannten Probe und den Ergebnissen von Tests mit mehreren Standardproben angestellt werden. Die Standardproben enthalten typischerweise unterschiedliche. Jedoch bekannte Konzentrationen des zu bestimmenden Cyclosporin-Analyten. Vorzugsweise umfassen die in den Standardproben vorliegenden Konzentrationsbereiche den Bereich der vermuteten Analytkonzentration in unbekannten Proben.
Heterogene Tests umfassen üblicherweise einen oder mehrere Trennschritte. Der heterogene Test kann kompetitiv oder nicht-kompetitiv sein. Im kompetitiven Test kann der Antikörper der Erfindung an einen Trägerstoff gebunden sein, der dann mit einem Medium vereinigt wird, welche Probe und Cyclosporin, das an einen detektierbaren Marker, wie z. B. ein Enzym, am Alanin-Stickstoffatom des zyklischen Gerüsts von besagtem Cyclosporin konjugiert ist, enthält. Cyclosporin in der Probe konkurriert mit dem Konjugat um Stellen am Trägerstoff-gebundenen Antikörper. Nach der Trennung von Trägerstoff und Medium, kann die Markeraktivität des Trägerstoffs oder Mediums mittels gebräuchlicher Techniken bestimmt werden und wird zur Menge von Cyclosporin in der Probe in Beziehung gesetzt.
In einer weiteren kompetitiven heterogenen Vorgehensweise wird ein Antikörper der Erfindung an einen Trägerstoff gebunden. Ein Medium wird hergestellt, das eine Probe mit vermutetem Cyclosporin-Gehalt und Cyclosporin enthält, das am Alanin-Stickstoffatom des zyklischen Gerüsts besagten Cyclosporins an ein kleines organisches Molekül (Molekulargewicht kleiner als 2.000), wie z. B. Biotin, konjugiert ist. Vorzugsweise ist Cyclosporin A, gegebenenfalls über eine Linkergruppe mit weniger als etwa 50 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, vorzugsweise weniger als etwa 35 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, noch bevorzugter weniger als etwa 20 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, mit einer Kette von nicht mehr als etwa 35, vorzugsweise 25, noch bevorzugter 15 Atomen Länge, über das Alanin-Stickstoffatom von Cyclosporin A-Aminosäureresten Nr. 7 und/ oder 8 konjugiert. Cyclosporin und das Konjugat konkurrieren um die Antikörperstellen. Nach einer Zeitspanne wird der Trägerstoff vom Medium getrennt, gewaschen und mit einem zweiten Medium vereinigt, das einen Marker, wie z. B. enzymgebundenen Rezeptor oder Bindungspartner, für das kleine organische Molekül enthält. Wenn das kleine organische Molekül Biotin ist, kann der Trägerstoff mit Avidin, das an ein Enzym gebunden ist, vereinigt werden. Der Trägerstoff wird vom zweiten Medium getrennt und die Enzymaktivität von entweder Trägerstoff oder zweitem Medium mittels gebräuchlicher Verfahren bestimmt. Die Enzymaktivität wird mit der Menge Cyclosporin in der Probe in Beziehung gesetzt.
Ein Beispiel für eine nicht-kompetitive Vorgangsweise ist ein Sandwich-Test, der zwei Antikörper umfasst, wobei einer davon markiert und der weitere an einen Trägerstoff gebunden sein kann oder dazu gebracht werden kann, dass er sich an den Trägerstoff bindet.
In einem weiteren Aspekt kann Agglutination genützt werden, um das Vorliegen oder die Menge von Cyclosporin in einer Probe zu bestimmen. Antikörper, die als Reaktion auf Cyclosporin erzuegt wurden, das an einem Alanin-Stickstoffatom des zyklischen Gerüsts besagten Cyclosporins an einen immunogenen Träger konjugiert ist, können an Teilchen konjugiert werden. Vorzugsweise wird der Antikörper als Reaktion auf Cyclosporin hergestellt, das gegebenenfalls über eine Linkergruppe mit weniger als etwa 50 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, vorzugsweise weniger als etwa 35 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, noch bevorzugter weniger als etwa 20 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, mit einer Kette von nicht mehr als etwa 35, vorzugsweise 25, noch bevorzugter 15 Atomen Länge, am Alanin-Stickstoffatom der Cyclosporin-Aminosäurereste Nr. 7 und/oder 8 an einen immunogenen Träger konjugiert ist. Bevorzugte immunogene Träger umfassen KLH und BSA, noch bevorzugter KLH.
Ein weiteres Konjugat, dass im Agglutinations-Aspekt eingesetzt werden kann, ist Cyclosporin, das an einem Alanin-Stickstoffatom des zyklischen Gerüst besagten Cyclosporins an ein Teilchen konjugiert ist. Vorzugsweise ist Cyclosporin A, gegebenenfalls über eine Linkergruppe mit weniger als etwa 50 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, vorzugsweise weniger als etwa 35 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, noch bevorzugter weniger als etwa 20 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, mit einer Kette von nicht mehr als etwa 35, vorzugsweise 25, noch bevorzugter 15 Atomen Länge, am Alanin-Stickstoffatom der Cyclosporin-Aminosäurereste Nr. 7 und/oder 8 konjugiert.
In einer Variante dieses Agglutinations-Aspekts kann eine Probe, in der Cyclosporin vermutet wird, mit einem oben erwähnten Antikörper-Teilchen-Konjugat vereinigt werden. Nach einer geeigneten Inkubation kann das Ausmaß der Agglutination direkt bestimmt werden. Andererseits können die Teilchen vom Medium getrennt, gewaschen und mit einem Cyclosporin, das in der oben beschriebenen Weise an ein Teilchen konjugiert ist, vereinigt werden. Agglutination kann dann als Maß für die Menge von Cyclosporin in der Probe bestimmt werden. Die obige Beschreibung dient als Beispiel für nur zwei von vielen Agglutinationsvorschriften, die unter Verwendung der Verbindungen der Erfindung durchgeführt werden können.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Sets, die für die bequeme Durchführung des Testverfahrens der Erfindung zur Messung der Menge von Cyclosporin in einer Probe, in der Cyclosporin vermutet wird, zweckdienlich sind. Um die Vielseitigkeit der vorliegenden Erfindung zu erhöhen, können die Reagenzien in abgepackter Kombination bereitgestellt werden, und zwar im selben oder in getrennten Behältern, so dass das Verhältnis der Reagenzien wesentliche Optimierung von Verfahren und Test ermöglicht. Die Reagenzien könne jedes in getrennten Behältern oder es können verschiedene Reagenzien in einem oder mehreren Behältern vereinigt werden, und zwar in Ab hängigkeit von der Kreuzrekativität und Stabilität der Reagenzien. Das Set umfasst als ein Reagens einen Antikörper, der in Reaktion auf Cyclosporin hergestellt wurde, das am Alanin-Stickstoffatom des zyklischen Gerüsts von Cyclosporin an einen immunogenen Träger konjugiert ist. Vorzugsweise ist der als Reaktion auf Cyclosporin A hergestellte Antikörper, gegebenenfalls über eine Linkergruppe mit weniger als etwa 50 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, vorzugsweise weniger als etwa 35 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, noch bevorzugter weniger als etwa 20 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, mit einer Kette von nicht mehr als etwa 35, vorzugsweise 25, noch bevorzugter 15 Atomen Länge, am Alanin-Stickstoffatom der Cyclosporin A-Aminosäurereste Nr. 7 und/ oder 8 konjugiert. Bevorzugte immunogene Träger umfassen KLH und BSA, noch bevorzugter KLH. Dieser Antikörper kann markiert oder unmarkiert sein.
Das Set kann auch ein Cyclosporin umfassen, das am Alanin-Stickstoffatom des zyklischen Gerüsts von Cyclosporin an einen Marker konjugiert ist. Vozugsweise ist Cyclosporin A, gegebenenfalls über eine Linkergruppe mit weniger als etwa 50 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, vorzugsweise weniger als etwa 35 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, noch bevorzugter weniger als etwa 20 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, mit einer Kette von nicht mehr als etwa 35, vorzugsweise 25, noch bevorzugter 15 Atomen Länge, am Alanin-Stickstoffatom der Cyclosporin-Aminosäurereste Nr. 7 und/oder 8 konjugiert. Das Set kann weiters andere abgepackte Reagenzien für die Durchführung eines Tests umfassen, einschließlich Teile des signalproduzierenden Systems, Trägerstoffe, Nebenreagenzien und so weiter.
Ein Trägerstoff ist, wie oben in den Definitionen beschrieben, ein poröses oder nichtporöses, wasserunlösliches Material. Der Trägerstoff kann hydrophil sein oder hydrophiliert werden und umfasst anorganische Pulver, wie z. B. Silicamaterial, Magnesiumsulfat und Tonerde; natürliche Polymer-Materialien, insbesondere Cellulosematerialien und von Cellulose abgeleitete Materialien, wie z. B. faserenthaltende Papiere, z. B. Filterpapier, chromatographisches Papier, usw.; synthetische oder modifizierte, natürlich vorkommende Polymere, wie z. B. Nitrocellulose, Celluloseacetat, Polyvinylchlorid, Poly acrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen, Poly(4- methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Polyethylenterephthalat, Nylon, Polyvinylbutyrat, usw.: jeweils alleine oder in Verbindung mit anderen Materialien; Glas, Keramiken, Metalle und dergleichen.
Verschiedene Nebenmaterialien werden häufig in einem Test gemäß der vorliegenden Erfindung angewendet. Beispielsweise sind im Testmedium normalerweise Puffer vorhanden, sowie auch Stabilisatoren für das Testmedium und die Testkomponenten. Häufig können zusätzlich zu diesen Additiven zusätzliche Proteine eingeschlossen sein, wie z. B. Albumine oder Tenside, insbesondere nichtionische Tenside, Bindungsverstärker, wie z. B. Polyalkylenglykole oder dergleichen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegenden Erfindung Atiocyclosporin, das gegebenenfalls über eine Linkergruppe an einen Marker oder immunogenen Träger konjugiert ist.
Vorzugsweise ist das Atiocyclosporin aus einem Cyclosporin-Metaboliten gebildet, noch bevorzugter einem Cyclosporin A-Metaboliten, noch bevorzugter Cyclosporin A-Metabolit M-1.
Vorzugsweise ist die Linkergruppe eine Bindung oder eine Gruppe mit 1 bis 60 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, mit einer Länge von nicht mehr als etwa 30 Atomen Länge. Noch bevorzugter ist die Linkergruppe eine Gruppe mit 1 bis 10 Atomen, die nicht Wasserstoff sind, mit einer Kette von nicht mehr als etwa 5 Atomen Länge.
Der Marker und immunogene Träger ist aus derselben Gruppe gewählt wie die oben für Cyclosporin-Konjugate beschriebenen Marker und immunogenen Träger. Für Enzymtests ist der Marker ein Enzym. Vorzugsweise ist der Marker für einen homogenen Enzymimmuntest eine Dehydrogenase, noch bevorzugter Glucose-6-phosphat-Dehydroge nase. Vorzugsweise ist der immunogene Träger eine antigene Polyaminosäure, noch bevorzugter Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin.
In einer ihrer bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung der Formel:
worin R folgende Formel besitzt:
Z ist ein immunogener Träger, wie z. B. ein Protein, Polysaccharid, Lipoprotein, Glykoprotein und dergleichen, und ist vorzugsweise ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von über 2.000, noch bevorzugter ist Z Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin oder Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, und n ist eine Zahl von 1 bis zum Molekulargewicht von Z, dividiert durch 5.000.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper, die zur Erkennung von kreuzreaktivem Material in einem Test auf Cyclosporin fähig sind und so verhindern, dass das Material den Test stört. Vorzugsweise ist der Test einer der oben beschriebenen Tests.
Wie oben beschrieben ist das störende kreuzreaktive Material vorzugsweise ein Cyclosporin-Metabolit, noch bevorzugter eine Cyclosporin A-Metabolit, noch bevorzugter Cyclosporin A-Metabolit M1.
Die Antikörper dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung stören den Test zur Messung der Menge an Cyclosporin nicht. Daher binden sich die Antikörper an das störende kreuzreaktive Material, sind jedoch im Wesentlichen nicht fähig, Cyclosporin oder Cyclosporin-Marker-Konjugate unter den Testbedingungen zu binden. Vorzugsweise binden die Antikörper an Cyclosporin A-Metaboliten, die noch den Undecapeptidring enthalten, binden im Wesentlichen nicht an Cyclosporin A und inhibieren im Wesentlichen nicht die Aktivität von Cyclosporin-Enzym-Konjugaten.
In einer ihrer bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegenden Erfindung Antikörper, die als Reaktion auf eine Zusammensetzung der folgenden Formel gebildet werden:
worin R die folgende Formel besitzt:
Z ist ein immunogener Träger, wie z. B. ein Protein, Polysaccharid, Lipoprotein, Glykoprotein und dergleichen und ist vorzugsweise ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von über 2.000, noch bevorzugter ist Z Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin und n ist eine Zahl von 1 bis zum Molekulargewicht von Z, dividiert durch 5.000. Diese Antikörper sind fähig zur Bindung an Cyclosporin A-Metabolit M1, erkennen im Wesentlichen nicht Cyclosporin A und inhibieren im Wesentlichen nicht die Aktivität von Cyclosporin A, das gegebenenfalls über eine Linkergruppe am Alanin-Stickstoffatom von Cyclosporin A-Aminosäurerest Nr. 7 an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase konjugiert ist. Die zur Erkennung von störendem, kreuzreaktiven Material fähigen Antikörper können durch das oben beschriebene Verfahren für Cyclosporin-erkennende Antikörper hergestellt werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegenden Erfindung Verfahren zur Herstellung von Atiocyclosporin, das gegebenenfalls über eine Linkergruppe an einen immunogenen Träger oder einen Marker konjugiert ist.
Das Verfahren zur Herstellung dieser Konjugate umfasst die folgenden Schritte:
(a) Oxidative Spaltung eines Cyclosporin-Metaboliten an der olefinischen Seitenkette des Aminosäurerests Nr. 1;
(b) gegebenenfalls Verlängerung des Produkts aus a) um ein Atiocyclosporin-Linkergruppe-Konjugat zu bilden,
(c) Aktivierung des Produkts aus b) für die Konjugation und
(d) Bildung des Konjugats durch Reaktion des aktivierten Produkts aus c) mit einem Marker oder immunogenen Träger.
Vorzugsweise spaltet die oxidative Spaltungsreaktion in Schritt a) eine oder mehrere Bindung(en), welche die Kohlenstoffatome Nr. 6 und 7 des Aminosäurerests Nr. 1 eines Cyclosporin-Metaboliten verbinden. Die Spaltungsreaktion erzeugt eine funktionelle Gruppe am Kohlenstoffatom Nr. 6. Diese funktionelle Gruppe ist eine beliebige funktionelle Gruppe, wie z. B. Hydroxy, Keto, Aldehyd, Carbonsäure, Amino, Imido, Sulfid, Disulfid oder dergleichen, die verwendet werden können, um entweder unter Bildung von Atiocyclosporin-Linkergruppe-Konjugat die Seitenkette zu verlängern oder um das Atiocyclosporin direkt über eine Bindung an einen immunogenen Träger oder Marker zu konjugieren.
Noch bevorzugter erzeugt die oxidative Spaltungsreaktion eine Atiocyclosporin-Carboxaldehyd. Zwei beispielhafte Spaltungsreaktionen dieser Art sind Ozonolyse und Periodatspaltung. Periodatspaltung von 1,2-Diolen, die ihrerseits durch Epoxidierung/Ring- Öffnung von Doppelbindungen hergestellt werden, ist im Detail beschrieben worden (G. Dryhurst, "Periodate oxidation of diol and other functional groups", Pergamon Press, New York (1970)). Ozonolyse von Doppelbindungen ist auch im Detail beschrieben worden ("Ozone Chemistry and Technology", American Chemical Society, Washington, D.C. (1959); F. R. May D, "Oxidation of Organic Compounds", American Chemical Society, Washington, D. C. (1967); R. L. Augustdine et al., "OXidation", Marcel Dekker, New York (1971)).
Noch bevorzugter ist die Spaltungsreaktion eine Lösungsphasen-Ozonolyse, gefolgt von reduktiver Aufarbeitung. Bevorzugte Lösungsmittel für die Reaktion umfassen Haloalkane, wie z. B. Dichlormethan. Die Temperatur der Reaktion beträgt -100ºC bis 10ºC, vorzugsweise -78ºC bis -50ºC. Das Ozon wird in einem Gasstrom in die Reaktion eingeleitet, vorzugsweise Sauerstoff oder Luft, noch bevorzugter Sauerstoff. Die Reaktion wird fortgesetzt bis die Lösung die charakteristische blaue Farbe von Ozon zeigt. Überschüssiges Ozon wird dann aus der Lösung entfernt, vorzugsweise durch Spülung mit einem inerten Gas. Die Temperatur des Reaktionsgemischs wird auf weniger als 30ºC, vorzugsweise weniger als 0ºC, noch bevorzugter weniger als -10ºC erhöht. Ein Reduktionsmittel wird dann zugesetzt, um das fertige Aldehydprodukt zu erzeugen. Vorzugsweise ist das Reduktionsmittel ein Dialkylsulfid, noch bevorzugter Dimethylsulfid.
Die Kettenverlängerungsreaktion b) kann jegliche der oben für die Verlängerung der Linkergruppen von Cyclosporin-Molekülen beschriebenen Reaktionen sein. Vorzugsweise ist die Reaktion b) eine Aldehydverlängerungsreaktion. Noch bevorzugter wird die Verlängerung durch Reaktion eines Atiocyclosporin-Carboxaldehyds mit einer Aminooxylalkansäure erzielt.
Vorzugsweise ist die Aminooxyalkansäure das HCl-Salz von Aminooxyessigsäure. Die Reaktion wird in einem Alkanol-Lösungsmittel durchgeführt, vorzugsweise einem Niederalkanol-Lösungsmittel, noch bevorzugter Methanol. Diese Reaktion wird zwischen 0ºC und 100ºC durchgeführt, vorzugsweise 20ºC und 50ºC, noch bevorzugter bei Raumtemperatur. Diese Reaktion wird unter einer inerten Atmosphäre zwischen 1 min und 24 h, vorzugsweise 10 min und 10 h, noch bevorzugter 1 h und 2 h, lang durchgeführt.
Die Aktivierungsreaktion in c) wird wie oben für die Aktivierung von Cyclosporin-Linkergruppe-Konjugaten beschrieben durchgeführt, vorzugsweise umfasst die Aktivierungsreaktion eine Behandlung mit Sulfo-NHS.
Die Konjugationsreaktion in d) wird wie oben für die Konjugationsreaktion von Cyclosporin-Linkergruppe-Konjugaten beschrieben durchgeführt, vorzugsweise umfasst die Konjugationsreaktion die Behandlung eines aktivierten Esterprodukts aus Schritt c) mit einer Polyaminosäure.
In einer ihrer bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung (4) in Schema I. Schritt a) in Schema I ist die Spaltung von Cyclosporin A-Metabolit M1 (Verbindung (1), Schema I) mit Ozon, gefolgt von Dimethylsulfid-Aufarbeitung. Schritt b) in Schema I ist die Kettenverlängerung von Verbindung (2) durch Behandlung mit dem HCl-Salz von Aminooxyessigsäure, was Verbindung (3). Schritt c) in Schema I ist die Aktivierung von Verbindung (3) mit Sulfo- NHS, wasr Bildung eines aktivierten Esters. Schritt d) in Schema I ist die Kopplung des aktivierten Esterprodukts aus Schritt c) mit Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin oder Glucose-6-phosphat, wasr bevorzugten Verbindung (4). Schema
KLH = Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Inaktivierung von störendem kreuzreagierendem Material in einem Test zur Messung der Menge an Cyclosporin in einer Probe, in der Cyclosporin vermutet wird. Vorzugsweise ist der Test einer der oben beschriebenen Tests auf Cyclosporin.
Das Inaktivierungsverfahren umfasst das Kombinieren eines Testmediums, das die Probe mit vermutetem Cyclosporin-Gehalt enthält, mit einem Antiköper, der zur Bindung an das störende kreuzreagierende Material fähig ist. Vorzugsweise ist das Testmedium ein oben beschriebenes Testmedium.
Die eingesetzten Antikörper stören nicht den Test zur Messung der Menge an Cyclosporin. Vorzugsweise binden sich die Antikörper unter den Testbedingungen im Wesentlichen nicht an Cyclosporin. Noch bevorzugter binden die Antikörper unter den Testbedingungen das störende kreuzreaktive Material, binden sich im Wesentlichen nicht an Cyclosporin und binden sich im Wesentlichen nicht an ein Cyclosporin-Marker-Konjugat.
In einer ihrer bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegenden Erfindung das Kombinieren von Antikörpern, die Cyclosporin A-Metabolit M1 binden, Cyclosporin A im Wesentlichen nicht binden und Cyclosporin A, das am Alanin-Stickstoffatom von Cyclosporin A-Aminosäurerest Nr. 7, gegebenenfalls über eine Linkergruppe, an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase konjugiert ist.
Die Menge des Antikörpers, die benötigt wird, um das störende kreuzreaktive Material zu inaktivieren, hängt von der Menge des in der Probe mit vermuteten Cyclosporin-Gehalt vorhandenen Materials ab und von dem Ausmaß der Störung des Tests durch das Material. Je mehr störendes Material vorhanden und je größer das Ausmaß von dessen Kreuzreaktivität ist, desto mehr Antikörper wird benötigt werden. Es wird ausreichend Antikörper wird zugesetzt, damit die Kreuzreaktion ohne Verlust an Testleistung minimiert wird.
Die berichtete Menge von im Serum vorhandenen M1 ist von 9,6% bis zu 23% des gesamten delektierten CsA (einschließlich Metaboliten). Die berichtete Konzentration von M1 liegt in einer Gruppe von Herztransplantationspatienten bei 30 bis 90 ng/ml und in einer Gruppe von Lebertransplantationspatienten bei 226 bis 544 ng/ml (siehe Transplant Proceeding VXX, 173-175 und 614-622 (1988)). Das Ausmaß der Störung von Metabolit M1 hängt von der Selektivität der Antikörper, die Cyclosporin binden, ab. Je niedriger die Selektivität der verwendeten Cyclosporin-Antikörper, desto stärker das Ausmaß der Störung von M1.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegenden Erfindung Sets, die zweckdienlich sind, um das Verfahren der Inaktivierung von störendem kreuzreagierendem Material in einem Test für Cyclosporin bequem durchführen zu können. Die bevorzugten Betrachtungen für solche Sets sind oben beschrieben worden und die Sets umfassen einen Antikörper gemäß diesem Aspekt der Erfindung.
Die folgenden Beispiele beschreiben weitergehend die spezifischen Ausführungsformen der Erfindung. Dies sind typische, veranschaulichende Beispiele und dienen der Beschreibung und nicht als Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung.

