CN116744986A - 纤维蛋白原除菌过滤 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了纤维蛋白原溶液的无菌过滤方法，该方法包括用选自玻璃纤维预过滤器和由聚砜或其衍生物制成的除菌过滤器的一个或多个过滤器过滤该溶液。本文进一步公开了通过该方法获得的除菌纤维蛋白原溶液。

Description

纤维蛋白原除菌过滤
技术领域
本发明尤其涉及纤维蛋白原溶液的无菌过滤方法。
背景技术
天然纤维蛋白原(因子I)是在脊椎动物的血液中循环的糖蛋白复合物。
纤维蛋白原是血液凝固的必需蛋白质。其聚合成在级联反应结束时形成的不溶性纤维蛋白，从而控制凝血，导致形成闭合负责出血的血管裂口的凝块。因此，凝块的放置对于确保出血停止是必要的。
提供包含纤维蛋白原的组合物(特别是用于治疗目的)需要纯化技术，其产生从各种性质的污染物中充分纯化的产物。
美国专利号5259971公开了一种从含有分子量高于和/或低于纤维蛋白原的分子量的污染物的液体样品中纯化天然、完整纤维蛋白原的方法。该方法包括使用一个或多个过滤器对样品进行过滤，该一个或多个过滤器所具有的截留分子量使得天然、完整的纤维蛋白原与污染物分离。
美国专利号10493133公开了一种制备高度浓缩的纤维蛋白原溶液的方法，该方法包括向低度浓缩的纤维蛋白原溶液中添加氨基酸或氨基酸衍生物和/或盐，之后超滤浓缩。
美国专利号7816495公开了纯化纤维蛋白原的方法以及易于溶解的纤维蛋白原制剂。
美国专利号7309428公开了一种用于分离血浆的方法和设备，该设备具有呈第一注射形式的混合单元，该混合单元具有第一连接管和第一活塞以提供用于由待分离的血浆和蛋白质沉淀剂构成的混合物的隔室；由过滤管构成的分离单元，用于分离和保存分离后的固体物质。
美国专利号9561478公开了一种分离膜，该分离膜包括包含聚合物的膜，其特征在于在膜的一侧的表面上形成功能层，在前述功能层的表面上通过化学分析用电子能谱(ESCA)测量的来源于酯基的碳的峰面积百分比为0.1％(以原子序数计)或更多但不超过10(原子序数％)，并且在与功能层相对的表面上通过化学分析用电子能谱(ESCA)测量的来源于酯基的碳的峰面积百分比为不超过10(原子序数％)。有机物、蛋白质、血小板等的附着少的分离膜模块提供有作为内置膜的分离膜。
日本专利申请号2007215569公开了一种血浆组分分离器，该血浆组分分离器是中空纤维膜型血浆组分分离器，其中中空纤维膜由聚砜聚合物和聚乙烯吡咯烷酮构成，牛血浆免疫球蛋白G的渗透率为≥80％且≤100％，牛血浆纤维蛋白原的渗透率为≥10％且≤30％，当转化成内径为200μm的中空纤维膜时，通过毛细上升法测量的中空纤维膜的液面上升值为≥80mm且≤120mm，并且中空纤维膜的内表面的孔洞直径的圆转化率直径为13nm-64nm。
发明内容
本发明尤其涉及纤维蛋白原溶液的无菌过滤方法。
典型配制剂中的纤维蛋白原蛋白浓度达到60mg/ml至120mg/ml。纤维蛋白原分子具有约340kDa的典型分子量，具有尺寸为9nm×47.5nm×6nm的棒状形状，并且在水溶液中容易形成多聚体颗粒。这样的颗粒不溶解，并且可以容易地积聚在用于灭菌过滤操作的滤膜的表面上，从而阻塞膜并且使得过滤难以进行。在传统方法中，使用聚偏二氟乙烯(PVDF)滤膜，由于滤膜的堵塞，一平方米的膜仅能够过滤约5L至10L纤维蛋白原溶液。另外，在过滤操作期间，过滤器需要更换多次，操作复杂，并且微生物污染的风险高。
本发明的一个目的是开发一种用于纤维蛋白原溶液的除菌过滤方法，该方法允许获得无菌纤维蛋白原组合物，并且具有增加的过滤能力(超过约90％)。本发明人已经开发了一种新的过滤方法，该过滤方法令人惊讶地提供了纤维蛋白原配制剂液体的非凡过滤能力，例如50L/m2至100L/m2膜，其易于以可接受的工业***格以工业规模实施。
根据本公开的一个方面，提供了一种包含感兴趣的蛋白质的溶液的无菌过滤方法，该方法包括：用选自玻璃纤维预过滤器和包含多硫化物或其衍生物的除菌滤膜的至少一个过滤器过滤该溶液。
在本文提供的任何方面的一些实施方案中，聚砜的衍生物选自聚醚砜(PES)、聚苯砜(PPSU)以及它们的混合物。在一些实施方案中，聚砜包括PES。
在本文提供的任何方面的一些实施方案中，该方法包括用预过滤器和聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤该溶液。
在本文提供的任何方面的一些实施方案中，该方法包括用聚砜过滤该溶液。
在本文提供的任何方面的一些实施方案中，包含聚砜或其衍生物的过滤器具有0.15μm至0.25μm的去除等级。
在本文提供的任何方面的一些实施方案中，玻璃纤维预过滤器具有0.35μm至0.55μm的去除等级。
在本文提供的任何方面的一些实施方案中，该方法包括在用聚砜过滤之前用玻璃纤维预过滤器过滤溶液。
在本文提供的任何方面的一些实施方案中，过滤是在2psi至30psi的压力下进行。
在本文提供的任何方面的一些实施方案中，该溶液是自血浆级分获得。在一些实施方案中，血浆级分是自猪获得。
在本文提供的任何方面的一些实施方案中，感兴趣的蛋白质包括纤维蛋白原。
