JP5086093B2 - 組換え型ヒトxiii因子の精製 - Google Patents
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Description
XIII因子(フィブリン安定化因子, フィブリノリガーゼ, または血漿トランスグルタミナーゼとしても知られている)は、フィブリノーゲンと複合体を形成した酵素前駆体(約320kDaのMr)として血液中を循環している血漿糖タンパク質である〔Greenberg and Shuman, J. Biol. Chem. 257:6096-6101 (1982)〕。血漿XIII因子の酵素前駆体は、2つのaサブユニットおよび2つのbサブユニットからなる四量体である。各サブユニットは、約83,000Daの分子量を有する。完全なタンパク質は、約320kDaの分子量を有する。aサブユニットは酵素の触媒部位を含有し、bサブユニットはaサブユニットを安定化する又はXIII因子の活性化を制御すると考えられている。aおよびbサブユニットのアミノ酸配列は、知られている〔Ichinose et al., Biochemistry 25:6900-6906 (1986); Ichinose et al., Biochemistry 25:4633-4638 (1986)〕。生物学的に活性なXIII因子の組換え型の発現が記載されている(例えば、EP0268772B1を参照されたい)。
本発明は、高度に精製されたXIII因子を単離するための方法を提供する。特定の態様において、開示された方法を用いることによって、混入タンパク質(contaminating proteins)に関して少なくとも95%純粋であるXIII因子組成物を取得することができる。これらの方法は、組換え型XIII因子を組換え型の宿主細胞から精製するために特に適している。特定の態様において、組換え型の宿主細胞は、組換え型の酵母細胞である。前記方法は、酵母産生型組換えヒトXIII因子を精製するために提供される。
本発明は、固定化金属アフィニティー基質での分画を使用することによって、高度に精製されたXIII因子を単離するための方法を提供する。開示された方法を用いて、混入タンパク質に関して少なくとも95%純粋な高度に精製されたXIII因子を、従来法よりも単純で安価に取得することができる。本発明の方法は、ヒトXIII因子を産生する組換え酵母宿主細胞のライセートを含んでいる生物学的流体を含む生物学的流体からの組換え型XIII因子の精製に特に適している。特定の態様において、前記方法は、さらに2%未満のタンパク質凝集物および/または1%未満の活性化XIII因子を含有する組成物を提供することができる。更に、本発明の特定の態様において、本発明の方法によって製造された精製組成物は、XIII因子の5%未満の荷電アイソマーを含む。XIII因子を精製するための幾つかの初期の方法とは異なり、沈殿および/または結晶化工程は必要とされない。(米国特許第5,612,456号)
本発明明細書中に使用される「XIII因子(factor XIII)」の用語は、ポリタンパク質が実質的なXIII因子活性の活性化を示さないかぎり、a2二量体を含んでいるXIII因子ポリタンパク質、a2b2四量体を含んでいるXIII因子ポリタンパク質、又はaおよびbサブユニットの他の組み合わせを意味する。
以下の例は、本発明の様々な側面の単なる例示として提供され、本発明を如何ようにも限定するものとして解釈されるべきではない。
、図Aから1Cに提供される。
100リッターの発酵槽製造実験:
種菌を、常用されている細胞バンクからXIII因子を発現している組換え細胞を用いて調製した。生産を、100リッターの発酵槽容器で実施した。マルチ発酵槽コンピュータシステムを、発酵プロセスのオンラインモニタリングに使用した。酸素摂取(OUR)、二酸化炭素進化率(CER;carbon dioxide evolution rate)および呼吸商(RQ;respiratory quotient)を、決定した。グルコースベースの酵母培養培地を、0.2μmフィルターをとおす濾過によって滅菌した。発酵槽に、第2段階の種のタンク培養を接種した。グルコース餌を、濾過滅菌し、バッチで調製した。発泡を、消泡剤試薬を手動で添加することによって制御した。処理時間後に、グルコース餌を終了し、pHをアンモニア溶液を用いて増加させた。培養物を、次に下流の処理に移す前に冷却した。