Beispiel 1

Geschütztes Cyclosporin

Zu einer gerührten Lösung von Cyclosporin A (1800 mg, 1,5 mmol) in getrocknetem Pyridin (6 ml) und getrocknetem Dichlormethan (6 ml) wurde Chlortrimethylsilan bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre zugetropft. Nach vollständiger Zugabe wurde das Gemisch über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde dann im Vakuum bis zur Trockene eingeengt, der feste Rückstand wurde in Dichlormethan wieder aufgelöst, auf einer Kieselgelsäule mit Ethylacetat/Hexan (80 : 20) gereinigt und ergab TMS-geschütztes Cyclosporin A (Formel (XXV), TMS-CsA, 1700 mg, 89%); ein weißes Pulver. Fp.: 152- 156ºC. IR (CHCl&sub3;): 3650w, 3300s, 2950s, 2945s, 2850s, 1650s, 1415s und 1400 cm¹. MS: m/e 1275 (M&spplus;). Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

Beispiel 2

Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin-Konjugat mit p-Carboxybenzyl-Cyclosporin

A. Geschütztes p-Carboxybenzyl-Cyclosporin

Zu einer gerührten Lösung des Produkts aus Beispiel 1 (900 mg, 0,71 mmol) in getrocknetem Toluol (20 ml) wurde 15-Krone-5-Ether (0,3 ml) zugesetzt. Natriumhydrid (350 mg, 50%ige Suspension in Mineralöl, gewaschen mit getrocknetem Toluol) wurde dann bei Eisbadtemperatur unter Argonatmosphäre zugesetzt. Das Gemisch wurde gerührt und über einen Zeitraum von 30 Minuten auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Methyl-p-brommethylbenzoat (400 mg, 2,5 · 0,71 mmol) wurde zugesetzt und das Gemisch für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Ethylacetat (150 ml) wurde zugesetzt, gefolgt von langsamer und vorsichtiger Zugabe von Wasser (50 ml) und dann Salzsäure (1 N), bis die Lösung sauer war (pH &supmin;3,0). Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser (2 · 50 ml) und Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, was einen blassen Schaum ergab (1,3 g), der auf einer Kieselgel-Dünnschichtplatte mit Ethylacetat/Hexan (65 : 35; Rf &supmin;0,6) als Elutionsmittel gereinigt wurde, was ein Gemisch (etwa 50 : 50) von TMS-geschütztem Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (XIII) am Alanin-Stickstoffatom der Cyclosporin A-Aminosäurereste Nr. 7 und 8 an eine Methoxygruppe gebunden war; ein weißer Feststoff (670 mg, 67%). MS: m/e 1.423 (M&spplus;). Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

B. p-Carboxybenzyl-Cyclosporin

Zu einer gerührten Lösung des Produkts aus Beispiel 2A (280 mg, 0,197 mmol) in Methanol (5 ml) wurde Wasser zugesetzt (tropfenweise &supmin;1/5 ml bis die Lösung leicht trüb wurde). Kaliumcarbonat (wasserfrei, 230 mg) wurde zugesetzt, das Gemisch für 12 Stunden gerührt und zusätzliches Wasser bis zum Auftreten einer leichten Trübung zugetropft. Das Gemisch wurde für weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dem Gemisch wurde vorsichtig Salzsäure (1 N) zugesetzt, bis es sauer war (pH &supmin;2,0). Wasser (50 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch mit Dichlormethan (3 · 50 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Kochsalzlösung (2 · 50 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, was ein Rohprodukt ergab (270 mg), das in Dichlormethan (10 ml) wieder aufgelöst und auf einer Kieselgelsäule gereinigt wurde, und zwar mit Ethylacetat als Laufmittel, bis das Ausgangsmaterial entfernt war, und dann mit Ethylacetat/Essigsäure (99,99 : 0,01), was ein Gemisch (etwa 50 : 50) von Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (XIII) am Alanin-Stickstoffatom der Cyclosporin A-Aminosäurereste Nr. 7 und 8 an eine Hydroxygruppe gebunden war (160 mg, 0,12 mmol, 63%); ein weißer Feststoff. Fp.: 171-177ºC. IR (CHCl&sub3;): 3700w, 3300w, 3000m, 2950s, 2920m, 2875m und 1640 cm&supmin;¹. UV: (Ethanol) 230 nm (&epsi; = 2,4 · 10&sup4;). MS: m/e 1.334 (M1, 24). Anal. ber. für C&sub7;&sub0;H&sub1;&sub1;&sub7;N&sub1;&sub1;O&sub1;&sub4;: C, 62,90; H, 8,82; N, 11,06. Gef.: C, 62,10; H, 8,83; N, 10,80. Die 1H- und C-NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

C. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin-Immunogen

Zu einer gerührten Lösung des Produkts aus Beispiel 2B (100 mg, 0/074 mmol) in getrocknetem DMF (1,3 ml) wurden 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC) (21 mg, 1,5 · 0,074 mmol) und N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS) (25 mg, 1,5 · 0,074 mmol) bei Eisbadtemperatur unter Argonatmosphäre zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, oder bis mittels DC-Analyse (Ethylacetat/Essigsäure, 99 : 1) kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden war. Diese Lösung wurde zu einer Lösung von Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) (150 mg, 66% Protein, 92% Reinheit) in Boratpuffer (6 ml, 100 mM, pH &supmin;9,1) und DMF (0,5 ml) über einen Zeitraum von 1,5 Stunden bei Eisbadtemperatur zugegeben. Nach vollständiger Zugabe wurde das Gemisch in einem 4ºC-Kühlraum (nachfolgend als "Kühlraum" bezeichnet) über Nacht gerührt. Das milchige Gemisch wurde gegen Wasser/DMF (80 : 20), Wasser/DMF (90 : 10) und schließlich Wasser dialysiert. Der Inhalt des Dialyseschlauchs wurde dann lyophilisiert, was ein Gemisch (etwa 50 : 50) von Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (XIII) am Alanin-Stickstoffatom der Cyclosporin A-Aminosäurereste Nr. 7 und 8 an ein Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin gebunden war (150 mg).

D. Bestimmung der Haptenzahl

Zu einer Lösung des Produkts aus Beispiel 2C (0,59 mg/ml, 1 ml) in Boratpuffer (pH &supmin;9,1, 100 mM) wurde eine Lösung von 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNB) (0,1%, 1 ml) zugesetzt und das Gemisch für 2 Stunden auf 40ºC erwärmt. Nach Abkühlung des Gemischs auf Raumtemperatur wurde eine Lösung von Natriumdodecylsulfat (SDS) (10%, 1 ml) und Salzsäure (1 N, 1 ml) zugesetzt. Eine Standardlösung von KLH (gereinigt, 1,09 mg/ml) in Boratpuffer (pH &supmin;9/1, 100 mM) wurde hergestellt und mit einer TNBS- Lösung (1 ml, 0,1%) bei 40ºC für 2 Stunden behandelt. Diese Standardlösung wurde mit einer SDS-Lösung (10%, 1 ml) und Salzsäure (1 N, 1 ml) umgesetzt. Die Absorption von Probe und Standardlösungen bei 340 nm wurde gemessen und die Haptenzahl nach dem Verfahren von A. F. Habeeb, Analytical Biochem. 14, 328 (1966), hierin durch Verweis aufgenommen, berechnet und mit 1.100 ermittelt.

Beispiel 3

Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin-Konjugat von o-Carboxybenzyl-Cyclosporin

A. Geschütztes o-Carboxybenzyl-Cyclosporin

Zu einer gerührten Suspension von Natriumhydrid (350 mg, 50%ige Suspension in Mineralöl, gewaschen mit 3 · 10 ml getrocknetem Toluol) in trockenem Toluol wurde das Produkt aus Beispiel 1 (900 mg, 0,71 mmol) bei Raumtemperatur zugesetzt, gefolgt von Zusatz von 15-Krone-5-Ether (0,35 ml). Das Gemisch wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre gerührt. Vier Portionen von Methyl-o-brommethylbenzoat wurden zugesetzt (zu den Zeiten 0, 12 Std., 24 Std., 36 Std.; 508 mg wurden zu jedem Zeitpunkt zugesetzt, also insgesamt 4 · 508 mg, 4 · 2 mmol). Nach Rühren des Gemischs für 36 Std. bei Raumtemperatur wurde Ethylacetat (150 ml) zugesetzt, gefolgt von vorsichtiger Zugabe von Wasser (20 ml). Das Gemisch wurde mit Salzsäure (1 N) angesäuert. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser (3 · 30 ml) und Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde entfernt, der ölige Rückstand wieder in Ethylacetat aufgelöst und auf einer Kieselgel- Dünnschichtplatte mit Ethylacetat/Hexan (65 : 35; Rf &supmin;0,6) als Elutionsmittel gereinigt, was ein Gemisch (etwa 50 : 50) von TMS-geschütztem Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (XIV) am Alanin-Stickstoffatom der Cyclosporin A-Aminosäurereste Nr. 7 und 8 an eine Methoxygruppe gebunden war (600 mg, 60%); ein weißer Feststoff. MS: m/e 1.423 (M&spplus;). Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

B. o-Carboxybenzyl-Cyclosporin

Zu einer gerührten Lösung des Produkts aus Beispiel 3A (500 mg, 0,357 mmol) in Methanol (10 ml) wurde Wasser zugesetzt (&supmin;3,0 ml oder bis die Lösung leicht trüb wurde). Kaliumcarbonat (wasserfrei, 1000 mg) wurde zugesetzt (falls das Gemisch trüb blieb, wurden einige Tropfen Methanol zugesetzt, um eine klare Lösung zu erhalten). Das Gemisch wurde für 27 Stunden bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase mit Dichlormethan (2 · 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser/Kochsalzlösung (1 : 1, 2 · 50 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde bis zur Trockene eingedampft und ergab ein Rohprodukt (40 mg), das auf einer Kieselgelsäule gereinigt wurde, und zwar mit Ethylacetat als Laufmittel, bis das Ausgangsmaterial und jegliche nichtazide Materialien entfernt waren, und dann mit einem Gemisch von Ethyl acetat/Essigsäure (99,5 : 0,5), was ein Gemisch (etwa 50 : 50) von Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (XIV) am Alanin-Stickstoffatom der Cyclosporin A- Aminosäurereste Nr. 7 und 8 an eine Hydroxygruppe gebunden war (350 mg, 0,26 mmol, 75%); ein weißer Feststoff. Fp.: 162-171ºC. IR (CHC): 3500w, 3450w, 3400w, 3300s, 2950m, 2850m und 1620s, 1420m, 1400 und 1200b cm&supmin;1. MS: m/e 1.334 (M-1, 60). Anal. ber. für C&sub7;&sub0;H&sub1;&sub1;&sub7;N&sub1;&sub1;O&sub1;&sub4;: C, 62,90; H, 8,82; N, 11,06. Gef.: C, 62,23; H, 8,48; N, 11,79. Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

C. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin-Immunogen

Unter Einsatz des Produkts aus Beispiel 3B und des Verfahrens von Beispiel 2C wurde Cyclosporin A, das über die Linkergruppe der Formel (XIV) am Alanin-Stickstoffatom der Cyclosporin A-Aminosäurereste Nr. 7 und 8 an Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin gebunden war, mit ähnlicher Ausbeute hergestellt.