在本文提供的任何方面的一些实施方案中，该方法的特征在于对溶液(例如纤维蛋白原溶液)的过滤能力为至少5kg/m2。在本文提供的任何方面的一些实施方案中，该方法的特征在于对溶液(例如纤维蛋白原溶液)的过滤能力为至少15kg/m2。在本文提供的任何方面的一些实施方案中，该方法的特征在于对溶液(例如纤维蛋白原溶液)的过滤能力为至少40kg/m2。
在本文提供的任何方面的一些实施方案中，该方法的特征在于纤维蛋白原回收率为至少85％。
在本文提供的任何方面的一些实施方案中，至少一个过滤器具有不均匀的孔径分布。
根据本发明的一个方面，提供了包含纤维蛋白原的溶液的无菌过滤，该无菌过滤包括在具有0.35μm至0.55μm的去除等级的过滤器上进行的第一次过滤，和在具有0.15μm至0.25μm的去除等级的过滤器上进行的第二次过滤。
在一些实施方案中，提供通过根据本文提供的任何方面的方法获得的无菌纤维蛋白原溶液。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和/或科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管类似于或等同于本文所述那些的方法和材料可用于本发明的实施方案的操作或试验，但下文描述的是示例性方法和材料。如发生矛盾，应以专利说明书及其定义为准。另外，材料、方法和示例仅为示例性的，而非旨在进行必需的限制。
附图说明
本文以举例的方式结合附图来描述本发明的一些实施方案。现在具体参考附图，需要强调的是，所示的细节是以举例的方式并出于例示性讨论本发明的实施方案的目的而示出。就这一点而言，结合附图进行的描述使本领域的技术人员明白如何实践本发明的实施方案。
在附图中：
图1给出显示了在每个三元组中使用以下物质的几批纤维蛋白原溶液的比较过滤能力(kg/m2)的柱状图：聚偏二氟乙烯(“PVDF”；左柱)、玻璃纤维预过滤器(“PRE”；中间柱)和聚醚砜(“PES”；右柱)。
图2给出了如图1中给出的显示几个批次的纤维蛋白原溶液的比较过滤能力(kg/m2)的柱状图，并且进一步显示了使用PRE+PES过滤器时的过滤能力(右柱，在每个四元组中添加)。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种用于从溶液除菌过滤纤维蛋白原的有效方法。
在详细说明本发明的至少一个实施方案之前，应当理解本发明不一定在其应用中限制于下述说明书中阐述或实施例示例的细节。本发明能够具有其它实施方案，或能够以各种方式实践或实施。
在本公开的一个方面，提供了一种包含感兴趣的蛋白质的混合物或溶液的无菌过滤方法，该方法包括：用选自玻璃纤维预过滤器和包含聚砜的除菌过滤器的一个或多个过滤器过滤该混合物或溶液。
本领域技术人员应当理解，采用过滤器或膜来产生产物。在不存在本文公开的方法中使用的过滤器或膜组件的情况下，该方法将不能产生具有期望的纯度、浓度等的期望产物，或增加的能力。过滤器或膜组件位于流体工艺流内，并且能够在上文提及的混合物或溶液通过其中时过滤该混合物或溶液。
术语“过滤”包括那些分离过程中的所有分离过程以及利用分离物质的过滤器的任何其他过程。在示例性实施方案中，使含纤维蛋白原的溶液通过过滤器的步骤允许从其中去除可能存在于溶液中的微絮凝物。在一些实施方案中，本公开的过滤不是超滤步骤或过程。通常，术语“超滤”是指通过压力驱动流过半透膜将液体分离成级分的方法，该半透膜具有200至约330,000范围内的截留分子量和约10埃至1000埃的孔直径。
术语“过滤器”(也称为“滤膜”)可以指用于过滤的筛、片状金属丝网或网状结构。过滤器可以例如设计成平面膜或平面丝网。该过滤器可以是渗透选择性的并且用于从流体中过滤出颗粒，特别是用于产生高纯度的感兴趣的蛋白质。
在一些实施方案中，“过滤溶液”意指使溶液(例如，含有感兴趣的蛋白质(例如，纤维蛋白原)的源溶液)通过过滤器以从其中去除可能存在的微絮凝物的步骤。即，纤维蛋白原可与污染物(例如细菌)一起通过过滤器，从而截留在过滤器中或过滤器上。在一些实施方案中，源溶液是新鲜的，或者在一些实施方案中，源溶液在过滤之前已被冷冻和解冻，与新鲜溶液(即未被冷冻)相比，其通常可具有更多的多聚体，该多聚体可降低过滤能力。
如本文所用，术语“混合物”是指但不限于任何物理形式(例如，共混物、溶液、悬浮液、分散体等等)的组分的组合。
术语“无菌过滤”、“除菌过滤”或其任何语法变形是通过无菌过滤器过滤制剂以去除污染物(诸如细菌和/或支原体)的功能性描述。
根据本发明使用的术语“无菌”是指没有或基本上没有微生物和/或病毒污染的物质。在这方面，术语“污染物”意指不同于期望的感兴趣的蛋白质的物质。
在一些实施方案中，除菌过滤步骤可实现源溶液中微生物的至少1-log、至少2-log、至少3-log、至少4-log或至少5-log减少。
通常，但非排他地，玻璃纤维过滤器由树脂粘结的玻璃纤维(例如但不限于玻璃棉)制成，然而，可使用岩棉、长玻璃纤维(长丝)或玻璃纤维布。通常，含有碱性氧化物的耐酸性或耐碱性玻璃纤维可用作过滤层的玻璃纤维。当考虑压力损失时，玻璃纤维过滤器的密度可以在150kg/m3-250kg/m3的范围内，并且玻璃纤维过滤器的厚度可以在40mm-60mm的范围内。
