MXPA06007856A

MXPA06007856A - Anticuerpo monoclonal especifico de factor de estimulacion de colonias de macrofagos (m-csf) y usos del mismo.

Info

Publication number: MXPA06007856A
Application number: MXPA06007856A
Authority: MX
Inventors: Cheng Liu; Deborah Lee Zimmerman; Gregory Martin Harrowe; Kirston Koths; William Michael Kavanaugh; Li Song; Maria Calderon-Cacia; Arnold H Horwitz
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 2004-01-07
Filing date: 2005-01-06
Publication date: 2007-03-23
Also published as: CN107090034B; JP2011078435A; JP2013208125A; HK1095841A1; NO20063569L; RU2401277C2; SI1704166T1; KR101307868B1; US20140242071A1; EP1704166A2; PT2311873T; CN107090034A; BRPI0506726A; US20170152311A1; SI2311873T1; CA2552750C; US9522186B2; DK2311873T3; KR101352853B1; EP2311873B1

Abstract

Se proporcionan anticuerpos derivados de RX-1 o basados en RX-1 especificos de M-CSF, junto con composiciones farmaceuticas que contienen este anticuerpo, Kits que contienen una composicion farmaceutica, y metodos para prevenir y tratar perdida osea en un sujeto afligido con una enfermedad osteolitica.

Description

ANTICUERPO MONOCLONAL ESPECIFICO DE FACTOR DE ESTIMULACIÓN DE COLONIAS DE MACROFAGOS (M-CSF) Y USOS DEL MISMO Campo de la Invención Esta invención se refiere a métodos para prevenir y tratar osteólisis, metástasis de cáncer y pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer al administrar a un sujeto un anticuerpo específico de M-CSF.

Antecedentes de la Invención La metástasis de cáncer es la causa principal de recurrencia post-operación o post-terapia en pacientes con cáncer. A pesar de esfuerzos intensivos para desarrollar tratamientos, la metástasis de cáncer permanece sustancialmente reacia a terapia. El hueso es uno de los sitios más comunes de metástasis de varios tipos de canceres humanos (por ejemplo, canceres de mama, pulmón, próstata y tiroides) . La ocurrencia de las metástasis osteolíticas de hueso provoca morbilidad seria debida a dolor intratable, alta susceptibilidad a fractura, compresión de nervios e hinpercalcemia. A pesar de la importancia de estos problemas clínicos, hay pocos tratamientos disponibles para la pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer. Los osteoclastos medían la readsorción ósea. Los osteoclastos son células multinucleadas que se diferencian REF:174326 de células hemopoyéticas . En general se aceptan que los osteoclastos se formen por la función de precursores mononucleares derivados de células madre hemopoyéticas en la médula ósea, en lugar de inhibición celular incompleta (Chambers, Bone and Mineral Research, 6 : 1-25, 1989; Gdthling et al., Clin Orthop Relat R. 120: 201-228, 1976; Kahn et al., Nature 258: 325-327, 1975, Suda et al., Endocr Rev 13: 66-80, 1992; Waiker, Science 180: 875, 1973; Waiker, Science 190: 785-787, 1975; Waiker, Science 190: 784-785, 1975) . Comparten una célula madre común con las células de linaje de monocitos-macrófagos (Ash et al., Nature 283: 669-670, 1980, Kerby et al., J. Bone Miner Res 7: 353-62, 1992). La diferenciación de los precursores de osteoclastos en osteoclastos multinucleados maduros requiere diferentes factores que incluyen estímulos hormonales y locales (Athanasou et al., Bone Miner 3: 317-333, 1988; Feldman et al., Endocrinology 107: 1137-1143, 1980; Waiker, Science 190: 784-785, 1975; Zheng et al., Histochem J 23: 180-188, 1991) y el hueso vivo y células óseas se ha mostrado que juegan un papel crítico en el desarrollo de los osteoclastos (Hagenaars et al., Bone Miner 6: 179-189, 1989). Las células estromales de la médula ósea osteoclásticas también se requieren para la diferenciación de los osteoclastos.

Uno de los factores producidos por estas células que soportan la formación de osteoclastos es el factor de estimulación de colonias de macrófagos M-CSF (Wiktor- Jedrzejczak et al., Proc Nati Acad Sci USA 87: 4828-4832, 1990; Yoshida et al., Nature 345: 442-444, 1990). El activador del receptor para el ligando de NF- B (RANKL, también conocida como TRANCE, ODF y OPGL) es otra señal (Suda et al., Endocr Rev 13: 66-80, 1992) a través de la cual las células osteoblásticas/estromales estimula la formación y resorpción de osteoclastos vía un receptor, RANK (TRANCER) , localizado en los osteoclastos y precursores de osteoclastos (Lacey et al., Cell 93: 165-176, 1998; Tsuda et al., Biochem Biophys Res Co 234: 137-142, 1997; Wong et al., J Exp Med 186: 2075-2080, 1997; Wong et al., J Biol. Chem 272: 25190-25194, 1997; Yasuda et al., Endocrinology 139: 1329-1337, 1998; Yasuda et al., Proc Nati Acad Sci US 95: 3597-3602, 1998). Los osteoblastos también segregan una prote na que inhibe fuertemente la formación de osteoclastos llamada osteoprotegerina (OPG, también conocida como OCIF) , que actúa como un receptor de señuelo para el RANKL inhibiendo de esta manera la señal positiva entre los osteoclastos y osteoblastos mediante RANK y RANKL. Los osteoclastos son responsables de disolver tanto la matriz ósea orgánica como mineral (Blair et al., J Cell Biol 102: 1164-1172, 1986). Los osteoclastos representan células terminalmente diferenciadas que expresan una morfología polarizada única con áreas de membrana especializadas y varios marcadores citoplasmáticos y de membrana, tal como fosfatasa acida resistente a tartrato (TRAP) (Anderson et al. 1979), anhidrasa II carbónica (Váán nen et al., Histochemistry 78: 481-485, 1983), receptor de calcitonina (Warshafsky et al., Bone 6: 179-185, 1985) y receptor vitronectina (Davies et al., J Cell Biol 109: 1817-1826, 1989). Los osteoclastos multinucleados usualmente contienen menos de 10 núcleos, pero pueden contener hasta 100 núcleos que son de entre 10 y 100 m de diámetro (Góthling et al., Clin Orthop Relat R 120: 201-228, 1976) . Esto los hace fácilmente identificados por microscopía de luz. Están altamente vacuolados cuando están en el estado activo, y también contienen muchas mitocondrias, indicativo de una alta velocidad metabólica (Mundy, in Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism, pag. 18-22, 1990) . Puesto que los osteoclastos juegan un papel principal en las metástasis osteolíticas del hueso, existe la necesidad en la técnica de nuevos agentes y métodos para prevenir la estimulación y función de los osteoclastos. De esta manera, permanece una necesidad en la técnica de identificar nuevos agentes y métodos para prevenir o tratar osteólisis o metástasis de cáncer, incluyendo metástasis osteolíticas de hueso.

Breve Descripción de la Invención Los materiales y métodos de la presente invención cumplen las necesidades mencionadas anteriormente y otras relacionadas en la técnica. En una modalidad de la invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal no murino, que incluye fragmento funcional, que se une de manera específica al mismo epitope de M-CSF como cualesquiera del anticuerpo monoclonal murino RXl, MCI o MC3 que tiene las secuencias de aminoácidos expuestas en las Figuras 4, 14 y 15, respectivamente. En una modalidad relacionada, se proporciona un anticuerpo mencionado anteriormente, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal que incluye un anticuerpo humano Engineered"; un anticuerpo humanizado; un anticuerpo humano; un anticuerpo quimérico; un fragmento de anticuerpo Fab, F(ab')2; Fv; Se Fv o SCA; un diacuerpo; un anticuerpo lineal; o una muteina de cualquiera de estos anticuerpos, que retenga de manera preferente la afinidad de unión de al menos 10"7, 10"8 o 10"9 o superior. Un anticuerpo monoclonal no murino, que incluye fragmento funcional, que compite con el anticuerpo monoclonal RXl, MCI, y/o MC3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4 para la unión a M-CSF por más de 75 %, también se contempla. En otra modalidad, se proporciona un anticuerpo monoclonal no murino, incluyendo un fragmento funcional, en donde el anticuerpo monoclonal no murino o fragmento funcional del mismo se une a un epitope de M-CSF que incluye al menos 4, 5, 6, 7 u 8 residuos contiguos de los aminoácidos 98-105 de la Figura 12. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal no murino, incluyendo fragmento funcional, en donde el anticuerpo monoclonal no murino o fragmento funcional del mismo se une a un epitope de M-CSF que incluye al menos 4, 5, 6, 7 u 8 residuos contiguos de los aminoácidos 65-73 o 138-144 de la Figura 12 (que corresponden a los epitopes M-CSF reconocidos por 5H4 o MC3) . En aún otra modalidad, se proporciona el anticuerpo mencionado anteriormente o fragmento que se une a un epitope de M-CSF que incluye los aminoácidos 98-105 de la Figura 12. En una modalidad relacionada, el anticuerpo mencionado anteriormente se proporciona que comprende CDR3 de la Figura 4A. En otra modalidad, se proporciona el anticuerpo que comprende al menos 1, 2, 3,4 ,5 o 6 CDR del anticuerpo murino RXl expuesto en la Figura 4A. Este anticuerpo que comprende al menos 1, 2, 3, 4 o 5 CDR del anticuerpo murino RXl también puede comprender al menos 1, 2, 3, 4 o 5 CDR de cualquiera de las 6 CDR del anticuerpo 5H expuesto en la Figura 16A-B. De manera alternativa, el anticuerpo que comprende al menos 1, 2, 3, 4 o 5 CDR del anticuerpo murino RXl también puede comprender al menos 1, 2 , 3 , 4 o 5 CDR de cualquiera de las 6 CDR del anticuerpo MCI expuesto en la Figura 16A-B. En aún otra alternativa, el anticuerpo mencionado anteriormente también puede comprender al menos 1, 2, 3, 4 o 5 CDR de cualquiera de las 6 CDR del anticuerpo MC3 expuesto en la Figura 16A-B. En una modalidad relacionada, se proporciona el anticuerpo que comprende al menos 1, 2, 3, 4 o 5 CDR del anticuerpo murino RXI que puede comprender al menos 1, 2, 3, 4 o 5 CDR de las CDR de consenso expuestos en la Figura 16A-B. En aún otra modalidad relacionada, en el anticuerpo mencionado anteriormente, uno o más residuos de las CDR de consenso está sustituido por el residuo correspondiente de cualquiera de las CDR del anticuerpo murino RXl, 5H4, MCI o MC3. La afinidad de unión deseada se puede retener aunque se hayan mutado uno o más de los aminoácidos en el anticuerpo, por ejemplo, por sustituciones conservadoras en las CDR, y/o cambios conservadores o no conservadores en los residuos de bajo y moderado riesgo. En otra modalidad de la invención, se proporcionan variantes del anticuerpo mencionado anteriormente, que comprenden una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que es al menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% homologa a la secuencia de aminoácidos expuesta en las Figuras 4A, 13 , 14 o 15. En una modalidad relacionada, el anticuerpo, comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que es al menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% homologa a la secuencia de aminoácidos expuesta en las Figuras 4A, 13, 14 o 15. En aún otra modalidad, el anticuerpo comprende una región constante y una o más regiones de estructura variable de cadena pesada y ligera de una secuencia de anticuerpo humano. En una modalidad relacionada, el anticuerpo comprende una región constante modificada o no modificada de una IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 humana. En una modalidad preferida, la región constante es IgGl o IgG4 humana, que puede estar opcionalmente modificada para mejorar o disminuir ciertas propiedades. En el caso de IgGl, las modificaciones a la región constante, particularmente la región de charnela o CH2 , puede incrementar o disminuir la función del efector, incluyendo la actividad de ADCC y/o CDC. En otras modalidades, se modifica una región constante de IgG2 para disminuir la formación de agregados a anticuerpo-antígeno. En el caso de IgG4, las modificaciones a la región constante, partic larmente la región de charnela, puede reducir la formación de medios anticuerpos. En aún otra modalidad de la invención, el anticuerpo mencionado anteriormente se deriva de, se basa en, o contiene parte de, una secuencia de consenso humana, una secuencia de línea germinal humana, una secuencia de línea germinal de consenso humana, o cualquiera de las secuencias de anticuerpo humanas en Kabat, NCBl Ig Blast, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi, base de datos Kabat http://www.bioinf.org.uk/abs/seqtest.html, sitio FTP para Kabat Reléase 5.0 (1992) ftp://ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat/Rel5-0/, base de datos I MunoGeneTics (Montpellier Francia) http: //imgt . cnusc. fr: 8104/, V-Base http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/LIST.php?menu=901, Zurich University http: //www.unizh. cht/-antibody/Sequences/index.html, The Therapeutic Antibody Human Homology Project (TAHHP) http: //www. path.cam.ac.uk/-mrc7/humanisation/TAHHP. tml, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Domains http://how.to/AnalyseAntibodies/, Humanization by design http: //people . cryst .bbk.ac .ukk-ubcg07s/, Antibody Resources http: //www.antibodyresource . com/educational .html, Antibody Engineering (by TT Wu) , Humana Press. En un aspecto preferido de la invención, el anticuerpo mencionado anteriormente es un anticuerpo humano Engineered11 por ejemplo, la secuencia del anticuerpo humano Engineered^ es cualquiera de las secuencias expuestas de las Figuras 23-24. Se contemplan otros anticuerpos humanos Engineered^ o variantes de los mismos.

Por ej emplo , en una modalidad, el anticuerpo basado en RXl mencionado anteriormente se proporciona, en donde la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos X1VX2LX3EX4GXsXeX7X8XsX10X11X12X;L3LX14LX15CX16VX17DYSITSDYAWNWIX18QX19X20 ^2i^22^23-'-J'^24W^<^YISYSGS SX25NX25X27LX28X29X30LX3;LLX32RX33X34X3SX36X37X38FX39 LX40LX41X42VX43X44X45DX4SAX47YYCASDFYAHAMDYWGX48GTX49VX50VX51X52 ( SEQ . ID . No . : 124 ) , en donde X es cualquier aminoácido . En una modalidad relacionada, se proporciona el anticuerpo en donde la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos DVX1LX2EX3GPX4X5VXSPX7X8X9LX10LX11CX12VTDYSITSDYAWNWIRQX13PX;L4X;L5KLEW MGYISYSGSTSYNPSLKX?eRIX17LX18RX19TX20X21NX22FX23LX24LX25X26VX27X28X29DX30 ATYYC SFDY H MDY GX31GTX32VX33VX34X3S (SEQ . ID . No . : 125 ) , en donde X es cualquier aminoácido . En aún otra modalidad de la invención, el anticuerpo mencionado anteriormente se proporciona, en donde la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos X1VQLQESGPGLVKPSQX2LSLTCTVX3DYSITSDYAWNWIRQFPGX4X5LEWMGYSISYSG STSYNPSLKSRIX6IX7RDTSKNQFX8LQLNSVTX3X10DTAX11YYCASFDYAHAMDYWGQG TX12VTVSS (SEQ . ID . No . : 126 ) , en donde X es cualquier aminoácido . En una modalidad relacionada, se proporciona el anticuerpo , en donde la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos DVQLQESGPGLVKPSQXiLSLTCTVTDYSITSDYAWNWIRQFPGX-^LEWMGYISYSGSTS YNPSLKSRIX3LX4RDTSKNQFXSLQLNSVTX6X7DTATYYCASFDYAHAMDYWGQGTX8VTV SS (SEQ. ID. No. : 127) , en donde X es cualquier aminoácido. En aún otra modalidad, el anticuerpo se proporciona, en 5 donde la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTDYSITSDYAWNWIRQFPGKKLEWMGYISYSGSTSY NPSLKSRITISRDTSKNQFSLQLNSVTAADTATYYCASFDYAHAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ. ID. No. : 41) . En aún otra modalidad, el anticuerpo se 10 proporciona en donde la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSDYSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTSY NPSLKSRITISRDTSKNQFSLQLNSVTAADTAVYYCASFDYAHAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ. ID. No. : 43) . 15 En aún otra modalidad de la invención, el anticuerpo mencionado anteriormente se proporciona en donde la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos X1LX2LX3QX4XSX6X7X8X9VX10X11X12X13X;L4VX1SFX1SCX17AX18QSIGTSHIHWYX19QX20X2:L ^ X22^23^24PX25^^^K^^^^^26^27^28^29LX30X31^32^^33^^34^^3S^-^36^37^,^38LX39 X40X41 VX42X43X44DX4SADYYCQQINSWPTTFGX4SGTX47LX48X4SX50X51XS2 (SEQ . ID . No . : 128 ) , en donde X es cualquier aminoácido . En una modalidad relacionada, se proporciona el anticuerpo en donde la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de 5 aminoácidos X1LX2LX3QX4PX5X6LX7VX8PX9X10X11VX12FX13CX14ASQSIGTSIHWYQQX15TX1SX17SPRL LIK ASEX13lSX1qIPX2oí FX2i ^22 ^-"-23^ *14 ^25^- ^ 6 ^-'^271^28^29 ^30^31^3 33"^^ CQQINSWPTTFGX34GTX35LX36X37X38X39X40 (SEQ . ID . No . : 129 ) , en donde X es cualquier aminoácido . En aún otra modalidad, se proporciona el anticuerpo en donde la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos X1LX2LTQSPX3X4LSVSPGERVX5FSCRASQSIGTSIHWYQQX6TX7X8XSPRLLIKYASEX10 X11X12GIPX13RFSGSGSGTDFTLX14LX15XleVESEDX17ADYYCQQINSWPTTFGX18GTKLE IKRX19 ( SEQ . ID . No . : 130 ) , en donde X es cualquier aminoácido . En otra modalidad de la invención, el anticuerpo mencionado anteriormente se proporciona en donde la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos X1LX2LTQSPX3X4LSVPGERVX5FSCRASQSIGTSIHWYQQX6TX7X8SPRLLIKYASEX9IS GIPX10RFSGSGSGTDFTLX11LX12X13VESEDX14ADYYCQQINSWPTTFGX15GTKLEIKRX1 6 (SEQ . ID . No . : 131) , en donde X es cualquier aminoácido . En una modalidad relacionada, se proporciona el anticuerpo en donde la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos X1LX2LTQSPX3X4LSVSPGERVS5FSCRASQSIGTSIHWYQQXsTX7XaX9PRLLIKYASESI SGIPX10RFSGSGSGTDFTLX11LX12X13VESEDX14ADYYCQQINSWPTTFGX1SGTKLEIKR X?e ( SEQ . ID . No . : 132 ) , en donde X es cualquier aminoácido . En aún otra modalidad, se proporciona el anticuerpo en donde la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos EIVLTQSPGTLSVSPGERVTFSCRASQSIGTSIHWYQQKTGQAPRLLIKYASESISGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRVESEDFADYYCQQINSWPTTFGQGTKLEIKRT (SEQ. ID. No. : 45) . En aún otra modalidad de la invención, se proporciona el anticuerpo mencionado anteriormente en donde la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos EIVLTQSPGTLSVSPGERVTFSCRASQSIGTSIHWQQKTGQAPRLLIKYASERATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRVESEDFADYYCQQINSWPTTFGQGTKLEIKRT (SEQ. ID. No.: 47). En otra modalidad, se proporciona el anticuerpo, en donde la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos EIVLTQSPGTLSVSPGERVTFSCRASQSIGTSIHWYQQKTGQSPRLLIKYASERISGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRVESEDFADYYCQQINSWPTTFGQGTKLEIKRT (SEQ. ID. No . : 48). En otra modalidad de la invención, se proporciona el anticuerpo mencionado anteriormente en donde al menos un X es un correspondiente aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4A. En una modalidad relacionada, se proporciona el anticuerpo en donde al menos un X es una substitución conservadora (de acuerdo a la Tabla 1) de un correspondiente aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4A. En aún otra modalidad relacionada, se proporciona el anticuerpo en donde al menos un X es una substitución no conservadora (de acuerdo a la Tabla 1) de un aminoácido correspondiente dentro de la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4A. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona el anticuerpo en donde al menos un X es un correspondiente aminoácido dentro de una secuencia de anticuerpo humano. El anticuerpo humano Engineered1® mencionado anteriormente se deriva de, se basa en, o contiene parte de la secuencia de consenso del anticuerpo humano, secuencia de línea germinal humana, secuencia de línea germinal de consenso humana, o cualquiera de las secuencias de anticuerpo humano en Kabat, NCBl Ig Blast, http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline. cgi, Kabat Datábase http://www.bioinf.org.uk/abs/segtest.html, sitio FTP para Kabat Reléase 5.0 (1992) ftp: //ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat/Rel5. O/, ImMunoGeneTics datábase (Montpellier Francia) http: //imgt. cnusc. fr: 8104/, V-Base http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/LIST.php?menu=901, Zurich University http://www.unizh.ch/-antibody/Sequences/index.html, The Therapeutic Antibody Human Homology Project (TAHHP) http : //www.pat . cam. ac . uk/-mrc7/humanisation/TAHHP . html, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Domains http://how.to/AnalyseAntibodies/, Humanization by design http://people.cryst.bbk.ac.uk/-ubcg07s/, Antibody Resources http: //www.antibodyresource . com/educational .html, Antibody Engineering (by TT Wu) , Humana Press. En otra modalidad de la invención, se proporciona el anticuerpo mencionado anteriormente, en donde la secuencia del anticuerpo humano Engineered™11 es una de las secuencias expuestas en las Figuras 23-24 o 29-30. En otra modalidad, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que es al menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% idéntica de una de las secuencias de aminoácidos de cadena pesada expuesta en la Figura 19B. En aún otra modalidad, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que es al menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a una de las secuencias de aminoácidos de cadena ligera expuesta en cualquiera de las Figuras 20B-22B. En aún otra modalidad, el anticuerpo mencionado anteriormente tal como el anticuerpo 5H4, MCI o MC3 con las secuencias expuestas en una de las Figuras 24C-24E es humano Engineered™1 de acuerdo a los métodos expuestos en Studnicka et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,766,886 y Ejemplo 4A en la misma, usando la numeración Kabat expuesta en las Figuras 24C-24E para identificar residuos de riesgo bajo, moderado y alto. En una modalidad relacionada, se proporciona el anticuerpo mencionado anteriormente en donde todos los residuos de bajo riesgo de ya sea la cadena pesada o ligera o ambas se modifican, donde es necesario, para ser los mismos residuos como una secuencia de inmunoglobulina de referencia humana. De manera similar, otra modalidad de la invención proporciona el anticuerpo mencionado anteriormente en donde todos los residuos de riesgo bajo + moderado de ya sea la cadena pesada o ligera o ambas se modifican, donde es necesario, para hacer los mismos residuos como una secuencia de inmunoglobulina de referencia humana. Una cadena pesada en donde todos los residuos de bajo riesgo se han modificado, se puede combinar con una cadena ligera en donde todos los residuos de riesgo bajo y moderado se han modificado, y vice versa. De manera similar, se puede combinar una cadena ligera o pesada humana Engineered™ mencionada anteriormente con una cadena ligera o pesada de un anticuerpo humanizado o quimérico. En aún otra modalidad, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que es al menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 , 97, 98 o 99% idéntica a una de las secuencias de aminoácidos de cadena pesada descrita inmediatamente antes, humana Engineered" de acuerdo al método de Studnicka. En aún otra modalidad, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que es al menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a una de las secuencias de aminoácidos de cadena ligera descrita inmediatamente antes humana Engineered™1 de acuerdo al método Studnicka. En aún otra modalidad, se proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada como se expone anteriormente y una cadena ligera como se expone anteriormente . En aún otra modalidad de la invención, el anticuerpo mencionado anteriormente tiene un Kd de afinidad de al menos ' 10 [-7] . En una modalidad relacionada, el anticuerpo tiene una Kd de afinidad de al menos 10 [-9] . En otra modalidad de la invención,, el anticuerpo mencionado anteriormente se proporciona que es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal incluyendo un anticuerpo humano Engineered™1; un anticuerpo humanizado; un anticuerpo humano; un anticuerpo quimérico; un fragmento de anticuerpo Fab, F(ab')2, Fv, ScFv o SCA; un diacuerpo; un anticuerpo lineal; o una muteina de cualquiera de estos anticuerpos. En - una modalidad relacionada, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo aislado. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena ligera del anticuerpo mencionado anteriormente . En una modalidad relacionada, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia de ácido nucleico de cadena pesada que es al menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos de cadena pesada expuesta en las Figuras 4A, 13, 14 o 15. En aún otra modalidad relacionada, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótidos de cadena ligera que es al menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos de cadena ligera expuesta en las Figuras 4A, 13 , 14 o 15. En otra modalidad, se proporciona un vector que comprende el ácido nucleico aislado mencionado anteriormente. En una modalidad relacionada, se proporciona el . vector mencionado anteriormente en donde el ácido nucleico aislado está enlazado de manera operable a una secuencia de control reguladora. En aún otra modalidad, se proporciona una célula hospedadora que comprende el vector mencionado anteriormente . Se contemplan numerosos métodos en la presente invención. Por ejemplo, se proporciona un método para producir un anticuerpo mencionado anteriormente que comprende cultivar la célula hospedadora mencionada anteriormente tal que el ácido nucleico aislado se exprese para producir el anticuerpo. En una modalidad relacionada, el método comprende además el paso de recuperar el anticuerpo del cultivo de célula hospedadora. En una modalidad relacionada, se proporciona un anticuerpo aislado producido por el método mencionado anteriormente. También se proporciona por la presente invención un hibridoma que segrega un anticuerpo mencionado anteriormente. Adicionalmente, se proporciona un anticuerpo mencionado anteriormente que se conjuga a una toxina. En otra modalidad de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las modalidades mencionadas anteriormente y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente adecuado. En una modalidad relacionada, la composición farmacéutica comprende además un segundo agente terapéutico . En aún otra modalidad relacionada, la composición farmacéutica se proporciona en donde el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico de cáncer. En aún otra modalidad relacionada, se proporciona la composición farmacéutica en donde el segundo agente terapéutico es un bisfosfonato. En otra modalidad, el segundo agente terapéutico es otro anticuerpo . Los anticuerpos de la presente invención se contemplan para que tengan numerosas características deseables para el tratamiento de enfermedades y trastornos. En una modalidad de la invención, se proporciona cualquiera de los anticuerpo mencionados anteriormente que se une a M-CSF para prevenir un sujeto afligido con una enfermedad que provoca o contribuye a osteólisis, en donde el anticuerpo reduce de forma efectiva la severidad de la pérdida ósea asociada con la enfermedad. De manera similar, se proporciona cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente que se une a M-CSF para tratar un sujeto afligido con una enfermedad que provoca o contribuye a osteólisis, en donde el anticuerpo reduce de manera efectiva la severidad de la pérdida ósea asociada con la enf rmedad . Se contemplan numerosas enfermedades y trastornos para ser tratables por el tratamiento basado en anticuerpo de la presente invención. En una modalidad de la invención, se proporciona el anticuerpo mencionado anteriormente en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de enfermedades óseas metabólicas asociadas con actividad relativamente incrementada de los osteoclastos, incluyendo endocrinopatías (hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatiroidismo primario o secundarios, hipertiroidismo) , hipercalcemia, estados de deficiencia (raquitismo/osteomalacia, escorbuto, mal nutrición) , enfermedades crónicas (síndromes de mala absorción, falla renal crónica (osteodistrofia renal) , enfermedad hepática crónica (osteodistrofia hepática) ) , fármacos (glucocorticoides (osteoporosis inducida por glucocorticoide) , heparina, alcohol) , y enfermedades hereditarias (osteogénesis imperfecta, homocistinuria) , cáncer, osteoporosis, osteopetrosis, inflamación de hueso asociada con artritis y artritis reumatoide, enfermedad periodontal, displasia fibrosa, y/o enfermedad de Pager. En una modalidad relacionada, el anticuerpo mencionado anteriormente que se une a M-CSF se proporciona para prevenir o tratar cáncer metastático al hueso, en donde el cáncer metastático es cáncer de mama, pulmón, renal, mieloma múltiple, de tiroides, próstata, adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, incluyendo leucemia y linfoma; cánceres de cabeza y cuello; cánceres gastrointestinales, incluyendo cáncer esofágico, cáncer estomacal, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer pancreático, cáncer hepático, cáncer de los conductos biliares o vesícula biliar; malignidades del tractogenital femenino, incluyendo carcinoma ovárico, cánceres endometriales uterinos, cáncer vaginal, y cáncer cervical; cáncer de vejiga; cáncer de cerebro, incluyendo neuroblastoma, sarcoma, osteosarcoma; y cáncer de piel, incluyendo melanoma maligno o cáncer de células escamosas . En otra modalidad de la invención, se proporciona un método para detectar un anticuerpo específico para M-CSF que comprende los pasos de poner en contacto el medio de células tumorales metastáticas, osteoclastos y un anticuerpo candidato; detectar la formación, proliferación y/o diferenciación de osteclastos; e identificar el anticuerpo candidato como un anticuerpo específico de M-CSF si se detecta una disminución en la formación, proliferación y/o diferenciación de osteclastos . De manera similar, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde el medio de células tumorales metastáticas incluye células de tumor. En otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde el paso de poner en contacto (a) se presenta in vivo, el paso de detección (b) comprende detectar el tamaño y/o número de metástasis óseas, y el anticuerpo candidato se identifica como un anticuerpo específico de M-CSF si se detecta una disminución en el tamaño y/o número de metástasis óseas. En una modalidad relacionada, se proporciona el método mencionado anteriormente que comprende además el paso de determinar si el anticuerpo candidato se une a M-CSF. De manera similar, otra modalidad de la invención proporciona el método mencionado anteriormente que comprende además el paso de determinar si el anticuerpo candidato inhibe la interacción entre M-CSF y su receptor M-CSFR. En otra modalidad de la invención, se proporciona un método para identificar un anticuerpo específico de M-CSF que puede prevenir o tratar cáncer metastático a hueso, que comprende los pasos de: (a) detectar la unión de un anticuerpo candidato a un epitope de M-CSF que incluye al menos 4 residuos contiguos de los aminoácidos 98-105 de la Figura 12; y (b) valorar la capacidad del anticuerpo candidato para prevenir o tratar cáncer metastático a hueso in vitro o in vivo. En otra modalidad de la invención, se proporciona un método para identificar un anticuerpo específico de M-CSF que puede prevenir o tratar cáncer metastático a hueso, que comprende los pasos de: (a) detectar la unión de un anticuerpo candidato a un epitope- de M-CSF que incluye al menos 4 residuos contiguos de los aminoácidos 65-73 o 138-144 de la Figura 12 (que corresponden a los epitopes de M-CSF reconocidos por 5H4 o MC3) ; y (b) valorar la capacidad del anticuerpo candidato para prevenir o tratar cáncer metastático a hueso o in vi tro o in vivo. En aún otra modalidad de la invención, un método para alterar una CDR de un anticuerpo que se une a un epitope de M-CSF que incluye los aminoácidos 98-105 de la Figura 12 se proporciona que comprende alterar un aminoácidos dentro de una CDR de la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4A y seleccionar un anticuerpo que se une a M-CSF con una Ka de afinidad de al menos 10 [-7] . En otra modalidad, se proporciona un método para alterar sistemáticamente hasta 60% de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada expuesta en la Figura 4A que comprende alterar cualquiera de X1-X52 en la secuencia de aminoácidos X1VX2LX3EX4GXsX6X7X8X9X10X11X:L2X13LX14LXlsCX?eVX17DYSITSDYAWNWIX18QX19X20 21 2"*^23 2 O x -L 0 25JM 26 27 28 29 30 31 32 33 3¿ 35 36 37 38 ^"39 LX40LX41X42VX43X44X4SDX46AX47YYCASFDYAHAMDYWGX48GTX49VX50VXS1X52 ( SEQ .