発酵槽収穫物を収集し、伝導度を測定した。収穫物を、3M Tris/60mM EDTAでpH8.5に調整することによって調製した。調製した収穫物を、高圧でホモジナイザーを単回通過させることによって均質化した。ホモジナイザーからでたホモジネートを、約15゜Cに冷却した。均質化プロセスによって、約108Lのクルードなホモジネートが得られた。ホモジネート中のrhFXIIIの量を1.6g/Lで測定(活性アッセイ)し、これによってこの特定の実施に関して、約172.8gの全量が提供された。
拡張ベッドクロマトグラフィー陰イオン交換分画を、DEAE STREAMLINE樹脂を充填したSTREAMLINE200ファルマシアカラム(ファルマシア)を用いて、周囲温度(ambient temperature)で実施した。ベッド高42cmでカラム容量(CV)が13.2L(即ち、カラム直径20cm、断面積314cm2)を、達成した。充填後すぐに、前記カラムを、ダウンフロー様式(down-flow mode)で4カラム容量(CV)または約80Lの10mM NaOHで洗浄し、一晩保存した。
疎水性相互作用クロマトグラフィーを、ファルマシアBPG300カラムに総容積12L(即ち、30cmカラム 直径, 断面積707cm2)のフェニル-セファロースTMを充填したもので、ファルマシア6mmバイオプロセスシステムを用いて、周囲温度で実施した。樹脂は新鮮なものであったが、幾つかのロットから貯蔵されたものであった(ファルマシア)。第1のXIII因子豊富化画分(DEAE STREAMLINE溶出液)を、等量の0.5M Na2SO4で希釈し、0.45/0.2μmフィルター(Sartobran P)をとおして濾過した。フェニル-セファロースTM カラムを、2CVの1M NaOHで30L/h(42.43cm/時間 リニア流速)で消毒し、次に5CVの水で洗浄した。カラムを、次に7CVの20mM Tris/250mM Na2SO4(pH7.8)で平衡化した。100Lの調製したSTREAMLINE溶出液の適用を、流速71L/h(100.42cm/時間 リニア流速)で実施した。5CVの20mM Tris/250mM Na2SO4(pH7.8)で洗浄後、カラムを硫酸ナトリウムのグラジエント(20mM Tris, 200mM Na2SO4, pH7.8から5mM Tris, 約14mM Na2SO4;pH7.8まで減少させる)を8.8CVを超える量で適用することで溶出した。溶出ピークを約9Lの12画分に収集し、この際に収集をUV吸光>0.1で開始し、収集をUV吸光<0.1で停止し、5mM Tris単独で溶出されたピーク後の物質を排除した。主ピークを網羅する全画分を、貯蔵する前に、分析のために集めた。溶出したサンプルを、SDS-PAGEで分析した(図3を参照されたい)。
クロマトグラフィーを、ファルマシアBPG200カラムに充填ベット容積4.7L(即ち、20 cmカラム直径, 断面積314cm2, ベット高15cm)で、ファルマシア6mmバイオプロセスシステムを用いて、周囲温度で実施した。使用した樹脂は、キレーティング セファロースTMファーストフロー(ファルマシア)であった。3.5CVの250mM Ni2SO4(pH7.8)を充填する前に、保存剤を除去するために5CVの水で31L/h(98.7cm/時間 リニア流速)で前記樹脂を洗浄した。次に前記カラムを、3CVの50mM Tris/100mM Na2SO4(pH7.8)で31L/hで平衡化する前に、3CVの20mM Tris/0.5M Na2SO4(pH7.8)を31L/hで適用して、任意の混入物および過剰なニッケルを除去した。前記フェニルカラムの溶出貯蔵物(105L)を、カラムに流速31L/hで適用した。カラム洗浄を、1CVの50mM Tris/250mM Na2SO4(pH7.8)をポンプで流速31L/hで実施した。XIII因子を50mM Tris(pH7.8)を用いて溶出した。そして、溶出ピークを、UV記録がベースラインを超えて上昇すると同時に収集した。トータルの溶出容量(第3のXIII因子豊富化画分)は8Lであり、これを即座に20Lまで50mM Tris(pH7.8)で希釈することによって沈殿を予防し、+4゜Cで一晩貯蔵した。
