DK162233B - Fremgangsmaade til isolering af faktor viii fra blodplasma og pharmaceutisk praeparat indeholdende den saaledes isolerede fator viii - Google Patents
Fremgangsmaade til isolering af faktor viii fra blodplasma og pharmaceutisk praeparat indeholdende den saaledes isolerede fator viii Download PDFInfo
- Publication number
- DK162233B DK162233B DK562189A DK562189A DK162233B DK 162233 B DK162233 B DK 162233B DK 562189 A DK562189 A DK 562189A DK 562189 A DK562189 A DK 562189A DK 162233 B DK162233 B DK 162233B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- plasma
- fviii
- gel filtration
- column
- factor viii
- Prior art date
Links
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 title claims abstract description 118
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 title claims abstract description 84
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims abstract description 118
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims abstract description 118
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims abstract description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 20
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 239000004023 fresh frozen plasma Substances 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 26
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 18
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 13
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 12
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 7
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 5
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 4
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 4
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 3
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 2
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 2
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 2
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 2
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 2
- 108010081391 Ristocetin Proteins 0.000 description 2
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 2
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N chembl1095986 Chemical compound C1[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]1C(N[C@H](C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3C=4C=C(C(=C(O)C=4)C)OC=4C(O)=CC=C(C=4)[C@@H](N)C(=O)N[C@@H](C(=O)N3)[C@H](O)C=3C=CC(O4)=CC=3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1)=CC=C1OC1=C(O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]5[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O5)O)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C4=CC2=C1 BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 2
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 2
- 229950004257 ristocetin Drugs 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 2
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 1
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010035369 Cohn fraction I Proteins 0.000 description 1
- 206010016077 Factor IX deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 1
- 241000209027 Ilex aquifolium Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Amplifiers (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Networks Using Active Elements (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Separation By Low-Temperature Treatments (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
DK 162233 B
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til isolering af koagulationsfaktor VIII direkte fra legemsvæsker såsom plasma, under anvendelse af gelfiltrering som et første isolationstrin.
5 OPFINDELSENS BAGGRUND
Faktor VIII (FVIII) også kendt som antihæmophili faktor A eller AHF er et plasmaprotein, som deltager i blodets naturlige koagulationssystem.
FVIII cirkulerer i blodplasmaet i en extrem lav koncentration 10 i form af et ikke-kovalent komplex af to proteiner med henholdsvis FVIII-koagulerende aktivitet (FVIII:C) og ristocetin-co-faktor aktivitet (von Willebrands Faktor) (vWF).
FVIII:C er fraværende eller uvirksomt i individer, som lider af blødersygdommen hæmofili A, som rammer ca. 5 ud af 100.000 15 personer.
vWF binder til aktiverede blodplader på en sådan måde, at aggregationen af de aktiverede blodplader fremmes. Denne effekt kan detekteres in vitro ved aggregation af ristocetininducerede blodplader. I forbindelse med von Willebrands sygdom ses en 20 forlænget blødningstid på grund af mangel på eller reduceret niveau for vWF's biologiske aktivitet.
Blødere, som lider af hæmofili A og patienter, som lider af alvorlige tilfælde af von Willebrands's sygdom, behandles i dag med koncentrater, som indeholder FVIII:C/vWF, en behandling som 25 har forbedret deres livskvalitet og erhvervsmuligheder væsentligt og har bidraget til at forøge disse patienters levetid.
DK 162233 B
2
Pharmaceutiske præparater, som indeholder FVIII (FVIII:c og/eller vWF) kan fremstilles ud fra blod eller blodplasma. Produktionen af sådanne præparater kan udføres på en række kendte måder, som alle er karakteriseret ved lave udbytter af 5 især FVIII:C. Fælles for næsten alle fremgangsmåderne er et initialt rensningstrin, som omfatter en cryofældning. Ved cryofældning optøes frosset plasma ved en temperatur på 0-4°C, hvilket giver anledning til et bundfald, som indeholder FVIII, som kan opsamles, f.eks. ved centrifugering. Selv om cryofæld-10 ningen er relativt simpel, har den en væsentlig ulempe, da den, når den anvendes i større skala, f.eks. pools af plasma indeholdende mere end 5 kg, giver et lavt udbytte af FVIII:C (30-45% af indholdet af plasma), hvilket betyder, at det endelige udbytte er lavt uafhængigt af hvilke senere rensnings-15 trin, som anvendes.
Endvidere indbefattes generelt et virusinaktiveringstrin under fremstillingen af FVIII-præparaterne. Virus inaktiveringstrinene har forøget sikkerheden imod virus i præparaterne betydeligt, men forårsager i de fleste tilfælde en yderligere reduktion af 20 FVIII-udbyttet.
Det meget lave totaludbytte af FVIII har ført til en mangel på disse præparater adskillige steder, og der er således et behov for nye fremgangsmåder til rensning af FVIII i højt udbytte for at opfylde behovet for FVIII til behandling af blødere.
25 Nye fremgangsmåder til isolering af FVIII direkte fra plasma i højt udbytte vil være af stor betydning, da op til 70% af FVIII-indholdet i plasma tabes så tidligt som i eller før cryofældningen.
Det er for nyligt forsøgt at isolere FVIII direkte fra plasma 30 under anvendelse af affinitetschromatografi (Thromb. Haemost., 61, (2), 234-237 (1989)), men der blev kun opnået et udbytte på mindre end 60% og en specifik aktivitet på 1 IU FVIII/mg protein i den isolerede FVIII-holdige fraktion.
DK 162233 3
Gelfiltrering, også betegnet gelpermeationschromatografi eller størrelsesexclutionschromatografi, er en diffusionskontrolleret proces, som anvendes til separering af opløste stoffer i overensstemmelse med deres størrelse. De opløste stoffer føres 5 igennem en søjle pakket med inerte porøse gelpartikler med en porestørrelse som udelukker de største molekyler, medens de mindre molekyler diffunderer ind i den stationære fase inden i gelpartiklerne. Således elueres de største molekyler, som totalt udelukkes fra gelpartiklerne, først i "void volume", 10 medens de mindre molekyler tilbringer længere tid med at passere søjlen og elueres i overensstemmelse med deres faldende størrelse med stigende elueringsvoluminer.