D. Bestimmung der Haptenzahl

Unter Einsatz des Produkts aus Beispiel 3C und des Verfahrens von Beispiel 2D wurde eine Haptenzahl von 500 ermittelt.

Beispiel 4

Rinderserumalbumin-Konjugat von o-Carboxybenzyl-Cyclosporin

A. Rinderserumalbumin-Cyclosporin

Unter Einsatz des Produkts aus Beispiel 3B und des Verfahrens von Beispiel 2C, jedoch unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) anstelle von KLH, wurde ein Gemisch (etwa 50 : 50) von Cyclosporin A, das über die Linkergruppe der Formel (XIV) am Alanin-Stickstoffatom der Cyclosporin A-Aminosäurereste Nr. 7 und 8 an Rinderserumalbumin (Cs-BSA) gebunden war, in ähnlicher Ausbeute erhalten.

B. Bestimmung der Haptenzahl

Unter Einsatz des Verfahrens von Beispiel 2D, jedoch unter Verwendung von BSA anstelle von KLH, wurde die Haptenzahl des in Beispiel 4A gebildeten Cs-BSA-Konjugats mit 55 ermittelt.

Beispiel 5

Geschütztes Hydroxyethyl-Cyclosporin

Zu einer gerührten Lösung der Verbindung aus Beispiel 1 (1000 mg, 0,78 mmol) und 15-Krone-5-Ether (0,2 ml) in getrocknetem Toluol (30 ml) wurde Natriumhydrid (450 mg, 50%ige Suspension in Mineralöl, gewaschen mit getrocknetem Toluol) bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre zugesetzt. Nach 30 Minuten wurde das Reaktionsgemisch auf 4ºC gekühlt und Ethylenoxid (6 ml) über eine Spritze zugesetzt. Der Reaktionskolben wurde verschlossen (abgedichtet mit Stopfen und Parafilm) und bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde vorsichtig mit Wasser (100 ml) behandelt und mit Salzsäure (1 N) angesäuert, und es wurde Dichlormethan (200 ml) zugesetzt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser (100 ml) gewaschen und getrocknet (MgSC). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, was einen weißen Feststoff ergab, der auf einer Kieselgelsäule mit Ethylacetat gereinigt wurde, was TMS-geschütztes Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (I) am Alanin-Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an eine Hydroxygruppe gebunden war; ein weißer Feststoff (350 mg, 34%). Fp.: 124-132ºC. IR (CHCl&sub3;): 3650w, 3400w, 3300 m, 2950 m, 1620 s, 1460w und 1400w und 1200b cm&supmin;¹. MS: m/e 1.317 (M&spplus;, 100), 1271 (M-CH&sub2;CH&sub2;OH, 10). Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

Beispiel 6

Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocycanin-Konjugat von Monocarboxamid-verlängertem Hydroxyethyl-Cyclosporin

A. Geschütztes Monocarboxamid-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin

Zu einer gerührten Lösung des Produkts aus Beispiel 5 (300 mg, 0,23 mmol) und Tri-n- butylzinnethoxid (154 mg, 0,4 mmol) in getrocknetem Toluol (2 ml) wurde Methylglycinat-Isocyanat bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für 2 Std. gerührt. Ethylacetat (50 ml) und Wasser (50 ml) wurden zugesetzt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser/Kochsalzlösung (1 : 1, 2 · 50 ml) gewaschen und getrocknet (MgSC). Das Lösungsmittel wurde bei reduziertem Druck entfernt und das Rohprodukt auf einer Kieselgelsäule mit Ethylacetat als Laufmittel gereinigt, was TMS-geschütztes Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (II) am Alanin-Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an eine Methoxygruppe gebunden war (280 mg, 0,20 mmol, 85%). MS: m/e 1433 (M + 1, 100). Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

B. Monocarboxamid-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin

Zu einer gerührten Lösung des Produkts aus Beispiel 6A (250 mg, 0,17 mmol) in Methanol (10 ml) wurde Wasser zugesetzt, bis das Gemisch leicht trüb wurde. Kaliumcarbonat (200 mg, wasserfrei) wurde zugesetzt und das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre gerührt. Das Gemisch wurde mit Salzsäure (1 N) angesäuert und mit Wasser (20 ml) versetzt. Das Gemisch wurde mit Dichlormethan (3 · 75 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung (10 ml) gewaschen und getrocknet (MgSC). Das Lösungsmittel wurde bei reduziertem Druck entfernt, was Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (II) am Alanin- Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an eine Hydroxygruppe gebunden war; ein weißes Pulver (220 mg, 0,16 mmol, 96%). Fp 156-166ºC. Dieses Material war etwa zu 95% rein, konnte aber auf einer Kieselgelsäule mit Ethylacetat/Methanol/Essigsäure (98 : 1,9 : 0,1, Rf = 0,15) weiter gereinigt werden. IR (CHC): 3650w, 3400w, 3300w, 2950 m, 1700w, 1620 s, 1460 m, 1400 m und 1090w cm&supmin;¹. MS: m/e 1369 (M&spplus; + Na, 60), 1347 (M + H, 50). Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

C. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin-Konjugat

Zu einer gerührten Lösung des Produkts aus Beispiel 6B (30 mg, 2,2 · 10&supmin;² mmol) in getrocknetem DMF (1 ml) wurden EDAC (5,2 mg, 1, 2 · 2, 2 · 10&supmin;² mmol) und Sulfo-NHS (5,8 mg, 1, 2 · 2, 2 · 10&supmin;²) bei 4ºC unter Argonatmosphäre zugesetzt. Das Gemisch wurde dann im Kühlraum über Nacht gerührt. Diese Lösung wurde einer KLH-Lösung (100 mg, 66% Protein, 92% Reinheit) in Boratpuffer (pH "9,1, 3,5 ml, 100 mM) und DMF (0,5 ml) über einem Zeitraum von 2 Std. zugesetzt. Nach vollständiger Zugabe wurde das Gemisch über Nacht im Kühlraum gerührt. Das Gemisch wurde gegen H&sub2;O/DMF (75% : 25%) und gegen Wasser dialysiert, was Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (II) am Alanin-Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin gebunden war (74 mg).

D. Bestimmung der Haptenzahl

Unter Einsatz des Produkts aus Beispiel 6C und des Verfahrens von Beispiel 2D wurde eine Haptenzahl von 500 ermittelt.

Beispiel 7

Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocycanin-Konjugatvon Tricarboxamid-verlängertem Hydroxyethyl-Cyclosporin

A. Dicarboxamidamino-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin

Zu einer Lösung des Produkts aus Beispiel 6B (80 mg, 6 · 10&supmin;² mmol) in getrocknetem THF (1 ml) wurden N-Hydroxysuccinimid (NHS) (9, mg, 1,3 · 6 · 10&supmin;² mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (DDC) (16,1 mg, 1,3 · 6 · 10&supmin;² mmol) bei 4ºC unter Argonatmosphäre zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht im Kühlraum gerührt und langsam einer Lösung von Ethylendiamin (600 mg, 10 mmol) in THF (5 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde für 4 Std. bei Raumtemperatur gerührt, und es wurde Wasser (20 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde mit Dichlormethan (3 · 50 ml) extrahiert und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, was Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (XI) am Alanin-Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an eine Aminogruppe gebunden war (80 mg, 5,6 · 10&supmin;² mmol, 94%), das ohne weitere Reinigung eingesetzt wurde.

B. Tricarboxamid-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin

Zu einer gerührten Lösung des Produkts aus Beispiel 7A (80 mg, 5,6 · 10&supmin;² mmol) in getrocknetem THF (1 ml) wurden Diglykolanhydrid (97%, 24 mg, 3 · 5,6 · 10&supmin;² mmol) und Triethylamin (26 mg, 0,25 mmol) bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre zugesetzt. Die Reaktion wurde über Nacht gerührt. Wasser (10 ml) und Dichlormethan (50 ml) wurden zugesetzt und das Gemisch mit Salzsäure (1 N) angesäuert. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase mit Dichlormethan (2 · 25 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, was Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (XII) am Alanin- Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an eine Hydroxygruppe gebun den war (70 mg, 83%); ein glasartiger Feststoff. MS: m/e 1505 (M + H, 30%). Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

C. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocycanin-Konjugat

Zu einer Lösung des Produkts aus Beispiel 7B (60 mg, 4 · 10&supmin;² mmol) in DMF (1 ml) wurden NHS (5,5 mg, 1,2 · 4 · 10&supmin;² mmol) und DDC (9,8 mg, 1,2 · 4 · 10&supmin;² mmol) bei 4ºC unter Argonatmosphäre zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Die Lösung wurde zu einer Lösung von KLH (120 mg, 66% Protein, 92% Reinheit) in Phosphatpuffer (6 ml, pH &supmin;8,3, 100 mM) und DMF (0,8 ml) über einen Zeitraum von 3 Std. bei 4ºC zugegeben. Nach vollständiger Zugabe wurde das Gemisch über Nacht im Kühlraum gerührt. Das Gemisch wurde gegen H&sub2;O/DMF (90 : 10) und Wasser dialysiert. Das Konjugat wurde dann lyophilisiert, was Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (XII) am Alanin-Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocycanin gebunden war (120 mg).

D. Bestimmung der Haptenzahl

Unter Einsatz des Produkts aus Beispiel 7C und des Verfahrens von Beispiel 2D wurde eine Haptenzahl von 700 ermittelt.

Beispiel 8

Monocarboxamid-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin-Homolog

A. Geschütztes Monocarboxamid-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin-Thioanalog

Zu einer gerührten Lösung des Produkts aus Beispiel 5 (60 mg, 4,5 · 10&supmin;² mmol) und Tri-n-butylzinnethoxid (30 mg, 8,9 · 10&supmin;² mmol) in getrocknetem Toluol (1 ml) wurde β- Alanin-Isocyanatmethylester zugesetzt. Das Gemisch wurde für 2 Std. gerührt. Ethylacetat (50 ml) und Wasser (50 ml) wurden zugesetzt, die organische Phase wurde abge trennt, mit Wasser/Kochsalzlösung (1 : 1,2 · 50 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Die organische Phase wurde bei reduziertem Druck entfernt und der schaumartige Feststoff auf einer Kieselgelsäule mit Ethylacetat als Laufmittel gereinigt, was TMS-geschütztes Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (IX) am Alanin-Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an eine Methoxygruppe gebunden war (59 mg, 4,1 · 10&supmin;² mmol, 91%).

B. Monocarboxamid-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin-Homolog

Zu einer gerührten Lösung des Produkts aus Beispiel 8A in Methanol (1 ml) wurden Wasser und Kaliumcarbonat (30 mg, wasserfrei) zugesetzt und das Gemisch für 20 Std. gerührt. Das Gemisch wurde mit Salzsäure (1 N) angesäuert, Wasser (20 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch mit Dichlormethan (2 · 20 ml) extrahiert und getrocknet (MgSO&sub4;). Dieses Material wurde auf einer Kieselgelsäule mit Ethylacetat/Methanol/Essigsäure (98 : 2 : 0,1) gereinigt, was Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (IX) am Alanin-Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an eine Hydroxygruppe gebunden war (25 mg, 90%). MS: m/e 1318 (M + H, 100).

