MXPA05007267A

MXPA05007267A - Producto de leche fermentada que comprende tripeptidos val-pro-pro (vpp) e ile-pro-pro (ipp).

Info

Publication number: MXPA05007267A
Application number: MXPA05007267A
Authority: MX
Inventors: Schalk Johannes
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 2003-01-06
Filing date: 2003-12-03
Publication date: 2005-09-08
Also published as: US20060246178A1; AU2003296605B2; ZA200504572B; WO2004060073A1; EA200501093A1; EP1581062A1; PL378232A1; AR042703A1; CN1735347A; JP2006512912A; CA2509627A1; CL2004000014A1; BR0316782A; AU2003296605A1

Abstract

La invencion se relaciona con el producto de leche fermentada que comprende una cantidad de tripeptidos VIP y/o IPP expresada como concentracion IPP equivalente [IPPeq] de 145 M o mas que comprende 40-600 mmol/kg K+ y/o Ca2+ y/o 6-50 mmol/kg Mg2+.

Description

PRODUCTO DE LECHE FERMENTADA QUE COMPRENDE TRIPEPTIDOS VAL-PRO-PRO (VPP) E ILE-PRO-PRO (IPP) Campo de la Invención La presente invención se relaciona con el producto de leche fermentada que comprende tripeptidos VPP y/o IPP. La invención adicionalmente se relaciona con el proceso para la preparación de tal producto de leche fermentada y a productos alimenticios producidos usando el producto de leche fermentada. Antecedentes de la Invención La hipertensión o presión sanguínea alta se considera ser uno de los principales factores de riesgo para Enfermedades Cardiovasculares (CVD, por sus siglas en inglés) . Uno de los mecanismos que regula la presión sanguínea es el sistema renina-angiotensina . Este es una cascada de reacciones que conducen a la formación de agiotensina II, la cual tiene un fuerte efecto vasoconstrictor y en consecuencia incrementa la presión sanguínea. Inhibición de una de las enzimas clave en esta cascada es: Enzima de Conversión Angiotensina I (ACE, por sus siglas en inglés) reduce la formación de angiotensina II y así tiene efecto de bajar la presión sanguínea. Estudios de intervención humana de período largo han mostrado que la toma regular de bajas cantidades de inhibidores ACE reduce CVD por 25% (Gerstein et al. (2000 ) , The Lancet 355 , 253-259 ) .

