MXPA05000395A - Proceso para la preparacion de fibrinogeno. - Google Patents

Abstract

Se describen composiciones farmaceuticas que poseen una distribucion y potencia de farmaco uniforme, que utilizan lasofoxifeno como ingrediente activo, y que contienen un dioxido de silicio para reducir la perdida de ingrediente activo durante el procedimiento de fabricacion, y metodos para fabricar estas composiciones.

Description

PROCESO PARA LA PREPARACION DE FIBRINOGENO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a procesos para la purificación de fibrinogeno, y a preparaciones de fibrinogeno fácilmente solubilizadas . El fibrinogeno es una proteina del plasma de la sangre que está relacionado en la formación de coágulos. Se convierte en el monómero de fibrina mediante la acción de la trombina proteasa en el plasma. Los monómeros de fibrina se agrupan entre sí para formar un coágulo débil y después se reticulan mediante la acción del factor XIII activado (es decir, el factor XlIIa) a una forma de coágulo más fuerte. El fibrinogeno se usa en terapia en combinación con la trombina en los llamados cicatrizantes de fibrina hasta alcanzar la hemostasis, para cicatrizar heridas y para la adhesión controlada de tejido. Los concentrados de fibrinogeno también se usan para el tratamiento de la terapia de reemplazamiento de pacientes con deficiencia de fibrinogeno (afibrinogenemia) que puede ser hereditaria o adquirida. - . Para · todas las aplicaciones clínicas, es importante tener fibrinogeno altamente puro para minimizar cualesquiera efectos colaterales indeseables que resultan de, por ejemplo, la presencia de proteínas contaminantes indeseables. En particular, es deseable que las preparaciones de fibrinogeno REF.: 161149 para el uso clínico, estén libres de plasminógeno y plasmina (Blomback B . , Blomback ., "Purification of human and bovine fibrinogen" , Arkiv for Kemi 1956; 10:415-443, y Mosesson M.W., "The preparation of human fibrinogen free of plasminogen" , Biochim Biophys Acta 1962, 57:204-213). El plasminógeno es el precursor inactivo de la plasmina, una enzima fibrinolítica que difiere los coágulos de fibrina. Por lo tanto, la presencia de plasminógeno en una preparación de fibrinogeno destinada para el uso in vivo, es indeseable porque la plasmina generada del plasminógeno en el sitio de la formación del coágulo puede desestabilizar después al coágulo . El plasminógeno tiende a co-purificar con el fibrinogeno y su remoción puede ser difícil. Por lo tanto, algunas preparaciones clínicas de fibrinogeno contienen agentes anti-fibrinolíticos para inhibir la plasmina o el plasminógeno presentes (por ejemplo, aprotinina, un inhibidor de la proteína de bovino de plasmina; o ácido tranexámico, un inhibidor de plasmina sintético también asociado con los efectos secundarios neurotóxicos) . Una ventaja de la .separación de plasminógeno del fibrinogeno es que después no hay necesidad de usar tales inhibidores fibrinolíticos en la preparación clínica de fibrinogeno. Además, es altamente deseable que el fibrinogeno derivado de fuentes humanas y animales se trate para inactivar cualquier virus encontrado en la sangre que puede estar presente, por ejemplo virus de la hepatitis o HIV. Son conocidos en la técnica diferentes métodos para la inactivación de virus, que incluyen pasteurización, tratamiento con calor seco y tratamiento con detergente y solvente (Pathogen Inactivation of Labile Blood Products, Council of Europe Expert Comittee and Blood Transfusión Study Group on Pathogen Inactivation in Labile Blood Products, Transfusión Medicine, 2001, 11, 149-175) . El tratamiento térmico seco se conoce que es efectivo para la inactivación de virus cubiertos y algunos descubiertos, mientras que el tratamiento con detergente y solvente se conoce que es efectivo para la inactivación de virus cubiertos (es decir, recubiertos con lipidos) tal como hepatitis B. Son conocidos en la técnica diferentes métodos para la purificación de fibrinógeno. Sin embargo, los métodos de purificación del arte previo tienen varias desventajas. Por ejemplo, los métodos de precipitación no permiten la fácil incorporación de una etapa de inactivación del virus con detergente y solvente (SD) , ya que la remoción de los reactivos SD es afectada mucho más eficientemente de manera cromatográfica . Los métodos de cromatografía no pueden separar el fibrinógeno del plasminógeno en una sola etapa, lo cual puede conducir a la necesidad de una cromatografía adicional para adsorber el plasminógeno o la necesidad de adicionar un agente anti-fibrinolítico a la preparación de fibrinógeno final, para combatir el plasminógeno residual. Además, no todos los métodos del arte previo son apropiados para la purificación del fibrinógeno de una amplia gama de soluciones que contienen fibrinógeno (incluyendo fracciones de plasma y recombinantes) . La US 5,169,936 ha sugerido anteriormente que la cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC, por sus siglas en inglés) puede usarse en la preparación de fibrinógeno humano. Sin embargo, no se describen ejemplos de tal método, ni se sugiere que la IMAC pueda usarse para la separación de fibrinógeno de plasminógeno . También es conocido que puede ser difícil la disolución de concentrados de fibrinógeno, y a menudo requiere el uso de temperaturas elevadas o agitación prolongada (ver US 5,260,420 y EP-A 0804933). Debido a la inestabilidad de las soluciones líquidas de fibrinógeno con el tiempo, las preparaciones de fibrinógeno para el uso clínico se comercializan en la forma de una solución completamente congelada o como un liofilizado (es decir una preparación secada por congelado) . Antes del uso, el producto comercial debe descongelarse o reconstituirse del liofilizado. Ambas de estas medidas requieren tiempo y esfuerzo considerables.

Por lo tanto, sería ventajoso proporcionar métodos alternativos para la purificación de fibrinogeno, en particular un método que es aplicable a cualquier material iniciador que contiene fibrinogeno y que permita la 5 incorporación de una o más etapas de inactivación del virus. También sería ventajoso proporcionar un método para la separación de fibrinogeno del plasminógeno . Además, sería ventajoso proporcionar un liofilizado, y de preferencia un concentrado de fibrinogeno tratado con calor, que pueda 0 volver a disolverse fácilmente a temperatura ambiente. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para la separación y purificación de fibrinogeno y por lo menos otra proteína que comprende las etapas de : 5 (a) cargar una solución que comprende fibrinogeno y por lo menos otra proteína sobre una matriz de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados, bajo condiciones- de modo que el fibrinogeno y por lo menos otra proteína se enlacen a la matriz, y 0 (b) eluir selectivamente el fibrinogeno y por lo menos - ' otra proteína de forma separada de la matriz. El fibrinogeno y por lo menos otra proteína pueden colectarse de forma separada y cada uno procesarse adicionalmente conforme se requiera . 5 De preferencia, la solución que comprende fibrinogeno es una fracción de plasma que contiene fibrinógeno. De preferencia, por lo menos la otra proteína es plasminógeno . En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para la separación de fibrinógeno del plasminógeno, que comprende el uso de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados. De preferencia, el método comprende las etapas de: (a) cargar una solución que comprende fibrinógeno y plasminógeno sobre una matriz de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados, bajo condiciones de modo que por lo menos el fibrinógeno se enlace a la matriz, y (b) eluir selectivamente el fibrinógeno de la matriz. De preferencia, el plasminógeno también se enlaza a la matriz, y el plasminógeno y el fibrinógeno también pueden eluirse selectivamente de forma separada de la matriz. Como se usa en la presente, las referencias a la separación y/o purificación del fibrinógeno incluyen la separación y/o co-purificación combinada del fibrinógeno y el factor XIII juntos, de los materiales iniciadores que comprenden el fibrinógeno y el factor XIII. El material iniciador para los métodos de la invención puede ser cualquier solución que contiene fibrinógeno, que incluye plasma o una fracción de plasma de humano o animal, fracciones de cultivo celular de tecnología recombinante, fracciones derivadas de leche de animales transgénicos , etc.