Beispiel 9

Monocarboxamid-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin-Thioanalog

Zu einer gerührten Lösung des Produkts aus Beispiel 5 (60 mg, 4,5 · 10&supmin;² mmol) und Tri-n-butylzinnethoxid (70 mg, 0,2 mmol) in getrocknetem Toluol (1 ml) wurde Essigsäure-Isothiocyanatmethylester (90 mg) zugesetzt. Das Gemisch wurde für 2 Std. gerührt. Ethylacetat (50 ml) und Wasser (50 ml) wurden zugesetzt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser/Kochsalzlösung (1 : 1,2 · 50 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Die organische Phase wurde bei reduziertem Druck entfernt und der schaumartige Feststoff auf einer Kieselgelsäule mit Ethylacetat als Laufmittel gereinigt, was TMS-geschütztes Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (X) am Alanin-Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an eine Methoxygruppe gebunden war (55 mg, 3,8 · 10&supmin;² mmol).

8. Monocarboxamid-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin-Thioanalog

Zu einer gerührten Lösung des Produkts aus Beispiel 9A (55 mg, 3,4 · 10&supmin;² mmol) in Methanol (10 ml) wurden Wasser und Kaliumcarbonat (30 mg, wasserfrei) zugesetzt und das Gemisch für 20 Std. gerührt. Das Gemisch wurde mit Salzsäure (1 N) angesäuert, Wasser (20 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch mit Dichlormethan (2 · 20 ml) extrahiert und getrocknet (MgSO&sub4;). Dieses Material wurde auf einer Kieselgelsäule mit Ethylacetat/Methanol/Essigsäure (98 : 2 : 0,1) gereinigt, was Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (X) am Alanin-Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an eine Hydroxygruppe gebunden war (50 mg, 3,4 · 10&supmin;² mmol, 89%). MS: m/e 1496 (70%), 1363 (80%).

Beispiel 10

Monocarboxamid-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin-Alkylanalog

A. Geschütztes Monocarboxamid-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin-Alkylanalog

Unter Einsatz des Produkts aus Beispiel 5 und des Verfahrens von Beispiel 8A (außer dass α-Alanin-Isocyanatmethylester anstelle von β-Alanin-Isocyanatmethylester verwendet wurde) wurde TMS-geschütztes Cyclosporin A, das über die Linkergruppe der Formel (VI) am Alanin-Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an eine Methoxygruppe gebunden war, in ähnlicher Ausbeute hergestellt.

B. Monocarboxamid-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin-Alkylanalog

Unter Einsatz des Produkts aus Beispiel 10A und des Verfahrens von Beispiel 8B wurde Cyclosporin A, das über die Linkergruppe der Formel (VI) am Alanin-Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an eine Hydroxygruppe gebunden war, in 90%- iger Ausbeute hergestellt. MS: m/e 1399 (M + K, 100%), 1383 (M + Na, 70%), 1362 (M + H, 30%).

Beispiel 11

Monocarboxamid-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin-Aromatanalog

A. Geschütztes Monocarboxamid-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin-Aromatanalog

Unter Einsatz des Produkts aus Beispiel 5 und des Verfahrens von Beispiel 8A (außer dass α-Phenyl-α-Alanin-Isocyanatmethylester anstelle von α-Alanin-Isocyanatmethylester verwendet wurde) wurde TMS-geschütztes Cyclosporin A, das über die Linkergruppe der Formel (V) am Alanin-Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an eine Methoxygruppe gebunden war, in ähnlicher Ausbeute hergestellt.

8. Monocarboxamid-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin-Aromatanalog

Unter Einsatz des Produkts aus Beispiel 10A und des Verfahrens von Beispiel 8B wurde TMS-geschütztes Cyclosporin A, das über die Linkergruppe der Formel (V) am Alanin- Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an eine Hydroxygruppe gebunden war, in ähnlicher Ausbeute hergestellt. MS: m/e 1422 (M - H, 30%).

Beispiel 12

Carboxymethyl-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin

A. Geschütztes Carboxymethyl-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin

Zu einer gerührten Lösung der Verbindung von Beispiel 5 (130 mg, 9,8 · 10&supmin;² mmol) in getrocknetem THF (1,5 ml) wurden Natriumhydrid (20 mg, 50%ige Suspension in Mineralöl, gewaschen mit getrocknetem THF) und 15-Krone-5-Ether (&supmin;20 mg) bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre zugesetzt. Das Gemisch wurde für 1 Std. gerührt und α- Bromessigsäuremethylester (80 mg) in getrocknetem THF (0,5 ml) wurde zugesetzt. Die Reaktion wurde für weitere 2 Std. gerührt, eine weitere Portion α-Bromessigsäuremethylester (80 mg) zugesetzt und die Reaktion für 2 Std. gerührt. Ethylacetat (50 ml) und Wasser (50 ml) wurden zugesetzt und das Gemisch mit Salzsäure (1 N) (pH &supmin;3,0) angesäuert. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser (2 · 50 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde bei reduziertem Druck entfernt und der Rückstand auf einer Kieselgel-Dünnschichtplatte mit Ethylacetat als Laufmittel gereinigt, was TMS-geschütztes Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (VII) am Alanin-Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an eine Methoxygruppe gebunden war (80 mg, 60%); ein weißer Feststoff. MS: m/e 1358 (M - H, 100). Die H- und C-NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

B. Carboxymethyl-verlängertes Hydroxyethyl-Cyclosporin

Zu einer gerührten Lösung des Produkts aus Beispiel 12A (79 mg, 5,8 · 10&supmin;² mmol) in Methanol (4 ml) wurde Wasser zugesetzt, bis das Gemisch trüb wurde (&supmin;1,5 ml). Kaliumcarbonat (wasserfrei, 40 mg) wurde zugesetzt und das Gemisch für 20 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde mit Salzsäure (1 N) angesäuert, und Wasser (20 ml) wurde zugesetzt; das Gemisch wurde mit Dichlormethan (2 · 20 ml) extrahiert und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Rohprodukt wurde auf einer Kieselgelsäule mit Ethylacetat/Methanol/Essigsäure (98 : 2 : 0,1) als Laufmittel gereinigt, was Cyclosporin A ergab, das über die Lin kergruppe der Formel (VII) am Alanin-Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an eine Hydroxygruppe gebunden war (65 mg, 80%); ein weißer Feststoff. MS: m/e 1326 (M + Na), 1304 (M + H). Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

Beispiel 13

Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin-Konjugat von Dicarboxamid-verlängertem p-Carboxybenzyl-Cyclosporin

A. Dicarboxamid-verlängertes p-Carboxybenzyl-Cyclosporin

Zu einer gerührten Lösung des Produkts aus Beispiel 2B (60 mg) in DMF (0,69 ml) wurden N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS, 12,8 mg) und (1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC, 13,9 mg) bei 4ºC unter Argonatmosphäre zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 4ºC gerührt. Vollständige Bildung des Sulfo- NHS-Esters wurde mittels DC (Kieselgel, Laufmittel: 0,15 : 2 : 8 Essigsäure/Methanol/Dichlormethan) nach 18 Stunden beobachtet. Der gebildete Sulfo-NHS-Ester wurde langsam zu einer Lösung von Glycyl-Glycin (12,1 g) in einen Gemisch von Boratpuffer (1 ml, pH 9, 0,05 M) und DMF (2 ml) mit eingestelltem pH im Bereich von 9,5 bis 9 über einen Zeitraum von 30 Minuten bei 4ºC zugegeben. Die leicht gelbe Lösung wurde bei 4ºC für zusätzliche 30 Minuten und bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Zum gebildeten Produkt wurde 1 N HCl zugesetzt (bis pH 4 erreicht war), und der Niederschlag wurde gesammelt und im Vakuum getrocknet, was ein weißes Produkt ergab (49 mg). Das Filtrat wurde mit Ethylacetat extrahiert, die organischen Extrakte wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und das Lösungsmittel abgedampft, was eine zweite Menge an Produkt ergab. Die vereinigten Produkte wurden mittels präparativer Schichtchromatographie (Kieselgel, Eluens: 3 : 40 : 160 Essigsäure/Methanol/Dichlormethan) gereinigt, was ein Gemisch (etwa 50 : 50) von Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (XIX) am Alanin-Stickstoffatom der Cyclosporin A-Aminosäurereste Nr. 7 und 8 an eine Hydroxygruppe gebunden war (29 mg). MS: m/e 1450 (M + H), 1488 (M + K).

B. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocycanin-Konjugat

Zum Produkt aus Beispiel 13A (20 mg) in DMF (300 ul) wurden EDAC (3,1 mg) und N- Hydroxysulfosuccinimid (3,58 mg) in DMF (300 ul) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 4ºC gerührt. Unvollständige Bildung von Sulfo-NHS-Ester wurde mittels DC (Kieselgel, Laufmittel: 3 : 40 : 160 Essigsäure/Methanol/Dichlormethan) beobachtet. Zusätzliches EDAC (3,1 mg) und N-Hydroxysulfosuccinimid (3,58 mg) wurden zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt. Vollständige Reaktion wurde mittels DC (Kieselgel, Laufmittel: 3 : 40 : 160 Essigsäure/Methanol/Dichlormethan) beobachtet. Zu einer Lösung von KLH (40 mg) in einem Gemisch von Boratpuffer (3,0 ml, pH 9, 0,05M) und DMF (0,7 ml) wurde das oben hergestellte Reaktionsgemisch von Sulfo-NHS-Ester über einen Zeitraum von 4 Stunden bei Raumtemperatur mit konstanter pH-Einstellung auf pH 8,5 zugesetzt. Eine Zusätzliche Menge DMF (0,25 ml) wurde während der 4-Stunden-Periode zugesetzt. Das gebildete Gemisch wurde bei 4ºC über Nacht gerührt. Das trübe Gemisch wurde gegen 10% DMF/Wasser (pH 8 mit NH&sub4;OH, 3 · 4 l) und Wasser (pH 8 mit NH&sub4;OH, 3 · 4 l) dialysiert. Das gebildete Produkt wurde lyophilisiert, was Cyclosporin A ergab, das über die Linkergruppe der Formel (XIX) am Alanin-Stickstoffatom der Cyclosporin A-Aminosäurereste Nr. 7 und 8 an Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin gebunden war (32 mg).

C. Bestimmung der Haptenzahl

Unter Einsatz des Produkts aus Beispiel 13B und des Verfahrens von Beispiel 2D wurde eine Haptenzahl von 948 ermittelt.

Beispiel 14

Cyclosporin-Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Konjugate

A. Aktivierung von Cyclosporin-Hapten

In einen ausgeflammten Kolben wurden 35 mg Cyclosporin-Hapten, im besonderen das Produkt aus Beispiel 6B, 6,2 mg Sulfo-NHS, 5,5 mg EDAC und 0,35 ml DMF gefüllt. Das Gemisch wurde über Nacht bei 4ºC gerührt.

B. Konjugation an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase

Das Produkt aus Beispiel 14A wurde portionsweise zu einer Lösung von Glucose-6- phosphat-Dehydrogenase (G6PDH, 0,055 m in Natriumcarbonatpuffer), Glucose-6-phosphat (G6P, 4,5 mg/mg G6PDH) und NADH (9 mg/mg G6PDH) in Natriumcarbonatpuffer/DMF (0,2 ml/ml von Puffer) pH 8, 8 bei Eisbadtemperatur zugegeben. Die Reaktion wurde überwacht und bei 29-35% Inhibierung der Enzymaktivität in Gegenwart von Anti-CsA-Antikörper, relativ zur Aktivität in Abwesenheit von Anti-CsA-Antikörper gestoppt.