ID . No . : 133 ) , y probar un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos alterada para la unión a un epitope de M-CSF que incluye los aminoácidos 98 -105 de la Figura 12 . En una modalidad relacionada, se proporciona un método para alterar sistemáticamente hasta 60% de la secuencia de aminoácidos de cadena ligera expuesta en la Figura" 4A que comprende alterar cualquiera de X1-X52 en la secuencia de aminoácidos X1IX2LX3QX4XSX6X7X8X9VX10X:L1X12X13X14VX1SFX16CX17AX18QSIGTSIHWYX19QX20X21X 22X23X24PX25LLIKY SEX2eX27X28X29LX30X3:LX32FX33GX34GX3SGX3SX37FX38LX33LX40X4;LV X42X43X44DX45ADYYCQQINSWPTTFGX4eGTX47LX48X49XS0XslX52 (SEQ . ID . No . : 134 ) , y probar un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos alterada para la unión a un epitope de M- CSF que incluye los aminoácidos 98 -105 de la Figura 12 . En aún otra modalidad de la invención, se proporciona un método para alterar una CDR de un anticuerpo que se une a un epitope de M- CSF que incluye los aminoácidos 65 - 73 o 138 -144 de la Figura 12 (que corresponde a los epi topes de M-CSF reconocidos por 5H4 o MC3 ) que comprende alterar un aminoácido dentro de una CDR de la secuencia de aminoácidos expuesta en una de las Figuras 13 , 14 y 15 , y seleccionar un anticuerpo que se une a M-CSF con una Ka de afinidad de al menos 10 [-7] . En otra modalidad, se proporciona un método para alterar sistemáticamente hasta 60% de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada expuesta en una de las Figuras 13 , 14 y 15 que comprende alterar las secuencias mencionadas anteriormente de acuerdo a los métodos expuestos en Studnicka et al . , Patente de los Estados Unidos No. 5,766,886 y Ejemplo 4A en la misma, y de acuerdo a la numeración de Kabat expuesta en las Figuras 24C-24E, y probar un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos alterada para la unión a un epitope de M-CSF que incluye "los aminoácidos 65-73 o 138-144 de la Figura 12 (que corresponde a los epitopes M-CSF reconocidos por 5H4 o MC3) . En una modalidad relacionada, se modifican todos los residuos de bajo riesgo. De manera similar, en otra modalidad de la invención, se modifican todos los residuos de riesgo bajo y moderado. En aún otra modalidad, se modifican todos los residuos de riesgo bajo y moderado excluyendo las prolinas. En otra modalidad de la invención, se proporciona un método para expresar un anticuerpo que tiene CDR diseñados por el proceso mencionado anteriormente. En otra modalidad, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que se une a M-CSF en donde el anticuerpo se hace usando el método mencionado anteriormente . En aún otra modalidad de la invención, se proporciona un método para prevenir o reducir la pérdida ósea que comprende administrar a un sujeto afligido con una enfermedad que provoca o contribuye a osteólisis una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente, que previene o reduce de este modo la pérdida ósea asociada con la enfermedad. En una modalidad relacionada, se proporciona un método para tratar un sujeto afligido con una enfermedad que provoca o contribuye a osteólisis que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente, reduciendo de este modo la severidad de la pérdida ósea asociada con la enfermedad. En una modalidad relacionada, el método mencionado anteriormente se proporciona en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de enfermedades óseas metabólicas asociadas con actividad relativamente incrementada de los osteoclastos, incluyendo endocrinopatías (hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatiroidismo primario o secundario, hipertiroidismo) , hipercalcemia, estados de deficiencia (raquitismo/osteomalacia, escorbuto, desnutrición) , enfermedades crónicas (síndromes de mala absorción, falla renal crónica (osteodistrofia renal) , enfermedad hepática crónica (osteodistrofia hepática) ) , fármacos (glucocorticoides (osteoporosis inducida por glucocorticoides), heparina, alcohol), y enfermedades -hereditarias (osteogénesis imperfecta, homocistinuria) , cáncer, osteoporosis, osteopetrosis, inflamación de hueso asociada con artritis y artritis reumatoide, enfermedad periodontal, displasia fibrosas y/o enfermedad de Paget. En aún otra modalidad, se proporciona un método para prevenir o tratar cáncer metastático a hueso que comprende administrar a un sujeto afligido con cáncer métastático una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente. En una modalidad relacionada, se proporciona el método en donde el cáncer metastático es cáncer de mama, pulmón, renal, mieloma múltiple, de tiroides, próstata, adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, incluyendo leucemia y linfoma; canceres de cabeza y cuello; canceres gastrointestinales, incluyendo cáncer esofágico, cáncer estomacal, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer pancreático, cáncer hepático, cáncer del conducto biliar o vesícula biliar; malignidades del tracto genital femenino, incluyendo carcinoma ovárico, cánceres endometriales uterinos, cáncer vaginal y cáncer cervical; cáncer de vejiga; cáncer de cerebro, incluyendo neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma; y cáncer de piel, incluyendo melanoma maligno o cáncer de células escamosas. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona un método para prevenir la pérdida ósea y crecimiento tumoral que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo, cantidades terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente. En una modalidad relacionada, el método comprende además administrar un segundo agente terapéutico. En aún otra modalidad relacionada, se proporciona el método en donde el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico de cáncer o un bisfosfonato . En aún otra modalidad relacionada, se proporciona el método en donde el bisfonato es zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato o ibandronato. En aún otra modalidad relacionada, se proporcionan los métodos mencionados anteriormente en donde el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico citotóxico. En otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde el sujeto está imposibilitado de recibir tratamiento con bisfosfonato. En aún otra modalidad relacionada, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde el anticuerpo es efectivo para reducir la dosis del segundo agente terapéutico requerido para lograr un efecto terapéutico. En otra modalidad, el segundo agente terapéutico es un factor de no estimulación de colonias de M-CSF, por ejemplo, G-CSF, o un anticuerpo anti-RANKL, o un receptor de RANKL soluble. En otra operación de la invención, los métodos mencionados anteriormente se proporcionan en donde el sujeto es un mamífero. En una modalidad relacionada, el mamífero es humano . - En otra modalidad, se proporcionan los métodos mencionados anteriormente en donde el anticuerpo inhibe la interacción entre M-CSF y su receptor (M-CSFR) . En otra modalidad relacionada, el anticuerpo inhibe la proliferación y/o diferenciación de osteoclastos inducidas por células tumorales. En aún otra modalidad, se proporcionan los métodos mencionados anteriormente en donde el anticuerpo se administra a una dosis de entre aproximadamente 2 µg/kg a 30 mg/kg, 0.1 mg/kg a 30 mg/kg o 0.1 mg/kg a 10 mg/kg peso corporal. En otra modalidad de la invención, se contempla el uso de un anticuerpo de la invención en la elaboración de un medicamento para prevenir o reducir la pérdida ósea en un paciente que presenta síntomas de osteólisis, y en la elaboración de un medicamento para tratar un paciente afligido con una enfermedad que provoca o contribuye a osteólisis . Además se contempla el uso mencionado anteriormente en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de enfermedades óseas metabólicas asociadas con actividad relativamente incrementada de osteoclastos, incluyendo endocrinopatías (incluyendo hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatiroidismo primario o secundario, hipertiroidismo) , hipercalcemia, estados de deficiencia (incluyendo raquitismo/osteomalacia, escorbuto, desnutrición) , enfermedades crónicas (incluyendo síndromes de mal-absorción, falla renal crónica (incluyendo osteodistrofia renal) , enfermedad hepática crónica (incluyendo osteodistrofia hepática) ) , fármacos (incluyendo glucocorticoides (osteoporosis inducidas por glucocorticoides) , heparina, alcohol) , y enfermedades hereditarias (incluyendo osteogénesis imperfecta, homocistinuria) , cáncer, osteoporosis, osteopetrosis, inflamación de hueso asociada con artritis y artritis reumatoide, enfermedad periodontal, displasia fibrosa y/o enfermedad de Pager. En otra modalidad, se contempla el uso de un anticuerpo de la invención en la regulación de un medicamento para prevenir o tratar cáncer metastático a hueso en un paciente que sufre de cáncer metastático. En una modalidad relacionada, el cáncer metastático es cáncer de mama, pulmón, renal, mieloma múltiple, tiroides, próstata, adenocarsinoma, malignidades de células sanguíneas, incluyendo leucemia o linfoma; canceres de cabeza o cuello; canceres gastrointestinales, incluyendo cáncer esofágico, cáncer estomacal, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer pancreático, cáncer hepático, cáncer de los conductos biliares o vesícula biliar; malignidades del tracto genital femenino, incluyendo carcinoma ovárico, canceres endometriales uterinos, cáncer vaginal o cáncer cervical, cáncer de vejiga; cáncer de cerebro, incluyendo neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma; o cáncer de piel, incluyendo melanoma maligno o cáncer de células escamosas . En aún otra modalidad, se contempla el uso del anticuerpo de la invención en la elaboración de un medicamento para tratar un paciente que tiene cáncer. En cualquiera de los usos mencionados anteriormente, el medicamento se coordina con tratamiento usando un segundo agente terapéutico. En una modalidad relacionada, el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico de cáncer. En modalidades relacionadas, el segundo agente terapéutico es un factor de no estimulación de colonias de M-CSF o un anticuerpo anti-RANKL, o receptor de RANKL soluble, o un bisfosfonato. En una modalidad relacionada, el bisfonato es zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato o ibandronato. En aún otra modalidad de la invención, se contempla cualquiera de los usos mencionados anteriormente en donde se prohibe al paciente recibir tratamiento con bisfosfonato, y/o en donde el paciente se ha pre-tratado con el segundo agente terapéutico. En una modalidad relacionada, el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico de cáncer, un factor de no estimulación de colonias de M-CSF, o un anticuerpo anti-RANKL, o receptor de RANKL soluble, o un bisfosfonato. En aún otra modalidad relacionada, el bisfonato es zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato, o ibandronato. En aún otra modalidad relacionada, se prohibe al paciente recibir tratamiento con bisfosfonato. En otra modalidad de la invención, se contempla el uso de una combinación sinérgica de un anticuerpo de la invención para la preparación de un medicamento para tratar un paciente que presenta síntomas de osteólisis en donde el medicamento se coordina con tratamiento usando un segundo agente terapéutico. En una modalidad relacionada, el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico de cáncer, un factor de no estimulación de colonias de M-CSF, o un anticuerpo anti-RANKL, o receptor de RANKL soluble, o un bisfosfonato. En una modalidad relacionada, el bisfonato es zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato, o ibandronato. En aún otra modalidad, se prohibe al paciente recibir tratamiento con bisfosfonato. Se contemplan modalidades de cualquiera de los usos mencionados anteriormente en donde la cantidad de anticuerpo en el medicamento está a una dosis efectiva para reducir la dosis del segundo agente terapéutico requerido para lograr un efecto terapéutico. En cualquiera de las modalidades mencionadas anteriormente que se relacionan a pérdida ósea asociada con cáncer, la cantidad de anticuerpo del medicamento es de manera preferente efectiva para inhibir la proliferación y/o diferenciación de osteoclastos inducida por células tumorales . La cantidad de anticuerpo en cualquiera de los medicamentos mencionados anteriormente puede estar a una dosis de entre aproximadamente 2 µg/kg a 30 mg/kg de peso corporal. En una modalidad relacionada, la cantidad de anticuerpo en el medicamento está a una dosis entre aproximadamente 0.1 mg/kg a 30 mg/kg de peso corporal. En aún otra modalidad, la cantidad de anticuerpo del medicamento está a una dosis entre aproximadamente 0.1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal. También se contemplan equipos por la presente invención. En una modalidad, Se proporciona un equipo que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención, envasada en un recipiente, tal como un frasco o botella, y que comprende además una etiqueta unida a o envasada con el recipiente, la etiqueta que comprende los contenidos del recipiente que proporciona indicaciones y/o instrucciones con respecto al uso de los contenidos del recipiente para prevenir o reducir la pérdida ósea. En otra modalidad, se proporciona un equipo que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención, envasada en un recipiente, tal como un frasco o botella, y que comprende además una etiqueta unida a o envasada con el recipiente, la etiqueta que describe los contenidos del recipiente que proporciona indicaciones y/o instrucciones con respecto al uso de los contenidos del recipiente a un paciente afligido con una enfermedad que provoca o contribuye a la osteólisis. En una modalidad relacionada, se proporciona el equipo en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de enfermedades óseas metabólicas asociadas con actividad relativamente incrementada de osteoclastos, que incluyen endocrinopatías (incluyendo hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatiroidismo primario o secundario, hipertiroidismo) , hipercalcemia, estados de deficiencia (incluyendo raquitismos/osteomalasia, escorbuto, desnutrición) , enfermedades crónicas (incluyendo síndrome de malabsorción, falla renal crónica (incluyendo osteodistrofia renal) , enfermedad hepática crónica (incluyendo osteodistrofia hepática) ) , fármacos (incluyendo glucocorticoides (osteoporosis inducida por glucocorticoides) , heparina, alcohol) , enfermedades hereditarias (incluyendo osteogénesis imperfecta, homocistinuria) , cáncer, osteoporosis, osteopetrosis, inflamación de hueso asociada con artritis y artritis reumatoide, enfermedad periodontal, displasia fibrosa y/o enfermedad de Pager. En otra modalidad, Se proporciona un equipo que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención, envasada en un recipiente, tal como un frasco o botella, y que comprende además una etiqueta unida a o envasada con el recipiente, la etiqueta que describe los contenidos del recipiente que proporciona indicaciones y/o instrucciones con respecto al uso de los contenidos del recipiente para prevenir o tratar cáncer metastático a hueso. En una modalidad relacionada, el cáncer metastático es cáncer de mama, pulmón, renal, mieloma múltiple de tiroides, próstata, adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, incluyendo leucemia o linfoma; cánceres de cabeza y cuello; cánceres gastrointestinales, incluyendo cáncer esofágico, cáncer estomacal, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer pancreático, cáncer hepático, cáncer del conducto biliar o vejiga biliar; malignidades del tracto genital femenino, incluyendo carcinoma ovárico, cánceres endometriales uterinos, cáncer vaginal, o cáncer cervical; cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, incluyendo neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma; o cáncer de piel, incluyendo melanoma maligno o cáncer de células escamosas . En aún otra modalidad, se proporciona un equipo que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención, envasada en un recipiente, tal como un frasco o botella, y que comprende además una etiqueta unida a o envasada con el recipiente, la etiqueta que describe los contenidos del recipiente que proporciona indicaciones y/o instrucciones con respecto al uso de los contenidos del recipiente para tratar cáncer. En otra modalidad, el equipo comprende además un segundo agente terapéutico. En una modalidad relacionada, el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico de cáncer, un factor de no estimulación de colonias de M-CSF, o un anticuerpo anti-RANKL, o receptor de RANKL soluble, o un bisfosfonato. En una modalidad relacionada, el bisfonato es zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato, o ibandronato. En aún otra modalidad, el equipo incluye instrucciones para tratar un paciente imposibilitado de recibir tratamiento con bisfosfonato. En otra modalidad, se proporciona el equipo mencionado anteriormente que comprende una dosis de anticuerpo efectiva para reducir la dosis del segundo agente terapéutico requerida para lograr un efecto terapéutico. En otra modalidad, el equipo comprende una dosis sinérgica del anticuerpo. En aún otra modalidad, el equipo comprende una dosis de anticuerpo efectiva para inhibir la proliferación y/o diferenciación de osteoclastos inducida por células de tumor . En aún otra modalidad de la invención, el equipo mencionado anteriormente comprende una dosis de anticuerpo entre aproximadamente 2 µg/kg a 30 mg/kg de peso corporal. En otra modalidad el equipo comprende . una dosis de anticuerpo entre aproximadamente 0.1 mg/kg a 30 mg/kg de peso corporal. En aún otra modalidad, el equipo comprende una dosis de anticuerpo entre aproximadamente 0.1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal . En aún otra modalidad de la invención, se proporciona un envase, frasco o recipiente que comprende un medicamento que comprende uno o más de los anticuerpos mencionados anteriormente e instrucciones de cómo se debe • usar el medicamento en combinación con cirugía o terapia de radiación. En otra modalidad, se proporciona un método para prevenir o tratar cáncer metastático a hueso que comprende los pasos de administrar cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente a un sujeto y tratar el sujeto con cirugía o terapia de radiación. En otra modalidad, se proporciona un método para seleccionar como objetivo una célula tumoral que expresa M-CSF unido a membrana en su superficie que comprende el paso de administrar cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente, en donde el anticuerpo se conjuga a un radionúclido u otra toxina. En aún otra modalidad, se proporciona un método para tratar un sujeto que sufre de un cáncer que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente . En aún otra modalidad de la invención, se proporciona un método para prevenir la pérdida ósea que comprende administrar a un sujeto afligido con una enfermedad que provoca o contribuye a osteólisis una cantidad de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente en una cantidad efectiva para neutralizar M-CSF producido por las células del sujeto, la cantidad que es mayor que la cantidad efectiva para neutralizar M-CSF producido por las células de cáncer. En una modalidad relacionada, se proporciona un método para tratar un sujeto afligido con una enfermedad que provoca o contribuye a osteólisis que comprende administrar al sujeto una cantidad de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente en una cantidad efectiva para neutralizar M-CSF producido por las células del sujeto, la cantidad que es mayor que la cantidad efectiva para neutralizar M-CSF producida por las células de cáncer. En una modalidad de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo RXl, 5H4, MCI y/o MC3 , o un anticuerpo no murino derivado de RXl, 5H4, MCI y/o MC3 o un anticuerpo de competición de RXl, 5H4 , MCI y/o MC3 , y un agente terapéutico de cáncer. En otra modalidad de la invención, se proporciona un envase, frasco o recipiente que comprende un medicamento que comprende el anticuerpo RXl, 5H4 , MCI y/o MC3 , o un anticuerpo no murino derivado RXl, 5H4, MCI y/o MC3 o un anticuerpo de competición de RXl, 5H4, MCI y/o MC3 , e instrucciones que medicamento se debe usar en combinación con terapia de cirugía o radiación. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona un método para tratar un sujeto que sufre de un cáncer, en donde las células que comprenden el cáncer no segregan M-CSF, que comprende el paso de administrar cualquiera de los anticuerpos mencionados aanteriormente .

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es un diagrama de topología que muestra los enlaces de disulfuro en M-CSF dimérico, truncado . La Figura 2 es un estereodiagrama de la columna C-alfa de M-CSF con cada décimo residuo marcado y con el eje de simetría no cristalográfico indicado por una línea punteada. La Figura 3 es una comparación de actividad inducida por osteoclastos entre M-CSF purificado y medio acondicionado (CM) de células MDA 231 y células MCF7. La Figura 4A muestra la secuencia de aminoácidos del anticuerpo murino RXl específico de M-CSF (SEQ ID Nos: 2 y 4) (codificado por el inserto de ADNc del plásmido depositado con la American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA, bajo el número de depósito ATCC PTA-6113) y una secuencia de ácido nucleico correspondiente (SEQ ID Nos: 1 y 3) . Las regiones de CDR se enumeran y muestran en negritas. Las Figuras 4B y 4C muestran las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera (SEQ ID NO: 5) y pesada (SEQ ID NO: 6) del anticuerpo RXl murino específico de M-CSF, respectivamente, con residuos de alto riesgo (negritas) , riesgo moderado (subrayados) y bajo riesgo identificados de acuerdo a Studnicka et al., W093/11794. La Figura 5A muestra que los anticuerpos RXl y 5A1 de M-CSF son específicos de la especie. La Figura 5B muestra la actividad de neutralización de M-CSF de los anticuerpos MCI y MC3. La Figura 6 muestra que el anticuerpo RXl inhibe de forma efectiva la osteólisis en un modelo de xenoinjerto humano a una concentración de 5 mg/kg. La Figura 7 muestra que el número de metástasis se reduce cuando se administra el "anticuerpo RXl a ratones desnudos que tienen cáncer de mama humano MDA-MB-231 a una concentración de 5 mg/kg. Las Figuras 8A y 8B muestran que un anticuerpo específico de M-CSF se une a la línea de células de cáncer de mama MDA-MB-231 o a una línea de células de cáncer de mieloma múltiple ARH77. La Figura 9 muestra que M-CSF es prevalente en varias superficies de células de cáncer. La Figura 10 es la secuencia de aminoácidos de M-CSFa (SEQ ID NO: 7) . La Figura 11 es la secuencia de aminoácidos de M-CSFß (SEQ ID NO: 8) . La Figura 12 es la secuencia de aminoácidos de M- CSF? (SEQ ID NO: 9) . Un número de polimorfismos en la secuencia de ADN puede dar por resultado diferencias de aminoácidos. Por ejemplo, un polimorfismo común proporciona un Ala en lugar de un Pro en la posición 104.

Las Figuras 13 , 14 y 15 muestran las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos murinos 5H4 (SEQ ID Nos: 10 y 11), MCI (SEQ ID Nos: 12 y 13) (producido por el hibridoma depositado bajo el número de depósito de ATCC PTA-6263) y MC3 (SEQ ID Nos: 14 y 15) (producido por el hibridoma depositado bajo el número de depósito de ATCC PTA-6264) específicos de MCSF, respectivamente. Las Figuras 16A-16B son una alineación de las regiones de CDR de las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera de los anticuerpos murinos RXl; 5H4 ; MCI; y MC3 (SEQ ID Nos: 16-38) específicos de M-CSF. La Figura 17 muestra las actividades de neutralización de fragmentos intactos versus Fab para RXl versus 5H4. La Figura 18 muestra la estructura de M-CSF con los epítopes de RXl, 5H4 y MC3 resaltados (SEQ ID Nos: 120, 122 y 123) . La Figura 19A muestra (a) la línea de riesgo para la cadena pesada de RXl murino (H=riesgo alto, M=riesgo moderado, L=riesgo bajo) , (b) la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de RXl (SEQ ID NO: 6) , (c) la secuencia de aminoácidos de la secuencia de consenso humano más cercana, Kabat Vh2 de consenso, alineada a RXl (SEQ ID NO: 39) y (d) cambios que se hicieron para producir dos secuencias humanas EngineeredMR de ejemplo (SEQ ID Nos: 41 y 43) . La Figura 19B muestra las secuencias de aminoácidos de dos secuencias humanas Engineered^ de cadena pesada de ejemplo (SEQ ID Nos: 41 y 43) , designadas "bajo riesgo" y "riesgo bajo+moderado" así como las correspondientes secuencias de ácido nucleico (SEQ ID Nos: 40 y 42) . La Figura 20A muestra (a) la línea de riesgo para la cadena ligera de RXl murino (H=riesgo alto, M=riesgo moderado, L= bajo riesgo) , (b) la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de RXl (SEQ ID NO: 5) , (c) la secuencia de aminoácidos de la secuencia de consenso humano más cercana, Kabat VK3 de consenso, alineada a RXl (SEQ ID NO: 49) y (d) cambios que se hicieron para producir dos secuencias humanas Engineered"11 de ejemplo (SEQ ID Nos: 45 y 47) . La Figura 20B muestra las secuencias de aminoácidos de dos secuencias humanas Engineered™1 de cadena ligera de ejemplo (SEQ ID Nos: 45 y 47), designadas "bajo riesgo" y "riesgo bajo+moderado" así como las correspondientes secuencias de ácido nucleico (SEQ ID Nos: 44 y 46) . La Figura 21A muestra (a) la línea de riesgo para la cadena ligera de RXl murino (H=alto riesgo, M=riesgo moderado, L=bajo riesgo) , (b) la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de RXl (SEQ ID NO: 5) , (c) la secuencia de aminoácidos de la secuencia de consenso humano más cercana, Kabat VK3 de consenso, alineada a RXl (SEQ ID NO: 49) y (d) una secuencia de aminoácidos de ejemplo alternativa en la cual no se cambiaron las posiciones 54-56 (es decir, permanecieron en la secuencia murina) (SEQ ID NO: 48) . La Figura 2IB muestra las secuencias de aminoácidos de dos secuencias humanas Engineered"* de cadena ligera alternativas de ejemplo (SEQ ID Nos: 48, 136), así como las correspondientes secuencias de ácido nucleico (SEQ ID Nos: 137 y 135) . La Figura 22A muestra (a) la línea de riesgo para la cadena ligera de RXl murino (H=alto riesgo, M=riesgo moderado, L=bajo riesgo) , (b) la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de RXl (SEQ ID NO: 5) , (c) la secuencia de aminoácidos de la secuencia de línea germinal de consenso humana más cercana, subgrupo 2-1- (1) Al4 de Vk6, alineada a RXl (SEQ ID NO: 50) y (d) cambios que se hicieron para producir dos secuencias humanas Engineered™1 de ejemplo (SEQ ID Nos: 51 y 53) . La Figura 22B muestra las secuencias de aminoácidos de dos secuencias humanas Engineered™ de cadena ligera de ejemplo (SEQ ID Nos: 51 y 53), designadas "bajo riesgo" y "riesgo bajo+moderado" así como la correspondiente secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 52) . Las Figuras 23A y 23B muestran la alineación de la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de RXl murino (SEQ ID NO: 54) con varias secuencias de consenso de línea germinal humana y de consenso humana que usan el sistema de numeración de Kabat (la numeración de aminoácidos indicada en la línea designada ("POS") (SEQ ID Nos: 55-82) . Las Figuras 24A y 24B muestran la alineación de la secuencia de aminoácidos de cadena pesadas de RXl murino (SEQ ID NO: 83) con varias secuencias de consenso de línea germinal humana y de consenso humana que usan el sistema de numeración Kabat (numeración de aminoácidos indicada en la línea designada ("POS") (SEQ ID Nos. 84-112). Las Figuras 24C-24E muestran cómo los residuos de aminoácido de los anticuerpos 5H4 , MCI y MC3 corresponden al sistema de numeración de Kabat (SEQ ID Nos: 10 y 11; SEQ ID Nos: 12" y 13, SEQ ID Nos: 14 y 15, respectivamente) . La Figura 25 muestra la neutralización comparativa de MCSF humano recombinante por el anticuerpo RXl murino recombinante, marcado como rmRXl, y tres versiones del anticuerpo RXl-a humanos Engineered^ (en el cual se han hecho todos los cambios de bajo riesgo) que cada uno tiene una región constante diferente (IgGl, IgG2 o IgG4) , marcado como heRXl-l.Gl, heRXl-l.G2 y heRXl-l.G4. La Figura 26 muestra la neutralización comparativa de suero humano por anticuerpo RXl murino recombinante, marcado como rmRXl y varias versiones diferentes de heRXl-1 (en el cual se han hecho todos los cambios de bajo riesgo) que cada uno tiene una región constante diferente (IgGl, IgG2 o IgG4) , marcado como RX2 , RXl-l-IgG2, RXl-1-IgGl, RX1- 1-IgGl, RXl-l-IgG4, RXl-a-IgG4. La Figura 27 muestra la neutralización comparativa del medio MDA231 (línea de células de cáncer de mama) por anticuerpo RXl murino recombinante, rmRXl, y varias versiones diferentes de heRXl-1 (en el cual se han hecho todos los cambios de bajo riesgo) que cada uno tiene una región constante diferente (IgGl, IgG2 o IgG4) , marcado como RX2, RXl-l-IgG2, RXl-1-IgGl, RXl-1-IgGl, RXl-l-IgG4, RXl-a-IgG4. La Figura 28 muestra el efecto en la osteoclastogénesis (como se mide por actividad de TRAP) de anticuerpo RXl murino recombinante, rmRXl, y dos versiones diferentes heRXl-1 que tiene cada uno una diferente región constante (IgGl o IgG2) , marcadas heRXl-l.IgGl y heRXl-1. IgG2. La Figura 29 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 114) y de nucleótidos (SEQ ID NO: 113) para heRXl-l.IgGl con cambios de aminoácidos de bajo riesgo. La Figura 29B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 116) y de nucleótidos (SEQ ID NO: 115) para heRXl-l.IgGl con cambios de aminoácidos de riesgo bajo + moderado. La Figura 30 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 119) y de nucleótidos (ADNc (SEQ ID NO: 118) y ADN genómico (SEQ ID NO: 117)) para heRXl-l.IgG4 con cambios de aminoácidos de bajo riesgo.

Descripción Detallada de la Invención La capacidad para metastatisarse es una característica definitoria de un cáncer. La metástasis se refiere a la propagación de las células de cáncer a otras partes del cuerpo o la condición producida por esta propagación. La metástasis es un proceso complejo de varios pasos que incluye cambios en el material genético de una célula, proliferación descontrolada de la célula alterada para formar un tumor primario, desarrollo de un nuevo suministro sanguíneo para el tumor primario, invasión del sistema circulatorio por células del tumor primario, dispersión de pequeñas aglomeraciones de células tumorales primarias a otras partes del cuerpo, y el crecimiento de tumores secundarios en estos sitios. El hueso es uno de los sitios más comunes de metástasis en cáncer humano de mama, pulmón, próstata y tiroides, así como otros cánceres, y en autopsias tanto como 60 % de los pacientes con cáncer se encuentra que tienen metástasis ósea. La metástasis oseolítica de hueso muestra un paso único de resorción osteoclástica de hueso que no se ve en metástasis a otros órganos. La pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer se media por los osteoclastos (células gigantes multinucleadas con la capacidad de resolver tejidos mineralizados) , que parece se activan por productos tumorales . El factor de estimulación de colonias (SCF-1) , también conocido como factor de estimulación de colonias de macrófagos (M-CSF) , se ha encontrado crucial para la formación de osteoclastos. Además, el M-CSF se ha mostrado que modula las funciones osteoclásticas de los osteoclastos maduros, su migración y su supervivencia en cooperación con otros factores solubles e interacción de célula a célula proporcionada por osteoblastos y fibroblastos (<biblio>) . El ARNm de M-CSF humano de longitud completa codifica para una proteína precursora de 554 aminoácidos. A través del empalme de ARNm alternativo y del procesamiento proteolítico pos-transduccional diferencial, el M-CSF ya sea se puede segregar en la circulación como un proteoglicano que contiene glucoproteina o sulfato de condroitina, o se puede expresar como una glucoproteina que se extiende en membrana en la superficie de células productoras de M-CSF. La estructura tridimensional de los 150 aminoácidos amino-terminales bacterianamente expresados de M-CSF humano, la secuencia mínima requerida para actividad biológica in vi tro completa, indica que esta proteína es un dímero enlazado a disulfuro con cada monómero que consiste de cuatro fajos alfa-helicoidales y una beta-hoja anti-paralela (Pandit et al., Science 258: 1358-62 (1992)). Se producen tres especies distintas de M-CSF a través del empalme de ARNm alternativo. Los tres precursores polipeptídicos son M-CSFa de 256 aminoácidos, M-CSFß de 554 aminoácidos y M-CSF? de 438 aminoácidos. El M-CSFß es una proteína segregada que no se presenta en una forma unida a membrana. El M-CSFa se expresa como una proteína de membrana integral que se libera lentamente por escisión proteolítica. El M-CSFa se escinde en los aminoácidos 191-197 de la secuencia expuesta en la Figura 10. La forma unida a membrana de M-CSF puede interactuar con receptores en células cercanas y por lo tanto media los contactos específicos célula a célula. El término "M-CSF" también puede incluir los aminoácidos 36-438 de la Figura 12. Varias formas de M-CSF funcionan por unión a su receptor M-CSFR en células objetivo. El M-CSFR es una molécula que abarca la membrana con cinco dominios extracelulares tipo inmunoglobulina, un dominio transmembrama y un dominio de tirosina-cinasa relacionado a Src interrumpido, intracelular. El M-CSFR se codifica por el proto-oncogén c-fms. La unión de M-CSF al dominio extracelular de M-CSFR conduce a la dimerización del receptor, que activa el dominio de cinasa citoplasmático, conduciendo a autofosforilación y fosforilación de otra proteínas celulares (Hamilton J. A., J Leukoc Biol., 62(2):145-55 (1997); Hamilton J, A., Immuno Today., 18(7): 313-7(1997) . Las proteínas celulares forsforiladas inducen una cascada de eventos bioquímicos que conducen a respuestas celulares: mitosis, secreción de citocinas, irritación de membrana y regulación de trascripción de su propio receptor.

(Fixe y Praloran, Cytokine 10: 32-37 (1998)). El M-CSF se expresa en células estromales, osteoblastos, y otras células. También se expresa en células de tumor de mama, uterino y ovárico. El grado de expresión en estos tumores correlaciona con pobre prognosis y alto grado (Kacinski Ann. Med. 27: 79-85 (1995); Smith et al., Clin. Cáncer Res. 1: 313-25 (1995)). En carcinomas de mama, la expresión de M-CSF es prevalente en células tumorales invasivas como lo opuesto a cáncer intraductal (pre-invasivo) (Scholl et al., J. Nati. Cáncer Inst. 86: 120-6 (1994) ) . Además se muestra que el M-CSF promueve el progreso de tumores mamarios a malignidad (Lin et al., J. Exp. Med. 93: 727-39 (2001)). Para cáncer de mama y ovario, la producción de M-CSF parece ser responsable de la reclutación de macrófagos al tumor. Como se muestra en la presente, un anticuerpo específico de M-CSF tal como el anticuerpo RXl, 5H , MCI o MC3, neutraliza la inducción de osteoclastos por células de cáncer metastáticas y/o reduce la metástasis a hueso en modelos de animal de cáncer. De esta manera, la presente invención proporciona composiciones y métodos para tratar o prevenir cáncer, metástasis y cáncer y pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer. Un anticuerpo murino RXl anti-M-CSF preferido se modificó para ser menos inmunógeno en humanos en base al método de humano EngineeredMR de Studnicka et al . En una modalidad preferida, se modificaron de 8 a 12 residuos de aminoácido expuestos en la superficie de la región variable de cadena pesada y de 16 a 19 residuos expuestos en superficie en la región de cadena ligera a los residuos humanos en posiciones determinadas que es poco probable que afecten de manera adversa ya sea la unión al antígeno _o el plegado de la proteína, en tanto que reducen su inmunogenicidad con respecto al ambiente humano. Se construyeron genes sintéticos que contienen regiones variables modificadas de cadena pesada y/o ligera y se enlazaron a regiones constantes de cadena ligera kappa y/o cadena pesada ? humanas . Se puede usar cualquier región constante de cadena ligera y cadena pesada humana en combinación con las regiones variables del anticuerpo humano Engineered1. Los genes de cadena ligera y cadena pesada se introdujeron en células de mamífero y se obtuvieron y caracterizaron los productos de inmunoglobulina recombinantes resultantes. Otros anticuerpos anti-M-CSF de ejemplo tal como 5H4, MCI o MC3 son de manera similar humanos Engineered*®. El término "anticuerpo derivado de RXl" incluye cualquiera de los siguientes: 1) una variante de aminoácidos del anticuerpo murino RXl que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4, que incluye variantes que comprenden una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que es al menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99 % homologa a la secuencia de aminoácidos como se expone en la Figura 4, y/o que comprende una secuencia -de aminoácidos de cadena ligera variable que es al menos 60, . 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o" 99 % homologa a la secuencia de aminoácidos como se expone en la Figura 4 , tomando en cuenta aminoácidos similares para la determinación de la homología; 2) polipéptidos de unión a M-CSF (excluyendo el anticuerpo murino RXl) que comprenden una o más regiones de determinación de complementariedad (CDR) del anticuerpo múrino RXl que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4, que comprende de manera preferente al menos CDR3 de la cadena pesada de RXl, y que comprende de manera preferente dos o más, o tres o más, o cuatro o más, o cinco o más, o todas las seis CDR; 3) anticuerpos humanos Engineered™1 que tienen las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera expuestas en las Figuras 19B hasta 22B o variantes de las mismas que comprenden una cadena pesada o ligera que tiene al menos 60 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la cadena pesada o ligera original humana Engineered^ de las Figuras 19B hasta 22B, de manera más preferente al menos 80 %, de manera más preferente . al menos 85 %, de manera más preferente al menos 90 %, y de manera más preferente al menos 95 %, que incluye por ejemplo 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83%, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % , 90 % , 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95%, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, y 100 % idéntica. 4) polipéptidos de unión a M-CSF (excluyendo anticuerpo murino RXl) que comprende los residuos de alto riesgo de una o más CDR de los anticuerpos humanos Engineered™ de las Figuras 19B hasta 22B, y que comprende de manera preferente residuos de alto riesgo de dos o más, o tres o más, o cuatro o más, o cinco o más, o todas las seis CDR; 5) anticuerpos humanos Engineered"* o variantes^ que retienen los residuos de aminoácido de alto riesgo expuestos en la Figura 4B, y que comprenden uno o más cambios en los residuos de riesgo bajo o moderado expuestos en la Figura 4B; por ejemplo, que comprende uno o más cambios en un residuo de bajo riesgo y sustituciones conservadoras en un residuo de riesgo moderado expuesto en la Figura 4B, o por ejemplo, que retiene los residuos de aminoácido de riesgo moderado y alto puestos en la Figura 4B y que comprenden uno o más cambios a un residuo de bajo riesgo, donde los cambios incluyen inserciones, supresiones o sustituciones y pueden ser sustituciones conservadoras o pueden provocar que el anticuerpo manejado esté más cerca en secuencia a una secuencia de cadena ligera o cadena pesada humana, una secuencia de cadena ligera o cadena pesada de línea germinal humana, una secuencia de cadena ligera o cadena pesada humana de consenso, o una secuencia de cadena ligera o cadena pesada de línea germinal humana de consenso; que retenga la capacidad para unirse a M-CSF.

Estos anticuerpos se unen de manera preferente a M-CSF con una afinidad de al menos 10"7, 10"s o 10~9 o mayor y de manera preferente neutraliza la osteoclastogénesis que inducen actividad de M-CSF. De manera similar, el término "anticuerpo derivado de MC3" incluye cualquiera de los siguientes: 1) una variante de aminoácidos del anticuerpo murino MC3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 15, incluyendo variantes que comprenden una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que es al menos 60, 65-, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 , 97, 98, o 99 % homologa a la secuencia de aminoácidos como se expone en la Figura 15 , y/o que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que es al menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96," 97, 98, o 99 % homologa a la secuencia de aminoácidos como se expone en la Figura 15, tomando en cuenta aminoácidos similares para la determinación de la homología; 2) polipéptidos de unión a M-CSF (que incluyen opcionalmente o excluyen el anticuerpo " murino MC3) que comprenden una o más regiones de determinación de complementariedad (CDR) del anticuerpo murino MC3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 15 , que comprende de manera preferente al menos CDR3 de la cadena pesada de MC3 , y que comprende de manera preferente dos o más, o tres o más, o cuatro o más, o cinco o más, o todas las seis CDR; 3) anticuerpos humanos Engineered01 generados al alterar la secuencia murina de acuerdo a los métodos expuestos en Studnicka et al., patente de los Estados Unidos No. 5,766,886 y Ejemplo 4A en la misma, usando la numeración de Kabat expuesta en las Figuras 24C-24E para identificar los residuos de riesgo bajo, moderado y alto; estos anticuerpos que comprenden al menos una de las siguientes cadenas pesadas y al menos una de las siguientes cadenas ligeras: (a) una cadena pesada en la cual se han modificado todos los residuos de bajo riesgo, si es necesario, para ser los mismos residuos como una secuencia de inmunoglobulina de referencia humana o (b) una cadena pesada en la cual se han modificado todos los residuos de riesgo bajo y moderado, si es necesario, para ser los mismos residuos como una secuencia de inmunoglobulina de referencia humana, (c) una cadena ligera en la cual se han modificado todos los residuos de bajo riesgo, si es necesario, para ser los mismos residuos como una secuencia de inmunoglobulina de referencia humana, o (b) una cadena ligera en la cual se han modificado todos los residuos de bajo riesgo moderado, si es necesario, para ser los mismos residuos como una secuencia de inmunoglobulina de referencia humana. 4) variantes de los anticuerpos mencionados anteriormente en el párrafo (3) anterior que comprende una cadena pesada ligera que tiene al menos 60 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la cadena pesada o ligera original humana Engineered™1, de manera más preferente al menos 80 %, de manera más preferente al menos 85 %, de manera más preferente al menos 90 %, y de manera más preferente al menos 95 %, que incluye por ejemplo 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83%, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95%, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, y 100 % idéntica. 5) polipéptidos de unión a M-CSF (que incluyen o excluyen opcionalmente anticuerpo murino MC3) que comprende los residuos de alto riesgo de una o más CDR del anticuerpo murino MC3 de la Figura 15 , y que comprende de manera preferente residuos de alto riesgo de dos o más, o tres o más, o cuatro o más, o cinco o más, o todas las seis CDR; 6) anticuerpos humanos Engineered" o variantes que retienen los residuos de aminoácido de alto riesgo del anticuerpo murino MC3 , y que comprenden uno o más cambios en los residuos de riesgo bajo o moderado; por ejemplo, que comprenden uno o más cambios en un residuo de bajo riesgo y sustituciones conservadoras en un residuo de riesgo moderado, o por ejemplo, que retiene los residuos de aminoácido de riesgo moderado y alto y que comprenden uno o más cambios en un residuo de bajo riesgo, donde los cambios incluyen inserciones, supresiones o sustituciones y pueden ser sustituciones conservadoras o pueden provocar que el anticuerpo manejado esté más cerca en secuencia a una secuencia de cadena pesada o cadena ligera humana, una secuencia de cadena pesada o cadena ligera de línea germinal humana, una secuencia de cadena pesada o cadena ligera humana de consenso, o una secuencia de cadena pesada o cadena ligera de línea germinal humana de consenso; que retenga la capacidad para unirse a M-CSF.

Estos anticuerpos^ se unen de manera preferente a M-CSF con una afinidad de al menos 10"7, 10"8 o 10"9 o mayor y de manera preferente neutraliza la osteoclastogénesis que inducen actividad de M-CSF. El término "anticuerpo derivado de 5H4" o "anticuerpo derivado de MCI" se define de manera similar de acuerdo a la descripción anterior. Como se describe en detalle en la presente, los anticuerpos derivados de RXl, 5H4 , MCI o MC3 , incluyendo los anticuerpos humanos Engineered" o variantes, puede ser de diferentes isotipos, tal como IgG, IgA, IgM o IgE. Los anticuerpos de la clase IgG pueden incluir una región constante diferente, por ejemplo, un anticuerpo de IgG2 se puede modificar para exhibir una región constante de IgGl o IgG4. En modalidades preferidas, la invención proporciona anticuerpos humanos Engineered"11 o variantes que comprenden una región constante IgGl o IgG4 modificada o no modificada. En el caso de IgGl, las modificaciones a la región constante, particularmente la región de charnela o CH2, pueden incrementar o disminuir la función efectora, incluyendo la actividad ADCC y/o CDC. En otras modalidades, se modifica una región constante de IgG2 para disminuir la formación de agregados anticuerpo-antígeno. En el caso de IgG4, las modificaciones a la región constante, particularmente la región de charnela, pueden reducir la formación de medios anticuerpos. En modalidades de ejemplo específicas, se proporciona la mutación de la secuencia de charnela de IgG4 Cys-Pro-Ser-Cys a la secuencia de charnela de IgGl Cys-Pro-Pro-Cys . Se muestra en la presente que los anticuerpos humanos Engineered"11 que contienen las regiones constantes de IgGl o IgG4 tienen propiedades mejoradas en comparación con los anticuerpos humanos Engineered™1 que contienen las regiones constantes IgG2. La elección de la región Fc de IgGl o IgG4 mejoró la afinidad de unión, actividad de neutralización de MCSF, y actividad anti-osteoclastos . Además, la elección de la región Fc de IgGl o IgG4 proporcionó complejos antígeno-anticuerpo que se asemejan más cercanamente a aquellos formados por el anticuerpo murino de origen. La movilidad en la región de charnela parece de esta manera afectar de manera notable la unión del anticuerpo al antígeno dimérico MCSF así como la actividad de neutralización del anticuerpo. La invención contempla en general que la preparación de anticuerpos que contienen una cadena pesada que comprende una región constante de IgGl o IgG4 modificada o no modificada, particularmente los dominios de charnela o CH2, o de manera preferente al menos los dominios de charnela, mejora la afinidad de unión y/o desacelera la .disociación del anticuerpo de los antígenos diméricos . El término "anticuerpo de competición de RXl" incluye 1) un anticuerpo monoclonal no murino o no de roedor que se une al mismo epítope de M-CSF como RXl murino que tiene las secuencias de cadena pesada y ligera completas "expuestas en la Figura 4 ; 2) Un anticuerpo monoclonal no murino o no de roedor que se une a al menos 4 aminoácidos contiguos de los aminoácidos 98-105 de M-CSF de la Figura 12; y 3) un anticuerpo monoclonal no murino o no de roedor que compite con el anticuerpo murino RXl que tiene la secuencia completa expuesta en la Figura 4 para la unión a M-CSF, por más de 75 %, más de 80 %, o más de 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 %. Estos anticuerpos se unen de manera preferente a M-CSF con una afinidad de al menos 10"7, 10~8 o 10"9 o mayor y neutralizan de manera preferente la osteoclastogénesis que induce actividad de M-CSF. El término "anticuerpo de competición de MCI" o "anticuerpo de competición de MC3" o "anticuerpo de competición de 5H4" se define de manera similar con referencia a los anticuerpos murinos 5H4 , MCI o MC3 que tienen las secuencias de cadena ligera y pesada completas expuestas en las Figuras 13, 14 o 15, respectivamente, y con referencia al epítope de M-CSF unido por el anticuerpo, por ejemplo, los aminoácidos 65-73 o 138-144 de la Figura 12 (que corresponden a los epítopes M-CSF reconocidos por 5H4 o MC3) . Opcionalmente", cualquier anticuerpo de M-CSF quimérico, humano o humanizado, públicamente descrito antes de la fecha de presentación de la presente, o descrito en una solicitud presentada antes de la fecha de presentación de la presente, se excluye del alcance de la invención. Anticuerpo monoclonal "no de roedor" es cualquier anticuerpo, como se define ampliamente en la presente, que no es un anticuerpo monoclonal de roedor, intacto, completo generado por un hibridoma de roedor. De esta manera, los anticuerpos no de roedor incluyen de manera específica, pero no se limitan a, variantes de anticuerpos de roedor, fragmentos de anticuerpos de roedor, anticuerpos lineales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos EngineeredMR y anticuerpo humanos, incluyendo anticuerpos humanos producidos de animales transgénicos o mediante tecnología de visualización en fagos. De manera similar, los anticuerpos no murinos incluyen de manera enunciativa y sin limitación variantes de anticuerpos murinos, fragmentos de anticuerpos murinos, anticuerpos lineales, anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos Engineered™ y anticuerpos humanos . "Tumor" como se usa en la presente, se refiere a todo el crecimiento y proliferación de células neoplásticas, ya sea maligno o benigno, y todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos . Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a, o describen, a la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular desregulado. Los ejemplos de cáncer incluyen de manera enunciativa y sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de estos canceres incluyen cáncer de" mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer hepático, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon, cáncer hepático, cáncer vulval, cáncer de tiroides, cáncer hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello. "Tratamiento" es una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o alterar la patología de un trastorno. Por consiguiente, "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen ya con el trastorno así como aquellos en los cuales el trastorno será prevenir. En el tratamiento de tumores (por ejemplo, cáncer) , un agente terapéutico puede disminuir directamente la patología de las células tumorales, o volver a las células tumorales más susceptibles al tratamiento por otros agentes terapéuticos, por ejemplo, radiación y/o quimioterapia. Los pacientes que sufren de síntomas clínicos, bioquímicos, radiológicos o subjetivos de la enfermedad, tal como osteólisis, pueden incluir alivio de algunos o todos los síntomas o reducción de la predisposición a la enfermedad. La "patología" de cáncer incluye todos los fenómenos que comprometan el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, crecimiento celular anormal o descontrolable, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de células vecinas, liberación de citocinas u otros productos secretorios a niveles anormales, supresión o agravamiento de respuesta inflamatoria o inmunológica, etc. De esta manera, la mejora después del tratamiento se puede manifestar como tamaño disminuido de tumor, declinación en la velocidad de crecimiento del tumor, destrucción de células tumorales o células metastásicas existentes, y/o una reducción en el tamaño en el número de metástasis. "Mamífero" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, de deportes o mascotas, tal como perros, caballos, gatos, vacas, etc. De manera preferente, el mamífero es humano. Como se usa en la presente, la frase '"cáncer metastático" se define como cáncer que tiene potencial para propagarse a otras áreas del cuerpo', particularmente el hueso. Una variedad de canceres pueden metastatizarse al hueso, pero los canceres de mastatetización más comunes son cáncer de mama, pulmón, renal, mieloma múltiple, de tiroides y próstata. A manera de ejemplo, otros canceres que tienen el potencial de metastatizarse a hueso incluyen de manera enunciativa y sin limitación adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, incluyendo leucemia y linfoma; canceres de cabeza y cuello; canceres gastrointestinales, incluyendo cáncer esofágico, cáncer de estomago, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer pancreático, cáncer hepático, cáncer del conducto biliar o vesícula biliar; malignidades del tracto genital femenino, incluyendo carcinoma ovárico, canceres endometriales uterinos, cáncer vaginal y cáncer cervical; cáncer de vejiga; cáncer de cerebro, incluyendo neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma; y cáncer de piel, incluyendo melanoma maligno y cáncer de células escamosas . La presente invención contempla especialmente prevención y tratamiento de lesiones osteolíticas inducidas por tumor en hueso. Como se usa en la presente, la frase "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de anticuerpo de M-CSF terapéutico o profiláctico que será apropiada para una modalidad de la presente invención, que producirá el efecto de respuesta terapéutica o profiláctica deseada cuando se administre de acuerdo con el régimen de tratamiento deseado. "M-CSF" humano como se usa en la presente se refiere a un polipéptido humano que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos como los polipéptidos de M-CSFa, M-CSF3, o M-CSF? humanos, maduros descritos en Kawasaki et al., Science 230:291 (1985), Cerreti et al., Molecular Immunology, 25:761 (1988), o Ladner et al., EMBO Journal 6:2693 (1987), cada uno de los cuales se incorpora como referencia. Esta terminología refleja el entendimiento que los tres M-CSF maduros tienen diferentes secuencias de aminoácidos, como se describe anteriormente, y que la forma activa de M-CSF es un dímero unido a disulfuro; de esta manera, cuando el término "M-CSF" se refiere a la forma biológicamente activa, se propone la forma dimérica. Dímero de M-CSF" se refiere a dos monómeros de polipéptido de M-CSF que se han dimerizado e incluyen tanto homodímeros (que consisten de dos del mismo tipo de monómero de M-CSF) y heterodímeros (que consisten de dos monómeros diferentes) .

