JPH02193913A - パイロジエンを除去する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 遺伝子組換え技術等により生産された生理活性物質を、
医薬品として人体に適用するには、製品中のパイロジエ
ンを高度に除去する必要がある。

本発明は、生理活性物質に混入するパイロジエンを除去
する方法に関する。

〔従来の技術〕

汰 パイロジエンは、生理に投与すると発熱を起こす物質の
総称であり、発熱物質、発熱因子とも呼ばれる。パイロ
ジエンの中で最も発熱に関与する物質は細菌由来のもの
であり、一般に外毒素（エン−トキシン）、および内毒
素（エン−トキシン）に大別されている。これらの毒素
のうち、大腸菌などのダラム陰性菌において、多糖類と
結合した脂質の複合体、リポ多糖体（リポポリサッカラ
イド：　ＬＰＳ　）を主とする内毒素が最も強い発熱性
を持ち、体内投与により発熱の他、ショックや白血球の
増加を誘引する。

近年、人為的に遺伝子を組換えて大腸菌などの宿主に導
入し、目的物質を発現させるような遺伝子操作が発達し
、ヒト生体内で微量にしか生産されない生理活性物質を
大量に取得することが可能になった。その反面、組換え
遺伝子を大腸菌に導入し、生理活性物質を発現させる場
合、その生産物へのパイロジエンの混入は免れえず、そ
の効率的な除去方法が望まれている。

パイロジエンの除去方法としては、１）ゲル濾過（特開
昭４９−６６８８５号公報）や膜による濾過（特開昭５
８−７３３７１号公報）など、分子量の差を利用する方
法、２）アスベスト、イオン交換体（米国特許第３８９
７３０９号明細書）およびヒスチジンを結合させた担体
（特開昭５７−１８３７１２号公報）などを用いて、パ
イロジエンを吸着させる方法などかあシ、医薬品分野で
は、一般にデル濾過やイオン交換体への吸着が適用され
ている。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来適用されているパイロジエンの除去方法テは、高度
除去のために繰り返し処理または、複数組合せ処理等が
必要であることよシ、低コストで、簡便な、よシ確実性
に富む方法の開発が望まれている。

デル濾過によるパイロジエンの分離は、パイロジエンが
数十万程度の高分子量を持つことを利用して、生理活性
物質から分離する方法である。そのため、適用可能な生
理活性物質は、分子−ｊ＃数万以下であることが必要と
される。また、多量のパイロジエンが存在している場合
、パイロジエンがよυ低分子領域へ混入し、生理活性物
質との分離が不完全なものとなシ望ましくない。

膜による濾過は、生理活性物質が通過し、パイロジエン
は通過しない大きさの細孔を持つ膜でパイロジエンを除
去する方法であるが、パイロジエンの一部は低分子に断
片化しているため、膜を通過し、生理活性物質に混入す
ることが問題となる。

パイロジエンを吸着させるものには、アスベスト、イオ
ン交換体またはヒスチジンを結合させた担体があるが、
いずれの場合も、生理活性物質の吸着が問題となる。ま
た、イオン交換体やヒスチジンを結合させた担体は、パ
イロジエンの吸着容量が低く、パイロジエンを完全除去
するためには生理活性物質に混入しているパイロジエン
量に対応した多量の樹脂が必要となり、工業的規模での
操作上の障害となっている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、金属キレ−１・担体にパイロジエンが吸
着しないことを見いだし、この樹脂に現用性を持つ生理
活性物質を吸着させ、パイロジエンを含有しない緩衝液
での洗浄で混入するパイロジエンを洗い流した後、溶出
することによりパイロジエンを含まない生理活性物質が
得られることを見い出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、パイロジエンが混入した生理活性物質
を、金属イオンを配位させた担体に吸着させ、洗浄によ
り該パイロジエンを除去する方法である。

本発明で生理活性物質とは、リンホトキシン、インター
フェロン、ラクトフェリン、コラゲナーゼ、フイブリノ
ーゲン、ティッシュ・ゾラスミノーデン・アクチベータ
などである。

金属キレート担体は、一般式Ｍ−８−Ｌ（Ｍは配位子を
保持するための支持体、Ｌは金属イオンを配位させるた
めの官能基、Ｓは官能基りと支持体Ｍを結合させるため
の間隔子を表す）で示される。配位子を固定化するため
の支持体は、操作土壊れることのない強度を有するもの
であればいずれでもよく、例えば、セルロースやアガロ
ースを骨格とするものなどがある。金属イオンを固定化
する配位子についても、特に限定されないが、イミノニ
酢酸を末端に有する官能基などが一般的である。

金属イオンは、適用する生理活性物質との親和性を有す
るものならばいずれでもよいが、本発明ではＺｎ”　、
　　Ｃｕ２＋またはＮ１２＋を用いる。

金属キレート担体によるパイロジエンの除去方法の特徴
は、樹脂量が、目的とする生理活性物質を十分く吸着す
る量であればよく、混入しているパイロジエン量に左右
されない点が挙げられる。

また、洗浄液中のパイロジエン量を測定することによシ
、パイロジエンの除去程度を知ることができ、洗浄液中
のパイロジエン量が検出限界以下であることを確認後、
生理活性物質を溶出することによシ、完全なパイロジエ
ン除去が可能となる。

〔実施例〕 以下、実施例によシ本発明をさらに詳細に説明するが、
これらに限定されないことは言うまでもない。

実施例１ キレートセファロースＦＦ（ファルマシア社製）を、０
．５Ｎ水酸化ナトリウムで洗浄後、パイロジエンを含ま
ない１０ｍＭ酢酸亜鉛（ＰＨ４，０＞溶液により亜鉛イ
オンを配位させ、亜鉛キレートセファロースカラムとし
た。

リンホトキシン（特開昭６３−８３９９号公報実施例１
によって製造されたもの）１００μｇおよび１００即に
、大腸菌エンドトキシン（和光紬薬工業（株）製）をそ
れぞれ１μｇおよび１００μｇ加え試料とした。この試
料を１Ｍ塩化す）　ＩＪウムを含有する２　０　ｍＭ　
ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，６’）に溶解し、あらかじめ
同緩衝液で平衡化した亜鉛キレートセファロースカラム
（φ５０Ｘ５０ｍ）に添加した。同緩衝液で十分に洗浄
を行い（１０カラム体積以上）、洗浄液のエンドトキシ
ンレベルが検出限界以下であることを確認後、同緩衝液
に２００飯イミダゾールを添加した緩衝液で溶出した。

精製前後のリンホトキシン量およびエンドトキシン量を
表に示す。

実施例２ 次以外は実施例１と同様に行った。

インターフェロンα（バイオネイティブ社製）２５μｇ
１コラデナーゼ（シグマ社製）、ティッシュ−プラスミ
ノ−ｒン・アクチベータ（ＴＰＡ　：バイオプール社製
）それぞれ１００μｇに、大腸菌エンドトキシン（和光
紬薬工業（株）製）を１００μｇ加え試料とした。亜鉛
キレートセファロースカラムはφ１０１０Ｘ５０のもの
を用いた。

実施例３ キレートセファロースＦＦ（ファルマシア社製）を、０
．５Ｎ水酸化ナトリウムで洗浄後、パイロジエンを含ま
ない１０ｍＭ酢酸鋼（ｐＨ４，０）溶液により銅イオン
を配位させ、銅キレートセファロースカラムとした。

リンホトキシン、ラクトフェリン（シグマ社製）、フイ
ブリノーゲン（シグマ社製）をそれぞれ用いた。

実施例４ 酢酸ニッケルを用い、ニッケルキレートセファロースカ
ラム（φ１０Ｘ１０Ｘ５０を使用した以外は実施例１と
同様に行なった。

比較例１ セファクリルＳ−２００（ファルマシア社製）を、０．
５Ｎ水酸化ナトリウムで洗浄後、パイロジエンを含まな
い１．００　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２＞で平衡化
した。これに実施例１で調製したリンホトキシンを添加
し、同緩衝液で溶出した。

測定方法 （１）エンドトキシン トキシカラーシステムＬ８−１セットおよびＥｔ−１セ
ツト（エンドトキシン標準液）（生化学工業社製）によ
る比色法エンドトキシン測定法を用いた。

検体およびＥｔ　−ｉセットそれぞれ１００μｔにＬＳ
−１セツト１００μｔを加え、６７℃、３０分加温後、
４０５ｎｍの吸光度を測定し、Ｅｔ　−１セツトとの比
較から検体中のエンドトキシン量を算出した。

（２）生理活性物質 ＢＣＡタンパク質定量試薬（ピアス社製）による比色法
タンパク質定量法を用いた。

検体およびアルブミン標準液それぞれ１０μｔにＢＣＡ
タンパク質定量試薬２００μｔを加え、５０℃、３０分
加温後、５５０ｎｍの吸光度を測定し、アルブミン標準
液との比較から検体中のタンパク質量を算出し、生理活
性物質量とした。

〔発明の効果〕

本発明により、生理活性物質に混入したパイロジエンを
低コストで、簡便に、そしてより確実に除去することが
可能となった。

特許出願人　電気化学工業株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、パイロジエンが混入した生理活性物質を、金属イオ
   ン配位させた担体に吸着させ、洗浄により該パイロジエ
   ンを除去する方法。