Gelfiltrering kan udføres på to forskellige måder: 1. Gruppeseparation 15 Ved gruppeseparation adskilles de opløste stoffer i to grupper med stor forskel i molekylstørrelse, idet den ene gruppe elueres med void volume, og den anden gruppe elueres senere med et langt større elueringsvolumen, ofte tæt ved det totale søjlevolumen; denne fremgangs-20 måde anvendes primært til at adskille proteiner fra opløste salte eller at udskifte puffer og kaldes "af-saltning". Til "afsaltning" anvendes stive geler med lille porestørrelse, og processen kan udføres under anvendelse af store materialemængder (prøvevoluminer 25 udgør 20-30% af søjlevolumen) og anvendelse af et højt flow (ca. 1 søjlevolumen puffer pr. time); således er søjlens kapacitet stor.
2. Fraktionering.
Ved fraktionering adskilles opløste stoffer med lignende 30 molekylvægte; denne procedure anvendes ofte til adskil lelse af proteiner. Til dette formål anvendes gelpartikler med større porer, og gelfiltreringsmediet vælges, så at det sikres, at proteinerne elueres mellem void volume og et elueringsvolumen, som svarer til det totale 35 søjlevolumen. Stofferne elueres tættere, end når der
DK 162233 B
4 anvendes gruppeseparationsbetingelser, og kan overlappe.
Høje flowhastigheder er endvidere ikke ønskelige, da dette ikke tillader en effektiv adskillelse af proteiner, og søjlebelastningen må holdes lav for at få en 5 fornuftig adskillelse af de enkelte proteiner. Således er gelfiltrering anvendt som fraktionering kun blevet anbefalet til adskillelse af proteiner som et sidste polerende trin, hvor det volumen, som skal fraktioneres, er lille (Jagschies, Ullmanns Encyclopedia of Industrial 10 Chemistry, vol B3(10), 1988 and Bio/Technol., 4, 954-58 (1986)).
Det har været forsøgt at isolere FVIII fra plasma under anvendelse af gelfiltrering (J. Lab. Clin. Med., 72, (6), 1968, 1007-1008 og J. Clin. Invest., 48, 1969, 957-962). Der blev 15 fundet en høj oprensning under forsøgene, men udbytterne var kun omkring 40-50%. Renheden af den resulterende FVIII-holdige fraktion blev fundet at være afhængig af udgangsplasmaet, da et stort indhold af lipider og chylomicroner gav anledning til en uklar FVIII-fraktion med lavere specifik aktivitet. Det blev 20 bemærket, at den anvendte gelfiltreringsteknik ikke tillod håndtering af store mængder af plasma, selv om foreløbige forsøg indicerede, at gelfiltrering af den langt mere koncentrerede Cohn-fraktion I syntes mulig.
Endvidere fandt Paulssen et al. (Thromb. Diathes. Haemorr., 22, 25 1969, 577-583), at FVIII kunne adskilles fra andre plasmaproteiner under anvendelse af gelmediet Sepharose 6B, men at chromatografi under anvendelse af gelfiltrering kun syntes mulig i stor skala, når der anvendtes genopløst cryoprecipitat som udgangsmateriale.
30 I US patentskrift nr. 3.637.489 beskrives en fremgangsmåde til adskillelse af blodkomponenter under anvendelse af gelfiltrering og porøse glaskugler. Fremgangsmåden er især tænkt til separering af immunologisk aktive materialer fra andre bestanddele i serum eller plasma.
5 DK 162253 3
Siden da er der udført adskillige forsøg på at anvende gelfiltrering til rensning af FVIII, men forsøgene har koncentreret sig om gelfiltrering af delvis rensede plasmafraktioner (genopløst cryopræcipitat og yderligere rensede fraktioner 5 deraf). Alle forsøg blev udført enten under anvendelse af små prøvemængder på søjlerne og/eller små flow hastigheder eller kombinationer deraf.
Gelfiltrering har været kendt siden 1959 som en fremgangsmåde til proteinfraktionering og anvendes bredt i biokemiske 10 forskningslaboratorier som en fremgangsmåde til karakterisering af proteiner og til oprensning af proteiner fra prøver med små voluminer, f.eks. < 1 liter. Gel filtrering har op til den foreliggende opfindelse ikke været anvendt i stor skala til proteinseparering ved plasmafraktionering, idet den eneste 15 anvendelse har været afsaltning af ethanol og salte fra albuminopløsninger. Således er angivet i opslagsbøgerne: "The main reason why gel filtration has not become a major technique in plasma fractionation are the low throughput of protein per column volume" (J.H. Berglof: "Fractionation by Gel Filtra-20 tion", p. 163-173 i J.M. Curling (Ed.): "Methods of Plasma
Protein Fractionation", Academic Press, London, 1980) og "Unfortunately, the protein masses that can be handled by reasonably sized columns are small, and the dilution of the sample cannot be neglected. The method is therefore not much 25 used in plasma fractionation" (J.J. Morgenthaier et al.: "Preservation of structure and function during isolation of human plasma proteins", p. 127-138 i Smit Sibinga et al. (Eds.): "Plasma Fractionation and Blood Transfusion", Martinus Nijhoff Publishers, Boston, 1985).
30 I offentliggjort international patentansøgning nr. W089/09784 beskrives fremstilling af varmestabile koncentrater af Faktor VIII ved diafiltrering af et koncentrat af Faktor ’VIII, i praksis et genopløst cryopræcipitat, og der antydes intet om en isolering af Faktor VIII direkte fra plasma.
DK 162233 B
& I US Patentskrift nr. 4.675.385 beskrives en fremgangsmåde til isolering af Faktor VIII prokoagulant protein fra et plasmapræparat, som indeholder Faktor VIII, højmolekylære bestanddele og lavmolekylære bestanddele ved sekventiel exclusions-HPLC ved, 5 i et første trin, at fremstillet en pufret vandig opløsning af et plasmapræparat og fraskille bestanddelene med lav molekylvægt ved at sætte præpratet på en chromatografisk søjle af porøse partikler til HPLC med en størrelse fra ca. 13 til ca.
35 μια og eluere søjlen med et puf ret elueringsmiddel. For at få 10 en god adskillelse angives det i US Patentskrift nr. 4.675.385, at der skal anvendes søj ler med et aspektforhold ikke under mellem 10 og 40, hvilket reducerer kapaciteten, men alligevel ikke sikrer en god adskillelse af Faktor VIII-bestanddele fra plasmaproteiner med lav molekylvægt. En sådan første isolering 15 alene sikrer imidlertid ikke en god adskillelse af proteiner, som udviser Faktor VIII-aktivitet, fra andre proteinbestanddele i plasmapræparatet, hvilket først opnås ved gennemførelse af den anden HPLC.
Således har det op til den foreliggende opfindelse været en 20 generelt accepteret kendsgerning, at gelfiltrering ikke er en hensigtsmæssig fremgangsmåde til proteinseparering ved plasmafraktionering, når der skal håndteres større voluminer, f.eks. over 5 liter.