C. Konjugat-Isolierung

Das Konjugat aus Beispiel 14B, Cyclosporin A, das über die Linkergruppe der Formel (II) am Alanin-Stickstoffatom des Cyclosporin A-Aminosäurerests Nr. 7 an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase gebunden war, wurde mittels chromatographischer Trennung auf Sephadex G100, unter Verwendung von 0,055 M Tris-HCl (pH 8,0), enthaltend 0,05% Natriumazid und 0,005% Thimerosal, isoliert. Haptenzahlen von weniger als etwa 5-10 wurden bei Inaktivierungen von weniger als etwa 35% erhalten.
Die Produkte der Beispiele 2B, 3B, 7B, 8B, 9B, 10B, 11 B oder 12B wurden ebenfalls nach dem Verfahren aus Beispiel 14 zu den entsprechenden G6PDH-Konjugaten umgesetzt.

Beispiel 15

Herstellung von monoklonalen Cyclosporin-Antikörpern

A. Allgemeine Verfahren

Die verwendeten Hybridom-Standardprozeduren sind im Einzelnen beschrieben worden (G. Kohler und C. Milstein, Nature 256, 495-7 (1975); J. R. G. Hurrell, "Monoklonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", CRC Press, Boca Rota, FL 33431, USA (1982).

B. Immunisierung

BALB/C-Mäuse wurden mit 50 bis 200 ug Immunogen (im Besondern das KLH-Konjugat aus Beispiel 13B) in Freund'schem vollständigem Adjuvans (CFA) durch intraperitoneale (IP) oder subkutane (SC) Injektion immunisiert. Boosten mit Immunogen (unvollständiges Freund'sches Adjuvans (IFA), IP oder SC) wurde monatlich durchgeführt. Eine letzte IP, IC oder intravenöse (IV) Injektion von 100-500 ug in Kochsalzlösung wurde vor der Fusion durchgeführt.

C. Überwachung der Immunisierung

Ein Serumantikörper-Fortschritt ELISA-Test wurde verwendet, um Mäuse nach 2 bis 3 Immunisierungen zu überwachen. Serumantikörpertiter wurden vor dem Test seriell zweifach verdünnt.
Mikrotiter-EIA-Platten (Costar Nr. 3590) wurden mit 50 ul/Napf des mit demselben Hapten wie das Immunogen markierten GGPDH-Enzymkonjugats beschichtet, in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 0,01 M Natriumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid und 0,02% Natriumazid, pH 7,2) 1 : 100 verdünnt, bei 37ºC für 1 Stunde inkubiert und dann mit 300 ul/Napf 1% normalem Schafserum (NSS) in PBS versetzt, um unspezifische Bindung zu blockieren. Nach 30 Minuten Stehenlassen wurden die Inhalte der Platten verworfen. 50 ul/Napf seriell verdünntes Serum wurde zugesetzt und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden 3 Mal mit ELISA-Waschpuffer gewaschen (0,05% Tween- 20 [Fisher Scientific Co. Nr. CS-279-3] in PBS, pH 7). Ziegen-Anti-Maus-Sera, markiert mit alkalischer Phosphatase (IgG + IgM + leichtkettenspezifisch, Tago Nr. 6543887, Mitten Road, Burlingame, CA94011, USA), 1 : 1000 in PBS verdünnt, wurde in einer Menge von 50 ul/Napfden Platten zugegeben und für zusätzliche 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden wie zuvor gewaschen, und dann wurden 100 ul/Napf Substrat (15 mg p-Nitrophenylphosphat, Dinatriumsalz [PNPP, Sigma Nr. S104-105] je 25 ml 10% Diethanolamin [Eastman Kodak Nr. 1598], pH 9,8, enthaltend 0,5 mM MgC [Mallinckrodt Nr. 5958]) zugegeben. Die Platten wurden auf einem Schüttler bei Raumtemperatur für etwa 30 Minuten, oder bis eine sichtbare Färbung auftrat, stehengelassen. Die Platten wurden dann an einem Titertek Multiscan bei 405 nm gemessen. OD-Ablesungen wurden über der Verdünnung der Serumprobe aufgetragen. Serumantikörpertiter wurde als diejenige Verdünnung definiert, bei der eine 70%ige Abnahme im Vergleich zur höchsten OD der Titrationskurve vorlag.

D. Zellfusion

Milzzellen wurden aus den immunisierten Mäusen gewonnen und unter Verwendung von PEG mit P3 X63-AG8.653-Myelomzellen fusioniert. Die Zellen wurden in mit HAT ergänztem Medium resuspendiert und in 96-Napf-Mikrotiterplatten verteilt. Vier Tage später wurden die Zellen durch Austausch der Hälfte des HAT-ergänzten Mediums versorgt.

E. Hybridom-Screening

Etwa 1 Woche nach der Zellfusion wurden die Hybridome auf spezifische Antikörper gescreent.
Mikrotiter-EIA-Platten wurden mit 50 ul/Napfan gegen IgG + IgA + IgM - H + L-Ketten spezifischem Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper (Zymed Nr. 61-6400 SY), 1 : 100 in PBS, pH 7,2 verdünnt, beschichtet und bis zum Gebrauch bis zu einer Woche bei 4ºC gelagert. Die Platten wurden mit 300 ul/Napf 1% NSS/PBS gefüllt, um unspezifische Bindung zu blockieren und für 30 Minuten stehen gelassen und der Inhalt dann verworfen. Verbrauchtes Medium, 50 ul/Napf, wurde dann zugegeben und für 30 bis 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden dann 3 Mal gewaschen. G6PDH-Enzym, markiert mit demselben Hapten wie das Immunogen, wurde 1 : 100 bis 1 : 700 in PBS verdünnt, 50 ul/Napf wurden zugegeben und dann für 30 bis 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden wiederum wie zuvor gewaschen und 100 ul/Napf Substrat (0,053 M Trizma-Base [Sigma Nr. T1503], 0,02 M NAD, 0,033 M G-6-P, 0,025% NaN [Natriumazid, J. T. Baker Nr. 7-V015], pH mit HCl auf 6,2 eingestellt, 0,63 mM p-Iodnitrotetrazolium-Violett [INT, Sigma Nr. I8377], 1% NSS und 80 Units/ml Diaphorase [Sigma Nr. 2381]) wurden zum Schluss zugesetzt. Platten wurden für etwa eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert und mit einem Titertek Multiscan bei 492 nm gemessen. Näpfe mit Werten, die zumindest um das zweifache höher lagen als der Hintergrund, wurden als ELISA+ angesehen.

F. Antikörperproduktion in Ascites

Um monoklonale Antikörper in größerem Maßstab in Ascites zu produzieren, wurden Mäuse durch IP-Injektion von IFA geprimt, um Tumorwachstum zu induzieren, und zwar mit 0,3 bis 0,5 ml/Maus, 2 bis 7 Tage vor der Passage von Zellen. Zellen wurden in einem T-75-Kolben in die log-Phase gezüchtet, etwa 18 · 10&sup6; Zellen, zentrifugiert und dann in 2 ml S-DMEM resuspendiert. Jede Maus erhielt eine 0,5 ml-IP-Injektion von etwa 4 bis 5 · 10&sup6; Zellen. Ein Ascites-Tumor entwickelte sich üblicherweise innerhalb einer bis zweier Wochen. Die eine hohe Antikörperkonzentration enthaltende Ascites- Flüssigkeit wurden dann mittels einer Nr. 18-Spritze abgezogen. Die Flüssigkeit wurde bei Raumtemperatur gerinnen gelassen und dann bei 1500 U/min für 30 Minuten zentrifugiert. Die Antikörper enthaltende Flüssigkeit wurde abgegossen und im gefrorenen Zustand bei -20ºC gelagert.
Nach dem Verfahren von Beispiel 15 wurden auch Antikörper gegen die Produkte der Beispiele 2C, 3C, 6C, 7C und 4A hergestellt.

Beispiel 16

Auswahl von Antikörpern und Enzymkonjugaten

A. Allgemeine Faktoren

Die Auswahl von optimalen monoklonalen Antikörpern und Enzymkonjugaten zur Verwendung in einem EMIT®-Test für Cyclosporin hängt von einer Anzahl in Wechselbeziehung stehenden Faktoren ab. In erster Linie muss der Antikörper das Enzymkonjugat erkennen und dessen Aktivität beeinflussen können. Da Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) ein bevorzugtes Enzym ist, wird der Antikörper basierend auf seiner Fähigkeit zur Erkennung von Cyclosporinen von Interesse gewählt. Beispielsweise wird, falls ein Test gewünscht wird, der zur Detektion von Cyclosporin A und nicht seiner Metaboliten fähig ist, ein Antikörper mit dieser Spezifität gewählt. Alternativ dazu wird, falls ein Test gewünscht wird, der zur Detektion von Cyclosporin A und seiner grundlegenden Metaboliten gewünscht wird, ein Antikörper mit dieser Spezifität gewählt.
Andere Auswahlfaktoren umfassen Stabilität, Einfachkeit der Herstellung und Löslichkeit der Antikörper und Metaboliten.
Details des durchzuführenden Tests beeinflussen auch die Auswahl von Antikörpern und Enzymkonjugaten. Beispielsweise kann die Probe Gesamtblut, Serum, Urin und dergleichen sein. Das Test-Verdünnungsmittel, Stabilisatoren, Pufferbestandteile, Entschäumer und Vorbehandlung könnten die Auswahl von Antikörpern und Enzymkonjugaten beeinflussen.
Die oben beschriebenen Faktoren sind allgemein und stehen in Beziehung zueinander. Die Auswahl optimaler Antikörper und Enzymkonjugate umfasst die sorgfältige Harmonisierung der oben beschriebenen Faktoren sowie anderer wichtiger Faktoren im jeweiligen Test von Interesse.

8. Enzym-Konjugat-Screening

In Beispiel 14 hergestellte Cyclosporin A-Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Konjugate wurden auf den Prozentanteil an Inhibierung bei Behandlung mit zwei der Antikörper (Klone 5E10 und 2G4) aus Beispiel 15 gescreent. Schlüsselfaktoren der Auswahl umfassten die Maximierung von Konjugat-Inhibierungsfähigkeit und -Stabilität. Tabelle 1

C. Antikörper-Screening

Antikörper aus Beispiel 15 wurden auf Prozent-Inhibierung gegen Glucose-6-phosphat- Konjugate aus Beispiel 14 gescreent. Schlüsselfaktoren der Auswahl umfassten die Maximierung der Inhibierung von Enzymkonjugaten und Herabsetzung der Inhibierung durch Zusatz von CsA. Tabelle 2 Cyclosporin-Antikörper-Screening, prozentuelle Inhibierung Tabelle 3 Cyclosporin-Antikörper-Screening, prozentuelle Inhibierung gegen G6PDH-Konjugat, Linkergruppe II KLH-Immunogen, Linkergruppe XIII KLH-Immunogen, Linkergruppe XIV KLH-Immunogen, Linkergruppe XIX

D. Screening auf Antikörper-Kreuzreaktivität

Antikörper aus Beispiel 15 wurden unter Verwendung von G6PDH-Konjugat, Linkergruppe II, auf Kreuzreaktivität gegen Cyclosporin-Metaboliten gescreent. Schlüsselfaktoren der Auswahl umfassten die Minimierung von Kreuzreaktivität. Tabelle 4 Kreuzreaktivität von Antikörpern mit den Metaboliten M1, MS, M17 und M21 Tabelle 5 Kreuzreaktivität von Antikörpern mit Metabolit M17

D. Schlussfolgerungen

Basierend auf dem obigen Screening wurde Cyclosporin A, das über eine Linkergruppe der Formel II am Alaninstickstoffatom von Cyclosporin A-Aminosäurerest Nr. 7 an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase konjugiert war, als ein beispielhaftes Enzymkonjugat ausgewählt.
Der Antikörper Klon Nr. 2G4 wurde als beispielhafter Antikörper ausgewählt.