本工程で使用したQ-セファロースTM樹脂は、以前に使用した。それをファルマシアBPG300カラムに、10.6L(15cmカラム直径, 断面積707cm2, ベッド高15cm)のベット容量で充填した。カラムを、2CVの1M NaOHで流速30L/h(42.43cm/h リニア流速)で消毒した。カラムを、次に5CVの精製水で、次に3CVの100mM Tris(pH7.5)および2CVの20mM Tris/0.5M Na2SO4(pH7.5)で洗浄することによって、樹脂を対イオンで荷電させた。次に、カラムを5CVの20mM Tris(pH7.5)で洗浄することによって、伝導度を<3.0mS/cmまで減少させた。フロースルー緩衝液の実測値は、1.46mS/cmと測定された。IMAC溶出物中に存在している任意の残留Niイオンを複合体とするために、希釈されたIMAC溶出物にEDTAを1mMの終濃度まで添加した。次に供試物質を、カラムに適用する前に、0.45/0.2μmフィルター(Sartopore 2)をとおして濾過した。流速71L/h(100.42cm/h リニア流速)で適用した後に、カラムを5CVの20mM Tris(pH7.5)で洗浄した。
本例において、0.6 m2の全体膜領域を提供している30kDa分子量カットオフ(MWCO)膜カセットを、ダイアフィルトレーションに使用した。要約すると、Q-セファロースTM クロマトグラフィー工程からの溶出液を、塩(Na2SO4)濃度を減少させるために、等容量の精製水で希釈した。希釈した溶出貯蔵物を、次に25%(w/v)スクロースを終濃度2.5%まで添加することによって調製し、200Lの全量が提供された。供給(feed)を、蠕動ポンプで10Lの冷却したリザーバーへと0.45/0.2μmフィルターを通して送った。一度、リザーバーが満たされると、3barの入口圧(0bar 出口圧)を適用することによって濃縮が開始され、そして保留物(retentate)を10Lのリザーバーへと戻した。
ダイアフィルトレーションしたrhFXIII濃縮画分を、等容量の処方緩衝液(20mMヒスチジン, 4.25%(w/v)スクロース, 0.02%(v/v)ポリソルベート, pH8.0)で希釈した。A280測定によって、計算上の濃度5.4g/Lが算出された。所望の濃度は約2.5g/Lなので、物質をさらに17.4L緩衝液(20mMヒスチジン, 4.25%(w/v)スクロース, 0.01%(v/v)ポリソルベートpH8.0)で希釈した。A280で測定された終濃度は、2.4g/Lであった。物質を、次に0.22μmフィルターを通して、幾つかのアリコートへと濾過滅菌し、-20゜Cで保存した。図6は、最終産物のSDS-PAGE銀染色分析の結果を示している。濃縮されたダイアフィルトレーション産物を、活性化されたrhFXIIIの存在に関して分析し、非常に低いレベル0.19%が示された。凝集物の存在をSEC-HPLCで測定し、非常に低いレベル0.05%(w/w)が示された。
Claims (9)
- XIII因子を生物学的流体から精製するための方法であって、前記生物学的流体を固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)で分画する工程を備え(ここで、IMAC分画の前に前記生物学的流体が陰イオン交換分画法で分画されて、XIII因子が豊富化された第1画分が産生される)、さらにXIII因子が豊富化された第1画分をIMAC分画の前に疎水性相互作用分画法で分画することをさらに備え、前記疎水性相互作用分画法は、フェニル基で誘導体化されたクロマトグラフィー媒体の使用を備える方法。
- 請求項1に記載の方法であって、IMACに引き続く陰イオン交換分画をさらに備える方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記生物学的流体は細胞ライセートである方法。
- 請求項3に記載の方法であって、前記細胞ライセートは組換え型酵母の細胞ライセートである方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記XIII因子は組換え型XIII因子である方法。
- 請求項5に記載の方法であって、前記組換え型XIII因子は組換え型ヒトXIII因子である方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記陰イオン交換分画法は、DEAEまたはQAEで誘導体化されたクロマトグラフィー媒体の使用を備える方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記固定化金属アフィニティークロマトグラフィー分画は、Cu 2+ 、Zn 2+ 、またはNi 2+ で荷電したクロマトグラフィー媒体の使用を備える方法。
- 請求項8に記載の方法であって、前記クロマトグラフィー媒体はNi 2+ で荷電した方法。
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