Det har nu overraskende vist sig, at når man udvælger gelfil-25 treringsmaterialer beregnet til høje flowhastigheder, er det muligt at isolere FVIII i form af en ren fraktion og i særdeles højt udbytte direkte fra plasma ved en meget mild mekanisk adskillelse uden at være afhængig af den normale indledende cryofældning
30 KORT BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til isolering af FVIII fra andre proteiner i blodplasma direkte fra plasma under anvendelse af gelfiltrering.
DK 162233 3 7
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at isoleret plasma eller optøet friskfrosset plasma, hvori al Faktor VIII er opløst, underkastes gelfiltrering under gruppeseparationsbetingelser under anvendelse af en høj belastning og 5 en høj flowhastighed, idet gelfiltreringsmediet udgøres af partikler, som er inerte overfor FVIII og har et fraktioneringsområde i intervallet fra 1 x 103 til 1 x 108, mere foretrukket fra 1 x 104 til 8 x 107. Fraktioneringsområdet kan f.eks. være i intervallet fra 5 x 104 til 4 x 107.
10 I en foretrukket udførelsesform udgør det påsatte plasmavolumen mindst 5% af søjlevoluminet. Den tilsatte mængde plasma er fortinsvis 15-40% af søjlevoluminet.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres fortrinsvis med en flowhastighed på mindst 0,3 søjlevoluminer pr. time, mere 15 foretrukket 0,5-2 søjlevoluminer pr. time.
Til den foreliggende opfindelses formål anvendes et gelfiltreringsmedium, som har en stivhed, som tillader en hurtig eluering. Endvidere skal gelen være kemisk og immunologisk inert over for FVIII under gel filtreringen. Forsøg har vist, at 20 fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan udføres under anvendelse af kommercielle geler såsom Sepharose CL-4B, Sepharose CL-6B, Sepharose 4FF, Sepharose 6FF, Sephacryl S-500, Fractogel TSK HW-65(F) og Matrex Cellufine CGL 2000, som alle er hensigtsmæssige til den foreliggende opfindelses formål.
25 Ifølge en udførelsesform for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse optøes frosset plasma, og det sikres at al FVIII er opløst, hvorefter det optøede plasma fortrinsvis påsættes kolonnen umiddelbart efter, at al FVIII er opløst. Temperaturen lades fortrinsvis ikke stige for højt for at undgå 30 for udstrakt nedbrydning af FVIII. Plasmaet kan forbehandles ved f.eks. at tilsætte heparin, citrat, saccharose, aminosyrer, salte eller andre stabilisatorer og eventuelt filtreres, centrifugeres, koncentreres ved ultrafiltrering, forfældes under anvendelse af sædvanlige fældningsmidler eller forbehand-35 les på en anden måde, før det sættes på søjlen, så længe enhver
DK 162233 B
8 af de eventuelle forbehandlinger ikke har nogen væsentlig indflydelse på indholdet af FVIII i plasmaet.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen har overraskende vist sig at give et særdeles højt udbytte af FVIII. Typisk: genfindes over 5 70% af indholdet af FVIII i plasmaet i produktet, og fremgangsmåden giver anledning til et meget rent produkt med en specifik aktivitet fra 1 til ca. 4 IU FVIII:C/mg protein. Dette kan delvis tilskrives den kendsgerning, at ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen skilles FVIII også fra 10 proteolytiske enzymer, som normalt kan forårsage.en nedbrydning af FVIII:C, meget tidligt i isoleringsfremgangsmåden.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen muliggør behandling af store mængder plasma under betingelser, hvor plasmaet påsættes under anvendelse af høje belastninger og høje flowhastigheder ved en 15 gelfiltrering, som giver anledning til høj genfinding af FVIII i høj renhed. Der tilbydes således en særdeles .effektiv fremgangsmåde med industriel anvendelighed.
De(n) FVIII-holdige fraktion(er) fra gelfiltreringen eller de kombinerede fraktioner fra flere gelfiltreringer kan derefter 20 koncentreres og yderligere renses under anvendelse af i og for sig kendte teknikker såsom ultrafiltrering, udfældninger, ionbytning, affinitetschromatografi eller lignende.
De tilbageværende plasmaproteiner såsom albumin, immunoglobu-liner, prothrombinkomplekset, antitrombin III og andre kan også 25 isoleres fra de senere fraktioner fra gelfiltreringen under anvendelse af i og for sig kendte teknikker, såsom udfældning med alkohol, PEG-fældninger, chromatografi eller lignende.
Bestemmelsen af FVIII:C-aktiviteten kan enten udføres som et et-trins assay eller to-trins assay. Det er en kendsgerning, at 30 et- og to-trins assay kan resultere i afvigende bestemmelser af FVIII:C-aktiviteten i en prøve. Det er endvidere kendt, at gentagne bestemmelser under anvendelse af det samme assay på 9 DK 162253 3 den samme prøve kan give anledning til variationer i bestemmelsen af FVIII:C-aktiviteten.
Udtrykket ''plasma" anvendes her til at betegne blod fra hvilket alle blodlegemer og -plader er fjernet, f.eks. ved centrifu-5 gering.
Udtrykket "FVIIIiAg" betegner Faktor VIII-relateret antigen, og "vWF-Ag" von Willebrand Faktor-relateret antigen. "Søjlevolu-men" defineres som voluminet af det pakkede gelmedium samt væsken i mellemrummene. "Void volume" defineres som voluminet 10 af puffer mellem gelpartiklerne, og "elueringsvoluminet" er det volumen puffer, som anvendes til at eluere et specifikt materiale. Udtrykket "søjlebelastning" anvendes til at betegne det volumen materiale, som sættes på søjlen, beregnet som en procentdel af søjlevoluminet. Udtrykket "fraktioneringsområde" 15 skal betegne det molekylvægtområde for (globulære) proteiner eller større molekyler, for hvilket gelmaterialet anbefales af leverandøren.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen forklares nærmere under henvisning til tegningen og eksemplerne, som belyser udførel-20 sesformer for opfindelsen. Eksemplerne skal kun belyse opfindelsen og skal ikke forstås som være begrænsende for opfindelsens omfang, som defineres af kravene.
KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGEN
Den foreliggende opfindelse belyses nærmere under henvisning 25 til tegningen, på hvilken
Fig. 1 viser en grafisk afbildning af elueringen af FVIII ved gelfiltrering i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse bestemt ved forskellige assays, og
DK 162233 B
10
Fig. 2 elueringsrækkefølgen for forskellige plasmapro teiner ved gelfiltrering i overensstemmelse med opfindelsen.
