JPH06138127A - 標識フィブリノーゲンおよびその用途 - Google Patents
標識フィブリノーゲンおよびその用途Info
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- JPH06138127A JPH06138127A JP28747792A JP28747792A JPH06138127A JP H06138127 A JPH06138127 A JP H06138127A JP 28747792 A JP28747792 A JP 28747792A JP 28747792 A JP28747792 A JP 28747792A JP H06138127 A JPH06138127 A JP H06138127A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 化学発光物質で標識されたフィブリノーゲ
ン、ならびに該フィブリノーゲンを主要成分とする血小
板ーフィブリノーゲン結合測定用試薬および該フィブリ
ノーゲンと血小板を反応させ、ついで生成した血小板ー
フィブリノーゲン結合体を化学発光法により測定するこ
とを特徴とする血小板ーフィブリノーゲン結合の測定方
法。 【効果】 従来の放射性ヨウ素原子 125Ｉ標識フィブリ
ノーゲンを用いる方法と同等の感度と選択性を有し、か
つ従来法のような煩雑かつ危険性のない優れた血小板−
フィブリノーゲン結合測定試薬であることから、血小板
凝集抑制作用を有する薬物のスクリーニングを容易かつ
安全に行うことができる。
ン、ならびに該フィブリノーゲンを主要成分とする血小
板ーフィブリノーゲン結合測定用試薬および該フィブリ
ノーゲンと血小板を反応させ、ついで生成した血小板ー
フィブリノーゲン結合体を化学発光法により測定するこ
とを特徴とする血小板ーフィブリノーゲン結合の測定方
法。 【効果】 従来の放射性ヨウ素原子 125Ｉ標識フィブリ
ノーゲンを用いる方法と同等の感度と選択性を有し、か
つ従来法のような煩雑かつ危険性のない優れた血小板−
フィブリノーゲン結合測定試薬であることから、血小板
凝集抑制作用を有する薬物のスクリーニングを容易かつ
安全に行うことができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、化学発光物質で標識さ
れたフィブリノーゲン、ならびに該フィブリノーゲンを
用いる血小板ーフィブリノーゲン結合の測定方法に関す
る。
れたフィブリノーゲン、ならびに該フィブリノーゲンを
用いる血小板ーフィブリノーゲン結合の測定方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】血小板は血管壁に接近して流れており、
血管が損傷され血管内皮が剥離して、内皮下組織の膠原
繊維が露出すると、そこに血小板が粘着・凝集する。こ
の粘着した血小板は、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を
放出し、さらに損傷組織や赤血球より由来するＡＤＰと
共に、血流中の血小板が、粘着した血小板を中心として
互いに凝集し、いわゆる血小板血栓を形成する。このと
き、血漿中のフィブリノーゲンは、正常状態の血小板に
は接合しないが、ＡＤＰなどで血小板が活性化され、該
血小板にフィブリノーゲンに対する受容体（ＧＰIIb ／
IIIa ）が発現し、フィブリノーゲンはその受容体と直
ちに結合する。この結合したフィブリノーゲンは血小板
相互間に架橋して凝集を形成するので、血小板受容体
（ＧＰIIb ／IIIa ）とフィブリノーゲンの結合は、血
小板凝集における一連の反応の中でも最も重要な反応で
ある。
血管が損傷され血管内皮が剥離して、内皮下組織の膠原
繊維が露出すると、そこに血小板が粘着・凝集する。こ
の粘着した血小板は、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を
放出し、さらに損傷組織や赤血球より由来するＡＤＰと
共に、血流中の血小板が、粘着した血小板を中心として
互いに凝集し、いわゆる血小板血栓を形成する。このと
き、血漿中のフィブリノーゲンは、正常状態の血小板に
は接合しないが、ＡＤＰなどで血小板が活性化され、該
血小板にフィブリノーゲンに対する受容体（ＧＰIIb ／
IIIa ）が発現し、フィブリノーゲンはその受容体と直
ちに結合する。この結合したフィブリノーゲンは血小板
相互間に架橋して凝集を形成するので、血小板受容体
（ＧＰIIb ／IIIa ）とフィブリノーゲンの結合は、血
小板凝集における一連の反応の中でも最も重要な反応で
ある。
【０００３】そのため、血小板凝集抑制作用を有する薬
物のスクリーニングにおいては、血小板とフィブリノー
ゲンの結合を測定することが非常に重要な意義を有する
ことになりこの血小板受容体（ＧＰIIb ／ IIIa ）の結
合実験には、これまで放射性ヨウ素原子 125Ｉとフィブ
リノーゲンの結合体である 125Ｉ−フィブリノーゲンを
使用するラジオアイソトープレセプターバインディング
アッセイ〔ザ ジャーナル オブ ビオロジカル ケミ
ストリー、第２５４巻、５３５７〜５３６３頁（１９７
９年）〕が一般的に使用されてきた。
物のスクリーニングにおいては、血小板とフィブリノー
ゲンの結合を測定することが非常に重要な意義を有する
ことになりこの血小板受容体（ＧＰIIb ／ IIIa ）の結
合実験には、これまで放射性ヨウ素原子 125Ｉとフィブ
リノーゲンの結合体である 125Ｉ−フィブリノーゲンを
使用するラジオアイソトープレセプターバインディング
アッセイ〔ザ ジャーナル オブ ビオロジカル ケミ
ストリー、第２５４巻、５３５７〜５３６３頁（１９７
９年）〕が一般的に使用されてきた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、 125Ｉ
−フィブリノーゲンを用いる方法は、 （１）放射性ヨウ素原子 125Ｉの半減期が短い。 （２）放射崩壊により標識する蛋白質（フィブリノーゲ
ン）が損傷を受け、感度が低下する。 （３）放射性物質であるため、取扱について特別な施設
を必要とする上、使用後の廃棄についても特別な取扱が
必要となる。 （４）また 125Ｉ−フィブリノーゲンを合成する際に
は、放射能レベルの高いヨウ素を使用する必要があるた
め放射線被爆の危険がある。 （５） 125Ｉは揮発性であるため、空気中に揮散するな
ど、環境汚染の原因となるなど、種々の問題があった。
−フィブリノーゲンを用いる方法は、 （１）放射性ヨウ素原子 125Ｉの半減期が短い。 （２）放射崩壊により標識する蛋白質（フィブリノーゲ
ン）が損傷を受け、感度が低下する。 （３）放射性物質であるため、取扱について特別な施設
を必要とする上、使用後の廃棄についても特別な取扱が
必要となる。 （４）また 125Ｉ−フィブリノーゲンを合成する際に
は、放射能レベルの高いヨウ素を使用する必要があるた
め放射線被爆の危険がある。 （５） 125Ｉは揮発性であるため、空気中に揮散するな
ど、環境汚染の原因となるなど、種々の問題があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究を
重ねた結果、放射性ヨウ素原子 125Ｉに代えて、化学発
光物質をフィブリノーゲンと結合させた標識フィブリノ
ーゲンは、放射性ヨウ素原子 125Ｉ−フィブリノーゲン
結合体と同様、活性化された血小板のＧＰIIb／ IIIa
受容体に高感度、高選択的に結合して、測定実験系とし
て必要な特異性、可逆性および飽和性の要件（薬物受容
体、高柳一成編、南山堂、１９９０年第２版発行）を満
足し、血小板ーフィブリノーゲン結合測定用試薬として
優れたものであることを見出し、本発明を完成するにい
たった。
重ねた結果、放射性ヨウ素原子 125Ｉに代えて、化学発
光物質をフィブリノーゲンと結合させた標識フィブリノ
ーゲンは、放射性ヨウ素原子 125Ｉ−フィブリノーゲン
結合体と同様、活性化された血小板のＧＰIIb／ IIIa
受容体に高感度、高選択的に結合して、測定実験系とし
て必要な特異性、可逆性および飽和性の要件（薬物受容
体、高柳一成編、南山堂、１９９０年第２版発行）を満
足し、血小板ーフィブリノーゲン結合測定用試薬として
優れたものであることを見出し、本発明を完成するにい
たった。
【０００６】すなわち、本発明は、化学発光物質で標識
されたフィブリノーゲン、ならびに該フィブリノーゲン
を主要成分とする血小板ーフィブリノーゲン結合測定用
試薬および該フィブリノーゲンと血小板を反応させ、つ
いで生成した血小板ーフィブリノーゲン結合体を化学発
光法により測定することを特徴とする血小板ーフィブリ
ノーゲン結合の測定方法である。
されたフィブリノーゲン、ならびに該フィブリノーゲン
を主要成分とする血小板ーフィブリノーゲン結合測定用
試薬および該フィブリノーゲンと血小板を反応させ、つ
いで生成した血小板ーフィブリノーゲン結合体を化学発
光法により測定することを特徴とする血小板ーフィブリ
ノーゲン結合の測定方法である。
【０００７】本発明の化学発光物質で標識されたフィブ
リノーゲン（以下、発光標識フィブリノーゲンという）
は、化学発光物質で標識されている以外は、通常のフィ
ブリノーゲンとほぼ同様の物理化学的性状を有してお
り、例えば、化学発光物質として４−（２−スクシンイ
ミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチ
ルアクリジニウム−９−カルボキシレート フルオロス
ルホネートで標識されたフィブリノーゲンを例として説
明すれば、両成分を１：１のモル比で反応させた場合、
比活性が約１５００〜２５００ｍｖｓ／ｐｍｏｌである
発光標識フィブリノーゲンが得られる。このとき上記化
学発光物質はフィブリノーゲンのＢβ鎖およびγ鎖に結
合しており、分子量は、Ａαが約６６０００、Ｂβ鎖が
約５２０００、γ鎖が約４６０００であった。更に、発
光標識フィブリノーゲンの凝固能は、用いたフィブリノ
ーゲンの凝固能とほぼ等しく、約９０％の凝固能を有し
ていた。本発明の発光標識フィブリノーゲンは、化学発
光物質とフィブリノーゲンを常法により反応させること
により容易に実施することが出来る。化学発光物質とし
ては、蛋白官能基と結合可能であり、かつ励起状態で発
光するものであれば特に限定されずどのようなものでも
使用することが出来る。かかる化学発光物質としては、
例えば４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエ
チル）フェニル−１０−メチルアクリジニウム−９−カ
ルボキシレート フルオロスルホネート、ＡＢＥＩ（化
学名：Ｎ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノール、
米国、シグマ社製）などがあげられ、とりわけ調製の容
易さ、或いは入手の容易さ等から、４−（２−スクシン
イミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メ
チルアクリジニウム−９−カルボキシレート フルオロ
スルホネートが好ましい。
リノーゲン（以下、発光標識フィブリノーゲンという）
は、化学発光物質で標識されている以外は、通常のフィ
ブリノーゲンとほぼ同様の物理化学的性状を有してお
り、例えば、化学発光物質として４−（２−スクシンイ
ミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチ
ルアクリジニウム−９−カルボキシレート フルオロス
ルホネートで標識されたフィブリノーゲンを例として説
明すれば、両成分を１：１のモル比で反応させた場合、
比活性が約１５００〜２５００ｍｖｓ／ｐｍｏｌである
発光標識フィブリノーゲンが得られる。このとき上記化
学発光物質はフィブリノーゲンのＢβ鎖およびγ鎖に結
合しており、分子量は、Ａαが約６６０００、Ｂβ鎖が
約５２０００、γ鎖が約４６０００であった。更に、発
光標識フィブリノーゲンの凝固能は、用いたフィブリノ
ーゲンの凝固能とほぼ等しく、約９０％の凝固能を有し
ていた。本発明の発光標識フィブリノーゲンは、化学発
光物質とフィブリノーゲンを常法により反応させること
により容易に実施することが出来る。化学発光物質とし
ては、蛋白官能基と結合可能であり、かつ励起状態で発
光するものであれば特に限定されずどのようなものでも
使用することが出来る。かかる化学発光物質としては、
例えば４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエ
チル）フェニル−１０−メチルアクリジニウム−９−カ
ルボキシレート フルオロスルホネート、ＡＢＥＩ（化
学名：Ｎ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノール、
米国、シグマ社製）などがあげられ、とりわけ調製の容
易さ、或いは入手の容易さ等から、４−（２−スクシン
イミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メ
チルアクリジニウム−９−カルボキシレート フルオロ
スルホネートが好ましい。
【０００８】また、フィブリノーゲンは、通常この技術
分野で使用される程度の純度のものであればよく、例え
ばヒトから採取した血液から血漿を分取し、これから、
低温下でエタノール分画を繰り返すなど、既知方法によ
り得られるものでもよいが、出来るだけ高純度のものが
好ましい。また試薬として市販されているものも好適に
使用することができ、かかる試薬の１例としては、例え
ば、フィブリノーゲン（フラクションＩ、米国、シグマ
社製）、フィブリノーゲン（タイプＩ、米国、シグマ社
製）などがあげられる。
分野で使用される程度の純度のものであればよく、例え
ばヒトから採取した血液から血漿を分取し、これから、
低温下でエタノール分画を繰り返すなど、既知方法によ
り得られるものでもよいが、出来るだけ高純度のものが
好ましい。また試薬として市販されているものも好適に
使用することができ、かかる試薬の１例としては、例え
ば、フィブリノーゲン（フラクションＩ、米国、シグマ
社製）、フィブリノーゲン（タイプＩ、米国、シグマ社
製）などがあげられる。
【０００９】化学発光物質として４−（２−スクシンイ
ミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチ
ルアクリジニウム−９−カルボキシレート フルオロス
ルホネートを使用する場合を例として発光標識フィブリ
ノーゲンの調製方法を説明すれば、該化合物０．５〜２
モルとフィブリノーゲン１モルを、水または緩衝液（ｐ
Ｈ６〜９）中、室温ないし冷却下で、約１０分〜１時間
程度攪拌することにより実施することが出来、生成する
発光標識フィブリノーゲンは、反応液をセファデックス
カラムに通導し、生理食塩水で溶出する等、既知方法に
より容易に精製することが出来る。
ミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチ
ルアクリジニウム−９−カルボキシレート フルオロス
ルホネートを使用する場合を例として発光標識フィブリ
ノーゲンの調製方法を説明すれば、該化合物０．５〜２
モルとフィブリノーゲン１モルを、水または緩衝液（ｐ
Ｈ６〜９）中、室温ないし冷却下で、約１０分〜１時間
程度攪拌することにより実施することが出来、生成する
発光標識フィブリノーゲンは、反応液をセファデックス
カラムに通導し、生理食塩水で溶出する等、既知方法に
より容易に精製することが出来る。
【００１０】また、本発明のもう一つの態様である血小
板とフィブリノーゲンの結合の測定は、 125Ｉ−フィブ
リノーゲンの代わりに発光標識フィブリノーゲンを用
い、結合体を化学発光法で測定する以外は、 125Ｉ−フ
ィブリノーゲンを用いる従来法と同様にして行うことが
出来る。例えば、血小板数を調整した検体に、上記発光
標識フィブリノーゲンを加え、室温で約５〜３０分間反
応させた後、未反応の発光標識フィブリノーゲンを除去
し、次いで結合体の化学発光を測定して、結合量を算出
することが出来、これに基づいて血小板凝集の度合いを
検定することが出来る。以下に本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。な
お、実施例中の比活性は、フィブリノーゲン１ｐｍｏｌ
に対する化学発光量で表し、各フラクションのフィブリ
ノーゲン量はＢＣＡ蛋白定量キット（商品名：ＢＣＡ蛋
白定量試薬、米国、ピアス社製）を用いて蛋白量として
求めた。
板とフィブリノーゲンの結合の測定は、 125Ｉ−フィブ
リノーゲンの代わりに発光標識フィブリノーゲンを用
い、結合体を化学発光法で測定する以外は、 125Ｉ−フ
ィブリノーゲンを用いる従来法と同様にして行うことが
出来る。例えば、血小板数を調整した検体に、上記発光
標識フィブリノーゲンを加え、室温で約５〜３０分間反
応させた後、未反応の発光標識フィブリノーゲンを除去
し、次いで結合体の化学発光を測定して、結合量を算出
することが出来、これに基づいて血小板凝集の度合いを
検定することが出来る。以下に本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。な
お、実施例中の比活性は、フィブリノーゲン１ｐｍｏｌ
に対する化学発光量で表し、各フラクションのフィブリ
ノーゲン量はＢＣＡ蛋白定量キット（商品名：ＢＣＡ蛋
白定量試薬、米国、ピアス社製）を用いて蛋白量として
求めた。
【００１１】また、化学発光量は０．１Ｎ ＮａＯＨ−
０．０６％Ｈ2 Ｏ2 水溶液約３００μｌを添加したとき
の発光を化学発光測定装置（１２５１ルミノメータ：Ｌ
ＫＢ−Ｗａｌｌａｃ）を用いて測定して求めた。
０．０６％Ｈ2 Ｏ2 水溶液約３００μｌを添加したとき
の発光を化学発光測定装置（１２５１ルミノメータ：Ｌ
ＫＢ−Ｗａｌｌａｃ）を用いて測定して求めた。
【００１２】
実施例１ フィブリノーゲン約１００ｎｍｏｌを生理食塩水１０ｍ
ｌに溶解し、０°Ｃで、４−（２−スクシンイミジルオ
キシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリ
ジニウム−９−カルボキシレート フルオロスルホネー
ト約１００ｎｍｏｌを、攪拌下フィブリノーゲン溶液の
中に、５回に分けて添加し、３０分間反応させた。反応
液はセファデックス−Ｇ５０のカラム（直径２．５ｃ
ｍ）に通導し、生理食塩水で溶出して、標識フィブリノ
ーゲン画分を捕集することにより、比活性が約２０００
ｍｖｓ／ｐｍｏｌである発光標識フィブリノーゲンを得
た。
ｌに溶解し、０°Ｃで、４−（２−スクシンイミジルオ
キシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリ
ジニウム−９−カルボキシレート フルオロスルホネー
ト約１００ｎｍｏｌを、攪拌下フィブリノーゲン溶液の
中に、５回に分けて添加し、３０分間反応させた。反応
液はセファデックス−Ｇ５０のカラム（直径２．５ｃ
ｍ）に通導し、生理食塩水で溶出して、標識フィブリノ
ーゲン画分を捕集することにより、比活性が約２０００
ｍｖｓ／ｐｍｏｌである発光標識フィブリノーゲンを得
た。
【００１３】実施例２ （１）ヒト血小板と標識フィブリノーゲンの特異的結合 健常ヒトの前腕正中皮静脈より採血した血液９容に対し
て１容の比率で、３．８％クエン酸三ナトリウムと混和
後、遠心分離（１５０ｇ×１０分間）し、血小板豊富血
漿（ＰＲＰ）である上層を分取した。セファロース２Ｂ
カラム（直径２ｃｍ×１８ｃｍ）にＰＲＰを移し、ヘペ
ス−タイロード（Ｈｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ）緩衝
液で溶出させ、ゲルろ過血小板を得た。このゲルろ過血
小板に、１ｍＭＣａ++、１０μＭ ＡＤＰおよび実施例
１で得た発光標識フィブリノーゲンを添加し、室温で１
０分間インキュベートした後、血小板ー発光標識フィブ
リノーゲン結合体と遊離の発光標識フィブリノーゲンと
を分離するため２０％シュクロースに重層させて遠心分
離（１２，０００ｇ×３分間）を行った。ついで、ペレ
ット部分を切り取り、ペレットの血小板に生理食塩水１
００μｌを加えて懸濁させて、これに０．１ＮａＯＨ−
０．０６％Ｈ2 Ｏ2 水溶液約３００μｌを添加して化学
発光を測定した。この測定結果をもとに、血小板に結合
したフィブリノーゲン量を比活性から算出して、血小板
と標識フィブリノーゲンの全結合量を求めた。
て１容の比率で、３．８％クエン酸三ナトリウムと混和
後、遠心分離（１５０ｇ×１０分間）し、血小板豊富血
漿（ＰＲＰ）である上層を分取した。セファロース２Ｂ
カラム（直径２ｃｍ×１８ｃｍ）にＰＲＰを移し、ヘペ
ス−タイロード（Ｈｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ）緩衝
液で溶出させ、ゲルろ過血小板を得た。このゲルろ過血
小板に、１ｍＭＣａ++、１０μＭ ＡＤＰおよび実施例
１で得た発光標識フィブリノーゲンを添加し、室温で１
０分間インキュベートした後、血小板ー発光標識フィブ
リノーゲン結合体と遊離の発光標識フィブリノーゲンと
を分離するため２０％シュクロースに重層させて遠心分
離（１２，０００ｇ×３分間）を行った。ついで、ペレ
ット部分を切り取り、ペレットの血小板に生理食塩水１
００μｌを加えて懸濁させて、これに０．１ＮａＯＨ−
０．０６％Ｈ2 Ｏ2 水溶液約３００μｌを添加して化学
発光を測定した。この測定結果をもとに、血小板に結合
したフィブリノーゲン量を比活性から算出して、血小板
と標識フィブリノーゲンの全結合量を求めた。
【００１４】（２）ヒト血小板と標識フィブリノーゲン
の非特異的結合 上記（１）において、Ｃａ++に代えて１０ｍＭＥＤＴＡ
を添加する他は、上記（１）と同様に処理して、血小板
と標識フィブリノーゲンの非特異結合量を求めた。
の非特異的結合 上記（１）において、Ｃａ++に代えて１０ｍＭＥＤＴＡ
を添加する他は、上記（１）と同様に処理して、血小板
と標識フィブリノーゲンの非特異結合量を求めた。
【００１５】（３）結果および考察 結果は、図１〜３に示す通りであり、図１は血小板ＧＰ
IIb ／ IIIa 受容体に対する発光標識フィブリノーゲン
の結合を示したものである。同図において、特異的結合
は全結合から非特異的結合を除いたものとして示されて
いるが、この特異的結合の濃度−結合曲線は一定の受容
体数に対して、発光標識フィブリノーゲンの濃度を高く
していくと、該フィブリノーゲンが受容体を占有して飽
和されることを示しており、このことから本発明の発光
標識フィブリノーゲンと血小板ＧＰIIb ／ IIIa 受容体
の結合が特異的であることがわかる。図２は、血小板と
発光標識フィブリノーゲンの親和性を示したもの（Ｓca
tchard Ｐlot ）であるが、結合数と結合／遊離フィブ
リノーゲン比のなす傾きが直線であることから、発光標
識フィブリノーゲンと血小板ＧＰIIb ／ IIIa 受容体の
結合が１：１の割合で質量作用の法則に従って結合して
いることを示している。また、同図において直線の傾き
は親和性を、横軸切片が最大結合量を示している。図３
は受容体の結合部位の数（種類）を示すものであり、傾
きが１に極めて近似していることから血小板におけるフ
ィブリノーゲンの受容体（ＧＰIIb ／ IIIa ）数が１で
あることが証明されている。以上のことから、発光標識
フィブリノーゲンは、血小板の受容体に対し、親和性お
よび飽和性を有していることがわかる。
IIb ／ IIIa 受容体に対する発光標識フィブリノーゲン
の結合を示したものである。同図において、特異的結合
は全結合から非特異的結合を除いたものとして示されて
いるが、この特異的結合の濃度−結合曲線は一定の受容
体数に対して、発光標識フィブリノーゲンの濃度を高く
していくと、該フィブリノーゲンが受容体を占有して飽
和されることを示しており、このことから本発明の発光
標識フィブリノーゲンと血小板ＧＰIIb ／ IIIa 受容体
の結合が特異的であることがわかる。図２は、血小板と
発光標識フィブリノーゲンの親和性を示したもの（Ｓca
tchard Ｐlot ）であるが、結合数と結合／遊離フィブ
リノーゲン比のなす傾きが直線であることから、発光標
識フィブリノーゲンと血小板ＧＰIIb ／ IIIa 受容体の
結合が１：１の割合で質量作用の法則に従って結合して
いることを示している。また、同図において直線の傾き
は親和性を、横軸切片が最大結合量を示している。図３
は受容体の結合部位の数（種類）を示すものであり、傾
きが１に極めて近似していることから血小板におけるフ
ィブリノーゲンの受容体（ＧＰIIb ／ IIIa ）数が１で
あることが証明されている。以上のことから、発光標識
フィブリノーゲンは、血小板の受容体に対し、親和性お
よび飽和性を有していることがわかる。
【００１６】実施例３ アルギニルーグルタミルーアスパラギル−セリンによる
結合阻害 上記実施例２（１）において、Ｃａ++に代えて、添加量
を種々変化させたアルギニルーグルタミルーアスパラギ
ル−セリン（以下、ＲＧＤＳと称する）を加え、以下上
記実施例２（１）と同様に処理して、血小板受容体に対
し、発光標識フィブリノーゲンと拮抗して結合するＲＧ
ＤＳの結合を求めた。結果は、図４に示す通りであり、
血小板の受容体に結合した発光標識フィブリノーゲン
が、ＲＧＤＳにより置換されたことを示している。この
ことからＲＧＤＳが血小板凝集抑制作用を持つこと、血
小板と発光標識フィブリノーゲンの結合は可逆的である
ことがわかる。
結合阻害 上記実施例２（１）において、Ｃａ++に代えて、添加量
を種々変化させたアルギニルーグルタミルーアスパラギ
ル−セリン（以下、ＲＧＤＳと称する）を加え、以下上
記実施例２（１）と同様に処理して、血小板受容体に対
し、発光標識フィブリノーゲンと拮抗して結合するＲＧ
ＤＳの結合を求めた。結果は、図４に示す通りであり、
血小板の受容体に結合した発光標識フィブリノーゲン
が、ＲＧＤＳにより置換されたことを示している。この
ことからＲＧＤＳが血小板凝集抑制作用を持つこと、血
小板と発光標識フィブリノーゲンの結合は可逆的である
ことがわかる。
【００１７】
【発明の効果】本発明の発光標識フィブリノーゲンは、
従来の放射性ヨウ素原子 125Ｉ標識フィブリノーゲンと
同等の感度と選択性を有するものでありながら、 125Ｉ
標識フィブリノーゲンのような煩雑かつ危険性のない優
れた血小板−フィブリノーゲン結合を測定し得る試薬と
なり得るものであり、これを使用することによって血小
板凝集抑制作用を有する薬物のスクリーニングを容易か
つ安全に行うことができる。
従来の放射性ヨウ素原子 125Ｉ標識フィブリノーゲンと
同等の感度と選択性を有するものでありながら、 125Ｉ
標識フィブリノーゲンのような煩雑かつ危険性のない優
れた血小板−フィブリノーゲン結合を測定し得る試薬と
なり得るものであり、これを使用することによって血小
板凝集抑制作用を有する薬物のスクリーニングを容易か
つ安全に行うことができる。
【図１】 実施例２における血小板と発光標識フィブリ
ノーゲンの結合を、特異結合および非特異結合の両面か
ら示す。
ノーゲンの結合を、特異結合および非特異結合の両面か
ら示す。
【図２】 実施例２における血小板と発光標識フィブリ
ノーゲンの親和性、並びに飽和度を示す。
ノーゲンの親和性、並びに飽和度を示す。
【図３】 実施例２における血小板の受容体数を示す。
【図４】 実施例３における血小板と発光標識フィブリ
ノーゲンの結合が、可逆的なものであることを示す。
ノーゲンの結合が、可逆的なものであることを示す。
Claims (4)
- 【請求項１】 化学発光物質で標識されたフィブリノー
ゲン。 - 【請求項２】 化学発光物質が４−（２−スクシンイミ
ジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチル
アクリジニウム−９−カルボキシレート フルオロスル
ホネートである請求項１記載の標識されたフィブリノー
ゲン。 - 【請求項３】 化学発光物質で標識されたフィブリノー
ゲンを主要成分とする血小板ーフィブリノーゲン結合測
定試薬。 - 【請求項４】 化学発光物質で標識されたフィブリノー
ゲンと血小板を反応させ、ついで生成した血小板ーフィ
ブリノーゲン結合体を化学発光法により測定することを
特徴とする血小板ーフィブリノーゲン結合の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28747792A JPH06138127A (ja) | 1992-10-26 | 1992-10-26 | 標識フィブリノーゲンおよびその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28747792A JPH06138127A (ja) | 1992-10-26 | 1992-10-26 | 標識フィブリノーゲンおよびその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06138127A true JPH06138127A (ja) | 1994-05-20 |
Family
ID=17717851
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28747792A Pending JPH06138127A (ja) | 1992-10-26 | 1992-10-26 | 標識フィブリノーゲンおよびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06138127A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7816495B2 (en) | 2002-07-10 | 2010-10-19 | Nhs Blood And Transplant | Processes for the preparation of fibrinogen |
-
1992
- 1992-10-26 JP JP28747792A patent/JPH06138127A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.BIOL.CHEM=1979 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7816495B2 (en) | 2002-07-10 | 2010-10-19 | Nhs Blood And Transplant | Processes for the preparation of fibrinogen |
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