JP2007513900A - Ace阻害効果を有するペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明の目的は、ACE阻害に適した食料品を提供することである。別の目的は、血圧低下効果を有するそのような食料品を提供することである。また更なる目的は、高濃度のACEインヒビターを有する食料品を提供することである。一つ以上のこれらの目的は、アンギオテンシン変換酵素インヒビターの調製のための、トリペプチドXPP[式中、X=C、M、S、T、またはK、及び/またはそれらの塩]の使用により、本発明によって達成される。
Description
本発明は、アンギオテンシン変換酵素(ACE)インヒビターの調製のための特定のペプチドに関する。本発明は更に、ACE阻害に適した食料品、及びそのような食料品の調製方法に関する。
高血圧または高い血圧は、心臓血管疾患(CVD)についての主な危険因子の一つであると解されている。血圧を調節するメカニズムの一つは、レニン−アンギオテンシン系である。これは、アンギオテンシンIIの形成を導く反応のカスケードであり、この物質は強力な血管収縮性を有し、それ故血圧上昇効果を有する。このカスケードで鍵となる酵素の一つ:アンギオテンシンI変換酵素(ACE)の阻害は、アンギオテンシンIIの形成を減少し、かくして血圧低下効果を有する。長期的な人の介入研究により、低量のACEインヒビターの規則的な取り込みが、25%までCVDを減少することが示されている(Gerstein等 (2000), The Lancet 355, 253-259)。
食料品中のACEインヒビターは周知である。そのような食料品は、例えばミルクや乳製品の発酵によって調製されている。プラシーボ制御の研究では、サワーミルク中のVPP及びIPPの血圧低下効果が高血圧のヒトにおいて示された(Hata, Y等, (1996), American Journal of Clinical Nutrition 64, 767-771)。
「穏やかな高血圧を有する人に適切」であることを主張している市販の発酵乳製品は、日本のカルピス食品工業によって生産されているLactobacillus helveticusで発酵されたカルピス(登録商標)サワーミルクである。別の市販の発酵乳製品は、Valio社により生産されるEvolusであり、それは「低血圧を補助する最初の欧州機能性食品」であることを主張している。これらの発酵乳製品は、Lactobacillus helveticus (Lb. helveticus)株で発酵されている。前記製品は、カゼインのタンパク分解により生産されるin vitroACE阻害に関与する生体活性ペプチド(VPP及びIPP)を含む。
当該技術分野で同定された別の可能性は、乳タンパク質の酵素的タンパク分解によるACE阻害食料品の調製である。WO 01/85984は、酵素トリプシンを使用するカゼイン単離物のタンパク分解によるACE抑制組成物の調製を記載している
Gerstein等 (2000), The Lancet 355, 253-259 Hata, Y等, (1996), American Journal of Clinical Nutrition 64, 767-771 WO 01/85984
Gerstein等 (2000), The Lancet 355, 253-259 Hata, Y等, (1996), American Journal of Clinical Nutrition 64, 767-771
本発明の目的は、ACE阻害に適した食料品を提供することである。別の目的は、血圧低下効果を有するそのような食料品を提供することである。また更なる目的は、高濃度のACEインヒビターを有する食料品を提供することである。
一つ以上のこれらの目的は、アンギオテンシン変換酵素インヒビターの調製のための、トリペプチドXPP[式中、X=C、M、S、T、またはK、及び/またはそれらの塩]の使用により、本発明によって達成される。
一般的な一つの文字コードは、アミノ酸を記載するために通常使用されているようにここで使用される。ここでの重量パーセンテージは、他に記載がなければ全重量に対するものとして表されるであろう。酵素は一つより多い酵素の混合物を含むものとここで解される。
本発明によれば、本発明に係るトリペプチドXPPはヒトの消費の後で比較的安定であり、本発明に係るペプチドXPPは有効なアンギオテンシン変換酵素インヒビターであることが見出された。好ましくはアンギオテンシン変換酵素インヒビターは、機能的な食料品である。
XPPでは、X=C、M、S、T、またはKである。好ましくはX=C、M、S、またはTであり、より好ましくはX=M、S、またはTである。
本発明は、1mg/g以上のXPP[式中、X=C、M、S、T、またはK]、好ましくは25mg/g以上の量のXPPを含む、アンギオテンシン変換酵素阻害に、及びヒトにおいて血圧を低下するのに適した食料品を提供し、より好ましくは前記食料品は50mg/g以上、更により好ましくは100mg/g以上のXPP[式中、X=C、M、S、T、またはK、好ましくはX=C、M、S、またはT、より好ましくはX=M、S、またはT]の量を含む。