EKSPERIMENTEL DEL
5 Eksempel 1
Gelfiltrering af plasma til isolation af FVIII.
En søjle med 0 2,6 cm pakkes med Sepharose CL-4B til en endelig højde på 60 cm.
Frosset plasma fra en dansk blodbank blev optøet ved 25 °C på et 10 vandbad. Efter tilsætning af 1 IU heparin/ml, sattes 50 ml (16% af søjlevoluminet) plasma på søjlen under anvendelse af et flow på 100 ml/time, hvorefter søjlen blev elueret under anvendelse af et flow på 200 ml/time puffer svarende til 0,63 søjlevolumi-ner pr. time. Ækvilibreringen af søjlen og elueringen blev 15 udført under anvendelse af en puffer, 0,02 M citrat, 0,15 M NaCl, pH-værdi 7,4. Til pufferen blev endvidere sat 2,55 ml M CaCl2 pr. liter til en fri calciumionkoncentration (Ca2+) på ca.
7 x 10'5. Den fri calciumionkoncentration blev kontrolleret under anvendelse af en calciumselektiv elektrode fra Ingold 20 GmbH (Frankfurt/Main, Vesttyskland) . Fraktioner opsamledes, og fra hver fraktion bestemtes OD280, FVIII:C (under anvendelse af både et-trins koagulationsassay og to-trins chromogen-assay), FVIII:Ag, albumin, IgG, fibrinogen, IgM, Alfa-2 makroglobulin, Faktor IX, Faktor X, protein C og antitrombin III. Protein målt 25 ved OD280 elueredes som en lille top ved void volume (frationer 10-18) efterfulgt af en meget stor bred top (fraktioner 19-50, jvf. fig. l). 82% af FVIII:C-aktiviteten bestemt ved to-trins chromogenassay og 91% af FVIII:C-aktiviteten bestemt ved et-trins koagulationsassay blev elueret i én samlet top sammen med 30 void volume (FVIII-hovedfraktion) sammen med den tidligste lille proteintop. Den tilbageværende mængde FVIII blev elueret i en mindre eftertop umiddelbart efter FVIII-hovedfraktionen
DK 162233 B
11 (fraktion 19-26). FVIII:Ag og vWF:Ag blev elueret sammen med FVIII:C, men med noget bredere eftertoppe.
Alle andre plasmaproteiner, der blev bestemt, blev elueret i fraktionen efter FVIII-hovedfraktionen sammen med den store 5 brede proteintop (jvf. fig. 2).
Bestemmelsen af FVIII:C-aktivitet under anvendelse af to-trins-chromogenassay blev udført under anvendelse af den chromogene substratmetode (KABI Coatest Faktor VIII), idet den oprindelige metode, hvor der anvendes reagensglas ved 37°C modificeredes 10 til at udføres under anvendelse af microtiter- plader med reduceret anvendelse af reagenser. Der anvendtes en prøve eller standard på 50 mikroliter, som efter blanding med 75 mikroliter af en opløsning af phospholipid, Faktor IXa, Faktor X og CaCl2 inkuberedes ved 37°C i 15 min., hvorefter der tilsattes 50 15 mikroliter substrat. Efter yderligere 20 min.s inkubation ved 37°C stoppedes reaktionen ved tilsætning af 50 mikroliter 1 M citronsyre. Farveudviklingen aflæstes ved 405 nm med reference ved 492 nm.
Bestemmelsen af FVIII: C-aktiviten under anvendelse af et-trins 20 assay'et udføres under anvendelse af APTT-metoden (Activated Partial Thromboplastin Time). 100 mikroliter prøve eller standard pipeteres ned i cuvetterne, hvorefter 100 mikroliter mangelplasma (FVIII-mangelplasma, General Diagnostic) tilsættes, og opløsningen termostateres ved 37°C i 5 min. Efter 25 tilsætning af 100 mikroliter 0,03 M CaCl2 bestemmes tiden indtil koagulation af opløsningen.
Til kvantitative bestemmelser fremstilles kalibreringskurver baseret på fortyndingsserier af en intern standard, som er kalibreret mod WHO standard (3rd Int. standard of FVIII, Human 30 Plasma, 3.9 IU/ml). To-trins-assay'et som beskrevet heri, har en lavere (ca. 10 gange) detektionsgrænse end et-trins-assay'et. Når der tilsættes heparin, er det en fordel at anvende to-trins-assay, da enhver mulig indflydelse af heparin på assay'et lettere kan fjernes ved fortynding.
DK 162233 B
12 FVIII:Ag bestemtes under anvendelse af ELISA under anvendelse af antistoffer fra en FVIII-inhibitorpatient som coating materiale på mikrotiterplade (Nunc, Kamstrup, 4000 Roskilde, Danmark) og under anvendelse af peroxidasemærket F(AB') 2-5 fragmenter fra den samme inhibitorpatient til bestemmelse af bundet FVIII (Thromb. Haemost., 53(3), 1985, 346-350).
Standardkurver fremstilledes under anvendelse af en pool af normalplasma, kalibreret mod WHO-standard (1st IRP, established 1982) .
10 VWF:Ag bestemtes også under anvendelse af ELISA, men under anvendelse af et kanin-anti-human vWF (DAKO, Danmark) som coatingmateriale og peroxidasemærket kanin-anti-human vWF (DAKO, Danmark) til bestemmelse af bundet vWF. Standardkurver blev fremstillet under anvendelse af det samme normalplasma som 15 for FVIII:Ag-ELISA.
Faktor IX blev bestemt under anvendelse af et-trins koagula-tionsassay på en analog måde som FVIII:C, idet der blot anvendtes Faktor IX-mangelplasma. IgG blev bestemt under anvendelse af radial immunodifffusion (Immunochemistry, 2, 20 1965, 235-254) og albumin, fibrinogen, alpha-2-macroglobulin, Faktor X, protein C og anti-thrombin III blev bestemt under anvendelse af raket immunelektroforese (Anal. Biochem., 15, 1966, 45-52) . OD280 blev bestemt under anvendelse af et spectrophotometer (Spectronic 601 fra Milton Roy Company) og 25 protein under anvendelse af Kjeldahl blev bestemt i overensstemmelse med pH. Eur. 2nd. Ed., I, V.3.5.2 uden udfældning med TCA. Specifik aktivitet for rensede fraktioner blev beregnet som forholdet mellem FVIII: C-koncentrationen og enten OD280 eller proteinkoncentrationen som bestemt under anvendelse 30 af Kjeldahl. Når der anvendes OD280 til beregning af den specifikke aktivitet, er resultaterne af de forskellige forsøg ikke direkte sammenlignelige, med mindre der anvendes samme udgangsplasma, da den fraktion, som indeholder FVIII, ofte er uklar, jvf. resultaterne fra Ratnoff et al. (J. Clin. Invest., 35 48, 1969, 957-962).