Los monómeros de M-CSF se pueden convertir a dímeros de M- CSF in vitro como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,929,700, que se incorpora en la presente como referencia.

Anticuerpos anti-MCSF La presente invención proporciona un anticuerpo específico de M-CSF tal como RXl, 5H4, MCI y/o MC3 , formulaciones farmacéuticas que incluyen un anticuerpo específico de M-CSF, tal como RXl, 5H4 , MCI y/o MC3 , métodos para preparar las formulaciones farmacéuticas, y métodos para tratar pacientes con las formulaciones y compuestos farmacéuticos . El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio e incluye anticuerpos completamente ensamblados, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) , fragmentos de anticuerpo que se puede unir a antígeno (por ejemplo, Fab', F'(ab)2, Fv, anticuerpos de cadena individual, diacuerpos) y péptidos recombinantes que comprenden lo anterior en tanto que exhiban la actividad biológica deseada. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se presentan de forma natural que se pueden presentar en cantidades menores . Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, que se dirigen contra un sitio antigénico individual. Además, en contraste a las preparaciones convencionales de anticuerpos (policlonales) que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopes) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante individual en el antígeno. " Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que se sintetizan por el cultivo homogéneo, descontaminados por otras inmunoglobulinas con diferentes especificidades y características . El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se va a considerar como que requiere producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden elaborar por el método de hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature, 256:495

[1975], o se pueden elaborar por los métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de las bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624628

[1991] y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) , por ejemplo. A pesar de las secuencias de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, se pueden asignar inmunoglobulinas a diferentes clases. Hay cinco clases principales, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas se pueden dividir adicionalmente en clases secundarias o isotipos, por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4, IgAl e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferente clases de inmunoglobulinas se llaman, alfa, delta, epsilon, gamma y mu respectivamente. Las estructuras de sub-unidad y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Los diferentes isotipos tienen diferentes funciones efectoras; por ejemplo, los isotipos IgGl e IgG3 tienen actividad DACC. "Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa intacto, de manera preferente el antígeno que se une a la región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos, anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng., 8 (10) : 1057-1062 (1995)); moléculas de anticuerpo de cadena individual; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio individual de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar 35 fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos fragmentos de anticuerpo "Fv" de cadena individual" "sFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena individual de polipéptido. De manera preferente, el polipéptido de Fv comprende además un ligador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permiten que Fv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv ver Pluekthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., springer Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). El término región "hipervariable" se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácido de una región de determinación de complementariedad o CDR [es decir, residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el domino variable de cadena ligera y 31-35 (Hl, 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada como se describe por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Ed. Public. Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991) ] y/o aquellos residuos de un asa hipervariable (es decir, residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada como se describe por [Chothia et al., J. Mol . Biol . 196: 901-917 (1987)]. Residuos de "estructura" o FR son aquellos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de región hipervariable . El término "diacuerpo" se refiere a fragmentos _de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH VL) . Al usar un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en por ejemplo EP 404,097; WO 93/11161; y 30 Hollinger et al., Proc. Nati.

Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). En algunas modalidades, puede ser deseable generar un anticuerpo monoclonal multiespecífico (por ejemplo, biespecífico) incluyendo anticuerpos monoclonales, humanos, humanizados, humanos Engineered™1 o anti-M-CSF variante que tienen especificidades de unión para al menos dos epitopes diferentes. Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo pueden unirse a dos diferentes epitopes de M-CSF. De manera alternativa, un brazo anti-M-CSF se puede combinar con un brazo que se une a una molécula de accionamiento en un leucocito tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo CD2 o CD3) , o receptores de Fc para IgG (Fc?R) , tal como Fc?RI (CD64) , Fc?RII (CD32) y Fc?Rlll (CD16) para enfocar mecanismos de defensa celular a las células que expresan M-CSF. También se pueden usar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos a las células que expresan M-CSF. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a M-CSF y un brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-60, alcaloide de vincapervinca, cadena de ricino A, hapteno de isótopo radioactivo o metotrexato) . Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab' ) . sub.2) . De acuerdo a otro planteamiento para elaborar anticuerpos biespecíficos, la entre cara entre un par de moléculas de anticuerpo se pueden manejar para aumentar al máximo el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes . La entrecara preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpos. En este método, se reemplazan una o más cadenas secundarias pequeñas de aminoácidos de la entrecara de la primera molécula de anticuerpo con cadenas secundarias más grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a las cadenas secundarias grandes se crean en la entrecara de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar cadenas secundarias grandes de aminoácidos con más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar la producción del heterodímero con respecto a otros productos finales indeseados tal como homodímeros. Ver WO 96/27011 publicada el 6 de septiembre de 1996. Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidita, el otro a biotina. Los anticuerpos heteroconjugados se pueden elaborar usando cualquier método conveniente de reticulación. Los agentes adecuados de reticulación son bien conocidos en la técnica, y se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 4,676,980, junto con varias técnicas de reticulación. Las técnicas para generar anticuerpos bioespecíficos de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando enlace químico. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde se escinden de manera proteolítica anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente formador de complejos de tiol, arsenita de sodio para estabilizar a los ditioles vecinales y para prevenir la formación de disulfuros intermoleculares. Los " fragmentos Fab' generados se convierten entonces a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados de Fab' -TNB entonces se vuelve a convertir al Fab' -tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar y otro derivado de Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. En aún una modalidad adicional, se pueden acoplar químicamente los fragmentos Fab' -SH directamente recuperados de E. coli in vi tro para formar anticuerpos biespecíficos. (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)). Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se segregó de manera separada de E. coli y se sometió a acoplamiento químico directo in vi tro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera fue capaz de unirse a células que sobre expresan el receptor HER2 y células T humanas normales, así como activan la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumores de mama humano. También se han descrito varias técnicas para elaborar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivos de células recombinantes . Por ejemplo, se han producido anticuerpo biespecíficos usando cremalleras de leucina. (Kostelny et al., J. Immunol . 148 (5) :1547-1553 (1992)). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región de charnela para formar monómeros y se volvieron a oxidar entonces para formar los heterodímeros de anticuerpos . Este método también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un anticuerpo alternativo para elaborar fragmentos de anticuerpos biespecíficos . Los fragmentos comprenden una región variable (VH) de cadena pesada conectada a una región variable (VJ de cadena ligera por un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a aparearse con los dominios VL y VH complementarios del otro fragmento, formando de esta manera dos sitios de unión a antígeno. Otra estrategia para elaborar fragmentos de anticuerpos biespecíficos por el uso de dímeros de Fv de cadena individual (sFv) también se ha reportado. Ver Gruber et al., J. Immunol . 152:5368 (1994). De manera alternativa, el anticuerpo biespecífico puede ser un "anticuerpo lineal" producido como se describe en Zapata et al., Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062 (1995). De manera breve, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH(1) que forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos . También se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. (Tutt et al., J. Immunol . 147:60 (1991)). En ciertas modalidades, el anticuerpo monoclonal, humano, humanizado, humano Engineered™1 o anti-M-CSF variante es -un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento de anticuerpo de RXl, 5H4, MCI o MC3. Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora se pueden producir directamente por células hospedadoras recombinantes. Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) describen la secreción de fragmentos funcionales de anticuerpo a partir de bacterias (ver, por ejemplo Better et al., Skerra et al., Science 240: 1038-1041 (1988)). Por ejemplo, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplar químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). En otra modalidad, se forma el F(ab')2 usando la cremallera de leucina GCN4 para promover el ensamble de la molécula F(ab')2. De acuerdo con otro planteamiento, se pueden aislar los fragmentos Fv, Fab o F(ab')2 directamente del cultivo de células huésped recombinantes . Otras técnicas para la reproducción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el experto en la técnica. Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes recombinantes de su ambiente natural son materiales que interferirán con los usos terapéuticos o de diagnostico para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más de 95 % en peso del anticuerpo como se determina por el método de Lowry, y de manera más preferente más de 99%, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos interna o N-terminal por el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie, o de manera preferente tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células -recombinantes puesto -que no estará presente al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo. Sin embargo, de forma ordinaria, se preparará el anticuerpo aislado por al menos un paso de purificación. Para descripción adicional de la estructura y generación de anticuerpos, ver Roth, D.B., y Craig, N.L., Cell, 94:411-414 (1998), y la Patente de los Estados Unidos No. 6,255,458, incorporada en la presente como referencia en su totalidad. De forma breve, el proceso para generar ADN que codifica para los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera se presenta principalmente en células B en desarrollo. Antes del rearreglo y unión de los varios segmentos del gen de inmunoglobulina, los segmentos génicos V, D, J y constante (C) se encuentran en general en proximidad relativamente cercana en un cromosoma individual. Durante la diferenciación de las células B, uno de cada uno de los miembros apropiados de la familia de los segmentos génicos V, D, J (o sólo V y J en el caso de genes de cadena ligera) se recombinan para formar genes funcionalmente rearreglados de inmunoglobulina pesados y ligeros . Este proceso de rearreglo de segmentos génicos parece ser secuencial. Primero, se hacen las uniones D a J de cadena pesada, seguido por uniones de V a DJ de cadena pesada y las uniones V a J de cadena ligera. La recombinación de los segmentos génicos de región variable para formar regiones variables de cadena pesada y ligera funcionales se medía por secuencias de señales de recombinación (RSS) que flanquean a los segmentos V, D y J recombinantemente competentes. Los RSS necesarios y suficientes para la recombinación directa, comprenden un haptámero diad-simétrico, un nonámero rico en AT y una región separadora de intervención de ya sea 12 o 23 pares de base. Estas señales se conservan entre los diferentes sitios y especies que llevan a cabo la recombinación D-J (o V-J) y son funcionalmente intercambiables. Ver Oettinger, et al., (1990), Science, 248, 1517-1523 y referencias citadas en el mismo. El haptámero comprende la secuencia CACAGTG o su análogo seguido por un separador de secuencia no conservada y entonces un nonámero que tiene la secuencia ACAAAAACC o su análogo. Estas secuencias se encuentran en la J, o en lado en la dirección tres con apóstrofo, de cada segmento génico de V y D . Inmediatamente precediendo los segmentos D y J de línea germinal están nuevamente dos secuencias de señal de recombinación, primero el nonámero y entonces el heptámero nuevamente separado por- una secuencia no conservada. Las secuencias heptaméricas y nonaméricas que siguen a un segmento VL, VH o D son complementarias a aquellas que preceden a los segmentos JL, D o "JH con las cuales se recombinan. Los separadores entre las secuencias heptaméricas y nonaméricas son de ya sea 12 pares de base de largo o entre 22 y 24 pares de base de largo. Además del re rreglo de los segmentos V, D y J, se genera diversidad adicional en el repertorio primario de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina por medio de recombinación variable en las ubicaciones donde los segmentos V y J en la cadena ligera se unen y donde se unen los segmentos D y J de cadena pesada. Esta variación en la cadena ligera se presenta típicamente dentro del último codon del segmento génico V y el primer codon del segmento J. Se presenta imprecisión similar en la unión en el cromosoma de cadena pesada entre los segmentos D y JH y puede extenderse sobre tanto como 10 nucleótidos. Además, se pueden insertar varios nucleótidos entre el D y JH y entre los segmentos génicos VH y D que no se codifican por ADN genómico. La adición de estos nucleótidos se conoce como diversidad de N-región. El efecto neto de estos rearreglos en los segmentos génicos de región variable y "la recombinación variable que puede presentarse durante la unión es la producción de un repertorio de anticuerpos primarios . "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión y reconocimiento de antígeno completo. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable e cadena pesada y de cadena ligera en asociación estrecha no covalente. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH VI. De manera colectiva, las seis CDR confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un dominio variable individual (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque a una menor afinidad que el sitio completo de unión. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la adición de unos pocos residuos en el término carboxi del dominio CH1 de cadena pesada que incluye una o más cisteinas de la región de charnela de anticuerpo. Fab' -SH es la designación en la presente para Fab' en la cual los residuos de cisteina de los dominios constantes tienen un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos de Fab' que tienen cisteinas de charnela entre los mismos . Por "anticuerpo de neutralización" se quiere decir una molécula de anticuerpo que es capaz de eliminar o reducir de manera significativa una función efectora de un antígeno objetivo al cual se une. Por consiguiente, un anticuerpo anti-objetivo de "neutralización" es capaz de eliminar o reducir de manera significativa una función efectora, tal como actividad enzimática, unión a ligando, o señalización intracelular. Como se proporciona en la presente, las composiciones y métodos para tratar metástasis de cáncer y/o pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer pueden utilizar uno o más anticuerpos usados de manera individual o en combinación con otros productos terapéuticos para lograr los efectos deseados . Los anticuerpos de acuerdo a la presente invención se pueden aislar de un animal que produce el anticuerpo como resultado de contacto directo con un antígeno ambiental o inmunización con el antígeno. De manera alternativa, se pueden producir anticuerpos por metodología de ADN recombinante usando uno de los sistemas de expresión de anticuerpos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)) . Estos anticuerpos pueden incluir IgG recombinantes, proteínas de fusión quiméricas que tienen secuencias derivadas -de monoglobulina o anticuerpos "Humanos EngineeredME" que se pueden usar todos para el tratamiento de metástasis de cáncer y/o pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer de acuerdo a la presente invención. Además de moléculas intactas de longitud completa, el término "anticuerpo" también se refiere a fragmentos de" las mismas (tal como por ejemplo, los fragmentos scFv, Fv, Fd, Fab, Fab' y F(ab)'2) o multímeros o agregados de moléculas intactas y/o fragmentos que se unen a M-CSF (o M-CSFR) . Estos fragmentos de anticuerpo se unen al antígeno y se pueden derivatizar para exhibir características estructurales que facilitan la depuración y captación, por ejemplo, por incorporación de residuos de galactosa. En una modalidad de la presente invención, se pueden preparar anticuerpos monoclonales de M-CSF esencialmente como se describe en Halenbeck et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,491,065 (1997), incorporada en la presente como referencia. Los anticuerpos monoclonales de M-CSF de ejemplo incluyen aquellos que se unen a un epitope conformacional aparente asociado con M-CSF recombinante o dimérico nativo con neutralización concomitante de la actividad biológica. Estos anticuerpos son sustancialmente no reactivos con formas biológicamente inactivas de M-CSF que incluyen M-CSF dimérico químicamente derivatizado y monomérico. En otras modalidades de la presente invención, se proporcionan anticuerpos humanos Engineered^ anti-M-CSF monoclonales. La frase "anticuerpo humano Engineered"11" se refiere a un anticuerpo derivado de un anticuerpo no humano, típicamente un anticuerpo monoclonal de ratón. De manera alternativa, se puede derivar un anticuerpo humano Engineered™1 de un anticuerpo quimérico que retiene o sustancialmente retiene las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo de origen no humano, pero que presenta inmunogenecidad disminuida en comparación al anticuerpo parenteral cuando se administra a humanos. La frase "anticuerpo quimérico", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo que contiene una secuencia, derivado de dos diferentes anticuerpos (ver, por ejemplo Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567) que se origina típicamente de diferentes especies. De manera más típica, los anticuerpos quiméricos comprenden fragmentos de anticuerpo humano y murino, en general regiones variables de ratón y constantes de humano.

La frase "región de determinación de complementariedad" o el término CDR" se refiere a secuencias de aminoácidos que definen conjuntamente la afinidad de unión y especificidad de la región natural Fv de un sitio de unión de inmunoglobulina nativa (ver por ejemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 917 (1987); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services NIH Publication No. 91 3242 (1991)). La frase "región constante" se refiere a la porción de la molécula de anticuerpo que confiere funciones efectoras. En la presente invención, las regiones constantes de ratón están sustituidas de manera preferente por regiones constantes humanas . Las regiones constantes de los presentes anticuerpos se derivan de inmunoglobulinas humanas. La región constante de cadena pesada se puede seleccionar de cualquiera de los cinco isotipos: alfa, delta, epsilon, gamma o mu. Los anticuerpos de la presente invención se dice que son inmunoespecíficos o que se unen de manera específica si se unen al antígeno con una Ka de más de o igual a aproximadamente 106M"1 de manera preferente mayor que o igual a aproximadamente 107M_1, de manera más preferente mayor que o igual a aproximadamente 108M"1, y de manera más preferente mayor que o igual a 109M_1, ÍO^M"1, ÍO^M"1, o 1012M" 1. Los anticuerpos anti-M-CSF pueden unirse a diferentes formas que se presentan de forma natural de M-CSF, incluyendo aquellas expresadas por tej idos del hospedador/sujeto así como aquellas expresadas por el tumor. Los anticuerpos monoclonales descritos en la presente, tal como el anticuerpo RXl, 5H4, MCI o MC3 , tienen afinidad para M-CSF y se caracterizan por una constante de equilibrio de disociación (Kd) de la menos 10" 4M, de manera preferente al menos aproximadamente 10"7M a aproximadamente 10"8M, de manera más preferente, al menos aproximadamente 10'8M, 10-10M, 10-1:LM o 10-12M. Estas afinidades se pueden determinar fácilmente usando técnicas convencionales, tal como diálisis de equilibrio; al usar el instrumento BIAcore 2000, usando procedimientos generales resumidos por el fabricante; por radioinmunoensayo usando M-CSF marcado con 125I; o por otro método conocido por el experto. Los datos de afinidad se pueden analizar, por ejemplo, por el método de Scatchard et al, Ann N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949). De esta manera, será evidente que los anticuerpos de M-CSF preferidos exhibirán un alto grado d especificidad para M-CSF y se unirán con sustancialmente menor afinidad a otras moléculas. Los anticuerpos preferidos se unen a M-CSF con una afinidad similar como RXl murino de la Figura 4 se une a M-CSF, exhiben baja inmunogenicidad, e inhiben metástasis de células cancerosas cuando se prueban en modelos de animales con enfermedad metastático. Otros anticuerpos de ejemplo se unen a M-CSF con una afinidad similar como 5H4 , MCI o MC3 murino de las Figuras 13, 14 o 15, respectivamente, se unen a M- CSF. El antígeno que se usa para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, M-CSF intacto o un fragmento de M-CSF que retiene el epitope deseado, opcionalmente fusionado a otro polipéptido que permite que el epitope se exhiba en su conformación nativa. De manera alternativa, las células que expresan M-CSF en su superficie celular se pueden usar para generar anticuerpos. Estas células se pueden transformar para expresar M-CSF o pueden ser otras células que se presenten de manera natural que expresan M-CSF. Otras formas de M-CSF útiles para generar anticuerpos serán evidentes por aquellos expertos en la técnica.

Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos policlonales se formulan de manera preferente en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno pertinente y un adyuvante. Se puede obtener una respuesta mejorada de anticuerpos al conjugar el antígeno pertinente a una partícula que es inmunogénica en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa, albúmina sérica, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soya usando un agente bifuncional o de derivatización, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil-sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteina) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico u otros agentes conocidos en la técnica. Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados al combinar, por ejemplo, 100 µg o 5 µg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes del adyuvante completo de Freund y al inyectar la solución de manera intradérmica en múltiples sitios. Un mes más tarde, los animales se refuerzan con 1/5 a {fracción (1/10) } la cantidad original de péptido conjugado en el adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. A los 7-14 días después de la inyección de refuerzo, los animales se sangran y se valora el suero para el título de anticuerpos . Los animales se refuerzan hasta la meseta del título. De manera preferente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un diferente reactivo de reticulación. Los conjugados también se pueden elaborar en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteína. También, se usan de manera adecuada agentes agregantes tal como alumbre para mejorar la respuesta inmunitaria.

Anticuerpos monoclonales Se pueden elaborar anticuerpos monoclonales usando el método de hibridoma descrito primero por Kohler et al . , Nature, 256:495 (1975) o se pueden elaborar por métodos de ADN recombinante . En el método de hibridoma, un ratón u otro animal hospedador apropiado, tal como un hámster o mono macaco, se inmuniza como se describe en la presente para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unen de manera específica a la proteína usada para inmunización. De manera alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vi tro. Los linfocitos entonces se fusionan con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academia Press, 1986) ) . Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y cultivan en un medio adecuado de cultivo que contiene de manera preferente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de células no fusionadas de mieloma de origen. Por ejemplo, si las células de mieloma de origen carecen de la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , sustancias que previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficiente, soportan producción a alto nivel estable de anticuerpo por las células seleccionadas que producen el anticuerpo, y son sensibles a un medio. Las líneas de células de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano también se han descrito par ala producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133; 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Las líneas de mieloma murino de ejemplo incluyen aquellas derivadas de tumores de ratón MOP-21 y M.C.-ll disponibles del Institute Cell Distribution Center, San diego, California. EUA, y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Md. EUA. El medio de cultivo en el cual se cultiva la célula de hibridoma se valora para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno . De manera preferente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vi tro, tal como radioinmunoensayo (RÍA) o ensayo inmunosolvente enlazado a enzimas (ELISA) . La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo por análisis Scatchard (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)). Después de que se identifican células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad deseada, afinidad deseada y/o actividad deseada,_ los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución de limitación y cultivar por métodos normales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este propósito se incluyen, por ejemplo, el medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden cultivar in vivo como tumores de ascitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales segregados por los subclones se separan de manera adecuada del medio de cultivo, del fluido de ascitis, o suero por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina tal como por ejemplo, cromatografía de proteína A-separosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Producción recombinante de anticuerpos El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales se puede aislar y secuenciar de las células de hibridoma usando procedimientos convencionales (por ejemplo, al usar sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse de manera, específica a genes que codifican para la cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales) . La determinación de la secuencia requerirá en general aislamiento de al menos una , porción del gen o ADNc de interés. Usualmente esto requiere la clonación del ADN o de manera preferente, del ARNm (es decir, ADNc) que codifica para los anticuerpos monoclonales . La clonación se lleva a cabo usando técnicas normales (ver, por ejemplo Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, que se incorpora en la presente como referencia) . Por ejemplo, se puede construir una biblioteca de ADNc por transcripción invertida de poliA+ ARNm, de manera preferente ARNm asociado a membrana, y la biblioteca se detecta usando sondas específicas para secuencias génicas de polipéptidos de inmunoglobulina humana. En una modalidad preferida, sin embargo, se usa la reacción de la cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los ADNc (o porciones de los ADNc de longitud completa) que codifican para un segmento génico de inmunoglobulina de interés (por ejemplo, un segmento variable de cadena ligera) . Las secuencias amplificadas se pueden clonar fácilmente en cualquier vector adecuado, por ejemplo, vectores de expresión, vectores de minigen, o vectores de visualización en fagos. Se apreciará que el método particular de clonación usado no es crítico, en tanto que sea posible determinar las secuencias de alguna porción del polipéptido de inmunoglobulina de interés . Como se usa en la presente, una molécula de ácido nucleico "aislado" o secuencia de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que ya sea (1) se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual está asociada ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico o (2) se clona, amplifica, marca o distingue de otra manera de los ácidos nucleicos de fondo tal que la secuencia de ácido nucleico de interés se puede determinar, y se considere aislada. Una molécula de ácido nucleico aislada es diferente en la forma o disposición en la cual se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas por lo tanto se distinguen de la molécula de ácido nucleico como existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que ordinariamente expresan el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de aquella de las células naturales.

Una fuente de ARN usada para clonar y secuenciar es un hibridoma producido al obtener una célula B del ratón transgénico y al fusionar la célula B a una célula inmortal. Una ventaja de usar hibridomas es que se pueden detectar fácilmente y un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal humano de interés se selecciona. De manera alternativa, se puede aislar ARN de células B (o bazo completo) del animal inmunizado. Cuando se usan fuentes diferentes de hibridomas, puede ser deseable detectar las secuencias que codifican para inmunoglobulinas o polipéptidos de inmunoglobulina con características de unión específica. Un método para esta detección es el uso de tecnología de visualización en fagos . La visualización en fagos se describe en, por ejemplo, Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047, y Catón y Koprowski, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 87:6450,6454 (1990), cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia. En una modalidad que usa tecnología de visualización en fagos, el ADNc de un ratón transgénico inmunizado (por ejemplo ADNc de bazo total) se aisla, la reacción en cadena de la polimerasa se usa para amplificar una secuencia de ADNc que codifica para una porción de un polipéptido de inmunoglobulina, por ejemplo, regiones de CDR, y las secuencias amplificadas se insertan en un vector de fago. Los ADNc que codifican para los péptidos de interés, por ejemplo, péptidos de región variable con características deseadas de unión, se identifican por técnicas normales tal como movimiento extendido. La secuencia del ácido nucleico amplificado o clonado entonces se determina. Típicamente, la secuencia que codifica para una región variable completa del polipéptido de inmunoglobulina se determina, sin embargo, algunas veces será adecuado a la secuencia sólo una porción de una región variable, por ejemplo, la porción que codifica para CDR. Típicamente, la porción secuenciada será al menos de 30 bases de longitud, más frecuentemente en base a la codificación para al menos aproximadamente un tercio a al menos aproximadamente la mitad de la longitud de la región variable se secuenciará. La secuenciación se puede llevar a cabo en clones aislados de una biblioteca de ADNc o cuando se usa PCR, después de subclonar la secuencia amplificada o por secuenciación directa de PCR de segmento amplificado. Se lleva a cabo la secuenciación usando técnicas normales (ver or ejemplo, (ver por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, and Sanger, F. et al. (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, que se incorpora en la presente como referencia) . Al comparar la secuencia del ácido nucleico clonado con secuencias publicadas de genes de inmunoglobulina humana y ADNc, un experto será capaz fácilmente de determinar, dependiendo de la región secuenciada, (i) el uso de segmento de línea germinal del polipéptido de inmunoglobulina de hibridoma (incluyendo el isotipo de la cadena pesada) y (ii) la secuencia de las regiones variables de cadena pesada y ligera, incluyendo secuencias que resultan de la adición de la n-región y el proceso de mutación somática. Una fuente de información de secuencia génica de inmunoglobulina es el National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que entonces se transfectan a células hospedadoras tal como células de E. coli , células COS de simio, células 2936 de riñon embriónico humano (por ejemplo, células 293E) , células de ovario de hámster Chino (CHO) , o células de mieloma que no producen de otro modo proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes . También se conoce en la técnica la producción recombinante de anticuerpos . Las secuencias de control de expresión se refieren a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operablemente enlazada en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Se conocen células eucarióticas que utilizan promotores, señales de poliadenilación e intensificadores . El ácido nucleico está enlazado de manera operable cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para un guía secretorio o de pre-secuencia se enlaza de manera operable a ADN para un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador se enlaza de manera operable a una secuencia de codificación si afecta la trascripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma se enlaza de manera operable a una secuencia de codificación si se coloca para facilitar la traducción. En general, enlazado de manera operable significa que las secuencias de ADN que se enlazan están contiguas, y en el caso de un guía secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen que estar contiguos. El enlace se logra por ligación en sitios de restricción convenientes. Si no existen estos sitios, se usan ligadores o adaptadores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional. Célula, línea celular y cultivo celular frecuentemente se usan de manera indistinta y todas estas designaciones incluyen en la presente la progenie . Los transformantes y células transformadas incluyen la célula sujeto, primaria y los cultivos derivados de la misma sin relación del número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica como se detecta en la célula originalmente transformada. Donde se - proponen designaciones distintas, será claro del contexto.'- . En una modalidad alternativa, la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina de interés se puede determinar por secuenciación directa de proteínas . Las secuencias de nucleótidos de codificación adecuada se pueden designar de acuerdo a la tabla de codones universales. Las variantes de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo deseado se pueden preparar al introducir cambios apropiados de nucleótidos en el ADN de codificación, o por síntesis de péptidos. Estas variantes incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos. Cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución se hace para arribar a la construcción final, con la condición que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos pos-transduccionales del anticuerpo monoclonal, humano, humanizado, humano Engineered15 o variante, tal como el cambio del número o posición de los sitios de glicosilación. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para las variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo se preparan por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos que se presentan de forma natural) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio) , mutagénesis por PCR, y mutagénesis de cartucho de una variante anteriormente preparada o una versión o variante del anticuerpo. La invención también proporciona ácido nucleico aislado que codifica para los anticuerpos de la invención, opcionalmente enlazado de manera operable a secuencias de control reconocidas por una célula hospedadora, vectores y células hospedadoras que comprenden los ácidos nucleicos, y técnicas recombinantes para la producción de los anticuerpos, que pueden comprender el cultivo de la célula hospedadora de modo que el ácido nucleico se exprese y opcionalmente, recuperar el anticuerpo del cultivo de células hospedadoras o medio de cultivo. Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que los codifica se aisla e inserta en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica para- el anticuerpo monoclonal se aisla fácilmente y se secuencia • usando procedimientos convencionales (por ejemplo, al usar sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo) . Están disponibles muchos vectores. Los componentes del vector incluyen en general, de manera enunciativa y sin limitación, uno o más de los siguientes: una _ secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores selectivos, un elemento intensificador, un promotor, y una secuencia de terminación de trascripción. (1) Componentes de secuencia de señal El anticuerpo de esta invención se puede ' producir de manera recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, • que es de manera preferente una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el N-término de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia de señal seleccionada de manera preferente es una que se reconoce y procesa (es decir, se escinde por una peptidasa de señal) por la célula hospedadora. Si las células hospedadoras procarióticas no reconocen ni procesan la secuencia de señal de anticuerpo nativa, la secuencia de señal se puede sustituir por una secuencia de señal seleccionada, por ejemplo, a partir del grupo de peptato-liasa (por ejemplo pelB) , fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o guías de enterotoxinas II estables al calor. Para la secreción en levadura, la secuencia de señal nativa se puede sustituir por ejemplo, la guía de invertasa de levadura, guía de factor alfa (incluyendo guías de factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces) , o guía de fosfatasa acida, la guía de glucoamilasa de C. albicans, o la señal descrita en WO 90/13646. En la expresión de células de mamífero, las secuencias de señal de mamífero así como las guías secretorias virales, por ejemplo, la señal gD de herpes simplex, están disponibles. El ADN para esta región precursora se liga en cuadro de lectura al ADN que codifica para el anticuerpo. (2) Origen de componente de replicación. Los vectores tanto de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que le vector se replique en una o más células hospedadoras seleccionadas, en general, en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique de manera independiente del ADN cromosómico del hospedador, e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican de manera autónoma. Estas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen de plásmido 2 µ es adecuado para levadura, y son útiles varios orígenes virales para vectores de clonación en células de mamífero. En general, el componente de origen de replicación no se necesita para vectores de expresión de mamífero (el origen SV40 se puede usar típicamente sólo debido a que contiene el promotor temprano) . (3) Componente marcador selectivo Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen selectivo, también llamado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican .para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, tetraciclina, G418, geneticina, histidinol, o ácido micofenólico, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de los medio complejos, por ejemplo, el gen que codifica para D-alanina-racemasa para Bacilli. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedadora. Estas células que se transforman de manera exitosa con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a fármaco y de esta manera sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de esta selección dominante usan los fármacos metotrexato, neomicina, histidinol, puromicina, ácido micofenólico e higromicina. Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células componentes para tomar el ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, tal como DHFR, timidina-cinasa, metalotioneina-I y .- -II, de manera preferente genes de metalotioneina de primate, adenosina-desamidasa, ornitina-descarboxilasa, etc. Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR se identifican primero al cultivar todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR. Una célula hospedadora apropiada cuando se emplea DHFR tipo silvestre es la línea de células de ovario de hámster Chino (CHO) deficiente en la actividad de DHFR. De manera alternativa, células hospedadoras (particularmente hospedadores tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN ue codifican para el anticuerpo de la invención, proteína DHFR tipo silvestre, y otro marcador seleccionable tal como aminoglicósido-3 ' -fosfotransferasa (APH) de pueden seleccionar por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, canamicina, neomicina, o G418. Ver, patente de los Estados Unidos No. 4,965,199. Un gen de selección adecuado para el uso en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977). La presencia de la lesión de trpl en el genoma de la célula hospedadora de levadura entonces proporciona un ambiente efectivo para detectar la transformación por crecimiento en la ausencia de triptofano. De manera similar, se complementan cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) por plásmidos conocidos que tienen el gen Leu2. Se complementan cepas de levaduras deficientes en Ura3 por plásmidos que tienen el gen Ura3. Además, vectores derivados del plásmido circular de 1.6 µm pKDl se pueden usar para transformación de levaduras de Kluyveromyces. De manera alternativa, un sistema de expresión para producción a gran escala de quimosina de becerro recombinante se reportó por K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990). Los vectores de expresión de multi-copia estables para secreción de albúmina de suero humano recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces también se han descrito. Fleer et al, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991). (4) Componente promotor Los vectores de expresión y clonación contienen usualmente un promotor que se reconoce por el organismo hospedador y está enlazado de manera operable al ácido nucleico que codifica para el anticuerpo. Los promotores adecuados para el uso con hospedares procarióticos incluyen el promotor de arabinosa (por ejemplo araB) promotor phoA, sistemas promotores de ß-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofano (trp) , y promotores híbridos tal como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos . Los promotores para el uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.), enlazada operablemente al ADN que codifica para el anticuerpo de la invención. Las secuencias promotoras se conocen para eucariota. Virtualmente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases en la dirección 5' del sitio donde se inicia la trascripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases en la dirección 5' desde el inicio de la trascripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos está una secuencia AATAAA que puede ser la señal para adición de la extremidad poli A al extremo 3 ' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertan de manera adecuada en vectores de expresión eucarióticos. Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para el uso con hospedadores de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato-cinasa u otras enzimas glicolíticas, tal como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato-descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato-isomerasa, 3-fosfoglicerato-mutasa, piruvato-cinasa, triosefosfato-isomerasa, fosfoglucosa-isomerasa y glucocinasa. Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de trascripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol-deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa acida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo de nitrógeno, metalotioneina, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores adecuados y promotores adecuados para el uso en la expresión de levaduras se describen adicionalmente en EP 73,657. También se usan de manera ventajosa intensificadores de levadura con promotores de levadura. La trascripción del anticuerpo de vectores en células hospedadoras de mamífero se controla, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tal como el virus de leucemia de Abelson, virus de polioma, virus de viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2) , virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, de manera más preferente citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis B, Virus Simiesco 40 (SV40) , de promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, con la condición que estos promotores sean compatibles con los sistemas de las células hospedadoras . Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen de manera conveniente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene de manera conveniente como un fragmento de restricción de HindIII E. Se describe un sistema para expresar ADN en hospedadores mamíferos usando el virus de papiloma bovino como un vector en la patente de los Estados Unidos No. 4,419,446. Una modificación de este sistema se describe en la patente de los Estados Unidos No. 4,601,978. Ver también Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1998) en la expresión de ADNc de ß-interferón humano en células de ratón .bajo el control de un promotor de timidina-cinasa de virus de herpes simplex. De manera alternativa, se puede usar la repetición terminal larga del virus de sarcoma de rous como el promotor. (5) Componentes de elemento intensificador La trascripción de un ADN que codifica para el anticuerpo de esta invención por eucariotas superiores frecuentemente se incrementa al insertar una secuencia intensificadora en el vector. No se conocen muchas secuencias intensificadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina) . Sin embargo, de forma típica, se usará un intensificador a partir de un virus de célula eucariótica. Los ejemplos incluyen el intensificador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270) , el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, el intensificador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, e intensificadores de adenovirus. Ver también Yaniv, Nature 297: 17-148 (1982) en elementos de intensificador para activación de promotores eucarióticos . El intensificador se puede empalmar en el vector en una posición 5' o 3' a la secuencia que codifica para el anticuerpo, pero de manera preferente se localiza en un sitio 5' del promotor. (6) Componente de terminación de trascripción Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucarióticas (levadura, hongos, insecto, planta, animal, humano o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la trascripción- y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias están comúnmente disponibles desde las regiones no traducidas de 5' y ocasionalmente 3' de los ADN o ADNc eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del anticuerpo de codificación de ARNm. Un componente de terminación de trascripción útil es la región de poliadenilación de hormona de crecimiento bovino. Ver WO 94/11026 y el vector de expresión descrito en la misma. Otro es el terminador de trascripción de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón. (7) Selección y transformación de células hospedadoras Las células hospedadoras adecuadas para clonación o expresión del ADN en los vectores en la presente son las células procarióticas, de levadura o eucarióticas superiores descritas anteriormente. Las procariotas adecuadas para este propósito incluyen eubacterias, tal como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por ejemplo. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41 P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de Abril de 1989) , Pseudomonas tal como P. aeruginosa, y Streptomyces . Un hospedador de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31,446) , aunque son adecuadas otras cepas tal como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), y E. coli W3110 (ATCC 27,325) . Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes . Además de las procariotas, los microbios eucarióticos tal como hongos filamentosos o levadura son adecuados hospedadores de clonación o expresión para vectores que codifican para el anticuerpo. El Saccharomyces cerevisiae, o levadura común de panadero, es el más comúnmente usado entre los microorganismo hospedadores eucarióticos inferiores. Sin embargo, Están comúnmente disponibles y son útiles en la presente varios otros géneros, especies y cepas, tal como Schizosaccharomyces pombe; hospedador 'Kluyveromyces, tal como por ejemplo, K. lactis, K fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. wal tii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastors (EP 183,070);" Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos, tal como por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y hospedadores Aspergillus tal como A. nidulans y A. niger. Las células hospedadoras adecuadas para la expresión del anticuerpo glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células invertebradas incluyen células vegetales y de insecto. Las numerosas cepas y variantes baculovilares y las correspondientes células hospedadoras de insecto permisibles de hospedadores tal como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) , y Bombyx mori se han identificado. Están públicamente disponibles una variedad de cepas virales para transfección, por ejemplo, la variante L-l de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y estos virus se pueden usar como el virus en la presente de acuerdo a la presente invención, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda . Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soya, petunia, tomate, tabaco, lema y otras células vegetales también se pueden utilizar como hospedadores . - ~ Sin embargo, ha habido mayor interés en células de invertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) ha llegado a ser un procedimiento de rutina. Los ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamífero útiles son células de ovario de hámster Chino, que incluyen células CHOK1 (ATCC CCL61) , DXB-11, DG-44, y células de ovario de hámster Chino /-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; línea de riñon embriónico humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, [Graham et al., J. Gen Virol . 36: 59 (1977)] células de riñon de hámster neonato (BHK, ATCC CCL 10) células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23 243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) células de riñon de mono verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065) ; tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRl (Mather. -et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 ; y línea de hepatoma humano (Hep G2) . Las células hospedadoras se transforman o transfectan con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de anticuerpos y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados como sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifiquen para las secuencias deseadas. Además, los nuevos vectores y líneas de células transfectadas con múltiples copias de unidades de trascripción separadas por un marcador selectivo son particularmente útiles y preferidos para la expresión de anticuerpos que tienen como objetivo M-CSF. (8) Cultivo de células hospedadoras Las células hospedadoras usadas para producir el anticuerpo de esta invención se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tal como Ham's FIO (Sigma), Medio Esencial Mínimo ((MEM), (Sigma) , RPMl-1640 (Sigma) , y Medio Eagle Modificado de Dulbecco ' s ( (DMEM) , Sigma) son adecuados para cultivar las células hospedadoras. Además, se puede usar cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz . 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patente de los Estados Unidos No. 4,767,704,- 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90103430; WO 87/00195; o Patente de los Estados Unidos No. 30,985 como el medio de cultivo para las células hospedadoras . Cualquiera de estos medios se puede complementar como sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tal como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidémico) , sales (tal como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , amortiguadores (tal como HEPES) , nucleótidos (tal como adenosina y timidina) , antibióticos (tal como el fármaco Gentamyicin™) , oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes usualmente a concentraciones finales en el intervalo micromolar) , y glucosa o una fuente equivalente de energía. También se puede incluir cualquier otro suplemento necesario a concentraciones apropiadas que se conocerá por aquellos expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tal como la temperatura, pH y similares, son aquellas anteriormente usadas con la célula hospedadora seleccionada para expresión, y serán evidentes al experto en la técnica. (9) Purificación de anticuerpo Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir de manera intracelular, en el espacio periplasmático, o segregar directamente en el medio, incluyendo de cultivos microbianos . Si el anticuerpo se produce de manera intracelular, como un primer paso, los desechos en partículas ya sea células hospedadoras o fragmentos lisados, se remueven, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Better et al. Science 240: 1041-1043 (1988) ; -ICSU Short Reports 10: 105 (1990); y Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 457-461 (1993) describen un procedimiento para aislar anticuerpo que se segregan al espacio periplasmático de E. coli . (Ver también, [Cárter et al., Bio/Technology 10 : 163-167 (1992)]. La composición de anticuerpos preparada a partir de células microbianas o de mamífero se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía de intercambio aviar o catiónica, cromatografía con hidroxilapatita, y cromatografía de afinidad, con la cromatografía de afinidad que es la técnica de purificación preferida. La adecuabilidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. Se puede usar la proteína A para purificar anticuerpos que se basan en las cadenas pesadas ?l, ?2, o ?4 humanas (Lindmark et al., I Immunol . Meth. 62: 1-13 (1983)). Se recomienda proteína G para todos los isotipos de ratón y para ?3 humano (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). La matriz a la cual se une el ligando de afinidad es más frecuentemente agarosa, pero están disponibles otras matrices . Las matrices mecánicamente estables tal como vidrio controlado en poros o poli (estirenodivinil) benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3 , la resina Bakerbond ABX™ (J. T. _Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. Otras técnicas para purificación de proteína tal como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase invertida, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina, cromatografía SEPHAROSE™ en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación con sulfato de amonio también son adecuadas dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar.