Los materiales iniciadores preferidos son fracciones de plasma, tales como crioprecipitado, precipitado de heparina y precipitado frío. Los materiales iniciadores más preferidos incluyen precipitado de heparina y crioprecipitado. Otros materiales iniciadores preferidos incluyen los que comprenden adicionalmente plasminógeno y/o factor XIII . El material iniciador puede prepararse mediante cualquier método apropiado conocido en la técnica, que incluye manipulación por vía genética, por ejemplo en el cultivo celular o especies transgénicas . Por ejemplo, el crioprecipitado puede prepararse de acuerdo con el método de Gunson H.H., Bidwell E., Lañe R.S., Wensley R.T., Snape T.J., "Variables involved in cryoprecipitate production and their effect on Factor VIII activity" , British Journal of Haematology, 1978; 43:287-295; el precipitado de heparina puede prepararse de acuerdo con el método de Winkelman L . , Owen N.E., Evans D.R., Evans H.E., Haddon M.E., Smith J.K., Prince P.J., Williams J.D. , Lañe R.S., "severely heated therapeutic Factor VIII concéntrate of high specific activity", Vox Sanguinas, 1989; 57:97-103; y el precipitado frío de acuerdo con el método de Smith J.K., Evans D.R., Stone V., Snape T.J., "A Factor VIII concéntrate of intermedíate purity and higher potency" , Transfusión, 1979; 19 :299-30S . Los contaminantes indeseados en el material iniciador que pueden separarse del fibrinógeno usando los métodos de la invención, pueden incluir otras proteínas (por ejemplo proteínas de plasma, tal como plasminógeno) , reactivos de las etapas de procesamiento previas (por ejemplo elementos del 5 medio de cultivo celular o reactivos de detergente y solvente), virus y priones. Se prefiere particularmente que el plasminógeno sea removido, de modo que pueda evitarse la adición de los inhibidores de plasmina (agentes anti- fibrinolíticos) al fibrinógeno. 0 La solución que contiene el fibrinógeno se carga sobre una matriz de IMAC. De preferencia, la matriz está presente en una columna para facilidad de procesamiento. Puede usarse cualquier ión metálico apropiado, por ejemplo cobre, zinc o níquel, de preferencia cobre. Los geles de cromatografía de 5 afinidad apropiados del ión metálico inmovilizado para el uso en el proceso de la invención incluyen gel de metacrilato con ligandos multi-sustituidos sobre espaciadores de la cadena lateral (por ejemplo, Fractogel EMD Chelate de Merck) , gel de metacrilato con grupos quelantes sencillos sobre el brazo del 0 espaciador (por ejemplo, Toyopearl Chelate de Tosoh Biosep) y • ·' gel de agarosa reticulado (por ejemplo, Sepharose FF de quelación de Amersham Biosciences) . Un gel preferido es el quelato Toyopearl AF 650 (M) de Tosoh Biosep. Las condiciones de carga, incluyendo el amortiguador 5 usado, deberían elegirse de modo que se enlacen al gel el fibrinógeno, y cualquier factor XIII si estuviera presente, en el material iniciador. Los contaminantes indeseados que no se enlazan al gel después pueden removerse por lavado. Por ejemplo, si el material iniciador se ha sometido previamente a una etapa de inactivación de detergente y solvente, ningún reactivo solvente o detergente restantes se enlazan al gel y se remueven fácilmente por lavado. De manera alternativa, si los contaminantes indeseados se enlazan al gel, estos pueden removerse mediante elución selectiva antes de que se eluya el fibrinógeno, o pueden permanecer unidos al gel mientras el fibrinógeno se eluye selectivamente. Adicionalmente, el lavado del gel y la o las proteínas enlazadas también pueden ayudar a remover cualesquiera virus que pueden estar presentes en las materias primas de alimentación de la cromatografía. Se ha encontrado que el plasminógeno se enlaza menos fuertemente que el fibrinógeno o el factor XIII a los geles de cromatografía del quelato metálico. Por lo tanto, cualquier plasminógeno presente en el material iniciador puede removerse por lavado, por elución selectiva usando una solución de baja concentración del compuesto de quelación competitivo de bajo peso molecular o cambiando las condiciones para reducir la fuerza de unión, por ejemplo, reduciendo el pH o concentración iónica, mientras el fibrinógeno permanece unido. Los compuestos de quelación apropiados incluyen aminoácidos, por ejemplo alanina, leucina y lisina, imidazol, sales de citrato y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) . Un compuesto de quelacion apropiado para la elución de plasminogeno es la alanina. La concentración del compuesto de quelacion debería elegirse de modo que el plasminogeno se eluya mientras que el fibrinógeno permanezca unido al gel . La concentración exacta dependerá del eluyente usado. Por ejemplo, las concentraciones < de aproximadamente 20 mM deberían remover selectivamente el plasminogeno en presencia del fibrinógeno enlazado. Las concentraciones apropiadas para la elución del plasminogeno incluyen = 20 mM de alanina o leucina, < 10 mM de lisina y < 10 mM de imidazol. El fibrinógeno después puede eluirse usando una concentración mayor del mismo o un compuesto de quelacion diferente, o reduciendo el pH o la concentración iónica. Los compuestos de quelacion preferidos para la elución del fibrinógeno son los aminoácidos, de preferencia lisina o arginina e imidazol . Un eluyente más preferido comprende arginina. Por ejemplo, el fibrinógeno puede eluirse usando una solución > 20 mM del compuesto de quelacion. Las condiciones para la elución del fibrinógeno (concentración y pH) deberían elegirse de modo que el fibrinógeno se remueva del gel, pero el ión metálico no, para minimizar la contaminación del producto con iones metálicos.