DK 162233 g 13
De forskellige gelfiltreringsmedier, som blev anvendt i forsøgene, var fra de foranstående kilder:
Sepharose CL-6B, Sepharose CL-4B, Sepharose CL-2B, Sepharose 6FF, Sepharose 4FF, Sephacryl S-400 og Sephacryl S-500 var alle 5 fra Pharmacia (Hillerød, Danmark), Biogel A-5m, Fine var fra BioRad (Bie & Berntsen, Rødovre, Danmark), Fractogel TSK HW-65(F) var fra Merck (Struers, Rødovre, Danmark) og Matrex Cellufine GCL 2000 var fra Amicon (Helsingborg, Sverige).
Eksempel 2 10 Gelfiltrering af plasma til isolering af FVIII under anvendelse af forskellige gelfiltreringsmedier.
En søjle med 0 2,6 cm blev pakket med forskellige gelfiltreringsmedier med forskellige fraktioneringsområder og forskellig struktur. I alle tilfælde var den endelige højde af 15 den pakkede søjle 60 cm. Plasma blev optøet som beskrevet i eksempel 1, og der blev tilsat 1 IU heparin pr. ml. For hvert af gelfiltreringsmedierne påsattes søjlen 50 ml plasma (16% af søjlevoluminet). Belastningen af søjlen og elueringen med puffer blev udført som beskrevet i eksempel 1. Flowhastigheden 20 var i alle tilfælde den samme som angivet i eksempel 1, bortset fra forsøget med anvendelse med Biogel A-5m, hvor flowhastigheden blev sænket til 50 ml/time p.gr.a. forøget modtryk. Fraktioner blev opsamlet, og for hver fraktion blev bestemt OD280 og FVIII:C under anvendelse af Coatest. Den specifikke 25 aktivitet for FVIII-hovedfraktionen blev beregnet som forholdet mellem FVIII :C/ml og OD280. Forsøgene blev gentaget n gange under anvendelse af forskellige plasmaer for hver belastning, og middelværdier for udbytte og specifik aktivitet blev beregnet. FVIII-hovedfraktionen blev udvalgt på samme måde som 30 beskrevet i eksempel 1, og udbyttet er angivet som indholdet af FVIII:C i FVIII-hovedfraktionen som en procentdel af indholdet af FVIII:C i det påsatte plasma.
DK 162233 B
14
Fraktioneringsområdet for de forskellige medier og de beregnede middelværdier er angivet i nedenstående Tabel I.
Tabel I
5 Gelfil. Fraktionerings Antal Udbytte Specifik medium område forsøg i % Aktivitet mw n A lxlO4 - 4xl06 3 95 0,16 10 —--r-;—l-1-1-1 B 6xl04 - 2x10' 4 82 0,88
-:. .......7 -I-1-1—'-H
C 7xl05 - 4xl07 3 68 0,24 --;-1—I-1-1-1 15 D lxlO4 - 4xl06 3 96 0,71 ---_]-1-1-[ E 6xl04 - 2xl07 3 86 1,35 ----;-1-1-:-!--1 F 6xl04 - 8xl07 3 91 0,28 20--:-7—1-H-1-1 G lxlO4 - 5x10° 1 71 0,12 --7- 1-1-1 H 5xl04 - 5x10° 2 84 0,18 --i- 1-1-1 --1-i—i—!—i-1-1 J lxio4 - 8x10° 3 101 0,75 _i_i_i_i_:_i A: Sepharose CL-6B; B: Sepharose CL-4B; C: Sepharose CL-2B; 30 D: Sepharose 6FF; E: Sepharose 4FF; F: Sephacryl S-500; G: Biogel A-5m Fine; H: Fractogel TSK HW-65 (F); I: Matrex Cellufine GCL 2000; J: Sephacryl S-400
DK 162233 B
15
Eksempel 3
Gelfiltrering af plasma til isolering af FVIII under anvendelse af forskellige søjlebelastninger.
En søjle med 0 2,6 cm blev pakket med Sepharose 4FF til en 5 endelig højde på 60 cm. Plasma blev optøet som beskrevet i eksempel 1. Efter optøning blev plasmaets pH-værdi indstillet til 7,0 under anvendelse af 0,5 M HC1, 1 IU heparin pr. ml blev tilsat, og plasmaet blev filtreret gennem et 10 /un nylonfilter.
Til søjlen blev sat henholdsvis 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml og 10 70 ml plasma. Påsætningen, flow og eluering under anvendelse af puffer blev udført som beskrevet i eksempel 1, selv om pufferen blev indstillet til pH-værdi 7,0. Der blev opsamlet fraktioner, og for hver fraktion blev bestemt OD280 og FVIII:c under anvendelse af Coatest. Specifik aktivitet af FVIII-hoved-15 fraktionen blev beregnet som forholdet mellem FVIII:C/ml og OD280. Forsøgene blev gentaget 3 gange under anvendelse af forskellige plasmaer for hver belastning, og der blev beregnet middelværdier (x). Voluminet af FVIII-hovedfraktionen (ml) er voluminet af den fraktion, som indeholder FVIII, og som kan 20 opsamles før den store brede proteintop (OD280) elueres, og udvælges på samme måde som beskrevet i eksempel 1. Udbyttet er angivet som indholdet af FVIII:C i FVIII-hovedfraktionen som en procentdel af indholdet af FVIII:C i det påsatte plasma. De beregnede tal er angivet i den nedenstående Tabel II.
DK 162233 B
16
Tabel II
Påsat mængde Faktor VIII Udbytte Specifik plasma hovedfraktion i aktivitet 5 i i % af Port. ml % ml søjle No.
volumen 1 70 88 0,81 10 2 70 95 0,18 30 9,4 3 70 90 0,63 x 70 91 0,54 15 1 70 76 0,68 2 70 85 0,17 40 12,6 3 70 93 0,61 X 70 85 0,49 20 ------ 1 80 91 0,57 2 · 80 90 0,20 50 15,7 3 80 85 0,53 25 x 80 89 0,43 1 80 79 0,81 2 80 85 0,16 60 18,8 3 90 95 0,61 30 X 83 86 0,53 1 80 85 0,82 2 100 90 0,21 35 70 22,0 3 100 93 0,53 x 93 89 0,52
Eksempel 4 40 Gelfiltrering af plasma til isolering af FVIII under anvendelse af forskellige elueringshastigheder.