Anticuerpos quiméricos y humanizados Debido a que los anticuerpos quiméricos o humanizados son menos inmonogénicos en humanos que los anticuerpos monoclonales de ratón de origen, se pueden usar para el tratamiento de humanos con mucho menor riesgo de anafilaxis. De esta manera, estos anticuerpos se pueden preferir en aplicaciones terapéuticas que comprenden la administración in vivo a un humano. Los anticuerpos monoclonales quiméricos, en los cuales los dominios Ig variables de un anticuerpo monoclonal de ratón se fusionan a los dominios Ig constantes humanos, se pueden generar usando procedimientos normales conocidos en la técnica (ver Morrison, S. L. , et al. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Región Domains, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855; y, Boulianne, G. L. , et al, Nature 312, 643-646. (1984)). Aungue algunos anticuerpos monoclonales quiméricos han probado ser menos inmunogénicos en humanos, los dominios Ig variables de ratón aún pueden conducir a una respuesta anti-ratón de humano significativa. Se pueden lograr anticuerpos humanizados por una variedad de métodos que incluyen, por ejemplo: (1) injertar las regiones de determinación de complementariedad (CDR) , no de humano en una estructura humana y región constante (un proceso referido en la técnica como humanización a través de "injerto de CDR"), o de manera alternativa, (2) transplantar los dominios variables completos no humanos, pero "encubriéndolos" con una superficie tipo humana por reemplazamiento de residuos de superficie (un proceso referido en la técnica como "enchapado"). En la presente invención, los anticuerpos humanizados incluirán anticuerpos tanto "humanizados" como "enchapados" . Estos métodos se describen en por ejemplo Jones et al., Nature 321:522 525 (1986); Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851 6855 (1984); Morrison y Oi, Adv. Immunol . , 44:65 92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3) :169 217 (1994)'; y Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng. 4(7): 773 83 (1991) cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia. En particular, un anticuerpo de roedor en la administración in vivo repetida en un humano ya sea sólo o como un conjugado provocará una respuesta inmunitaria en el receptor contra el anticuerpo de roedor; la llamada respuesta HAMA (Anticuerpo Humano Anti-Ratón) . La respuesta HAMA puede limitar la efectividad del producto farmacéutico si se requiere dosificación repetida. La inmunogenecidad del anticuerpo se puede reducir por modificación química del anticuerpo con un polímero hidrófilo tal como polietilenglicol o al usar los métodos de ingeniería genética para hacer la estructura de unión a anticuerpo más tipo humana. Por ejemplo, las secuencias génicas para los dominios variables del anticuerpo de ratón con el cual se puede sustituir CEA para los dominios variables de una proteína de mieloma humano, produciendo de esta manera un anticuerpo quimérico recombinante. Estos procedimientos se detallan en EP 194276, EP 0120694, EP 0125023, EP 0171496, EP 0173494 y WO 86/01533. De manera alternativa, las secuencias génicas de las CDR del anticuerpo de roedor se pueden aislar o sintetizar y sustituir por las regiones de secuencia correspondientes de un gen de anticuerpo humano homólogo, produciendo un anticuerpo humano con la especificidad del anticuerpo de ratón original . Estos procedimientos se describen en EP 023940, WO 90/07861 y WO 91/09967. De manera alternativa, se puede cambiar un gran número de residuos de superficie del dominio variable del anticuerpo de roedor a aquellos residuos normalmente encontrados en un anticuerpo humano homólogo, produciendo un anticuerpo de roedor que tiene una "chapa" superficial de residuos y que por lo tanto se reconocerá por si mismo por el anticuerpo humano. Este planteamiento se ha demostrado por Padlan et . al. (1991) Mol. Immunol . 28, 489. El injerto de CDR comprende la introducción de una o más de las seis CDR de los dominios Ig variables de cadena pesada y ligera de ratón en las cuatro regiones de estructura apropiadas de los dominios Ig variables humanos también llamado injerto de CDR. Esa técnica (Riechmann, L. , et al., Nature 332, 323 (1988)), utiliza las regiones de estructura conservadas (FR1-FR4) como un núcleo molecular para soportar las asas de CDR' que son los contactos primarios con el antígeno. Sin embargo, una desventaja del injerto de CDR, es que puede dar por resultado un anticuerpo humanizado que tiene una afinidad de unión sustancialmente menor que el anticuerpo de ratón original, debido a que los aminoácidos de las regiones de estructura pueden contribuir a la unión al antígeno, y debido a que los aminoácidos de las asas de CDR pueden tener influencia en la asociación de los dos dominios Ig variables. Para mantener la afinidad del anticuerpo monoclonal humanizado, se puede mejorar la técnica de injerto de CDR al elegir regiones de estructura humanas que se parecen más cercanamente a las regiones de estructura del anticuerpo de ratón original, o por mutagénesis dirigida al sitio de aminoácidos individuales dentro de la estructura o la CDR auxiliado por modelado en computadora del sitio de unión a antígeno (por ejemplo Co, M. S., et al. (1994), J. Immunol . 152, 2968-2976) . Un método para humanizar anticuerpos comprende alinear las secuencias de cadena pesada y ligera no humanas a las secuencias de cadena pesada y ligera humanas, seleccionar y reemplazar la estructura no humana con una estructura humana en base a esta alineación, modelar molecularmente para predecir la conformación de la secuencia humanizada y comparar a la conformación del anticuerpo de origen. Este proceso se sigue por retro-mutación repetida de residuos en la región de CDR que perturba la estructura de la CDR hasta que la conformación prevista del modelo de secuencia humanizada se aproxima cercanamente a la conformación de las CDR no humanas del anticuerpo no humano de origen. Estos anticuerpo humanizados se pueden derivatizar adicionalmente para facilitar la captación y depuración, por ejemplo, mediante receptores de Ashwell (Ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,530,101 y 5,585,089, patentes que se incorporan en la presente como referencia) . Se han reportado varias humanizaciones de anticuerpos monoclonales de ratón por diseño racional (ver por ejemplo 20020091240 publicada el 11 de Julio de 2002, WO 92/11018 y Patentes de los Estados Unidos No. 5,693,762, Patente de los Estados Unidos No. 5,766,866.

Variantes de la secuencia de aminoácidos Un método útil para identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para mutagénesis se llama "mutagénesis de exploración de la amina", como se describe por Cunningham y Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos objetivo se identifican (por ejemplo, residuos cargados tal como arg, asp, his, lys, y glu) y se reemplaza por un aminoácido neutral o negativamente cargado (de manera más preferente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Estas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones entonces se refinan al introducir adicionalmente otras variantes en, o por, los sitios de sustitución. De esta manera, en tanto que se predetermina el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos, no se puede predeterminar la naturaleza de la mutación per se. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, se lleva a cabo la mutagénesis aleatoria o de exploración de alanina en el codon objetivo o región objetivo y se segregan las variantes de anticuerpo expresadas para la actividad deseada. Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen funciones amino- y/o carboxil-terminales que varían en longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cientos o más de residuos, así como inserciones intra-secuencia de los residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N-residual o el anticuerpo (que incluye fragmento de anticuerpo) fusionado a una marca de epítope o a un epítope receptor de salvamento. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión a un polipéptido que incrementa la vida media en suero del anticuerpo, por ejemplo en el N-término o C-término. El término "marcado en epítope" se refiere al anticuerpo fusionado a una marca de epítope. El polipéptido de marca de epítope tiene suficientes residuos para proporcionar un epítope contra el cual nuevamente se pueda hacer un anticuerpo, aun es suficientemente corto tal que con interfiere con la actividad del anticuerpo. La marca de •epítope es de manera preferente suficientemente única de modo que el anticuerpo nuevamente no reaccionará de forma cruzada sustancialmente con otros epítopes . Los polipéptidos de marca adecuados tienen en general al menos seis residuos de aminoácido y usualmente entre aproximadamente 8-50 residuos de aminoácido (de manera preferente entre aproximadamente 9-30 residuos). Los ejemplos incluyen el polipéptido de marca flu HA y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol . Cell . Biol . 8: 2159-2165 (1988)]; la marca c-myc y los anticuerpo 8F9, 3C7, 6E10, G4 , B7 y 9E10 al mismo [Evan et al., Mol . Cell . Biol . 5 (12) : 3610-3616 (1985)]; y la marca de glucoproteina D de virus de Herpes Simplex (gD) y su anticuerpo [Paborsky et al . , Protein Engineering 3 (6) : 547-553 (1990)]. Otras marcas de ejemplo son una secuencia de poli-histidina, en general alrededor de seis residuos de histidina, que permiten el aislamiento de un compuesto marcado usando quelación de níquel . Se abarcan por la invención otros marbetes y marcas, tal como la marca FLAG™ (Eastman Kodak, Rochester, NY) , bien conocidas y usadas por rutina en la técnica. Como se usa en la presente, el término "epítope de unión a receptor de salvamento" se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo IgGi, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable de incrementar la vida media en suero in vivo de la molécula de IgG. Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo removido y un diferente residuo insertado en su lugar. La mutagénesis de sustitución dentro de cualquiera de las regiones hipervariables o de CDR o regiones de estructura se contempla. Se muestran en la Tabla 1 sustituciones conservadoras. Las sustituciones conservadoras se encuentran bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si estas sustituciones no dan por resultado cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones de ejemplo" en la Tabla 1, o como se describe además más adelante con referencia a las clases de aminoácidos, y los productos detectados .

Tabla 1 Original De Ejemplo Sustituciones de Residuo Preferidas Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys 5 Asn (N) gln; his; asp; lys; gln; arg Asp (D) glu; asn glu Cys (C) ser; ala ser Gln (Q) asn; glu asn Glu (E) asp; gln asp 0 Gly (G) ala His (H) asn; gln; lys; arg lie (I) leu; val; met; ala; leu phe norleucina Leu (L) norleucina; ile; val; ile _ c met; ala; phe; Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile ' leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr Pro (P) ala 0 Ser (S) thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; leu 5 ala; norleucina Se logran modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo al seleccionar sustituciones que difieren significativamente en su efecto al mantener (a) la estructura de la columna del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una hoja o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral . Los residuos que se presentan de manera natural se dividen en grupos en base a las propiedades comunes de la cadena lateral: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilos neutrales: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que tienen influencia en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe. Las sustituciones conservadores comprenden el reemplazo de un aminoácido con otro miembro de su clase. Las sustituciones no conservadoras comprenden el reemplazo de un miembro de una de estas clases con miembro de otra clase. Cualquier residuo de cisteína no comprendido en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo monoclonal, humano, humanizado, humano Engineered" o variante también se puede sustituir, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y para impedir reticulamiento anormal. A la inversa, se pueden adicionar enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) . La maduración de afinidad comprende preparación y detección de variantes de anticuerpo que tienen sustituciones dentro de las CDR de un anticuerpo de origen y la selección de variantes que tienen propiedades biológicas mejoradas tal como afinidad de unión con relación al anticuerpo de origen. Una manera conveniente para generar estas variantes de sustitución es la maduración de afinidad usando visualización en fagos. De forma breve, se maduran varios sitios de región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpo generadas de esta manera se exhiben de una manera monovalente a partir de partículas de fagos filamentosas como fusiones al producto del gen III de M13 empacado dentro de cada partícula. Las variantes visualizadas en fagos entonces se detectan para su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión). Se puede realizar la mutagénesis de exploración de alanina para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen de manera significativa a la unión del antígeno. De manera alternativa, o además, puede de ser benéfico analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Estos residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para sustitución de acuerdo a las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que se generan estas variantes, el panel de variantes se somete a detección como se describe en la presente y se pueden seleccionar los anticuerpos ' con propiedades superiores en uno o más ensayos pertinentes para desarrollo adicional. También se pueden producir variantes de anticuerpo qué tienen un patrón de glicosilación modificado con relación al anticuerpo de origen, por ejemplo, la supresión de una o más porciones de carbohidrato encontradas en el anticuerpo, y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glicosilación de los anticuerpos es típicamente ya sea N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas, asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para unión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. La presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación. De esta manera, se pueden adicionar sitios de glicosilación N- enlazados a un anticuerpo al alterar la secuencia de aminoácidos tal que contenga una o más de estas secuencias tripeptídicas. La glicosilación O-enlazada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-aceilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxi-aminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. Se pueden' adicionar sitios de glicosilación O-enlazados a un anticuerpo al insertar o sustituir uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original. A manera de ejemplo, los aminoácidos de RXl en las posiciones 41-43 de la Figura 4A (NGS) se pueden retener. De manera alternativa, sólo se pueden retener los aminoácidos 41 y 42 (NG) . Ordinariamente, las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano Engineered™ tendrán una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos del anticuerpo humano Engineered™ originales de cualquier cadena pesada o ligera (por ejemplo, como en cualquiera de las figuras 19B hasta 22B) , de manera más preferente al menos 80 %, de manera más preferente al menos 85 %, de manera más preferente al menos 90 %, y de manera más preferente al menos 95 %, incluyendo, por ejemplo, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, y 100 %. La identidad u homología con respecto a esta secuencia se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácido en la secuencia candidata que son idénticos con los residuos humanos EngineeredMR, después de la alineación de las secuencias y la introducción de separaciones, si es necesario, para lograr el máximo por ciento de identidad de secuencia, y no considerando ninguna sustitución conservadora (como se define en la Tabla 1 anterior) como parte de la identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones, supresiones o inserciones N-terminales, C-ter inales, o internas en la secuencia del anticuerpo se debe considerar como que afecta la identidad u homología de la secuencia. De esta manera, la identidad de la secuencia se puede determinar por métodos normales que se usan comúnmente para comparar la similitud de la posición de los aminoácidos de dos polipéptidos. Usando un programa de computadora tal como BLAST o FASTA, se alinean dos polipéptidos para correspondencia óptima de sus aminoácidos respectivos (ya sea a lo largo de la longitud completa de una o ambas secuencias, o a lo largo de una porción predeterminada de una o ambas secuencias) . Los programas proporcionan una penalidad de abertura por omisión y una penalidad de separación por omisión, y una matriz de puntuación tal como PAM 250 [una matriz de puntuación normal; ver Dayhoff et al., en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)] se puede usar en unión para el programa de computadora. Por ejemplo, el por ciento de identidad entonces se puede calcular como: el número total de correspondencias idénticas multiplicado por 100 y luego dividido por la suma de la longitud de la secuencia más larga dentro del intervalo correspondido y el número de separaciones introducidas en las secuencias más largas a fin de alinear las dos secuencias. Se contemplan otras modificaciones del anticuerpo. Por ejemplo, puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, pera mejorar la efectividad del anticuerpo del tratamiento de cáncer, a manera de ejemplo. Por ejemplo, se pueden introducir residuos de cisteína en la región Fc, permitiendo de este modo la formación de enlaces de disulfuro intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede tener capacidad de internalización mejorada y/o aniquilación celular incrementada mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Ver Carón et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor mejorada también se pueden preparar usando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., Cáncer Research 53: 2560-2565 (1993). De manera alternativa, se puede manejar un anticuerpo que tiene regiones Fc duales y de este modo puede tener lisis mejorada por complemento y capacidades de ADCC. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3 : 219-230 (1989) . Además, se ha mostrado que secuencias dentro de las CDR pueden provocar que un anticuerpo se una a un MHC Clase II y activar una respuesta de células T auxiliares indeseada. Una sustitución conservadora puede permitir que el anticuerpo retenga la actividad de unión, aún perder su capacidad para activar una respuesta de células T indeseada. Ver también Steplewski et al., Proc Nati Acad Sci EUA. 1988 ; 85 (13) : 4852-6, incorporada en la presente como referencia en su totalidad, que describió anticuerpos quiméricos en donde se unió una región variable murina con las regiones constantes gamma 1, gamma 2, gamma 3, y gamma 4 humanas. En ciertas modalidades de la invención, puede ser deseable usar un fragmento de anticuerpo, en lugar de un anticuerpo intacto, para incrementar la penetración tumoral, a manera de ejemplo. En este caso, puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo a fin de incrementar su vida media en suero, por ejemplo, adicionando moléculas tal como PEG u otros polímeros solubles en agua, incluyendo polímeros de polisacáridos, a fragmentos de anticuerpo para incrementar la vida media. Esto también se puede lograr, por ejemplo, por incorporación de un epítope de unión al receptor de salvamento en el fragmento de anticuerpo (por ejemplo, mutación de la región apropiada en el fragmento de • anticuerpo o al incorporar el epítope en una marca de péptido que entonces se fusiona al fragmento de anticuerpo en cualquier extremo o en la porción intermedia, por ejemplo, por síntesis de péptido o ADN) (ver, por ejemplo, W096/32478) . El epítope de unión de receptor de salvamento constituye de manera preferente una región en donde cualquiera de uno o más residuos de aminoácido de una o dos asas de un dominio Fc se transfieren a una posición análoga del fragmento de anticuerpo. De manera aún más preferente, se transfieren tres o más residuos de una o dos asas del dominio Fc. De manera aún más preferida, el epítope se toma del dominio CH2 de la región Fc (por ejemplo, de IgG) y se transfiere a la región CH1, CH3, o VH, o más de una región, del anticuerpo. De manera alternativa, el epítope se toma del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región C.sub.L o la región V.sub.L, o ambas, del fragmento de anticuerpo. Ver también solicitudes internacionales WO 97/34631 y WO 96/32478 que describen variantes de Fc y su interacción con el receptor de salvamento. De esta manera, los anticuerpos de la invención pueden comprender una porción Fc humana, una porción Fc de consenso humana, o una variante de la misma que retiene la capacidad para interactuar con el receptor de salvamento de Fc, incluyendo variantes en las cuales se modifican o remueven las cisteínas comprendidas" en el enlace de disulfuro, y/o en las cuales se adiciona un met en el N-término y/o uno o más de los 20 aminoácidos N-terminales se remueven, y/o regiones que interactúan con el complemento, tal como el sitio Clq, se remueven, y/o se remueve el sitio de ADCC [ver, por ejemplo, Molec. Immunol . 29 (5) : 633-9 (1992)]. Los estudios anteriores correlacionaron el sitio de unión en IgG humana o murina para FcR principalmente a la región inferior de charnela compuesta de los residuos 233-239 de IgG. Otros estudios propusieron segmentos amplios adicionales, por ejemplo, Gly316-Lys338 para receptor I de Fc humano, Lys274-Arg301 y Tyr407-Arg416 para receptor III Fc humano, o se encontraron unos pocos residuos específicos fuera de la charnela inferior, por ejemplo, Asn297 y Glu318 para IgG2b murina que interactúa con el receptor II Fc murino. El reporte de la estructura cristalina 3.2-Á del fragmento de Fc de IgGl humana con el receptor IIIA de Fc humano delinearon los residuos Leu234-Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299, y Ala327-Ile332 de IgGl como comprendidos de la unión al receptor IIIA de Fc. Se ha sugerido en base a la estructura de cristal que además de la charnela inferior (Leu234-Gly237) , los residuos en las asas FG (residuos 326- 330) y BC (residuos 265-271) de dominio CH2 de IgG puede jugar un papel en la unión al receptor IIA de Fc. Ver Shields et al., J. Biol. Chem., 276 (9) : 6591-6604 (2001), incorporado en la presente como referencia en su totalidad. La mutación de residuos dentro de los sitios de unión al receptor Fc puede dar por resultado función efectora alterada, tal como actividad ADCC o CDC alterada, o vida media alterada. Como se describe anteriormente, las mutaciones potenciales incluyen inserción, supresión o sustitución de uno o más residuos, incluyendo sustitución con alanina, una sustitución conservadora, una sustitución no conservadora, o reemplazo con un residuo de aminoácido correspondiente en la misma posición de una subclase diferente IgG (por ejemplo, reemplazando un residuo de IgGl con un correspondiente residuo de IgG2 en esa posición) . Shields et al., reportaron que los residuos de EgGl comprendidos en la unión a todos los receptores de Fc humanos se localizan en el dominio CH2 próximo a la charnela y caen en dos categorías como sigue: 1) posiciones que interactúan directamente con todos los FcR e incluyen Leu234-Pro238, Ala327, y Pro329 (y posiblemente Asp265) ; 2) posiciones que tienen influencia en la naturaleza o posición de carbohidrato incluyen Asp265 y Asn297. Los residuos de IgGl adicionales que afectan la unión al receptor II de Fc son como siguen: (efecto más grande) Arg255, Thr256, Glu258, Ser267, Asp270, Glu272, Asp280, Arg292, Ser298, y (menos efecto) His268, Asn276, His285, Asn286, Lys290, Gln295, Arg301, Thr307, Leu309, Asn315, Lys322, Lys326, Pro331, Ser337, Ala339, Ala378, y Lys414. A327Q, A327S, P329A, D265A y D270A redujeron la unión. Además de los residuos identificados anteriormente para todos los FcR, los residuos de IgGl adicionales que redujeron la unión al receptor IIIA de Fc por más de 40 % o más son como sigue: Ser239, Ser267 (Gly únicamente), His268, Glu293, Gln295, Tyr296, Arg301, Val303, Lys338, y Asp376. Las variantes que mejoraron la unión a FcRIIIA incluyen T256A, K290A, S298A, E333A, K334A, y A339T. Lys414 mostró una reducción de 40 % en la unión para FcRIIA y FcRIIB, Arg416 una reducción de 30 % para FcRIIA y FcRIIIA, Gln419 una reducción de 30 % a FcRIIA y una reducción de 40 % a FcRIIB, y Lys360 una mejora de 23 % a FcRIIIA. Ver también, Biochem. Soc. Trans. (2001) 30, 487-490. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos número 6,194,551, incorporada en la presente como referencia en su totalidad, describe variantes que alteran la función efectuada gue contiene mutaciones en la región Fc de IgG humana, en la posición de aminoácido 329, 331 ó 322 (usando numeración Kabat) , algunos de los cuales exhiben unión reducida a Clq o actividad de CDC. Como otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos número 6,737,056, incorporada en la presente como referencia en su totalidad, describe variantes con unión alterada al efector o receptor de Fc-gamma que contiene mutaciones en la región Fc de IgG humana, en las posiciones de aminoácidos 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ó 439 (usando numeración Kabat) , algunas de las cuales exhiben perfiles de unión a receptor asociadas con actividad reducida de ADCC o CDC. De éstas, una mutación en la posición de aminoácidos 238, 265, 269, 270, 327 ó 329 se señala que reduce la unión a FcRI, una mutación en la posición de aminoácidos 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 ó 439 se señala que reduce la unión a FcRII, y una mutación en la posición de aminoácidos 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 ó 437 se señala que reduce la unión a FcRIII. La patente de los Estados Unidos número 5,624,821, incorporada en la presente como referencia en su totalidad, reporta que la actividad de unión a Clq de un anticuerpo murino se puede alterar al mutar los residuos de aminoácido 318, 320 ó 322 de la cadena pesada y que al reemplazar el residuo 297 (Asn) da por resultado la remoción de la actividad lítica. La Publicación de Solicitud de patente de los Estados Unidos número 20040132101, incorporada en la presente como referencia en su totalidad, describe variantes con mutaciones en las posiciones de aminoácido 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 299, 313, 325, 328, ó 332 (usando numeración Kabat) ó posiciones 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330, ó 332 (usando numeración Kabat), de las cuales las mutaciones en las posiciones 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330, ó 332 pueden reducir la actividad de ADCC o reducir la unión a un receptor de Fc-gamma. Chappel et al., Proc Nati Acad Sci EUA. 1991; 88 (20) : 9036-40, incorporado en la presente como referencia en su totalidad, reportan que la actividad citófila de IgGl es una propiedad intrínseca de su dominio CH2 de cadena pesada. Las mutaciones de puntos individuales en cualesquiera de los residuos de aminoácido 234-237 de IgGl disminuyeron o abolieron de forma significativa su actividad. La sustitución de todos los residuos 234-237 (LLGG) de IgGl en IgG2 e IgG4 se requirieron para restaurar la actividad de unión completa. Un anticuerpo de IgG2 que contiene la secuencia ELLGGP completa (residuos 233-238) se observó que es más activa que la IgGl tipo silvestre. Isaacs et al., J Immunol . 1998 ; 161 (8 ): 3862-9, incorporado en la presente como referencia en su totalidad, reporta que mutaciones dentro de una porción crítica para la unión a Fc-gammaR (glutamato 233 a prolina, leucina/fenilalanina 234 a valina, y leucina 235 a alanina) previnieron completamente el agotamiento de las células objetivo. La mutación, glutamato 318 a alanina, eliminó la función efectora de IgG2b de ratón y también redujeron la potencia de IgG4 humana. Armour et al., Mol Immunol . 2003; 40 (9) : 585-93, incorporada en la presente como referencia en su totalidad, identificaron variantes de IgGl que reaccionan como el receptor de activación, Fcga maRIIa, al menos 10 veces menos eficientemente que la IgGl tipo silvestre pero cuya unión al receptor inhibidor, FcgammaRIIb, sólo se reduce cuatro veces. Se hicieron mutaciones en la región de los aminoácidos 233-236 y/o en las posiciones de aminoácidos 327, 330 y 331. Ver también WO 99/58572, incorporada en la presente como referencia en su totalidad.

Xu et al., J Biol Chem. 1994; 269 (5) : 3469-74, incorporada en la presente como referencia en su totalidad, reporta que la mutación IgGl Pro331 a Ser redujo notablemente la unión de Clq y eliminó virtualmente "la actividad lítica. En contraste, la sustitución de Pro por Ser331 en IgG4 otorgó actividad lítica parcial (40 %) a la variante Pro331 de IgG4. Schuurman et al,. Mol Immunol . 2001; 38 (1) : 1-8, incorporada en la presente como referencia en su totalidad, reportan que la mutación de una de las cisteínas de charnela comprendida en la formación de enlace de cadena interpesada, Cys226, a serina dio por resultado un enlace de cadena inter-pesada más estable. La mutación de la secuencia de charnela Cys-Pro-Ser-Cys de IgG4 a la secuencia de charnela de IgGl Cys-Pro-Pro-Cys también estabiliza de manera notable la interacción covalente entre las cadenas pesadas . Angal et al., Mol Immunol . 1993; 30 (1) : 105-8, incorporada en la presente como referencia en su totalidad, reportan que la mutación de la serina en la posición 241 de aminoácido en IgG4 a prolina (encontrada en esa posición en IgGl e IgG2) conduce a la producción de un anticuerpo homogéneo, así como la extensión de la vida media en suero y la mejora de la distribución en tejido en comparación a la IgG4 quimérica original.

Anticuerpos humanos y humanos EngineeredMR Humanos EngineeredMR Humanos EngineeredMR de dominios variables de anticuerpo se ha descrito por Studnicka [Ver, por ejemplo, Studnicka et al., patente de los" Estados Unidos número 5,766,886; Studnicka et al., Protein Engineering 7: 805-814 (1994)] como un método para reducir la inmunogenicidad en tanto que se mantiene la actividad de unión de moléculas de anticuerpo. De acuerdo al método, cada aminoácido de región variable se ha asignado a un riesgo de sustitución. Las sustituciones de aminoácidos se distinguen por una de tres categorías de riesgo: (1) cambios de bajo riesgo son aquellos que tienen el mayor potencial para reducir la inmunogenicidad con la menor oportunidad de perturbar la unión a antígeno; (2) cambios de riesgo moderado son aquellos que reducirán adicionalmente la inmunogenicidad, pero tienen una mayor oportunidad de afectar la unión a antígeno o plegado de la proteína; (3) residuos de alto riesgo son aquellos que son importantes para la unión o para mantener la estructura del anticuerpo y llevan el más alto riesgo que se afectará la unión al antígeno o plegado de la proteína. Debido al papel estructural tridimensional de las prolinas, en general se consideran las modificaciones en las prolinas como que son cambios de riesgo al menos moderado, aún si la posición es típicamente una posición de bajo riesgo . Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo de roedor son humanas EngineeredMR como sigue para sustituir los aminoácidos humanos en posiciones determinadas como que son improbables de que efectúen de manera adversa ya sea la unión a antígeno o al plegado de la proteína, pero probablemente reduzcan la inmunogenicidad en un ambiente humano. Los residuos de aminoácido que están en posiciones de "bajo riesgo" y que son candidatos para modificación de acuerdo al método se identifican al alinear la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de roedor con una secuencia de región variable humana. Se puede usar cualquier región variable humana, incluyendo una secuencia VH o VL individual o una secuencia VH o VL de consenso humana o una secuencia de línea germinal humana individual o de consenso. Los residuos de aminoácido en cualquier número de las posiciones de bajo riesgo, o en todas las posiciones de bajo riesgo, se pueden cambiar. Por ejemplo, en cada posición de bajo riesgo donde difieran los residuos de aminoácido murinos y humanos alineados, se introduce una modificación de aminoácido que reemplaza al residuo de roedor con el residuo humano. De manera alternativa, los residuos de aminoácido en todas estas posiciones de bajo riesgo y en cualquier número de posiciones de riesgo moderado se pueden cambiar. De manera ideal, para lograr la menor inmunogenicidad, se cambian todas las posiciones de riesgo bajo y moderado del roedor a la secuencia humana. Los genes sintéticos que contienen regiones variables de cadena pesada y/o ligera, modificadas, se construyen y enlazan a las regiones constantes de cadena ligera kappa y/o cadena pesada ? humanas. Cualquier región constante de cadena ligera y cadena pesada humana se puede usar en combinación con las regiones variables del anticuerpo humano Engineered™, incluyendo IgA (de cualquier subclase, tal como IgAl ó IgA2) , IgD, IgE, IgG (de cualquier subclase, tal como IgGl, IgG2, IgG3, O IgG4) ,-• o IgM. Los genes de cadena ligera y pesada humanos se introducen en las células hospedadoras, . tal como células de mamífero, y se obtienen y caracterizan los productos de inmunoglobulina recombinantes resultantes.

Anticuerpos humanos de animales transgénicos Los anticuerpos humanos a M-CSF también se pueden producir usando animales transgénicos que no tienen producción endógena de inmunoglobulinas y se manejan para contener sitios de inmunoglobulina humana. Por ejemplo la WO 98/24893 describe animales transgénicos que tienen un sitio Ig humano en donde los animales no producen inmunoglobulinas endógenas funcionales debido a la interacción de los sitios de cadena pesada y ligera endógenos. La WO 91/741 también describe hospedadores mamíferos no primates transgénicos capaces de montar una respuesta inmunitaria a un inmunógeno, en donde los anticuerpos tienen regiones constantes y/o variables, de primate, y en donde los sitios endógenos de codificación de inmunoglobulina se sustituyen o inactivan. La WO 96/30498 describe el uso del sistema Cre/Lox para modificar el sitio de inmunoglobulina en un mamífero, tal como para reemplazar toda una porción de la región constante variable para formar una molécula de anticuerpo modificada. La WO 94/02602 describe hospedadores de mamífero no humanos que tienen los sitios Ig endógenos inactivados y los sitios Ig humanos funcionales. La patente de los Estados Unidos número 5,939,598 describe métodos para elaborar ratones transgénicos en los cuales los ratones carecen de cadenas pesadas endógenas, y expresan un sitio de inmunoglobulina exógeno que comprende una o más regiones constantes xenogeneicas . Usando un animal transgénico descrito anteriormente, se puede producir una respuesta inmunitaria a una molécula antigénica seleccionada, y las células productoras del anticuerpo se pueden remover del animal y usar para producir hibridomas que segreguen anticuerpos monoclonales humanos. Los protocolos de inmunización, adyuvantes y similares se conocen en la técnica, y se usan en inmunización de, por ejemplo, un ratón transgénico como se describe en WO 96/33735. Esta publicación describe anticuerpos monoclonales contra una variedad de moléculas antigénicas incluyendo IL 6, IL 8 , TNFa, CD4 humana, L-selectina, gp39, y toxina de tétano. Los anticuerpos monoclonales se pueden probar para la capacidad para inhibir o neutralizar la actividad biológica o efecto fisiológico de la proteína correspondiente. La WO 96/33735 describe que los anticuerpos monoclonales contra IL-8, derivados de células inmunitarias de ratones transgénicos inmunizados con IL-8, bloquearon funciones inducidas por IL-8 de neutrófilos. Los anticuerpos monoclonales humanos con especificidad para el antígeno usado para inmunizar animales transgénicos también se describen en WO 96/34096 y la publicación de patente de los Estados Unidos número 20030194404; y la publicación de patente de los Estados Unidos número 20030031667). Ver también Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno . , 7:33 (1993); y la patente de los Estados Unidos número 5,591,669, patente de los Estados Unidos número 5,589,369, patente de los Estados Unidos número 5,545,807; y publicación de patente de los Estados Unidos número 20020199213. La solicitud de patente de los Estados Unidos número 20030092125 describe métodos para desviar la respuesta inmunitaria de un animal al epítope deseado. También se pueden generar anticuerpos humanos por células B activadas in vi tro (ver patentes de los Estados Unidos números 5,567,610 y 5,229,275).