Beispiel 17

Leistungsfähigkeit im EMIT-Test

Einzelheiten über die EMIT-Test-Vorschrift sind in US-A-3.517.837 (1974) beschrieben. Nach dem Verfahren in Beispiel 15 unter Verwendung des KLH-Konjugats aus Beispiel 13B hergestellte Antikörper wurden verwendet und werden im vorliegenden Beispiel als monoklonale Anti-CsA-Antikörper bezeichnet. Das G6PDH-Konjugat wurde nach dem Verfahren in Beispiel 14 unter Verwendung der Verbindung aus Beispiel 6B hergestellt und wird im vorliegenden Beispiel als CsA-GGPDH-Konjugat bezeichnet. Der Test wurde an einem COBAS MIRA-Analysator durchgeführt.
Einhundert Mikroliter einer Gesamtblut-Probe und 6 Eichsubstanzen wurden getrennt am Vortex mit 200 ul Methanol geschüttelt. Das Methanol lysierte Zellen, solubilisierte Cyclosporin und fällte Proteine. Nach einer einminütigen Inkubation wurde das Gemisch zentrifugiert. Der Überstand wurde 1 : 3 mit Vorbehandlungs-Verdünner verdünnt. Am Analysator wurden 36 p der resultierenden, vorbehandelten Probe für 75 Sekunden mit 155 ul des monoklonalen Anti-CsA-Antikörper-Reagens, das Substrat und Cofaktor umfasste, inkubiert. Anschließend wurden 75 ul des CsA-GGPDH-Konjugat-Reagens zugesetzt. Nach einer zweiten Inkubation für 175 Sekunden wurde Enzymaktivität (als Funktion der Medikamenten-Konzentration) gemessen, indem die Bildung von NADH spektralphotometrisch bei 340 nm für 100 Sekunden verfolgt wurde.
Das monoklonale Anti-CsA-Antikörper-Reagens enthielt monoklonalen Anti-CsA-Antikörper, Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid, Glucose-6-phosphat, Natriumchlorid, Volumsfüller, Tensid und Konservierungsmittel.
Das CsA-G6PDH-Konjugat-Reagens enthielt Enzymkonjugat, Tris-Puffer, Volumsfüller, Stabilisatoren und Konservierungsmittel.
Der Verdünner enthielt Tris-Puffer, Tensid und Konservierungsmittel.
Jedes der Reagenzien wurde so formuliert, dass es mit der Standard-EMIT-Technologie im Einklang stand. Die Reagenzien wurden nicht lyophilisiert und waren daher flüssig. Volumsfüller, Tenside und Konservierungsmittel wurden so gewählt, dass sie leicht handhab- und lagerbar waren.
Ein bevorzugtes Stabilisierungsmittel für das CsA-G6PDH-Konjugat-Reagens war ein Antikörper, der an einer Stelle oder an Stellen band, die nicht enzymatisch aktive Stellen waren. Ein solcher Antikörper wurde durch die in Beispiel 15 beschriebenen Standard- Hybridom-Techniken hergestellt, indem Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase als Immunogen verwendet wurde. Der Anti-G6PDH-Antikörper wurde als ein Stabilisator für das CsA-G6PDH-Konjugat-Reagens verwendet.
Zwanzig Proben und sechs Eichstandards wurden mittels dieser Arbeitsvorschrift in weniger als zwei Stunden vorbehandelt und getestet.
Der Test-Standardkurvenbereich erstreckte sich bis 500 ng/ml. Die analytische Wiederfindung innerhalb des Kurvenbereichs variierte von 95-104%. Innerhalb eines Laufs lag die Genauigkeit mit Dreifach-Vergleichen im Bereich von 5.0 bis 7,1% CV. Zwischen den Läufen lag die Genauigkeit mit denselben Proben im Bereich von 4,9 bis 7,4% CV.
Kreuzreaktivität wurde mit Cyclosporin A-Metabolit M1, nicht jedoch bei den anderen Haupt-Metaboliten M8, M17 und M21 beobachtet. Siebenundfünfzig potentiell gleichzeitig verabreichte Medikamente, Schwankungen von Hämatokrit und hohe Level an Bilirubin oder Triglyceriden störten den Test nicht. Testparameter am COBAS MIRA-Analysator
Drei Level von Cyclosporin A wurden in 10 frische, Cyclosporin A-negative Gesamtblutproben gespickt. Die Proben wurden zweifach getestet.
Fünf Level von Cyclosporin A wurden in zwei getrennte Proben von frischem, Cyclosporin A-negativen Gesamtblut gespickt. Die Proben wurden zweifach getestet.
Bestimmungen der Genauigkeit innerhalb eines Laufs wurden an 20 unterschiedlichen Probenextrakten bei jedem der drei Level durchgeführt. Bestimmungen der Genauigkeit zwischen den Läufen wurden bei jedem der drei Level und insgesamt 20 Läufen an zwei Analysatoren durchgeführt. Unterschiedliche Probenextrakte wurden in jedem Lauf getestet und Quantifizierungen erfolgten mit mitgelaufenen Standardkurven.
Proben der American Association of Clinical Chemist/College of American Pathologists (AACC/CAP) Whole Blood Cyclosporin A Survey und der United Kingdom Quality Assessment Scheme (UKQAS) wurden mit dem EMIT-Cyclosporin A-Test getestet. Die Ergebnisse waren vergleichbar mit jenen von HPLC und CYCLO-Trac SP-RIA (INCSTAR).
Die Kreuzreaktivität mit den vier Cyclosporin A-Hauptmetaboliten wurde in Gegenwart von 200 ng/ml Cyclosporin A bewertet. Von diesen Metaboliten zeigte nur M1 (AM9) signifikante Kreuzreaktivität.
Die siebenundfünfzig unten aufgelisteten Verbindungen zeigten im Test keine Kreuzreaktivität. Sie wurden in den folgenden Konzentrationen in Gegenwart von 200 ng/ml Cyclosporin A getestet. Eine Steigerung der Cyclosporin A-Konzentration von 25% oder mehr wurde als nennenswerte Kreuzreaktivität definiert.
Keine klinisch signifikante Störung wurde im EMIT®-Cyclosporin A-Test in Gegenwart von 30 mg/dl Bilirubin oder 1000 mg/dl Triglyceriden gefunden.
Proben mit Hämatokriten im Bereich von 18% bis 66% zeigten keine klinisch signifikanten Schwankungen der Wiederfindung von Cyclosporin A in Konzentrationen von 75, 250 und 400 ng/ml

Beispiel 18

Oxyessigsäureimino-verlängertes Atiocyclosporin

In eine gerührte Lösung von Cyclosporin A-Metabolit M-1 (Verbindung (1), Schema I, 6 mg, 4,9 · 10&supmin;³ mmol, erhalten aus Hunde-Urin durch das Verfahren von U. Christians et al., Clinical Chem. 34(1), 34-39 (1988), unter Verwendung von Bio-Beads gemäß dem Verfahren von D. L. Roerig et al., S. Chromatog. 110, 349 (1975)) in getrocknetem Methanol (1 ml) bei -78ºC wurde Ozon enthaltender Sauerstoff (Welbach Ozongenerator, 0,5 ml/min. Reglerdruck 6 psi, Ozongeneratordruck 4 psi, Ozongenerator betrieben bei 80 V) für 10 Minuten eingeleitet (bis sich die Lösung blau färbte), dann wurde der Ozon enthaltende Sauerstottstrom unterbrochen. Argon wurde für 10.15 Minuten durch die Lösung geleitet (bis die Temperatur der Lösung -20ºC erreichte). Dimethylsulfid (0,2 ml) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur (R.T.) erwärmen gelassen und das Atiocyclosporin-Carboxaldehyd-Produkt (Verbindung (2), Schema I) nicht isoliert, gereinigt oder charakterisiert, bis der Großteil des Methanols verdampft war. Das Ozon-Spaltprodukte enthaltende Reaktionsgemisch wurde in wasserfreiem Methanol (1 ml) wieder aufgelöst und mit Aminooxyessigsäure (HCl-Salz, 12 mg, 0,1 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde für 3 h bei R.T. gerührt. Dichlormethan (30 ml), ein Gemisch aus gesättigter Kochsalzlösung und Wasser (1 : 1, 20 ml) und 2 Tropfen HCl (1 N) wurden zugesetzt. Die Dichlormethan-Phase wurde abgetrennt, getrocknet (MgSO&sub4;) und bis zur Trockene eingeengt, was Oxyessigsäureimino-verlängertes Atiocyclosporin ergab (Verbindung (3), Schema I, 6 mg, 4,7 · 10&supmin;³ mmol, 96%). MS, m/e 1279,9 (M + H) Das Produkt wurde ohne Reinigung eingesetzt, kann aber mittels präparativer Dünnschichtchromatographie (Kieselgel, Ethylacetat/MeOH/AoCH 90 : 10 : 0,1) weiter gereinigt werden.

Beispiel 19

Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin-Konjugat von Oxyessigsäureimino-verlängertem Atiocyclosporin

Zu einer gerührten Lösung des Produkts aus Beispiel 18 (Verbindung (3), Schema I, 5 mg, 3,9 · 10&supmin;³ mmol) und N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS, 11 mg, 1,2 · 3,9 · 10&supmin;³ mmol) in getrocknetem DMF (0,2 ml) wurde 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC, 1,1 mg, 1,6 · 3,9 · 10&supmin;³ mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Argonatmosphäre bei R.T. für 5 h gerührt. Dünnschichtchromatographie (Kieselgel, Ethylacetat/MeOH/AcOH 85 : 15 : 0,4) wurde zur Beobachtung der Reaktion verwendet. Durch diese Technik wurde alles Startmaterial aufgebraucht. Das aktivierte Esterprodukt wurde nicht isoliert, gereinigt oder charakterisiert. Zu einer Lösung von Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH, 64% Reinheit, 17 mg, 2 · 10&supmin;&sup5; mmol) in Phosphatpuffer (pH &supmin;8,1, 100 mM, 2 ml) und DMF (0,2 ml) bei 4ºC wurde das aktivierte Esterprodukt über einen Zeitraum von 1 h zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht bei 4ºC gerührt. Das Gemisch wurde gegen H&sub2;O/DMF (80 : 20, 500 ml) und Wasser dialysiert. Das dialysierte Produkt wurde lyophilisiert, was das Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin-Konjugat von Oxyessigsäureimino-verlängertem Atiocyclosporin ergab (Formel (4), Schema I, 15 mg). Dieses Konjugat wird auch als M1-KLH-Konjugat bezeichnet.