La remoción del plasminógeno es ventajosa ya que el fibrinogeno después puede usarse clínicamente sin la necesidad de adicionar ningún anti-fibrinolítico a la preparación clínica. Una característica ventajosa adicional 5 es que el plasminógeno que se ha separado del fibrinogeno por IMAC después puede procesarse adicionalmente , para producir un concentrado de plasminógeno para uso clínico. Por lo tanto, la IMAC puede usarse para preparar el plasminógeno y el fibrinogeno de una solución iniciadora que comprende el 0 plasminógeno y el fibrinogeno. Es una característica ventajosa de los procesos de la invención que cualquier factor XIII en el material iniciador, tiende a co-eluirse con el fibrinogeno. La presencia medible del factor XIII (>1 u/ml) en las preparaciones de fibrinogeno 5 final puede ser benéfica si el fibrinogeno va a usarse clínicamente. Se ha mostrado que la concentración del factor XIII tiene un efecto en algunas pruebas in vi tro de Ios- cicatrizantes de fibrina, aunque no hay evidencia de que el factor XIII sea requerido para la eficacia clínica, y los 0 productos cicatrizantes de fibrina sin actividad medible del - ¦ factor XIII se han usado con efecto clínico. Cuando se usa en un ambiente sanguíneo (por ejemplo, para homeostasis) , el factor XIII endógeno del paciente estará presente para efectuar la reticulación del coágulo. Mientras que este no es 5 el caso, es posible que la presencia del factor XIII en el producto pueda ser benéfica. Dado que el factor XIII es una enzima catalítica puede operar efectivamente aun a baja concentración . Por lo tanto, la presente invención proporciona además un método de co-purificación de fibrinógeno y el factor XIII, que comprende el uso de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados. De preferencia, el método comprende las etapas de : (a) cargar una solución que comprende fibrinógeno y el factor XIII sobre una matriz de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados bajo las condiciones de modo que el fibrinógeno y el factor XIII se enlacen a la matriz, y (b) co-eluir selectivamente el fibrinógeno y el factor XIII de la matriz. Opcionalmente , el material iniciador que contiene el fibrinógeno puede someterse a un tratamiento de inactivación de virus con detergente y solvente antes de la cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados. La inactivación del virus de detergente y solvente puede llevarse a cabo usando los reactivos y los métodos conocidos en la técnica (ver por ejemplo, US 4,481,189, US 4,613,501 y US 4,540,573, todos las cuales se incorporan en la presente por referencia) . Los solventes apropiados incluyen fosfato de tri-n-butilo (TnB?) y éter, de preferencia TnBP. Los detergentes apropiados incluyen polisorbato (T een) 80, Polisorbato (Tween) 20 y Tritón X-100. Un detergente preferido es polisorbato 20 y una combinación particularmente preferida es polisorbato 20 y TnBP. La fracción que contiene el fibrinógeno puede agitarse con reactivos solventes y detergentes a una temperatura y durante un tiempo suficiente para inactivar cualquier virus cubierto que pudiera estar presente. Por ejemplo, el tratamiento de detergente y solvente puede llevarse a cabo durante aproximadamente 1 hora a 25 °C. El fibrinógeno recuperado de la etapa de cromatografía después puede procesarse adicionalmente para formularlo para el uso farmacéutico. Por ejemplo, puede concentrarse por ultrafiltración hasta una concentración de aproximadamente 15-30 mg/tnl, y/o someterse a una etapa de reducción de patógenos adicional, por ejemplo nanofiltración . El concentrado después puede formularse mediante la adición de una combinación de estabilizadores apropiados, por e emplo un aminoácido, un carbohidrato, una sal y un detergente. Particularmente, de preferencia el producto se formula sin la adición de ningunos agentes anti-fibrinolíticos o proteínas de estabilización, tal como albúmina. El producto formulado después puede esterilizarse por filtración y liofilizarse (secado por congelado) para almacenamiento a largo plazo. Opcionalmente , el producto secado por congelado puede someterse a un tratamiento térmico seco en una etapa de inactivación de virus adicional. Por ejemplo, puede calentarse a aproximadamente 80°C durante aproximadamente 72 horas o aproximadamente 100°C durante aproximadamente 24 horas. La combinación del aminoácido, la sal, el carbohidrato y el detergente usado para formular el producto de fibrinogeno ayuda a estabilizarlo por medio de la etapa de tratamiento térmico terminal y secado por congelado. También facilita la reconstitución del producto secado por congelado. En particular, los estabilizadores ayudan a estabilizar cualquier factor XIII presente en el producto, que es conocido que es altamente lábil. El producto liofilizado y tratado con calor puede reconstituirse con agua a temperatura ambiente en menos de 15 minutos, de preferencia menos de 10 minutos y más preferentemente menos de 5 minutos, para proporcionar una solución de fibrinogeno con una concentración de por lo menos aproximadamente 60 mg/ml. Es una característica ventajosa del proceso de la invención que se retire el plasminógeno, evitando de esta forma la necesidad de adicionar agentes anti-fibrinoliticos a la preparación de fibrinogeno final . Por lo tanto, como una característica adicional de la invención, se proporciona una preparación de fibrinogeno liofilizada, de preferencia tratada con calor, que comprende el fibrinógeno preparado de acuerdo con uno de los métodos de la invención, un carbohidrato, un amortiguador, una sal, un aminoácido y un detergente y opcionalmente el factor XIII, siendo la preparación capaz de disolverse en agua a temperatura ambiente en menos de 15 minutos, de preferencia menos de 10 minutos y más preferentemente menos de 5 minutos, para dar una solución de fibrinógeno. De preferencia, la concentración de fibrinógeno en la solución final es por lo menos de aproximadamente 60 mg/ml . Sin desear ser vinculado con ninguna teoría, se cree que la combinación de la sal, el detergente, el aminoácido y el carbohidrato facilita la rápida disolución de la preparación. El carbohidrato también se cree que ayuda a preservar cualquier actividad del factor XIII presente. El amortiguador controla el pH de la formulación. El uso de una combinación de un carbohidrato, un amortiguador, una sal, un aminoácido y un detergente en la preparación también estabiliza el fibrinógeno, y cualquier factor XIII presente, sin la necesidad de adicionar ningún otro estabilizador, por ejemplo, otras proteínas, tal como albúmina. Esto es ventajoso ya que la adición de otras proteínas puede ser una fuente de contaminación vital u otra contaminación del producto . De esta manera las preparaciones de fibrinógeno de la invención están libres de proteínas estabilizadoras , en particular albúmina. De preferencia, las preparaciones de fibrinógeno de la invención también están libres de agentes anti-fibrinolíticos . Los aminoácidos apropiados incluyen arginina, los carbohidratos apropiados incluyen sacarosa, trehalosa y rafinosa, de preferencia sacarosa, los amortiguadores apropiados incluyen sales de citrato (por ejemplo citrato de sodio) y sales de fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio) , las sales apropiadas incluyen cloruro de sodio y los detergentes apropiados incluyen polisorbato 20. De preferencia, el detergente usado en la formulación final es el mismo detergente usado para cualquier etapa previa de inactivación de virus de detergente y solvente, la formulación de aminoácidos es la misma que la usada para eluir el fibrinógeno de la columna de quelato metálico, y los componentes de la sal y el amortiguador son los mismos que los usados durante la purificación, por lo que se evita la necesidad de remover cantidades trazas de estos componentes del producto. También se desea minimizar la exposición del producto a una multiplicidad de reactivos durante la manufactura, ya que cada reactivo usado es una fuente de ¦ posible contaminación o modificación indeseada del producto. Así, es preferible si las formulaciones del producto final son reactivas que ya se han usado durante el procesamiento. Las concentraciones apropiadas de los diferentes componentes dependerán de la naturaleza y la fuente exacta del fibrinógeno, y pueden determinarse usando las pruebas rutinarias y los experimentos por error. Los intervalos de concentración apropiados antes del secado por congelado incluyen: carbohidrato (de preferencia sacarosa) : aproximadamente 0.5-2.5% p/p; detergente (de preferencia polisorbato 20) : aproximadamente 0.1-0.5% p/p ; sal (de preferencia cloruro de sodio) : aproximadamente 50-250 mM, de preferencia aproximadamente 50 mM; aminoácido (de preferencia arginina) : aproximadamente 50-120 mM, de preferencia aproximadamente 110 mM. Se adiciona amortiguador suficiente para controlar el pH conforme se desee, por ejemplo a aproximadamente pH 7.5. Las formulaciones preferidas comprenden aproximadamente 0.5-2.5% p/p de sacarosa, aproximadamente 0.1-0.5% p/p de polisorbato 20, aproximadamente 50-250 mM, más-preferentemente aproximadamente 50 mM de cloruro de sodio y aproximadamente 50-120 mM de arginina a aproximadamente pH 7.5. •Las preparaciones de fibrinógeno de la invención se preparan formando una solución de los componentes y después liofilizando la solución. Después de la liofilización, la preparación seca se somete de preferencia a una etapa de tratamiento térmico terminal para inactivar virus cubiertos y descubiertos. Por ejemplo, puede calentarse a aproximadamente 80°C durante aproximadamente 72 horas, o a aproximadamente 100°C durante aproximadamente 24 horas. El tratamiento térmico se conoce que es capaz de desnaturalizar las proteínas, lo cual puede causar agregación y reducir la solubilidad del producto tratado con calor. Los otros ingredientes en las preparaciones de la invención ayudan a estabilizar el fibrinógeno y cualquier factor XIII presente, durante la etapa de tratamiento térmico. Se proporciona ahora una descripción más detallada de las modalidades preferidas de la invención: Recuperación del crioprecipitado del plasma El plasma de humano congelado puede acondicionarse a alrededor de -11 °C, descongelarse entre -0.5 y 2°C y el crioprecipitado resultante recuperarse por centrifugación. El crioprecipitado puede lavarse a < 4°C y recuperarse por centrifugación. El crioprecipitado puede almacenarse congelado .