在示例性实施方案中，混合物是包含纤维蛋白原的液体样品。最佳地，纤维蛋白原以15mg/ml或更低的浓度存在。此外，纯化的蛋白质(例如纤维蛋白原)可以使用化学试剂沉淀，之后离心或冻干。在没有进一步稀释的情况下，样品可以通过过滤进行浓缩。
术语“预过滤器”指的是可能阻止相对大大小的固体颗粒(通常超过100微米)的过滤器。通常，但不排他地，预过滤器定位在一个或多个主要、初级过滤器的上游。
在一些实施方案中，包含感兴趣的蛋白质的混合物包含源溶液。“源溶液”广义上是指具有至少一种液体组分和感兴趣的蛋白质的成分的组合、混合物和/或掺和物。溶液通常包含至少一种数量或体积比溶质更大的溶剂。典型的溶剂包括水。在一些实施方案中，源溶液包含蛋白质的混合物。在一些实施方案中，源溶液包含血浆，通常是血液血浆或其级分。在一些实施方案中，血浆包括草酸盐处理的血浆。在一些实施方案中，源溶液包含从哺乳动物收获的血浆。在一些实施方案中，哺乳动物选自人类、马、牛和猪。在示例性实施方案中，源溶液包含猪血浆。
因此，血浆蛋白可以包括一种或多种凝血因子(F)，诸如纤维蛋白原、凝血酶原、凝血酶、FX、FXa、FIX、FIXa、FVII、FVIIa、FVIII、FVIIIa、FXI、FXIa、FXII、FXIIa、FXIII、FXIIIa、冯·威莱布兰德(von Willebrand)因子等；转运蛋白，诸如白蛋白、转铁蛋白、血浆铜蓝蛋白、触珠蛋白、血红素、血红素结合蛋白等；蛋白酶抑制剂，诸如β-抗凝血酶、α-抗凝血酶、α2-巨球蛋白、Cl-抑制剂、组织因子途径抑制剂(TFPI)、肝素辅因子II、蛋白C抑制剂(PAI-3)、蛋白C、蛋白S等；抗血管生成蛋白，诸如潜在抗凝血酶等；高度糖基化蛋白，包括α-1-酸性糖蛋白、抗胰凝乳蛋白酶、间-α-胰蛋白酶抑制剂、α-2-HS糖蛋白、C-反应性蛋白等；以及其它蛋白，诸如富含组氨酸的糖蛋白、甘露聚糖结合凝集素、C4-结合蛋白、纤连蛋白、GC-球蛋白、纤溶酶原；血液因子，诸如红细胞生成素、干扰素、肿瘤因子、tPA、gCSF以及它们的衍生物和突变蛋白。
在一些实施方案中，感兴趣的蛋白质包括纤维蛋白原。如本文和本领域中所用，术语“纤维蛋白原”是指血凝块基质的前体蛋白。纤维蛋白原具有约340,000道尔顿的分子量并且具有通过二硫键连接在一起的3对不同多肽链Aα、Bβ和γ。通常，纤维蛋白原具有三结节结构：由超螺旋的α-螺旋连接的两个相同D末端球状结构域和中心E球状结构域。
在一些实施方案中，纤维蛋白原源于纤维蛋白原浓缩物。在一些实施方案中，纤维蛋白原是血源性纤维蛋白原浓缩物。
在本文通篇中，术语“源于”或“来源于”可互换使用并且是指相关组分的起源或来源，该相关组分可包括天然存在的、重组的、处理的、未纯化的或纯化的分子(例如，相关蛋白)。
在一些实施方案中，源溶液包含自预纯化血浆获得的血浆级分。
“自预纯化血浆获得的血浆级分”意指人类血浆的任何部分或亚部分，其已经是一个或多个纯化步骤的对象。这样的血浆级分因此包括低温沉淀的血浆的上清液、血浆的低温沉淀物(再悬浮的)、通过乙醇分级分离(根据科恩(Cohn)或奇石乐与尼赤曼(Kistler&Nitschmann)的方法)获得的级分I、色谱的洗脱液以及未吸附的级分。
在本发明的一个实施方案中，经受本发明方法的纤维蛋白原组合物经历另外的色谱步骤。因此，根据一个实施方案，经受根据本发明的方法的纤维蛋白原组合物是来自色谱柱(包括多柱色谱)的色谱洗脱液或非吸附级分。
术语“聚砜”通常用于描述含有通式-(Ar-SO2-Ar)-的一个或多个二戊基砜基团(例如单体)的重复或复现单元的任何聚合物，其中Ar是取代或未取代的芳基，诸如苯基、联苯基、双酚或含有芳族烃或杂芳族环的任何其它芳基。在一些实施方案中，聚砜选自聚砜(PSU)、聚醚砜(PES)、聚苯基砜(PPSU)以及它们的混合物或衍生物。
术语“衍生物”或“化学衍生物”是指已经被化学修饰但是仍保持大部分未改变的主题分子，例如被另外的或不同的取代基取代的主题分子，其中一部分已经被氧化或水解的主题分子，等等。
术语“聚合物”描述由彼此共价连接的多个重复结构单元(单体单元)组成的有机物质。
在一些实施方案中，该方法包括用玻璃纤维预过滤器和在其下游或下方的聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤器过滤源溶液。在一些实施方案中，该方法包括用玻璃纤维预过滤器和在其下游或下方的聚砜过滤器过滤源溶液。
在一些实施方案中，玻璃纤维预过滤器可具有0.3μm至0.6μm的去除等级，例如0.4μm、0.5μm或0.6μm，包括其间的任何值和范围，这意味着大于指定大小的颗粒被过滤器有效地截留。过滤器可具有约1μm或更小或约0.5μm或更小的孔径。应理解，去除等级和孔径是不同的参数，去除等级反映过滤器的性能，并且孔径是过滤器膜的性质，尽管这些参数可能相互影响并且密切相关。
在一些实施方案中，玻璃纤维预过滤器的特征在于在约室温下最大操作压力为20psi至70psi。在一些实施方案中，玻璃纤维预过滤器的特征在于在约室温下最大操作压力为20psi、30psi、40psi、50psi、60psi或70psi，包括其间的任何值和范围。
术语“最大操作压力”是指不损坏过滤器的最高压力。差示压力是过滤器入口和过滤器出口之间的压力差。
在一些实施方案中，操作压力由泵控制，例如以形成过滤器的差示压力输出侧和输入侧，其中输出侧的压力更大。术语“泵”是指通过施加吸力或压力，例如通过压缩空气，而使流体运动的任何装置。
所谓“约室温”意指在10℃至40℃或15℃至37℃范围内的至少一个温度值，例如10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃，包括其间的任何值和范围。
过滤过程的进展可以使用多种手段来监测，例如通过检测过滤器上的污染物浓度。
如以下实施例部分中所显示，已经证明，与仅使用PVDF过滤器的旧方法相比，使用玻璃纤维预过滤器使得可能增加过滤能力，因此，例如，简化该方法的工业实施。
在一些实施方案中，与仅使用PVDF过滤器的旧方法相比，在使用玻璃纤维预过滤器时，对纤维蛋白原溶液的过滤能力增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
在一些实施方案中，与单独使用PVDF过滤器的传统方法相比，在使用玻璃纤维预过滤器时，过滤能力增加30％至150％。
在本公开中，“过滤能力”意指每膜面积的感兴趣的蛋白质(例如，纤维蛋白原)最大负荷，以相关过滤器(或过滤器的组合)的kg蛋白质/m2的膜表示。
在一些实施方案中，在使用玻璃纤维预过滤器之后使用PVDF过滤器时，过滤能力为至少5kg/m2、至少5.5kg/m2或至少6kg/m2。在一些实施方案中，在使用玻璃纤维预过滤器之后使用PVDF过滤器时，过滤能力为4.5kg/m2至15kg/m2。在一些实施方案中，在使用玻璃纤维预过滤器之后使用PVDF过滤器时，过滤能力为4.5kg/m2、5kg/m2、5.5kg/m2、6kg/m2、6.5kg/m2、7kg/m2、7.5kg/m2、8kg/m2、8.5kg/m2、9kg/m2、9.5kg/m2、10kg/m2、10.5kg/m2、11kg/m2、11.5kg/m2、12kg/m2、12.5kg/m2、13kg/m2、13.5kg/m2、14kg/m2、14.5kg/m2或15kg/m2，包括其间的任何值和范围。
因此，提供了一种用于在包含感兴趣的蛋白质(例如，纤维蛋白原)的溶液的无菌过滤中将PVDF过滤的过滤能力增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％的方法，该方法包括在PVDF过滤之前用至少一个包含玻璃纤维的预过滤器过滤该溶液。
在一些实施方案中，包含感兴趣的蛋白质的溶液包含在过滤过程之前先前未冷冻和/或解冻的纤维蛋白原。通常，已冷冻和解冻的材料可具有更多的多聚体、不溶性、聚集的或部分变性的材料，从而与新鲜溶液(即先前未冷冻和/或解冻的溶液)相比，将过滤能力(当使用预过滤器时)降低约50％。
在一些实施方案中，在使用玻璃纤维预过滤器之后使用PVDF过滤器时，纤维蛋白原回收率为至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，在使用玻璃纤维预过滤器之后使用PVDF过滤器时，纤维蛋白原回收率为约88％至大约100％。在一些实施方案中，在使用玻璃纤维预过滤器之后使用PVDF过滤器时，纤维蛋白原回收率为约88％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％，包括其间的任何值和范围。
在一些实施方案中，与使用PVDF过滤器且没有预过滤器的方法相比，在使用玻璃纤维预过滤器之后使用PVDF过滤器时，纤维蛋白原回收率(从纤维蛋白原源溶液的纤维蛋白原回收率)增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％或至少12％。在一些实施方案中，与使用PVDF过滤器且没有预过滤器的方法相比，在使用玻璃纤维预过滤器之后使用PVDF过滤器时，从纤维蛋白原溶液的纤维蛋白原回收率增加约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％或约15％，包括其间的任何值和范围。
术语“纤维蛋白原回收率”(也称为“纤维蛋白原活性回收率”和“过滤产率”)描述了在过滤过程之后发现的纤维蛋白原浓度(含量)除以在过滤过程之前溶液中的纤维蛋白原浓度。
在本文提供的任何方面的一些任何实施方案中，该方法的特征在于蛋白质回收率为至少约95％。在本文提供的任何方面的一些任何实施方案中，该方法的特征在于蛋白质回收率为约95％至约98％。
术语“蛋白质回收率”(也称为“蛋白质产率”)描述了在过滤过程后发现的蛋白质含量除以在过滤过程之前的蛋白质含量。
“蛋白质含量”是指物质中所含蛋白质的量。实际上，所公开的从流体流中去除微生物(而不会不利地影响产品质量)的方法中的除菌过滤允许几乎所有蛋白质(包括纤维蛋白原)通过过滤器。
在一些实施方案中，该方法包括用聚砜过滤器过滤源溶液。
用于测量蛋白质回收率和纤维蛋白原回收率的示例性方法在实施例部分中提供并且是本领域已知的。
如在随后的实施例部分中进一步显示的，已经证明，与仅使用PVDF过滤器的旧(传统)方法相比，使用聚砜(例如，PES)过滤器使得可能增加过滤能力，因此简化该方法的工业实施。
在一些实施方案中，与使用PVDF过滤器的旧方法相比，在使用聚砜过滤器时，过滤能力增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少6倍。在一些实施方案中，与使用PVDF过滤器的旧方法相比，在使用聚砜(例如，PES)时，过滤能力增加2倍至6倍。
在一些实施方案中，在使用聚砜(例如，PES)过滤器时，过滤能力为至少10kg/m2、至少12kg/m2或至少15kg/m2。在一些实施方案中，在使用聚砜(例如PES)过滤器时，过滤能力为15kg/m2至30kg/m2。在一些实施方案中，在使用聚砜(例如，PES)过滤器时，过滤能力为15kg/m2、16kg/m2、17kg/m2、18kg/m2、19kg/m2、20kg/m2、21kg/m2、22kg/m2、23kg/m2、24kg/m2、25kg/m2、26kg/m2、27kg/m2、29kg/m2、29kg/m2或30kg/m2，包括其间的任何值和范围。
在一些实施方案中，在使用聚砜(例如，PES)过滤器时，从纤维蛋白原溶液的纤维蛋白原回收率为至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
在一些实施方案中，该方法包括用玻璃纤维预过滤器及之后用聚砜(例如PES)过滤器(即其下游)过滤源溶液。
如在随后的实施例部分中进一步显示的，已经证明，与单独的砜过滤器相比，使用玻璃纤维预过滤器使得可能进一步增加过滤能力。在一些实施方案中，与单独使用砜过滤器(即不使用玻璃纤维预过滤器)相比，在使用玻璃纤维预过滤器时，对纤维蛋白原溶液的过滤能力增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍或至少7倍。
在一些实施方案中，与单独的砜过滤器相比，在使用玻璃纤维预过滤器时，过滤能力增加30％至150％。
因此，提供了一种在包含感兴趣的蛋白质(例如纤维蛋白原)的溶液的无菌过滤中，与单独使用砜过滤器相比，将聚砜(例如PES)过滤的过滤能力增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍或至少7倍的方法，该方法包括用至少一个包含玻璃纤维的预过滤器过滤该溶液。
在一些实施方案中，在使用玻璃纤维预过滤器之后使用聚砜(例如，PES)过滤器时，纤维蛋白原回收率为至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少89％。在一些实施方案中，在使用玻璃纤维预过滤器之后使用PVDF过滤器时，纤维蛋白原回收率为约88％至大约100％。在一些实施方案中，在使用玻璃纤维预过滤器之后使用聚砜(例如，PES)过滤器时，纤维蛋白原回收率为约88％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约89％，包括其间的任何值和范围。
过滤器的孔洞或孔形状可以影响过滤器的过滤能力。假设非对称孔洞过滤器比具有均匀(对称)孔洞形状的过滤器具有更高的对小颗粒的拦截能力。旧PVDF滤膜的孔形状和大小看起来比玻璃纤维和PES的孔形状和大小均匀得多。同时，0.45微米玻璃纤维预过滤器可拦截溶液中的大颗粒，以帮助增加最终过滤器的过滤通量。
因此，在本公开的一个方面，提供了一种包含感兴趣的蛋白质(例如，纤维蛋白原)的混合物的无菌过滤方法，该方法包括：用至少一个过滤器过滤该混合物，该过滤器具有从一个平面表面到另一个平面表面的梯度孔径或膜内的梯度孔径。因此，在一些实施方案中，滤膜，或在一些实施方案中，多个滤膜，形成总体多孔构件，该总体多孔构件是不对称多孔的，具有在从上(给料)表面到下表面的进程中直径逐渐减小的孔，使得总体膜孔形成“V”形，是不均匀的，并且不容易被溶液中的颗粒阻塞。另外，或替代地，总体膜孔是线性的和非均匀的。
在此上下文中，“不对称”或“不均匀”意指不均匀或宽的孔径分布。在一个实施方案中，该术语是指上(给料)表面的中值孔径或去除等级比下表面的中值孔径或去除等级高50％至400％，或在一些实施方案中高100％至200％，例如50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％或400％，包括其间的任何值和范围。替代地，这些术语意指膜的至少一个表面中的孔径变化50％至400％，或在一些实施方案中变化100％至200％，例如50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％或400％，包括其间的任何值和范围。
所谓“大小”意指孔、通常微孔的至少一个维度，例如直径。
通常，该方面的无菌过滤方法包括通过使用选自玻璃纤维预过滤器和包含聚砜的除菌过滤器中的至少一个过滤器来形成梯度孔径。“过滤器”、“玻璃纤维预过滤器”、“除菌过滤器”、“聚砜”、“感兴趣的蛋白质”和“混合物”的实施方案在本文全文中描述并并入本文。
在本公开的一个方面，提供了一种包含纤维蛋白原的溶液的无菌过滤方法，该方法包括在具有约0.35μm至约0.55μm(例如，0.35μm、0.4μm、0.45μm、0.50μm或0.55μm，包括其间的任何值和范围)的去除等级的过滤器上进行的第一次过滤，和在具有约0.15μm至约0.25μm(例如，0.15μm、0.20μm或025μm，包括其间的任何值和范围)的去除等级的过滤器上进行的第二次(例如，随后的)过滤。在该方面的一些实施方案中，对溶液的过滤能力为至少15kg/m2至至少85kg/m2，例如，15kg/m2、20kg/m2、30kg/m2、35kg/m2、40kg/m2、45kg/m2、50kg/m2、55kg/m2、60kg/m2、65kg/m2、70kg/m2、75kg/m2、80kg/m2或85kg/m2，包括其间的任何值和范围。
在一些实施方案中，提供了根据上述任何方面或实施方案通过本文公开的方法获得的纤维蛋白原的无菌溶液。
如本文所用，术语“约”是指±10％。
术语“包含”、“含”、“包括”、“含有”、“蕴含”、“内含”、“具有”、“有”及它们的变化形式意指“包括但不限于”。术语“由……组成”是指“包括并且限于”。术语“基本上由…组成”是指组合物、方法或结构可包含附加成分、步骤和/或部件，但前提条件是该附加成分、步骤和/或部件不在本质上改变受权利要求书保护的组合物、方法或结构的基本特征和新颖特征。
词语“示例性”在本文中用于指“用作示例、实例或例证”。被描述为“示例性”的任何实施方案不一定被理解为比其他实施方案优选或有利并且/或者不包括其他实施方案的特征。
词语“任选地”在本文中用于指“在一些实施方案中提供而在其他实施方案中不提供”。本发明的任何具体实施方案可包括多个“任选的”特征，除非此类特征有冲突。
如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物(包括它们的混合物)。
在整个本申请中，本发明的各种实施方案可以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被理解为是对本发明范围的固定限制。因此，范围的描述应被视为具有明确公开的所有可能子范围以及该范围内的各个数值。例如，范围诸如1至6的描述应被视为具有明确公开的子范围诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这均适用。
每当本文指示数值范围时，其是指包括位于所指示范围内的任何列举的数字(分数或整数)。短语“范围是在”第一指示数字和第二指示数字之间以及“范围是从”第一指示数字“到”第二指示数字在本文中可互换使用，并且是指包括第一指示数字和第二指示数字以及其间的所有分数和整数。
如本文所用，在本文中可互换使用的术语“方法”或“工艺”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、分析、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或易于从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
如本文所用，并且除非另行指出，否则术语“按重量计”、“w/w”、“重量百分比”或“重量％”在本文中可互换使用，它们描述特定物质在相应混合物、溶液、配制剂或组合物的总重量中的浓度。
在其中使用类似于“A、B和C中的至少一者等”的惯例的那些情况下，一般而言，此类结构意在具有本领域的技术人员将理解所述惯例的意义(例如，“具有A、B和C中的至少一者的组合物”将包括但不限于具有仅A、仅B、仅C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、和/或A、B和C一起等的组合物)。本领域的技术人员还应当理解，实际上，无论在具体实施方式、权利要求还是附图中，呈现两个或更多个替代术语的转折性词语和/或短语应被理解为涵盖包括所述术语中的一者、所述术语中的任一个或这两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”、“B”或“A和B”的可能性。
应理解，为清晰起见，在独立实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征，也可在单个实施方案中组合提供。相反地，为简明起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种结构也可单独地或以任何合适的子组合形式提供，或如其所适当地提供于本发明的任何其他所述实施方案中。在各种实施方案的上下文中所述的某些特征不应视为那些实施方案的基本特征，除非实施方案在没有那些要素的情况下不起作用。
如上文所述以及如下文的权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中得到实验支持。
实施例
现在参考以下实施例，这些实施例连同以上描述以非限制性方式示出了本发明的一些实施方案。
本研究的目的是探索一种安全有效的增加纤维蛋白原配制剂液体的过滤通量的新方法，以达到提高最终产物产率和节约过滤器耗材的目的。
材料和装备
材料
纤维蛋白原溶液：纤维蛋白原液体配制剂由广州倍绣生物技术有限公司(Guangzhou Bioseal biotechnology Co,Ltd)制造，含有30mg/ml-50mg/ml纤维蛋白原，并且通常储存在-20℃至约-30℃并且在进行过滤实验之前解冻。如下所述使用各种批次。
装备
具有相关参数的装备详情总结于下表1中：
表1
实施例1：实验设计I
进行实验设计I，尤其以研究使用与传统过滤器(称为“F1”)相比的各种过滤器设计来过滤纤维蛋白原液体配制剂的可行性。
设计三个平行过滤加工管线以同时过滤纤维蛋白原液体配制剂，并称重过滤的液体以比较不同过滤管线的过滤能力。过滤温度：室温，20度-26度。过滤压力：2psi-30psi，使用压缩空气提供期望的压力。加工管线的实验参数如下：
管线1：使用一个密理博聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤器。过滤面积：500cm2；目录号：MPGL10CL3。这是在旧工艺中使用的相同种类的过滤器。
管线2：在密理博PVDF最终过滤器之前添加玻璃纤维预过滤器(也称为“PRE”)，过滤器面积：900cm2；目录号：DFA3001UBC。
管线3：使用聚醚砜(PES)最终过滤器代替密理博PVDF过滤器进行灭菌过滤；过滤器面积：230cm2；目录号：KA02ECV2FT。
结果
各种批次的结果总结于下表2中并进一步在图1中说明。
表2
如表2中可见，PVDF的平均过滤能力为约4.7kg/m2膜；PRE+PVDF的平均过滤能力为8.7kg/m2膜，并且PES的平均过滤能力高得多：20.0kg/m2膜。
数据比较清楚地显示，添加预过滤器或用PES过滤器替换PVDF过滤器可显著改善对纤维蛋白原液体配制剂的过滤能力。
基于这些结果，如下所述进一步探索组合方法(玻璃纤维预过滤器+PES最终过滤器)的过滤能力。
实施例2：实验设计II
设计四个平行的过滤加工管线以同时过滤纤维蛋白原配制剂液体，用于称重过滤的液体以比较不同过滤管线的过滤能力。过滤温度：室温，20度-26度；过滤压力：2psi-30psi，如上所述。实验加工管线1至实验加工管线3和参数如上所述，添加管线4：使用玻璃纤维预过滤器(“PRE”)+PES最终过滤器进行灭菌过滤，模型和过滤面积与上述相同。
结果总结在下表3中，并进一步在图2中说明。
表3
比较这两个实验结果，可以容易地看出，PRE+PES(作为过滤过程中的最终过滤器)的组合过滤方法可以进一步提高对纤维蛋白原配制液体的过滤能力，并且平均过滤能力可以达到约80kg/m2膜的平均值。
数据比较清楚地显示，添加预过滤器或用PES过滤器替换PVDF过滤器可显著改善对主制备溶液的过滤能力。
“904”、“205”和“607”是在该实验中用作原料的三批纤维蛋白原配制液体。纤维蛋白原活性和蛋白浓度可见于下表4中。
表4
'904和'205的结果不同的原因可能是由于以下事实：’904的材料已经被冷冻并且然后重构，并且在冷冻并且然后解冻时，可以形成更多的多聚体，这可以影响过滤能力，而’205包括新鲜材料。
不受任何特定理论或机制的约束，可假设滤膜的孔洞(孔)形状影响过滤器的过滤能力。非对称孔洞过滤器比具有均匀孔洞形状的过滤器对小颗粒的拦截能力更高。PVDF滤膜的孔形状比玻璃纤维和PES的孔形状远更均匀。均匀的膜可能被溶液中的颗粒完全阻塞。同时，0.45微米玻璃纤维预过滤器可以拦截溶液中的大颗粒。在玻璃纤维预过滤器中，膜孔是线性且不均匀的，并且不容易被溶液中的颗粒阻塞。并且这可以帮助增加最终过滤器的过滤通量。PES膜具有“V”形孔并且也是不均匀的，并且因此不容易被溶液中的颗粒阻塞。
用于生产的过滤器规格的选择
根据上述过滤能力的实验数据，PRE+PES的平均过滤能力可达到约80kg/m2及更大。如果纤维蛋白原配制剂液体的密度被认为是1g/ml，则PRE+PES的平均过滤能力可以达到约80L/m2。'904纤维蛋白原配制剂液体已经被冷冻并且其后重构，并且在这种更差的条件下，该方法的过滤能力也达到54.26L/m2。
颇尔20英寸PES最终过滤器具有2.08m2的膜面积，并且使用的纤维蛋白原配制剂液体的批量大小为70L，因此使用20英寸颇尔PES过滤器足以过滤整批材料。因此，待选择的灭菌过滤器是颇尔20英寸PES滤器(目录号：AB2UECV7PH4)。
关于预过滤器的选择，选择900-cm2的预过滤器用于实验，快速且平稳地过滤5L液体纤维蛋白原溶液。选择0.45微米20英寸玻璃纤维过滤器作为过滤表面积为1.30m2的预过滤器(目录号：AB2UB7PH4)，然而，预过滤器的大小可以根据实际生产进行调整。
实施例3：纤维蛋白原活性
进行这组实验是为了研究在新的过滤过程中过滤器对纤维蛋白原液体配制剂的蛋白质的影响。
该实验过程与上文提及的过滤器过滤能力研究实验相同。过滤后，在过滤前后对纤维蛋白原液体配制剂取样以检测纤维蛋白原(“FIB”)活性并确定蛋白质含量以评估新过滤器对靶蛋白的吸附。
用于检测FIB活性的方案
通过在临床实验室中广泛使用的克劳斯法(Clauss method)确定FIB活性。该程序的指南由国家临床实验室标准委员会(National Committee for Clinical LaboratoryStandard，NCCLS)批准。此处，Stago STA-compact(一种基于克劳斯法的自动凝血分析仪)用于纤维蛋白原检测。该测定使用稀释的纤维蛋白原样品，其中用高浓度的试剂凝血酶引发凝血。使用参照纤维蛋白原标准品的系列稀释液绘制校准曲线。稀释测试血浆或纤维蛋白原样品，温育，并使用含有磷脂的FIB检测剂。添加凝血酶和钙，并且定时从添加FIB检测剂开始。将凝块形成所花费的时间与内部参照校准曲线比较以导出测试样品的纤维蛋白原浓度(例如，mg/mL)。
用于检测蛋白质含量的方案
“蛋白质含量”是指物质中所含蛋白质的量。实际上，除菌过滤是从流体流中去除微生物而不会不利地影响产品质量的过程，这意味着该过程将允许几乎所有蛋白质(包括纤维蛋白原)通过过滤器。
通过二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定来确定蛋白质含量，其是基于BCA的洗涤剂相容配制剂，用于比色检测和总蛋白质的定量。制备浓度为0μg/ml、25μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、750μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml的白蛋白标准品，之后将25μL复制的各标准品或未知样品移液至微板孔中(工作范围＝20μg/mL-2000μg/mL)。接着，将200μL量的BCA工作溶液添加到每个孔中，并且将板在板振荡器上充分混合30秒。然后盖上板并在37℃下温育30分钟。接着，将板冷却至室温，读取板读数器上562nm处或附近的吸光度。
每个样品的结果于下表5-7中给出。
表5
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表6
表7
基于上述数据，计算平均值并总结在下表8中。
表8
可以看出，新过滤方法的蛋白质回收率和纤维蛋白原活性回收率优于旧过滤方法。
尽管本发明已结合其具体实施方案进行了描述，但显然许多替代、修改和变型对于本领域中那些技术人员而言是显而易见的。因此，本文旨在涵盖落入所附权利要求书的实质和广义范围内的所有此类另选形式、修改和变型。

Claims (20)

1.一种包含纤维蛋白原的溶液的无菌过滤方法，所述方法包括：用选自玻璃纤维预过滤器和包含聚砜或其衍生物的除菌过滤器的至少一个过滤器过滤所述溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚砜的衍生物选自聚醚砜(PES)、聚苯基砜(PPSU)以及它们的组合或共聚物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述聚砜包括PES。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，所述方法包括用所述预过滤器并且之后用聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤所述溶液。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，所述方法包括用包含聚砜的所述过滤器过滤所述溶液。
6.根据权利要求5所述的方法，所述方法包括在所述用包含聚砜的所述过滤器过滤之前用所述玻璃纤维预过滤器过滤所述溶液。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述聚砜或其衍生物具有0.15μm至0.25μm的去除等级。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述玻璃纤维预过滤器具有0.35μm至0.55μm的去除等级。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述过滤是在2psi至30psi的压力下进行的。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述溶液是从血浆级分获得的。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述血浆级分是从猪获得的。
12.根据权利要求4所述的方法，所述方法具有至少5kg/m2的对所述溶液的过滤能力。
13.根据权利要求5所述的方法，所述方法具有至少15kg/m2的对所述溶液的过滤能力。
14.根据权利要求6所述的方法，所述方法具有至少40kg/m2且至多约85kg/m2的对所述溶液的过滤能力。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，所述方法具有至少85％的纤维蛋白原回收率。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述至少一个过滤器具有不均匀的孔径分布。
17.一种包含纤维蛋白原的溶液的无菌过滤方法，所述方法包括在具有0.35μm至0.55μm的去除等级的过滤器上进行的第一次过滤，和在具有0.15μm至0.25μm的去除等级的过滤器上进行的第二次过滤。
18.根据权利要求17所述的方法，所述方法具有至少15kg/m2的对所述溶液的过滤能力。
19.根据权利要求17或18所述的方法，所述方法具有至少85％的纤维蛋白原回收率。
20.一种通过根据权利要求1至19中任一项所述的方法获得的除菌纤维蛋白原溶液。
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