Beispiel 20

Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Konjugatvon Oxyessigsäureimino-verlängertem Atiocyclosporin

Unter Einsatz des Verfahrens in Beispiel 14 und des Cyclosporin-Haptens aus Beispiel 18 wurde Atiocyclosporin, das über eine Oxyessigsäureimino-verlängerte Linkergruppe an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (Verbindung 4, Schema I, worin anstelle von KLH eine Konjugation an G6PDH besteht) konjugiert ist, hergestellt. Dieses Konjugat wird auch als M1-G6PDH-Konjugat bezeichnet.

Beispiel 21

Herstellung von monoklonalen Anti-Mi-Antikörpern

A. Allgemeine Verfahren

Unter Einsatz des Verfahrens in Beispiel 15 und dem Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin-Konjugat von Oxyessigsäureimino-verlängertem Atiocyclosporin-Produkt aus Beispiel 19 wurden monoklonale Antikörper hergestellt.
Das Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Konjugat des Oxyessigsäureimino-verlängerten Atiocyclosporin-Produkts aus Beispiel 20 wurde für ELISA-Screening verwendet.

B. Auswahl des Anti-Mi-Antikörpers

Ein Gesamtmenge von Balb/c-Mäusen wurden immunisiert. Nach drei Immunisierungen (100 ug/Injektion/Maus, monatlich) wurde den Mäusen an der Schwanzvene Blut abgenommen und die Antikörper-Titer bestimmt. Gemäß Forward-ELISA-Vorschrift wurden Reihenverdünnungen von Seren sowohl gegen CsA-G6PDH als auch M1-G6PDH gescreent. Die anfänglichen Titer waren gegen M1-G6PDH 3 Mal höher als gegen CsA- G6PDH. Gegen M1-G6PDH gescreente Titer waren 1 : 30000, wogegen gegen CsA- G6PDH gescreente Titer nur 1 : 10000 waren.
Vier Fusionen wurden durchgeführt. Zur Zeit der Fusion waren die Milzen leicht vergrößert, was auf eine erhöhte Immunantwort hinweist. Die durch Verdrängung bestimmte Größe der Milzen lag im Bereich von 0,25 bis 0,5 ml.
Primäre Screenings wurden mittels reverser ELISA an jeweils mehreren Platten, die mit Kaninchen-α-Mäuse-IgG + IgA + IgM-Ketten (Zymed, 458, Carlton Court, S. San Francisco, CA 94080, U.S.A., Nr. 61-6400SY) beschichtet waren, durchgeführt. Die primäre Screening-Reaktion variierte von 3 bis 36 ELISA-positiven Näpfen je Fusion.
Sekundäre Screenings wurden mittels EMIT®-Antikörpern durchgeführt. Antikörper wurden auf Fähigkeit zur CsA-G6PDH-Inhibierung getestet. Antikörper wurden gewählt, die in Gegenwart von Anti-CsA-Antikörpern eine Aufhebung der Inhibierung in Gegenwart von CsA, nicht jedoch eine Aufhebung von Inhibierung in Gegenwart von M1 zeigten; und M1-G6PDH inhibierten, jedoch im Wesentlichen nicht CsA banden oder CsA- G6PDH inhibierten. Ein Antikörper (Klon 2B10) wurde als monoklonaler Anti-Mi-Antikörper ausgewählt.

C. Herstellung und Reinigung von Anti-Mi-Antikörper

Zellen mit der Fähigkeit zur Produktion des monoklonalen Anti-Mi-Antikörpers (Klon 2B10) wurden in Zentrifugenröhrchen bei 37ºC und 7% CO gezüchtet. Kulturen wurden durch Fütterung mit frischem Medium und Aufteilung der Kulturen auf zusätzliche oder größere Gefäße erhalten. Zellzahl- und Lebensfähigkeitsbestimmungen mittels Trypanblau wurden routinemäßig durchgeführt, um das Zellwachstum zu überwachen. Paragon-Gelelektophorese an Stach bis 10fach konzentrierten verbrauchten Medien wurden ebenfalls routinemäßig durchgeführt, um die Antikörperproduktion zu überwachen. Nach 10 Tagen wurden die Kulturen in einer Beckman-RC2B-Zentrifuge bei 5000 U/min für 15 Minuten und bei 4ºC zentrifugiert, um die Zellen vom Antikörper zu entfernen.
Der Antikörper in 15 l Kulturflüssigkeit wurde 5fach konzentriert und in einen 10 mM MES-Puffer dialysiert.
Der Antikörper wurde durch Säulenchromatographie an Bakerbond ABx (J. T. Baker Ine Nr. 7269-00) gereinigt. Eine 50 cm hohe Säule mit 2,6 cm Durchmesser wurde mit etwa 100 Gramm von in 10 mM MES-Puffer äquilibriertem ABx gepackt. Der Antikörper wurde mit 5 ml/min aufgetragen und dann mit einem 1 l-Gradienten von 10 mM MES pH 5, 6 bis 200 mM NaCl/100 mM Tris pH 7 eluiert. Proben wurden von der Säule in 10 ml-Fraktionen abgenommen und die Absorption bei 280 nm auf Proteingehalt überwacht. Antikörper enthaltende Fraktionen wurden vereinigt.

Beispiel 22

EMIT®-Test-Leistung mit Anti-Mi-Antikörper

Der Test aus Beispiel 17 wurde durchgeführt unter Verwendung eines monoklonalen Anti-CsA-Antikörper-Reagens, das zusätzlich zu den in Beispiel A spezifizierten Inhalten den Anti-Mi-Antikörper aus Beispiel 21 enthielt.
Kreuzreaktivität mit den vier Cyclosporin A-Hauptmetaboliten wurde in Gegenwart von 200 ng/ml Cyclosporin A beurteilt. Keine klinisch signifikante Kreuzreaktivität (klinisch signifikante Kreuzreaktivität ist Kreuzreaktivität, welche die CsA-Mengenbestimmung um ≥ 20% erhöhte) wurde bei den Metaboliten M1, M8, M17 oder M21 beobachtet.
Andere Aspekte der Test-Leistung waren im Wesentlichen unbeeinflusst.
Obwohl die vorangehende Erfindung anhand von Beispielen ziemlich ausführlich beschrieben worden ist, liegt es auf der Hand, dass gewisse Änderungen und Modifizierungen innerhalb des Schutzumfangs der angefügten Ansprüche vorgenommen werden können. Insbesondere können unwesentliche Veränderungen der Struktur der Linkergruppen von Verbindungen der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden. Solche Modifizierungen, welche die Eigenschaften der Verbindungen oder Antikörper der vorliegenden Erfindung nicht signifikant verändern, werden als offensichtlich angesehen.

Claims

1. Verfahren zum Inaktivieren eines Cyclosporin-Metaboliten in einem Test zum Messen der Cyclosporin-Menge in einer Probe, von der vermutet wird, dass sie Cyclosporin enthält, welches das Kombinieren eines Testmediums, das die Probe enthält, mit einem Antikörper umfasst, der zur Bindung des Cyclosporin-Metaboliten fähig ist, worin der Antikörper den Test zum Messen der Cylcosporin-Menge nicht stört.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Antikörper ein Antikörper ist, der sich an den Cyclosporin-Metaboliten M-1 bindet und der im Wesentlichen unfähig zur Bindung an Cyclosporin A ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 zum Messen der Cyclosporin-Menge in einer Probe, von der vermutet wird, das sie Cyclosporin enthält, folgende Schritte umfassend:

a) das Kombinieren in einem wässrigen Medium

1) der Probe, von der vermutet wird, dass sie Cyclosporin enthält,

2) von an Markierung konjugiertem Cyclosporin (Cyclosporin-Konjugat),

3) eines ersten Antikörpers, der zur Bindung an Cyclosporin und an das Cyclosporin-Konjugat fähig ist, und

4) eines zweiten Antikörpers, der zur Bindung an Cyclosporin-Metaboliten fähig ist; sowie

b) das Bestimmen der Aktivität der Markierung.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin der zweite Antikörper ein Antikörper ist, der zur Bindung an den Cyclosporin-Metaboliten M1 fähig ist, aber im Wesentlichen unfähig zur Bindung an Cyclosporin A oder das Cylcosporin-Konjugat ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, worin der zweite Antikörper ein Antikörper ist, der als Reaktion auf eine Verbindung der Formel:

gebildet wird, worin

Z ein immunogener Träger ist;

m eine Zahl von 1 bis zum Molekulargewicht von Z dividiert durch 5.000 ist, und

A ein Cyclosporin-Derivat der Formel:

ist, worin:

Y eine Bindung oder eine Linkergruppe aus 1 bis 60 Atomen (ohne Wasserstoff) ist, die eine Kette mit einer Länge von nicht mehr als etwa 30 Atomen aufweist.

6. Zusammensetzung, die aus einem Immunkomplex aus einem Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Hapten-Konjugat (G6PDH-Konjugat), einem Antikörper gegen Cyclosporin und einem zweiten Antikörper besteht, der sich an Cyclosporin-Metaboliten bindet, aber sich im Wesentlichen nicht an Cyclosporin oder das G6PDH-Konjugat bindet.

7. Verbindung der Formel:

worin

Z ein Hydroxyl, eine Markierung oder eine Gruppe mit einem Molekulargewicht von über 5.000 ist;

m eine Zahl von 1 bis zum Molekulargewicht von Z dividiert durch 5.000 ist; und

A ein Cyclosporinderivat der Formel

ist, worin

Y eine Bindung oder eine Linkergruppe aus 1 bis 60 Atomen (ohne Wasserstoff) ist, die eine Kette mit einer Länge von nicht mehr als 30 Atomen aufweist;

R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; Wasserstoff oder Hydroxyl sind, mit der Maßgabe, dass zumindest eines von R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; Hydroxyl ist;

R&sub4; Wasserstoff oder Niederalkyl ist; und

R&sub5; Hydroxyl ist und R&sub6; Wasserstoff ist.

8. Verbindung nach Anspruch 7, worin R&sub5; Hydroxyl ist und R&sub6; Wasserstoff ist.

9. Verbindung nach Anspruch 7 oder 8, worin R&sub1; Hydroxyl ist, R&sub2; und R&sub3; Wasserstoff sind und R&sub4; Methyl ist.

10. Verbindung nach Anspruch 7, 8 oder 9, worin Y der Formel

entspricht.

11. Als Reaktion auf eine Verbindung nach Anspruch 7 erzeugte Antikörper, worin Z ein immunogener Träger ist und worin die Antikörper zur Bindung an eine Verbindung nach Anspruch 8 fähig sind, worin Z eine Markierung ist und die Antikörper im Wesentlichen unfähig zur Bindung an Cyclosporin sind.

12. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 7, folgende Schritte umfassend:

a) das oxidative Spalten eines Cyclosporin-Metaboliten an der olefinischen Seitenkette von Aminosäurerest Nr. 1,

b) das Umsetzen des Produkts aus a) mit einer Aminooxyalkansäure,

c) das Aktivieren des Produkts aus b) für die Konjugation,

d) das Bilden der Verbindung nach Anspruch 8 durch Umsetzen des aktivierten Produkts aus c) mit einer Markierung oder einem immunogenen Träger.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin vor dem Messen der Cyclosporin-Menge in der Probe das störende kreuzreaktive Material aus der Probe entfernt wird.