Anticuerpos humanos de tecnología de visualización en fagos El desarrollo" de tecnologías para elaborar repertorios de genes de anticuerpos humanos recombinantes, y la visualización de los fragmentos de anticuerpo codificados en la superficie de bacteriófago filamentoso, ha proporcionado un medio para elaborar directamente anticuerpos humanos. Los anticuerpos producidos por la tecnología de fago se producen como fragmentos de unión a antígeno, usualmente fragmentos Fv o Fab en bacterias y de esta manera carecen de funciones efectoras. Las funciones efectoras se pueden introducir por una de dos estrategias. Los fragmentos se pueden manejar ya sea en anticuerpos completos para la expresión en células de mamífero, o en fragmentos de anticuerpo biespecíficos con un segundo sitio de unión capaz de activar una función efectora. Típicamente, el fragmento Fd (VH-CH1) y cadena ligera (VL-CL) de anticuerpos se clonan de manera separada por PCR y se recombinan aleatoriamente en bibliotecas de visualización en fagos de combinación, que entonces se pueden seleccionar para la unión a un antígeno particular. Los fragmentos Fab se expresan en la superficie de fagos, es decir, enlazados físicamente a genes que los codifican. De esta manera, la selección de Fab por unión al antígeno co-selecciona la secuencia de codificación de Fab, que se pueden amplificar de manera subsiguiente. Por varias rondas de unión a antígeno y re-amplificación, un procedimiento llamado movimiento extenso, se enriquecen y finalmente se aislan Fab específicos para el antígeno. En 1994, se describió un planteamiento para la humanización de anticuerpos, llamada "selección guiada". La selección guiada utiliza el poder de la técnica de visualización en fagos para la inmunización de anticuerpos monoclonales de ratón (Ver Jespers, L. S., et al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)). Para esto, el fragmento Fd del anticuerpo monoclonal de ratón se puede exhibir en combinación con una biblioteca de cadenas ligeras humanas, y la biblioteca resultante de Fab híbridos entonces se puede seleccionar con antígeno. El fragmento Fd de ratón de esta manera proporciona una plantilla para guiar la selección. De manera subsiguiente, las cadenas ligeras humanas seleccionadas se combinan con una biblioteca de fragmentos Fd humanos. La selección de la biblioteca resultante produce Fab completamente humano. Se ha descrito una variedad de procedimientos para derivar anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de visualización en fagos (ver, por ejemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991); patentes de los Estados Unidos números 5,565,332 y 5,573,905; Clackson, T., and Wells, J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)). En particular, la selección in vitro y la evolución de anticuerpos derivados de bibliotecas de visualización en fagos ha llegado a ser una herramienta poderosa (Ver, Burton, D. R. , y Barbas III, C. F. , Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994); y, Winter, G., et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994); solicitudes de patentes de los Estados Unidos números 20020004215 y W092/01047; solicitud de patente de los Estados Unidos número 20030190317 publicada el 9 de octubre de 2003 y la patente de los Estados Unidos número 6,054,287; patente de los Estados Unidos número 5,877,293. Watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178: 187-193, y solicitud de patente de los Estados Unidos número 200120030044772 publicada el 6 de marzo de 2003 describe métodos para detectar bibliotecas de anticuerpos expresadas en fagos u otras moléculas de unión por captura de alzamiento, un método que comprende inmovilización de las moléculas de unión candidatas en un soporte sólido.

Los productos de anticuerpos se pueden detectar para la actividad y para la adecuabilidad en los métodos de tratamiento de la invención usando ensayos como se describe en la sección titulada "Métodos de Detección" en la presente usando cualquier ensayo adecuado conocido en la técnica.

Otras modificaciones covalentes También se introducen modificaciones covalentes del anticuerpo incluidas dentro del alcance de esta invención. Se pueden elaborar por síntesis química o por escisión enzimática o química del anticuerpo, si es aplicable. Otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se introducen en la molécula al hacer reaccionar residuos de aminoácido seleccionados, del anticuerpo con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales . Los residuos de cisteinilo más comúnmente se hacen reaccionar con a-haloacetatos (y aminas correspondientes) , tal como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos de cisteinilo también se derivatizan por reacción con bromotrifluoroacetato, ácido . alfa. -bromo-ß- (5-imidozoil) propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil-2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri- 4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazol . Se derivatizan residuos de histidilo por reacción con dietilpirocarbonato a pH 5.5-7.0 debido a que este agente es altamente específico para la cadena lateral de histidilo. También es útil el bromuro de para-bromofenacilo; la reacción se realiza de manera preferente en cacodilato de sodio 0.1 M a pH 6.0. Se hacen reaccionar los residuos de lisinilo y amino-terminales con anhídrido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatización de los residuos que contienen . alfa. -amino- incluyen imidoésteres tal como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencensulfónico, O-metilisourea, 2, 4-pentanodiona, y reacción catalizada por transaminasa con glioxilato. Se modifican residuos de arginilo por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre estos fenilglioxal, 2, 3-butanodiona, 1, 2-ciclohexanodiona, y ninhidriná. La derivatización de los residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido a la alta pKa del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como el grupo epsilon-amino de arginina. La modificación específica de residuos de tirosilo se puede hacer, con interés particular en introducir marcas espectrales en los residuos tirosilo por reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano . Más comúnmente, se usan N-acetilimidazol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil-tirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo se yodan usando i25j 0 i3ij para preparar proteínas marcadas para el uso en radioinmunoensayos . Los grupos laterales de carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican de manera selectiva por reacción con carbodiimidas (R-N.dbd. C.dbd.N-R' ) , donde R y R' son grupos alquilo diferentes, tal como l-ciclohexil-3- (2-morfolinil-4-etil) carbodiimida o l-etil-3- (4-azonia-4, 4-dimetilpentil) carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten a residuos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio. Frecuentemente los residuos de glutaminilo y asparaginilo se desaminan frecuentemente a los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente. Estos residuos se desaminan bajo condiciones neutrales o básicas. La forma desaminada de estos residuos cae dentro del alcance de esta invención.

Otras modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilación de grupos . alfa.-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure y Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983) ) , acetilación de la amina N-terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal. Otro tipo de modificación covalente comprende el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos ya que no requieren producción del anticuerpo en una célula hospedadora que tenga capacidades de glicosilación para glicosilación N- u O-enlazada. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, los azúcares se pueden unir (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tal como aquellos de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tal como aquellos de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tal como aquellos de fenilalanina, tirosina, o triptofano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en WO87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981). La remoción de cualquier porción de carbohidrato presente en el anticuerpo se puede lograr de manera química o - enzimática. La desglicosilación química requiere exposición del - anticuerpo • al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da por resultado la escisión de la mayoría o todos los azúcares excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina) , en tanto que deja intacto el anticuerpo. La desglicosilación química se describe por Hakimuddin, et al. Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) y por Edge et al. Anal. Biochem., 118: 131 (1981). La escisión enzimática de porciones de carbohidrato en anticuerpos se puede lograr por el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura et al. Meth. Enzymol. 138: 350 (1987). Orto tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende el enlace del anticuerpo a uno de una variedad de polímeros no proteínicos, por ej.emplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioles polioxietilados, sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado, polioxialquilenos, o polímeros polisacáridos tal como dextrano. Estos métodos se conocen en la técnica, ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos números 4,640,835; 4,496,689; 4, 301, 144; 4,670,417; 4,791,192; 4,179,337; 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; 4,609,546 ó EP 315 456.

Terapia Génica La distribución de un anticuerpo terapéutico a células apropiadas se puede efectuar mediante terapia génica ex vivo, in situ, o in vivo por el uso de cualquier planteamiento adecuado conocido en la técnica, incluyendo por uso de métodos de transferencia de ADN físico (por ejemplo, liposomas o tratamientos químicos) o por el uso de vectores virales (por ejemplo, adenovirus, virus adeno-asociado, o un retrovirus) . Por ejemplo, para terapia in vivo, un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo deseado, ya sea solo o en unión con un vector, liposoma, o precipitado se puede inyectar directamente en el sujeto, y en algunas modalidades, se puede inyectar en el sitio donde se desea la expresión del compuesto de anticuerpo. Para tratamiento ex vivo, se remueven las células del sujeto, el ácido nucleico se introduce en estas células, y las células modificadas se regresan al sujeto ya sea directamente o, por ejemplo, se encapsulan con membranas porosas que se implantan en el paciente. Ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos números 4,892,538 y 5,283,187. Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere a células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del hospedador propuesto. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, y precipitación con fosfato de calcio. Un vector comúnmente usado para distribución ex vivo de un ácido nucleico es un retrovirus. Otras técnicas de transferencia de ácidos nucleicos in vivo incluyen transfección con vectores virales (tal como adenovirus, virus de herpes simplex I, o virus adeno-asociados) y sistemas basados en lípidos. El ácido nucleico y el agente de transfección opcionalmente se asocian con una micropartícula. Los agentes de transfección de ejemplo incluyen co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada con DEAE-dextrano, DOTMA anfifilo de amonio cuaternario (bromuro de (dioleoiloxipropil) trimetilamonio, comercializado como Lipofectina por by GIBCO-BRL) ) (Felgner et al, (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417; Malone et al. (1989) Proc. Nati Acad. Sci. USA 86 6077-6081); diésteres de glutamato lipófilos con cabezales de trimetilamonio colgantes (Ito et al. (1990) Biochem. Biophys. Acta 1023, 124-132) ; lípidos de origen metabolizables tal como el lípido catiónico, dioctadecilamido-glicilasparmina (DOGS, Transfectam, Promega) y dipalmitoilfosfatidil-etanolamilesparmina (DPPES) (J. P. Behr (1986) Tetrahedron Lett. 27, 5861-5864; J. P. Behr et al. (1989) Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 86, 6982-6986); sales de amonio cuaternario metabolizables (DOTB, metilsulfato N-(l-[2,3-dioleoiloxi] propil) -N,N,N-trimetilamono (DOTAP) (Boehringer Mannheim) , polietilenimina (PEÍ) , esteres de dioleoilo, ChoTB, ChoSC, DOSC) (Leventis et al. (1990) Biochim. ínter. 22, 235-241); 3beta [N- (N1 , N1 -dimetilaminoetano) -carbamoil] colesterol (DC-Chol) , dioleoilfosfatidil-etanolamina (DOPE) /3beta [N- (N1 ,N' -dimetilaminoetano) -carbamoil] colesterol DC-Chol en una mezcla uno a uno (Gao et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065, 8-14), espermina, espermidina, lipopoliaminas (Behr et al., Bioconjugate Chem, 1994, 5: 382-389), polilisinas - lipófilas (LPLL) (Zhou et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), hidróxido de [[(1,1,3, 3-tetrametilbutil) cre-soxi] etoxi] etilidimetil-bencilamonio (hidróxido de DEBDA) con fosfatidilcolina/colesterol en exceso (Bailas et al., (1988) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) /mezclas de DOPE (Pinnaduwage et al, (1989) Biochim. Biophys. Acta 985, 33-37), diéster lipófilo de ácido glutámico (TMAG) con DOPE, CTAB, DEBDA, bromuro de didodecilamonio (DDAB) , y estearilamina en mezcla con fosfatidiletanolamina (Rose et al., (1991) Biotechnique 10, 520-525), DDAB/DOPE (TransfectACE, GIBCO BRL), y lípidos que tienen oligogalactosa. Los agentes intensificadores de transfección de ejemplo incrementan la eficiencia de la transferencia incluyen, por ejemplo, DEAE-dextrano, polibreno, péptido destructivo de lisosomas (Ohmori N I et al, Biochem Biophys Res Commun Jun. 27, 1997 ; 235 (3) : 726-9) , proteoglicanos basados con condroitano, proteoglicanos sulfatados, polietilenimina, polilisina (Pollard H et al. J Biol Chem, 1998 273 (13) -.7507-11) , péptido de unión a integrina CYGGRGDTP nona sacárido de dextrano lineal, glicerol, grupos colesterilo unidos en el enlace internucleósido 3 '-terminal de un oligonucleótido (Letsinger, R. L. 1989 Proc Nati Acad Sci USA 86: (17):6553-6) , lisofosfátido, lisofosf tidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, y 1-oleoil-lisofosfatidilcolina. En algunas situaciones, puede ser deseable distribuir el ácido nucleico con un agente que dirige el vector que contiene ácido nucleico a células objetivo. Estas moléculas de "selección de objetivo" incluyen anticuerpos específicos para una proteína de membrana de superficie celular en la célula objetivo, o un ligando para un receptor en la célula objetivo. Donde se emplean liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis se pueden usar para selección de objetivo y/o para facilitar la captación. Los ejemplos de estas proteínas incluyen proteínas cápside y fragmentos de las mismas trópicas para un tipo celular particular, anticuerpos para proteínas que sufren internalización en ciclización, y proteínas que tienen como objetivo localización intracelular y mejorar vida media intracelular. En otras modalidades, se puede usar endocitosis mediada por receptor. Estos métodos se describen, por ejemplo, en Wu et al., 1987 o Wagner et al., 1990. Para revisión de la marcación génica actualmente conocida y protocolos de terapia génica, ver Anderson 1992. Ver también WO 93/25673 y referencias citadas en la misma. Para revisiones adicionales de tecnología de terapia génica, ver Friedmann, Science, 244: 1275-1281 (1989); Anderson, Nature, supplement to vol. 392, no 6679, pp. 25-30 (1998); Verma, Scientific American: 68-84 (1990) ; y Miller, Nature, 357: 455460 (1992) .

Métodos de Detección Los productos terapéuticos efectivos dependen de la identificación de agentes eficaces desprovistos de toxicidad significativa. Se pueden detectar anticuerpos para la afinidad de unión por métodos conocidos en la técnica. por ejemplo, métodos de desplazamiento en gel, transferencias Western, ensayo de competición radiomarcado, co-fraccionamiento por cromatografía, ero-precipitación, reticulación, ELISA, y similares se pueden usar, que se describen, por ejemplo en, Molecular Biology (1999) John iley & Sons, NY, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Para detectar inicialmente anticuerpos que se unen al epítope deseado en M-CSF (por ejemplo, aquellos que bloquean la unión de RXl, 5H4 , MCI y/o MC3 a M-CSF), se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988) . También se pueden usar ensayos de unión competitiva de rutina, en los cuales el anticuerpo no conocido se caracteriza por su capacidad para inhibir la unión de M-CSF a un anticuerpo específico de M-CSF de la invención. El M-CSF intacto, fragmentos del mismo, o epítopes lineales tal como se representa por los aminoácidos 98-105 de M-CSF de la Figura 12, o los aminoácidos 65-73 ó 138-144 de la Figura 12 (que corresponden a los epítopes de M-CSF reconocidos por TH4 o MC3) , se pueden usar. Se describe la correlación de epítopes en in Champe et al., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995) . Además se contempla que los anticuerpos se prueban entonces para su efecto en la osteoclastogénesis, seguido por administración a animales. Los compuestos potencialmente útiles en prevenir o tratar pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer se puede detectar usando varios ensayos. Por ejemplo, primero se puede caracterizar un antagonista candidato en un sistema de células cultivadas para determinar su capacidad para neutralizar M-CSF en la inducción de osteoclastogénesis . Este sistema puede incluir el co-cultivo de osteoblastos calvariales de ratón y células de bazo (Suda et al., Modulation of osteoclast differentiation. Endocr. Rev. 13: 66 80, 1992; Martin y Udagawa, Trends Endocrinol. Metab. 9: 6-12, 1998), el co-cultivo de líneas de células estromales de ratón (por ejemplo, MC3T3-G2/PA6 y ST2) y células de bazo de ratón (Udagawa et al., Endocrinology 125: 1805 13, 1989), y el co-cultivo de células ST2 y células de médula ósea, células mononucleares , de sangre periférica o macrófagos alveolares (Udagawa et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 7260 4, 1990; Sasaki et al., Cáncer Res. 58: 462 7, 1998; Mancino et al., J. Surg. Res.100: 18-24, 2001). En la ausencia de cualquier antagonista de M-CSF, las células multinucleadas formadas en estos co-cultivos satisfacen los criterios principales de los osteoclastos tal como actividad de fosfatasa acida resistente a tartrato (TRAP, una enzima marcadora de los osteoclastos) receptores de calcitonina, p60C-STC, receptores de vitronectina, y la capacidad para formar hoyuelos de resorción en hueso y pedazos de dentina. La presencia de un antagonista de M-CSF efectivo inhibe la formación de estas células multinucleadas . Además de los sistemas de co-cultivo anteriores, se puede valorar la capacidad de un anticuerpo de M-CSF candidato en la inhibición de la osteoclastogénesis en un sistema libre de osteoblastos o libre de células estromales. El M-CSF requerido para osteoclastogénesis se puede proporcionar por células de cáncer metastáticas co- cultivadas (por ejemplo, MDA 231) o medio acondicionado de estas células de cáncer (Mancino et al., J. Surg. Res. 0: 18-24, 2001) o por adición de M-CSF purificado. La eficiencia de un anticuerpo de M-CSF dado en la prevención o tratamiento de la pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer también se puede probar en cualquiera de los sistemas de modelo de metástasis de hueso de animal familiares a aquellos expertos en la técnica. Estos sistemas modelo incluyen aquellos que comprenden inyección directa de células tumorales en la cavidad medular de los huesos (Ingall, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 117: 819-22, 1964; Falasko, Clin. Orthop . 169: 20 7, 1982), en la aorta abdominal de rata (Powles et al., Br . J. Cáncer 28: 316 21, 1973) , en la vena de rabo lateral de ratón o en el ventrículo izquierdo de ratón (Auguello et al., Cáncer Res. 48: 6876 81, 1988) . En la ausencia de un antagonista de M-CSF efectivo, las metástasis de hueso osteolíticas formadas de células tumorales inyectadas se puede determinar por radiografías (áreas de lesiones óseas osteolíticas) o histología e inmunohistoquímica (hueso y tejidos blandos) . Sasaki et al., Cáncer Res. 55: 3551 7, 1995; Yoneda et al., J. Clin. Invest. 99: 2509 17, 1997. Clohisy y Ramnaraine, Orthop Res. 16: 660 6, 1998. Yin et al., J. Clin. Invest. 103: 197 206, 1999. En la presencia de un anticuerpo de M-CSF efectivo, se puede prevenir o inhibir la metástasis osteolítica de hueso para dar por resultado metástasis más pequeñas y/o menores. Los anticuerpos de M-CSF de la presente invención también pueden ser útiles en la prevención o tratamiento de metástasis de cáncer. La efectividad de un anticuerpo de M-CSF candidato en la prevención o tratamiento de metástasis de cáncer se puede detectar usando un modelo de invasión de membrana base aniónica humana como se describe en Filderman et al., Cáncer Res 52: 36616, 1992. Además, cualquiera de los sistemas de modelo de animal para metástasis de varios tipos de cáncer también se puede usar. Estos modelos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, aquellos descritos en Wenger et al., Clin. Exp. Metástasis 19: 169 73, 2002; Yi et al., Cáncer Res. 62: 917 23, 2002; Tsutsumi et al., Cáncer Lett 169: 77-85, 2001; Tsingotjidou et al., Anticancer Res. 21: 971 8, 2001; Wakabayashi et al., Oncology 59: 75 80, 2000; Culp y Kogerman, Front Biosci. 3:D67283, 1998; Runge et al., Invest Radiol. 32: 212 7; Shioda et al., J. Surg. Oncol. 64: 122 6, 1997; Ma et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 37: 2293 301, 1996; Kuruppu et al., J Gastroenterol Hepatol . 11: 26 32, 1996. En la presencia de un anticuerpo de M-CSF efectivo, se pueden prevenir o inhibir las metástasis de cáncer para dar por resultado metástasis más pequeñas y/o menores . La actividad anti-tumor de un anticuerpo de M-CSF particular, o combinación de anticuerpos de M-CSF, se puede evaluar in vivo usando un modelo de animal adecuado. Por ejemplo, modelos de cáncer de linfoma xenogénico en donde se introducen células ~de linfoma humanó en animales inmuno-comprometidos, tal como ratones desnudos o SCID. Se puede predecir la eficiencia usando ensayos que miden inhibición de formación tumoral, regresión o metástasis de tumor, y similares . En una variación de un ensayo ín vitro, la invención proporciona un método que comprende los pasos de (a) poner en contacto un M-CSF inmovilizado con un anticuerpo candidato y (b) detectar la unión del anticuerpo candidato al M-CSF. En una modalidad alternativa, el anticuerpo candidato se inmoviliza y se detecta la unión de M-CSF. La inmovilización se logra usando cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo unión covalente a un soporte, una cuenta, o una resina cromatográfica, así como interacción o covalente de alta afinidad tal como, unión a anticuerpo, o el uso de la unión de estreptavidina/biotina en donde el compuesto inmovilizado incluye una porción de biotina. Se puede lograr la detección de unión (i) usando una marca radioactiva en el compuesto que no se inmoviliza, (ii) usando una marca fluorescente en el compuesto no inmovilizado, (iii) usando un anticuerpo inmunoespecífico para el compuesto no inmovilizado, (iv) usando una marca en el compuesto no inmovilizado que excita un soporte fluorescente al cual se une el compuesto inmovilizado, así como otras técnicas bien conocidas y practicadas por rutina en la técnica. Los anticuerpos que modulan (es decir, incrementan, disminuyen, o bloquean) la actividad o expresión de M-CSF se pueden identificar al incubar un modulador putativo con una célula que exprese un M-CSF y al determinar el efecto del modulador putativo en la actividad o expresión de M-CSF. La selectividad de un anticuerpo que modula la actividad de un polipéptido o polinucleótido de M-CSF se puede evaluar al comparar sus efectos en el polipéptido o polinucleótido de M-CSF o su efecto en otros compuestos relacionados. Los moduladores selectivos pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos y otras proteínas, péptidos o moléculas orgánicas que se unen de manera específica a polipéptido de M-CSF o un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de M-CSF. Los moduladores de la actividad de M-CSF serán terapéuticamente útiles en el tratamiento de enfermedades y condiciones fisiológicas en las cuales esté comprendida la actividad normal o anormal del polipéptido de M-CSF. La invención también comprende ensayos de detección de alto rendimiento (HTS) para identificar anticuerpos que interactúan con o inhiben actividad biológica (es decir, inhibe actividad enzimática, actividad de unión, etc.) de un polipéptido de M-CSF. Los ensayos de HTS permiten la detección de grandes números de compuestos de una manera eficiente. Los sistemas de HTS basados en célula se contemplan para investigar la interacción entre los polipéptidos de M-CSF y sus compañeros de unión. Se diseñan ensayos de HTS para identificar "aciertos" o "compuestos guía" que tienen la propiedad deseada, de lo cual se pueden diseñar modificaciones para mejorar la propiedad deseada. La modificación química del "acierto" o "compuesto guía" frecuentemente se basa en una relación de estructura/actividad identificable entre el "acierto" y los polipéptidos de M-CSF. Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para identificar anticuerpos que modulan (es decir, disminuyen) la actividad de un M-CSF que comprende poner en contacto un M-CSF con un anticuerpo, y determinar si el anticuerpo modifica la actividad del M-CSF. La actividad en la presencia del anticuerpo de prueba se compara a la actividad en la ausencia del anticuerpo de prueba. Donde la actividad de la muestra que contiene el anticuerpo de prueba es menor que la actividad en la muestra que carece del anticuerpo de prueba, el anticuerpo tendrá actividad inhibida . Está disponible una variedad de sistemas heterólogos para expresión funcional y polipéptidos recombinantes que son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estos sistemas incluyen bacterias (Strosberg, et al., Trends in Pharmacological Sciences (1992) 13:95-98), levaduras (Pausch, Trends in Biotechnology J1997) 15:487-494) , varias clases de células de insecto (Vanden Broeck, Int. Rev. Cytology (1996) 164:189-268), células de anfibio (Jayawickreme et al., Current Opinión in Biotechnology (1997) 8: 629-634) y varias líneas de células de mamífero (CHO, HEK293, COS, etc.; ver Gerhardt, et al., Eur. J. Pharmacology (1997) 334:1-23). Estos ejemplos no impiden el uso de otros posibles sistemas de expresión celular, incluyendo líneas de células obtenidas de nematodos (publicación PCT WO 98/37177) . En una modalidad de la invención, los métodos de detección de anticuerpos que modulan la actividad de M-CSF comprenden poner en contacto anticuerpos de prueba con un polipéptido de M-CSF y valorar la presencia de un complejo entre el anticuerpo y el M-CSF. En este ensayo, el ligando se marca típicamente. Después de la incubación adecuada, el ligando libre se separa de aquél presente en la forma unida, y la cantidad de marca libre o no vuelta compleja es una medida de la capacidad del anticuerpo particular para unirse al polipéptido de M-CSF o M-CSFR. En otra modalidad de la invención, se emplea detección de alto rendimiento para fragmentos de anticuerpo o CDR que tienen afinidad de unión adecuada a un polipéptido de N-CSF. De forma breve, se sintetizan en un sustrato sólido un gran número de diferentes compuestos de prueba de péptido pequeño. Los anticuerpos de prueba de péptido se ponen en contacto con un polipéptido de M-CSF y se lavan. Los polipéptidos de M-CSF unidos entonces se detectan por métodos bien conocidos en la técnica. Los polipéptidos purificados de la invención también se pueden revestir directamente en las placas para el uso en las técnicas de detección de fármacos mencionados anteriormente. Además, se pueden usar anticuerpos no neutralizantes para capturar la proteína e inmovilizarla en el soporte sólido.

Terapia de Combinación Habiendo identificado más de un anticuerpo de M- CSF que es efectivo en un modelo de animal, puede ser ventajoso además mezclar dos o más de estos anticuerpos de ' M-CSF conjuntamente para proporcionar aún eficiencia mejorada contra metástasis de cáncer y/o pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer. Las composiciones que comprenden uno o más anticuerpos de M-CSF se pueden administrar a personas o mamíferos que sufren de, o están predispuestos a sufrir de, metástasis de cáncer y/o pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer. La administración concurrente de dos agentes terapéuticos no requiere que los agentes se administren al mismo tiempo o por la misma ruta, en tanto que haya un traslape en el periodo de tiempo durante el cual los agentes estén ejerciendo su efecto terapéutico. Se contempla la administración simultánea o secuencial, como es la administración en diferentes días o semanas . Aunque la terapia de anticuerpo de M-CSF se puede usar para todas las etapas de cáncer, la terapia de anticuerpos puede ser particularmente apropiada en cánceres avanzados o matastáticos . Combinando el método de terapia de anticuerpo, puede ser preferido un régimen quimioterapéutico o de radiación en pacientes que no han recibido tratamiento quimioterapéutico, en tanto que el tratamiento con la terapia de anticuerpo se puede indicar para pacientes quienes han recibido una o más quimioterapias. Adicionalmente, la terapia de anticuerpo también puede permitir el uso de dosis reducidas de quimioterapia concomitante, particularmente en pacientes que no toleran bien la toxicidad del agente quimioterapéutico. El método de la invención contempla la administración del anticuerpo anti-M-CSF individuales, así como combinaciones, o "cócteles" de diferentes anticuerpos. Estos cócteles de anticuerpos pueden tener ciertas ventajas en tanto que contengan anticuerpos que saquen- provecho de diferentes mecanismos efectores o combinen directamente los anticuerpos citotóxicos con anticuerpo que dependen de la funcionalidad efectora inmunitaria. Estos anticuerpos en combinación pueden exhibir efectos terapéuticos sinérgicos . La combinación del derivado de RXl o humano Engineered™ del anticuerpo RXl con otros productos terapéuticos puede tener un efecto en un paciente que experimenta enfermedad osteoclástica y/o crecimiento o metástasis de tumor. Por ejemplo, se puede usar el anticuerpo RXl en la. elaboración de un medicamento para tratar un paciente que tiene una enfermedad osteolítica, en donde el medicamento se coordina con tratamiento usando un anticuerpo anti-RANKL, receptor de RANKL soluble, otros inhibidores de RANKL, o bisfosfonatos (por ejemplo Aredia; Zometa,- Clodronato) . De manera alternativa, se puede usar un anticuerpo anti-RANKL o bisfosfonato en la elaboración de un medicamento para tratar un paciente que tiene una enfermedad osteolítica en donde el medicamento coordinado con el tratamiento que usa anticuerpo RXl o derivado manejado humano del anticuerpo RXl . La combinación puede tener también un efecto sinérgico en un paciente tratado. El anticuerpo RXl y otro producto terapéutico no se necesitan administrar de manera simultánea. RXl o variante manejada humana y otro producto terapéutico se pueden administrar con un día, una semana, dos semanas, cuatro semanas, dos meses, tres meses, seis meses, un año o dos años entre sí. La invención también contempla el uso de un anticuerpo RXl o un derivado humano Engineered™ del anticuerpo RXl en la elaboración de un medicamento para tratar un paciente que tiene una enfermedad osteolítica en donde el medicamento se usa en un paciente que sea pretratado con un anticuerpo anti-RANKL o bisfosfonatos. "Pretratamiento" significa que un paciente está tratado en el espacio de dos años, un año, seis meses, tres meses, dos meses, un mes, dos semanas, una semana o al menos un día antes del tratamiento con RXl o variante humana Engineered™ de RXl. El anticuerpo RXl o variantes humanas Engineered™ se pueden usar en combinación con otros productos terapéuticos de cáncer. Por ejemplo, se puede usar el anticuerpo RXl o variantes manejadas humanas en la elaboración de un medicamento para tratar un paciente que tiene enfermedad de cáncer en donde el medicamento se coordina con el tratamiento usando otros agentes terapéuticos y/o procedimientos, que incluyen de manera enunciativa y sin limitación varios agentes quimioterapéuticos, andrógeno-bloqueadores, e inmunomoduladores (por ejemplo IL-2, GM-CSF, SLC) , Bisfosfonato (s) (por ejemplo, Aredia; Zometa; Clodronate) , cirugía, radiación, quimioterapia citotóxica, terapia de hormonas (por ejemplo, Tamoxifeno; terapia anti-Andrógeno) , terapia de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos a neutralización de RANKL/RANK; neutralización de PTHrP, anticuerpos anti-Her2, anti-CD20, anti-CD40, CD22, VEGF, IGFR-1, EphA2, HAAH, TMEFF2 , CAIX) , terapia de proteína terapéutica (por ejemplo, receptor de RANKL soluble; inhibidores OPG, y PDGF y MMP) , terapia de fármacos de molécula pequeña (por ejemplo, inhibidor de Src-cinasa) , inhibidores de cinasa de receptores de factores de crecimiento, o inhibidores de RANKL, terapia de oligonucleótidos (por ejemplo, RANKL o RANK o PTHrP Anti-sentido) , terapia génica (por ejemplo, inhibidores de RANKL o RANK) , terapia peptídica (por ejemplo, muteinas de RANKL) , así como aquellas proteínas, péptidos, compuestos y moléculas pequeñas descritos en la presente. Se puede usar RXl y variantes humanas Engineered™ en la elaboración de un medicamento para tratar pacientes que se han pretratado con los productos terapéuticos mencionados anteriormente . Un agente citotóxico se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o provoca destrucción de las células . El término se propone que incluya isótopos radioactivos (por ejemplo I131, I125, Y90 y Re186) , agentes quimioterapéuticos, y toxinas tal como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, vegetal o animal o toxinas sintéticas, o fragmentos de las mismas . Un agente no citotóxico se refiere a una sustancia que no inhibe ni previene la función de las células y/o no provoca destrucción de las células. Un agente no citotóxico puede incluir un agente que se puede activar para ser citotóxico. Un agente no citotóxico puede incluir una cuenta, liposoma, matriz o partícula (ver, por ejemplo, Publicaciones de patente de los Estados Unidos No. 2003/0028071 y 2003/0032995 que se incorporan en la presente como referencia) . Estos agentes se pueden conjugar, acoplar, enlazar o asociar con un anticuerpo de acuerdo a la invención. Los agentes quimioterapéuticos de cáncer incluyen, sin limitación, agentes de alquilación, tal como carboplatina y cisplatina; agentes de alquilación de mostazas de nitrógeno; agentes de alquilación de nitrosourea, tal como carmustina (BCNU) ; antimetabolitos, tal como metotrexato; ácido folínico, antimetabolitos análogos de purina, mercaptopurina; antimetabolitos análogos de pirimidina, tal como fluorouracilo (5-FU) y gencitabina (Gemzar™) ; antineoplásticos hormonales, tal como goserelina, leuprólido, y tamoxifeno; antineoplásticos naturales, tal como aldesleucina interleucina-2, docetaxel, etopósido (VP- 16) , interferón alfa, paclitaxel (TaxolMR) , y tretinoina (ATRA) ; antineoplásticos naturales antibióticos, tal como bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorrubicina, daunomicina y mitomicinas incluyendo mitomicinas C; y antineoplásticos naturales de alcoiles de vinca por vinca, tal como vinblastina, vincristina, vindesina; hidroxiurea; aceglatona, adriamicina, ifosfamida, enocitabina, pitiostanol, ^aclarrubicina, ancitabina, nimustina, clorhidrato de procarbazina, carboquona, carboplatina, carmofur, cromomicina A3 , polisacáridos antitumor, factores de plaquetas antitumor, ciclofosfamids (Cytoxin™) , Schizophyllan, citarabina (arabinósido de citosina) , dacarbazina, tioinosina, tiotepa, tegafur, dolastatinas, análogos de dolastatinas tal como auristatina, CPT-11 (irinotecano) , mitozantrona, vinorelbina, tenipósido, aminopterina, carminomicina, esperamicinas (Ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,675,187), neocarzinostatin, OK-432, bleomicina, furtulón, broxuridina, busulfano, honvano, peplomicina, bestatina (Ubenimex™) , interferón-ß, mepitíostaño, mitobronitol, melfalano, péptidos de laminina, lentinano, extracto versicolor Corioloso, tegafur/uracilo, estramustina (estrógeno/mecloretamina) . Además, los agentes adicionales usados como terapia para pacientes con cáncer incluyen EPO, G-CSF, ganciclovir; antibióticos, leuprólido; meperidina; zidovudina (AZT); interleucinas 1 hasta 18, incluyendo mutantes y análogos; interferones o citocinas, tal como hormonas de interferones a, ß, y ?, tal como hormona de liberación de hormona luteinizante (LHRH) y análogos y, hormona de liberación de gonadrotopina (GnRH) ; factores de crecimiento, tal como factor-ß de crecimiento de transformación (TGF-ß) , factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) , factor de crecimiento de nervios (NGF) , factor de liberación de hormona de crecimiento (GHRF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor homólogo de factor de crecimiento de fibroblastos (FGFHF) , factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , y factor de crecimiento de insulina (IGF) ; factor-a y ß de necrosis tumoral (TNF-a y ß) ; factor-2 de inhibición de invasión (IIF-2) ; proteínas 1-7 morfogenéticas de hueso (BMP 1-7) ; somatostatina; timosina-a-1; ?-globulina; superóxido-dismutasa (SOD) ; factores de complemento; factores anti-angiogénicos ; materiales antigénicos; y pro-fármacos. El profármaco se refiere a una forma de precursor o derivado de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxico o no citotóxico a células tumorales en comparación al fármaco de origen y es capaz de ser activado o convertido enzimáticamente en una forma activa o más activa de origen. Ver, por ejemplo Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactíons, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs : A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, " Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed. ) , pp. 247-267, Humana Press (1985) . Los profármacos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, profármacos que contiene fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con D-aminoácidos, profármacos glicosilados, profármacos que contienen ß-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que se pueden derivar en una forma de profármacos para el uso en la presente incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente .

Administración y preparación Los anticuerpos anri-M-CSF usados en la práctica de un método de la invención se pueden formular en composiciones farmacéuticas que comprenden un portador adecuado para el método de distribución deseado. Los portadores adecuados incluyen cualquier material que, cuando se combina con anticuerpo anti-M-CSF, retiene la función anti-tumor del anticuerpo y es no reactivo con los sistemas inmunitarios del sujeto. Los ejemplos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, cualquiera de un número de portadores farmacéuticos normales tal como soluciones salinas amortiguadas con fosfato estériles, . agua bacteriostática, y similares. Se pueden usar una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua, agua amortiguada, solución salina al 0.4 %, glicina al 0.3 %, y similares, y pueden incluir otras proteínas para estabilidad mejorada, tal como albúmina, lipoproteína, globulina, etc., sometida a modificaciones químicas moderadas o similares. Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo se preparan para almacenamiento al mezclar el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) ) , en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tal como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tal como cloruro de octadecildimetilbencil- amonio; cloruro de hexamitonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencenonio, fenol, alcohol butílico o bencílico alquil-parabenos tal como metil- o propil-parabeno; catecol resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol) polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tal como albúmina sérica, gelatina, o immunoglobulinas; polímeros hidrófilos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mannosa, o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; azúcares tal como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones formadores de sal tal como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) ; y/o agentes tensioactivos no iónicos tal como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG) . La formulación de la presente también puede contener más de un compuesto activo como es necesario para la indicación particular que se trata, de manera preferente aquellos con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además un agente inmunosupresor. Estas moléculas se presentan de manera adecuada en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito indicado. Los ingredientes activos también se pueden atrapar en microcápsula preparada, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsula de gelatina y microcápsula de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de distribución de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) . Las formulaciones que se deben usar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles. El anticuerpo se administra por cualquier medio adecuado, incluyendo parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, y si se desea para tratamiento local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica o subcutánea. Además, el anticuerpo se administra de manera adecuada por infusión de impulso, particularmente con dosis declinantes del anticuerpo. De manera preferente, la dosificación se da por inyecciones, de manera más preferente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Se contemplan otros métodos de administración, que incluyen administración tópica, particularmente transdérmica, transmucosal , rectal, oral o local, por ejemplo a través de un catéter colocado cerca al sitio deseado. Las composiciones de la presente invención pueden estar en la forma de, por ejemplo, granulos, polvos, tabletas, cápsulas, jarabe, supositorios, inyecciones, emulsiones, elíxires, suspensiones o soluciones. Las presentes composiciones se pueden formular para varias rutas de administración, por ejemplo, por administración oral, por administración nasal, por administración rectal, inyección subcutánea, inyección intravenosa, inyecciones intramusculares o inyección intraperitoneal . Las siguientes formas de dosis se dan a manera de ejemplo y no se deben considerar como limitantes de la presente invención. Para administración oral, bucal y sublingual, los polvos, suspensiones, granulos, tabletas, pildoras, cápsulas, cápsulas de gelatina y cápsulas de núcleo sólido son aceptables como formas de dosis sólidas. Estas se pueden preparar, por ejemplo, al mezclar uno o más compuestos de la presente invención, o sales o tautómeros farmacéuticamente aceptables de los mismos, con al menos un aditivo tal como un almidón u otro aditivo. Los aditivos adecuados son sacarosa, lactosa, azúcar de celulosa, mannitol, maltitol, dextrano, almidón, agar, alginatos, quitinas, quitosanes, pectinas, goma de tragacanto, goma arábiga, gelatinas, colágenos, caseína, albúmina, polímeros sintéticos o semisintéticos o glicéridos. Opcionalmente, las formas de dosis orales pueden contener otros ingredientes para ayudar en la administración, tal como un diluyente inactivo, o lubricantes tal como estearato de magnesio o conservadores tal como parabeno o ácido sórbico o antioxidantes tal como ácido ascórbico, tocoferol o cisteína, un agente desintegrante, aglutinantes, espesantes, amortiguadores, edulcorantes, agentes saborizantes o agentes de perfume. Las tabletas y pildoras se pueden tratar además con materiales de revestimiento adecuados conocidos en la técnica. Las formas de dosis líquidas para administración oral pueden estar ' en la forma de emulsiones farmacéuticamente aceptables, jarabes, elíxires, suspensiones y soluciones, que pueden contener un diluyente inactivo, tal como agua. Las formulaciones farmacéuticas y medicamentos se pueden preparar como suspensiones o soluciones líquidas usando un líquido estéril, tal como de manera enunciativa y sin limitación, un aceite, agua, un alcohol y combinaciones de estos. Los agentes tensioactivos farmacéuticamente adecuados, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, se pueden adicionar para administración oral o parenteral . Como se señala anteriormente, las suspensiones pueden incluir aceites. Este aceite incluye, de manera enunciativa y sin limitación, aceite de cacahuate, aceite de ajonjolí, aceite de algodón, aceite de maíz y aceite de oliva. La preparación de suspensión también puede contener esteres de ácidos grasos tal como oleato de etilo, miristato de isopropilo, glicéridos de ácidos grasos y glicéridos de ácidos grasos acetilados. Las formulaciones de suspensión pueden incluir alcoholes, tal como de manera enunciativa y sin limitación, .etanol, alcohol isopropílico, alcohol hexadecílico, glicerol y propilerglicol. Éteres, tal como de manera enunciativa y sin limitación, poli (etilenglicol) , hidrocarburos de petróleo tal como aceite mineral y petrolato; y agua también se pueden usar en formulaciones de suspensión. Para administración nasal, las formulaciones farmacéuticas y medicamentos pueden ser una aspersión o aerosol que contiene solventes apropiados y opcionalmente otros compuestos tal como de manera enunciativa y sin limitación, estabilizadores, agentes antimicrobianos, antioxidantes, modificadores de pH, agentes tensioactivos, modificadores de biodisponibilidad y combinaciones de estos. Un propulsor para una formulación de aerosol puede incluir aire comprimido, nitrógeno, dióxido de carbono u otro hidrocarburo basado en solvente de bajo punto de ebullición. Las formas de dosis inyectables incluyen en general suspensiones acuosas o suspensiones aceitosas que se pueden preparar usando un agente humectante o dispersante adecuado y un agente de suspensión. Las formas inyectables pueden estar en fase de solución o en la forma de una suspensión, que se prepara con un solvente o diluyente. Los solventes o vehículos aceptables incluyen agua esterilizada, solución de Ringer, o una solución salina acuosa isotónica. De manera alternativa, se pueden emplear aceites estériles como solventes o agentes de suspensión. De manera preferente, el aceite o ácido graso es un volátil incluyendo aceites naturales o sintéticos, ácidos grasos, mono-goma di-o tri-glicéridos . Para inyección, la formulación farmacéutica y/o medicamento puede ser un polvo adecuado para reconstitución con una solución apropiada como se describe anteriormente. Los ejemplos de estos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, polvos liofilizados, secados de forma giratoria o secados por aspersión, polvos amorfos, granulos, precipitados o partículas. Para inyección, las formulaciones pueden contener opcionalmente estabilizadores, modificadores de pH, agentes tensioactivos, modificadores de biodisponibilidad y combinaciones de estos.

Para administración rectal, las formulaciones farmacéuticas y medicamentos pueden estar en la forma de un supositorio, un ungüento, un enema, una tableta o una crema para liberación del compuesto en los intestinos, flexión sigmoide y/o recto. Los supositorios rectales se preparan al mezclar uno o más compuestos de la presente invención, o sales o tautómeros farmacéuticamente aceptables del compuesto, con vehículos aceptables, por ejemplo, manteca de cacao o polietilenglicol, que está presente en una fase sólida a temperaturas normales de almacenamiento, y presente en una fase líquida a aquellas temperaturas adecuadas para liberar un fármaco dentro del cuerpo, tal como en el recto. También se pueden emplear aceites en la preparación de formulaciones del tipo de gelatina blanda y supositorios . Se pueden emplear agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones relacionadas de azúcar, y gliceroles en la preparación de formulaciones de suspensión que pueden contener también agentes de suspensión tal como peptinas, carbómeros, metil-celulosa, hidroxipropil-celulosa o carboximetil-celulosa, así como amortiguadores y conservadores . Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , poliláctidos (patente de los Estados Unidos No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tal como Lupron Depot™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico. En tanto que los polímeros tal como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos más cortos de tiempo. Cuando los anticuerpos encapsulados se mantienen en el cuerpo durante un periodo más prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a humedad a 37 °C, dando por resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Las estrategias racionales se pueden contemplar para estabilización dependiendo del mecanismo comprendido. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es una formación de enlace S- -S intermolecular a través del intercambio de tio-disulfuro, se puede lograr la estabilización al modificar residuos de sulfhidrilo, liofilizando de. soluciones acidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones específicas de matriz polimérica. Las formulaciones de la invención se pueden diseñar para acción corta, liberación rápida, acción larga, o liberación sostenida como se describe en la presente. De esta manera, las formulaciones farmacéuticas también se pueden usar para liberación controlada o para liberación lenta. Las presentes composiciones también pueden comprender, por ejemplo, micelas o liposomas, o alguna otra forma encapsulada, o se pueden administrar en una forma de liberación no extendida para proporcionar un efecto de distribución y/o almacenamiento prolongado. Por lo tanto, las formulaciones farmacéuticas y medicamentos se pueden comprimir en granulos o cilindros e implantar intramuscularmente de forma subcutánea como inyecciones de depósito o como implantes tal como endoprótesis . Estos implantes pueden emplear materiales inertes conocidos tal como siliconas y polímeros biodegradables. Además de aquellas formas de dosis representativas descritas anteriormente, los excipientes y portadores farmacéuticamente aceptables se conocen en general por aquellos expertos en la técnica y de esta manera se incluyen en la presente invención. Estos excipientes y portadores se describe, por ejemplo en "Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991), que se incorpora en la presente como referencia. Se pueden ajustar dosis específicas dependiendo de las condiciones de la enfermedad, la edad, peso corporal, condiciones generales de salud, sexo, y dieta del sujeto, intervalos de dosis, rutas de administración, velocidad -de excreción y combinaciones de fármacos . Cualquiera de las formas de dosis anteriores que contengan cantidades efectivas está bien dentro de los límites de la experimentación de rutina y por lo tanto, está bien dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos de M-CSF útiles como productos terapéuticos para metástasis de cáncer o pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer frecuentemente se prepararán de manera suficientemente libres de otras inmunoglobulinas que se presentan de forma natural u otras moléculas biológicas. Los anticuerpos de M-CSF preferidos también exhibirán toxicidad mínima cuando se administren a un mamífero afligido con, o predispuesto a sufrir de, metástasis de cáncer y/o pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer. Las composiciones de la invención se pueden esterilizar por técnicas de esterilización, convencionales, bien conocidas . Las soluciones resultantes se pueden envasar para el uso -o filtrar bajo condiciones asépticas y liofilizar, la preparación liofilizada que se combina con una solución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como se requiere para aproximar las condiciones fisiológicas, tal como agentes amortiguadores y de ajuste de pH, agentes de ajuste de tonicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio y estabilizadores (por ejemplo, maltosa al 120 %, etc) . Los anticuerpos de M-CSF de la presente invención también se pueden administrar mediante liposomas, que son vesículas pequeñas compuestas de varios tipos de lípidos y/o fosfolípidos y/o agente tensioactivo que son útiles para la distribución de un fármaco (tal como los anticuerpos descritos en la presente y opcionalmente un agente quimioterapéutico) . Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas/ monocapas insolubles, dispersiones de fosfolípidos, capas lamelares y similares, y pueden servir como vehículos para dirigir los anticuerpos de M-CSF a un tejido particular así como para incrementar la vida media de la composición. Una variedad de métodos están disponibles para preparar liposomas, como se describe, por ejemplo en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,837,028 y 5,019,369, patentes que se incorporan en la presente como referencia. Se preparan liposomas que contienen el anticuerpo por métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980); y patentes de los Estados Unidos Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con tiempo de circulación mejorados se describen en la patente de los Estados Unidos No. 5,013,556. Los liposomas particularmente útiles se pueden generar por el método de evaporación de fase invertida con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar a los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuro. Opcionalmente está contenido un agente quimioterapéutico (tal como Doxorrubicina) dentro del liposoma ver, por ejemplo., Gabizon et al., J. National Cáncer Inst. 81(19): 1484 (1989)] . La concentración del anticuerpo de M-CSF en estas composiciones puede variar ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente 10 %, usualmente al menos aproximadamente 25 % a tanto como 75 % o 90 % en peso y se seleccionará principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Los métodos reales para preparar composiciones oral, tópica o parenteralmente administrables serán conocidos o evidentes para aquellos expertos en la técnica y se describen, en detalle por ejemplo en, Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed. , Mack Publishing Co., Easton, PA (1995), que se incorpora en la presente como referencia. - La determinación de una cantidad efectiva de una composición de la invención para tratar metástasis de cáncer y/o pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer en un paciente se puede lograr a través de métodos empíricos normales que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la actividad de neutralización in vivo de los sueros de un sujeto tratado con una dosis dada de anticuerpo de M-CSF se puede evaluar usando un ensayo que determina la capacidad de los sueros para bloquear proliferación inducida por M-CSF y supervivencia de monocitos murinos (célula CDllb+, un subconjunto de células CD11, que expresan altos niveles del receptor a M-CSF) in vitro como se describe en Cenci et al., Clin. Invest. 1055: 1279-87, 2000.

Las composiciones de la invención se administran a un mamífero que ya sufre de, o está predispuesto a, metástasis de cáncer y/o pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer en una cantidad suficiente para prevenir o detener al menos parcialmente el desarrollo de metástasis de cáncer y/o pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "dosis terapéuticamente efectiva" . Las cantidades efectivas de un anticuerpo de M-CSF variarán y dependen de la severidad de la enfermedad y el peso y estado general del paciente que se trate, pero en general varían desde aproximadamente 1.0 µg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 10 µg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, con dosis desde aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg por aplicación que es más comúnmente usado. Por ejemplo, aproximadamente 10 µg/kg a 5 mg/kg o aproximadamente 30 µg/kg a 1 mg/kg de anticuerpo es una dosis candidata inicial para administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. La administración es diaria, o en días alternativos, de manera semanal o menos frecuentemente, como sea necesario dependiendo de la respuesta a la enfermedad y la tolerancia del paciente a la terapia. Las dosis de mantenimiento durante un periodo más prolongado de tiempo tal como 4, 5, 6, 7, 8, 10 o 12 semanas o más tiempo se pueden necesitar hasta que se presente una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad, y las dosis se pueden ajustar como sea necesario. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente por técnicas y ensayos convencionales . Las administraciones individuales o múltiples de las composiciones se pueden llevar a cabo con- los niveles de dosis y el patrón que se selecciona por el facultativo que trata. Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada del anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, como se define anteriormente, la severidad y transcurso de la enfermedad, ya sea que el anticuerpo se administre para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia anterior, historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, y discreción del facult tivo que atiende . El anticuerpo se administra de manera adecuada al paciente de una vez o una serie de tratamientos . En cualquier caso, las formulaciones deben proporcionar una cantidad de anticuerpo de M-CSF durante el tiempo que sea suficiente para prevenir o reducir al mínimo de manera efectiva la severidad de la metástasis de cáncer y/o pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer. Las composiciones de la presente invención se pueden administrar solas o como una terapia adjunta en unión con otros productos terapéuticos conocidos en una técnica para el tratamiento de metástasis de cáncer y/o pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer. La composición de anticuerpo se formulará, dosificará y administrará de una manera consistente con buena práctica médica. Los factores para consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular que se trata, la condición clínica del paciente individual, al causa del trastorno, el sitio de distribución del agente, el método de administración, la programación de administración, y otros factores conocidos a los practicantes médicos . La cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto que se va a administrar se gobernará por estas consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar, o tratar le enfermedad mediada por M-CSF, condición o trastorno, particularmente para tratar células de cáncer, y más particularmente para tratar metástasis de células tumorales. Esta cantidad está de manera preferente por abajo de la cantidad que es tóxica al hospedador o vuelve al hospedador significativamente más susceptible a las infecciones. El anticuerpo no necesita ser, pero opcionalmente se formula con, uno o más agentes actualmente usados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. Por ejemplo, en cáncer, el anticuerpo se puede dar en unión con agente quimioterapéutico o un ADEPT como se describe anteriormente . La cantidad efectiva de estos otros agentes depende de la cantidad del anticuerpo presente en la formulación, el tipo de enfermedad, condición o trastorno o tratamiento, y otros factores analizados anteriormente. En general estos se usan en las mimas dosis y con rutas de administración como se usa anteriormente en la presente o aproximadamente de 1 a 99 % de las dosis empleadas hasta la fecha. En otra modalidad de la invención, se proporciona un artículo para elaboración que contiene materiales útiles para el tratamiento de las enfermedades, trastornos o condiciones descritas anteriormente, que incluye tratamiento de cáncer. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta. Los recipientes adecuados incluye, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas y tubos de prueba. Los recipientes de pueden formar de una variedad de materiales tal como vidrio o plástico. El recipiente mantiene una composición que es efectiva para retener la condición y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . El agente activo en la composición es el anticuerpo de la invención. La marca en, o asociada con, el recipiente indica que la composición se usa para tratar la condición de elección. El artículo de fabricación o manufactura puede comprender además un segundo recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer, y solución de dextrosa. Además, puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y piezas de inserción de empaque con instrucciones para el uso.

Inmunoterapia Los anticuerpos anti-M-CSF útiles en el tratamiento de pacientes que tiene cánceres incluyen aquellos que son capaces de iniciar una potente respuesta inmunitaria contra el tumor y aquellos que son capaces de citotoxicidad directa. A este respecto, los anticuerpos anti-M-CSF pueden producir lisis de células tumorales ya sea por mecanismos de citotoxicidad dependiente de anticuerpo o mediada por complemento (ADCC) , ambos de los cuales requieren una porción Fc intacta de la molécula de inmunoglobulina para interacción con los sitios del receptor de Fc de células efectoras o proteínas de complemento. Además, los anticuerpos anti-M-CSF que ejercen un efecto biológico directo en el crecimiento tumoral son útiles en la práctica de la invención. Los mecanismos potenciales por los cuales estos anticuerpos directamente citotóxicos pueden actuar incluyen inhibición del crecimiento celular, modulación de la diferenciación celular, modulación de los perfiles del factor de angiogénesis de tumor, y la inducción de apóptosis. El mecanismo por el cual un anticuerpo anti-M- CSF particular ejerce un efecto anti-tumor se puede evaluar usando cualquiera de varios ensayos in vitro diseñados para determinar ADCC, ADMMC, lisis celular mediada por complemento, y así sucesivamente, como se conoce en general en la técnica. En una modalidad, se lleva a cabo la inmunoterapia usando anticuerpos que tienen una mayor afinidad para la forma unida a membrana de M-CSF (M-CSFa) que las formas segregadas de M-CSF. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos que se unen de manera específica en o alrededor del sitio de escisión de M-CSFa o a la porción de M-CSFa adyacente a la membrana. Estos anticuerpos pueden inhibir de forma benéfica la escisión y liberación de la porción activa soluble de M-CSFa. Los anticuerpos anti-M-CSF se pueden administrar en su forma "desnuda" o no conjugada, o pueden tener agentes terapéuticos conjugados a los mismos. En una modalidad, se usan anticuerpos anti-M-CSF como un radiosensibilizador . En estas modalidades, los anticuerpos anti-M-CSF se conjugan a un agente de radiosensibilización. El término "radiosensibilizador", como se usa en la presente, se define como una molécula, de manera preferente una molécula de bajo peso molecular, administrada a animales en cantidades terapéuticamente efectivas para incrementar la sensibilidad de las células para ser radiosensibilizadas a radiación electromagnética y/o para promover el tratamiento de enfermedades que son tratables con radiación electromagnética. Las enfermedades que son tratables con radiación electromagnética incluyen enfermedades neoplásticas, tumores benignos y malignos, y células cancerosas . Los términos "radiación electromagnética" y "radiación" como se usa en la presente incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, radiación que tiene la longitud de onda de 10"20 a 100 metros. Las modalidades preferidas de la presente invención emplean radiación electromagnética de: gamma-radiación, (1020 a 10"13 m) , radiación de rayos X (10"12 a 10"9 m) , luz ultravioleta (10 nm a 400 nm) , luz visible (400 nm a 700 nm) , radiación infrarroja (700 nm a 1.0 mm) , y radiación de microondas (1 mm a 30 cm) . Se conoce que los radiosensibilizadores incrementan la sensibilidad de células cancerosas a los efectos tóxicos de radiación electromagnética. Muchos protocolos de tratamiento de cáncer emplean actualmente radiosensibilizadores activados por la radiación electromagnética de rayos X. Los ejemplos de radiosensibilizadores activados por rayo X incluyen, de manera enunciativa y sin limitación. Lo siguiente: metronidazol, misonidazol, desmetilmisonidazol, pimonidazol, etanidazol, nimorazol, mitomicina C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, nicotinamida, 5-bromodesoxiuridina (BUdR) , 5-yododesoxiuridina (IUdR) , bromodesoxicitidina, fluorodesoxiuridina (FUdR) , hidroxiurea, cisplatina, y análogos terapéuticamente efectivos y derivados de los mismos . La terapia fotodinámica (PDT) de cánceres emplea luz visible como el activador de radiación del agente de sensibilización. Los ejemplos de radiosensibilizadores fotodinámicos incluyen los siguientes, de manera enunciativa y sin limitación: derivados de hematoporfirina, Fotofrina (r) , derivados de benzoporfirina, NPe6, etioporfirina de estaño (SnET2) , feoborbido-a, bacterioclorófil-a, naftalocianinas, ftalocianinas, ftalocianina de zinc, y análogos terapéuticamente efectivos y derivados de los mismos . En otra modalidad, el anticuerpo se puede conjugar a un receptor (tal como estreptavidina) para utilización en pre-selección como objetivo de tumor en donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por remoción de conjugado no unido de la circulación usando un agente de depuración y luego administración de un ligando (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionúclido) . La presente invención proporciona además los anticuerpos descritos anteriormente en forma detectablemente marcada. Los anticuerpos se pueden marcar de manera detectable a través del uso de radioisótopos, marcas de afinidad (tal como biotina, avidina, etc.), marcas enzimáticas (tal como peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, etc.), marcas fluorescentes o luminiscentes o bioluminiscentes (tal como FITC o rodamina, etc.), átomos paramagnéticos y similares . Los procedimientos para lograr esta marcación son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, ver (Sternberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer, E.A. et al., Meth. Enzym. 62:308 (1979); Engval, E. et al., Immunol . 109:129 (1972); Goding, J.W. J. Immunol . Meth. 13:215 (1976)). "Marca" se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directamente o indirectamente al anticuerpo. La marca se puede detectar por si misma (por ejemplo, marcas de radioisótopos y o marcas fluorescentes) o en el caso de una marca enzimática, puede catalizar alteración química de un compuesto de sustrato o composición que es detectable. De manera alternativa, la marca no puede ser detectable en si misma sino puede ser un elemento que se une por otro agente que es detectable (por ejemplo, una marca de epítope o uno de un par de compañeros de unión tal como biotina-avidina, etc.). De esta manera, el anticuerpo puede comprender una marca o etiqueta que facilita su aislamiento, y los métodos de la invención para identificar anticuerpos incluyen un paso de aislar el M-CSF/anticuerpo a través de la interacción con la etiqueta o marca. Los inmunoco jugados terapéuticos de ejemplo comprenden el anticuerpo descrito en la presente, conjugado a un agente citotóxíco tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fungal, vegetal o animal, o fragmentos de la misma) , o un isótopo radiactivo (por ejemplo, un radioconjugado) . Se describen proteínas de fusión en detalle adicional más adelante . La producción de inmunoconjugados se describe en la patente de los Estados Unidos No. 6,306,393. Se pueden preparar inmunoconjugados por conjugación indirecta de un agente terapéutico aun componente de anticuerpo. Las técnicas generales se describen en Shih et al., Int. J. Cáncer 41:832-839 (1988); Shih et al., Int. J. Cáncer 46:1101-1106 (1990); y Shih et al., patente de los Estados Unidos No. 5,057,313. El método general comprende hacer reaccionar un componente de anticuerpo que tiene una porción de carbohidrato oxidada con un polímero portador que tiene al menos una función amina libre y se carga con una pluralidad de fármacos, toxinas, queladores, adicionadores de boro, u otro agente terapéutico. Esta reacción da por resultado un enlace de base Schiff inicial (imina) , que se puede estabilizar por reducción a una amina secundaria para formar el conjugado final. El polímero portador es de manera preferente un aminodextrano o polipéptido de al menos 50 residuos de aminoácido, aunque también se pueden, usar otros portadores de polímero sustancialmente equivalente. De manera preferente. El inmunoconjugado final es soluble en una solución acuosa, tal como suero de mamífero, para facilidad de administración y selección de objetivo efectiva para el uso en terapia. De esta manera, las funciones de solubilización en el polímero portador mejorarán la solubilidad en suero del inmunoconjugado final. En particular, se preferirá un aminodextrano. El proceso para preparar un inmunoconjugado con un portador de aminodextrano empieza típicamente con un polímero de dextrano, de manera ventajosa un dextrano de peso molecular promedio de aproximadamente 10,000-100,000. El dextrano se hace reaccionar con un agente oxidante para afectar una oxidación controlada de una porción de sus anillos de carbohidrato para generar grupos aldehido. La oxidación se efectúa de manera conveniente con reactivos químicos glicolíticos tal como NaI04, de acuerdo a procedimientos convencionales . El dextrano oxidado entonces se hace reaccionar con unas poliamina, de manera preferente una diamina, de manera más preferente, una mono- o polihidroxi-diamina. Las aminas adecuadas incluyen etilen-diamina, propilen-diamina, o polimetilen-diamina similares, dietilen-triamina o poliaminas similares, 1, 3-diamino-2-hidroxipropano, o diaminas o poliaminas hidroxiladas y similares. Se usa un exceso de la amina con relación a los grupos aldehido del dextrano para asegurar conversión sustancialmente completa de las funciones aldehido a los grupos base de Schiff. Un agente reductor, tal como NaBH4, NaBH3CN o similar, se usa para efectuar estabilización reductiva del compuesto intermedio de base de Schiff resultante. El aducto resultante se puede purificar por paso a través de una columna de de dimensionamiento convencional para remover los dextranos reticulados . También se pueden usar otros métodos convencionales de derivatización de un dextrano para inducir funciones de amina, por ejemplo, reacción con bromuro de cianógeno, seguido por reacción con una diamina. El aminodextrano entonces se hace reaccionar con un derivado del fármaco particular, toxina, quelador, inmunomodulador, adicionador de boro u otro agente terapéutico que se va a cargar, en una forma activada, de manera preferente, un derivado activado con carboxilo, preparados por medios convencionales, por ejemplo, usando diciclohexilcarbodiimida (DCC) o una variante soluble en agua del mismo, para formar un aducto intermedio. De manera alternativa, las toxinas de polipéptido tal como proteína antiviral de hierva carmesí o cadena A de ricino y similares se pueden acoplar a aminodextrano por condensación de glutaraldehído o por reacción de grupos carboxilo activados en la proteína con aminas en el amino dextrano . Los queladores para radiometales o mejoradores de resonancia magnética son bien conocidos en la técnica. Típicos son derivados de ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) y ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA) . Estos queladores tienen típicamente grupos en la cadena lateral por los cuales se puede unir el quelador a un portador.

Estos grupos incluyen, por ejemplo, bencilisotiocianato, por el cual el DTPA o EDTA se puede acoplar al grupo amina de un portador. De manera alternativa, se pueden acoplar grupos carboxilo o grupos amina en un quelador a un portador por activación o derivatización anterior y luego acoplamiento, todo por medios bien conocidos . Los adicionadores de boro, tal como carbúranos, se pueden unir a los componentes de anticuerpo por métodos convencionales. Por ejemplo, se pueden preparar carbúranos con funciones carboxilo en cadenas laterales colgantes, como es bien conocido en la técnica. La unión de estos carbúranos a un portador, por ejemplo, aminodextrano, se puede lograr por activación de los grupos carboxilo de los carbúranos y condensación con aminas en el portador para producir un conjugado intermedio. Estos conjugados intermedios entonces se unen a los componentes de anticuerpo para producir inmunoconjugados terapéuticamente útiles, como se describe más adelante . Se puede usar un potador de polipéptido en lugar de aminodextrano, pero el portador de polipéptido debe tener al menos 50 residuos de aminoácido en la cadena, de manera preferente 100-5000 residuos de aminoácido. Al menos algunos de los aminoácidos deben ser residuos de lisina o residuos de glutamato o aspartato . Las aminas colgantes de los residuos de lisina y carboxilatos colgantes de glutamina y aspartato son convenientes para la unión de un fármaco, toxina, inmunomodulador, quelador, adicionador de boro u otro agente terapéutico. Los ejemplos de portadores polipeptídicos adecuados incluyen polilisina, ácido poliglutámico, ácido poliaspártico, copolímeros de los mismos y polímeros mezclados de estos aminoácidos y otros, por ejemplo, serinas, para conferir propiedades deseables de solubilidad en el portador cargado resultante y en el inmunoconjugado . La conjugación del conjugado intermedio con el componente de anticuerpos se efectúa al oxidar la porción de carbohidrato del componente de anticuerpo y al hacer reaccionar los carbonilos de aldehido (y cetona) resultantes con grupos amina que permanecen en el portador después de la carga con un fármaco, toxina, quelador, inmunomodulador, adicionador de boro u otro agente terapéutico . De manera alternativa, se puede unir un conjugado intermedio a un componente de anticuerpo oxidado mediante grupos amina que se han introducido en el conjugado intermedio después de cargar con el agente terapéutico. Se efectúa de manera conveniente la oxidación ya sea de manera química, por ejemplo, con NaI04, u otro reactivo glicolítico, o enzimáticamente, por ejemplo, con neuraminidasa y galactosa-oxidasa. En el caso de un portador de aminodextrano, no todas las aminas del aminodextrano se usan típicamente para cargar un agente terapéutico. Las aminas restantes del aminodextrano se condensan con el componente oxidado de anticuerpo para formar aductos de base Schiff, que entonces se estabilizan de forma reductiva, normalmente con un reactivo reductor de borohidruro. Se usan procedimientos análogos para producir otros inmunoconjugados de acuerdo a la invención. Los portadores de polipéptidos cargados tienen de manera preferente residuos libres de lisina que permanecen para condensación con la porción de carbohidrato oxidada de un componente de anticuerpo . Los carboxilos en el portador de polipéptido se pueden convertir, si es necesario, a aminas por ejemplo por activación con DCC y reacción con un exceso de una diamina. El inmunoconjugado final se purifica usando técnicas convencionales, tal como cromatografía de dimensionamiento en Sephacryl S-300 o cromatografía de afinidad usando uno o más epítopes de CD84Hy. De manera alternativa, se pueden preparar inmunoconjugados al conjugar directamente un componente de anticuerpo con un agente terapéutico. El procedimiento general es análogo al método indirecto de conjugación excepto que un a través de se une directamente a un componente de anticuerpo oxidado. Se apreciará que se pueden sustituir otros agentes terapéuticos por los queladores descritos en la presente. Aquellos expertos en la técnica serán capaces de contemplar esquemas de conjugación sin experimentación indebida. Como una ilustración adicional, se puede unir un agente terapéutico a la porción de charnela de un componente de anticuerpo reducido mediante formación de enlaces de disulfuro. Por ejemplo, los péptidos del toxoide de tétano se pueden construir con un residuo de cisteína individual que se usa para unir el péptido a un componente de anticuerpo. Como una alternativa, estos péptidos se pueden unir al componente de anticuerpo usando un reticulador heterobifuncional, tal como N-succinil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) . Yu et al., Int. J. Cáncer 56:244 (1994). Las técnicas generales para esta conjugación son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Wong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Birch et al., (eds.), págs. 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", in Monoclonal Antibodies: Production, Eninerring and Clinical Application, Riter et al. (eds.), págs 60-84 (Cambridge University Press 1995) . Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se hacen usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tal como N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como adipimidato de dimetilo HCL) , esteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tal como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tal como bis- (p-diazoniumbenzoil) -etilenediamina) , diisocianatos (tal como 2, 6-diisocianato de tolieno), y compuestos de flúor bis-activos (tal como 1, 5-difluoro-2,4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricino como se describe en Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietileno-triaminapentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quemador de ejemplo para conjugación de radionúclido al anticuerpo (ver, por ejemplo, WO 94/11026) . Como se describe anteriormente, las porciones de carbohidrato en la región de Fc de un anticuerpo se pueden usar para conjugar un agente terapéutico. Sin embargo, la región Fc puede estar ausente si se usa un fragmento de anticuerpo como el componente de anticuerpo del inmunoconjugado. Sin embargo, es posible introducir una porción de carbohidrato en la región variable de cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Ver, por ejemplo Leung et al., J. Immunol . 154:5919 (1995); Hansen et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,443,953. La porción de carbohidrato manejada entonces se usa para unir un agente terapéutico. Además, aquellos expertos en la técnica reconocerán numerosas variaciones posibles de los métodos de conjugación. Por ejemplo, la porción de carbohidrato se puede usar para unir polietilenglicol a fin de extender la vida media de un anticuerpo intacto, o fragmento de unión a antígeno del mismo, en sangre, linfas, u otros fluidos extracelulares. Además, es posible ' construir un "inmunoconjugado divalente" al unir agentes terapéuticos a una porción de carbohidrato y a un grupo sulfhidrilo libre. Este grupo sulfhidrilo libre se puede localizar en la porción de charnela del componente de anticuerpo.

Proteínas de fusión de anticuerpo anti-M-CSF La presente invención contempla el uso de proteínas de fusión que comprenden una o más porciones de anticuerpo anti-M-CSF y un inmunomodulador o porción de toxina. Los métodos para elaborar proteínas de fusión de anticuerpo son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 6,306,393. Las proteínas de fusión de anticuerpo que comprenden una porción de interleucina-2 se describen por Boleti et al., Ann. Oncol. 6:945 (1995), Nicolet et al., Cáncer Gene Ther. 2:161 (1995), Becker et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93:7826 (1996), Hank et al., Clin. Cáncer Res. 2:1951 (1996), y Hu et al., Cáncer Res. 56:4998 (1996). Además, Yang et al., Hum. Antibodies Hybridomas 6:129 (1995), describen una proteína de fusión que incluye un fragmento F(ab')2 y una porción de factor alfa de necrosis tumoral.

Los métodos para elaborar proteínas de fusión de anticuerpo-toxina en las cuales una molécula recombinante comprende uno o más componentes de anticuerpo y una toxina o agente quimioterapéutico también se conocen por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las proteínas de fusión de anticuerpo-exotoxina A de Pseudomonas se han descrito por Chaudhary et al., Nature 339:394 (1989), Brinkmann et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 88:86161 (1991), Batra et al., Proc. Nat'l. acad. Sci. EUDA 89:5867 (1992 ) , Friedman et al., J. Immunol. 150:3054 (1993), Wels et al., Int. J. Can. 60:137 (1995), Fominaya et al., J. Biol. Chem. 271:10560 (1996), Kuan et al., Biochemistry 35:2872 (1996), y Schmidt et al., Int. J. Can. 65:538 (1996). Las proteínas de fusión de anticuerpo-toxina que contienen una porción de toxina de difteria se han descrito por Kreitman et al., Leucemia 7:553 (1993), Nicholls et al., J. Biol. Chem. 268:5302 (1993), Thompson et al., J. Biol. Chem. 270:28037 (1995), y Vallera et al., Blood 88:2342 (1996). Deonarain et al., Tumor Targeting 1:177 (1995), han descrito una proteína de fusión de anticuerpo-toxina que tiene una porción de RNasa, en tanto que Linardou et al., Cell Biophys. 24-25:243 (1994), produjeron una proteína de fusión de anticuerpo-toxina que comprende un componente de DNasa I . Se usó gelonina como la porción de toxina en la proteína de fusión de anticuerpo-toxina de Wang et al., Abstracts of the 209th ACS National Meeting, Anaheim, Calif., Apr. 26-6, 1995, Part 1, BIOT005. Como un ejemplo adicional Dohlsten Et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 91:8945 (1994), reportaron una proteína de fusión de anticuerpo-toxina que comprende la enterotoxina A de Staphylococcal . Ilustrativo de toxinas que se emplean de manera adecuada en la preparación de estos conjugados son ricino, abrina, ribonucleasa, DNasa I, enterotoxina A de Staphylococcal, proteína antiviral de hierba carmesí, gelonina, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas y endotoxina de Pseudomonas. Por ejemplo, Pastan et al., Cell 47:641 (1986), y Goldenberg, CA—A Cáncer Journal for Clinicians 44:43 (1994). Se conocen otras toxinas adecuadas por anticuerpo. Los anticuerpos de la presente invención también se pueden usar en ADEPT al conjugar el antígeno a una enzima de activación de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo, ver WO 81/01145) a un fármaco activo anti-cáncer, ver, por ejemplo, WO88/07378, Patente de los Estados Unidos No. 4,975,278. El componente de enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en un profármaco de una manera tal para convertirlo en su forma citotóxica más activa. Las enzimas que son útiles en el método de esta invención, de manera enunciativa y sin limitación, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina-desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anti-cáncer, 5-fluorouracilo; proteasas, tal como serratia-proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tal como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácidos ; enzimas de escisión de carbohidratos tal como ß-galactosidasa y neuramidinidasa útil para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; ß-lactamasa útil para convertir fármacos derivatizados con ß-lactamas en fármacos libres; y penicilina-amidasas, tal como penicilina V-amidasa o penicilina G-amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. De manera alternativa, anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como abzymas, se pueden usar para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (ver, por ejemplo, Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Se pueden preparar conjugados de anticuerpo-abzyma como se describe en la presente para la distribución de la abzyma a una población de células tumorales . Las enzimas de esta invención se pueden unir de manera covalente a los anticuerpos por técnicas bien conocidas en la técnica tal como el uso de los reactivos de reticulación heterobifuncionales analizados anteriormente. De manera alternativa, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención enlazada a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención se pueden construir usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)).

Usos no terapéuticos Los anticuerpos de la invención se pueden usar como agentes de purificación de afinidad para M-CSF o ensayos d diagnostico para proteínas de M-CSF, por ejemplo, detectando su expresión en células específicas, tejidos específicos o suero. Los anticuerpos también se pueden usar para ensayos de diagnóstico in vivo. En general, para estos propósitos, el anticuerpo se marca como un radionúclido (tal como 110In, 9STc, 14C, 131I, 12SI, 3H, 32P o 3SS) de modo que el tumor se pueda localizar usando inmunoescintiografía.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden emplear en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos de intercalación directa o indirecta, tal como ELISA, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987) . Los anticuerpos también se pueden usar para inmunoistoquímica, para marcar muestras de tumor usando métodos conocidos en la técnica. Como materia de conveniencia, el anticuerpo de la presente invención se puede proporcionar en un equipo, es decir, una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Donde el anticuerpo se marca con una enzima, el equipo incluirá substratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de substrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable. Además, se pueden incluir otros aditivos tal como estabilizadores, amortiguadores (por ejemplo, un amortiguador de bloqueo o amortiguador de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los varios reactivos se pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimizan de manera sustancial la sensibilidad del ensayo. De manera particular, se pueden proporcionar los reactivos como polvos secos, usualmente liofilizados, que incluyen excipientes que en disolución proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada. La invención se ilustra por los siguientes ejemplos, que no se propone que sean limitantes de ningún modo.

Ej emplos Ejemplo 1 Este ejemplo muestra que los anticuerpos RXl y 5A1 de M-CSF son específicos de la especia que los anticuerpos RXl, MCI y MC3 neutralizan la actividad de M-CSF humano. El RXl es un anticuerpo comercialmente vendido que estuvo disponible más de un año antes de la fecha de presentación de esta solicitud. Las fuentes comerciales de ejemplo incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, los clones 116, 692 y 21 (Anogen) ; de anticuerpo monoclonal anti-M-CSF humano de ratón; los clones 21113.131, 26730 y 26786 (R & D Systems, Inc.); de anticuerpo anti-M-CSF humano; y el clon M16 (Antigenix America, Inc.) de anticuerpo anti-M-CSF humano . Para probar la actividad de neutralizantes de RXl y 5A1, se usó un ensayo de proliferación de la línea de células M-NFS-60 (American Type Culture Collection Accession No. CRL-1838, disponible de ATCC en Rockville, MD, EUA, derivado de una leucemia mielógena inducida con retrovirus ecotrópico de ratón silvestre Cas-Br-MuLV, sensible tanto a interleucina 3 como a M-CSF y que contiene u proto-oncogen c-myb truncado provocado por la integración de un retrovirus) . La proliferación de M-NFS-60 requiere M-CSF activo de una manera dependiente de la dosis. En el ensayo, se lavaron células M-NFS60 y se colocaron en placa y en medio RPMl 1640 con FBS al 10 % y 3000 U/ml de M-CSF y 1 % de Pen/Step. El M-CSF humano recombinante (a una concentración final de 10 ng/ml) , específico de humano o murino, se incubó con varias concentraciones de anticuerpos durante 1 hora - a 37°C en C02 al 5 % en una incubadora . Después de la incubación, la mezcla se adicionó al cultivo de M-NFS60 en placas de microtítulo de 96 cavidades. El volumen total de ensayo por cavidad fue de 100 µl , con 10 ng/ml de M-CSF, y la concentración de anticuerpo indicada en la Figura 5. Las células se incubaron a 37°C bajo C02 al 5 % durante 72 horas antes de que se cuantificaran los números celulares por el ensayo CellTiter Glo (Promega) . El ensayo mencionado anteriormente se repitió para los anticuerpos MC3 y MCI. Como se muestra en la Figura 5, los anticuerpos RXl y 5A1 de M-CSF son específicos de la especie. La proliferación celular se presenta como la lectura fluorescente del ensayo CellTiter Glo, que es lineal con el número celular. La actividad neutralizante específica de la especie de RXl y 5A1 se muestran por su capacidad para inhibir M-NFS-60 en la presencia de ya sea M-CSF humano o murino. Finalmente, como se muestra en la Figura 5B, los anticuerpos MC3 y MCI también son inhibidores efectivos de la actividad de M-CSF.

Ej emplo 2 Este ejemplo muestra que el anticuerpo RXl inhibe de manera efectiva la osteólisis en un modelo de xenoinjerto humano a una dosis de 5 mg/kg. Ratones desnudos hembras a la edad de 4-7 semanas de edad, peso promedio de aproximadamente 20 g se usaron en este estudio. Las células tumorales (MDA-MB-231, 3 x 105) suspendidas en 10 µl de solución salina se inyectaron en la cavidad de la médula ósea de la tibia derecha. Se tomaron radiografías de las patas traseras un día después de la inoculación con tumor para obtener la imagen de línea base y verificar la fractura de hueso provocada por la inyección. Los ratones se aleatorizaron en grupos de tratamiento a 10 ratones por grupo que incluyen PBS y RXl a 5 mg/kg, inyectado i.p. una vez a la semana durante las 6 semanas . Al final del estudio, se tomaron nuevamente radiografías de las patas traseras y se compararon contra la línea base para daño óseo. El grado de daño óseo provocado por tumor se definió como se muestra en la Figura 6. El grupo con tratamiento de 5 mg/kg de RXl mostró protección estadísticamente significativa del hueso del daño provocado por tumor.

Ejemplo 3 Este ejemplo muestra que el número de metástasis se reduce cuando se administrar el anticuerpo RXl a ratones desnudos que tienen cáncer de mama humano MDA-MB-231 a una concentración de 5 mg/kg. Se usaron ratones desnudos hembras de una edad de 4-7 semanas, peso promedio aproximadamente 20 g, para este estudio. Las células tumorales (MDA-MB-231, 3 x 105) suspendidas en 10 µl de solución salina se inyectaron en la cavidad de la médula ósea de la tibia derecha. Se tomaron radiografías de las patas traseras un día después de la inoculación con tumor para obtener la imagen de línea base y se verificó la factura de hueso la fractura de hueso provocada por inyección. Los ratones se agruparon al usar en los grupos de tratamiento que incluyen PBS y RXl a 5 mg/kg inyectado i.p. una vez por semana durante 6 semanas. Al final del estudio, se recolectaron los pulmones de cada grupo de tratamiento y se fijaron en solución de Bouin para conteo de nodulos pulmonares metastáticos . Como se muestra en la Figura 7, el número de metástasis se redujo cuando se administra el anticuerpo RXl a ratones desnudos que tienen cáncer de mama humano MDA-MB- 231 de 5 mg/kg.

Ejemplo 4 Este ejemplo expone un procedimiento para humanización del anticuerpo RXl. Se humanizaron 5H4 , MCI y MC3 usando procedimientos similares .

Diseño de genes de cadenas ligera y pesada de RXl humanizado La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos para RXl murino se exponen en la Figura 4B. La secuencia de un anticuerpo humano identificado usando el recurso National Biomedical Foundation Protein Identification Resource o base de datos similar se usa, para proporcionar la estructura del anticuerpo humanizado. Para seleccionar la secuencia de la cadena pesada humanizada, se alinea la secuencia de cadena pesada de RXl murino con la secuencia de la cadena pesada de anticuerpo humano. En cada posición, el aminoácido de anticuerpo se selecciona para la secuencia humanizada, a menos que esta posición caiga en cualquiera de las cuatro categorías definidas a continuación, caso en el cual se selecciona el aminoácido de RXl murino: (1) La posición cae dentro de una región de determinación de complementariedad (CDR) , como se define por Kabat, J. Immunol . , 125, 961-969 (1980); (2) El aminoácido de anticuerpo humano es raro para las cadenas pesadas humanas en esa posición, en tanto que el aminoácido RXl murino es común para las cadenas pesadas humanas en esa posición; (3) La posición está inmediatamente adyacente a una CDR en la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de RXl murino; o (4) El modelado tridimensional del anticuerpo RXl murino sugiere que el aminoácido está físicamente cercano a la región de unión a antígeno. Para seleccionar la secuencia de la cadena ligera humanizada, la secuencia de cadena ligera de RXl murino se alinea con la secuencia de la cadena ligera de anticuerpo humano. El aminoácido de anticuerpo humano se selecciona en cada posición para la secuencia humanizada, a menos que la posición caiga nuevamente en una de las categorías descritas anteriormente y repetidas a continuación: (1) Las CDR; (2) Aminoácidos de RXl murino más típico que el anticuerpo humano; (3) Adyacente a las CDR; o (4) Posible proximidad tridimensional a la región de unión. La secuencia de nucleótidos real de los genes de cadena pesada y ligera se selecciona como sigue: (1) Las secuencias de nucleótidos codifican para la secuencia de aminoácidos, elegidas como se describe anteriormente,- (2) 5' de estas secuencias de codificación, las secuencias de nucleótidos codifican para una secuencia guía (de señal) . Estas secuencias guías se eligen como típicas de anticuerpo; (3) 3' de las secuencias de codificación, las secuencias de nucleótidos son las secuencias que siguen al segmento J5 de cadena ligera de ratón y al segmento J2 de cadena pesada de ratón, que son parte de la secuencia RXl murina. Estas secuencias se incluyen debido a que contienen señales donadoras de empalme; y (4) En cada extremo de la secuencia está un sitio Xba I para permitir el corte en los sitios Xba I y la clonación en el sitio Xba I de un vector.

Construcción de genes de cadena ligera y pesada humanizados Para sintetizar la cadena pesada, se sintetizan cuatro oligonucleótidos usando un sintetizador de ADN Applied biosystems 380B. Dos de los oligonucleótidos son parte de cada hebra de la cadena pesada y cada oligonucleótido traslapa el siguiente por aproximadamente 20 nucleótidos para permitir la fijación. Sin embargo, los oligonucleótidos cubren la región variable de cadena pesada humanizada completa con unos pocos nucleótidos adicionales en cada extremo para permitir el corte en los sitios Xba I. Los oligonucleótidos se purifican a partir de geles de poliacrilamida . Cada oligonucleótido se fosforila- usando ATP y T4-polinucleótido-cinasa por procedimientos _ normales (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Para fijar los oligonucleótidos fosforilados, se suspenden conjuntamente en 40 µl de TA (acetato de Tris 3 mM, pH 7.9, acetato de potasio 66 mM, acetato de magnesio 10 mM) a una concentración de aproximadamente 3.75 µM cada uno, calentado a 95 °C durante 4 minutos y enfriado lentamente a 4°C. Para sintetizar el gen completo de los oligonucleótidos al sintetizar la hebra opuesta de cada oligonucleótido, se adicionan los siguientes componentes en un volumen final de 100 µl: 10 µl oligonucleótidos fijados 0.16 mM cada desoxirribonucleótido 0.5 mM ATP . 0.5 mM DTT 100 µg/ml BASA 3.5 µg/ml proteína T4 g43 (ADN-polimerasa) 25 ug/ml proteína T4 g44/62 (proteína secundaria de polimerasa) 25 ug/ml proteína 45 (proteína secundaria de polimerasa) La mezcla se incuba a 37°C durante 30 minutos. Entonces se adicionan 10 µ de T4-ADN-ligasa y la incubación a 37°C se reasume durante 30 minutos. La polimerasa y ligasa se inactivan por incubación de la reacción a 70 °C durante 15 minutos. Para digerir el gen con Xba I, se adicionan 50 µl de 2 X TA que contiene BSA a 200 µg/ml y DTT a 1 mM, 43 µl de agua, y 50 µ de Xba I en 5 µl . La reacción se incuba durante 3 horas a 37°C, y entonces se purifica en un gel. El fragmento de Xba I se purifica de un gel y se clona en el sitio Xba I del plásmido pUC19 por métodos normales . Los plásmidos se purifican usando técnicas normales y se secuencian usando el método de didesoxi . La construcción de los plásmidos para expresar cadenas ligeras y pesadas humanizadas se logra al aislar los fragmentos de Xba I de cadena ligera y pesada del plásmido pUC19 en el cual se ha insertado y luego al insertarlo en el sitio Xba I de un vector de expresión apropiado que expresará altos niveles de una cadena pesada completa cuando se transfecte en una célula hospedadora apropiada .

Síntesis y afinidad de anticuerpo humanizado Los vectores de expresión se transfectan en células Sp2/? de ratón, y las células que integran los plásmidos se seleccionan en base a los marcadores seleccionables conferidos por los vectores de expresión por métodos normales . Para verificar que estas células segreguen anticuerpo que se unen a M-CSF, se incuban sobrenadantes de las células con células que se conoce que expresan M-CSF. Después del lavado, las células se incuban con anticuerpo anti-humano de cabra conjugado con fluoresceína, se lavan y analizan por fluorescencia en un citofluorómetro FACSCAN. Para los siguientes experimentos, se inyectan en ratones las células productoras del anticuerpo humanizado y se recolectan los ascitis resultantes. Se purifica el anticuerpo humanizado a homogeneidad sustancial de los ascitis por paso a través de una columna de afinidad de anticuerpo de inmunoglobulina-anti-humano de cabra, preparado en un soporte Affigel-10 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Calif.) de acuerdo a técnicas normales. Para determinar la afinidad del anticuerpo humanizado con relación al anticuerpo RXl murino original, se realiza un experimento de unión competitiva de acuerdo a técnicas conocidas en la técnica.

Ejemplo 4A Este ejemplo describe clonación y expresión de anticuerpos RXl humanos Engineered™, así como purificación de estos anticuerpos y prueba para actividad de unión. Los anticuerpos 5H4, MCI y MC3 humanos Engineered™ se preparan usando procedimientos similares .

Diseño de secuencias humanas Engineered™ Se ha descrito Humanos Engineering™ de dominios variables de anticuerpo por Studnicka [Ver, por ejemplo Studnicka et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,766,886; Studnicka et al., Protein Engineering 7: 805-814 (1994)] como un método para reducir inmunogenicidad en tanto que se mantiene actividad de unión de las moléculas de anticuerpo. De acuerdo al método, cada aminoácido de región variable se ha asignado a un riesgo de substitución. Las sustituciones de aminoácido se distinguen por una de tres categorías de riesgo: (1) cambios de bajo riesgo son aquellos que tienen el mayor potencial para reducir la inmunogenicidad con la menos oportunidad de perturbar la unión al antígeno; (2) cambios de riesgo moderado que son aquellos que reducirán adicionalmente la inmunogenicidad, pero tienen una oportunidad mayor de afectar la unión al antígeno o plegado de la proteína; (3) residuos de alto riesgo son aquellos que son importantes para la unión o para mantener la estructura del anticuerpo y tienen el riesgo más alto que afectará la unión al antígeno o plegado de la proteína. Debido al papel estructural tridimensional de las prolinas, las modificaciones en las prolinas en general se consideran que son al menos cambios de riesgo moderado, aún si la posición es típicamente una posición de bajo riesgo. Los cambios de sustitución se prefieren pero también son posibles inserciones y supresiones. Las Figuras 4B y 4C muestran asignación de riesgo para cada residuo de aminoácido de las cadena ligera y pesada de RXl murino, respectivamente, categorizadas como cambio de riesgo alto, moderado o bajo. Las regiones variables de las cadenas ligeras y pesada del anticuerpo RXl murino son humanas Engineered™ usando este método. Los residuos de aminoácidos que son candidatos para modificación de acuerdo al método en posiciones de bajo riesgo se identificaron al alinear las secuencias de aminoácidos de las regiones variables murinas con una secuencia de región variable humana. Se puede usar cualquier región variable humana, incluyendo una secuencia VH o VL individual o una secuencia VH o VL de consenso humana. Los residuos de aminoácidos en cualquier número de las posiciones de bajo riesgo, • o todas las posiciones de bajo riesgo, se pueden cambiar. Para la secuencia de cadena pesada de "bajo riesgo" humana Engineered™ en las Figuras 19A-B, se usó Vh2 de consenso humana (basada en Kabat) como la plantilla, y para cada - posición donde los residuos de aminoácido murinos y humanos difieren en posiciones de bajo riesgo, se introdujo la modificación de aminoácido que reemplazó el residuo murino con el residuo humano. Para la secuencia de cadena ligera de "bajo riesgo" humana Engineered™ en las Figuras 20A-B, se usó kappa-3 de consenso humana (basada _ en Kabat) como la plantilla, y para cada posición donde los residuos de aminoácidos murinos y humanos difieren en posiciones de bajo riesgo, se introdujo una modificación de aminoácido que reemplazó el residuo murino con el residuo humano. Se hicieron un total de 16 modificaciones de bajo riesgo de aminoácidos a la cadena ligera y 8 modificaciones de bajo riesgo se hicieron a la cadena pesada. De manera similar, los residuos de aminoácido que son candidatos para modificación de acuerdo al método en todas las posiciones de riesgo bajo y moderado se identificaron al alinear la secuencia de aminoácidos de las regiones variables murinas con una secuencia de región variable humana. Los residuos de aminoácidos en cualquier número de las posiciones de riesgo bajo o moderado, o todas las posiciones de riesgo bajo y moderado, se hacen cambiar. Para la secuencia de cadena pesada humana Engineered™ en las Figuras 19A-B, se usó Vh2 de consenso humana (basada en Kabat) como la plantilla, y para cada posición donde los residuos de aminoácido murinos y humanos difirieron en las posiciones de riesgo bajo moderado, se introdujo una modificación de aminoácidos que reemplazó el residuo murino en el residuo humano. Para la secuencia de cadena ligera humana Engineered™ en las Figuras 20A-B, se usó kappa-3 de consenso humano (basada en Kabat) como la plantilla, y para cada posición donde los residuos de aminoácido humanos y murinos difirieron en posiciones de bajo o moderado riesgo, se introdujo una modificación de aminoácido que reemplazó el residuo murino con el residuo humano. Se hicieron un total de 19 modificaciones de aminoácido de riesgo bajo y moderado a la cadena ligera y 12 modificaciones bajas y moderadas se hicieron a la cadena pesada. Una secuencia de cadena ligera de "bajo riesgo alternativo" también se preparó como se muestra en las Figuras 21A-B, en las cuales la modificación en la posición 54 se invirtió de regreso a murino. Una secuencia de cadena ligera "de riesgo baj o+moderado alternativo" también se preparó como se muestra en las Figuras 21A-B, en la cual las modificaciones en las posiciones 54-56 se revistieron de regreso a murino. Finalmente, la secuencia de la región V de cadena ligera "riesgo bajo + moderado" humana Engineered™ también se produjo usando el subgrupo 2-1- (1) A 14 de la línea germinal VK6 humana como la plantilla, como se muestra en las Figuras 22A-B.

También contemplados por la presente invención son los aminoácidos restantes 41-43 (NGS) de la Figura 4A que representan el sitio de glicosilación. De manera alternativa, sólo se puede retener uno o dos de los aminoácidos 41-43 (por ejemplo, NG) .

Preparación de Vectores de Expresión para Desarrollo de Línea Celular Permanente Los fragmentos de ADN que codifican para cada una de las secuencias de la región V de cadena pesada y ligera, descritas anteriormente, junto con secuencias de señal derivadas de anticuerpo se construyeron usando síntesis de nucleótidos sintéticos. El ADN que codifica para cada una de las secuencias de aminoácidos de la región V de cadena ligera descritas anteriormente, se insertaron en el vector pMXPlO que contiene la región constante de cadena ligera Kappa humana. El ADN que codifica para cada una de las secuencias de aminoácidos de región V de cadena pesada descritas anteriormente, se insertaron en el vector pMXP6 que contiene la región constante de cadena pesada de Gamma-2 humana. Se construyeron vectores adicionales que contienen las secuencias de aminoácidos de región V de cadena pesada fusionadas a las regiones constantes Gamma-1 (ADNc) y Gamma- 4 (genómica y ADNc) humanas que tienen las secuencias exhibidas en las Figuras 29A, 29b y 30. Todos estos vectores contienen un promotor hCMV y una región 3 ' no traducida de cadena ligera kappa de ratón así como genes marcadores seleccionables tal como neo o his para selección de transfectantes resistentes a G418 o histidinol, respectivamente . Los vectores de cadena ligera y pesada se describen en las Tablas 2 y 3 , respectivamente .

Tabla 2. Vectores de cadena ligera Kappa permanente de gen individual Tabla 3. Vectores de cadena pesada permanentes de gen individual Los vectores que comprenden los genes de cadena pesada más ligera humana Engineered™ deseados (Gamma-1, Gamma-2 y Gamma-4) también se construyeron. Estos vectores de "2-Gen" contienen genes que codifican para cada cadena de anticuerpo, pesada y ligera, bajo el control del promotor hCMV, el donador de empalme CMV, el aceptor de empalme SV40 16S y el ADN 3 ' -no traducido de cadena ligera kappa de ratón que incluye el sitio poliA. También contienen un gen marcado seleccionable tal como neo o his y el gen de resistencia a ampicilina. Los vectores que contienen tanto los genes de cadena pesada como ligera se describen en la Tabla 4. Los vectores que comprenden dos copias de cada gen de cadena ligera y pesada (cuatro vectores génicos) también se pueden construir.

Preparación de Vectores de Expresión para Expresión Transitoria Los vectores que contienen ya sea los genes de cadena ligera o pesada descritos anteriormente también se construyeron para transfección transitoria. Estos vectores son similares a aquellos descritos anteriormente para transfecciones permanentes excepto que en lugar de los genes neo o his, contienen el virus de Epstein-Barr ariP para la aplicación en células HEK293 que expresan el antígeno nuclear del virus de Epstein-Barr. Los vectores para transfección transitoria se describen en las Tablas 5 y 6.

Expresión Transitoria de RXl Human Engineered en Células HEK293E Los vectores separados que contienen cada uno oriP del virus de Epstein-Barr y los genes de cadena ligera y cadena pesada descritos anteriormente se transfectaron de manera transitoria en células HEK293E. Las células transitoriamente transfectadas se dejaron incubar durante hasta 10 días después de lo cual se recuperó el sobrenadante y el anticuerpo se purificó usando cromatografía con Proteína A. Las proteínas producidas por transfección transitoria de células 293E se describen en la tabla 7 a continuación.

Desarrollo de Células CHO-Kl Permanentemente Transfectadas Los vectores descritos anteriormente (Tabla 4) que contienen una copia cada uno de los genes ligero y pesado conjuntamente se transfectan en células CHO-Kl adaptadas a Q Ex-Cell 302. Las células CHO-Kl adaptadas a crecimiento en suspensión en el medio Ex-Cell 302 se sometieron a electroporesis típicamente con 40 µg de vector linealizado. De manera alternativa, el ADN linealizado se puede volver complejo con polietilenimina lineal (PEÍ) y usar para r transfección. Las células se colocaron en placas de 96 cavidades que contienen el medio Ex-Cell 302 complementado con FBS al 1 % y G418. Se detectan clones en placas de 96 cavidades y aproximadamente el 10 % superior de los clones de cada transfección se transfirió a placas de 24 cavidades que contienen el medio Ex-Cell 302. Se realiza una prueba de productividad en placas de 24 cavidades en el medio Ex-Cell 302 para cultivos cultivados durante 7 y 14 días tiempo en el cual los sobrenadantes de cultivo se prueban para niveles del anticuerpo segregado por un ensayo ELISA de inmunoglobulina para IgG. Los clones superiores se transfieren a matraces agitados que contienen medio Ex-Cell 302. Tan pronto como las células se adaptan al crecimiento en suspensión, se realiza la prueba de matraz agitado con estos clones en el medio Ex-Cell 302. Las células se cultivan durante hasta 10 días en matraces Erlenmeyer den 125 ml que contienen 25 ml de medio. Los matraces se abren al menos cada día diferente del periodo de incubación para permitir el intercambio de bases y los niveles de polipéptido de inmunoglobulina en el medio de cultivo se determinan por ELISA de IgG al final del periodo de incubación. Múltiples transfecciones secuenciales de la misma línea celular con dos o tres vectores de transcripción de múltiples unidades dan por resultado clones y líneas celulares que exhiben incrementos adicionales en los niveles de producción de inmunoglobulina, de manera preferente a 300 µg/ml o más.

Purificación Se puede diseñar un proceso para la purificación de polipéptidos de inmunoglobulina a partir de vectores y todas las líneas de acuerdo con la invención. De acuerdo a los métodos bien conocidos en la técnica, se remueven células por filtración después de la terminación. El filtrado se carga en una columna de Proteína A (en múltiples pasadas, si se necesita) . La columna se lava y entonces los polipéptidos de inmunoglobulina expresados y segregados se eluyen de la columna. Para la preparación del producto de anticuerpo, la mezcla de proteína A se mantiene a un pH bajo (pH 3 durante un mínimo de 30 minutos y un máximo de una hora) como un paso de inactivación viral . Entonces se usa un paso de intercambio catiónico adsorbente para purificar adicionalmente el producto. El producto eluido de la columna de separación adsorbente se pasa a través de un filtro de retención de virus para proporcionar limpieza adicional de partículas virales potenciales . El filtrado además se purifica por el paso a través de una columna de intercambio aniónico en la cual no se une el producto. Finalmente, el proceso de purificación se concluye al transferir el producto en el amortiguador de formulación a través de diafiltración. El producto retenido se ajusta a una concentración de proteína de al menos 1 mg/mL y se adiciona a un estabilizador.

Actividad de unión Se determina la actividad de unión a MCSF de los anticuerpos recombinantes humanos Engineered™. La proteína se purifica se purifica de los sobrenadantes de cultivo de matraz agitado por paso sobre una columna de proteína A seguido por determinación de concentración por A280. Se realizan ensayos de unión como se describe en el Ejemplo 1 anterior o 12 posterior. Se pre-revisten placas de Immulon II con el antígeno de sM-CSF pre-diluido en una solución de revestimiento de PBS para inmovilizarlo a la microplaca. Se adicionan varias concentraciones de prueba de M-CSF que varían desde 0.25 a 20 µg/ml a 50 µl/cavidad y se incuban a 4°C durante la noche. Las placas entonces se lavan 3 veces con PBS-Tween al 0.05 %. Se realiza el bloqueo al adicionar en PBS-Tween al 0.05 %, BSA al 1 % seguido por una incubación de 30 minutos a 37 °C. Se preparan diluciones de polipéptidos de inmunoglobulina en solución de PBS-Tween al 0.05 % de BSA al 1 %. Se preparan diluciones seriales de 2 a 3 veces y se adicionan (100 µl/cavidad) en duplicado o triplicado. Después de una incubación de 90 minutos a 37 °C, la microplaca se lava 3 veces con PBS-Tween al 0.05 %. Para la revelación de la señal, el anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de humano (específico de Fc o gamma) conjugado a peroxidasa se adiciona a cada cavidad y se incuba durante 60 minutos a 37°C seguido por adición de OPD a 0.4 mg/ml en amortiguador de citrato más H202 al 0.012 %. Después de 5 -10 minutos a temperatura ambiente, el ensayo se detiene por la adición de 100 µl de H2S04 1M y las placas se leen a 490 nm. Se han empleado anticuerpos de cabra anti-IgG de humano (específicos de gamma) y de cabra anti-IgG de humano (específicos de Fc) .

Ejemplo 5 Los siguientes ejemplos exponen un procedimiento para el tratamiento de humanos usando anticuerpo específico de M-CSF, tal como un anticuerpo derivado de RXl o de competencia de RXl, que incluye un anticuerpo humano Engineered™ RXl con una región constante de IgGl o IgG4 modificada o no modificada. El procedimiento también se puede seguir para un anticuerpo derivado de MCI o MC3 o de competencia de MCI o MC3. El intervalo de dosificación eficaz esperado es 2 µg/kg a 10 mg/kg. Esta estimación se basa en el siguiente fundamento sostenido por datos experimentales : El nivel de M-CSF medido en plasma humano (tanto pacientes de cáncer de mama como saludables) es aproximadamente 1 ng/ml. El anticuerpo neutralizante RXl de M-CSF tiene una ECS0 medida de 2 ng/ml contra 1 ng/ml de M-CSF humano. Por consiguiente, la concentración efectiva de anticuerpo en el plasma humano se espera que sea de 10 a 50,000 veces sobre su ECS0, es decir, 20 ng/ml a 100 µg/ml de anticuerpo en plasma humano. En base a los estudios de PK, a fin de efectuar esta concentración en pacientes humanos, se requiere una dosificación de 2 µg/kg a 10 mg/kg para alcanzar 20 ng/ml a 100 µg/ml de concentración de anticuerpo en plasma.

Ej emplo 6 Este ejemplo expone un procedimiento para la evaluación de la actividad anti-cáncer de anticuerpo - monoclonal anti-M-CSF en un modelo subcutáneo. El ejemplo 2 mostró anteriormente que el tratamiento dé anticuerpo monoclonal anti-M-CSF inhibió de manera significativa el crecimiento de tumor en médula ósea. El propósito de este estudio es evaluar si el anticuerpo también puede inhibir el crecimiento de tumor en el tejido blando. Ratones nu/nu hembras a la edad de 10 semanas, con peso promedio de aproximadamente 20g, se usaron para este estudio. Los ratones se someterán a un periodo de aclimatación de al menos 7 días antes del inicio del estudio. En el día 0, el flanco derecho de los ratones de nudo se inyectará con células de cáncer de colon humano SW620 de manera subcutánea a 5 x 106 células por ratón por 100 µl. Cuando el volumen de tumor alcanza 100-200 mm3 (usualmente 1 semana después de la inoculación de tumor) , los ratones se aleatorizarán en 5 grupos a 10 ratones por grupo como sigue : 1) PBS 2) RXl 3) 5A1 4) mlgGl+rlgGl, isotipo Ab control 5) 5A1+RX1 Los ratones se tratarán de manera intraperitoneal con los anticuerpos designados a 10 mpk una vez por semana durante 4 semanas. Cuando el volumen de tumor alcance 2000 mm3, el estudio se terminará. De manera alternativa, también se someterán a eutanasia animales cuando se cumplan cualquiera de las siguientes condiciones: ulceración de superficie de tumor es mayor de 30 % de área superficial total de tumor, pérdida de peso corporal significativa (>20 %) , deshidratación y agónico. La sangre entera se recolectará de todos los ratones y se analizará la población de monocitos como un marcador sustituto potencial . El crecimiento/tamaño de tumor se medirá por análisis 2-D. Las mediciones del ancho y longitud de tumor se usarán para calcular el volumen de tumor. Se espera que el crecimiento de tumor en tejido blando se inhibirá como resultado del experimento anterior.

Ej emplo 7 El siguiente ejemplo expone un procedimiento para la evaluación de terapia de combinación para el tratamiento y prevención de enfermedad osteolítica severa asociada con metástasis de cáncer. Diseño experimental . El estudio descrito en el Ejemplo 5 anterior se repite esencialmente como se describe con las siguientes excepciones . Además del anticuerpo o combinación de anticuerpo expuesta en los grupos de tratamiento posteriores, los animales recibirán uno de los siguientes tratamientos adicionales : 1. Bisfosfonato (por ejemplo, Aredia; Zometa; Clodronato) . 2. Cirugía 3. Radiación 4. Quimioterapia 5. Terapia hormonal (por ejemplo, Tamoxifeno; terapia anti-Andrógeno) 6. Terapia de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes de RANKL/RANK; anticuerpo neutralizante PTHrP) . 7. Terapia de proteína terapéutica (por ejemplo, receptor soluble de RANKL; OPG, e inhibidores de PDGF y MMP) . 8. Terapia de fármacos de molécula pequeña (por ejemplo, inhibidor de Src-cinasa) 9 . Terapia de oligonucleótidos (por ejemplo, RANKL o RANK o PTHrP Anti-sentido) . 10. Terapia génica (por ejemplo, inhibidores de RANKL o RANK) 11. Terapia peptídica (por ejemplo, muteínas de RANKL) .

Los grupos de tratamiento son como siguen. Los tratamientos adicionales anteriores se indican más adelante como "más terapia X" : 1. PBS únicamente 2. tratamiento con terapia X únicamente 3. control de isotipo de IgGl de rata 4. control de isotipo de IG1 murino 5. RXl anti-MCSF humano únicamente 6. 5A1 IgGl de rata, anti-MCSF de ratón únicamente 7. combinación de control de isotipo de IgGl murino e IgGl de rata 8. combinación de RXl y 5A1 9. control de isotipo IgGl de rata más terapia X 10. control de isotipo IG1 murino más terapia X 11. RXl anti-MCSF humano más terapia X 12. 5A1 IgGl de rata anti-MCSF de ratón más terapia X 13. combinación de control de isotipo de IgGl murino e IgGl de rata más terapia X 14. combinación de RXl y 5A1 más terapia X. Dosificación: se usa 0.1-30 mg/kg de cada anticuerpo para administración a cada animal. La dosificación preferida es 10 mg/kg. La ruta de administración puede ser IV, IP, SC. La ruta preferida es ?p. El tratamiento empezará el día siguiente de la inyección de las células de tumor, como se---describe en el ejemplo 5 anterior. Mediciones . Para valorar la severidad de la osteólisis entre los varios grupos de tratamiento, cada ratón recibió una imagen Faxitron de línea base tomada el día después de la inyección de células de tumor. También se toma una imagen Faxitron al final del estudio (8 semanas) .

El crecimiento de tumor se mide de manera simultánea usando el sistema de Xenogen puesto que las células de tumor expresan de manera estable luciferasa. Se espera que la terapia de combinación para el tratamiento y prevención de enfermedad osteolítica severa asociada con metástasis de cáncer se mejorará con relación a la terapia de anticuerpo sola.

Ej emplo 8 El siguiente ejemplo proporciona un protocolo para evaluar la capacidad del anticuerpo específico de M-CSF para unirse a, por ejemplo, células de cáncer de mama (línea celular MDA231) o células de cáncer de mieloma múltiple (línea celular ARH77) usando un clasificador celular activado por fluorescencia. Las células se lavan primero dos veces con PBS (no Ca2+, Mg2+) . Para cada placa de 10 cm, se adicional 2 ml de EDTA 3 mM, y los sedimentos se incubaron a 37 °C durante 2-3 minutos, hasta que las células se redondearon y empezaron a desprenderse de la placa. Entonces, se adicionaron y mezclaron 10 ml de amortiguador A (PBS + FBS al 5 %) . En ese momento, las células se sedimentaron y volvieron a suspender a aproximadamente 5 x 106 células/ml en PBS+FBS al 5 %, y las células se colocaron en túbulos a 100 µl/muéstra. En este punto, se adicionaron 0.1-10 µg/ml del anticuerpo primario (usado a concentración indicada de anticuerpo de M-CSF o anticuerpo de control) . La dilución, si es necesaria, se hizo en FBS al 5 %/PBS. La mezcla entonces se incubó durante 30 minutos a 4°C. Después del periodo de incubación, las células se lavaron 3 veces por centrifugación a 400 g durante 5 minutos, y las células se volvieron a suspender en PBS. El anticuerpo anti-IgG marcado con FITC o PE (0.25 µg/muestra) se diluyó en BSA/PBS al 1 % a la dilución óptima, y las células se volvieron a suspender en esta solución y se incubaron durante 30 minutos a 4°C. Entonces, las células se lavaron 3 veces como se describe anteriormente. Después de los lavados celulares, las células se suspendieron con 0.5 ml/muestra de PI-PBS (si es necesario para distinguir células muertas de las vivas) . Las células también se pueden fijar para análisis posterior (las células pueden durar aproximadamente 3 días si se fijan con formaldehído al 0.1 %) . Las células entonces se analizaron en un FACS activo a fluorescencia usando procedimientos normales . Como se muestra en la Figura 8A y 8B, un anticuerpo RXl específico de MCSF se unió a la línea de células de cáncer de mama MDA231 o a la línea de células de cáncer de mieloma múltiple ARH77 a una variedad de concentraciones de anticuerpo como se indica.

Ejemplo 9 El siguiente ejemplo muestra que M-CSF es prevalente en varias superficies de células de cáncer. La tinción inmunohistoquímica de M-CSF se llevó a cabo usando un anticuerpo RXl específico de M-CSF como sigue. En el establecimiento, se calientan portaobjetos en un horno a 55-60°C durante 1 hora y se dejan enfriar durante 2-3 minutos. Se usaron los siguientes parámetros de des-encerado y re-hidratación: a. Xileno 3 x 5 minutos b. Alcohol Reactivo 100 % 2 x 5 minutos c . Alcohol Reactivo 95 % 2 x 4 minutos d. Alcohol Reactivo 75 % 2 x 3 minutos e. Alcohol Reactivo 50 % 1 x 3 minutos g. H20 di 2 - 3 enjuagues rápidos Antes del paso de bloqueo de peróxido, se preparó recuperación de antígeno usando 1 x Biogenex Citra Plus . La solución se sometió a microondas inicialmente a poder completo para bullir. Una vez que bulló la solución, el microondas se dejó rápidamente durante otros 13 minutos a una potencia de nivel 2, y se dejó enfriar antes de proseguir. El paso de bloqueo de peróxido se realizó como sigue. Los portaobjetos fueron portaobjetos sumergidos en H202 al 3 % (25 ml 30 % a 250 ml de H20 di) y se colocó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los portaobjetos entonces se enjugaron 2 x con H20 di, y se lavaron con 1 X PBS 2 x 2 minutos . El procedimiento de bloqueo de avidina/biotina se realizó como sigue. Se colocaron portaobjetos planos en un soporte metálico. Se usó una pluma de Azul PAP (marcador de portaobjetos hidrófobo) alrededor del tejido. Entonces, se adicionaron 2 gotas de Avidina Zymed (Reactivo A) suficiente para cubrir el tejido y los portaobjetos se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, los portaobjetos se lavaron como sigue: 2 x 3 lavados por minuto en 1 X PBS. 2 gotas de Biotina Zymed (Reactivo B) , temperatura ambiente durante 10 minutos. 2 x 3 lavados por minuto en 1 X PBS . El procedimiento de bloqueo de proteína se realizó como sigue. Primero, se adicionaron suero al 10 % [a 2 % de concentración final] de especie de anticuerpo secundario. El BioGenex Power Block se diluyó entonces a 1 X con H20 di. El soporte de los portaobjetos se sumergió en Power Block durante 8 minutos a temperatura ambiente, y los portaobjetos se incubaron 2x en PBS IX. Para la adición del anticuerpo primario (RXl) , los portaobjetos se colocaron planos en soporte metálico. Se adicionó anticuerpo para cubrir cada sección (aproximadamente 350 µl) y el anticuerpo se propagó con la punta de la pipeta (si es necesario) sin desechar el tejido. Los portaobjetos entonces se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, los portaobjetos se lavaron 3 x con 1 x PBS 3-5 minutos cada vez. En este punto, se aplicó BioGenex Multi-Link a las secciones y se incubó durante 10-11 minutos a temperatura ambiente . Las secciones entonces se lavaron 3 minutos cada vez . Se realizó la marcación al aplicar la marca BioGenex HRP a las secciones, que entonces se incubaron a temperatura ambiente durante 10-11 minutos y se lavaron con 1 x PBS, 3 x 3 minutos. Entonces, se adicionó el sustrato BioGenex HH202 (1 gota AEC para cada 2.5 ml de H202) a las secciones y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las secciones entonces se enjuagaron varias veces con H20 di. El paso de contrateñido se realizó como sigue.

Las soluciones se tiñeron con hematoxilina durante 1 minuto a temperatura ambiente. Entonces, las secciones se enjuagaron con H20 dos veces, y se incubaron 1 X PBS durante 1 minuto. Entonces las secciones se enjuagaron bien con H20 para remover PBS . Las secciones se montaron al aplicar una gota de BioGenex Super Mount a la sección y entonces se secaron con aire durante la noche a temperatura ambiente. Como se muestra en la Figura 9, el M-CSF es prevalente en varias superficies de células de cáncer. Las secciones para los tipos de células de cáncer indicados se clasificaron como sigue : 0. - No tinción 1. - Tinción fue similar a fondo 2.- Positivo, pero tinción débil 3. - Positivo y tinción significativa 4. - Positivo y tinción fuerte Ejemplo 10 El siguiente ejemplo muestra el procedimiento para producir los anticuerpos MCI y MC3. MCI y MC3 son dos anticuerpos murinos monoclonales que neutralizan el anticuerpo de M-CSF humano y se unen a M-CSF humano. Las secuencias de aminoácidos de estos anticuerpos se muestran en las figuras 14 y 15, respectivamente. Se identificaron por una serie de pasos que incluyen a) inmunización de ratones Balb C con M-CSF humano recombinante; b) detección para clones positivos que producen anticuerpos que se unen a M-CSF humano en un formato ELISA; c) subclonación de clones positivos para generar clones de hibridoma estables; d) aumento en escala del cultivo celular para producir- gran cantidad de anticuerpos; e) purificación y caracterización de anticuerpos en análisis de afinidad, unión a células y ensayos de actividad neutralizante como se describe en los ejemplos anteriores. Las figuras 16A y 16B muestran la alineación de las CDR de las cadenas pesada y ligera, respectivamente, de los anticuerpos RXl, 5H4 , MCI y MC3. Se generan versiones humanizadas y humanas Engineered™ como se describe en los ejemplos anteriores.

Ejemplo 11 Este ejemplo muestra que los anticuerpos RXl y 5H4 de M-CSF, así como los fragmentos Fab de los mismos, tienen diferentes actividades neutralizantes. El siguiente ejemplo también muestra que los anticuerpos RXl, 5H4 y MC3 tienen afinidades variables para M-CSF. Este ejemplo demuestra además que las afinidades de los anticuerpos intactos mencionados anteriormente son relativamente mayores a los fragmentos Fab de los anticuerpos mencionados anteriormente . Las actividades de neutralización de RXl y 5H4 intactos versus fragmentos Fab de RXl y 5H4 se determinaron al medir la proliferación celular dependiente de M-CSF en la presencia de varias concentraciones de anticuerpo. La proliferación celular se determinó por tinte quimioluminiscénte . Como se muestra en la Figura 17, RXl intacto tiene el más alto potencial, en tanto que el fragmento Fab de RXl pierde su potencia y se comporta como 5H4 y el fragmento Fab de 5H . Las propiedades de unión de los anticuerpos mencionados anteriormente se analizaron usando análisis Biacore. A fin de determinar las afinidades relativas de RXl, 5H4 y MC3 a M-CSF, se inmovilizó Fc anti-ratón de conejo en un chip biosensor CM5 mediante acoplamiento con la amina. Los anticuerpos mencionados anteriormente entonces se capturaron en el chip biosensor Fc anti-ratón/CM5 a 1.5 µg/ml durante 3 minutos a 2 µl/min. El MCSF se hizo fluir sobre la superficie del biosensor modificado a concentraciones variables (Rmax aproximadamente 15) . Los anticuerpos de prueba y el antígeno se diluyeron en HEPES 0.01 M, pH 7.4, NaCL 0.15 M, EDTA 3 mM, agente tensioactivo P20 al 0.00 5% (HBS-EP) . Todos los experimentos se realizaron a 25 °C. Se determinaron constantes de afinidad y cinéticas usando el programa de Biaevaluación (Biacore) con un ajuste global/modelo de interacción de 1:1. Como se muestra más adelante en la tabla 8, RXl se une a M-CSF con la afinidad más alta con relación a 5H4 y MC3 Para determinar las diferencias relativas en la afinidad de unión de Mab intacto y los fragmentos Fab de RXl, 5H4 y MC3 , se usó una configuración alternativa en el análisis Biacore. Específicamente, se inmovilizó M-CSF en el chip biosensor CM5 mediante acoplamiento con amina. Se inyectó 0.05 µg/ml M-CSF en acetato de sodio 10 mM pH 4.0 a 1 µl/min durante 5 minutos para lograr RL=6-12RU. El anticuerpo de prueba (o fragmento Fab) se hizo fluir sobre la superficie del biosensor modificado a concentraciones variables . Los anticuerpos de prueba se diluyeron en HEPES 0.01 M, pH 7.4, NaCL 0.15 M, EDTA 3 mM, Agente Tensioactivo PP20 al 0.005 % (HBS-EP) y todos los experimentos se realizaron a 25°C. Se determinaron las constantes de afinidad y de cinética usando el programa Biaevaluación (Biacore) con un ajuste global/modelo de interacción de 1:1. Como se muestra más adelante en la tabla 9, RXl se une a M-CSF con la afinidad más alta con relación a los otros anticuerpos probados. El fragmento Fab de RXl se une a M-SCF con una afinidad relativamente menor con relación a la haloproteína RXl . Tabla 9 Los datos de neutralización y de afinidad de unión indican que la actividad de neutralización de RXl es debido principalmente a su afinidad relativamente alta para M-CSF, y que esta alta afinidad puede ser debido al menos en parte a la capacidad de ambos brazos del anticuerpo para unirse simultáneamente al dímero de M-CSF.

Ej emplo 12 El siguiente ejemplo revela el epítope lineal (es decir, secuencia de aminoácido) en M-CSF reconocido por los anticuerpos RXl, 5H , y MC3. Inicialmente, se diseñó la estrategia de correlación de epítope para determinar si los anticuerpos RXl, 5H4 y MC3 reconocieron epítopes lineales o epítopes conformacionales dentro de M-CSF. Por consiguiente, los anticuerpos anti-M-CSF se probaron contra 0.1 µg de M-CSF bajo condiciones reductoras así como no reductoras. Sólo la forma no reducida de M-CSF se reconoció por cada uno de los anticuerpos, sugiriendo que los epítopes reconocidos son de naturaleza discontinua. Entonces, se determinó el epítope lineal de M-CSF para cada anticuerpo. De manera específica, se prepararon membranas de SPOT (Sigma Genosys) donde la secuencia de interés del fragmento de M-CSF, que traslapa péptidos lOmer sintetizada con un desplazamiento de aminoácido se cargaron en el soporte de membrana de celulosa. Estas membranas entonces se sondearon con los anticuerpos mencionados anteriormente y se identificaron los SPOT reactivos . La secuencia de péptidos entonces se identificó por su ubicación correspondiente en la membrana, y los aminoácidos de traslape dentro de los péptidos de reacción positiva se identificaron como el epítope . Como se muestra en la Figura 18, RXl se unió a un diferente epítope lineal que es 5H4 y MC3, que correlaciona a una ubicación diferente en M-CSF. RXl se une a un epítope lineal representado por RFRDNTPN (SEQ ID NO: 120) o RFRDNTAN (SEQ ID NO: 121) , los aminoácidos 98-105 de M-CSF de la Figura 12. 5H4 se une a un epítope lineal representado por ITFEFVDQE (SEQ ID NO: 122) , aminoácidos 65-73 de M-CSF de la Figura 12. MC3 se une a dos epítopes lineales representados por (1) ITFEFVDQE (SEQ ID NO: 122), aminoácidos 65-73 de M-CSF de la Figura 12 y (2) FYETPLQ (SEQ ID NO: 123), aminoácidos 138-144 de M-CSF de la Figura 12.

Ejemplo 13 La afinidad de unión de versiones humanas Engineered™ de los anticuerpos RXl preparados como se describe anteriormente en el Ejemplo 4A se determinaron. Este ejemplo muestra que los anticuerpos RXl humanos Engineered™ con diferentes regiones constantes de la subclase de IgG se unen a M-CSF con diferentes afinidades in vi tro. Para determinar las diferencias relativas en la afinidad de unión de anticuerpos intactos por análisis de Biacore, se inmovilizó M-CSF en chip biosensor de CM5 mediante acoplamiento de amina. Se inyectaron 0.05 µg/ml de M-CSF en Na-acetato de sodio 10 mM, pH 4.0 a 1 µl/min., durante 5 minutos para lograr RL-6-12 RU. El anticuerpo de prueba o fragmentos Fab se hicieron fluir sobre la superficie de biosensor modificada a concentraciones variables que varían desde lOOnM a 1.5 nM en diluciones de dos veces. Los anticuerpos de prueba se diluyeron en HEPES 0.01 pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, agente tensioactivo P20 al 0.005 % (HBS-EP)' y todos los experimentos se realizaron a 25 °C. Cada punto de concentración y puntos blancos de amortiguador se corrieron en triplicado, y los datos se recolectaron durante 3 minutos de asociación y 8 minutos de disociación. Se determinaron las constantes de afinidad y cinéticas usando el programa Biaevaluación con un ajuste global/modelo de interacción 1:1. Como se muestra en la Tabla 10 más adelante heRXl-l.Gl y heRXl-l.G4 se unen a M-CSF con afinidades que se asemejan más cercanamente a la afinidad de unión de RX-murino-1-M-CSF.

En contraste, como se muestra en la Tabla 11 más adelante, aunque hubo alguna variación en la afinidad de unión, todas las construcciones de Gamma-2 exhibieron al menos una disminución de 7 veces en la afinidad de unión en comparación al anticuerpo murino de origen.

Tab3 .a 11 ka (M-l sec- kd (sec-1) KD (nM) Anticuerpo 1) Murino RXl (2.23 ± 0.35) (1.56 ± 0.67) 0.7 ± 0.27 n=21 x 105 x 10"4 heRXl-l.G2 (2.36 ± 0.18) (1.37 ± 0.24) 5.9 ± 1.4 n=5 X 105 x 10"3 Ejemplo 14 Este ejemplo muestra que los anticuerpos RXl humanos Engineered™ con diferentes regiones constantes de la subclase IgG poseen diferentes actividades de neutralización in vi tro. Para probar la actividad de neutralización de los anticuerpos M-CSF, se usó un ensayo de proliferación de la línea celular M-NFS-60 (American Type Culture Collection, No. de Acceso CRL-1838, disponible de ATCC en Rockville, MD, EUA, derivado de una leucemia mielógena inducida con el retrovirus ecotrópico de ratón silvestre Cas-Br.MuLV. La línea celular responde tanto a interleucina 3 como a M-CSF y contiene un proto-oncogen c-myb truncado provocado por la integración de un retrovirus. La proliferación de M-NFS-60 requiere M-CSF activo de una manera dependiente de la dosis. En el ensayo, se lavaron células M-NSF-60 y se colocaron en placa en el medio RPIM 1640 con FBS al 10 % y Pen/Estrep al 1 %. Se incubó M-CSF humano recombinante (a concentración final de 10 ng/ml, que es equivalente a 3000 U/ml de actividad de M-CSF) , con varias concentraciones de anticuerpo que varían desde 1 µg/ml a 0.5 ng/ml (en dilución serial de 2 veces) durante 1 hora a 37°C en C02 al 5 % en una incubadora. Después de la incubación, la mezcla se adicionó al cultivo de M-NFS-60 en placas de microtítulo de 96 cavidades. El volumen total de ensayo por cavidad fue de 100 µl, con 10 ng/ml de M-CSF, y se indicó la concentración del anticuerpo. Las células se incubaron a 37°C bajo C02 al 5 % durante 72 horas antes de que se cuantificaran los números celulares por el ensayo CellTiter Glo (Promega) . Cada anticuerpo se probó en triplicado, con una repetición en el siguiente día (para un total de seis ensayos por anticuerpo) . La IC50 de cada anticuerpo se analizó por ajuste a la curva. El ensayo se repitió usando MCSF humano en suero, medio acondicionado de MDA231 (que contiene M-CSF) , MCSF de mono cinomólogo de suero, y MCSF recombinante de mono cinomólogo. Los resultados se presentan en las Figuras 25 (MCSF recombinante) , 26 (MCSF humano en suero) y 27 (medio acondicionado de MDA231) como la lectura fluorescente de ensayo CellTiter Glo, que es lineal con el número celular. La actividad neutralizante de los anticuerpos se muestra como una inhibición de la proliferación de células M-NSF-60.. Los resultados muestran que la IC50 de heRXl-1-IgGl y heRXl-l-IgG4 fue aproximadamente la misma como el anticuerpo RXl murino recombinante de origen, en tanto que la IC50 de heRXl-l-IgG2 fue aproximadamente 2 veces a 4 veces mayor. La Tabla 12 más adelante muestra la IC50 relativa (en términos de pérdida en veces de IC50) de las varias construcciones de IgG2 preparadas como se describe anteriormente en el Ejemplo 4A. De estas construcciones, heRXl-l.G2 y heRXl-10.G2 mostraron la menor reducción en IC50.

Ejemplo 15 Este ejemplo muestra que los anticuerpos RXl humanos Engineered™ con diferentes regiones constantes de la subclase de IgG poseen diferentes actividades de TRAP en un ensayo de osteoclastogénesis ín vi tro. Las células CD34+ de médula ósea humanas (Biowhittaker número de catálogo 2M-101A, 3 x 105 células/frasco) se incubaron para diferenciarse en osteoclastos bajo las condiciones experimentales descritas en la presente. En el día 1, se descongelaron células CD34+ de un frasco congelado en 10 ml del medio (Alpha MEM con FCS al 10 %, 1 x Pen Estrep y lx fungizona) . Las células se lavaron una vez y se volvieron a suspender en 2 ml del medio y se colocaron en una placa de 96 cavidades a 100 µl por cavidad. En el Día 2, sin remover el medio original, 50 µl de CSF-1 4x a 30 ng/ml de concentración final y 50 µl de RANKL 4x (sRANKL, Chemicon catálogo # GF091, 10 µg/paquete) a una concentración final de 100 ng/ml se adicionó a cada cavidad. En el Día 7, se adicionaron 50 µl de RANKL 5x a concentración final de 100 ng/ml a cada cavidad. En el día 17, las células se tiñeron para actividad de TRAP (equipo de Fosfatasa Acida de Leucocito para tinción por TRAP Sigma, catálogo # 378-A) y se examinaron bajo el microscopio. Se adicionaron anticuerpos de neutralización de M-CSF en el día 2 del ensayo. Los anticuerpos inhibieron la diferenciación de osteoclastos de una manera dependiente de la dosis como se muestra en la Figura 28. La actividad inhibitoria de los anticuerpos en el ensayo de diferenciación de osteoclastos se muestra como carencia de osteoclastos visibles en el Día 17 del ensayo.

Ejemplo 16 Los anticuerpos RXl humanos Engineered™ con diferentes regiones constantes de la subclase IgG se caracterizaron adicionalmente. Los complejos antígeno-anticuerpo que los varios anticuerpos RXl humanos Engineered™ formaron con MCSF y se estudiaron al combinar M-CSF y el anticuerpo en amortiguador en relaciones molares iguales, seguido por análisis del tamaño del complejo antígeno-anticuerpo usando cromatografía de exclusión de tamaño o dispersión de luz. Los resultados mostraron que el RXl de origen murino pareció formar complejos 1:1 con MCSF de aproximadamente 200 kDa. Los anticuerpos he-RXl-9.G2 ó 1-10. G2 parecieron formar complejos 2:1 a 2:2 con MCSF de aproximadamente 400 KDa. El heRXl-lG.2 pareció formar grandes agregados reticulares con MCSF de más de 2 x 10s Da. Las construcciones de IgGl e IgG4 formaron complejos pequeños similares a aquel del RXl murino de origen. SDS-PAGE reductor y nó reductor desnaturalizante de heRXl-l.G4 mostró que la versión de IgG4 pareció formar medios anticuerpos, como se espera. Todas las patentes de los Estados Unidos, publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos, solicitudes de patente de los Estados Unidos, patentes extranjeras, solicitudes de patentes extranjeras y publicaciones no de patente, anteriores, referidas en esta especificación y/o listadas en la hoja de datos de la solicitud, se incorporan en la presente como referencia, en su totalidad. De lo anterior, será evidente que, aunque se han descrito en la presente modalidades específicas de la invención, para propósitos de ilustración, se pueden hacer varias modificaciones sin desviarse del espíritu y el alcance de la invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Anticuerpo no murino que compite con anticuerpo monoelonal RXl para la unión a M-CSF por más de 75 %, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal RXl comprende las • secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera expuestas en SEQ ID NOs : 2 y 4 , respectivamente . 2. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se une de manera específica al mismo epítope de M-CSF como el anticuerpo mónoclonal RXl, en donde el anticuerpo monoclonal RXl comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera expuestas en SEQ ID NOs: 2 y 4, respectivamente. 3. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque se une a un epítope de M-CSF que comprende al menos 4 residuos contiguos de SEQ ID NO: 120 o 121. 4. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque se une a un epítope de M-CSF que comprende SEQ ID NO: 120 o 121. 5. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal. 6. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo manejado, humano, un anticuerpo humano, o un anticuerpo de cadena individual . 7. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque es un anticuerpo de IgG. 8. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, o un fragmento Fv de cadena individual . . Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque retiene una Kd de afinidad (constante de equilibrio de disociación) con respecto a M-CSF de SEQ ID NO: 9 de al menos 10"7 M o mayor. 10. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque retiene una Kd de afinidad con respecto a M-CSF de SEQ ID NO: 9 de al menos 10" 8 M o mayor. 11. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque retiene una Kd de afinidad con respecto a M-CSF de SEQ ID NO: 9 de al menos 10" 5 M o mayor. 12. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos 90 % idéntica a SEQ ID NO: 24. 13. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende SEQ ID NO: 24. 14. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque comprende al menos 1 de SEQ ID NOs : 18, 21, 24, 29, 32, y 36. 15. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque comprende al menos 2 de SEQ ID NOs : 18, 21, 24, 29, 32, y 36. 16. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque comprende al menos 3 de SEQ ID NOs : 18, 21, 24, 29, 32, y 36. 17. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque comprende al menos 4 de SEQ ID NOs : 18, 21, 24, 29, 32, y 36. 18. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque comprende al menos 5 de SEQ ID NOs : 18, 21, 24, 29, 32, y 36. 19. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque comprende todas las SEQ ID NOs: 18, 21, 24, 29, 32, y 36. 20. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-18, caracterizado porque además comprende una o más de SEQ ID NOs: 16, 19, 22, 27, 30, y 3 . 21. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-18, caracterizado porque además comprende una o más de SEQ ID NOs: 17, 20, 23, 28, 31, y 35. 22. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-18, caracterizado porque además comprende una o más de SEQ ID NOs: 18, 21, 25, 29, 32, y 37. 23. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-18, caracterizado porque además comprende una o más CDR de consenso expuestas en SEQ ID NOs: 18, 21, 26, 29, 33, y 38. 24. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-23, caracterizado porque al menos un aminoácido dentro de una CDR está sustituido por un residuo correspondiente de una CDR correspondiente de otro anticuerpo 'anti-MCSF. 25. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-24, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de 'cadena ligera variable que es al menos 65 % homologa a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO : 4. 26. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-25, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que es al menos 65 % homologa a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2. 27. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque comprende una región constante de una secuencia de anticuerpo humano y una o más regiones de estructura variable de cadena pesada y ligera de una secuencia de anticuerpo humano . 28. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la secuencia de anticuerpo humano es una secuencia humana individual, una secuencia humana de consenso, una secuencia de línea germinal humana individual, o una secuencia de línea germinal humana de consenso. 29. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende un fragmento de una región constante de IgGl . 30. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque comprende una mutación en la región constante de IgGl que reduce la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo o actividad de citotoxicidad dependiente de complemento. 31. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende un fragmento de una región constante de IgG4. 32. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque comprende una mutación en la región constante de IgG4 que reduce la formación de medios anticuerpos . 33. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia " de aminoácidos XVXLXEXGXXXXXXXXXLXLXCXVXDYSITSDYAWNWIXQXXXXXLX MGYISYSGSTSX NXXLXXXIXIXRXXXXXXFXLXLXXVXXXDXAXYYCASFDYAHAMDYWGXGTXVXVXX, en donde X es cualquier aminoácido. 34. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos DVXLXEXGPXXVXPXXXLXLXCXVTDYSITSDYAWN IRQXPXXKLEWMGYISYSGSTSY NPSLKXRIXIXRXTXXNXFXLXLXXVXXXDXATYYCASFDYAHAMDY GXGTXVXVXX, en donde X es cualquier aminoácido. 35. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos XVQLQESGPGLVKPSQXLSLTCTVXDYSITSDYA NWIRQFPGXXLE MGYISYSGSTSY NPSLKSRIXIXRDTSKNQFXLQLNSVTXXDTAXYYCASFDYAHAMDY GQGTXVTVSS, en donde X es cualquier aminoácido. 36. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos DVQLQESGPGLVKPSQXLSLTCTVTDYSITSDYA N IRQFPGXKLE MGYISYSGSTSY NPSLKSRIXIXRDTSKNQFXLQLNSVTXXDTATYYCASFDYAHAMDYWGQGTXVTVSS, en donde X es cualquier aminoácido. 37. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTDYSITSDYA N IRQFPGKKLE MGYISYSGSTSY NPSLKSRITISRDTSKNQFSLQLNSVTAADTATYYCASFDYAHAMDYWGQGTTV TVSS . 38. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSDYSITSDYA N IRQFPGKGLE MGYISYSGSTSY NPSLKSRITISRDTSKNQFSLQLNSVTAADTAVYYCASFDYAHAMDY GQGTT VTVSS . 39. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos XIXLXQXXXXXXVXXXXXVXFXCXAXQSIGTSIH YXQXXXXXPXLLIKYASEXXXXIXX XFXGXGXGXXFXLXIXXVXXXDXADYYCQQINS PTTFGXGTXLXXXXX, en donde X es cualquier aminoácido. 40. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos XIXLXQXPXXLXVXPXXXVXFXCXASQSIGTSIHWYQQXTXXSPRLIIKYASEXISXIPX RFXGXGXGXXFXLXIXXVXXXDXADYYCQQINS PTTFGXGTXLCXXXXX, en donde X es cualquier aminoácido. 41. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos XLXLTQSPXXLSVSPGERVXFSCRASQSIGTSIH YQQXTXXXPRLLIKYASEXXXGIPX RFSGSGSGTDFTLXIXXVESEDXADYYCQQINSWPTTFGXGTKLEIKRX, en donde X es cualquier aminoácido. 42. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos XIXLTQSPXXLSVSPGERVXFSCRASQSIGTSIHWYQQXTXXSPRLLIKYASEXISGIPX RFSGSGSGTDFTLXIXXVESEDXADYYCQQINS PTTFGXGTKLEIKRX, en donde X es cualquier aminoácido. 43. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos XIXLTQSPXXLSVSPGERVXFSCRASQSIGTSIHWYQQXTXXXPRLLIKYASESISGIPX RFSGSGSGTDFTLXIXXVESEDXADYYCQQINS PTTFGXGTKLEIKRX, en donde X es cualquier aminoácido. 44. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos EIVLTQSPGTLSVSPGERVTFSCRASQSIGTSIH YQQKTGQAPRLLIKYASESISGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRVESEDFADYYCQQINSWPTTFGQGTKLEIKRT. 45. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos EIVLTQSPGTLSVSPGERVTFSCRASQSIGTSIH YQQKTGQAPRLLIKYASERATGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRVESEDFADYYCQQINS PTTFGQGTKLEIKRT. 46. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos EIVLTQSPGTLSVSPGERVTFSCRASQSIGTSIH YQQKTGQSPRLLIKYASERISGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRVESEDFADYYCQQINS PTTFGQGTKLEIKRT . 47. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-46, caracterizado porque al menos una X es la misma como un aminoácido en la misma posición correspondiente en SEQ ID NOs : 2 o 4 usando numeración de Kabat. 48. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-46, caracterizado porque al menos una X es una sustitución conservadora de un aminoácido en la misma posición correspondiente en SEQ ID NOs : 2 o 4 usando numeración de Kabat . 49. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-46, caracterizado porque al menos una X es una sustitución no conservadora de un aminoácido en la misma posición correspondiente en SEQ ID NOs : 2 o 4 usando numeración de Kabat. 50. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-46, caracterizado porque al menos una X es un aminoácido en la misma posición correspondiente con una secuencia de anticuerpo humano, usando numeración de Kabat. 51. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-46, caracterizado porque al menos una X es un aminoácido en la misma posición correspondiente dentro de una secuencia de anticuerpo de consenso humano, usando numeración de Kabat. 52. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la secuencia de anticuerpo humano es una secuencia de consenso humana, una secuencia de línea germinal humana, una secuencia de línea germinal de consenso humana, o cualquiera de las secuencias de anticuerpo humano en Kabat . 53. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada expuestas en SEQ ID NOS: 114, 116, o 119. 54. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende cualquiera de las secuencias de región variable de cadena pesada expuestas en SEQ ID NOS: 41 o 43. 55. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende cualquiera de las secuencias de cadena ligera expuestas en SEQ ID NOS: 45, 47, 48, 51, 53 o 136. 56. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la secuencia de cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 114 y la secuencia de cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 47. 57. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la secuencia de cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 116 y la secuencia de cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 47. 58. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la secuencia de cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 119 y la secuencia de cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 47. 59. Anticuerpo de conformidad con cualcjuiera de las reivindicaciones 33-46, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que es al menos 65 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NOS: 41 O 43. 60. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que es al menos 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NOs : 41 o 43. 61. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-46, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que es al menos 65 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NOs : 45, 47, 48, 51, o 53. 62. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que es al menos 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NOs : 45, 47, 48, 51, o 53. 63. Anticuerpo, caracterizado porque comprende una cadena pesada como se expone en cualquiera de las reivindicaciones 33-38, 53 o 59-60 y una cadena ligera como se expone en cualquiera de las reivindicaciones 39-46, 54 o 61-62. 64. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-63, caracterizado porque tiene una Kd de afinidad de al menos 10"7. 65. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque tiene una Kd de afinidad de al menos 10"9. 66. Ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena ligera del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-65. 67. Ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico de cadena pesada que es al menos 65 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs : 40 o 42. 68. Ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico de cadena pesada que es al menos 80 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs : 40 o 42. 69. Ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 66 , caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico de cadena ligera que es al menos 65 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NOs : 44, 46, 52, 135, o 137. 70. Ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico de cadena ligera que es al menos 80 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NOs : 44, 46, 52, 135, o 137. 71. Vector, caracterizado porque comprende el ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-70. 72. Vector de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el ácido nucleico aislado está enlazado operablemente a una secuencia de control reguladora . 73. Célula hospedadora, caracterizado porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 72 o el ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-70. 74. Método para producir un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-65, caracterizado porque comprende cultivar una célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 73 tal que el ácido nucleico aislado se exprese para producir el anticuerpo . 75. Método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque además comprende el paso de recuperar el anticuerpo del cultivo de célula hospedadora. 76. Anticuerpo aislado, caracterizado porque se produce por el método de conformidad con reivindicación 75. 77. Hibridoma o célula hospedadora, caracterizada porque segrega un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5. 78. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-65 o 76, caracterizado porque está conjugado a una toxina . 79. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende cualquiera de los anticuerpos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-65 o 76, y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. 80. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque además comprende un segundo agente terapéutico. 81. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada porque el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico de cáncer. 82. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada porque el segundo agente terapéutico es un bisfosfonato. 83. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 82, caracterizada porque el bisfonato es zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato, o ibandronato. 84. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada porque el segundo agente terapéutico es otro anticuerpo. 85. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-41 o 50, caracterizado porque se une a M-CSF para prevenir a un sujeto afligido con una enfermedad que provoca o contribuye a osteólisis, en donde el anticuerpo reduce de manera efectiva la severidad de la pérdida ósea asociada con la enfermedad. 86. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-65 o 76, caracterizado porque se une a M-CSF para tratar un sujeto afligido o con una enfermedad que provoca o contribuye a osteólisis, en donde el anticuerpo reduce de manera efectiva la severidad de la pérdida ósea asociada con la enfermedad. 87. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de enfermedades metabólicas de hueso asociadas con actividad relativamente incrementada de osteoclastos, incluyendo endocrinopatías (incluyendo ~ ' hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatiroidismo primario o secundario, hipertiroidismo) , hipercalcemia, estados de deficiencia (incluyendo raquitismos/osteomalasia, escorbuto, desnutrición) , enfermedades crónicas (incluyendo síndrome de malabsorción, falla renal crónica (incluyendo osteodistrofia renal) , enfermedad hepática crónica (incluyendo osteodistrofia hepática) ) , fármacos (incluyendo glucocorticoides (osteoporosis inducida por glucocorticoides) , heparina, alcohol) , y enfermedades hereditarias (incluyendo osteogénesis imperfecta, hqmocistinuria) , cáncer, osteoporosis, osteoporosis, inflamación de hueso asociada con artritis y artritis reumatoide, enfermedad periodontal, displasia fibrosa y/o enfermedad de Paget. 88. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-65 o 76, caracterizado porque se une a M-CSF para prevenir o tratar cáncer metastático a hueso, en donde el cáncer metastático es cáncer de mama, pulmón, renal, mieloma múltiple, tiroides, próstata, adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, incluyendo leucemia o linfoma; cánceres de cabeza o cuello; cánceres gastrointestinales, incluyendo cáncer esofágico, cáncer estomacal, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer pancreático, cáncer hepático, cáncer del conducto biliar o vejiga biliar; malignidades del tracto genital femenino, incluyendo carcinoma ovárico, cánceres endometriales uterinos, cáncer vaginal, o cáncer cervical; cánceres de vejiga, cáncer de cerebro, incluyendo neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma; o cáncer de piel, incluyendo melanoma maligno o cáncer de células escamosas . 89. Método para prevenir o reducir pérdida ósea, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto afligido con una enfermedad que provoca o contribuye a osteólisis una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 65 o 76, en una cantidad efectiva para prevenir o reducir pérdida ósea asociada con la enfermedad. 90. Método para tratar un sujeto afligido con una enfermedad que provoca o contribuye a osteólisis, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 65 o 76, en una cantidad efectiva para reducir la severidad de la pérdida ósea asociada con la enfermedad. 91. Método de conformidad con la reivindicación 89 o 90, caracterizado porque la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de enfermedades metabólicas óseas asociadas con actividad relativamente incrementada de osteoclastos, que incluyen endocrinopatías (incluyendo hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatiroidismo primario o secundario, hipertiroidismo) , hipercalcemia, estados de deficiencia (incluyendo raquitismos/osteomalasia, escorbuto, desnutrición) , enfermedades crónicas (incluyendo síndrome de malabsorción, falla renal crónica (incluyendo osteodistrofia renal) , enfermedad hepática crónica (incluyendo osteodistrofia hepática) ) , fármacos (incluyendo glucocorticoides (osteoporosis inducida por glucocorticoides) , heparina, alcohol) , . enfermedades hereditarias (incluyendo osteogénesis imperfecta, homocistinuria) , cáncer, osteoporosis, osteoporosis, inflamación de hueso asociada con artritis y artritis reumatoide, enfermedad periodontal, displasia fibrosa y/o enfermedad de Pager. 92. Método para prevenir o tratar cáncer metastático a hueso, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto afligido con cáncer metastático una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-65 o 76. 93. Método de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque el cáncer metastático es cáncer de mama, pulmón, renal, mieloma múltiple, tiroides, próstata, adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, incluyendo leucemia o linfoma; cánceres de cabeza y cuello; cánceres gastrointestinales, incluyendo cáncer esofágico, cáncer estomacal, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer pancreático, cáncer hepático, cáncer del conducto biliar o vejiga biliar; malignidades del tracto genital femenino, incluyendo carcinoma ovárico, cánceres endometriales uterinos, cáncer vaginal, o cáncer cervical; cánceres de vejiga, cáncer de cerebro, incluyendo neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma; o cáncer de piel, incluyendo melanoma maligno o cáncer de células escamosas . 94. Método para tratar cáncer, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo, cantidades terapéuticamente efectivas de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-65 o 76. 95. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 89-94, caracterizado porque además comprende administrar un segundo agente terapéutico. 96. Método de conformidad con la reivindicación 95, caracterizado porque el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico de cáncer. 97. Método de conformidad con la reivindicación 95, caracterizado porque el segundo agente terapéutico es un factor de no estimulación de colonias de M-CSF, o un anticuerpo anti-RANKL, o un receptor soluble de RANKL. 98. Método de conformidad con la reivindicación 95, caracterizado porcjue el segundo agente terapéutico es un bisfosfonato. 99. Método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque el bisfonato es zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato, o ibandronato. 100. Método de conformidad con la reivindicación 98 o 99, caracterizado porque el sujeto está imposibilitado" de recibir tratamiento de bisfosfonato. 101. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 95-100, caracterizado porque el anticuerpo es efectivo para reducir la dosis del segundo agente terapéutico, requerida para lograr un efecto terapéutico. 102. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 89-101, caracterizado porque el sujeto es un mamífero. 103. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 89-101, caracterizado porque el anticuerpo se administra en una cantidad efectiva para inhibir proliferación de osteoclastos y/o diferenciación inducida por células de tumor. 104. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 89-103, caracterizado porque el anticuerpo se administra a una dosis de entre aproximadamente 2 µg/kg a 30 mg/kg de peso corporal. 105. Método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque el anticuerpo se administra a una dosis entre aproximadamente 0.1 mg/kg a 30 mg/kg de peso corporal . 106. Método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque el anticuerpo se administra a una dosis de entre aproximadamente 0.1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal . 107. Uso del anticuerpo de cualquiera de" las reivindicaciones 1 hasta 65 o 76, en la elaboración de un medicamento para prevenir o reducir pérdida ósea en un paciente que presenta osteólisis. 108. Uso del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 65 o 76, en la elaboración de un medicamento para txatar un paciente afligido con una enfermedad que provoca o contribuye a osteólisis; 109. Uso de conformidad con la reivindicación 108, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de enfermedades metabólicas óseas asociadas con actividad relativamente incrementada de osteoclastos, incluyendo endocrinopatías (incluyendo hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatiroidismo primario o secundario, hipertiroidismo) , hipercalcemia, estados de deficiencia (incluyendo raquitismos/osteomalasia, escorbuto, desnutrición) , enfermedades crónicas (incluyendo síndrome de malabsorción, falla renal crónica (incluyendo osteodistrofia renal) , enfermedad hepática crónica (incluyendo osteodistrofia hepática) ) , fármacos (incluyendo glucocorticoides (osteoporosis inducida por glucocorticoides) , heparina, alcohol) , y enfermedades hereditarias (incluyendo osteogénesis imperfecta, homocistinuria) , cáncer, osteoporosis, osteoporosis, inflamación de hueso asociada con artritis y artritis reumatoide, enfermedad periodontal, displasia fibrosa y/o enfermedad de Paget . 110. Uso del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 65 o 76, en la elaboración de un medicamento para prevenir o tratar cáncer metastático a hueso en un paciente que sufre de cáncer metastático. 111. Uso de conformidad con la reivindicación 110, en donde el cáncer metastático es cáncer de mama, pulmón, renal, mieloma múltiple, tiroides, próstata, adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, incluyendo leucemia o linfoma; cánceres de cabeza y cuello; cánceres gastrointestinales, incluyendo cáncer esofágico, cáncer estomacal, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer pancreático, cáncer hepático, cáncer del conducto biliar o vejiga biliar; malignidades del tracto genital femenino, incluyendo carcinoma ovárico, cánceres endometriales uterinos, cáncer vaginal, o cáncer cervical; cánceres de vejiga, cáncer de cerebro, incluyendo neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma; o cáncer de piel, incluyendo melanoma maligno o cáncer de células escamosas . 112. Uso del anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 hasta 65 o 76, en la elaboración de un medicamento para tratar un paciente que tiene cáncer. 113. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 107-112, en donde el medicamento se coordina con tratamiento usando un segundo agente terapéutico. 114. Uso de conformidad con la reivindicación 113 , en donde el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico de cáncer. 115. Uso de conformidad con la reivindicación 113 , en donde el segundo agente terapéutico es un factor de no estimulación de colonias de M-CSF, o un anticuerpo anti-RANKL, o un receptor soluble de RANKL. 116. Uso de conformidad con la reivindicación 113, en donde el segundo agente terapéutico es un bisfosfonato. 117. Uso de conformidad con la reivindicación 116, en donde el bisfonato es zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato, o ibandronato . 118. Uso de conformidad con la reivindicación 116 o 117, en donde el paciente está imposibilitado de recibir tratamiento de bisfosfonato. 119. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 107-112, en donde el paciente se ha pretratado con el segundo agente terapéutico. 120. Uso de conformidad con la reivindicación 119, en donde el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico de cáncer . 121. Uso de conformidad con la reivindicación 119, en donde el segundo agente terapéutico es un factor de no estimulación de colonias de M-CSF, o un anticuerpo anti-RANKL o un receptor soluble de RANKL. 122. Uso de conformidad con la reivindicación 119, en donde el segundo agente terapéutico es un bisfosfonato . 123. Uso de conformidad con la reivindicación 122, en donde el bisfonato es zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato, o ibandronato. 124. Uso de conformidad con la reivindicación 122 o 123, en donde el paciente está imposibilitado de recibir tratamiento de bisfosfonato. 125. Uso de una combinación sinérgica del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 65 o 76, para la preparación de un medicamento para tratamiento de un paciente que presenta osteólisis en donde el medicamento se coordina con tratamiento usando un segundo agente terapéutico. 126. Uso de conformidad con la reivindicación 125, en donde el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico de cáncer. 127. Uso de conformidad con la reivindicación 125, en donde el segundo agente terapéutico es un factor de no estimulación de colonias de M-CSF, o un anticuerpo anti-RANKL o un receptor soluble de RANKL. 128. Uso de conformidad con la reivindicación 125, en donde el segundo agente terapéutico es un bisfosfonato. 129. Uso de conformidad con la reivindicación 125, en donde el bisfonato es zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato, o ibandronato . 130. Uso de conformidad con la reivindicación 128 o 129, en donde el paciente está imposibilitado de recibir tratamiento de bisfosfonato. 131. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 113-130, en donde la cantidad de anticuerpo en el medicamento está a una dosis efectiva para reducir la dosis del segundo agente terapéutico requerida para lograr un efecto terapéutico. 132. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 107-139, en donde la cantidad de anticuerpo en el medicamento es efectiva para inhibir la proliferación y/o diferenciación de osteoclastos inducida por células de tumor . 133. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 89-103, en donde la cantidad del anticuerpo en el medicamento está a una dosis entre aproximadamente 2 µg/kg a 30 mg/kg de peso corporal. 134. Uso de conformidad con la reivindicación 104, en donde la cantidad del anticuerpo en el medicamento está a una dosis entre aproximadamente 0.1 mg/kg a 30 mg/kg de peso corporal . 135. Uso de conformidad con la reivindicación 105, en donde la cantidad de anticuerpo en el medicamento está a una dosis entre aproximadamente 0.1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal . 136. Kit, caracterizado porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 65 o 76, envasado en un recipiente, tal como un frasco o botella, y que comprende además una etiqueta unida a o envasada con el recipiente, la etiqueta que describe los contenidos del recipiente que proporciona indicaciones y/o instrucciones con respecto al uso de los contenidos del recipiente para prevenir o reducir la pérdida ósea. 137. Kit, caracterizado porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 65 o 76, envasado en un recipiente, tal como un frasco o botella, y que comprende además una etiqueta unida a o envasada con el recipiente, la etiqueta que describe los contenidos del recipiente que proporciona indicaciones y/o instrucciones con respecto al uso de los contenidos del recipiente a un paciente afligido con una enfermedad que provoca o contribuye a osteólisis. 138. Kit de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de enfermedades metabólicas de hueso asociadas con actividad relativamente incrementada de osteoclastos, incluyendo endocrinopatías (incluyendo hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatiroidismo primario o secundario, hipertiroidismo) , hipercalcemia, estados de deficiencia (incluyendo raquitismos/osteomalasia, escorbuto, desnutrición) , enfermedades crónicas (incluyendo síndrome de malabsorción, falla renal crónica (incluyendo osteodistrofia renal) , enfermedad hepática crónica (incluyendo osteodistrofia hepática) ) , fármacos (incluyendo glucocorticoides (osteoporosis inducida por glucocorticoides) , heparina, alcohol) , y enfermedades hereditarias (incluyendo osteogénesis imperfecta, homocistinuria) , cáncer, osteoporosis, osteoporosis, inflamación de hueso asociada con artritis y artritis reumatoide, enfermedad periodontal, displasia fibrosa y/o enfermedad de Paget . 139. Kit, caracterizado porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 65 o 76, envasado en un recipiente, tal como un frasco o botella, y que comprende además una etiqueta unida a o envasada con el recipiente, la etiqueta que describe los contenidos del recipiente y que proporciona indicaciones y/o instrucciones con respecto al uso de los contenidos del recipiente para prevenir o tratar cáncer metastático a hueso. 140. Kit de conformidad con la reivindicación 139, caracterizado porque el cáncer metastático es cáncer de mama, pulmón, renal, mieloma múltiple, tiroides, próstata, adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, incluyendo leucemia o linfoma; cánceres de cabeza y cuello; cánceres gastrointestinales, incluyendo cáncer esofágico, cáncer estomacal, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer pancreático, cáncer hepático, cáncer del conducto biliar o vejiga biliar; malignidades del tracto genital femenino, incluyendo carcinoma ovárico, cánceres endometriales uterinos, cáncer vaginal, o cáncer cervical; cánceres de vejiga, cáncer de cerebro, incluyendo neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma; o cáncer de piel, incluyendo melanoma maligno o cáncer de células escamosas .. 141. Kit, caracterizado porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 65 o 76, envasado en un recipiente, tal como un frasco o botella, y que comprende además una etiqueta unida a o envasada con el recipiente, la etiqueta que describe los contenidos del recipiente y que proporciona indicaciones y/o instrucciones con respecto al uso de los contenidos del recipiente para tratar cáncer. 142. Kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 136-141, caracterizado porque además comprende un segundo agente terapéutico. 143. Kit de conformidad con la reivindicación 142, caracterizado porque el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico de cáncer. 144. Kit de conformidad con la reivindicación 142, caracterizado porque el segundo agente terapéutico es un factor de no estimulación de colonias de M-CSF, o un anticuerpo anti-RANKL o un receptor soluble de RANKL. 145. Kit de conformidad con la reivindicación 142, caracterizado porque el segundo agente terapéutico es un bisfosfonato . 146. Kit de conformidad con la reivindicación 145, caracterizado porque el bisfonato es zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato, o ibandronato. 147. Kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 136-146, caracterizado porque incluye instrucciones para tratar un paciente imposibilitado de recibir tratamiento de bisfosfonato. 148. Kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 136-147, caracterizado porque comprende una dosis de anticuerpo efectiva para reducir la dosis del segundo agente terapéutico requerida para lograr un efecto terapéutico. 149. Kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 136-147, caracterizado porque comprende una dosis sinérgica de anticuerpo. 150. Kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 136-147, caracterizado porque comprende una dosis de anticuerpo efectiva para inhibir la proliferación y/o diferenciación de osteoclastos inducida por células de tumor . 151. Kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 136-147, caracterizado porque comprende una dosis de anticuerpo de entre aproximadamente 2 µg/kg a 30 mg/kg de peso corporal . 152. Kit de conformidad con la reivindicación 151, caracterizado porque comprende una dosis de anticuerpo entre aproximadamente 0.1 mg/kg a 30 mg/kg de peso corporal. 153. Kit de conformidad con la reivindicación 152, caracterizado porque comprende una dosis de anticuerpo entre aproximadamente 0.1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal. 154. Método para detectar un anticuerpo específico de M-CSF, caracterizado porque comprende los pasos de: a) poner en contacto el medio de células tumorales metastáticas, osteoclastos y un anticuerpo candidato; b) detectar la formación, proliferación y/o diferenciación de osteoclastos; y c) identificar el anticuerpo candidato como un anticuerpo específico de M-CSF si se detecta una disminución en la formación, proliferación y/o diferenciación de osteoclastos . 155. Método de detección de conformidad con la reivindicación 154, caracterizado porque el medio de células tumorales metastáticas incluye células tumorales . 156. Método de detección de conformidad con la reivindicación 154, caracterizado porque el paso de puesta en contacto (a) se presenta in vivo, el paso de detección (b) comprende detectar el tamaño y/o el número de metástasis de hueso, y el anticuerpo candidato se identifica como un anticuerpo específico de M-CSF si se detecta una disminución en el tamaño y/o número de metástasis de hueso. 157. Método de detección de conformidad con la reivindicación 154-156, caracterizado porque además comprende el paso de determinar si el anticuerpo candidato se une a M-CSF. 158. Método de detección de conformidad con la reivindicación 154-157, caracterizado porque además comprende el paso de determinar si el anticuerpo candidato inhibe la interacción entre M-CSF y su receptor M-CSFR. 159. Método para identificar un anticuerpo específico de M-CSF que puede prevenir o tratar cáncer metastático a hueso, caracterizado porque comprende los pasos de : a) determinar la unión de un anticuerpo candidato a un epítope de M-CSF que incluye al menos 4 residuos contiguos de SEQ ID NOs: 120 o 121; y b) valorar la capacidad del anticuerpo candidato para prevenir o tratar cáncer metastático a hueso in vitro o in vivo . 160. Método para alterar sistemáticamente hasta 60 % de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 2, caracterizado porque comprende alterar cualquier X en la secuencia de aminoácidos XVXLXEXGXXXXXXXXXLXLXCXVXDYSITSDYAN IXQXXXXXLX MGYISYSGSTSX NXXLXXXIXIXRXXXXXXFXLXLXXVXXXDXAXYYCASFDYAHAMDY GXGTXVXVXX, y probar un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos alterada para la unión a un epítope de M-CSF que incluye al menos 4 aminoácidos contiguos de SEQ ID NOS: 120 o 121. 161. Método para alterar sistemáticamente hasta 60 % de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 4, caracterizado porque comprende alterar cualquier X en la secuencia de aminoácidos XIXLXQXXXXXXVXXXXXVXFXCXAXQSIGTSIH YXQXXXXXPXLLIKYASEXXXXIXX XFXGXGXGXXFXLXIXXVXXXDXADYYCQQINS PTTFGXGTXLXXXXX, y probar un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos alterada para la unión a un epítope de M-CSF que incluye al menos 4 aminoácidos contiguos de SEQ ID NOS: 120 o 121.