Precipitación El crioprecipitado puede descongelarse con amortiguador (es decir, redisolverse) para recuperar las proteínas contenidas en el mismo. El fibrinógeno, fibronectina y el factor XIII después pueden precipitarse usando un agente químico apropiado, por ejemplo heparina, polietilen glicol (PEG) o etanol , o mediante el ajuste de la temperatura y el pH. El precipitado después se recupera, por ejemplo por centrifugación. Este precipitado puede almacenarse congelado.

Resuspensión del precipitado La heparina u otro precipitado después pueden resuspenderse usando un amortiguador apropiado y mezclando durante un tiempo apropiado y a una temperatura apropiada. La preparación resultante después puede clarificarse, por ejemplo por filtración o centrifugación intensa, antes de la filtración de 0.45 µt o más pequeñas, para remover cualesquiera agregados que puedan estar presentes y que puedan proteger los virus de los reactivos de inactivación de detergente y solvente .

Tratamiento de detergente y solvente El solvente y el detergente después pueden adicionarse al filtrado, y la mezcla puede agitarse a una temperatura apropiada para inactivar los virus cubiertos. El solvente es de preferencia fosfato de tri-n-butilo (TnBP) , mientras que el detergente puede ser polisorbato 20, polisorbato 80 ó Tritón X-100, de preferencia polisorbato 20.

Cromatografía El material tratado con detergente y solvente después puede aplicarse directamente a una columna de cromatografía de quelato metálico, donde el ión metálico puede ser cobre o cualquier otro ión apropiado . Las condiciones del amortiguador y la carga son tales que los componentes del solvente y el detergente no se retienen por el adsorbente, mientras que el fibrinógeno sí. Cualquier plasminógeno que se enlaza después puede eluirse selectivamente usando una baja concentración de un compuesto de quelación de bajo peso molecular, por ejemplo alanina. La fracción lavado del eluato que contiene el plasminógeno después puede procesarse adicionalmente para producir un concentrado de plasminógeno que puede usarse clínicamente. El fibrinógeno después puede eluirse a alto rendimiento, usando una mayor concentración del mismo u otro compuesto de quelación, por ejemplo arginina. El factor XIII se co-eluye con el fibrinógeno. El fibrinógeno en general está presente en el eluato a concentraciones de aproximadamente 3-20 mg/ml. La elución de la columna puede monitorearse mediante .eualquier método apropiado, por ejemplo por absorbancia UV a una longitud de onda de 280 nanómetros . Esto proporciona una medida de la concentración de proteínas en el eluato y puede usarse para indicar la colección de la fracción y/o los cambios en el amortiguador.

Concentración Opcionalmente, el eluato de fibrinógeno puede concentrarse usando ultrafiltración para dar concentraciones finales de aproximadamente 15-30 mg/ml, de preferencia aproximadamente 20-25 mg/ml.

Formulación El concentrado de fibrinógeno puede formularse mediante la adición de una combinación de un aminoácido, un carbohidrato, un amortiguador, una sal y un detergente. El producto formulado después puede esterilizarse por filtración a 0.2 µt? y llenarse. La filtración puede remover o reducir los virus y otros patógenos, por ejemplo en agente causal de Encef lopatías Espongiformes Transmisibles (TSE) , que se cree actualmente que son priones. El amortiguador de formulación (y las condiciones de secado por congelado) se eligen de preferencia de modo que el tapón de fibrinógeno puede reconstituirse en agua a temperatura ambiente en menos de 10 minutos. Una formulación preferida es arginina 110 mM, - sacarosa al 1.5% p/p, polisorbato 20 al 0.1% p/p, NaCl 50 mM, citrato trisódico 10 mM.

Tratamiento de secado por congelado y térmico El producto se seca por congelado y después se trata opcionalmente con calor a temperaturas elevadas para inactivar los virus cubiertos y descubiertos . La contaminación microbiológica durante el proceso se minimiza mediante la sanitización apropiada del medio IMAC y por filtración de los amortiguadores para remover la contaminación bacteriana (por ejemplo, mediante el uso de filtros de 0.2 µt ) . El fibrinogeno preparado usando el proceso de la invención puede usarse clínicamente, ya sea solo o en combinación con trombina en un kit de cicatrización de fibrina. Por lo tanto, la presente invención también proporciona fibrinogeno obtenido de acuerdo con el proceso de la invención, para el uso en terapia, y kits farmacéuticos que comprenden el fibrinogeno obtenido de acuerdo con el proceso de la invención en combinación con trombina. Se prefieren los kits que comprenden el fibrinogeno preparado de acuerdo con el proceso de la invención y la trombina preparada de acuerdo con la solicitud del PCT co-pendiente del solicitante No. (desconocido), titulada "Process for the preparation of - thrombin" (Proceso para la preparación de trombina) presentada el 7 de julio de 2003 que reivindica la prioridad de la solicitud de patente UK No. 0216002.6 presentada el 10 de julio de 2002, la descripción de las cuales se incorpora en la presente por referencia. La invención se ilustrará además con referencia a los siguientes Ejemplos no limitantes.

El fibrinógeno se midió usando los siguientes métodos: Prueba de Precipitación Térmica basada en un método publicado por Desvignes, P. and Bonnet, P., "Direct Determination of Plasma Fibrinogen levéis by Heat Precipitation . ? comparison 5 of the Technique against Thrombin Clottable Fibrinogen with Spectrophotometry and Radial Immune Diffusión", Clínica Chimica Acta, 110 (1981), 9-17. La prueba del. tiempo de coagulación basada en el método de Clauss (Clauss, A., Gerinnungaphysiologische Schnellmethode zur Bestimmung des 10 Fibrinogens. Acta Haematol 1957; 17:234-46). La prueba coagulable total basada en un método de Blomback and Blomback, Arkiv fur Chemi . , 1956, Capítulo 10, 415-443. El factor XIII se midió por determinación fotométrica (plasma humano estándar - normal) . El método se basó en las 15 siguientes referencias: Fickenscher, K. , Aab, A., Stüber, W., " Photometric Assay for Elood Coagulation Factor XIII", Thromb. Haemostas .· 65 (1991), 535-540 y Solleder, E . , Demuth, D., Pfeiffer, C. , Bomhard, M., Mayer, J., Eller, T. , Brauer, P., Keller, F., 20 Grun, J. , Fickenscher, K. , Wagner C, "Klinische Prufung - ' elnes neuen photometrischen Tests zur Bestimmung der Factor XIII Aktivitat im Plasma", Lab Med. 16 (1992), 48-53. El plasminogeno y el factor XIII se midieron por ELISA.

Ejemplo 1: Recuperación del crioprecipitado del plasma El plasma se almacenó a menos de -30°C hasta el uso. El peso requerido del plasma después se acondicionó a -11°C antes de destapar el envase. El plasma de fondo (acumulación de plasma de varios donadores) después se descongeló a < 2.5°C para recuperar el fibrinógeno, el factor VIII, el factor de von Willebrand (vWF) y el crioprecipitado de fibronectina del plasma. Este precipitado se recuperó por centrifugación y se almacenó congelado.