På samme søjle som anvendt i eksempel 3 blev sat 50 ml plasma, optøet som beskrevet ovenfor. Efter optøning blev plasmaets pH-værdi indstillet til 7,0 under anvendelse af 0,5 M HC1, 1 IU 45 heparin/ml blev tilsat, og plasmaet blev filtreret gennem et 10
DK 162233 B
17 μια nylonfilter. Under anvendelse af 3 forskellige portioner plasma blev der undersøgt flowhastigheder på henholdsvis 100, 200 og 300 ml/time. Der anvendtes samme flow under påsætningen af plasmaet og den efterfølgende eluering. Elueringen blev 5 udført under anvendelse af den samme puffer som beskrevet i eksempel 3. Fraktioner blev opsamlet, og for hver fraktion blev bestemt OD280 og FVIIIrC under anvendelse af Coatest. Specifik aktivitet og udbyttet af FVIII-hovedfraktionen blev beregnet som i eksempel 3. Middelværdier (x) for volumen af FVIII-10 hovedfraktion, udbytte og specifik aktivitet blev beregnet. Resultaterne er angivet i nedenstående Tabel III:
Tabel III
Flow Plasma Faktor VIII Udbytte Specifik 15 ml/time Søjle Portion hovedfrak- i % aktivi- volumen Nr. tion tet pr. time ml 1 80 89 0,75 20 2 80 88 0,17 100 0,31 3 80 80 0,65 X 80 86 0,52 25 1 80 84 0,99 2 80 88 0,18 200 0,63 3 80 89 0,79 X 80 87 0,65 30 ------ 1 70 85 0,72 2 80 96 0,18 300 0,94 3 80 83 0,44 35 X 77 88 0,45
Eksempel 5
Gel filtrering af plasma til isolering af FVIII under anvendelse af forskellige søjlebelastninger.
DK 162233 B
18
En søjle med 0 10 cm blev pakket med Sepharose 4FF til en endelig højde på 60 cm. Frosset plasma fra en dansk blodbank blev optøet ved 30°C på et vandbad. Henholdsvis 925, 1497 og 2000 g blev sat på søjlen. Flow'et blev holdt på ca. 4200 5 ml/time under påsætning og elueringen af plasmaet under anvendelse af en Master flex slangepumpe (Buch & Holm,' Herlev, Danmark) svarende til ca. 0,89 søjlevoluminer pr. time. Til eluering blev anvendt den samme puffer som beskrevet i eksempel 1. OD280 blev overvåget kontinuerligt under anvendelse af en 10 Pharmacia Monitor UV-1. Når OD280 begyndte at stige i void volume, blev opsamlingen af FVIII-hovedfraktionen startet, og den blev afsluttet, når OD280 viste, at den store proteintop begyndte at blive elueret. I FVIII-hovedfraktionen blev FVIII: C-indholdet bestemt under anvendelse af et-trins koagula-15 tionsassay, og protein blev bestemt under anvendelse af Kjel-dahl. Den specifikke aktivitet blev beregnet som forholdet mellem det totale antal FVIII: C-enheder i FVIII-hovedfraktionen og det totale antal milligram protein i FVIII-hovedfraktionen. Udbyttet af FVIII:C blev beregnet som indholdet af FVIII:C i 20 FVIII-hovedfraktionen i procent af indholdet af FVIII:C i det påsatte plasma.
Resultaterne er angivet i nedenstående Tabel IV.
Tabel IV
25 Tilsat mængde plasma Faktor VIII Udbytte Specifik i gram % af søjle- hovedfrak- i % aktivitet volumen tion i gram IU/mg 925 19,6 1192 74 2,50 30 1497 31,8 1860 73 2,24 2000 42,4 2200 81 1,08
Eksempel 6
Gelfiltrering af plasma til isolering af FVIII under anvendelse 35 af en søjle i industriel størrelse.
Claims (7)
1. Fremgangsmåde til isolering af Faktor VIII fra andre proteiner i blodplasma direkte fra plasma under anvendelse af et gelfiltreringsmedium, kendetegnet ved, at isoleret plasma 25 eller optøet friskfrosset plasma, hvori al Faktor VIII er opløst, underkastes gelfiltrering under gruppeseparationsbetingelser under anvendelse af en høj belastning og en høj flowhastighed, idet gelfiltreringsmediet udgøres af partikler, som er inerte overfor Faktor VIII og har et fraktioneringsom-30 råde i intervallet fra 1 x 103 til 1 x 108.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at gelfiltreringsmediet udgøres af et gelmateriale med et fraktioneringsområde i intervallet fra 1 x 104 til 8 x 107· DK 162233 B 20
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at gelfiltreringsmediet udgøres af et gelmateriale med et fraktioneringsområde i intervallet fra 5 x 104 til 4 x 107.
4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5 3, kendetegnet ved, at det påsatte plasmavolumen udgør mindst 5. af søjlevoluminet.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det påsatte plasmavolumen er 15-40% af søjlevoluminet.
6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10 5, kendetegnet ved, at flowhastigheden er mindst 0,3 søjlevolu- miner pr. time.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at flowhastigheden er 0,5-2 søjlevoluminer pr. time. 1 Pharmaceutisk præparat indeholdende Faktor VIII isoleret 15 i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7.