本発明に係る食料品は、ヒトの消費に適した製品として規定され、ここで本発明に係るXPPは、顕著なACE阻害効果が得られるように有効量の成分として使用された。
ここで理論的に整合が取れることを望まないが、本発明に係るトリペプチドは、以下の理由により良好なACEインヒビターであると解される:
・サイズが比較的小さいこと(2から10アミノ酸の間の長さ)
・中性または正に荷電していること
・負に荷電した残基からならないこと
・疎水性で分枝したアミノ酸からなること
・C末端プロリン残基を有すること。
・サイズが比較的小さいこと(2から10アミノ酸の間の長さ)
・中性または正に荷電していること
・負に荷電した残基からならないこと
・疎水性で分枝したアミノ酸からなること
・C末端プロリン残基を有すること。
更に、二つの連続したPro残基の存在に対して、XPPの場合ではACEによる最後の二つの残基の放出が、立体障害により有意に妨害されると解される。
更に、C末端のPP(-Pro-Pro)配列の存在は、ヒトの消化酵素、ヒトの腸内上皮細胞のブラッシュボーダー膜と会合したペプチダーゼ、及びヒトの血液循環中のぺプチダーゼに対して、前記ペプチドをより安定にすると解される。それ故、前記ペプチドを含む食料品の消費は、ヒトの身体内で前記ペプチドの有効な吸収を導き、ACE阻害と血圧の低下を誘導するであろうと解される。
これらの観察を要約すると、あまり長くなく、中性または正に荷電した疎水性アミノ酸からなり、C末端Pro[または-Pro-Pro]配列を有するいずれかのペプチドが、本質的にACEに対する良好なインヒビターであることが推定できる。
一般的にこの結果は、最も良好なACE阻害XPPペプチドが、中性で疎水性のアミノ酸からなるという観察と一致する。Trp、Tyr、及びPheのような大きな疎水性残基が含まれない理由は、おそらく二つのPro残基と組み合わせたこれらの残基が前記酵素の活性剤に正確にフィットするにはあまりに嵩高いという事実から導かれる。
CPPが含まれる理由は、ACEがZn含有酵素であり、Zn原子と基質の相互作用が基質と酵素の間の結合には必須であり、Cysの遊離スルフィドリル基の存在がこの相互作用を嗜好するという事実から導かれる。
以下のタンパク質(及びそれらの前駆体)が、例えばその構成タンパク質及び供給源の主要構造の範囲内で、記載されたXPP配列を含むように同定されている:
CPP:コラーゲン[ニワトリ]、トロポニン[ニワトリ]、チログロビン[ウシ]
MPP:アルブミン[エンドウマメ、ヤエナリ]、ミオシン[ウシ、ニワトリ、ブタ、酵母]、ゼイン[トウモロコシ]
SPP:コラーゲン[ニワトリ]、カゼイン[ウシ]、レグミン[ヤエナリ、Sativumマメ]
TPP:コラーゲン[ニワトリ]、グルテニン[コムギ]、クルセフェリン[レープ]、レグミン[綿花]、ミオシン[酵母]、ゼイン[トウモロコシ]
KPP:ミオシン[ブタ、ニワトリ、酵母]、カゼイン[ブタ]
CPP:コラーゲン[ニワトリ]、トロポニン[ニワトリ]、チログロビン[ウシ]
MPP:アルブミン[エンドウマメ、ヤエナリ]、ミオシン[ウシ、ニワトリ、ブタ、酵母]、ゼイン[トウモロコシ]
SPP:コラーゲン[ニワトリ]、カゼイン[ウシ]、レグミン[ヤエナリ、Sativumマメ]
TPP:コラーゲン[ニワトリ]、グルテニン[コムギ]、クルセフェリン[レープ]、レグミン[綿花]、ミオシン[酵母]、ゼイン[トウモロコシ]
KPP:ミオシン[ブタ、ニワトリ、酵母]、カゼイン[ブタ]
これらのタンパク質材料は、例えば基質として使用しても良く、そこから本発明に係るペプチドが遊離しても良い。当業者は、これを達成するための既知の発酵または既知の酵素処理、例えば酵素的加水分解を使用する方法を知っているであろう。
発酵または加水分解条件の最適化を通じて、本発明に係る生物学的な活性分子XPPの生産が最大化されて良い。生産を最大化することを試みる当業者は、加水分解時間、加水分解温度、酵素のタイプ及び濃度等のような反応パラメーターを調節する方法を知っているであろう。
好ましくは、XPPの生産において、XPPのモル収率は高い。XPPのモル収率は、加水分解の前の出発材料に存在するタンパク質の総量におけるXPP断片のモル量によって、生産されたXPPのモル量を割り算したものとして規定される。
酵素的加水分解で使用される酵素は、XPPを含む基質を有効に加水分解できるいずれかの酵素であって良く、そこから一つ以上のXPP[式中、X=C、M、S、T、またはK]の遊離が生じる。
酵素処理は、従来の態様で実施されて良い。それは、前記基質への酵素(または酵素の混合物)の添加と、酵素的加水分解を実施するのに適した制御条件下での生成反応混合物の維持を含む。制御される条件は、温度、pH、反応時間、及び酵素濃度を含む。反応混合物の好ましい温度は、40−60℃、より好ましくは45−55℃、最も好ましくは約50℃である。反応混合物のpHは、好ましくは5から9、より好ましくは6−8、最も好ましくは約7である。酵素濃度は、反応混合物の総重量に基づいて2−10重量%、より好ましくは3−10重量%、最も好ましくは4−6重量%である。反応時間(加水分解時間)は、好ましくは2−50時間、より好ましくは2−10時間、最も好ましくは4−8時間である。
別の好ましい実施態様では、加水分解工程は、前記基質の加水分解を引き起こすであろう微生物での発酵工程によって置換されても良い。
発酵槽中の材料と基質は、均一な発酵媒体を達成するために従来法で混合されて良い。
発酵は有利には、25から50℃、好ましくは35から45℃で、3から80時間、好ましくは6から25時間で実施されて良い。
有利には、酵素処理と任意の発酵の後、いくつかの付加的な反応工程が実施されて良い。
好ましくは、本発明によれば、以下の工程を含むXPP[式中、X=C、M、S、T、またはK]を含む食料品の調製方法が使用される:
a)加水分解化タンパク質産物を生成する、配列XPPを有するタンパク質を含む基質の酵素的加水分解
b)前記加水分解化タンパク質産物からのトリペプチドで富化した分画の分離
c)トリペプチドXPPで富化した固体を得るための、工程b)からの前記分画の乾燥
d)前記食料品の調製における成分としての、工程c)で調製された固体の使用。
a)加水分解化タンパク質産物を生成する、配列XPPを有するタンパク質を含む基質の酵素的加水分解
b)前記加水分解化タンパク質産物からのトリペプチドで富化した分画の分離
c)トリペプチドXPPで富化した固体を得るための、工程b)からの前記分画の乾燥
d)前記食料品の調製における成分としての、工程c)で調製された固体の使用。
酵素的加水分解工程a)の後、任意の分離工程または濃縮工程が存在しても良い。この工程は、例えば濾過、遠心分離、またはクロマトグラフィー、及びそれらの組み合わせによって、当業者に既知のいずれかの方法で実施されて良い。好ましくは分離工程は、限外濾過(UF)及び/またはナノ濾過(NF)法を使用して実施される。濾過工程で使用される膜の孔のサイズ、並びに膜の荷電は、トリペプチドXPPの分離を制御するように使用されて良い。荷電したUF/NF膜を使用するタンパク質加水分解産物の濾過は、Y. Poilot等, Journal of Membrane Science 158 (1999) 105-114に記載されている。例えば電気透析はWO 00/42066に記載されている。そのような分離工程の産物は、ここでACE分画と称される。
任意に加水分解産物は、トリペプチドXPP[式中、X=C、M、S、T、またはK]で富化した固体を得るために乾燥されて良い。この工程は、例えばスプレー乾燥または凍結乾燥といった従来法で実施されて良い。
調製された乾燥固体は、以下ではACE固体と称される。ACE分画及び/またはACE固体は、食料品における成分として有利に使用されて良い。
本発明に係る食料品、またはそこから由来する食料品は、低温殺菌または滅菌されて良い。
本発明に係る食料品は、いずれかの食品タイプを有して良い。それらは、香料、糖類、果肉、ミネラル、ビタミン、安定剤、増粘剤等のような食料品に添加される通常の食品成分を適切な量で含んで良い。
好ましくは前記食料品は、50-200mmok/kgのK+、及び/または15-60mmol/kgのCa2+、及び/または6-25mmol/kgのMg2+、より好ましくは100-150mmok/kgのK+、及び/または30-50mmol/kgのCa2+、及び/または10-25mmol/kgのMg2+、最も好ましくは110-135mmok/kgのK+、及び/または35-45mmol/kgのCa2+、及び/または13-20mmol/kgのMg2+を含む。
好ましくは前記食料品は、フルーツジュース製品、乳製品、凍結菓子製品、またはスプレッド/マーガリンである。これらの好ましいタイプの食料品は、以下に幾分詳細に記載され、例として記載される。
・フルーツジュース製品
本発明に係るフルーツジュース製品の例は、オレンジ及びグレープフルーツのような柑橘類、トロピカルフルーツ、バナナ、ピーチ、ピアー、ストロベリーから由来するジュースであり、そこにACE固体及び/またはACE分画が添加される。
本発明に係るフルーツジュース製品の例は、オレンジ及びグレープフルーツのような柑橘類、トロピカルフルーツ、バナナ、ピーチ、ピアー、ストロベリーから由来するジュースであり、そこにACE固体及び/またはACE分画が添加される。
・乳製品
本発明に係る乳製品の例は、ミルク、乳製品スプレッド、クリームチーズ、乳飲料、及びヨーグルトであり、そこでXPPが食料品の調製の間で生産される。前記食料品は、乳飲料のようなものとして使用されても良い。別法としてまたは加えて、香料または他の添加剤が添加されて良い。乳製品はまた、水または乳製品にACE固体及び/またはACE分画を添加することによって調製されても良い。
ヨーグルトタイプの製品のための組成物の例は、約50-80重量%の水、0.1-15重量%のACE固体、0-15重量%のホエーパウダー、0-15重量%の糖類(例えばスクロース)、0.01-1重量%のヨーグルトカルチャー、0-20重量%の果肉、0.05-5重量%のビタミンとミネラル、0-2重量%の香料、0-5重量%の安定剤(増粘剤またはゲル化剤)である。
本発明に係る乳製品の例は、ミルク、乳製品スプレッド、クリームチーズ、乳飲料、及びヨーグルトであり、そこでXPPが食料品の調製の間で生産される。前記食料品は、乳飲料のようなものとして使用されても良い。別法としてまたは加えて、香料または他の添加剤が添加されて良い。乳製品はまた、水または乳製品にACE固体及び/またはACE分画を添加することによって調製されても良い。
ヨーグルトタイプの製品のための組成物の例は、約50-80重量%の水、0.1-15重量%のACE固体、0-15重量%のホエーパウダー、0-15重量%の糖類(例えばスクロース)、0.01-1重量%のヨーグルトカルチャー、0-20重量%の果肉、0.05-5重量%のビタミンとミネラル、0-2重量%の香料、0-5重量%の安定剤(増粘剤またはゲル化剤)である。
ヨーグルトタイプの製品のための典型的な提供量は、50から250g、一般的には80から200gであろう。
・凍結菓子製品
本発明の目的のため、用語「凍結菓子製品」は、アイスクリームのような凍結菓子を含むミルク、フローズンヨーグルト、シャーベット、ソルベット、アイスミルク及びフローズンカスタード、ウォーターアイス、グラニタス、及び凍結果肉プーリを含む。
本発明の目的のため、用語「凍結菓子製品」は、アイスクリームのような凍結菓子を含むミルク、フローズンヨーグルト、シャーベット、ソルベット、アイスミルク及びフローズンカスタード、ウォーターアイス、グラニタス、及び凍結果肉プーリを含む。
好ましくは、凍結菓子中の固体濃度(例えば糖類、脂肪、香料等)は、3重量%より多い、好ましくは10から70重量%、例えば40から70重量%である。
アイスクリームは典型的に、0から20重量%の脂肪、0.1から20重量%のACE固体、甘味料、0から10重量%のノンファットミルク成分、及び乳化剤、安定剤、防腐剤、香料成分、ビタミン、ミネラル等のような任意成分を含み、残部は水であろう。典型的にアイスクリームは、20から400%、とりわけ40から200%のオーバーランに曝気され、−2から−200℃、とりわけ−10から−30℃の温度に凍結される。アイスクリームは通常、約0.1重量%の濃度でカルシウムを含む。
・他の食料品
本発明に係る他の食料品は、食品のためのベース材料として加水分解化タンパク質を使用して、または適切な量の成分としてACE固体のような派生製品を使用して、共通の一般的知見に基づいて当業者により調製できる。そのような食料品の例は、焼いた食品、乳製品タイプの食品、スナック等である。
本発明に係る他の食料品は、食品のためのベース材料として加水分解化タンパク質を使用して、または適切な量の成分としてACE固体のような派生製品を使用して、共通の一般的知見に基づいて当業者により調製できる。そのような食料品の例は、焼いた食品、乳製品タイプの食品、スナック等である。
有利には前記食料品は、例えばスプレッドといった油と水を含むエマルションである。油水エマルションはここで、油と水を含むエマルションとして規定され、水中油型(O/W)エマルション、及び油中水型(W/O)エマルション、および水中油中水(W/O/W/O/W)エマルションといったより複雑なエマルションを含む。油はここで脂肪を含むものと規定される。好ましくは前記食料品は、スプレッド、凍結菓子、またはソースである。好ましくは本発明に係るスプレッドは、30−90重量%の植物油を含む。有利にはスプレッドは4.2−6.0のpHを有する。
実施例1
ACE阻害効果について、大量のペプチドをスクリーニングした(IC50値を測定した)。更に、ヒトの血清、HUVEC、Caco−2細胞、及び以下に記載される胃腸の酵素への曝露の間での安定性について、全てのペプチドをスクリーニングした。
ACE阻害効果について、大量のペプチドをスクリーニングした(IC50値を測定した)。更に、ヒトの血清、HUVEC、Caco−2細胞、及び以下に記載される胃腸の酵素への曝露の間での安定性について、全てのペプチドをスクリーニングした。
実施例1で使用された材料及び方法は以下に記載される。
セルカルチャー
Caco−2細胞を、American Type Culture Collection (ATCC)から得て、30-40継代で実験で使用した。細胞を75cm2の培養フラスコ(Corning Costar, Badhoevedorp, The Netherland)で培養した。培養培地は、20%(v/v)胎児ウシ血清、1%(v/v)ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、及び1%(v/v)NEAAで補ったDMEM(高グルコース、L-グルタミン含有)からなった。空気中に5%CO2の湿潤雰囲気下で37℃で細胞を維持した。安定性の実験については、細胞を12穴細胞培養プレート(Costar, Badhoevedorp, The Netherlands)に植菌し、少なくとも21日間培養した。
Caco−2細胞を、American Type Culture Collection (ATCC)から得て、30-40継代で実験で使用した。細胞を75cm2の培養フラスコ(Corning Costar, Badhoevedorp, The Netherland)で培養した。培養培地は、20%(v/v)胎児ウシ血清、1%(v/v)ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、及び1%(v/v)NEAAで補ったDMEM(高グルコース、L-グルタミン含有)からなった。空気中に5%CO2の湿潤雰囲気下で37℃で細胞を維持した。安定性の実験については、細胞を12穴細胞培養プレート(Costar, Badhoevedorp, The Netherlands)に植菌し、少なくとも21日間培養した。
HUVEC細胞
HUVEC細胞をCambrex Bio Science (Verviers, Belgium)から得て、1-5継代で実験で使用した。細胞を75cm2の培養フラスコ(Corning Costar, Badhoevedorp, The Netherland)で培養した。培養培地は、2%(v/v)胎児ウシ血清、0.04%(v/v)ヒドロコルチコイド、0.4%(v/v)ヒト線維芽細胞増殖因子ベーシック(ヘパリン含有)、0.1%(v/v)血管内皮増殖因子、0.1%(v/v)ヒト組換えインスリン様増殖因子、0.1%(v/v)アスコルビン酸、0.1%(v/v)ヒト組換え上皮増殖因子、0.1%(v/v)ゲンタマイシン、アンホテリシン−B、及び0.1%(v/v)ヘパリンで補ったEBM−2からなった。空気中に5%CO2の湿潤雰囲気下で37℃で細胞を維持した。安定性の実験については、細胞を12穴細胞培養プレート(Costar, Badhoevedorp, The Netherlands)に100.000細胞/ウェルの密度で植菌し、少なくとも2日間培養した。
HUVEC細胞をCambrex Bio Science (Verviers, Belgium)から得て、1-5継代で実験で使用した。細胞を75cm2の培養フラスコ(Corning Costar, Badhoevedorp, The Netherland)で培養した。培養培地は、2%(v/v)胎児ウシ血清、0.04%(v/v)ヒドロコルチコイド、0.4%(v/v)ヒト線維芽細胞増殖因子ベーシック(ヘパリン含有)、0.1%(v/v)血管内皮増殖因子、0.1%(v/v)ヒト組換えインスリン様増殖因子、0.1%(v/v)アスコルビン酸、0.1%(v/v)ヒト組換え上皮増殖因子、0.1%(v/v)ゲンタマイシン、アンホテリシン−B、及び0.1%(v/v)ヘパリンで補ったEBM−2からなった。空気中に5%CO2の湿潤雰囲気下で37℃で細胞を維持した。安定性の実験については、細胞を12穴細胞培養プレート(Costar, Badhoevedorp, The Netherlands)に100.000細胞/ウェルの密度で植菌し、少なくとも2日間培養した。
試験製品
ペプチド混合物1は、VPP、IPP、IIAEK、ITP、VF、FY、KVLPVP、及びHLPLPからなった。混合物2は、VAP、GPR、CPP、MPP、SPP、TPP、PIP、及びPLPからなった。合成ペプチドは、Bachem(トリペプチドKPP及びGPR)から注文したか、ユトレヒト大学(Dr. M. Egmond)から得た。
ペプチド混合物1は、VPP、IPP、IIAEK、ITP、VF、FY、KVLPVP、及びHLPLPからなった。混合物2は、VAP、GPR、CPP、MPP、SPP、TPP、PIP、及びPLPからなった。合成ペプチドは、Bachem(トリペプチドKPP及びGPR)から注文したか、ユトレヒト大学(Dr. M. Egmond)から得た。
前記ペプチドは、50μlのmilliQ水またはDMSOに5mgの濃度で別個に溶解された。いくつかのペプチドについては、前記濃度は純度のため較正された(ITP60%、KVLPVP85%)。残りのペプチドは>95%の純度であった。ジペプチドを除く全てのペプチドをmilliQ水に溶解した。FYはDMSOに溶解した。FYはまだ不溶性であったため、いくらかのHCl(0.3Mの最終濃度)を添加した。VFは0.3M HClに直接溶解した。混合物1を調製するため、50μlの各ペプチドを共に混合し、100μlのmilliQ水を添加し、5mgの各ペプチドを含む500μlの溶液を生成した(0.06M HCl及び10%DMSO中)。混合物2を同様の方法で調製したが、更に50μlのmilliQ水を添加した点で異なった。混合物の2の最終組成も、10mg/mlの各ペプチドであった。
ペプチドの安定性試験
血清、HUVEC、及びCa−co−2細胞を使用する安定性試験
ペプチド混合物を、0.1、1、及び10μg/Lの最終濃度でヒト血清(Cambrex Bio Science, Verviers, Belgium)に添加した。ペプチド混合物を含む血清を、37℃で0、1、2、5、10、20、60、120、240、及び360分間インキュベートした。1.5mlのサンプルを各時点でエッペンドルフチューブに回収した。その直後に、30μlの10%(v/v)トリフルオロ酢酸(TFA)と5μlの10μgのUC-13-IPP/10mlをサンプルに添加した。その後サンプルを100℃で5分間インキュベートし、次いでIEC Micromax RF遠心器(Boom BV Meppel)で10.000rpmで20分間遠心分離した。上清をエッペンドルフチューブに回収し、更なる分析のため-20℃で貯蔵した。実験は三重で実施した。
血清、HUVEC、及びCa−co−2細胞を使用する安定性試験
ペプチド混合物を、0.1、1、及び10μg/Lの最終濃度でヒト血清(Cambrex Bio Science, Verviers, Belgium)に添加した。ペプチド混合物を含む血清を、37℃で0、1、2、5、10、20、60、120、240、及び360分間インキュベートした。1.5mlのサンプルを各時点でエッペンドルフチューブに回収した。その直後に、30μlの10%(v/v)トリフルオロ酢酸(TFA)と5μlの10μgのUC-13-IPP/10mlをサンプルに添加した。その後サンプルを100℃で5分間インキュベートし、次いでIEC Micromax RF遠心器(Boom BV Meppel)で10.000rpmで20分間遠心分離した。上清をエッペンドルフチューブに回収し、更なる分析のため-20℃で貯蔵した。実験は三重で実施した。
細胞を12穴プレートで培養した。ペプチド混合物を、胎児ウシ結成を含まず、20%(v/v)固相抽出胎児ウシ血清を含む培養培地に加えた。HUVECについては、0.1、1、及び10μg/mlのペプチドを含む400μlの培地を、培養プレートのウェルに添加した。3回130μlの培地を、0、5、10、20、30、60、90、及び120分のインキュベーションで回収した。Caco−2細胞については、0.1、1、及び10μg/mlのペプチドを含む330μlの培地を、培養プレートの各ウェルに添加した。3回110μlの培地を、0、5、10、20、30、60、90、180、及び360分のインキュベーションで回収した。実験は三重で実施し、全てのサンプルを直接ドライアイスに配置して-20℃で貯蔵した。ペプチド定性測定のため、TFA及びUC13-IPP(それぞれ0.2%(v/v)及び60ng/mlの最終濃度)をサンプルに添加した。細胞を含まないウェルをコントロールとして使用した。
ACE阻害アッセイ1:酵素ベースのアッセイ(EEA)
ACE及び合成基質(Abz-FRK-(Dnp)P-OH)を、白色光学プレート96ミクロプレート(Packard Bioscience)で実施するACE阻害アッセイで使用した。基質はAdriana K. Carmona (Dept. of Biophysics, Escola Paulista de Medivina, Universidae Federal de Sao Paulo, Brazil)の寄贈であった。Abz-FRK-(Dnp)P-OHのストック溶液をDMSO中で調製した。ε365=17300M−1cm−1のモル吸光係数を使用して分光光学的に測定した。アッセイバッファーの組成は、100mMのNaClを含む100mMトリス/HClバッファー、pH7.0であった。4μlのアッセイバッファー中のサンプル溶液を各ウェルに添加した。コントロールの場合では、バッファーのみを添加した。サンプルを蛍光測定器(Fluostar, BMG labtechnologies)で三重に測定した。装置は最初に150μlの基質(アッセイバッファー中に3.75μM)を分散し、次いで各ウェルに20μlのACE(0.00625ユニット/ml)を添加した。λex=320nm及びλem=420nmの蛍光を測定することにより、ACE活性を10サイクル(約10分)測定した。生データを傾斜/秒に変換し、ACE阻害活性を以下の等式を使用して計算した。
ACE及び合成基質(Abz-FRK-(Dnp)P-OH)を、白色光学プレート96ミクロプレート(Packard Bioscience)で実施するACE阻害アッセイで使用した。基質はAdriana K. Carmona (Dept. of Biophysics, Escola Paulista de Medivina, Universidae Federal de Sao Paulo, Brazil)の寄贈であった。Abz-FRK-(Dnp)P-OHのストック溶液をDMSO中で調製した。ε365=17300M−1cm−1のモル吸光係数を使用して分光光学的に測定した。アッセイバッファーの組成は、100mMのNaClを含む100mMトリス/HClバッファー、pH7.0であった。4μlのアッセイバッファー中のサンプル溶液を各ウェルに添加した。コントロールの場合では、バッファーのみを添加した。サンプルを蛍光測定器(Fluostar, BMG labtechnologies)で三重に測定した。装置は最初に150μlの基質(アッセイバッファー中に3.75μM)を分散し、次いで各ウェルに20μlのACE(0.00625ユニット/ml)を添加した。λex=320nm及びλem=420nmの蛍光を測定することにより、ACE活性を10サイクル(約10分)測定した。生データを傾斜/秒に変換し、ACE阻害活性を以下の等式を使用して計算した。
ACE阻害(%)=[1−(S平均−B平均)/(C平均−B平均)]×100
式中、
S平均=サンプル(ペプチド+基質+ACE)の平均結果
B平均=バックグランド(基質)の平均結果
C平均=コントロール(ACE+基質)の平均結果
式中、
S平均=サンプル(ペプチド+基質+ACE)の平均結果
B平均=バックグランド(基質)の平均結果
C平均=コントロール(ACE+基質)の平均結果
ACE阻害アッセイ2:修飾Matsuiアッセイ
ACE阻害活性を、Matsui等(Matsui, T.等 (1992) Biosci. Biotech. Biochem. 56: 517-518)の方法に従って、以下に記載の修飾をしてアッセイした。
ACE阻害活性を、Matsui等(Matsui, T.等 (1992) Biosci. Biotech. Biochem. 56: 517-518)の方法に従って、以下に記載の修飾をしてアッセイした。
各サンプルに対して、75μlの3mMヒプリルヒスチジンロイシン(Hip-His-Leu, Sigma chemicals Co.;この化学物質を200mM NaClを含む250mMホウ酸、pH8.3に溶解した);20μlの0.1U/mlACE(Sigmaから得た)または水、及び25μlのサンプルまたは水を混合した(表1参照)。混合物を37℃でインキュベートし、125μlの0.5MHClを添加することにより30分後に停止した。その後225μlのビシン/NaOH溶液(1M NaOH:0.25Mビシン(4:6))を添加し、その後25μlの0.1M TNBS(2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸, Fluka, Switzerland; 0.1M Na2HPO4中)を添加した。37℃で20分間インキュベートした後、4mlの0.2M NaH2PO4中の4mM Na2SO3を添加し、416nmでの吸光度をUV/Vis分光光度計(CPSコントローラー, Netherlandsを備えたShimadzu UV-1601)で測定した。
ACE阻害(ACEI)活性の量を、インヒビターの不存在下でのACEの変換速度と比較した阻害のパーセンテージとして計算した:
ACE阻害(ACEI)活性の量を、インヒビターの不存在下でのACEの変換速度と比較した阻害のパーセンテージとして計算した:
ACEI(%)=(((C1−C2)−(S1−S2)/(C1−C2))×100 (1)
式中、
C1=ACE阻害成分なしの吸光度(=最大のACE活性)[AU]
C2=ACE阻害成分とACEなしの吸光度(バックグランド)[AU]
S1=ACEとACE阻害成分の存在下での吸光度[AU]
S2=ACE阻害成分の存在下だがACEなしの吸光度[AU]
式中、
C1=ACE阻害成分なしの吸光度(=最大のACE活性)[AU]
C2=ACE阻害成分とACEなしの吸光度(バックグランド)[AU]
S1=ACEとACE阻害成分の存在下での吸光度[AU]
S2=ACE阻害成分の存在下だがACEなしの吸光度[AU]
HPLC−MRM−MSを使用するペプチドの定性
全ての測定は、Waters Quattro-IIまたはQuattro-Ultimaの三重の4重極子質量分析計で実施した。LC分離を、0-50%アセトニトリル/0.1%(v/v)TFAを使用して、3μmの粒子で実装された150×2.1mmのInertsil 5 ODS3カラム(Chompack)で25℃で実施した。カラムの流速は0.2ml/分であった。ポストカラムメイクアップ後の全流量は0.05/分であり、プロピオン酸とプロパノール-2の7/3(v/v)混合物を含んだ。勾配係数を、ポジティブESIモードでMRMマススペクトロメトリーを使用して分析した。キャピラリー電圧は4kVであった。ソース及びネブライザー温度は、それぞれ100℃及び250℃であった。乾燥とネブライザーガス流量は、それぞれ300l/h及び17l/hであった。衝突ガスは、7.9e-4mbarの圧力でアルゴンであった。分析されたペプチドについてのMSデータが表2に示されている。
全ての測定は、Waters Quattro-IIまたはQuattro-Ultimaの三重の4重極子質量分析計で実施した。LC分離を、0-50%アセトニトリル/0.1%(v/v)TFAを使用して、3μmの粒子で実装された150×2.1mmのInertsil 5 ODS3カラム(Chompack)で25℃で実施した。カラムの流速は0.2ml/分であった。ポストカラムメイクアップ後の全流量は0.05/分であり、プロピオン酸とプロパノール-2の7/3(v/v)混合物を含んだ。勾配係数を、ポジティブESIモードでMRMマススペクトロメトリーを使用して分析した。キャピラリー電圧は4kVであった。ソース及びネブライザー温度は、それぞれ100℃及び250℃であった。乾燥とネブライザーガス流量は、それぞれ300l/h及び17l/hであった。衝突ガスは、7.9e-4mbarの圧力でアルゴンであった。分析されたペプチドについてのMSデータが表2に示されている。
in vitro胃腸消化
発酵したまたは加水分解したミルクタンパク質を胃と小腸における典型系的な条件に供することにより、ヒトの胃腸管におけるペプチドを安定性を研究した。2.0gのNaCl、2.9gのペプシン、及び0.45gのRhizopus oryzae由来のAmano Lipase F-AP15を含む820mlの水中に、80mlの発酵したまたは加水分解したミルクタンパク質を溶解することにより、胃の条件として擬制した。液をHClでpH3.5に調節し、ぺドル(50rpm)で攪拌し、60分間37℃で維持した。次いで、刺激した胃液に9gのパンクレアチンと125mgの塩水抽出物を添加し、NaHCO3で6.8にpHを調節することにより、腸の条件として擬制した。刺激した腸液を、ぺドル(50rpm)で攪拌し、37℃で120分維持した。in vitro胃腸消化の間の各種の時点で、サンプルを回収した。回収後、サンプルを直接95℃で30分過熱し、その後-20℃で貯蔵した。
発酵したまたは加水分解したミルクタンパク質を胃と小腸における典型系的な条件に供することにより、ヒトの胃腸管におけるペプチドを安定性を研究した。2.0gのNaCl、2.9gのペプシン、及び0.45gのRhizopus oryzae由来のAmano Lipase F-AP15を含む820mlの水中に、80mlの発酵したまたは加水分解したミルクタンパク質を溶解することにより、胃の条件として擬制した。液をHClでpH3.5に調節し、ぺドル(50rpm)で攪拌し、60分間37℃で維持した。次いで、刺激した胃液に9gのパンクレアチンと125mgの塩水抽出物を添加し、NaHCO3で6.8にpHを調節することにより、腸の条件として擬制した。刺激した腸液を、ぺドル(50rpm)で攪拌し、37℃で120分維持した。in vitro胃腸消化の間の各種の時点で、サンプルを回収した。回収後、サンプルを直接95℃で30分過熱し、その後-20℃で貯蔵した。
実施例1の結果が表3に示されている。
表3で使用された記号の説明
+=安定
−=細胞または血清によりかなり分解
+/−=細胞または結成によりゆっくりと分解
ND=測定不能
+=安定
−=細胞または血清によりかなり分解
+/−=細胞または結成によりゆっくりと分解
ND=測定不能
表3は、全てのXPP[式中、X=C、M、S、T、またはK]が、中程度から良好なACEインヒビターであることを示す(低いIC50値)。それにこれらのペプチドは、試験された他のペプチドと比較して、ヒトの血清に供された場合にゆっくりと分解を示し、HUVEC、Caco−2、及び胃腸酵素に供された場合に比較的安定である。
Claims (9)
- アンギオテンシン変換酵素インヒビターの調製のための、トリペプチドXPP[式中、X=C、M、S、T、またはK、及び/またはそれらの塩]の使用。
- 前記トリペプチドがXPP[式中、X=C、M、S、またはT]である、請求項1に記載の使用。
- 前記トリペプチドがXPP[式中、X=M、S、またはT]である、請求項2に記載の使用。
- 前記アンギオテンシン変換酵素インヒビターが機能性食料品である、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
- 5mg/g以上のXPP[式中、X=C、M、S、T、K、P、またはA]の量を含む、ヒトにおける血圧低下に適した食料品。
- XPPの量が10mg/g以上である、請求項5に記載の食料品。
- XPPの式中、X=C、M、S、またはTである、請求項5または6に記載の食料品。
- XPPの式中、X=M、S、またはTである、請求項7に記載の食料品。
- XPP[式中、X=C、M、S、T、またはK]を含む食料品の調製方法であって、以下の工程:
a)加水分解化タンパク質産物を生成する、配列XPPを有するタンパク質を含む基質の酵素的加水分解
b)前記加水分解化タンパク質産物からのトリペプチドで富化した分画の分離
c)トリペプチドXPPで富化した固体を得るための、工程b)からの前記分画の乾燥
d)前記食料品の調製における成分としての、工程c)で調製された固体の使用
を含む方法。
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