Ejemplo 2: Precipitación El crioprecipitado preparado de acuerdo con el Ejemplo 1 se resuspendió en Tris 20 mM/HCl pH 6.7 a una relación de 0.024x del peso del plasma de fondo neto y se descongeló calentando entre 20 y 40 °C durante >20 minutos. El pH después se ajustó a 6.55 con HCl 0.1M. Después se adicionó una solución patrón de heparina para dar una concentración final de 0.88 mg/ml y la mezcla resultante se agitó durante >2 minutos. Esto resultó en la precipitación del fibrinógeno y fibronectina dejando el factor VIII y vWF en solución. El precipitado de heparina después se recuperó por centrifugación. Este precipitado puede almacenarse congelado.

Ejemplo 3: Resuspensión del precipitado El precipitado de heparina preparado de acuerdo con el Ejemplo 2 se resuspendió en Na¾P04 20 mM/Na2HP04, citrato trisódico 10 mM, NaCl 0.5M pH 6.0 en una relación de 1 parte de precipitado a 5 partes de amortiguador. Esta suspensión después se calentó a 40°C y se incubó con mezclado durante >1 hora. El precipitado de heparina resuspendido después se clarificó por filtración a través de dos filtros hondos (Cuno 05SP y Cuno 3OLA) y un filtro de membrana (Sartobran 0.65/0.45 µp?) para asegurar la remoción de agregados que pudieran proteger los virus del tratamiento con detergente y solvente subsecuente.

Ejemplo 4: Tratamiento de detergente y solvente Una solución patrón de detergente y solvente de polisorbato 20 al 20% v/v y TnBP al 6% v/v después se adicionó al filtrado para dar una concentración final de polisorbato 20 de 1% v/v y TnBP de 0.3% v/v. La mezcla resultante después se agitó durante no menos de 1 hora a temperatura ambiente .

Ejemplo 5: Cromatografía El ¦ precipitado de heparina tratado con detergente y solvente preparado de acuerdo con el Ejemplo 4, se cargó en una columna Toyopearl Chelate 650 (M) cargada con cobre que habla sido pre-equilibrada con no menos de 5 volúmenes de lecho de amortiguador 1 (EW1 : Na¾P04 20 mM/Na2HP04 , citrato trisódico 10 tnM, NaCl 0.5 M pH 6.0) . La columna después se cargó con 3 volúmenes de lecho de precipitado de heparina tratado. La velocidad de carga no fue mayor de 77 cm/hr. El lecho después se lavó con 18 volúmenes de lecho de 5 amortiguador 1. El plasminógeno enlazado se lavó usando 15 volúmenes de lecho de amortiguador 2 (EW2 : Na2HP04 20 mM, alanina 15 mM, NaCl 0.5 M pH 7.5). El plasminógeno eluido puede procesarse adicionalmente para producir un concentrado que puede usarse clínicamente. Las condiciones del 0 amortiguador después se ajustaron usando 5 volúmenes de lecho de amortiguador 3 (E 3 : citrato trisódico 10 mM, NaCl 50 mM pH 7.0). El fibrinogeno enlazado después se eluyó usando suficientes volúmenes de lecho de amortiguador 4 (E 4 : arginina 50 mM, citrato trisódico 10 mM, NaCl 50 mM pH 7.5), 5 de modo que la A280nm (absorbancia UV a una longitud de onda de 280 nm) regresó a la línea base. Los iones de cobre después se atraparon de la resina usando 5 volúmenes de lecho de Na2HP04 20 mM, NaCl 0.25 M, EDTA 50 mM pH 7.0. 0 Ejemplo 6: Concentración ¦ ·" .- El fibrinogeno eluido preparado de acuerdo con el Ejemplo 5 se concentró usando una membrana cortada de peso molecular de 100 KDa (Sartocon Sartorius) . La membrana se pre-lavó usando arginina 50 mM, citrato trisódico 10 mM, NaCl 5 50 mM pH 7.5. La concentración objetivo de fibrinogeno fue de 22 mg/ml.

Ejemplo 7: Formulación Una solución de fibrinógeno concentrado preparada de acuerdo con el Ejemplo 6 se formuló mediante la adición de arginina 710 mM, sacarosa al 16.5% p/p, polisorbato 20 al 1.1% p/p, NaCl 50 mM, citrato trisódico 10 mM pH 7.5 a una relación de 1:10. Las concentraciones de la formulación final fueron arginina 110 mM, sacarosa 1.5% p/p, polisorbato 20 al 0.1% p/p, NaCl 50 mM, citrato trisódico 10 mM. El producto formulado después se filtró a 0.2 µp? (Sartobran 0.45/0.2 µt?, Sartorius) .

Ejemplo 8: Tratamiento secado por congelado y térmico El producto del Ejemplo 7 se llenó asépticamente en ampolletas de vidrio a 15 mi por ampolleta y después se secó por congelado, se tapó y se selló. Las ampolletas se trataron con calor a 80 °C durante no menos de 72 horas para inactivar los virus descubiertos y cubiertos .

Ejemplo 9: Cromatografía a escala piloto del concentrado de fibrinógeno 1274 g del precipitado de heparina (preparado de acuerdo con el Ejemplo 2) se re- suspendió en un volumen de 5 veces de Na¾P04 20 mM/Na2HP04, citrato trisódico 10 mM, NaCl 0.5 M pH 6.0 a 40°C en un baño de agua con agitación constante durante más de 1 hora. La solución resultante se filtró a 0.45 µt? con el tren de filtrado Cuno 05SP, Cuno 3 OLA y Sartobran P 0.65/0.45 µt?. La mezcla del detergente y solvente después se adicionó para dar concentraciones finales de polisorbato 20 al 1% v/v y TnBP al 0.3% v/v. La mezcla después se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora . Se cargaron 6391 g del precipitado de heparina tratado con detergente y solvente sobre 2123 L de una resina de Toyopearl AF Chelate 650 (M) empacada en una columna Amicon Vantage 130 para dar una altura de sedimento de 16 cm. La columna de cromatografía se sanitizó usando 5 volúmenes de lecho de NaOH 0.5 M y se equilibró con aproximadamente 5 volúmenes de lecho del amortiguador 1 (E 1, Na¾P04 20 mM/Na2HP04 , citrato trisódico 10 mM, NaCl 0.5 M pH 6.0) . Esta se lavó con aproximadamente 5 volúmenes de lecho de agua destilada. La resina después se cargó con iones metálicos usando aproximadamente 5 volúmenes de lecho de una solución de sulfato de cobre 3 mg/ml. Los iones metálicos débilmente enlazados se removieron usando aproximadamente 5 volúmenes de lecho de arginina 50 mM, citrato trisódico 10 mM, NaCl 50 mM pH 7.5 y después aproximadamente 10 volúmenes de lecho del amortiguador 1. Después se aplicó la carga y el lecho después se lavó con aproximadamente 18 volúmenes de lecho del amortiguador 1. El plasminógeno enlazado se lavó usando aproximadamente 16 volúmenes de lecho del amortiguador 2 (EW2: NaH2P04 20 mM/Na2HP04, alanina 15 mM, NaCl 0.5 M pH 7.5). Las condiciones del amortiguador después se ajustaron usando aproximadamente 5 volúmenes de lecho del amortiguador 3 (EW3: citrato trisódico 10 mM, NaCl 50 mM pH 7.0). El fibrinógeno enlazado después se eluyó usando aproximadamente 5 volúmenes de lecho del amortiguador 4 (E : arginina 50 mM, citrato trisódico 10 mM, NaCl 50 mM pH 7.5). Los iones de cobre después se atraparon de la resina usando aproximadamente 5 volúmenes de lecho de Na2HP04 20 mM, NaCl 0.25 M, EDTA 50 mM pH 7.0. Los datos de las concentraciones y de la recuperación para el fibrinógeno, plasminógeno y el Factor XIII se proporcionan en la Tabla 1. La clarificación del TnBP y el polisorbato 20 se dan en la Tabla 2.

Tabla 1 Muestra Volumen Fibrinógeno Factor XIII Plasminógeno mi mg/ml g, g, o U/ml o g/ml o Carga 6391 11.81 (100) 0.8 (100) 43.9 (100) FT 6407 <1 <8.49 0.01 0.02 EW1 31971 <1 <42.36 0.01 6.25 0.03 0.34 E 2 33800 <1 <44.78 0.05 33.06 7.74 93.25 Muestra Volumen Fibrinógeno Factor XIII Plasminógeno mi mg/ml U/ml ug/ml EW3 10674 <1 <14.14 0.05 10.44 0.20 0.76 EP1 680 EP2 8943 6.45 76.43 0.32 55.98 4.00 12.75 EP3 2060 ED A 9155 <1 <12.13 0.01 0.03 Abreviaciones usadas: FT = flujo a través de; EW1 = lavado en equilibrio 1; EW2 = lavado en equilibrio 2; EW3 = lavado en equilibrio 3; EP1 = pico de elución 1 (borde lider del pico de elución) ; EP2 = pico de elución 2 (pico de elución principal) ; EP3 = pico de elución 3 (borde de salida del pico de elución) .

Tabla 2 Muestra Volumen TnBP Polisorbato 20 (mi) Conc . Recuperación Conc. Recuperación (mg/1) (%) (mg/1) (%) Carga 639.1 2900 (100) 13700 (100) EP2 8943 6.9 0.3 38 0.4 Abreviaciones usadas : EP2 = elución del pico 2 (pico de elución principal) . Los resultados mostraron que las tres proteínas, fibrinógeno, plasminógeno y factor XIII, se capturaron eficientemente en Toyopearl cargada con Cu2+ y después 93% del plasminógeno cargado se removió selectivamente lavando con el amortiguador de alanina 15 mM (EW2) . El producto del fibrinógeno eluido contuvo 76% y 56% del fibrinógeno aplicado y el factor XIII respectivamente. La clarificación de los químicos del detergente y solvente también fue eficiente: sólo 0.3 y 0.4% del TnBP y polisorbato 20 aplicado, respectivamente, se dejaron en el producto después de la cromatografía .

Ejemplo 10: Ultrafiltración del fibrinógeno a escala piloto Dos casetes cortados de polisulfona de Sartorius (0.1 m2 cada uno) se ensamblaron en un sujetador de membrana de Sartorius y se limpiaron con 7 1 de agua desionizada. El montaje se sanitizó con un lavado de 1 1 de NaOH 1 M calentado a 40 °C y después 5 1 de NaOH, se recirculó durante 1, hora-. -El sistema después se limpió con 10 1 de agua desionizada a una velocidad de flujo transversal de 880 ml/min. La membrana se preparó con 5 1 de EW4 (arginina 50 mM, citrato trisódico 10 mM, NaCl 50 mM pH 7.5) sin contrapresión aplicada a la misma velocidad de flujo transversal . 8960 mi de la fracción de fibrinógeno eluido se aplicó a una concentración de fibrinógeno inicial de 5.24 mg/ml a una presión de entrada máxima y presión de trans-membrana de 1.4 y 0.7 bar (140,000 y 70,000 Pa) , respectivamente. La ultrafiltración tomó 1 hora 36 minutos y proporcionó un retenido de 1227 mi y 23.8 mg/ml de fibrinógeno. El flujo promedio fue de 28.8 L/m2/h y las concentraciones de gelificación predichas fueron de 31.0 mg/ml.

Ejemplo 11: Elección de los geles IMAC para la purificación de fibrinógeno Se probaron varios geles de cromatografía de quelato metálico para su capacidad de unirse y liberarse subsecuentemente al fibrinógeno. Estos se representan en la Tabla 3 posterior: Tabla 3 Gel Fabricante Matriz base Grupo de quelación Toyopearl Tosoh Biosep Metacrilato Ácido Chelate AF iminodiacético Gel Fabricante Matriz base Grupo de quelación Toyopearl Tosoh Biosep Metacrilatc Ácido Chelate AF iminodiacético (brazo de espaciador modificado) Fractogel EMD Merck Metacrilato Ácido Chelate iminodiacético Chelating Amersham Agarosa Ácido Sepharose FF Biosciences reticulada iminodiacético El material iniciador fue el crioprecipitado que contuvo fibrinógeno. Este precipitado se redisolvió en el Amortiguador I (amortiguador de fosfato de sodio 20 mM que contiene ya sea cloruro de sodio 250 mM o cloruro de sodio 500 mM, pH 7) . El gel de quelación se cargó con iones metálicos (cobre, níquel o zinc) , después se equilibró con el Amortiguador I. El crioprecipitado redisuelto se aplicó a una columna empacada que contuvo el gel- cargado, equilibrado. Después de que todo el material se había aplicado, la columna se lavó con el Amortiguador I. El fibrinógeno se eluyó lavando la columna con el Amortiguador II (fosfato de sodio 20 mM, amortiguador EDTA 0.05M que contiene cloruro de sodio 250 mM o cloruro de sodio 500 mM, pH 7) o el Amortiguador III (fosfato de sodio 20 mM, arginina 50 mM, cloruro de sodio 250 mM, pH 7.5) o el Amortiguador IV (fosfato de sodio 20 mM, arginina 200 mM, cloruro de sodio 250 mM, pH 7.0) . Los resultados se muestran en la Tabla .

Tabla 4 Gel Ión Fibrinógeno Factor XIII metálico eluido, mg eluido, u/mg por mi de gel de fibrinógeno Toyopearl Chelate Cobre 38.7a 0.3 AF (Tosoh Biosep) Toyopearl Chelate Cobre 24.lb 0.1 AF (Tosoh Biosep) Toyopearl Chelate Cobre 35.6Ü 0.08 AF (brazo de espaciador modificado) (Tosoh Biosep) Gel Ión Fibrinógeno Factor XIII metálico eluido, mg eluido, u/mg por mi de gel de fibrinógeno Fractogel EMD Cobre 30.8a 0.26 Chelate (Merck) Chelating Cobre 16. Ia No probado Sepharose FF (Amersham Biosciences ) Toyopearl Chelate Zinc 23.5a 0.22 AF (Tosoh Biosep) Fractogel EMD Zinc 31a 0.27 Chelate (Merck) Chelating Zinc 11.5a No probado Sepharose FF (Amersham Biosciences ) Toyopearl Chelate Níquel 23.7C No probado AF (Tosoh Biosep) aEluido con el Amortiguador II. bEluido con el Amortiguador III cEluido con el Amortiguador IV.

Los resultados muestran que el fibrinógeno y el factor XIII pueden aislarse de una solución que contiene fibrinógeno usando cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) con una variedad de químicos de matriz de base IMAC e iones metálicos.

Ejemplo 12; Elección de los materiales iniciadores Se investigó la capacidad de la cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) para purificar el fibrinógeno de soluciones que contienen diferente fibrinógeno. Soluciones que contienen fibrinógeno: ?. Crioprecipitado redisuelto obtenido de plasma humano descongelado (preparado de acuerdo con el Ejemplo 1) . B. Precipitado de heparina vuelto redisuelto obtenido de crioprecipitado vuelto a disolver que se había mezclado con heparina (preparado de acuerdo con el Ejemplo 2) . C. Precipitado frío redisuelto obtenido por enfriamiento del crioprecipitado vuelto a disolver. D. Solución que contiene fibrinógeno agotada de forma cromatográfica del factor VIII, factor de von illebrand (vWF) y fibronectina, obtenida de plasma de humano. El precipitado frío usado en C se preparó como sigue: el crioprecipitado, preparado como en el Ejemplo 1, se volvió a disolver en cuatro veces su peso de solución de cloruro de calcio 50 µ? a 28°C. El pH se ajustó a 6.8 con ácido acético 1M y la solución- se enfrió a 10°C. Después de mezclar durante >10 minutos, el precipitado que se formó se colectó por centrifugación . Cada solución A-D, que contiene aproximadamen e 1-20 mg de fibrinógeno por mi, se incubó con solvente y detergente para inactivar los virus, después se aplicó a una columna de resina de IMAC Toyopearl Chelate que se había cargado con iones de cobre, y se equilibró con fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 250 mM, pH 7.0. Después de cargar, la resina se lavó con el mismo amortiguador. El fibrinógeno se eluyó mediante la aplicación de imidazol 25 mM (Amortiguador X) o arginina 50 mM, fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 250 mM, pH 7.5 (Amortiguador Y) . Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5 Los resultados muestran que la IMAC puede usarse para preparar fibrinógeno de diferentes materiales iniciadores que contienen fibrinógeno.

Ejemplo 13: Formulación de fibrinógeno para permitir la rápida re-solución después del tratamiento secado por congelado y térmico El fibrinógeno que habla sido eluido de la resina IMAC de acuerdo con los E emplos 3 y 10 y concentrado a aproximadamente 15 mg/ml en arginina 50 m , fosfato 20 mM, pH 7.5 (Tablas 6 y 8) o arginina 50 mM, citrato trisódico 10 mM, pH 7.5 (Tabla 7) se formuló con varios compuestos adicionados, se rellenó en ampolletas de vidrio (20 mi por ampolleta) y se secó por congelado. Una vez que se completó el secado por congelado, las ampolletas se sellaron a vacío, después se trataron con calor a 80°C durante 72 horas para inactivar los virus. Las ampolletas después . se reconstituyeron con agua (5 mi por ampolleta) a temperatura ambiente (18°C-25°C) . Se midió el tiempo de re-solución, como el tiempo entre la adición de agua y el tiempo en el cual se observó una solución clara homogénea sin materia sólida residual . Los resultados se muestran en las Tabla 6, 7 y 8.

Tabla 6 Arg mM Polys % NaCl mM Cit mM Suc % Tiempo Fib Factor recons, después XIII mins recons, después mg/ml recons, u/ml 50 0.5 250 10 1.5 4.5 44.3 <1 50 0.1 250 10 1.5 8.1 49.3 <1 50 0.5 250 0 0 4.1 40.0 <0.5 50 0.5 250 10 1.5 6.5 37.0 <0.5 50 0.5 250 0 1.5 5.8 33.1 <0.5 50 0.25 250 0 1.5 4.9 35.4 <0.5 50 0.1 250 0 1.5 3.9 39.9 <0.5 50 0.5 230 0 1.5 4.5 36.6 <0.5 50 0.5 200 0 1.5 3.6 37.5 <0.5 50 0.5 180 0 1.5 4.9 35.0 <0.5 50 0.5 150 0 1.5 4.2 37.9 <0.5 50 0.5 130 0 1.5 5.7 36.8 <0.5 50 0.5 100 0 1.5 7.1 36.9 <0.5 50 0.5 80 0 1.5 7.8 36.9. <0.5 ¦ 50 0.5 50 0 1.5 12.2 41.3 1.2 50 0.5 50 10 1.5 8.6 43.3 1.3 50 0.5 50 0 2.5 7.6 40.7 1.2 Tabla 7 Arg mM Polys 1 NaCl mM Phos mM Suc % Tiempo Fib Factor recons , después XIII mins recons, después mg/ml recons, u/ml 50 0.5 250 6.3 63.7 <1.5 50 0.5 50 1.5 4.5 67 2.4 50 0.5 50 20 1.5 2.1 63 1.9 50 0.25 50 1.5 1.4 71.7 1.8 50 0.1 50 1.5 1.6 61.9 1.8 50 0.25 50 20 1.5 2.0 62.1 1.8 50 0.1 50 20 1.5 2.6 70.8 1.7 50 0.5 50 1 4.3 70.1 2.0 50 0.5 50 0.75 2.7 69.1 2.0 50 0.5 50 0.5 2.6 73.3 1.7 50 0.25 50 0.75 3.0 71.7 1.8 100 0.1 50 1.5 8.8 54.8 1.3 50 0.1 250 7.2 53.7 <1 120 0.1 50 1.5 5.7 55.4 <1 Tabla 8 Abreviaciones usadas en las Tablas 6-8: Arg = arginina Poly = polisorbato 20 Cit = citrato Suc = sacarosa Fib = fibrinógeno Recons = reconstitución Carbo = carbohidrato Phos = fosfato Los resultados mostraron que los interva concentración efectiva de los formulaciones fueron: Sacarosa: 0.5-2.5% Polisorbato 20: 0.1-0.5% Cloruro de sodio = 50-250 mM (50 mM para la retención del factor XIII) Arginina: 50-120 mM Las altas concentraciones de cloruro de sodio (250 mM) en combinación con arginina, polisorbato 20 y una sal amortiguadora, permitieron la rápida re-constitución del fibrinógeno secado por congelado, tratado con calor, pero se perdió la actividad del factor XIII. La reducción en el contenido de cloruro de sodio acompañado de la adición de sacarosa, permitió la rápida reconstitución y la retención de la actividad del factor XIII. Las combinaciones selectivas de arginina, polisorbato 20, cloruro de sodio, una sal amortiguadora apropiada y un carbohidrato, proporcionaron una formulación para el fibrinógeno y el factor XIII, que permitió la rápida reconstitución del producto secado por congelado, tratado con calor a temperatura ambiente, con actividad de retención de fibrinógeno y el factor XIII.

Ejemplo 14: Tratamiento por ultrafiltración, formulación, secado por congelado y térmico En cuatro experimentos independientes (A-D) , se resuspendió un precipitado de heparina de acuerdo con el Ejemplo 3 y se trató con detergente y solvente de acuerdo con el Ejemplo 4. La solución resultante se separó por cromatografía de acuerdo con el Ejemplo 9 para dar un eluato rico en fibrinógeno y factor XIII. Este eluato después se concentró de acuerdo con el Ejemplo 10. El concentrado se formuló hasta un objetivo de arginina 110 m , sacarosa al 1.5% p/p, polisorbato 20 al 0.1% p/p, NaCl 50 mM, citrato trisódico 10 mM y se filtró estéril a 0.2 µp\ de acuerdo con el Ejemplo 7. El concentrado filtrado después se llenó asépticamente, se secó por congelado y se trató con calor de acuerdo con el Ejemplo 8, para dar un producto inactivado vital doble. Los eluatos, concentrados filtrados y productos se probaron para la actividad de la proteína coagulable y el factor XIII, y los resultados se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9 Fracción Propiedad A B C D eluato Proteína 5.8 5.6 4.4 4.52 coagulable (mg/mL) Actividad del 0.19 0.41 0.18 0.18 factor XIII (U/mL) Concentrado Proteína 21.2 20.4 22.1 18.2 filtrado coagulable (mg/mL) Actividad del 0.61 1.43 0.68 0.65 factor XIII (U/mL) Fracción Propiedad A B C D Producto Proteina 63.3 45.9 48.8 46.3 coagulable (mg/mL) Actividad del 1.19 1.64 1.25 1.17 factor XIII (U/mL) Tiempo de 9.05 5.35 8.72 11.22 reconstitución (min) Los resultados muestran que el fibrinógeno puede concentrarse a aproximadamente 20 mg/mL usando ultrafiltración . También muestran que las condiciones de formulación proporcionan un producto con una concentración del factor XIII de >1 U/mL y tiempos de reconstitución <<15 min.

Ejemplo 15: Efecto de la concentración del Amortiguador de Elución y pH sobre la elución de fibrinógeno y cobre de una resina de quelato. El crioprecipitado se volvió a disolver en el amortiguador 1 (amortiguador de fosfato 20 mM que contiene NaCl 0.25 M, pH 6.0) y se trató con detergente y solvente como en el Ejemplo 4. La resina de quelato (Toyopearl AF Chelate 650 (M) ) se cargó con iones de cobre, se pre-lavó con el amortiguador de elución apropiado y después se equilibró con el amortiguador 1. Este material se cargó sobre la resina empacada, cargada con cobre. Después de que todo el material se había aplicado, la columna se lavó con quince a veinte volúmenes de amortiguador 1. La columna después se lavó con cinco a siete volúmenes de lecho de amortiguador 2 (amortiguador de fosfato 20 mM que contiene NaCl 0.25 M, pH 7.0) . La columna se eluyó con un amortiguador que contiene fosfato 20 mM, NaCl 0.25 M y arginina a un intervalo de concentraciones y pH. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10 ConcenpH del ConcenMgs de Concenµg de tración de amortiguador tración de fibrinógeno tración cobre/mg de arginina en de elución fibrinógeno eluido/ml de fibrinógeno el eluido de resina cobre eluido amortiguador mg/ml eluido de elución mg/L 200 7 4.5 32.3 8 1.8 100 7 4.8 35.7 4.6 0.95 .. 50 7 2.5 17.5 2 0.8 50 6.0 1.9 17.6 1.4 0.74 50 7.5 4.4 33.3 2 0.46 50 8.0 3.96 35.3 2.5 0.63 Los resultados mostraron que una reducción en la concentración de arginina en el amortiguador de elución redujo la concentración de cobre en el eluato de fibrinogeno, pero tuvo un efecto en la recuperación de fibrinogeno. Un 5 aumento en el pH del amortiguador de elución de arginina 50 mM a 7.5 resultó en una alta recuperación de fibrinogeno y los niveles de cobre co-eluidos se redujeron sustancialmente .

Ejemplo 16: Tratamiento del precipitado de heparina 0 El precipitado de heparina congelado se re-disolvió en fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 mM, citrato trisódico 10 mM, pH 6.0 a una relación de 1:5 en peso. Se compararon dos métodos de re- solución: Método 1: El precipitado de heparina se adicionó al 5 amortiguador a temperatura ambiente. La mezcla después se calentó a 4"0°C y se incubó a 40°C durante 1 hora. Método 2: El amortiguador se pre-calentó a 40°C y el- precipitado de heparina después se adicionó a una velocidad que mantuvo una temperatura de >36°C. Después de la adición 0 de todo el precipitado, la mezcla después se incubó durante 1 - · h a 40°C. Se probaron tres lotes diferentes de precipitado. En cada caso, el método 2 de re-solución resultó en una capacidad de filtrado significativamente mayor. El peso del 5 filtrado final y la concentración de fibrinogeno también fue i I I consistentemente mayor, resultando en rendimientos mejorados de fibrinógeno (ver la Tabla 11) .

Tabla 11 Observaciones : 1 Área de filtrado a escala de banco = 0.00173 m2; área de filtrado de escala piloto = 0.3 m2. La presión de aire aplicado inicial durante la filtración fue de 0.25 bar (25,000 Pa) a escala de banco y 0.1-0.2 bar (10,000-20,000 Pa) a escala piloto. 2 La capacidad del filtro se calcula como la cantidad máxima de material re-solubilizado filtrado dividido por el área del filtro. Los ejemplos que muestran capacidades "mayor que" no bloquearon el filtro bajo las condiciones experimentales . 3 El rendimiento del fibrinógeno se calcula en esta caso como los mg de fibrinógeno recuperado del filtro (= concentración recuperada mgmL"1 x mL de filtrado colectado) dividido por los mg de fibrinógeno que estuvo en este volumen del material iniciador (= concentración aplicada mgmL"1 x mL de filtrado colectado) x 100 (%) . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para la separación y purificación de fibrinógeno y por lo menos otra proteína, caracterizado porque comprende las etapas de : (a) cargar una solución que comprende fibrinógeno y por lo menos otra proteína sobre una matriz de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados, bajo condiciones de modo que el fibrinógeno y por lo menos otra proteína se enlacen a la matriz, y (b) eluir selectivamente el fibrinógeno y por lo menos otra proteína de forma separada de la matriz.
2. 2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque por lo menos otra proteína es pl sminógeno .
3. 3. Un método para la separación de fibrinógeno de plasminógeno, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) cargar una solución que comprende fibrinógeno y ·' .plasminógeno sobre una matriz de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados, bajo condiciones de modo que por lo menos el fibrinógeno se enlace a la matriz, y (b) eluir selectivamente el fibrinógeno de la matriz.
4. 4. Un método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el plasminógeno y el fibrinógeno se eluyen selectivamente de forma separada de la matriz.
5. 5. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la solución que comprende el fibrinógeno es una fracción de plasma que contiene fibrinógeno.
6. 6. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la solución que comprende el fibrinógeno comprende además el factor XIII y el factor XIII se co-eluye con el fibrinógeno de la matriz.
7. 7. Un método para la co-purificación de fibrinógeno y factor XIII, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) cargar una solución que comprende fibrinógeno y el factor XIII sobre una matriz de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados bajo las condiciones de modo que el fibrinógeno y el factor XIII se enlacen a la matriz, y (b) co-eluir selectivamente el fibrinógeno y el factor XIII de la matriz.
8. 8. El uso de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados para la separación de fibrinógeno de plasminógeno.
9. 9. El uso de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados para la preparación de fibrinógeno y plasminógeno .
10. 10. El uso de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados para la co-purificación de fibrinógeno y factor XIII .
11. 11. El fibrinógeno, caracterizado porque se prepara por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
12. 12. El fibrinógeno, caracterizado porque se prepara por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en terapia.
13. 13. Un kit farmacéutico, caracterizado porque comprende fibrinógeno preparado por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, junto con trombina.
14. 14. Un kit de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la trombina se prepara por un método que comprende las etapas de : (a) inactivación de virus con detergente-solvente de una solución que comprende protrombina y factor X; (b) cargar el producto de la etapa (a) en un medio de intercambio aniónico; (c) lavar el medio para remover los reactivos usados para la inactivación del virus con detergente y solvente en la- etapa (a) ; (d) activar la protrombina en el medio para formar trombina mediante la adición de iones de calcio; y _opcionalmente (e) eluir selectivamente la trombina del medio de intercambio aniónico.
15. 15. Una formulación farmacéutica, caracterizada porque comprende el fibrinógeno preparado de acuerdo con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7. 5
16. 16. Una formulación de fibrinógeno liofilizado, caracterizada porque comprende el fibrinógeno preparado de acuerdo con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, factor XIII, un carbohidrato, un aminoácido, una sal, un amortiguador y un detergente, siendo 0 la formación capaz de la disolución en agua a temperatura ambiente en menos de 15 minutos, de preferencia menos de 10 minutos y más preferentemente menos de 5 minutos para dar una solución de fibrinógeno.
17. 17. Una formulación de conformidad con la reivindicación 5 16, caracterizada porque la concentración de la solución de fibrinógeno es por lo menos aproximadamente 60 mg/ml.
18. 18. Una formulación de conformidad con la reivindicación 16 o la reivindicación 17, caracterizada porque se trata con calor para inactivar los virus . 0
19. 19. Una formulación de conformidad con cualquiera de las - · reivindicaciones 16 a 18, caracterizada porque está libre de agentes anti-fibrinolíticos .
20. 20. Una formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, caracterizada porque está libre de 5 proteínas estabilizadoras , tal como albúmina.