Priority Applications (28)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK562189A DK162233C (da) | 1989-11-09 | 1989-11-09 | Fremgangsmaade til isolering af faktor viii fra blodplasma og pharmaceutisk praeparat indeholdende den saaledes isolerede fator viii |
| ZA908599A ZA908599B (en) | 1989-11-09 | 1990-10-26 | A method for isolating biologically active compounds |
| SK5371-90A SK537190A3 (en) | 1989-11-09 | 1990-11-01 | Method of the factor viii isolation |
| CS905371A CZ537190A3 (cs) | 1989-11-09 | 1990-11-01 | Způsob izolování faktoru VIII |
| SU905052211A RU2055593C1 (ru) | 1989-11-09 | 1990-11-05 | Способ выделения фактора viii из других белков в плазме крови |
| HU9201551A HU214905B (hu) | 1989-11-09 | 1990-11-05 | Eljárás VIII. faktor izolálására |
| DE69017050T DE69017050T2 (de) | 1989-11-09 | 1990-11-05 | Verfahren zur isolierung von faktor viii. |
| AU67470/90A AU631471B2 (en) | 1989-11-09 | 1990-11-05 | A method for isolating factor viii |
| PCT/DK1990/000279 WO1991007438A1 (en) | 1989-11-09 | 1990-11-05 | A method for isolating factor viii |
| ES90917201T ES2068404T3 (es) | 1989-11-09 | 1990-11-05 | Un metodo para aislar el factor viii. |
| AT90917201T ATE118508T1 (de) | 1989-11-09 | 1990-11-05 | Verfahren zur isolierung von faktor viii. |
| JP3500067A JP2509407B2 (ja) | 1989-11-09 | 1990-11-05 | 生物学的に活性な化合物の単離方法 |
| CA002073012A CA2073012C (en) | 1989-11-09 | 1990-11-05 | Method for isolating factor viii |
| UA94020494A UA29421C2 (uk) | 1989-11-09 | 1990-11-05 | Спосіб виділення фактора vііі з інших білків в плазмі крові |
| EP90917201A EP0524172B1 (en) | 1989-11-09 | 1990-11-05 | A method for isolating factor viii |
| NZ236004A NZ236004A (en) | 1989-11-09 | 1990-11-07 | Isolation of factor viii using gel filtration |
| US07/610,480 US5245014A (en) | 1989-11-09 | 1990-11-07 | Method for isolating factors viii from plasma by gel filtration chromatography under group separation conditions |
| SI9012105A SI9012105A (sl) | 1989-11-09 | 1990-11-07 | Postopek za izoliranje biološko aktivnih spoji |
| YU210590A YU47524B (sh) | 1989-11-09 | 1990-11-07 | Postupak za izolovanje faktora viii iz drugih proteina u krvnoj plazmi |
| PT95830A PT95830B (pt) | 1989-11-09 | 1990-11-08 | Processo para o isolamento do factor viii sob a forma de uma fraccao pura directamente de plasma mediante filtracao em gel |
| IE402290A IE66836B1 (en) | 1989-11-09 | 1990-11-08 | A method for isolating biologically active compounds |
| IL9627790A IL96277A (en) | 1989-11-09 | 1990-11-08 | Method for isolating factor IIIV |
| PL90287703A PL164894B1 (pl) | 1989-11-09 | 1990-11-09 | Sposób izolowania c zynnika krzepniecia VIII PL PL PL PL PL PL PL PL |
| CN90109030A CN1044121C (zh) | 1989-11-09 | 1990-11-09 | 分离凝血因子viii配合物的方法 |
| BG96316A BG61231B1 (en) | 1989-11-09 | 1992-05-08 | A method for isolating factor viii |
| NO921839A NO180741C (no) | 1989-11-09 | 1992-05-08 | Fremgangsmåte for isolering av Faktor VIII |
| FI922105A FI103510B (fi) | 1989-11-09 | 1992-05-08 | Menetelmä tekijän VIII eristämiseksi |
| HRP-2105/90A HRP930277A2 (en) | 1989-11-09 | 1993-03-08 | A method for isolating biologically active compounds |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK562189A DK162233C (da) | 1989-11-09 | 1989-11-09 | Fremgangsmaade til isolering af faktor viii fra blodplasma og pharmaceutisk praeparat indeholdende den saaledes isolerede fator viii |
| DK562189 | 1989-11-09 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK562189D0 DK562189D0 (da) | 1989-11-09 |
| DK562189A DK562189A (da) | 1991-05-10 |
| DK162233B true DK162233B (da) | 1991-09-30 |
| DK162233C DK162233C (da) | 1992-03-16 |
Family
ID=8144000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK562189A DK162233C (da) | 1989-11-09 | 1989-11-09 | Fremgangsmaade til isolering af faktor viii fra blodplasma og pharmaceutisk praeparat indeholdende den saaledes isolerede fator viii |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5245014A (da) |
| EP (1) | EP0524172B1 (da) |
| JP (1) | JP2509407B2 (da) |
| CN (1) | CN1044121C (da) |
| AT (1) | ATE118508T1 (da) |
| AU (1) | AU631471B2 (da) |
| BG (1) | BG61231B1 (da) |
| CA (1) | CA2073012C (da) |
| CZ (1) | CZ537190A3 (da) |
| DE (1) | DE69017050T2 (da) |
| DK (1) | DK162233C (da) |
| ES (1) | ES2068404T3 (da) |
| FI (1) | FI103510B (da) |
| HU (1) | HU214905B (da) |
| IE (1) | IE66836B1 (da) |
| IL (1) | IL96277A (da) |
| NO (1) | NO180741C (da) |
| NZ (1) | NZ236004A (da) |
| PL (1) | PL164894B1 (da) |
| PT (1) | PT95830B (da) |
| RU (1) | RU2055593C1 (da) |
| SK (1) | SK537190A3 (da) |
| UA (1) | UA29421C2 (da) |
| WO (1) | WO1991007438A1 (da) |
| YU (1) | YU47524B (da) |
| ZA (1) | ZA908599B (da) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0399321B1 (en) * | 1989-05-24 | 1993-06-23 | Miles Inc. | Gel filtration of heat treated factor viii |
| US5888974A (en) * | 1992-04-07 | 1999-03-30 | Emory University | Hybrid human/animal factor VIII |
| US6180371B1 (en) | 1996-06-26 | 2001-01-30 | Emory University | Modified factor VIII |
| US5859204A (en) * | 1992-04-07 | 1999-01-12 | Emory University | Modified factor VIII |
| US5659017A (en) * | 1995-11-07 | 1997-08-19 | Alpha Therapeutic Corporation | Anion exchange process for the purification of Factor VIII |
| US7560107B2 (en) | 1996-06-26 | 2009-07-14 | Emory University | Modified factor VIII |
| US6458563B1 (en) | 1996-06-26 | 2002-10-01 | Emory University | Modified factor VIII |
| US6531577B1 (en) * | 1997-12-15 | 2003-03-11 | Hemasure Denmark A/S | von Willebrand factor (vWF)-containing preparation, process for preparing vWF-containing preparations, and use of such preparations |
| US6290527B1 (en) * | 1998-07-03 | 2001-09-18 | Nippon Telegraph And Telephone Corp. | Nippon telegraph and telephone corporation |
| BR0008405B1 (pt) | 1999-02-22 | 2014-04-22 | Baxter Int | Composição de fator viii formulada sem a adição de albumina, uso de uma composição de fator viii, e, método de liofilizar uma formulação farmacêutica aquosa |
| JP2002348300A (ja) * | 1999-04-12 | 2002-12-04 | Fujimori Kogyo Co Ltd | 血液凝固第ｖｉｉｉ因子および血液凝固第ｖｉｉｉ因子／フォン・ビルブラント因子複合体の精製方法 |
| AUPR638801A0 (en) * | 2001-07-13 | 2001-08-09 | Life Therapeutics Limited | Factor viii separation |
| PL1750733T3 (pl) | 2004-05-03 | 2014-05-30 | Univ Emory | Sposób podawania świńskiego czynnika krzepnięcia VIII pozbawionego domeny B |