REF: 164647 Un producto de leche fermentada .disponible comercialmente, el cual se afirma ser "apropiado para aquellos con hipertensión media" es leche agria Calpis, fermentada con Lactobacillus helveticus y Saccharomyces cerevisiae, producida por Calpis Food Industry, Japón. Otro producto de leche fermentada disponible comercialmente es Evolus producido por Valió, Finlandia, el cual se afirma ser lel primer alimento funcional Europeo para ayudar a bajar la presión sanguínea' . Ambos productos de leche fermentada se fermentan con cepas de Lactobacillus helveticus (Lb. helveticus) . Los productos contienen péptidos bio-activos responsables de inhibición ACE in vitro, lo cual se produce por proteólisis de caseínas. Comparada con otra bacteria de ácido láctico Lb. helveticus es una de las especies de Lactobacillus proteolítico más eficiente. La descomposición de las caseínas por el sistema proteolítico de bacteria de ácido láctico puede dividirse en tres etapas . Inicialmente la descomposición de caseína se realiza por proteinasas (endopeptidasas) extracelulares , seguida por la toma de di/tri péptidos y oligopeptidos (4 a 12 residuos ácidos amino) usando mecanismos de toma específicos. En la última etapa, los péptidos se degradan adicionalmente por peptidasas intracelulares, produciendo pequeños péptidos y aminoácidos para crecimiento bacterial. Este complicado sistema proteolítico de bacteria de ácido láctico se describe en Kunji et al., (1996), Microbiología Molecular 27, 1107-1118. Una revisión sobre el sistema de peptidasa intracelular puede encontrase en Christensen et al, (1999), Microbiología Molecular 76, 217-246. EP-A-0737690 describe el agente antihiperténsico que comprende una cantidad efectiva de péptidos que contienen la secuencia de aminoácidos Lys Val Leu Pro Val Pro Gln y/o Tyr lys Val Pro Gln Leu y el proceso para preparar tal agente usando proteinasa (endopeptidasa) producida por bacteria de ácido láctico. En la página 3, se describe que para incrementar la producción de proteinasa dirigida el pH debería estar en rango neutro, esto es en el rango de 5 a 8. De conformidad con EP-A-1016709, se desea producir leche fermentada con contenido más alto de lactotripéptidos comparado con el contenido de ácido láctico generado en leche fermentada. Este proporciona la cepa de Lactobacillus helveticus CM4 que en fermentación proporciona 30-50 \ig de tripéptidos Val-Pro-Pro (VPP) e Ile-Pro-Pro (IPP) por O.lg de ácido láctico-DL. En la tabla 2 de EP-A-1016709 se muestra que estas cepas producen 38.5 g/ml suero de VPP y 23.5 g/ml suero IPP, lo cual corresponde al valor IPPeq, como se define a continuación, de 140 µ?. Sumario de la Invención Es el objeto de la presente invención proporcionar el producto de leche fermentada que tiene contenido más alto de tripéptidos VPP y/o IPP. Es otro objeto de la invención proporcionar el producto de leche fermentada, que cuando se usa en el producto alimenticio, tenga buen sabor. Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar el producto de leche fermentada que muestre efecto mejorado para bajar la presión sanguínea . Uno o más de estos objetos se logran de conformidad con la invención, la cual proporciona el proceso para la preparación del producto de leche fermentada, en donde la fermentación se controla agregando la base en tal cantidad que el pH durante parte sustancial de la fermentación es 4 .3-5 . 9 . Esta invención adicionalmente se relaciona con el producto de leche fermentada que comprende la cantidad de tripéptidos VPP y/o IPP expresada como concentración IPP equivalente [IPPeq] de 145 µ o más, que puede obtenerse de conformidad con el proceso de la invención, comprendiendo 40-600 mmol/kg K+ y/o 30-400 mmol/kg Ca2+ y/o 6-50 mmol/kg Mg2+. Descripción Detallada de la Invención Las cantidades proporcionadas se expresarán relativo al peso total del producto alimenticio o producto de leche fermentada, a menos que se indique lo contrario. Lactobacillus en el presente documento se abrevia como Lb. El péptido Val-Pro-Pro se abrevia como VPP y el péptido Ile-Pro-Pro como IPP. Tripéptidos VPP y/o IPP cornos se definen en el presente documento incluyen VPP, IPP y péptidos que contienen 3-25 residuos aminoácidos incluyendo la secuencia VPP y/o IPP, y mezclas de estos péptidos. La cantidad molar total de tripéptidos VPP y/o IPP en mezclas se calculan en el presente documento agregando cantidades molares de tripéptidos en la mezcla. La fermentación de conformidad con la invención produce los tripéptidos activos VPP e IPP, los cuales tienen actividad diferente. El IC50, la concentración del cual resulta en inhibición del 50% de la actividad ACE, es 5 µ? para IPP y 9 µ? para VPP (Kohmura, M. Et al. (1990), Química Agrícola y Bioquímica, 54, 835-836 y Nakamura, Y. et al (1995), J Dairy Sci. 78, 1253-1257) . Para expresar la concentración total de estos péptidos activos en la figura individual, la concentración IPP equivalente ( [IPPeq] como se usa en el presente documento, la cual se define a continuación, y preferiblemente expresada en µ?: [IPPeq] = [IPP] + 5/9* [VPP] (1) Los productos alimenticios de conformidad con la invención se definen como productos, apropiados para consumo humano, en el cual el producto de leche fermentada de conformidad con la invención se usó como ingrediente en una cantidad efectiva, tal que se obtiene el efecto inhibidor-ACE notable. El material inicial de leche puede ser cualquier leche, mientras que contenga proteína comprendiendo la secuencia de aminoácido VPP y/o IPP. Leche de animal tal como leche de vaca, leche de cabra, leche de camello, leche de caballo , puede usarse como material inicial . Puede usarse leche descremada. El contenido de sólido en el material inicial de leche no está particularmente limitado, pero es usualmente 5 a 20% en peso. El material inicial de leche puede ser leche reconstituida preparada mezclando agua e ingredientes de leche, por ejemplo leche en polvo (descremada) . El material inicial de leche puede contener aditivos, tales como carbohidratos, etc. mientras que estos aditivos no interfieran con la fermentación. La fermentación del material inicial de leche puede ejecutarse en fermentadores convencionales, en los cuales el material inicial de leche como medio es inoculado con Lb. helveticus. Lb. helveticus puede ser cualquier cepa Lb. helveticus. Cepas preferidas son aquellas que producen altas cantidades de tripéptidos VPP y/o IPP. La más preferida es cepa de Lactobacillus helveticus CNRZ 244, depositada en el Centro Nacional de Investigaciones Zootécnicas, Jouy-en-Josas, Francia. Pueden agregarse opcionalmente otros microorganismos al medio de fermentación mientras que se logre el objeto de la presente invención. Por ejemplo, puede usarse adicionalmente levadura para mejorar el sazón y buen sabor del producto de leche fermentada resultante. Cepas de levadura no están particularmente limitadas, y por ejemplo, levadura del género Saccharomyces tal como Saccharomyces cerevisiae puede usarse preferiblemente. El contenido de levadura puede seleccionarse apropiadamente, dependiendo del resultado deseado. No existe limitación particular de la cantidad de Lb. helveticus con la cual el medio es inoculado. La cantidad de inoculación es usualmente aproximadamente 107 a 109 células de bacteria Lb. helveticus. Lb. helveticus puede agregarse a la fermentación preferiblemente en la forma de iniciador precultivado que tiene suficiente actividad. La cuenta de células iniciales del iniciador es preferiblemente aproximadamente 107 a 109 células/mi . Los materiales en el fermentador, incluyendo Lb. helveticus inoculo y el material inicial de leche, pueden mezclarse de manera convencional, para lograr el medio de fermentación homogéneo . La fermentación puede realizarse venta osamente desde 25 hasta 502C y preferiblemente desde 30 hasta 45SC, durante 6 a 100 horas y preferiblemente 15 a 50 horas.

Preferiblemente la temperatura de fermentación es 38-422C, puesto que en este rango de temperatura se forma la cantidad más alta de tripéptidos VPP y/o IPP. Hemos encontrado que el pH durante la fermentación es crítico así como la cantidad formada de tripéptidos VPP y/o IPP. Preferiblemente por lo tanto, la fermentación se controla agregando la base en tal cantidad que el pH durante parte sustancial de la fermentación es 4.3-5.9. El pH durante parte sustancial de la fermentación es 4.3-4.9, más preferiblemente 4.4-4.8 y más preferiblemente 4.5-4.7. Parte sustancial de la fermentación significa en este contexto al menos 1 hora o más del tiempo de fermentación. Preferiblemente el pH durante la fermentación se controla durante 3 horas o más del tiempo de fermentación, más preferiblemente 5 horas o más. El pH puede controlarse por adición de la base (o amortiguador) al medio de fermentación. La base puede ser cualquier base apropiada para uso en la preparación de productos alimenticios . Tal fermentación controlada se nombra en el presente documento fermentación con pH controlado. Sin control de pH se nombra en el presente documento fermentación de acidificación libre. Preferiblemente, la base tiene K+ iones y el pH durante parte sustancial de la fermentación es 4.9-5.5. Alternativamente, en una modalidad preferida, la base tiene Ca2+ iones y el pH durante parte sustancial de la fermentación es 4.3-4.9. La combinación de base que contiene los iones K+, Ca2+ y/o Mg2+ se prefiere especialmente. Durante la fermentación, Lb. helveticus produce entre otros ácido láctico. El ácido láctico (HLa o LaH) se disocia en el protón, H+, y el anión de lacto , La- (algunas veces preferido en presente documento como lacto sal disuelta cuando está presente otra fuente de catión, típicamente desde la base o sal intermediaria) . La cantidad de disociación se relaciona con el pH de la solución y el Pka de ácido láctico. El pKa de ácido láctico a 252C es 3.86 (a 50SC es aproximadamente 3.89). La ecuación (2) a continuación describe cómo se relacionan pH, pKa, y el grado de disociación de ácido láctico . PH = pKa + log ( [La"] / [LaH] ) La ecuación (2) muestra que la mitad del ácido se disocia cuando el pH iguala el pKa del ácido. A valores de pH mayores, mayor parte del ácido láctico está en la forma de lacto de anión. Si el extracto de fermentación tiene el valor de pH entre 3.0 y 4.5, habrá una cantidad significativa de ácido láctico en la forma no disociada. De hecho con pH de 3.0 el índice molar de ácido láctico libre (no disociado) para el ión de lacto a 25SC es aproximadamente 7.0; y, con pH de aproximadamente 4.5 el índice a 252C, es aproximadamente 0.23. El protocolo preferido para la fermentación con pH controlado se ejecuta como sigue: Después de inoculación (1) la fermentación de acidificación libre hasta el pH deseado se alcanza (en el rango de 4.3-4.9), subsecuentemente (2) la fermentación con pH controlado y opcionalmente (3) subsecuentemente la segunda fermentación libre de acidificación hasta la terminación, por ejemplo con pH de 3.5-4.0. Como resultado de este protocolo puede producirse una cantidad más alta de IPP equivalente, mientras se mantiene el nivel de sales relativamente bajo en el producto de leche fermentad . Preferiblemente la base es sal de metal, metal el cual es común en alimentos, pero no incrementa la presión sanguínea. Preferiblemente la base es un hidróxido. La base que contiene sodio, tal como hidróxido de sodio, por lo tanto se excluye preferiblemente. Más Preferiblemente la base es una sal elegida del grupo que consiste de sal cálcica, sal potásica y/o sal de magnesio . Los iones de metal de tal base K+, Ca2+ y/o Mg2+, los cuales como resultado de la fermentación con pH controlado se convierten en parte del producto de leche fermentada, pueden disminuir la presión sanguínea en humanos. Preferiblemente el nivel de oxígeno disuelto (d02) durante la fermentación es 5% o menos . A menores niveles de oxígeno disuelto la producción de tripéptidos VPP y/o IPP aumenta, comparado con niveles de oxígeno más altos. El termentador puede ser rociarse y/o el hueco del termentador puede enjuagarse, con gas inerte, tal como nitrógeno para lograr niveles de oxígeno disuelto bajos. Ventajosamente, después de terminar la fermentación, pueden ejecutarse varios pasos del proceso adicionales. Por ejemplo, lactato de calcio sólido y/o lactato de magnesio pueden separarse de la leche fermentada, por ejemplo enfriando el producto de leche fermentada, tal que estos lactatos se precipitan. El producto de leche fermentada puede usarse como tal, o puede diluirse, puede concentrarse, puede purificarse y puede secarse preferiblemente secado con rocío o secado por congelación. De conformidad con la invención un número relativamente alto de moléculas VPP y/o IPP pueden liberarse de la caseína que contiene el material inicial (el sustrato) . Preferiblemente, la producción molar de VPP sobre su sustrato es 15% o más, preferiblemente 20% o más y más preferiblemente 25% o más. La producción molar de VPP se define como la cantidad molar de VPP producida en la fermentación dividida por la cantidad molar de fragmentos de VPP en la masa total de la caseína presente en el material inicial de leche previo al inicio de la fermentación. Un cálculo análogo proporciona la producción molar de IPP . La producción molar de IPP es preferiblemente 8% o más, más preferiblemente 10% o más y más preferiblemente 25% o más. Con el proceso de la invención, puede obtenerse la leche fermentada, la cual comprende una cantidad de tripéptidos VPP y/o IPP expresada como concentración equivalente IPP [IPPeq] de 145 uM o más. El producto de leche fermentada comprende 40-600 mmol/kg K+ y/o 30-400 mmol/kg Ca2+ y/o 6-50 mmol/kg Mg2+ preferiblemente, 50-600 mmol/kg K+ y/o 40-400 mmol/kg Ca2+ y/o 8-50 mmol/kg Mg2+, más preferiblemente 100-150 mmol/kg K+ y/o 40-100 mmol/kg Ca2+ y/o 10-25 mmol/kg g+ y más preferiblemente 110-135 mmol/kg K+ y/o 40-60 mmol/kg Ca+ y/o 13-20 mmol/kg Mg2+. Los niveles de estos iones en el presente documento se presentarán como , Ca y Mg, es decir sin importar la carga del ion. Preferiblemente, el producto de leche fermentada comprende dos o más de los iones mencionados anteriormente K+, Ca+ y Mg2+ en las cantidades mencionadas anteriormente, más preferiblemente todos los tres de estos iones en las cantidades mencionadas . El producto de leche fermentada o productos derivados del mismo, pueden consumirse como tal por seres humanos. Estos también pueden usarse en el producto alimenticio como ingrediente alimenticio. Preferiblemente, en tal caso los niveles de concentración IPP equivalentes y K+, Ca2+ y Mg2+ del producto alimenticio están dentro de los rangos definidos en el presente documento por el producto de leche fermentada. El producto de leche fermentada de conformidad con la invención o productos alimenticios derivados del mismo pueden pasteurizarse o esterilizarse. Los productos alimenticios de conformidad con la invención pueden ser cualquier tipo de alimento. Estos pueden comprender ingredientes alimenticios comunes además del producto de leche fermentada, tal como sabor, azúcar, frutas, minerales, vitaminas, estabilizadores, espesantes, etc. en cantidades apropiadas . Preferiblemente los productos alimenticios son productos de tipo lácteo o productos de confitería congelados. Estos tipos preferidos de productos alimenticios se describen con más detalle a continuación y en los ejemplos. Productos de tipo lácteo Ejemplos de productos lácteos de conformidad con la invención son leche, lácteos para untar, queso crema, bebidas tipo leche y yogur, en donde los sólidos de leche están parcialmente o completamente consistiendo de sólidos de leche fermentada Lb.helveticus. Como ejemplo de la composición para el producto de tipo yogur tiene aproximadamente 50-80% en peso de agua, 3-12% en peso de sólidos de leche fermentada de Lb. Helvetícus, 0-15% en peso suero en polvo, 0-15% en peso azúcar (por ejemplo sucrosa), 0.01-1% en peso cultivo yogurt, 0-15% en peso fruta, 0.05-5% en peso vitaminas y minerales, 0-2% en peso de esencia artificial, 0-5% en peso estabilizador (espesante o agente gelificante) .

El tamaño de porción típica para el producto tipo yogur podría ser desde 50 hasta 250 g, generalmente desde 80 hasta 200 g. • Productos de Confitería Congelados Para el propósito de la invención el término producto de confitería congelado incluye leche que contiene confituras congeladas tales como helado, yogur congelado, sorbete, helado de agua, leche congelada y crema congelada, helados de agua, helado granizado y puré de frutas congelado. Preferiblemente el nivel de sólidos en confitura congelada (por ejemplo azúcar, grasa, esencia artificial etc.) es más de 3% en peso, más preferiblemente desde 10 hasta 70% en peso, por ejemplo 40 a 70% en peso. El helado comprende típicamente 0 a 20% en peso de grasa, 2 a 20% en peso de sólidos de leche fermentada, dulcificantes, 1 a 10% en peso de componentes de leche no-grasos y componentes opcionales tales como agentes emulsionantes, estabilizadores, preservativos, ingredientes de esencia artificial, vitaminas, minerales, etc., siendo el balance agua. Típicamente el helado será aireado hasta un límite de 20 a 400%, más específicamente de 40 hasta 200% y congelado a temperatura desde -2 hasta -200aC, más específicamente desde -10 hasta -30SC. El helado normalmente comprende calcio a un nivel de aproximadamente 0.1% en peso. Otro producto alimenticio de conformidad con la invención puede prepararse por la persona experta basado en el conocimiento general común, usando leche fermentada o productos derivados de leche fermentada como ingrediente en cantidades apropiadas. Ejemplos de tales productos alimenticios son mercancías horneadas, alimentos de tipo lácteo, bocadillos, bebidas etc. Ventajosamente el producto alimenticio es una emulsión que contiene aceite y agua, por ejemplo comida para untar. La emulsión de aceite y agua se define en el presente documento como emulsión que comprende aceite y agua e incluye emulsiones de aceite en agua (O/W) y emulsiones de agua en aceite (W/O) y emulsiones más complejas por ejemplo emulsiones agua-en-aceite-en-agua (W/0/W/O/W) . Aceite en el presente documento se define como incluyendo grasa. Preferiblemente el producto alimenticio es una bebida, especialmente de bebida de tipo lácteo, comida para untar, confitura congelada, o salsa. Preferiblemente la comida para untar de conformidad con la invención comprende 30-90% en peso de aceite vegetal. Ventajosamente la comida para untar tiene pH de 4.2-6.0. Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra las concentraciones de VPP, IIP e iPPeg calculado (en uM) de conformidad con los ejemplos 1-8 como función del pH. Los datos IPP se indican por ?, y datos VPP por · y datos IPPeq se indican por ?.

La Figura 2 muestra perfiles pH típicos . El pH se gráfica como función del tiempo de fermentación (en horas) . La curva corta muestra fermentación de acidificación libre de 24 horas con la fase de pH controlado de 10-15 horas y la curva larga de fermentación sin control de pH durante 48 horas. La Figura 3 muestra la concentración de ACE formado inhibiendo péptidos VPP e IPP expresados en µ? como función del tiempo de fermentación (en horas) . Los datos VPP se muestran como · y los datos IPP como A. Los datos por ejemplo 16 se conectan por la línea sólida y aquellos del ejemplo 17 con líneas punteadas . Ejemplos Determinación de cantidades de IPP y VPP La cuantificación de VPP e IPP se realizó usando HPLC- RM-MS en modo ESI positivo. Los ejemplos se analizaron usando HP1100 (ex Agilent) sistema HPLC combinado con el espectrómetro de masa de cuatro polos triple Quattro-II (ex Micromass UK) . Las muestras se inyectaron sobre la columna Varian 150x2.1 mm Inertsil ODS-3 empacada previamente por GL_Sciences. El gradiente del eluyente fue lineal desde 100% de agua que contiene 0.1% de ácido trifluórico (TFA) hasta 100% de acetonitrilo que contiene 0.1% de TFA en 46 minutos con índice de flujo de 0.2 mi/min. La fuente de ión del MS estuvo operando en el modo de electrorocío positivo. El ión hijo m/z 213.1 se monitoreó en MRM de los iones padres m/z 12.2 y m/z 326.2 de VPP e IPP respectivamente. El cono de voltaje fue 19V y la energía de colisión 18eV para ambos compuestos . El gas de colisión usado fue Argón, y la presión del gas de colisión fue 2.3 x 10"3 mbar. La cuantificación se realizó demandando la curva de calibración externa separada para ambos compuestos . Determinación de la actividad de inhibición ACE La actividad de inhibición ACE se determinó usando la técnica de prueba descrita a continuación. En esta prueba ín Vi tro el sustrato fluorogénico templado internamente Abz-FRK (Dnp) P-OH descrito por Araujo M.C. et al, Bioquímica 39, 8519-8525 (200) , se usó. Cuando ACE divide la unión R-K del sustrato fluorogénico, la distancia del templador (Dnp) con respecto al grupo fluorescente (Abz) será alargada resultando en la señal fluorescente . Esta señal está directamente relacionada con la actividad ACE y se mide con fluorometro. Las muestras se prepararon como sigue: La leche fermentada se transfirió al tubo para centrifugar. El pH se ajustó a 4.0 ± 0.1 agregando pocos µ? de 6 M HCl y se centrifugó durante 5-10 minutos a 4.000 x g a temperatura ambiente (RT, por sus siglas en inglés) . El flotante se transfirió al tubo y el pH se ajustó a 7.0± 0.1 agregando pocos µ? de 6M NaOH. La muestra con pH ajustado se transfirió al tupo Eppendorf y centrifugó durante diez minutos a 14.000 rpm a ET. El flotante se transfirió al tubo y listo para la prueba de actividad de inhibición ACE. Si la muestra no se procesa inmediatamente, se almacena a -20aC. 150 µ? 3.75µ? Abz-FRK (Dnp) P-OH en el amortiguador de prueba (=100 mM amortiguador Tris (con 100 mM NaCl) pH 7.0) + 20µ1 0.00625U/ml ACE en amortiguador de prueba + 40µ1 muestra/amortiguador de prueba se agregó por pozo a la microplaca, la actividad de ACE después siguió usando directamente fluorescencia (Kex- 320 nm Aem: 420 nm) . La pendiente/segundo es una medida para la actividad de ACE. Como estándar, se usó Captopril (InM concentración-final) o IPP (5µ? concentración-final) . Ambas concentraciones proporcionaron aproximadamente 30% de inhibición de actividad ACE. La inhibición ACE (ACEI) se expresó como unidades arbitrarias (a.u. ) , lo cual se define como sigue: Inhibición ACE (a.u. )=ACEI (%) *Dilución (3) ACEI(%)=(1-(A-B)/(C-B) )*100 (4) A = valor de la muestra B = valor del blanco, no ACE ni inhibidor C = valor del control, ACE y no inhibidor Actividad Proteolítica La presencia de la cantidad total de grupos amino, libre de aminoácidos, péptidos y proteínas en muestras de leche fermentadas se usaron para evaluar la actividad proteolítica (proteólisis) de la bacteria de ácido láctico. Se usó el método para determinar el grado de hidrólisis en hidrolisados de proteína de alimento como se describe en Adler-Nissen J. en Agrie. Food Chem. 27, 1256-1262 (1979). 5yL de muestra, leucina estándar ( 0.25-2.5 mM) o agua destilada se agregaron a 40 ]ih de 0.21 M fosfato amortiguador pH 8.2 y 40 pL de 0.1% en peso de solución TNBS," seguida por incubación en oscuro durante 60 minutos a 50SC. La reacción se templó agregando 80 pL de 0.1 M HC1. La absorbancia se midió a 340 nm (Adler-Nissen J. Hidrólisis Enzimática de proteínas de alimentos. Nueva York: Elsevier Editores de Ciencia Aplicada p. 110-169) . La cantidad total de grupos amino presentes en la leche se expresó como equivalentes de Leucina mM. Las concentraciones de Metal de Ca y Mg se midieron usando el Plasma Acoplado Inductivo (ICP, por sus siglas en inglés) - Espectrometría de Emisión de Plasma y se midieron las concentraciones de metal de Na y K usando Espectrometría de Absorción Atómica de Flama (FAAS, por sus siglas en inglés) . Ejemplos comparativos A-l Preparación de Precultivo-1 Leche descremada estéril (Yopper ex Campi a, Holanda) se inoculó durante 24 horas a 37 SC con 2 a 4% de cultivo de cepa de Lactobacillus helveticus de la tabla 1, que se habían almacenado a -80aC como cultivo completamente crecido en la leche descremada descrita anteriormente, diluido con 10% glicol estéril para concentración final de 6% glicerol . El producto resultante se designó como precultivo-1. Para ejemplos comparativos A-I, leche descremada estéril (Yopper ex Campiña, Holanda) se fermentó con 2% en peso de precultivo-1 preparado para cada cepa diferente como se describió en la preparación de pre-cultivo. La fermentación con las nueve cepas diferentes de Lactobacillus helveticus se agitó y desarrolló sin control de pH bajo condiciones anaeróbicas a 40-C. Los resultados de la inhibición ACE (ACEI, por sus siglas en inglés) , formación IPP y VPP y la actividad proteolítica (proteólisis) de fermentaciones (repetida dos veces) se muestran en la tabla 1 (datos promediados) . Tabla 1: Resultados de filtrado de cepas Lb. helveticus en ejemplos comparativos A-I : Explicación del origen de cepa: CNRZ : Centro Nacional de Investigaciones Zootécnicas, Jouy-en-Josas, Franci . NCDO: Colección Nacional de Organismos Lácteos. Véase: NCFB. NCFB: Colección Nacional de Bacteria de Alimentos (nombrada previamente NCDO) después NCIMB: Colección Nacional de Bacteria Industrial y Marina, Nacional Colecciones de Bacteria Industrial, de Alimentos y Marina, 23 Machar Drive, Aberdeen, AB24 3RY, Escocia. ATCC: Colección de Cultivo Tipo Americano iesby: Danisco Cultor BP 1: cepa aislada de producto comercial Evolus (ex Valió, Finlandia) Los ejemplos comparativos A-I muestran que de las cepas filtradas de Lb. helveticus, CNRZ 244 muestra la formación más alta de VPP e IPP. Además estos resultados muestran que Lb. helveticus CNRZ 244 tuvo una capacidad mayor para formar inhibición ACE y actividad proteolítica más alta comparada con otras cepas Lb. helveticus. Ejemplos 1-8 El precultivo (precultivo-2) se preparó con leche descremada estéril (Yopper ex, Campiña, Holanda) , el cual se inoculó con el precultivo-1 de Lactobacillus helveticus CNRZ 244. Este precultivo no se agitó e incubó durante 24 horas a 37SC. Las fermentaciones se dirigieron por inoculación de la leche descremada estéril (Yopper) con el precultivo-2 en el reactor del tanque de agitación (STR) equipado con el impulsor de seis cuchillas con el fondo de impulsión (fermentadores Ruston) que tiene volumen de 3 litros. La velocidad de agitación se mantuvo a 150 rpm y el oxígeno disuelto (d02) y el pH se monitoreó durante la fermentación. Condiciones anaeróbicas (d02 menor del 5%) se mantuvo usando enjuague del hueco con gas de nitrógeno. Las fermentaciones con pH controlado se realizaron con la fase de acidificación libre previo al control de pH.. Durante la fermentación el pH se permitió disminuir hasta que se alcanzó su punto fijo de pH. Después el pH se controló usando 10% en peso de hidróxido de calcio. Después de 24 horas de fermentación los niveles de calcio se elevaron desde 0.4 hasta 0.6% en peso de la leche fermentada. Los resultados se proporcionan en la tabla 2 y en la figura 1. Tabla 2. Fermentación con pH controlado usando hidróxido de calcio como base en tiempo de fermentación de 24 horas.

Ejemplo Producción Molar en pH Concentración (µ ) caseína IPP VPP IPP eq IPP VPP 1 4.3 47.8 68.8 86.0 9% 18% 2 4.5 110.1 1 0.7 171.6 20% 29% 3 4.6 96.2 114.6 159.9 17% 30% 4 4.7 85.8 129.0 157.5 15% 33% 4.9 63.7 69.0 102.0 11% 18% 6 4.9 64.6 76.9 107.3 12% 20% 7 5.5 15.0 40.5 37.5 3% 10% 8 6.0 1.3 13.9 9.0 0.2% 4% Ejemplos 9-13 Los ejemplos 9-13 se ejecutaron como los ejemplos 1-8 , pero ahora el tiempo de fermentación fue 42 a 46 horas en lugar de 24 horas. Los niveles finales de calcio en leche fermentada alcanzaron hasta 0 . 8% en peso (200 mmol/kg) . Los resultados se muestran en la tabla 3 . Tabla 3 : Fermentación con pH controlado usando hidróxido de calcio como base en tiempo de fermentación de 42 a 46 horas (ferm. ) .

Los ejemplos 1-13 muestran que controlando el pH durante la fermentación en el rango de 4. 3-4 . 9 , la formación de tripéptidos VPP e IPP liberados de caseínas de leche durante la fermentación es alta. Ejemplo 14 Los 14 ejemplos se ejecutaron en un termentador Rushton de 15 litros usando las condiciones descritas en los Ejemplos 1-8 , con diferentes protocolos para precultivo y control de pH durante la fermentación.

El precultivo (precultivo-3 ) se preparó con leche descremada estéril (Yopper, ex Campiña, Holanda) , el cual se inoculó con 2% en peso de precultivo-1 de Lactojbacillus helveticus C RZ 244. El precultivo-3 se agitó e incubó a 402C durante 24 horas bajo condiciones anaeróbicas, usando enjuague de gas de nitrógeno de hueco. La leche descremada se reconstituyó mezclando 9% en peso de polvo de leche descremada (Promex, ex Coberco, Holanda) con agua de la llave y se esterilizó. La leche reconstituida estéril se fermentó con 2% en peso de precultivo-3 a 40aC bajo condiciones anaeróbicas. El pH se controló por un tiempo limitado usando como base la mezcla de hidróxidos que contienen 3.9% en peso de hidróxido de calcio y 1.25 M hidróxido de potasio como sigue (Protocolo de fermentación A) . Durante la fermentación el pH de la leche se permitió disminuir desde pH 6.5 o 6.3 hasta pH 4.6, durante 9 a 11 horas. Con pH 4.6 el pH se controló durante 5 a 7 horas, usando la mezcla de base de hidróxido de calcio e hidróxido de potasio (Volumen de 300 mi que contiene 3.9% en peso de hidróxido de calcio y 1.25 M hidróxido de potasio se usó para 7.5 1 de leche fermentada). Después de esta fase controlada de pH se permitió al pH disminuir hasta 4.0. Los niveles finales de calcio y potasio en la leche fermentada fueron 0.2% en peso (50 mmol/kg y 0.29% en peso (74 mmol/kg) respectivamente. La curva de pH típica para la fermentación controlada como en este ejemplo 14 se proporciona en la Figura 2 . Los resultados se muestran en la tabla 4. Ejemplo comparativo j El ejemplo comparativo J se ejecutó como el ejemplo 14, pero ahora el pH no se controló (protocolo de fermentación B) . El protocolo de fermentación sin control de pH (acidificación libre): Precultivo-3 , leche reconstituida estéril y condiciones similares al ejemplo 14 sin control de pH. Después de la fermentación se agregó calcio y potasio como lacto sales . Los resultados se muestran en la tabla 4. Tabla 4: Resultados del ejemplo 14 y ejemplo comparativo J La tabla 4 muestra que controlando el pH al pH=4.6 usando la mezcla de hidróxido de calcio e hidróxido de potasio incrementa la producción de péptidos activos VPP e IPP. Ejemplo 15 Preparación de bebidas de leche fermentada Las leches fermentadas se obtienen de conformidad con los 14 ejemplos y el ejemplo comparativo J se usó para producir bebidas fermentadas . La bebida de leche fermentada contiene 90% en peso de leche fermentada original y los siguientes ingredientes : 5.5% en peso sucrosa (ex CSM, Holanda), 1.5% en peso jarabe de fructuosa (ex Sensus, Holanda), 2% en peso pulpa de fruta con frutas múltiples (ex Wild, Holanda), 0.1% en peso sabor yogur ZD-49492 (ex Quest, Holanda), 0.03% en peso sabor fruta 037-00330-11 (ex Givaudan, Suiza), 0.1% en peso sabor crema U33162 (ex Danisco, Dinamarca) y 0.8% en peso Genu pectina YM-115-H (ex CPKelco, Dinamarca) . Después los ingredientes se mezclaron, las bebidas de leche fermentada se homogenizaron a 150 bar y se pasteurizaron durante 15 segundos a 75 eC. El sabor de la leche fue bueno. Ejemplo 16 y 17 Los ejemplos 16 y 17 se ejecutaron en el fermentador Rushton usando las condiciones descritas en los Ejemplos 1-8, con el mismo protocolo de precultivo, en lugar de hidróxido de calcio, se usó hidróxido de potasio para control de pH durante la fermentación. El pH se controló a puntos fijos de pH de 5.2 (ejemplo 16) y 5.9 (ejemplo 17). Los niveles finales de potasio alcanzaron hasta 1.6% en peso (410 mmol/kg K+ promedio) de leche fermentada.

Ejemplo 18 El ejemplo 18 se ejecutó como el Ejemplo 14, pero la fermentación se inició como fermentación acidificada libre y una vez que se alcanzó el pH de 4.6, el pH se mantuvo en este pH agregando la base de mezcla durante el tiempo de fermentación restante. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Producto de leche fermentada que comprende tripéptidos VPP y/o IPP, en donde el producto de leche fermentada comprende la cantidad de tripéptidos VPP y/o IPP expresada como concentración equivalente IPP [ PPeq] de 145 µ o más, caracterizado porque el producto de leche fermentada comprende 40- 600 mmol/kg K+ y/o 30-400 mmol/kg Ca2+ y/o 6-50 mmol/kg Mg2+. 2 . Producto de leche fermentada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porgue el producto de leche fermentada comprende 50-600 mmol/kg K+ y/o 40-400 mmol/kg Ca2+ y/o 8-50 mmol/kg Mg2+.
3 . Producto de leche fermentada de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque comprende 100-150 mmol/kg K+ y/o 40-100 mmol/kg Ca2+ y/o 10-25 mmol/kg Mg2+. 4. Producto de leche fermentada de conformidad con la reivindicación 3 , caracterizado porque comprende 110-135 mmol/kg K+ y/o 40- 60 mmol/kg Ca2+ y/o 13 -20 mmol/kg Mg2+. 5. Proceso para la preparación del producto de leche fermentada, caracterizado porque la fermentación se controla agregando la base en tal cantidad que el pH durante parte sustancial de la fermentación es
4.3-
5.9.
6. Proceso de conformidad la reivindicación 5, caracterizado porque la base tiene iones K+ y el pH durante una parte sustancial de la fermentación es 4.9-5.5.
7. Proceso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque tiene iones Ca2+ y el pH durante una parte sustancial de la fermentación es 4.3-4.9.
8. Proceso de conformidad con la reivindicación 5 caracterizado porque la base comprende +, Ca2+ y/o g2+.
9. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, caracterizado porque la temperatura durante la fermentación es 38-42aC.
10. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, caracterizado porque el nivel de oxígeno disuelto (d02) durante la fermentación es 5% o menor.
11. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-9, caracterizado porque la base es sal elegida del grupo que consiste de sal de calcio, sal de potásio y/o sal de magnesio.
12. Proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la sal es un hidróxido.
13. Proceso de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque después de terminar la fermentación el lactato calcio sólido se separa de la leche fermentada .
14. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-12, caracterizado porque el producto que contiene agua de la fermentación se seca.
15. Proceso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el producto que contiene agua de la fermentación se seca por apersión o se seca por congelamiento .
16. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-14, caracterizado porque la producción molar de VPP en su sustrato es 15% o más.
17. Uso de cepa de Lactobacillus helveticus CNRZ 244, depositado en el Centro Nacional de Investigaciones Zootécnicas, Jouy-en-Josas , Francia, para la producción del producto de leche fermentada que comprende [IPPeq] de 145 uM o más .