| WO2006021584A2 (en) * | 2004-08-27 | 2006-03-02 | Novo Nordisk Health Care Ag | Purification of factor xiii polypeptides from biological materials |
| US20060226086A1 (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-12 | Robinson Thomas C | Centrifuge for blood processing systems |
| US20100168018A1 (en) * | 2008-11-07 | 2010-07-01 | Baxter International Inc. | Factor viii formulations |
| DK3133157T3 (da) * | 2010-03-30 | 2019-08-12 | Octapharma Ag | Fremgangsmåde til oprensning af vitamin k-afhængige proteiner |
| RU2445974C2 (ru) * | 2010-04-26 | 2012-03-27 | Учреждение Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр ГНЦ РАМН | Способ получения концентрата фактора viii из плазмы крови человека |
| EP2635297B1 (en) | 2010-11-05 | 2019-02-27 | Baxalta GmbH | A new variant of antihemophilic factor viii having increased specific activity |
| WO2012082933A1 (en) | 2010-12-15 | 2012-06-21 | Baxter International, Inc. | Eluate collection using conductivity gradient |
| CN103506080A (zh) * | 2012-06-19 | 2014-01-15 | 汪志友 | 一种用于分离纯化凝血因子viii的介质及其制备方法 |
| US11078518B2 (en) * | 2012-09-28 | 2021-08-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for evaluating blood coagulation reaction |
| US9663553B2 (en) * | 2014-01-29 | 2017-05-30 | Hemarus Therapeutics Limited | Integrated process for the production of therapeutics (human albumin, immunoglobulins, clotting factor VIII and clotting factor IX) from human plasma |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4495175A (en) * | 1982-08-05 | 1985-01-22 | University Of Rochester | Preparation of highly purified human antihemophilic factor |
| US4543210A (en) * | 1984-10-04 | 1985-09-24 | Miles Laboratories, Inc. | Process for producing a high purity antihemophilic factor concentrate |
| DK525384D0 (da) * | 1984-11-05 | 1984-11-05 | Nordisk Insulinlab | Praeparat paa basis af faktor viii til behandling af haemofili a inhibitorpatienter samt fremgangsmaade til fremstilling af et saadan praeparat |
| US4847362A (en) * | 1985-02-01 | 1989-07-11 | New York University | Method for purifying antihemophilic factor |
| US4675385A (en) * | 1985-03-27 | 1987-06-23 | Alpha Therapeutic Corporation | Isolation of human plasma procoagulant protein factor VIII from biological factors |
| US4758657A (en) * | 1985-07-11 | 1988-07-19 | Armour Pharmaceutical Company | Method of purifying Factor VIII:C |
| AT391808B (de) * | 1986-11-03 | 1990-12-10 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer faktor viii (ahf)-haeltigen fraktion |
| EP0321835B1 (en) * | 1987-12-21 | 1994-09-28 | Miles Inc. | Gel filteration of factor VIII |
| WO1989009784A1 (en) * | 1988-04-08 | 1989-10-19 | Commonwealth Serum Laboratories Commission | Production of heat-stable factor viii concentrate |
| EP0399321B1 (en) * | 1989-05-24 | 1993-06-23 | Miles Inc. | Gel filtration of heat treated factor viii |
-
1989
- 1989-11-09 DK DK562189A patent/DK162233C/da not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-10-26 ZA ZA908599A patent/ZA908599B/xx unknown
- 1990-11-01 SK SK5371-90A patent/SK537190A3/sk unknown
- 1990-11-01 CZ CS905371A patent/CZ537190A3/cs unknown
- 1990-11-05 WO PCT/DK1990/000279 patent/WO1991007438A1/en active IP Right Grant
- 1990-11-05 DE DE69017050T patent/DE69017050T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-05 EP EP90917201A patent/EP0524172B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 AU AU67470/90A patent/AU631471B2/en not_active Ceased
- 1990-11-05 RU SU905052211A patent/RU2055593C1/ru active
- 1990-11-05 JP JP3500067A patent/JP2509407B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 ES ES90917201T patent/ES2068404T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 UA UA94020494A patent/UA29421C2/uk unknown
- 1990-11-05 HU HU9201551A patent/HU214905B/hu unknown
- 1990-11-05 AT AT90917201T patent/ATE118508T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-05 CA CA002073012A patent/CA2073012C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-07 NZ NZ236004A patent/NZ236004A/xx unknown
- 1990-11-07 US US07/610,480 patent/US5245014A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-07 YU YU210590A patent/YU47524B/sh unknown
- 1990-11-08 IL IL9627790A patent/IL96277A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-11-08 IE IE402290A patent/IE66836B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-11-08 PT PT95830A patent/PT95830B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-11-09 PL PL90287703A patent/PL164894B1/pl unknown
- 1990-11-09 CN CN90109030A patent/CN1044121C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-08 NO NO921839A patent/NO180741C/no not_active IP Right Cessation
- 1992-05-08 FI FI922105A patent/FI103510B/fi active
- 1992-05-08 BG BG96316A patent/BG61231B1/bg unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2073012C (en) | Method for isolating factor viii | |
| RU2088590C1 (ru) | Способ получения стандартизированного концентрата человеческого фактора виллебранда и концентрат, полученный этим способом | |
| US4495175A (en) | Preparation of highly purified human antihemophilic factor | |
| US5869617A (en) | High and low molecular weight fractions of von Willebrand Factor and preparations of same | |
| AU737986B2 (en) | Purification of von willebrand factor by cation exchange chromatography | |
| US20110275570A1 (en) | Process for obtaining a concentrate of von willebrand factor of a complex of factor viii/von willebrand factor and use of the same | |
| EP0934748B1 (en) | Von Willenbrand factor (vWF)- containing preparation, process for preparing vWF-containing preparations, and use of such preparations | |
| US7888476B2 (en) | Process for the preparation of a von Willebrand (FvW) factor concentrate by chromatography and a FvW concentrate thus obtainable | |
| MXPA05000395A (es) | Proceso para la preparacion de fibrinogeno. | |
| JPS6160614A (ja) | 第８因子製剤およびその製造方法 | |
| CA2749902C (en) | New process for highly selective purification of two plasma proteins: von willebrand factor (vwf) and fibronectin (fn) | |
| CN116322920A (zh) | 使用氧化硅吸附从血浆中纯化fviii | |
| Branović et al. | Characterization of F VIII concentrates produced by two methods incorporating double virus inactivation | |
| Smith et al. | Advances in Plasma Fractionation and in the Production of Factor VIII Concentrates | |
| HRP930277A2 (en) | A method for isolating biologically active compounds |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |