MX2014008961A - Composiciones y metodos para utilizar inhibidores de csf1r. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona inhibidores de la trayectoria de CSF1-R, incluyendo anticuerpos anti-IL-34, anticuerpos biespecíficos anti-IL-34/CSF-1 y anticuerpos anti-CSF-1R y métodos para utilizar los mismos para tratar enfermedades inmunológicas patogénicas mieloides.

Description

- - COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA UTILIZAR INHIBIDORES DE CSF1R CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y métodos para utilizar inhibidores de la trayectoria de CSF1-R, (Receptor del Factor Estimulante de Colonias 1) incluyendo anticuerpos anti-IL-34, anticuerpos IL-34/CSF1 biespecíficos y anticuerpos CSF1R.

ANTECEDENTES La Interleucina-3 , también conocida como C16orf77 o UNQ20374 (Clark et al., Genome Res 13: 2265-2270 (2003)), se identificó recientemente como un segundo ligando y de alta afinidad para CSF-1R en una exámen de proliferación de monocito humano (Lin et al., Science 320: 807-811 (2008)). Este descubrimiento se ha previsto por mucho tiempo por el fenotipo más severo en ratones nulos de CSF-1R, que en ratones CSF-lop/CSF-lop deficientes en CSF-1 (Dai et al., Blood 99: 111-120 (2002)). Como CSF-1 (también conocido como M-CSF) , el ligando mejor caracterizado para CSF-1R, IL-34 estimula la fosforilación de ERK1/2 en monocitos humanos y promueve la formación del progenitor de granulocito-macrófago (CFU-GM) y el progenitor de megacariocito (CFU-M) en cultivos de médula ósea de humano (Lin et al., Science 320: 807-811 (2008)). Mediada por el receptor común CSF-1R, la transcripción del proto-oncogén c-fms, IL-34 y CSF-1 sirven como los reguladores clave de la diferenciación, proliferación, y supervivencia de la célula de estirpe de fagocito mononuclear tales como monocitos, macrófagos y osteoclastos (Droin et al., Journal of leukocyte biology 87: 745-747 (2010) ) .

La función de IL-34 tiene fuerte similitud con la de CSF-1, pero con varias diferencias notables. Ambas citocinas soportan crecimiento celular y la supervivencia en los estudios de cultivos celulares de manera equivalente (Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010); Wei et al., Journal of leukocyte biology 88: 495-505 (2010)) . El gen IL-34, cuando se expresa bajo el control del promotor de CSF-1, podría rescatar el fenotipo de ratones CSF-lop/CSF-lop nullizygous CSF-1 (que llevan dos alelos mutantes nulos) (Wei et al., Journal of leukocyte biology 88: 495-505 (2010)). IL-34 también puede sustituirse por CSF-1 para soportar osteoclastogénesis inducida por RA KL (Baud'huin et al., The Journal of pathology 221: 77-86 (2010) ) . Sin embargo, los dos factores aparecen diferentes en su habilidad para inducir la producción de quimiocinas tales como CP-1 y eotaxin-2 en macrófagos primaros, el cambio morfológico en células TF-l-fms y la migración de células J774A.1 (Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010)). IL-34 ha mostrado inducir una fosforilación de tirosina más fuerte, pero transitoria de - - CSF-IR y efectores corriente abajo, y rápidamente subregula la expresión de CSF-IR (Chinara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010)). Además, IL-34 y CSF-1 exhiben patrones de expresión espaciotemporales diferenciales tanto en tejidos embriónicos como de adulto, que conduce a la activación complementaria del CSF-IR ( ei et al., Journal of leukocyte biology 88: 495-505 (2010)). Más impresionantemente, IL-34 pero no ARN mensajero de CSF-1 se detecta junto con CSF-IR en cerebro embriónico que explicaría por qué la microglía se desarrolla en ratones deficientes en CSF-1 pero no deficientes en CSF-IR (Ginhoux et al., Science 330: 841-845 (2010); Mizuno et al., The American journal of pathology 179: 2016-2027 (2011)). De esta manera, mientras IL-34 y CSF-1 se parecen entre sí, no son necesariamente idénticos en sus papeles de desarrollo, actividad biológica, y resistencia o cinéticas de activación de señal.

A pesar de una falta de similitud de secuencia apreciable con otras proteínas, IL-34 se propuso por métodos de reconocimiento de doblez para ser citocina helicoidal de cadena corta que pertenece a la misma familia que CSF-1, SCF, y Flt3L (Garceau et al., Journal of leukocyte biology 87: 753-764 (2010)). Estas tres últimas citocinas hematopoyéticas diméricas son únicas entre citocinas helicoidales en que tienen formas unidas a membrana (Bazan, Cell 65: 9-10 (1991a); Hannum et al., Nature 368: 643-648 (1994)); IL-34 difiere de manera importante en que carece de un segmento de transmembrana hidrofóbica. Además, los dímeros de citocina CSF-1, SCF y Flt3L se unen a la subfamilia PDGFR (tipo III/V) de la familia de receptor de tirosina quinasa (RTK) (Rosnet et al . , Critical reviews in oncogenesis 4: 595-613 (1993)) en lugar de receptores de citocina hematopoyética (Bazan, Immunology today 11: 350-354 (1990)). Los dímeros de citocina CSF-1, SCF y Flt3L imitan funcionalmente los dímeros del factor de crecimiento de nudo de cistina PDGF y VEGF que son los ligandos de activación de la familia RTK (Sawides et al., Nature structural biology 7: 486-491 (2000); Wiesmann et al., Nature structural biology 7: 440-442 (2000)). Todos los miembros de esta familia RTK comparten una arquitectura general similar comprendida de múltiples dominios similares a Ig en sus regiones extracelulares, un segmento de transmembrana única, y un dominio de tirosina cinasa citoplásmico con una gran inserción. En la estimulación, CSF-1R dimeriza y autofosforila ciertos residuos de tirosina en su dominio intracelular, que sirven como sitios de acoplamiento para proteínas efectoras que contienen SH2, que contribuyen a diferenciación de macrófago (Pixley et al., Trends in cell biology 14: 628-638 (2004)).

La estructura de CSF-1 dimérico en compuesto con CSF-1R revela un compuesto 2:1 no simétrico, en el cual un protómetro de CSF-1 acerca su receptor en la hendidura entre D2 y D3 , mientras el segundo promotor de CSF-1 permanece sin ocupar (Chen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 18267-18272 (2008) ) . Aún, la base molecular mediante la cual CSF-1R también es capaz de reconocer IL-34, un ligando distantemente relacionado con escasa identidad de secuencia, ha permanecido impreciso hasta que se describió en la presente. IL-34 puede funcionar independientemente, pero no incrementa su actividad con CSF-1 (Lin et al., Science 320: 807-811 (2008)). De hecho, CSF-1 compite con IL-34 para unirse a CSF-1R (Wei et al., Journal of leukocyte biology 88: 495-505 (2010)), sugiriendo un sitio de unión a ligando común en CSF-1R. En contraste, sin embargo, un estudio reciente comparativo de secuencia entre CSF-1R y sus dos ligandos sugirió que el ciclo CD de IL-34, y la unión entre D3 y D4 de CSF-1R comparten fuertes coeficientes de correlación de conservación de secuencia durante la evolución, y por lo tanto pueden representar un modo de unión único que es distinto del modo de unión empleado por el compuesto CSF-1/CSF-1R (Garceau et al., Journal of leukocyte biology 87: 753-764 (2010)). De manera interesante, se reporta un anticuerpo anti-CSF-lR MAb 12-2D6 para bloquear la unión de tanto IL-34 como CSF-1 a CSF-1R, aún otro anticuerpo MAb 2-4A5 bloqueó solamente la unión de CSF-1/CSF-1R (Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010)). Estos resultados sugieren fuertemente que IL-34 y CSF-1 tienen sitios de unión sobrepuestos, pero no idénticos en la superficie de CSF-IR.

Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo solicitudes de patente y publicaciones, se incorporan por la presente para referencia en su totalidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona anticuerpos anti-lL-34, anticuerpos biespecíficos que se unen a IL-34 y CSF-1, y anticuerpos anti-CSF-lR, y métodos para utilizar los mismos. En una modalidad, los anticuerpos de esta invención tienen citotoxicidad mediada por célula dependiente del anticuerpo (ADCC) reducida y/o actividad de citotoxicidad dependiente complementaria (CDC) . En una modalidad específica, los anticuerpos de esta invención tienen actividad ADCC reducida al comprender al menos una sustitución de región Fe en uno o más de los siguientes residuos 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (numeración EU) . En una modalidad específica, la sustitución de región Fe para reducir la actividad ADCC está en el residuo 297. En otra modalidad, la sustitución de región Fe para reducir la actividad ADCC es N297G o N297A. En otra modalidad, la sustitución Fe para reducir ADCC es D265A. En todavía otra modalidad, las sustituciones Fe para reducir la actividad ADCC son la sustitución de residuos 265 y 297 a alanina. En una modalidad, el anticuerpo biespecífico anti-IL-34/anti-CSF-l es un anticuerpo biespecífico nudo en agujero.

Se proporcionan en la presente anticuerpos aislados que se unen a IL-34 humana, la cual se une a un ep tope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido Glul03, Leul09, Glnl06, Asnl50, Leul27, Asnl28, Serl84, Leul86, Asnl87, Lys44, Glul21, Aspl07, Glulll, Serl04, Glnl20, Trpll6, y Asn61 de una IL-34 humana, donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1, y que inhiben la unión entre IL-34 humana y CSF-1R humano .

Se proporcionan en la presente anticuerpos aislados que se unen a una IL-34 humana, la cual se une a un epitope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido desde Glul03 hasta Asnl50 de una IL-34 humana, donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la SEC ID NO: 1, y que inhiben la unión entre IL-34 humana y CSF-1R humano .

En algunas modalidades, el anticuerpo se une a un epitope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido Glul03, Leul09, Glnl06, y Asnl50 de la IL-34 humana, donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1. En algunas modalidades, el epitope comprende además al menos uno de los residuos de aminoácido SerlOO, Glul23, Trpll6, Thrl24, Leul27, Asnl28, Glnl31, y Thrl34 de la IL-34 humana, donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a aminoácidos dentro de las posiciones 100-108, 116-134, 109 y 150 de la IL-34 humana, donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el anticuerpo se une a un epítope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido Asnl28, Serl84, Leul86, Asnl87, Lys44, y Glul21 de la IL-34 humana, donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1. En algunas modalidades, el epítope comprende además al menos uno de los residuos de aminoácido Phe40, Asp43, Leul25, Glnl89, Thr36, y Vall85 de la IL-34 humana, donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a aminoácidos dentro de las posiciones 36-44, 121-128, y 184-187 de la IL-34 humana, donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el anticuerpo se une a un epítope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido de Glul03 -Leul27 de la IL-34 humana, donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a un epítope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido Aspl07, Glulll, Serl04, Glnl20, Glul03, Leul09, Trpll6, y Asn61 de la IL-34 humana, donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1. En algunas modalidades, el epítope comprende además al menos uno de los residuos de aminoácido Prol52, Vall08, LeullO, Glnl06, Glul23, Leul27, Lysll7, Ile60 y Lys55 de la IL-34 humana, donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a aminoácidos dentro de las posiciones 55-61, 100-108, 109, 111-127 y 152 de la IL-34 humana, donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H3 - ¬ que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) ; (b) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) ; y (c) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos STWIH (SEC ID NO: 59), (b) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52) ; y (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ; (b) una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (c) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) .

En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) O GINQGSKRGAMDY (SEC ID NO: 32) ; (b) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) O QQSYTTPPT (SEC ID NO: 43) o QQYTALPYT (SEC ID NO: 49) o QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) o QQYSDVPYT (SEC ID NO: 47) o QQSRTARPT (SEC ID NO: 41); y (c) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52) o RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos STWIH (SEC ID NO: 59) ; (b) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52) o RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51); y (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGA DY (SEC ID NO: 33) O GINQGSKRGAMDY (SEC ID NO: 32) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ; (b) una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (c) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) o QQSYTTPPT (SEC ID NO: 43) O QQYTALPYT (SEC ID NO: 49) O QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) O QQYSDVPYT (SEC ID NO: 47) O QQSRTARPT (SEC ID NO: 41) O QQSFYFPN (SEC ID NO: 38) o QQSYTTPP (SEC ID NO: 42) O QQYTALPY (SEC ID NO: 48) o QQYSDLPY (SEC ID NO: 44) o QQYSDVPY (SEC ID NO: 46) O QQSRTARP (SEC ID NO: 40) .

En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33); (b) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) ; y (c) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos de ST IH (SEC ID NO: 59) ; (b) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51); y (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ; (b) una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (c) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) .

En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 9 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 9 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 11 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 12. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 11 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 12. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 13 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 14. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 13 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 14.

En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos SRGAYRFAY (SEC ID NO: 56) ; (b) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSYTTPPT (SEC ID NO: 43) ; y (c) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos SITPASGDTDYADSVKG (SEC ID NO: 54) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos SNYIH (SEC ID NO: 55), (b) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos SITPASGDTDYADSVKG (SEC ID NO: 54); y (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos SRGAYRFAY (SEC ID NO: 56) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ; (b) una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (c) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSYTTPPT (SEC ID NO: 43) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 15 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 16. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 15 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 16. En algunas modalidades, el anticuerpo no inhibe la unión entre CSF-1 humano y CSF-1R humano.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 descrito en la presente se une a un dímero de la IL-34. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 descrito en la presente se une a un epítope que se extiende sobre ambos protómeros del dímero de IL-34. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 descrito en la presente neutraliza la actividad de IL-34. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 se une a IL-34 humana, inhibe la unión entre IL-34 humana y CSF-1R humano, y/o neutraliza la actividad de IL-34.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 descrito en la presente es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 descrito en la presente es un anticuerpo humano, humanizad o quimérico. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico . En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende una segunda especificidad de unión a CSF-1 humano.

Se proporcionan en la presente anticuerpos biespecíficos que comprenden una primera especificidad de unión a IL-34 humana y una segunda especificidad de unión a CSF-1 humano y su uso para tratar enfermedades inmunológicas patogénicas mieloides y cánceres. En algunas modalidades, el anticuerpo inhibe la unión de IL-34 humana a CSF-IR humano e inhibe la unión de CSF-1 humano a CSF-IR humano. En otra modalidad, se proporcionan en la presente dos polipéptidos que comprenden especificidad de unión a IL-34 humana y la especificidad de unión a CSF-1 humano, respectivamente, cada uno tiene un dominio de heteromultimerización que es capaz de heterodimerización entre sí.

En algunas modalidades , el anticuerpo descrito arriba es un fragmento de anticuerpo que une IL-34 humana. En algunas modalidades, el fragmento es un fragmento Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv o scFv.

En algunas modalidades, el anticuerpo descrito en la presente es un anticuerpo de un brazo. En algunas modalidades, el anticuerpo descrito en la presente es un anticuerpo lineal. En algunas modalidades, el anticuerpo descrito en la presente es un anticuerpo IgGl o IgG4 de longitud completa.

Se proporcionan además en la presente anticuerpos aislados que se unen a CSF- IR humano, que se une a un epítope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido Argl44, Gln248, Gln249( Ser250, Phe252, y Asn254 de CSF-1R humano, donde la posición del residuo de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2, y que inhiben la unión entre IL-34 humana y CSF-1R humano.

En algunas modalidades, el anticuerpo se une a un epítope que comprende el residuo de aminoácido Argl44 de CSF-1R, donde la posición del residuo de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a un epítope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido Argl44, Argl42, Argl46, y Argl50 de CSF- IR humano, donde la posición de los residuos de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2. En algunas modalidades, el epítope comprende además al menos uno de los residuos de aminoácido Serl72 y Argl92 de CSF- IR humano, donde la posición de los residuos de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2. En algunas modalidades, el epítope comprende además al menos uno de los residuos de aminoácido Argl46, Metl49, Argl50, Phel69, Ilel70, y Glnl73 de CSF-1R humano, donde la posición de los residuos de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a aminoácidos dentro de las posiciones 142-150 y 169-173, donde la posición de los residuos de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2.

En algunas modalidades, el anticuerpo se une a un epítope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido Argl44, Gln248, Gln249, Ser250, Phe252, y Asn254 de CSF-1R humano, donde la posición del residuo de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a un epítope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido Tyr257, Gln248, Gln249, Ser250, Phe252, y Asn254 de CSF-1R humano, donde la posición de los residuos de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2. En algunas modalidades, el epítope comprende además al menos uno de los residuos de aminoácido Pro247, Gln258, y Lys259, donde la posición de los residuos de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2. En algunas modalidades, el epítope comprende además al menos uno de los residuos de aminoácido Val231, Asp251, y Tyr257 de CSF-1R humano, donde la posición del residuo de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a residuos de aminoácido dentro de las posiciones 231, 248-252, y 254, donde la posición de los residuos de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2.

Se proporcionan además en la presente ácidos nucleicos aislados que codifican cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente. También se proporcionan en la presente vectores que comprenden el ácido nucleico de cualquiera de los ácidos nucleicos proporcionados en la presente. También se proporcionan en la presente células huésped que comprenden el ácido nucleico proporcionado en la presente .

Se proporcionan además en la presente métodos para producir un anticuerpo, que comprende cultivar cualquiera de las células huésped proporcionadas en la presente, de manera que se produzca el anticuerpo. En algunas modalidades, el método comprende además recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped.

También se proporcionan en la presente composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Se proporcionan en la presente anticuerpos descritos en la presente para usarse como un medicamento. Se proporcionan en la presente los anticuerpos descritos en la presente para usarse en el tratamiento de una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide. Se proporcionan en la presente los anticuerpos descritos en la presente para usarse en la inhibición de la unión entre IL-34 humana y CSF-IR humano .

También se proporciona en la presente el uso de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente en la elaboración de un medicamento. En algunas modalidades, el medicamento es para tratar una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide. En algunas modalidades, el medicamento es para inhibir la unión entre IL-34 humana y CSF-IR humano.

Se proporcionan en la presente métodos para tratar a un individuo que tiene una enfermedad inflamatoria y/o una enfermedad autoinmune con un componente patogénico mieloide ("enfermedad inmunológica patogénica mieloide") que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente. También se proporcionan en la presente métodos para tratar a un individuo que tiene una enfermedad inflamatoria y/o una enfermedad autoinmune que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de cualquiera de los anticuerpos o terapias de combinación proporcionadas en la presente. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que inhibe la actividad de IL-34 humana y CSF-1 humano. En algunas modalidades, el método comprende administrar una cantidad efectiva de cualquiera de los anticuerpos anti-IL-34 proporcionados en la presente junto con un anticuerpo que se une a CSF-1 humano. En algunas modalidades, la actividad de IL-34 humana y CSF-1 humano se inhibe por un anticuerpo biespecífico anti-IL-34 y anti-CSFl. En algunas modalidades, la inhibición de actividad es al inhibir la unión de IL-34 humana a CSF-1R humano, e inhibir la unión de CSF-1 humano y CSF-1R humano.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos de arriba, la enfermedad inmunológica patogénica, mieloide es artritis reumatoide (RA) , enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, de Crohn, colitis ulcerativa) , esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, asma, osteoporosis , enfermedad de Paget, ateroesclerosis, síndrome metabólico, diabetes tipo II, síndrome activado por macrófago (SAM) , vasculitis (arteritis de células gigantes, vasculitis asociada a ANCA) , lupus discoide, sarcoidosis, enfermedad de injerto contra huésped, LSDs (enfermedades de almacenamiento lisosomal como pero no limitadas a Citostinosis, trastorno de almacenamiento de ácido sálico, enfermedad de Gaucher) , Histiocitosis incluyendo pero no limitándose a enfermedad Rosai-Dorfman, histiocitosis Faisalabad, síndrome H, hipertricosis pigmentada con diabetes dependiente de insulina (PHID)s, vasculitis, infarto al miocardio y enfermedad de injerto contra huésped. En una modalidad, la vasculitis es poliarteritis microscópica, vasculitis CNS, vasculitis necrotizante, cutánea o por hipersensibilidad, vasculitis necrotizante sistémica, o vasculitis asociada a ANCA, tal como síndrome o vasculitis Churg-Strauss (CSS) ) . En otra modalidad, la vasculitis es vasculitis de vaso grande o vasculitis de vaso medio. En una modalidad la vasculitis de vaso grande es polimialgia reumática o arteritis de células gigantes o arteritis de Takayasu. En una modalidad, la vasculitis de vaso medio es enfermedad de Kawasaki de poliarteritis nodosa. En una modalidad específica, un anticuerpo de esta invención (por ejemplo, IL-34, anticuerpo biespecífico IL-34/CSF1 o anticuerpo CSF1R) se utiliza para tratar pacientes con AR quienes responden de manera inadecuada a una terapia (DMARD-IR) con fármaco antirreumático que modifica la enfermedad (DMARD) . En una modalidad adicional, el paciente en DMARD-IR no se ha tratado previamente con un agente anti-TNF ("TNF simple")- En una modalidad, el DMARD es metotrexato. En una modalidad específica, un anticuerpo de esta invención (por ejemplo, anticuerpo IL-34, anticuerpo biespecífico IL-34/CSF1 o anticuerpo CSF1R) se utiliza para tratar pacientes con AR quienes responden de manera inadecuada a una terapia (DMARD-IR) con fármaco antirreumático que modifica la enfermedad (DMARD) . En una modalidad adicional, el paciente en DMARD-IR no se ha tratado previamente con un agente anti-TNF ("TNF simple"). En una modalidad específica, un anticuerpo de esta invención (por ejemplo, IL-34, anticuerpo biespecífico IL-34/CSF1 o anticuerpo CSF1R) se utiliza para tratar pacientes con AR quienes responden de manera inadecuada a terapias anti-TNF (por ejemplo, TNFR-Fc o anticuerpos anti-TNF"). En una modalidad específica, un anticuerpo de esta invención (por ejemplo, IL-34, anticuerpo biespecífico IL-34/CSF1 o anticuerpo CSF1R) se utiliza para tratar pacientes que padecen de una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide quienes responden de manera inadecuada a terapias anti-TNF (por ejemplo, incluyendo pero no limitándose a, TNFR-Fc, anticuerpos anti-TNF e inhibidores de molécula pequeña de TNF o un receptor de TNF) .

En otra modalidad de esta invención, el paciente con a tratarse con un inhibidor de la trayectoria de CSFl-R de esta invención tiene un subtipo Mieloide y/o subtipo Fibroide de RA. En una modalidad, la invención proporciona un método para tratar artritis reumatoide en un individuo que padece del mismo que comprende administrar un inhibidor de la trayectoria de CSFl-R a un paciente quien se ha determinado que tiene un subtipo mieloide y/o un subtipo fibroide de RA. En una modalidad, el subtipo Mieloide o Fibroide se determina al medir el nivel de expresión de gen o nivel de expresión de proteína de un gen subtipo mieloide o subtipo fibroide y determinar si los individuos con AR tiene un subtipo mileoide o uno fibroide de AR, en donde una determinación de que un individuo con AR tiene un subtipo mieloide o uno fibroide de AR indica que es más probable que el individuo con AR responda a un inhibidor de la trayectoria de CSFl-R.

En una modalidad de esta invención, el efecto farmacodinámico de un anticuerpo de esta invención podría medirse al monitorear la reducción en los niveles de monocitos no clásicos (CD14+CD16++) y/o monocitos intermedios (CD14++CD16+) en la sangre de un paciente después del tratamiento con el anticuerpo.

Se proporcionan además en la presente métodos para inhibir la unión entre IL-34 humana y CSF-1R humano en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente.

Se proporcionan además en la presente artículos de elaboración que comprenden cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente. En algunas modalidades, el artículo de manufactura comprende además instrucciones para administrar una cantidad efectiva del anticuerpo a un individuo para tratar una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide en el individuo. También se proporcionan en la presente artículos de elaboración que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-IL-34 proporcionados en la presente y que comprenden además un anticuerpo que se une a CSF-1 humano. En algunas modalidades, el artículo de manufactura comprende además instrucciones para administrar una cantidad efectiva del anticuerpo anti-IL-34 y el anticuerpo que se une a CSF-1 humano a un individuo para tratar una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide en el individuo. En algunas modalidades, la enfermedad inmunológica patogénica, mieloide es artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, asma, osteoporosis , enfermedad de Paget, ateroesclerosis, síndrome metabólico, diabetes tipo II, LSDs (enfermedades de almacenamiento lisosomal como pero no limitadas a Citostinosis, trastorno de almacenamiento de ácido sálico, enfermedad de Gaucher) , Histiocitosis incluyendo pero no limitándose a enfermedad Rosai-Dorfman, histiocitosis Faisalabad, síndrome H, hipertricosis pigmentada con diabetes dependiente de insulina (PHID) .

Esta invención proporciona un método para diagnosticar a un paciente con AR a tratarse con un inhibidor de la trayectoria de CSF1-R que comprende la etapa de medir el nivel de expresión de gen o nivel de expresión de proteína de un gen de subtipo mieloide o subtipo fibroide y determinar si el individuo con RA tiene un subtipo mieloide o uno fibroide de AR, en donde una determinación de que un individuo con AR tiene un subtipo mieloide o uno fibroide de AR indica que es más probable que el individuo con AR responda a un inhibidor de la trayectoria de CSF1-R. En una modalidad, el método comprende además la etapa de medir el nivel de expresión de proteína o gen de IL-34 y/o CSF-1 en el paciente. En una modalidad, el nivel CSF-1 se mide en una muestra biológica del suero o fluido sinovial de un paciente con A . En otra modalidad, el nivel de IL-34 se mide en el suero, fluido sinovial o biopsia de tejido de un paciente con AR.

También se proporciona en la presente un polipéptido que comprende los primeros tres dominios de IgG (es decir, la primera, segunda, y tercera IgG del N-terminal) de un CSF-1R, en donde el polipéptido no comprende otros dominios de IgG del CSF-1R. En algunas modalidades, el polipéptido comprende además un enlazador entre los dominios de IgG. En algunas modalidades, el polipéptido comprende además uno o más patrones de fusión (por ejemplo, una secuencia Fe) . También se proporcionan en la presente un ácido nucleico que codifica el polipéptido, un vector que comprende el ácido nucleico, y una célula huésped que comprende el ácido nucleico. También se proporciona en la presente un método para producir el polipéptido que comprende cultivar una célula huésped que produce el polipéptido. También se proporciona en la presente un método para tratar una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide descrita en la presente que comprende administrar a un individuo una cantidad efectiva del polipéptido. También se proporciona en la presente un artículo de manufactura que comprende el polipéptido descrito en la presente.

Debe entenderse que una, algunas, o todas las propiedades de las diversas modalidades descritas en la presente pueden combinarse para formar otras modalidades de la presente invención. Estos y otros aspectos de la invención serán aparentes para un experto en la materia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1A-D muestra la estructura del núcleo funcional de IL-34 humana. (Fig.lA) Representación esquemática de la IL-34 humana. Un sitio de glicosilación N-enlazado predicho se indica con una estrella. Los puentes de disulfuro conservados en secuencias de IL-34 a través de las especies se muestran como líneas rayadas. (Fig.lB) hIL-34s es active para promover la viabilidad del monocito humano. (Fig.lC) Representación Ribbon de la estructura dimérica de IL-34 humanas. Las estructuras terminales y secundarias se marcan (cuando están visibles). (Fig.lD) Representación Ribbon de la estructura de CSF-1 de murino. Se marcan las estructuras terminales y secundarias.

La Figura 2A-D muestra la caracterización biofísica de hIL-34s e interacciones de hCSF-1 con dos diferentes hCSF-lRs que contienen dominios D1-D3 y D1-D5. (Fig.2A) Análisis de cromatografía de exclusión de tamaño analítica de hIL-34s, CSF-1R D1-D3 y D1-D5, y sus compuestos correspondientes. Los cromatogramas se muestran encima de corridas independientes como se describe en los métodos y hacen referencia a estándares de peso molecular. Inserción: SDS-PAGE de muestras derivadas de fracciones máximas mostradas a la derecha. (Fig.2B) Mediciones calorimétricas de valoración isotérmica de la unión de D1-D5 CSF-IR a hIL-34s (izquierda) , D1-D3 CSF-IR a hIL-34s (en medio) y desplazamiento de D1-D3 CSF-IR de hIL-34s por D1-D5 CSF-IR (derecha) . (Fig.2C) Mediciones calorimétricas de la unión de D1-D3 CSF-IR a hCSF-1 (izquierda) y D1-D5 CSF-IR a hCSF-1 (derecha) . (Fig.2D) Sumario de las proteínas en la jeringa y sus concentraciones, las proteínas en la célula y sus concentraciones, el cambio de entalpia (??) , cambio de entropía (AS) , cambio de energía libre de Gibbs (AG) , afinidad de unión (KD) y estequiometria (n) derivada de los análisis de los tres experimentos de valoración ITC mostrados en los paneles B y C. N.D. indica sin determinar debido a lo empinado de la curva.

La Figura 3A-D muestra una comparación de las interfases de Sitio 1 y 2 para CSF-IR en composición con IL-34 y CSF-1. (A-D) Vistas en primer plano del sitio 1 y sitio 2 de las interfases IL-34/CSF-1R (Fig.3A, 3C) o CSF-l/CSF-lR (Fig.3B, 3D) . Los residuos que interactúan con el receptor de citocina clave se muestran como barras, los enlaces de hidrógeno se dibujan como líneas rayadas, y los elementos de estructura secundaria se marcan en las cintas y filamentos.

La Figura 4A muestra la inhibición de la actividad biológica de IL-34 por YW404.33.56 Fab en el ensayo de viabilidad de monocito. La Figura 4B muestra una vista en primer plano de interacciones de los bucles de CDR (H1-H3, L3) de YW404.33.56 Fab con hIL-34s (representación animada). Los residuos críticos incluidos en las interacciones de interfase se resaltan en modelos de barra.

Figura 5A-B muestra residuos que contactan el receptor trazados sobre la estructura secundaria de IL-34 (Fig.5A) y CSF-1 (Fig.5B). Los residuos interfaciales Sitiol y Sitio2 se resaltan por un óvalo punteado.

Figura 6 muestra una comparación de las estructuras complejas de señalización de IL-34 humana/CSF-lR (izquierda) , CSF-1/CSF-1R de murino (en medio, PDB 3EJJ) y SCF/Kit (derecha, PDB 2E9W) . Las citocinas diméricas con haz de cuatro hélices se muestran como animaciones y superficies semitransparentes. Los ectodominios receptores se representan como representación de cinta o se muestran como óvalos para D4 y D5 CSF-IR. Los pares iónicos se han implicado en los contactos hemotípicos del receptor de CSF-IR y Kit se muestra como círculo y se anota.

Figura 7A-B. Alineación de secuencia de homólogos mamíferos de IL-34 (Homo sapiens (SEC ID NO: 68) ; Macaca mulatta (SEC ID NO: 69) ; Canis lupus familiaris (SEC ID NO: 70) ; Ailuropoda melanoleuca (SEC ID NO: 71) ; Equus caballus (SEC ID NO: 72); Bos taurus (SEC ID NO: 73); Mus musculus (SEC ID NO: 74) ; Rattus norvegicus (SEC ID NO: 75) ; secuencia consenso (SEC ID NO: 76)). La numeración y estructura secundaria de acuerdo a la IL-34 humana (SEC ID NO: 68) . Los residuos estrictamente conservados se sombrean en gris oscuro y los residuos conservados en la mayoría de las secuencias, como se calcula por una puntuación de similitud, se encierran. Los residuos de IL-34 en el sitio 1, sitio 2 e interfase de dimerización IL-34 se denotan por círculos sólidos, círculos y estrellas en la parte inferior, respectivamente. Los triángulos indican el sitio de glicosilación y acoplamiento de enlace disulfuro. Las figuras de alineación se hacen utilizando el programa ESPRIT (en la Red esprit.ibcp.fr/ESPript/ESPript).

Figura 8 muestra actividad neutralizante de Ab YW404.33 anti-IL-34en el ensayo de proliferación de monocito.

Figura 9A-B muestra actividad neutralizante de Abs YW404.1, YW404.6, YW404.33, Y 405.1, YW405.3, YW406.1, YW406.93 (Fig.9A) y Abs YW404.33 anti-IL-34, YW404.33.12 y YW404.33.56 a una concentración de mIL-34 de 100 ng/ml (Fig.9B) en el ensayo de proliferación de monocito.

Figura 10A-B: secuencias variables de cadena pesada (Fig.lOA) y ligera (Fig.lOB) de Abs YW404.1, YW404.3, YW404.33, YW404.33.10, YW404.33.12, YW404.33.il, YW404.33.56, y YW404.33.93 anti-IL-34. Los residuos de aminoácido - - enfocados para maduración por afinidad para estos anticuerpos se rodean por un cuadro. Figura 10A muestra las secuencias de aminoácidos VH para 404.1 (SEC ID NO: 15), 404.6 (SEC ID NO: 77), 405.3 (SEC ID NO: 25), 404.33 (SEC ID NO: 5), 404.33.10 (SEC ID NO: 7), 404.33.12 (SEC ID NO: 11), 404.33.11 (SEC ID NO: 9), 404.33.56 (SEC ID NO: 3), y 404.33.93 (SEC ID NO: 13). La Figura 10B muestra las secuencias de aminoácidos VL para 404.1 (SEC ID NO: 16), 404.6 (SEC ID NO: 78), 405.3 (SEC ID NO: 26), 404.33 (SEC ID NO: 6), 404.33.10 (SEC ID NO: 8), 404.33.12 (SEC ID NO: 12), 404.33.11 (SEC ID NO: 10), 404.33.56 (SEC ID NO: 4), y 404.33.93 (SEC ID NO: 14). Las secuencias de región de estructura de cadena pesada HVRs Kabat son secuencia FRl (SEC ID NO: 17), secuencia FR2 (SEC ID NO: 18), FR3 (SEC ID NO: 19) , y FR4 (SEC ID NO: 20) mostradas en la Figura 10A. Las secuencias de región de estructura de cadena ligera entre HVRs Kabat son secuencia FRl (SEC ID NO: 21) , secuencia FR2 (SEC ID NO: 22), secuencia FR3 (SEC ID NO: 23), y secuencia FR4 (SEC ID NO: 24) mostradas en la Figura 10B.

Figura 11 muestra la puntuación de histología de ratones Balb/c con enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) inducida por dextran sulfato sódico tratada con ya sea anticuerpo de control (anti-ambrosia, a-RW) , ciclosporina (CSA) , anticuerpo anti-CSF-1 (a-CSF-1) , anticuerpo anti-IL-34 - - (a-IL-34) o una combinación de anticuerpo anti-CSF-1 y anticuerpo anti-IL-34.

Figura 12 muestra que los niveles de suero de IL-34 y CSF-1 se elevaron en ratones Balb/c con IBD inducida por DSS con anticuerpo de control (a-RW) comparados con ratones de control .

Figura 13 muestra que CSF-1 y IL-34 se expresan en suero, fluido sinovial y tejido de pacientes con artritis reumatoide .

Figura 14A-B muestra que la trayectoria CSF1/IL34 está presente en pacientes con AR TNF-NR primaria y secundaria.

Figura 15 muestra que el tratamiento de una combinación de aCSFl+aIL34 coincide con inhibición de inflamación TNFRII-Fc y es superior en la protección de erosiones óseas en CIA de ratón (activadores mieloide) .

Figura 16A-C muestra que el bloqueo dual de CSFl e IL-34 inhibe colitis por DSS en un modelo.

Figura 17 muestra que IL-34 se expresa en colon IBD pero es baja/no detectable en suero.

Figura 18 muestra que no hay correlación de IL-34/CSF-1 y expresión TNFa en fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide y osteoartritis .

Figura 19 muestra la reducción de células mieloide de ratón (Mf y monocitos) que infiltran la articulación sinovial después de solamente 7 días de tratamiento con combinación de anti-CSFl/IL-34.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES DE LA INVENCIÓN Sin limitarse por teoría, se cree que el planteamiento combinatorio para inhibir tanto IL-34 como CSF-1 directamente para tratar enfermedades inmunológicas patogénicas mieloides es superior para dirigir directamente su receptor o ya sea IL-34 y CSF-1 sólo. Se predice que las ventajas a este planteamiento incluyen, pero no se limitan a, cualquiera o una combinación de las siguientes, mejores propiedades farmacocinéticas, mejores perfiles de seguridad, mejor eficacia, mejor potencia y una mejor ventaja terapéutica en base a las consideraciones de seguridad y eficacia de arriba.

DEFINICIONES Los términos "anticuerpo anti-IL-34" y "un anticuerpo que se une a IL-34" se refieren a un anticuerpo que es capaz de unir IL-34 con suficiente afinidad, de modo que el anticuerpo es útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico para enfocarse en IL-34. En algunas modalidades, el grado de unión de un anticuerpo anti-IL-34 a una proteína no IL-34 no relacionada es menor a aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo a IL-34 según se midió, por ejemplo, por un ensayo BIACORE o un ensayo BLI . En algunas modalidades, un anticuerpo que se une a IL-34 tiene una constante de disociación (Kd) de = ?µ?, = 500 nM, = 250 nM, < 100 nM, = 10 nM, = 1 nM, = 0.1 nM, = 0.01 nM, o = 0.001 nM (por ejemplo, 10"8 M o menor, por ejemplo, de 10"8 M a 10"13 M, por ejemplo, de 10"9 M a 10~13 M) . En algunas modalidades, un anticuerpo anti-IL-34 se une a un epítope de IL-34 que se conserva entre IL-34 de diferentes especies.

El término "IL-34", como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier IL-34 nativo de cualquier fuente vertebrada, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) , al menos que se indique de otra manera. El término comprende IL-34 sin procesar, de "longitud completa" así como cualquier forma de IL-34 que resulta del procesamiento en la célula. El término también comprende variantes que ocurren de manera natural de IL-34, por ejemplo, variantes de unión o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una IL-34 humana ej emplificativa se muestra en la SEC ID NO: 1. En algunas modalidades, la IL-34 humana comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 1, en donde se elimina el aminoácido Q en posición 81.

Los términos "anticuerpo anti-CSF-1" y "un anticuerpo que se une a CSF-1" se refieren a un anticuerpo que es capaz de unir CSF-1 con suficiente afinidad, de modo que el anticuerpo es útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico para enfocarse en CSF-1. En algunas modalidades, el grado de unión de un anticuerpo anti-CSF-1 a una proteína no CSF-1, no relacionada es menor a aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo a CSF-1 según se midió, por ejemplo, por un ensayo BIACORE o un ensayo BLI . En algunas modalidades, un anticuerpo que se une a CSF-1 tiene una constante de disociación (Kd) de = ?µ?, = 500 nM, = 250 n , = 100 nM, < 10 nM, = 1 nM, = 0.1 nM, = 0.01 nM, o = 0.001 nM (por ejemplo, 10~8 M o menor, por ejemplo, de 10"8 M a 10"13 M, por ejemplo, de 10"9 M a 10"13 M) . En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CSF-1 se une a un epítope de CSF-1 que se conserva entre CSF-1 de diferentes especies.

El término "CSF-1," como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier CSF-1 nativo de cualquier fuente vertebrada, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) , al menos que se indique de otra manera. El término comprende CSF-1 sin procesar, de "longitud completa" así como cualquier forma de CSF-1 que resulta del procesamiento en la célula. El término también comprende variantes que ocurren de manera natural de CSF-1, por ejemplo, variantes de unión o variantes alélicas. Un CSF-1 humano ejemplificativo se describe en Takahashi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 161 (2), 892-901 (1989) .

Los términos "anticuerpo anti-CSF-lR" y "un anticuerpo que se une a CSF-1R" se refieren a un anticuerpo - - que es capaz de unir CSF-1R con suficiente afinidad, de modo que el anticuerpo es útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico para enfocarse en CSF-1R. En algunas modalidades, el grado de unión de un anticuerpo anti-CSF-lR a una proteína no CSF-1R, no relacionada es menor a aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo a CSF-1R según se midió, por ejemplo, por un ensayo BIACORE o un ensayo BLI . En algunas modalidades, un anticuerpo que se une a CSF-1R tiene una constante de disociación (Kd) de = ?µ?, = 500 nM, = 250 nM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, o = 0.001 nM (por ejemplo, 10~8 M o menor, por ejemplo, de 10"8 M a 10"13 M, por ejemplo, de 10"9 M a 10"13 M) . En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CSF-lR se une a un epítope de CSF-1R que se conserva entre IL-34 de diferentes especies.

El término "CSF-1R" o "CSF1R" como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier CSF-1R nativo de cualquier fuente vertebrada, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) , al menos que se indique de otra manera. El término comprende CSF-1R sin procesar, de "longitud completa" así como cualquier forma de CSF-1R que resulta del procesamiento en la célula. El término también comprende variantes que ocurren de manera natural de CSF-1R, por ejemplo, variantes de unión o variantes alélicas . La secuencia de aminoácidos de un CSF-1R humano ej emplificativo se muestra en la SEC ID NO: 2.

Un agente terapéutico de acuerdo a esta invención incluye un agente que puede unirse al objetivo identificado en la presente arriba, tal como un polipéptido (s) (por ejemplo, un anticuerpo, una immunoadhesina o un pepticuerpo) , un aptámero o una molécula pequeña que puede unirse a una proteina o una molécula de ácido nucleico que puede unirse a una molécula de ácido nucleico que codifica un objetivo identificado en la presente (es decir, ARNsi) .

El término "inhibidor de la trayectoria de CSFl-R" se refiere a un agente terapéutico que inhibe la señalización de CSFl-R. En una modalidad, el inhibidor de la trayectoria de CSFl-R se une a CSF-1, IL-34, CSFl-R o CSF-1 e IL-34. En una modalidad, el agente que une CSF-1, IL-34 o CSF-1 e IL-34 inhibe la unión de tal proteína (s) a CSFl-R. En otra modalidad, el agente que une CSFl-R inhibe la unión de CSFl-R a IL-34 y CSF-1. En una modalidad, una reducción en actividad de quinasa de CSFl-R indica una reducción en señalización de CSF-1R. En una modalidad, el inhibidor de la trayectoria de CSFl-R es un anticuerpo de esta invención. En otra modalidad, el inhibidor de trayectoria de CSF-1R es un inhibidor de molécula pequeña de CSFl-R. En otra modalidad, el inhibidor de la trayectoria de CSFl-R es un dominio extracelular CSFl-R fusionado a Fe.

El término "anticuerpo" en la presente se utiliza en el sentido más amplio y comprende diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo pero no limitándose a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) , y fragmentos de anticuerpo siempre y cuando muestren la actividad de unión a antígeno deseada.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena ligera o pesada de anticuerpo que se incluye en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, con cada dominio comprendiendo cuatro regiones de estructura conservada (FRs) y tres regiones hipervariables (HVRs) . (Ver, por ejemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed. , W.H. Freeman and Co., página 91 (2007) .) Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular pueden aislarse utilizando un dominio VH o VL de un anticuerpo que une el antígeno para probar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Ver, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

El término "región hipervariable" o "HVR, " como se utiliza en la presente, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). Generalmente, anticuerpos de cuatro cadenas nativos comprenden seis HVRs; tres en VH (Hl, H2, H3), y tres en VL (Ll, L2, L3) . HVRs generalmente comprenden residuos de aminoácido de los bucles hipervariables y/o de las "regiones de determinación complementarias" (CDRs) , las últimas siendo de variabilidad de secuencia más alta y/o incluidas en reconocimiento de antigeno. Una HVR como se utiliza en la presente puede comprender residuos ubicados dentro de las posiciones 24-36 (para Ll) , 46-56 (para L2) , 89-97 (para L3) , 26-35B (para Hl) , 47-65 (para H2) , y 93-102 (para H3) . Por ejemplo, una HVR puede incluir residuos en las posiciones descritas previamente : A) 24-34 (Ll), 50-56 (L2) , 89-97 (L3), 26-32 (Hl) , 52-56 (H2) , y 95-102 (H3) (Chothia and Lesk, J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987); B) 24-34 de Ll, 50-56 de L2 , 89-97 de L3 , 31-35B de Hl, 50-65 de H2, y 95-102 de H3 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) ; y C) 30-36 (Ll), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35 (Hl) , 47-58 (H2), 93-101 (H3) ( acCallum et al . J. Mol. Biol . 262:732-745 (1996) .

Al menos que se indique de otra manera, residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos de FR) se enumeran en la presente de acuerdo a Kabat et al . , supra .

Al menos que se indique de otra manera, residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos de FR) se enumeran en la presente de acuerdo a Kabat et al . , supra .

Con la excepción de CDR1 en VH, CDRs generalmente comprenden los residuos de aminoácido que forman los bucles hipervariables . CDRs también comprenden "residuos que determinan especificidad," o "SDRs," que son residuos que contactan el antígeno. SDRs se contienen dentro de regiones de las CDRs llamadas CDRs abreviadas, o a-CDRs. a-CDRs ejemplificativas (a-CDR-Ll, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-Hl, a-CDR-H2 , y a-CDR-H3) ocurren en residuos de aminoácido 31-34 de Ll, 50-55 de L2, 89-96 de L3 , 31-35B de Hl, 50-58 de H2, y 95-102 de H3. (Ver Almagro and Fransson, Front . Biosci. 13:1619-1633 (2008) .) Al menos que se indique de otra manera, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos de FR) se enumeran en la presente de acuerdo a Kabat et al., supra.

"Estructura" o "FR" se refiere a residuos de dominio variable diferentes a residuos de región hipervariable (HVR) . La FR de un dominio variable generalmente consiste de cuatros dominios FR: FR1, FR2, FR3 , y FR4. De acuerdo con lo anterior, las secuencias de HVR y FR generalmente aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL) : FRl-Hl(Ll) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4.

Una "estructura consenso humana" es una estructura que representa los residuos de aminoácido que ocurren más comúnmente en una selección de secuencias de estructura VL o VH de inmunoglobulina humana. Generalmente, la selección de secuencias VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. Generalmente, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. En algunas modalidades, para VL, el subgrupo es subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra . En algunas modalidades, para VH, el subgrupo es subgrupo III como en Kabat et al., supra.

Una "estructura humana de aceptación" para los propósitos en la presente es una estructura que comprende la secuencia de aminoácidos de una estructura de dominio variable de cadena ligera (VL) o una estructura de dominio variable de cadena pesada (VH) derivada de una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura consenso humana, como se define abajo. Una estructura humana de aceptación "derivada de" una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios de secuencia de aminoácidos. En algunas modalidades, el número de cambios de aminoácido son 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos , 7 o menos , 6 o menos , 5 o menos , 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunas modalidades, la estructura humana de aceptación VL es idéntica en secuencia a la secuencia de estructura de inmunoglobulina humana VL o secuencia de estructura consenso humana.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseída por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de estas pueden dividirse además en subclases (isotipos) , por ejemplo, Igd, IgG2, IgG3, IgG4/ IgAi, e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman , d, e, ?, y µ, respectivamente.

El término "región Fe" en la presente se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante . El término incluye regiones Fe de secuencia nativa y regiones Fe variantes. En algunas modalidades, una región Fe de cadena pesada de IgG humana se extiende de Cys226, o de Pro230, al término carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fe puede o no estar presente . Al menos que se especifique de otra manera en la presente, la numeración de residuos de aminoácido en la región Fe o región constante es de acuerdo al sistema de numeración de EU, también llamado el índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"Anticuerpos nativos" se refieren a moléculas de inmunoglobulina que ocurren de manera natural con estructuras variables. Por ejemplo, anticuerpos de IgG nativa son glicoproteínas heterotetrámericas de aproximadamente 150,000 daltones, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se unen por disulfuro. De N- a C-terminal, cada cadena pesada tiene una región variable (VH) , también llamada un dominio pesado variable o un dominio variable de cadena pesada, seguido por tres dominios constantes (CH1, CH2, y CH3) . De manera similar, de N- a C-terminal, cada cadena ligera tiene una región variable (VL) , también llamada un dominio ligero variable o un dominio variable de cadena ligera, seguido por un dominio ligero constante (CL) . La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, llamados kappa (?) y lambda - - (?) , en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante .

El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o unen el mismo epítope, excepto para posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, conteniendo mutaciones que ocurren de manera natural u originándose durante la producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, tales variantes generalmente estando presentes en cantidades menores. En contraste a preparaciones de anticuerpo policlonal, que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante único en un antígeno. De esta manera, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obteniéndose de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe construirse como requiriendo la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden hacerse por una variedad de técnicas, incluyendo pero no limitándose al método hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de despliegue de fago, y métodos - - que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los lugares de inmunoglobulina humana, tales métodos y otros métodos ejemplificativos para hacer anticuerpos monoclonales describiéndose en la presente.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el cual una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente particular o especies, mientras el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente diferente o especie .

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácido de HVRs no humanas y residuos de aminoácido de FRs de humano. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las HVRs (por ejemplo, CDRs) corresponden a aquellas de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas de las FRs corresponden a aquellas de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una. porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha experimentado humanización.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un - - anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpo humano y otras secuencias que codifican anticuerpo humano. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humano.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula diferente a un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que une el antígeno al cual se une el anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab' , Fab' -SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única (por ejemplo, scFv) ; y anticuerpos multiespecífieos formados de fragmentos de anticuerpo.

Los términos "anticuerpo de longitud completa," "anticuerpo intacto," y "anticuerpos completo" se utilizan en la presente de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fe como se define en la presente .

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su ambiente natural . En algunas modalidades, un anticuerpo se purifica a más de 95% o 99% de pureza como se determina mediante, por ejemplo, método electroforático (por ejemplo, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico (IEF) , electroforesis capilar) o cromatográfico (por ejemplo, intercambio iónico o HPLC de fase inversa) . Para revisión de los métodos de valoración de la pureza del anticuerpo, ver, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007) .

Un anticuerpo "madurado por afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVRs) , en comparación con un anticuerpo de origen que no posee tales alteraciones, tales alteraciones resultando en una mejora en la afinidad del anticuerpo para antígeno.

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un sitio de unión único de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su socio de unión (por ejemplo, un antígeno) . Al menos que se indique de otra manera, como se utiliza en la presente, "afinidad de unión" se refiere a afinidad intrínseca de unión que refleja una interacción 1 : 1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X para su socio Y puede representarse generalmente por la constante de disociación (Kd) . La afinidad puede medirse por métodos conocidos comunes en la materia, incluyendo aquellos descritos en la presente. Las modalidades ej emplificativas e ilustrativas específicas para medir afinidad de unión se describen a continuación.

Un "anticuerpo que se une al mismo epítope" como un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia por 50% o más, y a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia por 50% o más. Se proporciona en la presente un ensayo de competencia ejemplificativo.

"Funciones efectoras" se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe de un anticuerpo, que varían con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión Clq y citotoxicidad dependiente complementaria (CDC) ; unión de receptor Fe; citotoxicidad mediada por célula dependiente del anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; subregulación de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B) ; y activación de célula B.

Un "anticuerpo desnudo" se refiere a un anticuerpo que no se conjuga con una porción heteróloga (por ejemplo, una porción citotóxica) o radiomarca. El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.

Un "ácido nucleico aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su ambiente natural . Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen ordinariamente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosomalmente o en una ubicación cromosomal que es diferente de su ubicación cromosomal natural. "Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-IL-34" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifica las cadenas pesada y ligera de anticuerpo (o fragmentos de las mismas) , incluyendo tales molécula (s) de ácido nucleico en un vector único o vectores separados, y tales molécula (s) de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones en una célula huésped.

"Por ciento (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptidos de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidato que son idénticos con los residuos de aminoácido en la secuencia de polipéptidos de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el por ciento máximo de identidad de secuencia, y no considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación para propósitos de determinar el por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse en varias maneras que están dentro de la experiencia en la materia, por ejemplo, utilizando software de computadora públicamente disponible tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Aquellos expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Para propósitos en la presente, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa de computadora de comparación de secuencia ALIGN-2. El programa de computadora de comparación de secuencia ALIGN-2 es de autoría de Genentech, Inc., y el código fuente se ha llenado con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE.UU., Washington D.C., 20559, donde se registra bajo No. de Registro de Derechos de Autor de EE.UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede recopilarse del código fuente. El programa ALIGN-2 debería recopilarse para usarse en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones donde ALIGN-2 se emplea para comparaciones de secuencia de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A a, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B - - (que puede expresarse alternativamente como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue. 100 veces la fracción X/Y donde X es el número de residuos de aminoácido clasificados como pares idénticos por el programa de alineación de secuencia ALIGN-2 en esa alineación de programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácido en B. Se apreciará que donde la longitud de secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A. Al menos que se establezca específicamente de otra manera, todos los valores de identidad de secuencia de aminoácidos en % utilizados en la presente, se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente utilizando el programa de computadora ALIGN-2.

El término "vector," como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al cual se une. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico auto-replicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la cual se ha introducido. Ciertos - - vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los cuales se enlazan operativamente. Tales vectores se refieren en la presente como "vectores de expresión. " Los términos "célula huésped," "línea celular huésped," y "cultivo celular huésped" se utilizan de manera intercambiable y se refieren a células en las cuales se ha introducido el ácido nucleico exógeno, incluyendo la progenie de tales células . Las células huésped incluyen "transformadores" y "células transformadas," que incluyen la célula transformada primaria y progenie derivada de la misma sin considerar el número de canales. La progenie no puede ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula de origen, pero puede contener mutaciones. La progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica como se prueba o clasifica para la célula originalmente transformada se incluye en la presente.

Como se utiliza en la presente, "tratamiento" (y variaciones gramáticas del mismo tales como "tratar" o "tratando") se refiere a intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo que se trata, y puede realizarse ya sea para profilaxis o durante el curso de patología clínica. Los efectos deseables de tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevenir la ocurrencia o recurrencia de enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad, y remisión o diagnóstico mejorado. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención se utilizan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o reducir el progreso de una enfermedad.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros, y caballos) , primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos tales como monos) , conejos, y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) . En algunas modalidades, el individuo o sujeto es un humano.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma para permitir la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma para ser efectiva, y que no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente tóxicos a un sujeto al cual se administraría la formulación.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, diferente a un ingrediente activo, que no es tóxico a un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón químico, excipiente, estabilizador, o conservador.

Una "cantidad efectiva" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico o terapéutico deseado.

Como se entiende en el contexto clínico, una cantidad efectiva de un agente terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo proporcionado en la presente) , fármaco, compuesto, o composición farmacéutica puede o no lograrse junto con otro fármaco, compuesto, o composición farmacéutica. De esta manera, una "cantidad efectiva" puede considerarse en el contexto de administrar uno o más agentes terapéuticos, y puede considerarse que un agente único se de en una cantidad efectiva si, junto con uno o más otros agentes, puede ser o se logra un resultado deseable.

Como se utiliza en la presente, "junto con" se refiere a administración de una modalidad de tratamiento además de otra modalidad de tratamiento. Como tal, "junto con" se refiere a administración de una modalidad de tratamiento antes, durante o después de administración de la otra modalidad de tratamiento al individuo.

El término "folleto del paquete" se utiliza para referirse a instrucciones normalmente incluidas en paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosificación, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias que conciernen al uso de tales productos terapéuticos .

"Enfermedad inflamatoria intestinal" o "IBD" se refiere al grupo de trastornos que causan que los intestinos se inflamen, generalmente se manifiesten con síntomas incluyendo dolor y calambres abdominales, diarrea, pérdida de peso y sangrado intestinal. Las formas principales de IBD son colitis ulcerativa (UC) y enfermedad de Crohn.

Como se utiliza en la presente, "enfermedad inmunológica patogénica mieloide" se refiere a una enfermedad inflamatoria y/o una enfermedad autoinmune con un componente patogénico mieloide.

Como se utiliza en la presente, "DMARD" se refiere a un fármaco antirreumático que modifica la enfermedad. Ejemplos de DMARDs incluyen adalimumab, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, azatioprina, D-penicilamina, sales de oro (aurotiomalato de sodio, auranofín) , Gold (oral) , Gold (intramuscular) , minociclina, ciclosporina, etanercept, golimumab, infliximab, minociclina y ritixumab.

Como se utiliza en la presente, "Fl" se refiere a subtipo tipo 1 rico en fibroblast, "F2" se refiere a subtipo tipo 2 rico en fibroblasto, "L" se refiere a subtipo rico en linfoide o subtipo linfoide, y " " se refiere a subtipo rico en mieloide o subtipo mieloide. Colectivamente, estos subtipos identifican cuatro subtipos moleculares de pacientes con artritis reumatoide en base a análisis de expresión genética. Colectivamente, los subtipos Fl y F2 se refieren como el fibroide o subtipo "F" . El subtipo L de pacientes con AR generalmente tienen un patrón de expresión genética característico de célula B, célula de plasma, célula T, e inclusión de macrófago y evidencia de activación de célula B y T, cambio de isotipo, secreción de Ig, y producción de citocina. El subtipo mieloide de pacientes con AR generalmente tiene un patrón de expresión genética característico de monocito, macrófago, neutrófilo e inclusión de linfocito y evidencia de activación de macrófago, fagocitosis, irrupción respiratoria, activación de célula T y producción de citocina. El subtipo fibroide de pacientes con AR generalmente tiene un patrón de expresión genética característico de inclusión de fibroblasto y osteoblasto y evidencia de formación ósea, crecimiento y diferenciación y vasculogénesis .

Como se utiliza en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "el (la) incluyen referencia plural al menos que el contexto lo indique de otra manera claramente. Por ejemplo, la referencia a un "anticuerpo" es una referencia a de uno a muchos anticuerpos, tales como cantidades molares, e incluye equivalentes de las mismas conocidas por aquellos expertos en la materia, y así sucesivamente.

Referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente incluye (y describe) modalidades que se dirigen a aquel valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción refiriéndose a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X." Debe entenderse que el aspecto y variaciones de la invención descritos en la presente incluyen "consistiendo" y/o "consistiendo esencialmente de" aspectos y variaciones.

COMPOSICIONES Y MÉTODOS La invención proporciona anticuerpos que se unen a IL-34, anticuerpos biespecíficos con una primera especificidad de unión para IL-34 y una segunda especificidad de unión para CSF-1 (referidos además en la presente como anticuerpos biespecíficos anti-IL-34/CSF-l) , y anticuerpos que se unen a CSF-1R. Los anticuerpos de la invención son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento de enfermedades inmunológicas patogénicas mieloides, incluyendo pero no limitándose a enfermedad inflamatoria intestinal, artritis reumatoide y esclerosis múltiple. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-IL-34 se unen a IL-34 de mamífero (por ejemplo, humano) . En algunas modalidades, los - - anticuerpos biespecíficos anti-IL-34/CSF-l comprenden una primera especificidad de unión a una IL-34 de mamífero (por ejemplo, humano) y una segunda especificidad de unión a un de mamífero CSF-1 (por ejemplo, humano) . En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CSF-lR se unen a un CSF-IR de mamífero (por ejemplo, humano) .

Anticuerpos Anti-IL-34 y CSF-IR Ejemplifica ivos Anticuerpos Anti-IL-34 En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos aislados que se unen a IL-34 (por ejemplo, IL-34 humana) . Los anticuerpos anti-IL-34 descritos en la presente pueden tener una o más de las siguientes características: (i) inhibición de unión de IL-34 (por ejemplo, IL-34 humana) a CSF-IR (por ejemplo, CSF-IR humano) ; (ii) neutralización de la actividad de IL-34 (por ejemplo, actividad de IL-34 humana) ; (iii) inhibición de proliferación inducida por IL-34 de células mononucleares sanguíneas periféricas; (iv) unión a un dímero de IL-34 (por ejemplo, IL-34 humana) ; (v) unión a un epítope que se extiende sobre ambos protómeros de IL-34 (por ejemplo, IL-34 humana) ; (vi) no 'inhibición de unión de CSF-1 (por ejemplo, CSF-1 humano) a CSF-IR (por ejemplo, CSF-IR humano) . En algunas modalidades, el grado de unión de un anticuerpo anti-IL-34 a una proteína no IL-34 no relacionada es menor a aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo a IL-34 como se mide, por ejemplo, por un ensayo BIACORE o un ensayo de interferometría bicapa (BLI) . En algunas modalidades, el anticuerpo que se une a IL-34 tiene una constante de disociación (Kd) de = ?µ , = 500 M, = 250 nM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, o < 0.001 nM (por ejemplo, 10"8 M o menor, por ejemplo, de 10"8 M a 10"13 M, por ejemplo, de 10"9 M a 10"13 M) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 tiene un valor Kd menor a aproximadamente 500 nM. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 tiene un valor Kd menor a aproximadamente 100 nM o 10 nM. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 tiene un valor Kd menor a aproximadamente 1 nM. En algunas modalidades, el anticuerpo IL-34 tiene un valor Kd menor a aproximadamente 100 pM. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-IL-34 tiene un Kd de aproximadamente 100-200 pM, aproximadamente 100-500 pM, aproximadamente 100 pM-1 nM, o de aproximadamente 1??-50??. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-IL-34 tiene un Kd de aproximadamente 17 nM. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-IL-34 tiene un Kd de aproximadamente 120 nM. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 se une a un epítope de IL-34 que se conserva entre IL-34 de diferentes especies .

En un aspecto, se proporciona en la presente un anticuerpo anti-IL-34, que se une a un epítope que comprende al menos cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, o dieciséis, o diecisiete residuos de aminoácido Glul03, Leul09, Glnl06, Asnl50, Leul27, Asnl28, Serl84, Leul86, Asnl87, Lys44, Glul21, Aspl07, Glulll, Serl04, Glnl20, Trpll6, y Asn61 de una IL-34 humana. En un aspecto, se proporciona en la presente un anticuerpo anti-IL-34, que se une a un epítope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido desde Glul03 hasta Asnl50 de una IL-34 humana. En un aspecto, se proporciona en la presente un anticuerpo anti-IL-34, que se une a un epítope que comprende al menos cualquiera de uno, dos, o tres, o cuatro residuos de aminoácido Glul03, Leul09, Glnl06, y Asnl50 de una IL-34 humana. En cualquiera de los aspectos anteriores, el anticuerpo anti-IL-34 puede unirse a un epítope que comprende además al menos cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, o siete, u ocho residuos de aminoácido SerlOO, Glul23, Trpll6, Thrl24, Leul27, Asnl28, Glnl31, y Thrl34 de una IL-34 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 se une a aminoácidos dentro de las posiciones 100-108, 116-134, 109 y 150 de una IL-34 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 inhibe la unión entre IL-34 humana y CSF-1R humano. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 neutraliza la actividad de IL-34 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 se une a un dímero de IL-34 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL- 34 se une a un epítope que abarca ambos protómeros de IL-34 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 es un anticuerpo humano, humanizado, o quimérico. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 es un fragmento de anticuerpo que se une a una IL-34 humana. Como se utiliza en la presente, la posición del residuo en la presente corresponde a la posición de residuo en la SEC ID NO: 1.

En un aspecto, se proporciona en la presente un anticuerpo anti-IL-34, que se une a un epítope que comprende al menos cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, o dieciséis, o diecisiete residuos de aminoácido Glul03, Leul09, Glnl06, Asnl50, Leul27, Asnl28, Serl84, Leul86, Asnl87, Lys44, Glul21, Aspl07, Glulll, Serl04, Glnl20, Trpll6, y Asn61 de una IL-34 humana. En un aspecto, se proporciona en la presente un anticuerpo anti-IL-34, que se une a un epítope que comprende al menos cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, o cinco, o seis de los residuos de aminoácido Asnl28, Serl84, Leul86, Asnl87, Lys44, y Glul21 de una IL-34 humana. En cualquiera de los aspectos anteriores, el anticuerpo anti-IL-34 puede unirse a un epítope que comprende además al menos cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, o cinco, o seis de los residuos de aminoácido Phe40, - - Asp43, Leul25, Glnl89, Thr36, y Vall85 de una IL-34 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 se une a aminoácidos dentro de las posiciones 36-44, 121-128, y 184-187 de una IL-34 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 inhibe la unión entre IL-34 humana y CSF-1R humano. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 neutraliza la actividad de IL-34 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 se une a un dímero de IL-34 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 se une a un epítope que abarca ambos protomeros de IL-34 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 es un anticuerpo monoclonal . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 es un anticuerpo humano, humanizado, o quimérico. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 es un fragmento de anticuerpo que se une a una IL-34 humana. Como se utiliza en la presente, la posición del residuo en la presente corresponde a la posición de residuo en la SEC ID NO: 1.

En un aspecto, se proporciona en la presente un anticuerpo anti-IL-34 que se une a un epítope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido de Glul03 -Leul27 de una IL-34 humana. En un aspecto, se proporciona en la presente un anticuerpo anti-IL-34 que se une a un epítope que comprende al menos cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, o siete, u ocho residuos de aminoácido Aspl07, Glulll, Serl04, Glnl20, Glul03, Leul09, Trpll6, y Asn61 de una IL-34 humana. En cualquiera de los aspectos proporcionados arriba, el anticuerpo puede unirse a un epítope que comprende además al menos cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, u ocho, o nueve residuos de aminoácido Prol52, Vall08, LeullO, Glnl06, Glul23, Leul27, Lysll7, Ile60 y Lys55 de una IL-34 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a aminoácidos dentro de las posiciones 55-61, 100-108, 109, 111-127 y 152 de una IL-34 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 inhibe la unión entre IL-34 humana y CSF-1R humano. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 neutraliza la actividad de IL-34 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 se une a un dímero de IL-34 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 se une a un epítope que abarca ambos protómeros de IL-34 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 es un anticuerpo humano, humanizado, o quimérico. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 es un fragmento de anticuerpo que se une a una IL-34 humana. Como se utiliza en la presente, la posición del residuo en la presente corresponde a la posición de residuo en la SEC ID NO: 1.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 que comprende al menos cualquiera de una, dos, tres, cuatro, o cinco, o seis HVRs en cualquier combinación como se muestra en las Figuras 10A y 10B. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 comprende al menos cualquiera de una, dos, tres, cuatro, o cinco, o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-Hl que comprende una secuencia de aminoácidos de STWIH (SEC ID NO: 59) ; (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52) ; (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33); (d) HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ; (e) HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 comprende al menos cualquiera de una, dos, tres, cuatro, o cinco, o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-Hl que comprende una secuencia de aminoácidos STWIH (SEC ID NO: 59) o GFTFSST (SEC ID NO: 30) O SSTWIH (SEC ID NO: 57), (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52) o PYYYY (SEC ID NO: 37) o WVARISPYYYYSD (SEC ID NO: 62) ; (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) o ARGLGKGSKRGAMD (SEC ID NO: 28) ; (d) HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) o STAVAWY (SEC ID NO: 58) (e) HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) O LLIYSASFLY (SEC ID NO: 34); y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos de QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) o QQSFYFPN (SEC ID NO: 38) .

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 comprende al menos cualquiera de una, dos, tres, cuatro, o cinco, o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-Hl que comprende una secuencia de aminoácidos de STWIH (SEC ID NO: 59) ; (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51); (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGA DY (SEC ID NO: 33) ; (d) HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ; (e) HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (f ) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 comprende al menos cualquiera de una, dos, tres, cuatro, o cinco, o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-Hl que comprende una secuencia de aminoácidos STWIH (SEC ID NO: 59) o GFTFSST (SEC ID NO: 30) o SSTWIH (SEC ID NO: 57) (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51) o PYSGY (SEC ID NO: 36) O WVARISPYSGYTN (SEC ID NO: 61) ; (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) o ARGLGKGSKRGAMD - - (SEC ID NO: 28) ; (d) HVR-Ll que comprende una secuencia de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) o STAVAWY (SEC ID NO: 58); (e) HVR-L2 que comprende las secuencias de aminoácidos de SASFLYS (SEC ID NO: 53) o LLIYSASFLY (SEC ID NO: 34) ; y (f ) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) O QQYSDLPY (SEC ID NO: 44) .

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 comprende al menos cualquiera de una, dos, tres, cuatro, cinco, o seis HVRs seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos STWIH (SEC ID NO: 59) ; (b) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52) o RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51) ; (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) o GINQGSKRGA DY (SEC ID NO: 32) ; (d) una HVR-Ll que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ; (e) una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (f ) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) o QQSYTTPPT (SEC ID NO: 43) o QQYTALPYT (SEC ID NO: 49) o QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) o QQYSDVPYT (SEC ID NO: 47) O QQSRTARPT (SEC ID NO: 41) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 comprende (a) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) o GINQGSKRGAMDY (SEC ID NO: 32) ; (b) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) o QQSYTTPPT (SEC ID NO: 43) O QQYTALPYT (SEC ID NO: 49) O QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) O QQYSDVPYT (SEC ID NO: 47) O QQSRTARPT (SEC ID NO: 41); y (c) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52) O RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 comprende al menos cualquiera de una, dos, tres, cuatro, o cinco, o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-Hl que comprende una secuencia de aminoácidos STWIH (SEC ID NO: 59) o GFTFSST (SEC ID NO: 30) o SST IH (SEC ID NO: 57); (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52) o RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51) o PYYYY (SEC ID NO: 37) o PYSGY (SEC ID NO: 36) o VARISPYYYYSD (SEC ID NO: 62) o WVARISPYSGYTN (SEC ID NO: 61) ; y (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) o GINQGSKRGAMDY (SEC ID NO: 32) O ARGLGKGSKRGAMD (SEC ID NO: 28) o ARGINQGSKRGAMD (SEC ID NO: 27); (d) HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) o STAVAWY (SEC ID NO: 58); (e) HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) o LLIYSASFLY (SEC ID NO: 34); y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) o QQSYTTPPT (SEC ID NO : 43) O QQYTALPYT (SEC ID NO: 49) o QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) o QQYSDVPYT (SEC ID NO: 47) o - - QQSRTARPT (SEC ID NO: 41) o QQSFYFPN (SEC ID NO: 38) o QQSYTTPP (SEC ID NO: 42) o QQYTALPY (SEC ID NO: 48) o QQYSDLPY (SEC ID NO: 44) o QQYSDVPY (SEC ID NO: 46) o QQSRTARP (SEC ID NO: 40) .

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 comprende al menos cualquiera de una, dos, tres, cuatro, o cinco, o seis HVRs seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos SNYIH (SEC ID NO: 55) ; (b) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos SITPASGDTDYADSVKG (SEC ID NO: 54) ; (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos SRGAYRFAY (SEC ID NO: 56) ; (d) una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ; (e) una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (f) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSYTTPPT (SEC ID NO: 43) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 comprende (a) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos SRGAYRFAY (SEC ID NO: 56) ; (b) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSYTTPPT (SEC ID NO: 43); y (c) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos SITPASGDTDYADSVKG (SEC ID NO: 54) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 comprende al menos cualquiera de una, dos, tres, cuatro, o cinco, o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos SNYIH (SEC ID NO: 55) o GFTFTSN (SEC ID NO: 31) o TSNYIH (SEC ID NO: 60); (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos SITPASGDTDYADSVKG (SEC ID NO: 54) o PASGD (SEC ID NO: 35) O WVASITPASGDTD (SEC ID NO: 63) ; (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos SRGAYRFAY (SEC ID NO: 56) o ARSRGAYRFA (SEC ID NO: 29) ; (d) HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) o STAVAWY (SEC ID NO: 58) ; (e) HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) O LLIYSASFLY (SEC ID NO: 34); y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSYTTPPT (SEC ID NO: 43) o QQSYTTPP (SEC ID NO: 42) .

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 que comprende al menos una, al menos dos, o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (a) HVR-Hl que comprende una secuencia de aminoácidos STWIH (SEC ID NO: 59) ; (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52) ; (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 comprende HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 comprende (a) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) , y (b) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti- IL-34 comprende (a) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGA DY (SEC ID NO: 33); (b) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) ; y (c) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos ST IH (SEC ID NO: 59) ; (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52) ; y (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33).

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 que comprende al menos una, al menos dos, o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (a) HVR-Ll que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ; (b) HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53); y (c) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) HVR-Ll que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ; (b) HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (c) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) .

En otro aspecto, un anticuerpo anti-IL-34 de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos STWIH (SEC ID NO: 59), (ii) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSV G (SEC ID NO: 52) , y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) ; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) , (ii) HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53), y (iii) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) .

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 que comprende (a) HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos de STWIH (SEC ID NO: 59) ; (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52) ; (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) ; (d) HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ; (e) HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) .

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 que comprende al menos una, al menos dos, o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos ST IH (SEC ID NO: 59) ; (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51) ; (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 comprende HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 comprende (a) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) , y (b) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 comprende (a) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33); (b) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) ; y (c) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos STWIH (SEC ID NO: 59); (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51) ; y (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) .

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 que comprende al menos una, al menos dos, o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50); (b) HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (c) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ; (b) HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (c) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) .

En otro aspecto, un anticuerpo anti-IL-34 de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos STWIH (SEC ID NO: 59) , (ii) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51) , (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) ; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ,- (ii) HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (iii) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) .

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 que comprende (a) HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos STWIH (SEC ID NO: 59) ; (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51); (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) ; (d) HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50); (e) HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) .

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 que comprende (a) HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos SNWIH (SEC ID NO: 79) , (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPNSGYTDYADSVKG (SEC ID NO: 80) ; (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos SMRARRGFDY (SEC ID NO: 81) ; (d) HVR-Ll que comprende una secuencia de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ; (e) HVR-L2 .que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSYTTPPT (SEC ID NO: 43) .

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 derivado de un anticuerpo anti-IL-34 ejemplificado en la presente.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 comprende cualquiera o cualquier combinación de dos, tres, cuatro, cinco, o seis de las siguientes HVRs: HVR-H1: SXiXalH, en donde X1 es N o T, y X2 es Y o W (SEC ID NO: 64) ; HVR-H2 : XiIX^X^XsXeXvXgYADSVKG, en donde ?? es S o R; y X2 es T o S; X3 es A o Y; X4 es S o Y; X5 es G o Y; X6 es D O Y; X7 es T o S; y X8 es D O N (SEC ID NO: 65) ; HVR-H3: SRGAYRFAY (SEC ID NO: 56), O GX1X2X3GSKRGAMDY , en donde Xi es L o I; X2 es G o N; X3 es K o Q (SEC ID NO: 66) ; HVR-L1: RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50); HVR-L2: SASFLYS (SEC ID NO: 53); HVR-L3: QQ X1IX2PX3X4X5XS , en donde Xi es S o Y; y X2 es Y, T, S, F, o R; X3 es T, A, D, o Y; X4 es T, L, V, F, o A; X5 es P O R; X6 es P, Y, O N (SEC ID NO: 67) .

En algunas modalidades, uno o más residuos de aminoácido en HVRs pueden sustituirse . En algunas modalidades, las sustituciones son sustituciones conservadoras, como se proporciona en la presente.

En cualquiera de las modalidades anteriores, se humaniza un anticuerpo anti-IL-34. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-IL-34 comprende HVRs como en cualquiera de las modalidades anteriores, y comprende además una estructura humana de aceptación, por ejemplo, una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura consenso humana. En otra modalidad, un anticuerpo anti-IL-34 comprende HVRs como en cualquiera de las modalidades anteriores, y comprende además un VH que comprende una secuencia FR1 de SEC ID NO: 17, y secuencia FR2 de SEC ID NO: 18, una secuencia FR3 de SEC ID NO: 19, una secuencia FR4 de SEC ID NO: 20 y/o un VL que comprende una secuencia FR1 de SEC ID NO: 21, una secuencia FR2 de SEC ID NO: 22, una secuencia FR3 de SEC ID NO: 23, una secuencia FR4 de SEC ID NO: 24.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-IL-34 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos cualquiera de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, o 100% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 (secuencia de aminoácidos VH de anticuerpo 404.33.56 mostrada en la Figura 10A) . En algunas modalidades, una secuencia VH que tiene al menos cualquiera de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, o 98%, o 99% de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras) , inserciones, o eliminaciones relativas a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-IL-34 que comprende esa secuencia retiene la habilidad de unirse a IL-34. En algunas modalidades, se ha sustituido, insertado y/o eliminado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEC ID NO: 3. En algunas modalidades, las sustituciones, inserciones, o eliminaciones ocurren en regiones fuera de las HVRs (es decir, en FRs) . Opcionalmente, el anticuerpo anti-IL-34 comprende la secuencia VH en la SEC ID NO: 3, incluyendo modificaciones post- raslacionales de esa secuencia. En una modalidad particular, VH comprende una, dos o tres HVRs seleccionadas de: (a) HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos STWIH (SEC ID NO: 59) ; (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52); (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) .

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti- IL-34, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos cualquiera de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, o 100% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4 (secuencia de aminoácidos VL de anticuerpo 404.33.56 mostrada en la Figura 10B) . En algunas modalidades, una secuencia VL que tiene al menos cualquiera de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, o 98%, o 99% de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras) , inserciones, o eliminaciones relativas a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-IL-34 que comprende esa secuencia retiene la habilidad de unirse a IL-34. En algunas modalidades, se ha sustituido, insertado y/o eliminado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEC ID NO: 4. En algunas modalidades, las sustituciones, inserciones, o eliminaciones ocurren en regiones fuera de las HVRs (es decir, en FRs) . Opcionalmente, el anticuerpo anti-IL-34 comprende la secuencia VL en la SEC ID NO: 4, incluyendo modificaciones post-traslacionales de esa secuencia. En una modalidad particular, VL comprende una, dos o tres HVRs seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50); (b) HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (c) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) .

En otro aspecto, un anticuerpo anti-IL-34 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos cualquiera de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, o 100% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 11 (secuencia de aminoácidos VH de anticuerpo 404.33.12 mostrada en la Figura 10A) . En algunas modalidades, una secuencia VH que tiene al menos cualquiera de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, o 98%, o 99% de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras) , inserciones, o eliminaciones relativas a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-IL-34 que comprende esa secuencia retiene la habilidad de unirse a IL-34. En algunas modalidades, se ha sustituido, insertado y/o eliminado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEC ID NO: 11. En algunas modalidades, sustituciones, inserciones, o eliminaciones ocurren en regiones fuera de las HVRs (es decir, en FRs) . Opcionalmente , el anticuerpo anti-IL-34 comprende la secuencia VH en la SEC ID NO: 11, incluyendo modificaciones post-traslacionales de esa secuencia. En una modalidad particular, VH comprende una, dos o tres HVRs seleccionadas de: (a) HVR-Hl que comprende una secuencia de aminoácidos de STWIH (SEC ID NO: 59) ; (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51) ; (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) .

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-IL-34, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos cualquiera de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, O 100% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 12 (secuencia de aminoácidos VL de anticuerpo 404.33.12 mostrada en la Figura 10B) . En algunas modalidades, una secuencia VL que tiene al menos cualquiera de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, O 98%, o 99% de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras) , inserciones, o eliminaciones relativas a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-IL-34 que comprende esa secuencia retiene la habilidad de unirse a IL-34. En algunas modalidades, se ha sustituido, insertado y/o eliminado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEC ID NO: - - 12. En algunas modalidades, las sustituciones, inserciones, o eliminaciones ocurren en regiones fuera de las HVRs (es decir, en FRs) . Opcionalmente, el anticuerpo anti-IL-34 comprende la secuencia VL en la SEC ID NO: 12, incluyendo modificaciones post-traslacionales de esa secuencia. En una modalidad particular, VL comprende una, dos o tres HVRs seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50); (b) HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (c) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) .

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-IL-34, en donde el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de las modalidades proporcionadas arriba, y un VL como en cualquiera de las modalidades proporcionadas arriba. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en la SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4, respectivamente, incluyendo modificaciones post-traslacionales de aquellas secuencias. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en la SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12, respectivamente, incluyendo modificaciones post-traslacionales de aquellas secuencias. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en la SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 6, respectivamente, incluyendo modificaciones post- traslacionales de aquellas secuencias. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en la SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 8, respectivamente, incluyendo modificaciones post-traslacionales de aquellas secuencias. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en la SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10, respectivamente, incluyendo modificaciones post-traslacionales de aquellas secuencias. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en la SEC ID NO: 13 y SEC ID NO: 14, respectivamente, incluyendo modificaciones post-traslacionales de aquellas secuencias. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en la SEC ID NO: 15 y SEC ID NO: 16, respectivamente, incluyendo modificaciones post-traslacionales de aquellas secuencias. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en la SEC ID NO: 77 y SEC ID NO: 78, respectivamente, incluyendo modificaciones post-traslacionales de aquellas secuencias .

En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítope como un anticuerpo anti-IL-34 proporcionado en la presente. Por ejemplo, en algunas modalidades, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítope como un anticuerpo anti-IL-34 seleccionado del anticuerpo anti-IL-34 que comprende una secuencia VH de SEC ID NO: 3 y una secuencia VL de SEC ID NO: 4, un anticuerpo anti-IL-34 que comprende una secuencia VH de SEC ID NO: 11 y una secuencia VL de SEC ID NO: 12, un anticuerpo anti-IL-34 que comprende una secuencia VH de SEC ID NO: 5 y una secuencia VL de SEC ID NO: 6, un anticuerpo anti-IL-34 que comprende una secuencia VH de SEC ID NO: 7 y una secuencia VL de SEC ID NO: 8, un anticuerpo anti-IL-34 que comprende una secuencia VH de SEC ID NO: 9 y una secuencia VL de SEC ID NO: 10, un anticuerpo anti-IL-34 que comprende una secuencia VH de SEC ID NO: 13 y una secuencia VL de SEC ID NO: 14, o un anticuerpo anti-IL-34 que comprende una secuencia VH de SEC ID NO: 15 y una secuencia VL de SEC ID NO: 16. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 se une al mismo epítope como un anticuerpo anti-IL-34 que comprende una secuencia VH de SEC ID NO: 3 y una secuencia VL de SEC ID NO: 4. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 se une al mismo epítope como un anticuerpo anti-IL-34 que comprende una secuencia VH de SEC ID NO: 11 y una secuencia VL de SEC ID NO: 12. En algunas modalidades, el epítope es un epítope conformacional . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-IL-34 se une al mismo epítope como un anticuerpo anti-IL-34 que comprende una secuencia VH de SEC ID NO: 77 y una secuencia VL de SEC ID NO: 78. En algunas modalidades, el epítope es un epítope conformacional . En algunas modalidades, el epítope es un epítope lineal.

En un aspecto adicional de la invención, un anticuerpo anti-IL-34 de acuerdo a cualquiera de las modalidades anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-IL-34 es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab' , scFv, diacuerpo, o F(ab')2- En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo intacto de IgGl o IgG4 u otro isotipo o clase de anticuerpo como se define en la presente.

En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-IL-34 de acuerdo a cualquiera de las modalidades anteriores puede incorporar cualquiera de las características, de manera única o en combinación, como se describe en las Secciones 1-7 abajo: Anticuerpos anti-CSF-lR En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos aislados que se unen a CSF-1R (por ejemplo, CSF-1R humano) . En un aspecto, se proporciona en la presente un anticuerpo anti-CSF-lR, que se une a un epítope que comprende al menos cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, o cinco, o seis de los residuos de aminoácido Argl44, Gln248, Gln249, Ser250, Phe252, y Asn254 de CSF-1R humano. En un aspecto, se proporciona en la presente un anticuerpo anti-CSF-lR, que se une a un epítope que comprende el residuo de aminoácido Argl44 de CSF-1R humano. En un aspecto, se proporciona en la presente un anticuerpo anti-CSF-lR, que se une a un epítope que comprende al menos cualquiera de uno, dos, o tres, o cuatro residuos de aminoácido Argl44, Argl42, Argl46, y Arg250 de CSF-1R humano. El anticuerpo anti-CSF-lR de cualquiera de los aspectos anteriores puede unirse a un epítope que comprende además al menos uno, o dos de los residuos de aminoácido Serl72 y Argl92 de CSF-1R humano. El anticuerpo anti-CSF-lR de cualquiera de los aspectos anteriores puede unirse a un epítope que comprende además al menos cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, o cinco, o seis de los residuos de aminoácido Argl46, Metl49, Argl50, Phel69, Ilel70, y Glnl73 de CSF-1R humano. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CSF-lR se une a aminoácidos dentro de las posiciones 142-150 y 169-172 de CSF-1R. Como se utiliza en la presente, la posición del residuo en la presente corresponde a la posición de residuo en la SEC ID NO: 2. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CSF-lR inhibe la unión entre IL-34 humana y/o CSF-1 humano a CSF-1R humano.

En otro aspecto, se proporciona en la presente un anticuerpo anti-CSF-lR, que se une a un epítope que comprende al menos cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, o cinco, o seis de los residuos de aminoácido Argl44, Gln248, Gln249, Ser250, Phe252, y Asn 254 de CSF-1R humano. En un aspecto, se proporciona en la presente un anticuerpo anti-CSF-lR, que se une a un epítope que comprende al menos cualquiera de uno, dos, tres, o cuatro, o cinco de los residuos de aminoácido Gln248, Gln249, Ser250, Phe252, y Asn254 de CSF-1R humano. En un aspecto, se proporciona en la presente un anticuerpo anti-CSF-lR, que se une a un epítope que comprende al menos cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, o cinco, o seis de los residuos de aminoácido Gln248, Gln249, Ser250, Phe252, Asn254, y Tyr257 de CSF-1R humano. El anticuerpo anti-CSF-lR de cualquiera de los aspectos anteriores puede unirse a un epítope que comprende además al menos uno, al menos dos, o tres de los residuos de aminoácido Pro247, Gln258, y Lys259 de CSF-1R humano. El anticuerpo anti-CSF-lR de cualquiera de los aspectos anteriores puede unirse a un epítope que comprende además al menos uno, al menos dos, o tres de los residuos de aminoácido Val23l, Asp251, y Tyr257 de CSF-1R humano. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CSF-lR se une a aminoácidos dentro de las posiciones 231, 248-252 y 254 de CSF-1R. Como se utiliza en la presente, la posición del residuo en la presente corresponde a la posición de residuo en la SEC ID NO: 2. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CSF-lR inhibe la unión entre IL-34 humana y/o CSF-1 humano a CSF-1R humano.

En un aspecto adicional de la invención, un anticuerpo anti-CSFIR de acuerdo a cualquiera de las modalidades anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunas modalidades, anticuerpo anti-CSF-lR es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab' , scFv, diacuerpo, o F(ab')2- En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo intacto de IgGl o IgG4 u otro isotipo o clase de anticuerpo como se define en la presente.

En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-CSF-lR de acuerdo a cualquiera de las modalidades anteriores puede incorporar cualquiera de las características, de manera única o en combinación, como se describe en las Secciones 1-7 abaj o : Afinidad de Anticuerpo En algunas modalidades, un anticuerpo proporcionado en la presente tiene una constante de disociación (Kd) de < ?µ?, = 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, = 0.1 nM, < 0.01 nM, o = 0.001 nM (por ejemplo, 10~8 M o menor, por ejemplo, de 10"8 M a 10"13 M, por ejemplo, de 10"9 M a 10"13 M) .

En algunas modalidades, Kd se mide por un ensayo de unión de antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno, como se describe por el siguiente ensayo. La afinidad de unión de la solución de Fabs para antígeno se mide al equilibrar Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en la presencia de una serie de valoración de antígeno sin marcar, capturando entonces antígeno unido con una placa revestida con anticuerpo anti-Fab (ver, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas de múltiples cavidades MICROTITER® (Thermo Scientific) se revisten durante la noche con 5 ug/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en 50 mM de carbonato de sodio (pH 9.6), y subsiguientemente se bloquean con 2% (p/v) de albúmina de suero bovino en PBS por dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . En una placa no adsorbente (Nunc #269620) , 100 pM o 26 pM de antígeno [125I] se mezclan con diluciones seriales de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con valoración del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). Fab de interés se incuba entonces durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar por un periodo más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. Después, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, por una hora) . La solución se remueve entonces y la placa se enjuaga ocho veces con 0.1% de polisorbato 20 (TWEEN-20e) en PBS. Cuando las placas se han secado, se agregan 150 µ?/cavidad de abrillantador (MICROSCINT-20 ™; Packard) , y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) por diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual a 20% de unión máxima se eligen para usarse en ensayos de unión competitivos .

De acuerdo a otra modalidad, Kd se mide utilizando ensayos de resonancia de plasmón de superficie utilizando un BIACORE^OOO o un BIACORE ^??? (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antigeno inmovilizado en -10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, chips de biosensor de dextran carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-W - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo a las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con 10 mM de acetato de sodio, pH 4.8, a 5 pg/ml (-0.2 µ?) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, 1 M de etanolamina se inyecta para bloquear grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, diluciones seriales dobles de Fab (0.78 nM a 500 nM) se inyectan en PBS con 0.05% de agente tensoactivo (PBST) polisorbato 20 (TWEEN-20™) a 25°C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Tasas de asociación (^activa) Y tasas de disociación (^inactiva) se calculan utilizando un modelo de unión Langmuir uno a uno simple (BIACORE 8 Evaluation Software versión 3.2) al ajustar simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la proporción kinactiva/kactiva. Ver' Por ejemplo, Chen et al., J. Mol.

Biol. 293 : 865 - 881 ( 1999 ) . Si la tasa activa excede 106 ivr 1 s-l por el ensayo de resonancia de plasmón de superficie de arriba, entonces la tasa activa puede determinarse al utilizar una técnica de revenido fluorescente que mide el incremento o disminución en intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm paso banda) a 25 ° C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7 . 2 , en la presencia de concentraciones crecientes de antígeno según se midió en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con cierre de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro serie 8000 SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

De acuerdo a otra modalidad, Kd se mide utilizando un ensayo BLI, por ejemplo, como se describe en la presente.

Fragmentos de Anticuerpo En algunas modalidades, se proporciona un anticuerpo en la presente un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, y scFv, y otros fragmentos descritos abajo. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpo, ver Hudson et al . Nat. Med. 9 : 129 -134 ( 2003 ) . Para una revisión de fragmentos scFv, ver, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds . , (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); ver también WO 93/16185; y Patentes de EE.UU. Nos. 5,571,894 y 5,587,458. Para discusión de fragmentos Fab y F(ah')2 que comprenden residuos de epítope de unión a receptor de rescate y habiendo incrementado la vida media in vivo, ver Patente de EE.UU. No. 5, 869, 046.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos . Ver, por ejemplo, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden toda o una porción del dominio variable de cadena pesada o toda o una porción del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En algunas modalidades, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA,- ver, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 6,248,516 Bl) .

En algunas modalidades, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una vida media in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, tal un fragmento de anticuerpo puede comprender un brazo de unión a antígeno enlazado a una secuencia Fe capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento. En una modalidad, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo de un brazo como se describe en WO2005/063816. En una modalidad, el anticuerpo de un brazo comprende mutaciones Fe que constituyen "nudos" y "agujeros" como se describe en WO2005/063816.

El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en Pat . de EE.UU. No. 5,641,870. Tales fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos .

Los fragmentos de anticuerpo pueden hacerse por varias técnicas, incluyendo pero no limitándose a digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago) , como se describe en la presente.

Anticuerpos Humanizados y (Quiméricos En algunas modalidades, un anticuerpo proporcionado en la presente es un anticuerpo quimérico. Se describen ciertos anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo, o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "de cambio de clase" en el cual la clase o subclase se ha cambiado de aquella del anticuerpo de origen. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos .

En algunas modalidades, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad a humanos, mientras retiene la especificidad y afinidad del anticuerpo parenteral no humano. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los cuales HVRs, por ejemplo, CDRs, (o porciones de las mismas) se derivan de un anticuerpo no humano, y FRs (o porciones de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante humana. En algunas modalidades, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del cual se derivan los residuos de HVR) , por ejemplo, para restaurar o mejorar la afinidad o especificidad de anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y métodos para hacerlos se revisan, por ejemplo, en Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); Patentes de EE.UU. NOS. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, y 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (describiendo injerto SDR (a-CDR) ) ; Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (describiendo "renovación"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (describiendo "entremezcla FR" ) ; y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cáncer, 83:252-260 (2000) (describiendo el planteamiento de "selección guiada" a entremezcla FR) .

Las regiones de estructura humanas que pueden utilizarse para humanización incluyen pero no se limitan a: regiones de estructura seleccionadas utilizando el método de "más adecuado" (ver, por ejemplo, Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiones de estructura derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena pesada o ligera (ver, por ejemplo, Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993) ) ; regiones de estructura madura humana (somáticamente mutada) o regiones de estructura de línea germinal humana (ver, por ejemplo, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones de estructura derivadas del examen de bibliotecas FR (ver, por ejemplo, Baca et al., J.

Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al . , J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).

Anticuerpos Humanos En algunas modalidades, se proporciona un anticuerpo en la presente un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos pueden producirse utilizando varias técnicas conocidas en la materia. Los anticuerpos humanos se describen generalmente en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

Los anticuerpos humanos pueden prepararse al administrar un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta al estímulo antigénico. Tales animales típicamente contienen toda o una porción de los lugares de inmunoglobulina humana, los cuales reemplazan los lugares de inmunoglobulina endógena, o que están presentes extracromosomalmente o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal . En tales ratones transgénicos , los lugares de inmunoglobulina endógena generalmente se han inactivado. Para la revisión de métodos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, ver Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Ver también, por ejemplo, Patentes de EE.UU. Nos. 6,075,181 y 6,150,584 que describen tecnología XENOMOUSE™; Patente de EE.UU. No. 5,770,429 que describe tecnología HUMAB® ; Patente de EE.UU. No. 7,041,870 que describe tecnología K-M MOUSE®, y Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. No. US 2007/0061900, que describe tecnología VELOCIMOUSE®) . Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generadas por tales animales pueden modificarse además, por ejemplo, al combinar con una región constante humana diferente.

Los anticuerpos humanos también pueden hacerse por métodos a base de hibridoma. Se han descrito líneas celulares de heteromieloma de ratón-humana y mieloma humana para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Ver, por ejemplo, Kozbor J. , Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991). Los anticuerpos humanos generados a través de tecnología de hibridoma de célula B humana también se describen en Li et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los métodos adicionales incluyen aquellos descritos, por ejemplo, en Patente de EE.UU. No. 7,189,826 (describiendo la producción de anticuerpos de IgM humana monoclonal de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4) :265-268 (2006) (describiendo hibridomas humano-humano) . La tecnología de hibridoma humana (tecnología Trioma) también se describe en Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3 ): 927-937 (2005) y Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).

Los anticuerpos humanos también se generan al aislar secuencias de dominio variable de clon Fv seleccionadas de bibliotecas de despliegue de fago derivado de humano. Tales secuencias de dominio variable pueden combinarse entonces con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de bibliotecas de anticuerpo se describen abajo.

Anticuerpos Derivados de Biblioteca Los anticuerpos de la invención pueden aislarse al seleccionar bibliotecas combinatorias para anticuerpos con la actividad deseada o actividades. Por ejemplo, se conoce una variedad de métodos en la materia para generar bibliotecas de despliegue de fago y seleccionar tales bibliotecas para anticuerpos que poseen las características de unión deseadas . Tales métodos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen además, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-528 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004) .

En ciertos métodos de despliegue de fago, los repertorios de genes VH y VL se clonan por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en bibliotecas de fago, que pueden probarse entonces para fago de unión a antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fago típicamente despliega fragmentos de anticuerpo, ya sea como fragmentos Fv de cadena única (scFv) o como fragmentos Fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad al inmunógeno sin el requerimiento de construir hibridomas . Alternativamente, puede clonarse el repertorio simple (por ejemplo, de humano) para proporcionar una fuente única de anticuerpos a un amplio rango de no auto-antígenos y auto-antígenos sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, las bibliotecas simples también pueden hacerse sintéticamente al clonar segmentos de gen V sin reordenar de células madre, y utilizar cebadores PCR que contienen secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para realizar el reordenamiento in vi tro, como se describe por Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen bibliotecas de fago de anticuerpo humano incluyen, por ejemplo: Patente de EE.UU. No. 5,750,373, y Publicaciones de Patente de EE.UU. Nos. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, y 2009/0002360.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de bibliotecas de anticuerpo humano se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en la presente. 6. Anticuerpos Multiespecíficos Anticuerpos biespecíficos Anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para dos antígenos diferentes. En algunas modalidades, los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos humanizados o humanos. En algunas modalidades, una de las especificidades de unión es para IL-34 (por ejemplo, IL-34 humana) y la otra es para cualquier otro antígeno. En algunas modalidades, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos diferentes epítopes de IL-34 (por ejemplo, IL-34 humana) . En algunas modalidades, los anticuerpos biespecíficos comprenden una primera especificidad de unión a IL-34 (por ejemplo, IL-34 humana) y una segunda especificidad de unión a CSF-1 (por ejemplo, CSF-1 humano) . En algunas modalidades, los anticuerpos biespecíficos se unen al mismo epítope en IL-34 como cualquiera de los anticuerpos anti-IL-34 descritos en la presente. En algunas modalidades, los anticuerpos biespecífieos comprenden al menos cualquiera de una, dos, tres, cuatro, o cinco o seis HVRs de cualquiera de los anticuerpos anti-IL-34 descritos en la presente. Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2).

Los métodos para hacer anticuerpos biespecíficos se conocen en la materia. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)). Debido a la selección aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que usualmente se hace por etapas de cromatografía por afinidad, es preferentemente difícil, y los rendimientos del producto son bajos. Se describen procedimientos similares en O 93/08829 publicada el 13 de Mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBOJ. , 10: 3655 (1991) .

De acuerdo a un planteamiento diferente, dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión, por ejemplo, es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la articulación, regiones CH2, y CH3. En algunas modalidades, la primera región constante de cadena pesada (CH1) , que contiene el sitio necesario para unión de cadena ligera, está presente en al menos una de las fusiones. ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfecta en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona mayor flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de péptido en modalidades cuando las proporciones no iguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Es, sin embargo, posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales resulta en altos rendimientos y cuando las proporciones son de significado no particular.

En algunas modalidades de este planteamiento, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (proporcionando una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseada, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solamente una mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera fácil de separación. Este planteamiento se describe en WO 94/04690. Para detalles adicionales para generar anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acuerdo a otro planteamiento, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede diseñarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de cultivo celular recombinante . La interfase comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más largas (por ejemplo, tirosina o triptofan) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena (s) lateral (es) grande (s) se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar cadenas laterales de aminoácido grandes con pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros .

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos "heteroconjugados" o reticulados. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heterocon ugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir las células del sistema inmune a células no deseadas (Patente de EE.UU. No. 4,676,980), y para tratamiento de infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/00373, y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados pueden hacerse utilizando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados se conocen bien en la materia, y se describen en la Patente de EE.UU. No. 4,676,980, junto con un número de técnicas de reticulación.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse utilizando enlace químico. Brennan et al., Science 229: 81 (1985) describe un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se parten proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2'. Estos fragmentos se reducen en la - - presencia de la arsenita de sodio del agente de composición ditiol para estabilizar los ditioles próximos y prevenir la formación intermolecular de disulfuro. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados de Fab' -TNB se reconvierten entonces en Fab' -tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecífieos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab' -SH de E. coli, que pueden acoplarse de manera química para formar anticuerpos biespecíficos . Shalaby et al., J. Exp. Med. , 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')2 biespecífica de anticuerpo completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó por separado de E. coli y se somete a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico de esta manera formado fue capaz de unirse a células que sobreexpresan el receptor HER2 y células T de humano normales, así como activar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumor de mama de humano .

- - También se han descrito varias técnicas para hacer y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente de cultivo celular recombinante . Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se han producido utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazan a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión de gen. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región de articulación para formar monómeros y después re-oxidarse para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para hacer fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con lo anterior, se forzan los dominios VH y VL de un fragmento para emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión a antígeno. Otra estrategia para hacer fragmentos de anticuerpo biespecífico por el uso de dímeros Fv de cadena única también se ha reportado. Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

De acuerdo a una modalidad, un polipéptido que comprende un dominio de unión a antígeno de esta invención comprende un dominio de heterodimerización. Como se utiliza en la presente, "dominio de heteromultimerización" se refiere a alteraciones o adiciones a una molécula biológica para promover la formación de heteromultímero y dificultar la formación de homomultímero. Cualquier dominio de heterodimerización que tiene una fuerte preferencia para formar heterodímeros sobre homodímeros está dentro del alcance de la invención. Los ejemplos ilustrativos incluyen pero no se limitan a, por ejemplo, Solicitud de Patente de EE.UU. 20030078385 (Arathoon et al.; que describen nudo en agujeros); WO2007147901 (Kjaergaard et al.; que describen interacciones iónicas); WO 2009089004 (Kannan et al.; que describen efectos de dirección electroestática) ; WO2011/034605 (Christensen et al.; que describen bucles en espiral) . Ver también, por ejemplo, Pack, P. & Plueckthun, A., Biochemistry 31, 1579-1584 (1992) que describe cremallera de leucina o Pack et al., Bio/Technology 11, 1271-1277 (1993) que describen el motivo de hélice-vuelta-hélice. La frase "dominio de heteromultimerización" y "dominio de heterodimerización" se utilizan de manera intercambiable en la presente.

El término "nodo en agujero" o tecnología "KnH" como se menciona en la presente se refiere a la tecnología que dirige el emparejamiento de dos polipéptidos juntos in vitro o in vivo al introducir una protuberancia (nodo) en un polipéptido y una cavidad (agujero) en el otro polipéptido en una interfase en la cual interactúan. Por ejemplo, KnHs se han introducido en las interfases de unión Fc:Fc, interfaces CL:CH1 o interfases VH/VL de anticuerpos (por ejemplo, US2007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431and Zhu et al. (1997) Protein Science 6:781-788).

Las técnicas adicionales para hacer anticuerpos multiespecífieos, por ejemplo, biespecífieos incluyen, pero no se limitan a, ingeniería de "nudo en agujero" (ver, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 5,731,168), ingeniería utilizando efectos de dirección electroestática para hacer moléculas de heterodiméricas de Fe anticuerpo (WO 2009/089004A1) .

Se contemplan los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos . Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

Los anticuerpos diseñados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo "anticuerpos de Pulpo," también se incluyen en la presente (ver, por ejemplo, US 2006/0025576A1) .

El anticuerpo o fragmento en la presente también incluye un "FAb de Acción Doble" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a IL-34 así como otro antígeno diferente (por ejemplo, CSF-1) (ver, US2008/0069820, por ejemplo) . 7. Variantes de Anticuerpo En algunas modalidades, se contemplan las variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en la presente. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo pueden prepararse al introducir modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica para el anticuerpo, o por síntesis de péptido. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidoss del anticuerpo. Puede hacerse cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.

Variantes de Sustitución, Inserción, y Eliminación En algunas modalidades, se proporcionan las variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones de aminoácido. Los sitios de interés para mutagénesis sustitucional incluyen HVRs y FRs . Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones conservadoras." Los cambios más sustanciales se proporcionan en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones ejemplificativas, " y como se describe además abajo con referencia a las clases de cadena lateral de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácido pueden introducirse en un anticuerpo de interés y los productos seleccionados para una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno retenida/mejorada, inmunogenicidad disminuida, o CDS o ADCC mejorada.

TABLA. 1 Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo a propiedades de la cadena lateral común: (1) hidrofóbicos : Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, He ; (2) hidrofxlicos neutrales: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg,- (5) residuos que influencian la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases para otra clase .

Un tipo de variante sustitucional incluye sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo de origen (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) . Generalmente, la(s) variante (s) resultante (s) seleccionada (s) para estudio adicional tendr (n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en ciertas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad incrementada, inmunogenicidad reducida) relativas al anticuerpo de origen y/o tendrán ciertas propiedades biológicas sustancialmente retenidas del anticuerpo de origen. Una variante sustitucional ejemplificativa es un anticuerpo madurado por afinidad, que puede generarse convencionalmente, por ejemplo, utilizando técnicas de maduración por afinidad en base a despliegue de fago tales como aquellas descritas la presente. Brevemente, uno o más residuos de HVR se mutan y los anticuerpos variantes se despliegan en fago y seleccionan para una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión) .

Las alteraciones (por ejemplo, sustituciones) pueden hacerse en HVRs, por ejemplo, para mejorar la afinidad de anticuerpo. Tales alteraciones pueden hacerse en "áreas de conflicto" de HVR, es decir, residuos codificados por codones que experimentan mutación a alta frecuencia durante el proceso de maduración somático (ver, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol . 207:179-196 (2008)), y/o SDRs (a-CDRs) , con VH o VL variante resultante probándose para afinidad de unión. Se ha descrito la maduración por afinidad al construir y volver a seleccionar de bibliotecas secundarias, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed. , Human Press, Totowa, NJ, (2001) . ) En algunas modalidades de maduración por afinidad, se introduce la diversidad en los genes variables elegidos para maduración por cualquiera de una variedad de métodos (por ejemplo, PCR propensa a error, cambio de cadena, o mutagénesis dirigida a oligonucleótido) . Se crea entonces una biblioteca secundaria. La biblioteca se selecciona entonces para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad incluye planteamientos dirigidos a HVR, en los cuales se aleatorizan los varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez) . Los residuos de HVR incluidos en unión a antígeno pueden identificarse específicamente, por ejemplo, utilizando modelado o mutagénesis de exploración de alanina. Con frecuencia nos enfocamos en CDR-H3 y CDR-L3 en particular.

En algunas modalidades, sustituciones, inserciones, o eliminaciones pueden ocurrir dentro de una o más HVRs siempre que tales alteraciones no reduzcan sustancialmente la habilidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, las alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporcionan en la presente) que no reducen sustancialraente la afinidad de unión pueden hacerse en HVRs . Tales alteraciones pueden estar fuera de las "áreas de conflicto" de HVR o SDRs . En algunas modalidades de las secuencias VH y VL variantes proporcionadas arriba, cada HVR ya sea no se altera, o no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácido.

Un método útil para identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que pueden tenerse como objetivo para mutagénesis se llama "mutagénesis de exploración de alanina" como se describe por Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, un residuo o grupo de residuos objetivo (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) se identifican y reemplazan por un aminoácido neutral o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si se afecta la interacción del anticuerpo con antigeno. Las sustituciones adicionales pueden introducirse en las ubicaciones de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. Alternativa, o adicionalmente, una estructura de cristal de un compuesto antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y antígeno. Tales residuos de contrato y residuos próximos pueden tenerse como objetivo o eliminarse como candidatos para sustitución. Las variantes pueden probarse para determinar si contienen las propiedades deseadas .

Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones de amino- y/o carboxilo-terminal que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones de intrasecuencia de residuos de aminoácido únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionil N-terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión de la N- o C-terminal del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la vida media en suero del anticuerpo Variantes de glicosilación En algunas modalidades, un anticuerpo proporcionado en la presente se altera para incrementar o disminuir el grado al cual se glicosila el anticuerpo. La adición o eliminación de sitios de glicosilación a un anticuerpo puede realizarse convenientemente al alterar la secuencia de aminoácidos de modo que se crea o remueve uno o más sitios de glicosilación.

Donde el anticuerpo comprende una región Fe, puede alterarse el carbohidrato unido al mismo. Los anticuerpos nativos producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario, ramificado que generalmente se une por un N-enlace a Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Ver, por ejemplo, Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir varios carbohidratos, por ejemplo, mañosa, glucosamina de N-acetil (GlcNAc) , galactosa, y ácido siálico, así como una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenaria. En algunas modalidades, pueden hacerse las modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención para crear variantes de anticuerpo con ciertas propiedades mejoradas.

En algunas modalidades, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fe. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en tal anticuerpo puede ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% o de 20% a 40%. La cantidad de fucosa se determina al calcular la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, relativa a la suma de todas las glicoestructuras unidas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y ricas en mañosa) según se midió por espectrometría de masa MALDI-TOF, como se describe en WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina ubicado en aproximadamente la posición 297 en la región Fe (numeración de EE.UU. de los residuos de región Fe) ,- sin embargo, Asn297 también puede ubicarse aproximadamente ± 3 aminoácidos corriente arriba o corriente abajo en la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones menores de secuencia en anticuerpos. Tales variantes de fucosilación pueden tener función de ADCC mejorada. Ver, por ejemplo, Publicaciones de Patente de EE.UU. Nos. US 2003/0157108 (Presta, L.); U.S. 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co. , Ltd) . Ejemplos de publicaciones relacionadas a variantes de anticuerpo "defucosilado" o "deficient en fucosa" incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742 ; WO2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) . Ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos defucosilados incluyen células CHO Lecl3 deficientes en fucosilación de proteína (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Sol. De Pat . De EE.UU. No US 2003/0157108 Al, Presta, L; y WO 2004/056312 Al, Adams et al., Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 66: 213-221 (2010), especialmente en el Ejemplo 11) , y líneas celulares bloqueadas, tal como gen alfa-l , 6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO bloqueadas (ver, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol . Bioeng. , 94(4): 680-688 (2006) ; y WO2003/085107) .

Las variantes de anticuerpo se proporcionan además con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en los cuales un oligosacárido biantenario unido a la región Fe del anticuerpo se biseca por GlcNAc. Tales variantes de anticuerpo pueden tener fucosilación reducida y/o función de ADCC mejorada. Se describen los ejemplos de tales variantes de anticuerpo, por ejemplo, en wo 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Patente de EE.UU. No. 6,602,684 (Umana et al.); y US 2005/0123546 (Umana et al . ) . También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fe. Tales variantes de anticuerpo pueden tener función CDC mejorada. Se describen tales variantes de anticuerpo, por ejemplo, en WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).

Variantes de región Fe En algunas modalidades, una o más modificaciones de aminoácido pueden introducirse en la región Fe de un anticuerpo proporcionado en la presente, generando así una variante de región Fe . La variante de región Fe puede comprender una secuencia de región Fe humana (por ejemplo, una región Fe de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácido.

En algunas modalidades, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, que la hace un candidato deseable para aplicaciones en las cuales la vida media del anticuerpo in vivo es importante ya que ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o dañinas . Los ensayos de citotoxicidad in vi tro y/o in vivo pueden conducirse para confirmar la reducción/eliminación de actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, los ensayos de unión al receptor Fe (FcR) pueden conducirse para asegurar que el anticuerpo carece de unión FcyR (por lo tanto, probablemente careciendo de actividad de ADCC) , pero retiene habilidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan solamente FcyRIII, mientras los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991) . Los ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para valorar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describe en la Patente de EE.UU. No. 5,500,362 (ver, por ejemplo, Hellstrom, I. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (ver Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativamente, pueden emplearse los métodos de ensayo no radiactivos (ver, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radioactiva ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y ensayo de citotoxicidad no radioactiva CytoTox 96® (Promega, Madison, WI) . Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células Asesinas Naturales (NK) . Alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede valorarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como aquel descrito en Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Los ensayos de unión Clq también pueden llevarse a cabo para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse a Clq y por lo tanto carece de actividad CDC. Ver, por ejemplo, ELISA de unión a Clq y C3c en WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para valorar la activación completa, puede realizarse un ensayo CDC (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). La unión a FcRn y determinaciones de liberación/vida media in vivo también pueden realizarse utilizando métodos conocidos en la materia (ver, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18 (12) : 1759-1769 (2006) ) .

Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más residuos de región Fe 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (Patente de EE.UU. No. 6,737,056). Tales imitantes Fe incluyen mutantes Fe con sustituciones en dos o más posiciones de aminoácido 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el así llamado mutante Fe "DANA" con sustitución de residuos 265 y 297 por alanina (Patente de EE.UU. No. 7,332,581).

Se describen ciertas variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a FcRs. (Ver, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 6,737,056; WO 2004/056312, y Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)).

En algunas modalidades, se hacen alteraciones en la región Fe que resultan en unión a Clq alterada (es decir, ya sea mejorada o disminuida) y/o Citotoxicidad Dependiente Complementaria (CDC) , por ejemplo, como se describe en Patente de EE.UU. No. 6,194,551, WO 99/51642, y Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Los anticuerpos con vidas medias incrementadas y unión mejorada al receptor Fe neonatal (FcRn) , que es responsable de la transferencia de IgGs maternales al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Aquellos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fe a FcRn. Tales variantes Fe incluyen aquellas con sustituciones en uno o más residuos de región Fe: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución de residuo de región Fe 434 (Patente de EE.UU. No. 7,371, 826) .

Ver también Duncan et al., Nature 322:738-40 (1988); Patente de EE.UU. No. 5,648,260; Patente de EE.UU. No. 5,624,821; y WO 94/29351 que concierne a otros ejemplos de variantes de región Fe .

Variantes de anticuerpo diseñados por cisteina En algunas modalidades, puede ser deseable crear anticuerpos diseñados por cisteina, por ejemplo, "thioMAbs , " en los cuales uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteina. En modalidades particulares, los residuos sustituidos ocurren en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir aquellos residuos con cisteina, los grupos tiol reactivos se posicionan así en sitios accesibles del anticuerpo y pueden utilizarse para conjugar el anticuerpo con otras porciones, tales como porciones de fármaco o porciones de enlazador-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe además en la presente. En algunas modalidades, cualquiera o más de los siguientes residuos pueden sustituirse con cisteina: V205 (numeración Kabat) de the cadena ligera; A118 (numeración de EE.UU.) de la cadena pesada,- y S400 (numeración de EE.UU.) de la región Fe de cadena pesada. Los anticuerpos diseñados por cisteína pueden generarse como se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. No. 7,521,541.

Derivados de Anticuerpo En algunas modalidades, un anticuerpo proporcionado en la presente puede modificarse además para contener porciones no proteínicas adicionales que se conocen en la materia y están fácilmente disponibles. Las porciones adecuadas para derivatización del anticuerpo incluyen pero no se limitan a polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG) , copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextran, alcohol polivinílico, pirrolidona polivinílica, poli-1, 3-dioxolano, poli-1, 3 , 6-trioxano, copolímero de etileno/andhídrido maléico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios) , y dextran o poli (pirrolidona de n-vinil) olietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, co-polímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) , alcohol polivinílico, y mezclas de los mismos. Propionaldehído de polietilenglicol pueden tener ventajas en la elaboración debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unido al anticuerpo puede variar, y si más de un polímero se une, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros utilizados para derivatización pueden determinarse en base a consideraciones incluyendo pero no limitándose a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo a mejorarse, si el derivado de anticuerpo se utilizará en una terapia bajo condiciones definidas, etc.

En otra modalidad, se proporcionan los conjugados de un anticuerpo y porción no proteínica que pueden calentarse selectivamente por exposición a radiación. En algunas modalidades, la porción no proteínica es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan las células ordinarias, pero que calientan la porción proteínica a una temperatura a la cual se asesinan las células próximas a la porción no proteínica de anticuerpo.

Composiciones y Métodos Recombinan es Los anticuerpos pueden producirse utilizando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en Patente de EE.UU. No. 4,816,567. En algunas modalidades, se proporciona el ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-IL-34, un anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l o un anticuerpo anti-CSF-lR descrito en la presente. Tal ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo) . En algunas modalidades, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden tal ácido nucleico. En algunas modalidades, se proporciona una célula huésped que comprende tal ácido nucleico. En algunas modalidades, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con) : (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En algunas modalidades, la célula huésped es eucariótica, por ejemplo, una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO) o célula linfoide (por ejemplo, célula YO, NSO, Sp20 cell) . En algunas modalidades, se proporciona un método para hacer un anticuerpo anti-IL-34, un anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l o un anticuerpo anti-CSF-lR , en donde el método comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, como se proporciona arriba, bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de célula huésped) .

Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-IL-34, un anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l o un anticuerpo anti-CSF-lR, ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describe arriba, se aisla e inserta en uno o más vectores para clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Tal ácido nucleico puede aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo) .

Las células huésped adecuadas para clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo incluyen células procarióticas o eucarióticas descritas en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse en bacterias, en particular cuando no son necesarias la glicosilación y función efectora Fe. Para expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacteria, ver, por ejemplo, Patentes de EE.UU. Nos. 5,648,237, 5,789,199, y 5,840,523. (Ver también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed. , Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describen la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli.). Después de la expresión, el anticuerpo puede aislarse de la pasta celular bacterial en una fracción soluble y puede purificarse además.

Además de las procariotas, los microbios eucarióticos tales como levadura u hongos filamentosos son huéspedes de expresión o clonación adecuados para vectores que codifican el anticuerpo, incluyendo cepas de levadura y hongos cuyas trayectorias de glicosilación se han "humanizado" , resultando en la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcial o completamente humano. Ver Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpo glicosilado también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados) . Ejemplos de células invertebradas incluyen células de insecto y planta. Se han identificado numerosas cepas baculovirales que pueden utilizarse junto células de insecto, particularmente para transfeccion de células Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de célula de planta también pueden utilizarse como huéspedes. Ver, por ejemplo. Patentes de EE.UU. Nos. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, y 6,417,429 (que describen tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas) .

Las células vertebradas también pueden utilizarse como huéspedes. Por ejemplo, las líneas celulares de mamífero que se adaptan para crecer en suspensión pueden ser útiles. Otros ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7) ; línea de riñon embriónica de humano (293 o 293 células como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK) ; células de sertoilo de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1) ; células de riñon de mono verde africano (VERO- 76) ; células de carcinoma cervical de humano (HELA) ; células de riñón canino (MDCK; células de hígado de rata buffalo (BRL 3A) ; células de pulmón de humano (W138) ; células de hígado de humano (Hep G2) ; tumor mamario de ratón (M T 060562) ; células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; y células FS4. Otras líneas celulares huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) , incluyendo células CHO DHFR" (Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como YO, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de ciertas líneas celulares huésped de mamífero para producción de anticuerpo, ver, por ejemplo, Yazaki and u, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed. , Humana Press, Totowa, NJ) , pp. 255-268 (2003) .

Ensayos Los anticuerpos anti-IL-34, anticuerpos biespecíficos anti-IL-34/CSF-l y anticuerpos anti-CSF-lR proporcionados en la presente pueden identificarse, probarse, o caracterizarse por sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por varios ensayos conocidos en la materia .

Ensayos de unión y otros ensayos En un aspecto, un anticuerpo de la invención se prueba por su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, por métodos conocidos tales como ELISA, Western blot, etc.

En otro aspecto, los ensayos de competición pueden utilizarse para identificar un anticuerpo anti-IL-34 o un anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l que compite con, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-34 descrito en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos que compiten con un anticuerpo anti-IL-34 comprendiendo una secuencia VH de SEC ID NO: 5 y una secuencia VL de SEC ID NO: 6 para unión a IL-34. En algunas modalidades, tal un anticuerpo de competición se une al mismo epítope (por ejemplo, un epítope lineal o uno conformación) que se une mediante, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-34 que comprende una secuencia VH de SEC ID NO: 5 y una secuencia VL de SEC ID NO: 6. Los métodos ejemplificativos detallados para trazar un epítope al cual se une un anticuerpo, se proporcionan en Morris (1996) "Epitope - - Mapping Protocols," en Methods in Molecular Biology vol . 66 (Humana Press, Totowa, NJ) .

En un ensayo de competición ejemplificativo, IL-34 inmovilizado se incuba en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a IL-34 (por ejemplo, un anticuerpo anti- IL-34 que comprende una secuencia VH de SEC ID NO: 5 y una secuencia VL de SEC ID NO: 6) y un segundo anticuerpo no marcado que se está probando por su habilidad para competir con el primer anticuerpo para unión a IL-34. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante hibridoma. Como un control, IL-34 inmovilizado se incuba en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación bajo condiciones permisibles para unión del primer anticuerpo a IL-34, se remueve el anticuerpo no unido en exceso, y se mide la cantidad de marca asociada con IL-34 inmovilizado. Si la cantidad de marca asociada con IL-34 inmovilizado se reduce sustancialmente en la muestra de prueba relativa a la muestra de control, entonces esa indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el anticuerpo para unión a IL-34. Ver Harlow and Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) .

En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-IL-34, anticuerpos biespecíficos anti-IL-34/CSF-l o anti-anticuerpos CSF1R que tienen actividades biológicas. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, inhibición de proliferación de células mononucleares de sangre periférica de humano (PB Cs) , inhibición de unión de IL-34 a CSF-1R, o inhibición de unión de CSF-1 a CSF-1R. También se proporcionan los anticuerpos que tienen tal actividad biológica in vivo y/o in vitro.

En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención se prueba por tal actividad biológica. Por ejemplo, la actividad neutralizante de un anticuerpo anti-IL-34, un anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l o anticuerpo anti-CSF-lR puede medirse utilizando un ensayo de proliferación celular por CellTiter-Glo . hIL-34 o mIL-34 se combina con diluciones seriales de mAbs anti-IL-34, anticuerpos biespecíficos anti-IL-34/CSF-l o anticuerpos anti-CSFl antes de agregar sobre las células, tales como células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) . La actividad de inhibición del anticuerpo se obtiene al medir RLU después de incubar las placas a 37 °C por 72 horas. La Concentración Inhibidora Máxima Media (IC50) , definida como la concentración de anticuerpo requerido para producir inhibición máxima media de actividad de IL-34 en células, cuando IL-34 está presente a una concentración para producir 70-80% de respuesta de proliferación, puede calcularse con KaleidaGraph.

La inhibición de unión de IL-34 o CSF-1 a CSF-1R por un anticuerpo proporcionado en la presente puede probarse en ensayos ELISA utilizando IL-34 inmovilizado o CSF-1 y CSF-1R soluble en la presencia de dilución serial del anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-34, anticuerpo biespecífico IL-34/CSF-1 o anticuerpo anti-CSF-1.

Métodos y Composiciones para Diagnóstico y Detección En algunas modalidades, cualquiera de los anticuerpos anti-IL-34 y anti-CSF-lR proporcionados en la presente es útil para detectar la presencia de IL-34 o CSF-1R en una muestra biológica. El término "detectar" como se utiliza en la presente comprende detección cuantitativa o cualitativa. En algunas modalidades, una muestra biológica comprende una célula o tejido.

En algunas modalidades, se proporcionan anticuerpos anti-IL-34 para usarse en un método de diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar la presencia de IL-34 en una muestra biológica. En algunas modalidades, el método comprende contactar la muestra biológica con un anticuerpo anti-IL-34 como se describe en la presente bajo condiciones permisivas para la unión de anticuerpo anti-IL-34 a IL-34, y detectar si se forma un compuesto entre el anticuerpo anti-IL-34 e IL-34. Tal método puede ser un método in vitro o in vivo. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-IL-34 se utiliza para seleccionar sujetos elegibles para terapia con un anticuerpo anti-IL-34, por ejemplo, donde IL-34 es un biomarcador para selección de pacientes.

En algunas modalidades, se proporciona los anticuerpos anti-CSF-lR para usarse en un método de diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar la presencia de CSF-1R en una muestra biológica. En algunas modalidades, el método comprende contactar la muestra biológica con un anticuerpo anti-CSF-lR como se describe en la presente bajo condiciones permisivas para unir el anticuerpo anti-CSF-lR a CSF-1R, y detectar si se forma un compuesto entre el anticuerpo anti-CSF-1R y CSF-1R. Tal método puede ser un método in vitro o in vivo. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CSF-lR se utiliza para seleccionar sujetos elegibles para terapia con un anticuerpo anti-CSF-lR, por ejemplo, donde CSF-1R es un biomarcador para selección de pacientes .

Los trastornos ejemplificativos que pueden diagnosticarse utilizando un anticuerpo de la invención incluyen enfermedades inmunológicas patogénicas mieloides tales como artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, o esclerosis múltiple.

En algunas modalidades, se proporcionan anticuerpos anti-IL-34 y anti-CSF-lR marcados. Las marcas incluyen, pero no se limitan a, marcas o porciones que se detectan directamente (tal como marcas fluorescentes, cromofóricas , densas por electrón, quimioluminescente, y radioactivas) , así como porciones, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Las marcas ejemplificativas incluyen, pero no se limitan a, los radioisótipos 32P, 14C, 125I, 3H, y 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierra rara o floresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacterial (Patente de EE.UU. No. 4,737,456), luciferina, 2, 3-dihidroeftalazinadionas, peroxidasa de rábano picante (HRP) , fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacárido, por ejemplo, oxidasa de glucosa, oxidasa de galactosa, y dehidrogenasa de glucosa-6-fosfato, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y oxidasa de xantina, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidizar un precursor de tinta tal como HRP, lactoperoxidasa, o microperoxidasa, biotina/avidina, sondas radicales, marcas de bacteriófago, radicales libres estables, y lo similar.

Biomarcadores para Subtipos Mieloide y Fibrioide En una modalidad, los pacientes con AR a tratarse con un inhibidor de la trayectoria de CSF1-R son aquellos pacientes que corresponden a los subtipos Mieloide o Fibroide (Fl y/o F2) de RA. En ciertas modalidades, un agente terapéutico subtipo M se selecciona de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 6 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, un agente terapéutico subtipo M se selecciona de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 2 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, un agente terapéutico subtipo M se selecciona de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 11 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, un agente terapéutico subtipo M se selecciona de una o una combinación de proteínas codificadas por uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 6 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, un agente terapéutico subtipo se selecciona de una o una combinación de proteínas codificadas por uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 2 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, un agente terapéutico subtipo se selecciona de una o una combinación de proteínas codificadas por uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 11 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, un objetivo terapéutico de subtipo M de AR se selecciona de uno o más de CLEC5A, CLEC7A, ALCAM, IL1RAP, IRAK1, NRP2 , TREMI, y VEGF.

En otro aspecto, métodos para diagnosticar un cierto subtipo de AR, descrito en la presente como el subtipo M, comprenden medir la expresión genética de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 6 de WO2011/028945 , o medir la cantidad de proteína expresada por - - uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 6 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, uno o más de los genes identificados en la Tabla 6 de WO2011/028945 , o proteínas codificadas por dichos genes, son biomarcadores del subtipo M. En ciertas modalidades, métodos para diagnosticar subtipo M de AR comprenden medir la expresión genética de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 2 de WO2011/028945, o medir la proteína expresada por uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 2 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, uno o más de los genes identificados en la Tabla 2 de WO2011/028945 , o proteínas codificadas por dichos genes, son biomarcadores del subtipo M. En ciertas modalidades, métodos para diagnosticar subtipo M de AR comprenden medir la expresión genética de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 11 de WO2011/028945, o medir la proteína expresada por uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 11 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, uno o más de los genes identificados en la Tabla 11 de WO2011/028945 , o proteínas codificadas por dichos genes, son biomarcadores del subtipo M. En ciertas modalidades, métodos para diagnosticar subtipo M de RA comprenden medir la expresión genética o expresión de proteína de uno o más de ADAM8, CTSB, CXCL3 , ICAM1, IL18BP, IL1B, IL8 , MMP12, CCL2 , VEGFA, y S100A11.

En ciertas modalidades, un agente terapéutico subtipo F2 se selecciona de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 7 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, un agente terapéutico subtipo F2 se selecciona de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 3 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, un agente terapéutico subtipo F2 se selecciona de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 12 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, un agente terapéutico subtipo F2 se selecciona de una o una combinación de proteínas codificadas por uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 7 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, un agente terapéutico subtipo F2 se selecciona de una o una combinación de proteínas codificadas por uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 3 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, un agente terapéutico subtipo F2 se selecciona de una o una combinación de proteínas codificadas por uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 12 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, un objetivo terapéutico de subtipo F2 de RA se selecciona de uno o más de IL17D, IL17RC, TIMP3 , y TNFRSF11B .

En otro aspecto, métodos para diagnosticar un cierto subtipo de RA, descrito en la presente como el subtipo F2, comprenden medir la expresión genética de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 7 de WO2011/028945, o medir la proteína expresada por uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 7 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, uno o más de los genes identificados en la Tabla 7 de WO2011/028945 , o proteínas codificadas por dichos genes, son biomarcadores del subtipo F2. En ciertas modalidades, métodos para diagnosticar subtipo F2 de AR comprenden medir la expresión genética de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 3 de WO2011/028945 , o medir la proteína expresada por uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 3. En ciertas modalidades, uno o más de los genes identificados en la Tabla 3 de WO2011/028945 , o proteínas codificadas por dichos genes, son biomarcadores del subtipo F2. En ciertas modalidades, métodos para diagnosticar subtipo F2 de AR comprenden medir la expresión genética de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 12 de WO2011/028945, o medir la proteína expresada por uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 12 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, uno o más de los genes identificados en la Tabla 12 de WO2011/028945 , o proteínas codificadas por dichos genes, son biomarcadores del subtipo F2. En ciertas modalidades, métodos para diagnosticar F2 subtipo de AR comprenden medir la expresión genética o expresión de proteína de uno o más de FGF10, FGF18 , FGF2 , LRP6 , TGFbeta2f W T11, ???6 , BTC, CLU, CRLF1 , ????3, FZD10 , FZD7 , FZD8 , y IL17D.

En ciertas modalidades, un objetivo terapéutico de subtipo Fl se selecciona de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 8 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, un objetivo terapéutico de subtipo Fl se selecciona de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 4 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, un objetivo terapéutico de subtipo Fl se selecciona de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 13 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, un objetivo terapéutico de subtipo Fl se selecciona de una o una combinación de proteínas codificadas por uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 8 de O2011/028945. En ciertas modalidades, un objetivo terapéutico de subtipo Fl se selecciona de una o una combinación de proteínas codificadas por uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 4 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, un objetivo terapéutico de subtipo Fl se selecciona de una o una combinación de proteínas codificadas por uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 13 de O2011/028945. En ciertas modalidades, un objetivo terapéutico de subtipo Fl de AR se selecciona de uno o más de CDH11, ITGA11, y CLEC11A.

En otro aspecto, métodos para diagnosticar un cierto subtipo de RA, descrito en la presente como el subtipo Fl, comprenden medir la expresión genética de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 8 de O2011/028945 , o medir la proteína expresada por uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 8 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, uno o más de los genes identificados en la Tabla 8 de WO2011/028945 , o proteínas codificadas por dichos genes, son biomarcadores del subtipo Fl. En ciertas modalidades, métodos para diagnosticar subtipo Fl de AR comprenden medir la expresión genética de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 4 de WO2011/028945 , o medir la proteína expresada por uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 4 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, uno o más de los genes identificados en la Tabla 4 de WO2011/028945 , o proteínas codificadas por dichos genes, son biomarcadores del subtipo Fl . En ciertas modalidades, métodos para diagnosticar subtipo Fl de AR comprenden medir la expresión genética de uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 13 de WO2011/028945 , o medir la proteína expresada por uno o una combinación de genes enlistados en la Tabla 13 de WO2011/028945. En ciertas modalidades, uno o más de los genes identificados en la Tabla 13, o proteínas codificadas por dichos genes, son biomarcadores del subtipo Fl . En ciertas modalidades, métodos para diagnosticar Fl subtipo de AR comprenden medir la expresión genética o expresión de proteína de uno o más de ITGA11, MMP11, MMP13, MMP16, MMP28, ADAM12, ADAM22, CTSK, CTHRC1, ENPEP, POSTN, ANGPT2 , SFRP2 , TIE1, y VWF.

Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-IL-34, un anticuerpo biespecífico anti-lL-34/CSF-l, o un anticuerpo anti-CSF-lR como se describe en la presente se preparan al mezclar tal anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales [Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) ) , en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables generalmente son no tóxicos a recipientes en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no se limitan a: tampón químicos tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de amonio de octadecildimetilbencilo; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol de butilo o bencilo; parabenos de alquilo tales como parabeno de metilo o propilo; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menor a aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílieos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; azúcares tales como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tal como sodio; compuestos de metal (por ejemplo, compuesto de proteína Zn) ; y/o agentes tensoactivos no iónicos tal como polietilenglicol (PEG) . Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplificativos en la presente incluyen además agentes de dispersión de fármaco intersticial tales como glicoproteínas de hialuronidasa activas neutrales, solubles (sHASEGP) , por ejemplo, glicoproteínas de hialuronidasa PH-20 solubles de humano, tal como rHuPH20 (HYLENEX*, Baxter International, Inc.). Ciertas sHASEGPs ejemplificativas y métodos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en Publicaciones de Patente de EE.UU. Nos. 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glicosaminoglicanasas adicionales tales como condroitinasas .

Las formulaciones de anticuerpo liofilizadas ej emplificativas se describen en la Patente de EE.UU. No. 6,267,958. Las formulaciones de anticuerpo acuosas incluyen aquellas descritas en la Patente de EE.UU. No. 6,171,586 y WO2006/044908 , las últimas formulaciones incluyendo un tampón químico de histidina-acetato .

La formulación en la presente también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellas con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre si. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además un anticuerpo anti-CSF-1. Tales ingredientes activos están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito planeado .

Los ingredientes activos pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) .

Pueden prepararse las preparaciones de liberación prolongada. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, tales matrices están en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas, o microcápsulas .

Las formulaciones a utilizarse para administración in vivo generalmente son estériles. La esterilidad puede realizarse fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Métodos Terapéuticos y Composiciones Cualquiera de los anticuerpos anti-IL-34, anticuerpos biespecífieos anti-IL-34/CSF-l o anticuerpos anti CSF-1R proporcionados en la presente pueden utilizarse en métodos terapéuticos .

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-IL-34 o un anticuerpo anti-CSF-lR para usarse como un medicamento. En aspectos adicionales, se proporciona un anticuerpo anti-IL-34 o un anticuerpo anti-CSF-lR para usarse en el tratamiento enfermedades inmunológicas patogénicas mieloides. En algunas modalidades, la enfermedad inmunológica patogénica, mieloide es artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, asma, osteoporosis, enfermedad de Paget, ateroesclerosis , síndrome metabólico, diabetes tipo II, LSDs (enfermedades de almacenamiento lisosomal como pero no limitadas a Citostinosis, trastorno de almacenamiento de ácido sálico, enfermedad de Gaucher) , Histiocitosis incluyendo pero no limitándose a enfermedad Rosai-Dorfman, histiocitosis Faisalabad, síndrome H, hipertricosis pigmentada con diabetes dependiente de insulina (PHID) . En algunas modalidades, se proporciona un anticuerpo anti-IL-34 o un anticuerpo anti-CSF-1R para usarse en un método de tratamiento. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 o un anticuerpo anti-CSF-lR para usarse en un método para tratar a un individuo que tiene una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide (por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal o esclerosis múltiple) que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del anticuerpo anti-IL-34 o anticuerpo anti-CSF-lR. En algunas modalidades, el método comprende además administrar al individuo una cantidad efectiva de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe abajo. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 o un anticuerpo anti-CSF-lR para usarse en la inhibición de la unión de IL-34 a CSF-1R. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 o un anticuerpo anti-CSF-lR para usarse en un método para inhibir la unión de IL-34 a CSF-1R en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del anticuerpo anti-IL-34 o anticuerpo anti-CSF-lR para inhibir la unión de IL-34 a CSF-1R. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 o un anticuerpo anti-CSF-lR para usarse en actividad neutralizante de IL-34. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 o un anticuerpo anti-CSF-lR para usarse en un método de actividad neutralizante de IL-34 en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del anticuerpo anti-IL-34 o anticuerpo anti-CSF-lR para neutralizar la actividad de IL-34. Un "individuo" de acuerdo a cualquiera de las modalidades anteriores es preferentemente un humano.

En un aspecto adicional, la invención se proporciona para el uso de un anticuerpo anti-IL-34 o un anticuerpo anti-CSF-lR en la elaboración o preparación de un medicamento. En algunas modalidades, el medicamento es para tratamiento de enfermedad inmunológica patogénica mieloide . En algunas modalidades, la enfermedad inmunológica patogénica, mieloide es artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, asma, osteoporosis, enfermedad de Paget, ateroesclerosis, síndrome metabólico, diabetes tipo II, LSDs (enfermedades de almacenamiento lisosomal como pero no limitadas a Citostinosis, trastorno de almacenamiento de ácido sálico, enfermedad de Gaucher) , Histiocitosis incluyendo pero no limitándose a enfermedad Rosai-Dorfman, histiocitosis Faisalabad, síndrome H, hipertricosis pigmentada con diabetes dependiente de insulina (PHID) . En algunas modalidades, el medicamento es para usarse en un método para tratar una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide (por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal o esclerosis múltiple) que comprende administrar a un individuo que tiene una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide (por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal o esclerosis múltiple) una cantidad efectiva del medicamento. En algunas modalidades, el método comprende además administrar al individuo una cantidad efectiva de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe abajo. En algunas modalidades, el medicamento es para inhibir la unión de IL-34 a CSF-1R en un individuo. En algunas modalidades, el medicamento es para usarse en un método para inhibir la unión de IL-34 a CSF-1R en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del medicamento para inhibir la unión de IL-34 a CSF-1R en un individuo. En algunas modalidades, el medicamento es para neutralizar la actividad de IL-34 en un individuo. En algunas modalidades, el medicamento es para usarse en un método para neutralizar la actividad de IL-34 en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del medicamento para neutralizar la actividad de IL-34 en un individuo. Un "individuo" de acuerdo a cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide. En algunas modalidades, la enfermedad inmunológica patogénica, mieloide es artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, nefritis lüpica, asma, osteoporosis , enfermedad de Paget, ateroesclerosis, síndrome metabólico, diabetes tipo II, LSDs (enfermedades de almacenamiento lisosomal como pero no limitadas a Citostinosis, trastorno de almacenamiento de ácido sálico, enfermedad de Gaucher) , Histiocitosis incluyendo pero no limitándose a enfermedad Rosai-Dorfman, histiocitosis Faisalabad, síndrome H, hipertricosis pigmentada con diabetes dependiente de insulina (PHID) . En algunas modalidades, el método comprende administrar a un individuo que tiene una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide (por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal o esclerosis múltiple) una cantidad efectiva del anticuerpo anti-IL-34 o anticuerpo anti-CSF-lR. En algunas modalidades, el método comprende además administrar al individuo una cantidad efectiva de al menos un agente terapéutico adicional, como se describe abajo. Un "individuo" de acuerdo a cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para inhibir la unión de IL-34 a CSF-1R en un individuo. En algunas modalidades, el método comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-IL-34 o un anticuerpo CSF-1R para inhibir la unión de IL-34 a CSF-1R en un individuo. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para actividad neutralizante de IL-34 en un individuo. En algunas modalidades, el método comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-IL-34 o un anticuerpo CSF-1R para neutralizar la actividad de IL-34 en un individuo. En algunas modalidades, un "individuo" es un humano .

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico anti-lL-34/CSF-l para usarse como un medicamento. En aspectos adicionales, se proporciona un anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l para usarse en el tratamiento enfermedad inmunológica patogénica mieloide . En algunas modalidades, la enfermedad inmunológica patogénica, mieloide es artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, asma, osteoporosis , enfermedad de Paget, ateroesclerosis, síndrome metabólico, diabetes tipo II, LSDs (enfermedades de almacenamiento lisosomal como pero no limitadas a Citostinosis, trastorno de almacenamiento de ácido sálico, enfermedad de Gaucher) , Histiocitosis incluyendo pero no limitándose a enfermedad Rosai-Dorfman, histiocitosis Faisalabad, síndrome H, hipertricosis pigmentada con diabetes dependiente de insulina (PHID) . En algunas modalidades, se proporciona un anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l para usarse en un método de tratamiento. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l para usarse en un método para tratar a un individuo que tiene enfermedad inmunológica patogénica mieloide (por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal o esclerosis múltiple) que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-1. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l para usarse en la inhibición de la unión de IL-34 a CSF-1R y unión de CSF-1 a CSF-1R. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l para usarse en un método para inhibir la unión de IL-34 a CSF-1R y unión de CSF-1 a CSF-1R en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l para inhibir la unión de IL-34 a CSF-1R y unión de CSF-1 a CSF-1R. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l para usarse en actividad neutralizante de IL-34 y/o CSF-1. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l para usarse en un método de actividad neutralizante de IL-34 y/o CSF-1 en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l para neutralizar la actividad de IL-34 y/o CSF-1. Un "individuo" de acuerdo a cualquiera de las modalidades anteriores es preferentemente un humano.

En un aspecto adicional, la invención se proporciona para el uso de un anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-1 en la elaboración o preparación de un medicamento. En algunas modalidades, el medicamento es para tratamiento de enfermedad inmunológica patogénica mieloide. En algunas modalidades, la enfermedad inmunológica patogénica, mieloide es artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, asma, osteoporosis, enfermedad de Paget, ateroesclerosis, síndrome metabólico, diabetes tipo II, LSDs (enfermedades de almacenamiento lisosomal como pero no limitadas a Citostinosis, trastorno de almacenamiento de ácido sálico, enfermedad de Gaucher) , Histiocitosis incluyendo pero no limitándose a enfermedad Rosai-Dorfman, histiocitosis Faisalabad, síndrome H, hipertricosis pigmentada con diabetes dependiente de insulina (PHID) . En algunas modalidades, el medicamento es para usarse en un método para tratar enfermedad inmunológica patogénica mieloide (por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal o esclerosis múltiple) que comprende administrar a un individuo que tiene enfermedad inmunológica patogénica mieloide (por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal o esclerosis múltiple) una cantidad efectiva del medicamento. En algunas modalidades, el medicamento es para inhibir la unión de IL-34 a CSF-1R y unión de CSF-1 a CSF-1R en un individuo. En algunas modalidades, el medicamento es para usarse en un método para inhibir la unión de IL-34 a CSF-1R y unión de CSF-1 a CSF-1R en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del medicamento para inhibir la unión de IL-34 a CSF-1R y unión de CSF-1 a CSF-1R en un individuo. En algunas modalidades, el medicamento es para neutralizar la actividad de IL-34 y/o CSF-1 en un individuo. En algunas modalidades, el medicamento es para usarse en un método para neutralizar la actividad de IL-34 y/o CSF-1 en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del medicamento para neutralizar la actividad de IL-34 y/o CSF-1 en un individuo. Un "individuo" de acuerdo a cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide. En algunas modalidades, la enfermedad inmunológica patogénica, mieloide es artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, asma, osteoporosis , enfermedad de Paget, ateroesclerosis , síndrome metabólico, diabetes tipo II, LSDs (enfermedades de almacenamiento lisosomal como pero no limitadas a Citostinosis , trastorno de almacenamiento de ácido sálico, enfermedad de Gaucher) , Histiocitosis incluyendo pero no limitándose a enfermedad Rosai-Dorfman, histiocitosis Faisalabad, síndrome H, hipertricosis pigmentada con diabetes dependiente de insulina (PHID) . En algunas modalidades, el método comprende administrar a un individuo que tiene una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide (por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal o esclerosis múltiple) una cantidad efectiva de un anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l . Un "individuo" de acuerdo a cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para inhibir la unión de IL-34 a CSF-1 y unión de CSF-1 a CSF-1R en un individuo. En algunas modalidades, el método comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l para inhibir la unión de IL-34 a CSF-1R y unión de CSF-1 a CSF-1R en un individuo. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para actividad neutralizante de IL-34 y/o CSF-1 en un individuo. En algunas modalidades, el método comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l para neutralizar la actividad de IL-34 y/o IL-34 en un individuo. En algunas modalidades, un "individuo" es un humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-IL-34, anticuerpos biespecíficos anti-lL-34/CSF-l, o anticuerpos anti-CSF-lR proporcionados en la presente, por ejemplo, para usarse en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores. En algunas modalidades, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-IL-34, anticuerpos biespecíficos anti-IL-34/CSF-l, o anticuerpos anti-CSF-lR proporcionados en la presente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-IL-34, anticuerpos biespecíficos anti-IL-34/CSF-l, o anticuerpos anti-CSF-lR proporcionados en la presente y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe abajo.

Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse ya sea solos o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede co-administrarse con al menos un agente terapéutico adicional. En algunas modalidades, un agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-CSFl.

Tales terapias de combinación observadas arriba comprenden administración combinada (donde dos o más agentes terapéuticos se incluyen en las mismas formulaciones o separadas) , y administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la invención puede ocurrir antes de, simultáneamente, y/o después de, la administración del agente terapéutico adicional y/o adyuvante.

En aspectos adicionales, se proporcionan un anticuerpo anti-IL-34 y un anticuerpo anti-CSF-1 para usarse en el tratamiento de enfermedad inmunológica patogénica mieloide. En algunas modalidades, la enfermedad inmunológica patogénica, mieloide es artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, asma, osteoporosis, enfermedad de Paget, ateroesclerosis, síndrome metabólico, diabetes tipo II, LSDs (enfermedades de almacenamiento lisosomal como pero no limitadas a Citostinosis, trastorno de almacenamiento de ácido sálico, enfermedad de Gaucher) , Histiocitosis incluyendo pero no limitándose a enfermedad Rosai-Dorfman, histiocitosis Faisalabad, síndrome H, hipertricosis pigmentada con diabetes dependiente de insulina (PHID) . En algunas modalidades, se proporcionan un anticuerpo anti-IL-34 and un anticuerpo anti-CSF-1 para usarse en un método de tratamiento. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 y un anticuerpo anti-CSF-1 para usarse en un método para tratar a un individuo que tiene enfermedad inmunológica patogénica mieloide (por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal o esclerosis múltiple) que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del anticuerpo anti-IL-34 junto con un anticuerpo anti-CSF-1. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 y un anticuerpo anti-CSF-1 para usarse en la inhibición de la unión de IL-34 a CSF-1R y unión de CSF-1 a CSF-1R. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 y un anticuerpo anti-CSF-1 para usarse en un método para inhibir la unión de IL-34 a CSF-1R y unión de CSF-1 a CSF-1R en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del anticuerpo anti-IL-34 junto con un anticuerpo anti-CSF-1 para inhibir la unión de IL-34 a CSF-1R y unión de CSF-1 a CSF-1R. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 y un anticuerpo anti-CSF-1 para usarse en actividad neutralizante de IL-34 y/o CSF-1. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-34 y un anticuerpo antl-csp-i para usarse en un método de actividad neutralizante de IL-34 y/o CSF-1 en ua ^indi iduo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del anticuerpo anti-IL-34 junto con un anticuerpo anti-CSF-1 para neutralizar la actividad de IL-34 y/o CSF-1. Un "individuo" de acuerdo a cualquiera de las modalidades anteriores es preferentemente un humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide. En algunas modalidades, la enfermedad inmunológica patogénica, mieloide es artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, asma, osteoporosis, enfermedad de Paget, ateroesclerosis, síndrome metabólico, diabetes tipo II, LSDs (enfermedades de almacenamiento lisosomal como pero no limitadas a Citostinosis , trastorno de almacenamiento de ácido sálico, enfermedad de Gaucher) , Histiocitosis incluyendo pero no limitándose a enfermedad Rosai-Dorfman, histiocitosis Faisalabad, síndrome H, hipertricosis pigmentada con diabetes dependiente de insulina (PHID) . En algunas modalidades, el método comprende administrar a un individuo que tiene una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide (por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal o esclerosis múltiple) una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-IL-34 junto con un anticuerpo anti-CSF-1. Un "individuo" de acuerdo a cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para inhibir la unión de IL-34 a CSF-IR y unión de CSF-1 a CSF-IR en un individuo. En algunas modalidades, el método comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-IL-34 junto con un anticuerpo anti CSF-1 para inhibir la unión de IL-34 a CSF-IR y unión de CSF-1 a CSF-IR en un individuo. En algunas modalidades, un "individuo" es un humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para actividad neutralizante de IL-34 y/o CSF-1 en un individuo. En algunas modalidades, el método comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-IL-34 junto con un anticuerpo anti CSF-1 para neutralizar la actividad de IL-34 y/o CSF-1 en un individuo. En algunas modalidades, un "individuo" es un humano.

El anticuerpo anti-IL-34, anticuerpo anti-CSF-lR, y anticuerpo biespecífico anti-IL-34/CSF-l descritos en la presente pueden utilizarse para enfocarse en la estroma mieloide de un tumor. En algunas modalidades, el anticuerpo se utiliza para tratar cáncer (tal como colón, pulmón, mama, próstata y cáncer uterino, etc.) . En algunas modalidades, el anticuerpo se administra a un individuo junto con otra terapia anti-cáncer para tratar el cáncer en el individuo. En algunas modalidades, la terapia anti-cáncer es un tratamiento con Herceptin*1, Avastin*, o Tarceva"'.

El anticuerpo anti-IL-34, anticuerpo anti-CSF-lR, y anticuerpo biespecifico anti-IL-34/CSF-l descritos en la presente también pueden utilizarse para tratar enfermedad de almacenamiento lisosómico (LSD) , y enfermedad autoinmune incluyendo pero no se limita a artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD, por ejemplo, Crohn's, colitis ulcerativa), esclerosis múltiple, enfermedades vasculares incluyendo pero no limitándose a ateroesclerosis, infarto al miocardio y angina, osteoporosis , enfermedad de Alzheimer, diabetes mellitus (Tipo 1 y/o Tipo 2) , enfermedades infecciosas, y cáncer.

Enfermedad de Almacenamiento Lisosómico (LSD) es un trastorno metabólico que resulta de los defectos en función lisosómica. Las enfermedades de almacenamiento lisosómico resultan cuando un organelo específico en las células del cuerpo - el lisosoma - funciona mal. Ejemplos de LSDs incluyen, pero no se limitan a, enfermedades causadas por una proteína que es deficiente/defectuosa tal como, hidrolasas lisosómicas defectuosas/deficientes (por ejemplo, esfingolipidosis como gangliosidosis , Gaucher y varias enfermedades Niemann-Pick) , sulfatasas modificadas de manera post-traslacional (por ejemplo, deficiencia de sulfatasa múltiple) , proteínas de transporte de membrana defectuosas/deficientes tales como transportadores de nucleótido/nucleósido o N-acetilglucosamina-l-fosfato transferasa (por ejemplo, mucolipidosis tipo II y IIIA) , proteínas protectoras de enzima defectuosas/deficientes tales como catepsina A (por ejemplo, deficiencia GM2-AP, AB variante, enfermedad Niemann-Pick, tipo C2, deficiencia SAP), proteínas de transmembrana defectuosas/deficientes tales como M-CSFR, ENT3, NPC1 y sialina (por ejemplo, enfermedad Niemann-Pick, tipo Cl, enfermedad Salla) . Categorías de LSDs incluyen trastornos de almacenamiento lipídico (por ejemplo, esfingolipidosis) , gangliosidosis (por ejemplo, enfermedad Tay-Sachs) , leucodistrofias, mucopolisacaridosis (incluyendo síndrome Hunter y enfermedad Hurler) , trastornos de almacenamiento glicoproteínico (por ejemplo, enfermedad de Pompe) y mucolipidosis.

LSDs más comunes se conocen como las siguientes: Deficiencia de Activador/Gangliosidosis GM2, Alfa-manosidosis, Aspartilglucosaminuria, enfermedad de almacenamiento de éster Colesteril, Deficiencia de Hexosaminidasa A Crónica, Cistinosis, enfermedad Danon, enfermedad Fabry, enfermedad Farber, Fucosidosis, Galactosialidosis, Enfermedad Gaucher (Tipo I, Tipo II, Tipo III) , gangliosidosis GM1, (Infantil, Infantil/Juvenil Tardía, Adulta/Crónica) , enfermedad de Célula I/Mucolipidosis II, Enfermedad de Almacenamiento de Ácido Siálico Libre Infantil/lSSD, Deficiencia de Hexosaminidasa A Juvenil, enfermedad Krabbe (Inicio Infantil, Inicio Tardío) , Leucodistrofia Metacromática, trastornos de Mucopolisacaridosis (por ejemplo, polidistrofia Pseudo-Hurler/Mucolipidosis IIIA, Síndrome MPSI Hurler, Síndrome MPSI Scheie, Síndrome MPS I Hurler-Scheie, síndrome MPS II Hunter, síndrome de Sanfilippo Tipo A/MPS III A, síndrome de Sanfilippo Tipo B/MPS III B, síndrome de Sanfilippo Tipo C/MPS III C, síndrome de Sanfilippo Tipo D/MPS III D, Morquio Tipo A/MPS IVA, Morquio Tipo B/MPS IVB, Deficiencia de Hialuronidasa MPS IX, MPS VI Maroteaux-Lamy, MPS VII de Síndrome Sly, Mucolipidosis I/Sialidosis, Mucolipidosis IIIC, Mucolipidosis tipo IV) , deficiencia de sulfatasa múltiple, Enfermedad Niemann-Pick (Tipo A, Tipo B, Tipo C) , Ceroidolipofuscinosis neuronal (por ejemplo, enfermedad CLN6 - Infantil Tardía Atípica, variante de Inicio Tardío, Juvenil Temprana, enfermedad Batten-Spielmeyer-Vogt/NCL/CLN3 Juvenil, CLN5 Infantil Tardía Variante Finés, enfermedad Jansky-Bielschowsky/CLN2 Infantil Tardía/Enfermedad TPP1, Kufs/enfermedad NCL/CLN4 inicio adulto. Epilepsia Norte/CLN8 infantil tardía variante, Santavuori-Haltia/enfermedad CLN1/PPT Infantil, Beta-manosidosis) , enfermedad de Pompe/enfermedad de almacenamiento glicogénico tipo II, Picnodisostosis, enfermedad de Sandhoff/Inicio Adulto/Gangliosidosis GM2. Enfermedad de Sandhoff/gangliosidosis GM2 - Infantil, enfermedad de Sandhoff/gangliosidosis GM2 - Juvenil, enfermedad de Schindler, enfermedad de Salla/Enfermedad de Almacenamiento de Ácido Siálico, Tay-Sachs/gangliosidosis GM2 , y enfermedad de Wolman.

Una "enfermedad autoinmune" descrita en la presente es una enfermedad o trastorno que se origina de y se dirige contra los tejidos propios de un individuo o un co-segregado o manifestación del mismo o condición resultante del mismo. Ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunes incluyen, pero no se limitan a artritis (artritis reumatoide tales como artritis aguda, artritis reumatoide crónica, artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis psoriásica, artritis vertebral, y artritis reumatoide de inicio juvenil, osteoartritis, artritis crónica progresiva, artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva, y espondilitis anquilosante) , enfermedades de piel hiperproliferativas inflamatorias, psoriasis tales como psoriasis de placa, psoriasis en gotas, psoriasis pustular, y psoriasis de las uñas, dermatitis incluyendo dermatitis por contacto, dermatitis por contacto crónica, dermatitis alérgica, dermatitis por contacto alérgico, dermatitis herpetiforme, y dermatitis atópica, síndrome de IgM hiper x-enlazada, urticaria tal como urticaria alérgica crónica y urticaria idiopática crónica, incluyendo urticaria autoinmune crónica, polimiositis/dermatomiositis , dermatomiositis juvenil, necrolisis epidérmica tóxica, escleroderma (incluyendo escleroderma sis émico) , esclerosis tales como esclerosis sistémica, esclerosis múltiple (MS) tal como S espino-óptica, MS progresiva primaria (PPMS) , y MS de remisión por recaída (RRMS) , esclerosis sistémica progresiva, ateroesclerosis , arterioesclerosis , esclerosis diseminada, y esclerosis atáxica, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales mediadas autoinmunes, colitis tales como colitis ulcerativa, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis colagenosa, colitis poliposa, enterocolitis necrotizante, y colitis transmural, y enfermedad intestinal inflamatoria autoinmune) , pioderma grangrenoso, eritema nodoso, colangitis esclerosante primaria, episcleritis) , síndrome de distrés respiratorio, incluyendo síndrome de distrés respiratorio adulto o agudo (ARDS) , meningitis, inflamación de toda o parte de la úvea, iritis, coroiditis, un trastorno hematológico autoinmune, espondiolitis reumatoide, pérdida repentina de la audición, enfermedades mediadas por IgE tales como anfalixasis y rinitis alérgica y atópica, encefalitis tal como encefalitis de Rasmussen y encefalitis límbica y/o del tronco del encéfalo, uveítis, tales como uveítis anterior, uveitis anterior aguda, uveítis granulomatosa, uveítis no granulomatosa, uveítis facoantigénica, uveítis posterior, o uveítis autoinmune, glomerulonefritis (GN) con o sin síndrome nefrótico tal como glomerulonefritis crónica o aguda tal como GN primaria, GN inmuno-mediada, GN membranosa (nefropatía membranosa) , GN membranosa idiopática o nefropatía membranosa idiopática, GN (MPGN) proliferativa membrano o membranosa, incluyendo Tipo I y Tipo II, y GN rápidamente progresiva, condiciones alérgicas, reacción alérgica, eczema incluyendo eczema alérgica o atópica, asma tal como asma bronquial, y asma auto-inmune, condiciones que incluyen infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, miocarditis autoinmune, deficiencia de adhesión a leucocito, lupus eritematoso sistémico (SLE) o lupus tales como SLE cutáneos, lupus eritematoso cutáneo subagudo, síndrome de lupus neonatal (NLE) , lupus eritematoso diseminado, lupus (incluyendo nefritis, cerebritis, pediátrico, no-renal, extra-renal, discoide, alopecia) , diabetes mellitus con inicio juvenil (Tipo I) , incluyendo diabetes mellitus dependiente de insulina pediátrica (IDDM) , diabetes mellitus con inicio adulto (diabetes Tipo II) , diabetes autoinmunes, diabetes insípida idiopática, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retrasada mediada por citocinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis, incluyendo vasculitis (incluyendo vasculitis de vaso grande (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de células gigantes o arteritis de Takayasu) , vasculitis de vaso medio (incluyendo enfermedad de Kawasaki y poliarteritis nodosa) , poliarteritis microscópica, vasculitis CNS, vasculitis necrotizante , cutánea o por hipersensibilidad, vasculitis necrotizante sistémica, y vasculitis asociada a ANCA, tal como síndrome (CSS) o vasculitis Churg-Strauss, arteritis temporal, anemia aplásica, anemia aplásica autoinmune, anemia positiva Coombs, anemia Diamond Blackfan, anemia hemolítica o anemia hemolítica inmune incluyendo anemia hemolítica autoinmune (AIHA) , anemia perniciosa, enfermedad de Addison, anemia de glóbulos rojos puros o aplasia (PRCA) , deficiencia del Factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmune, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que incluyen diapédesis de leucocito, trastornos inflamatorios CNS, síndrome de lesión de órgano múltiple tales como aquellos secundarios a septicemia, trauma o hemorragia, enfermedades mediadas por complejo de antígeno-anticuerpo, enfermedad de membrana base anti-glomerular, síndrome de anticuerpo anti-fosfolípido, neuritis alérgica, Bechet ' s o enfermedad de Behcet's, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide tales como penfigoide ampolloso y penfigoide de piel, pénfigo (incluyendo pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, pénfigo de membrana mucosa, y pénfigo eritematoso) , poliendocrinopatías autoinmunes, síndrome o enfermedad de Reiter, nefritis compleja inmune, nefritis mediada por anticuerpo, neuromielitis óptica, polineuropatías , neuropatía crónica tales como polineuropatías de IgM o neuropatía mediada por IgM, trombocitopenia (según se desarrolló por pacientes con infarto al miocardio, por ejemplo) , incluyendo púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) y trombocitopenia inmuno-mediada o autoinmune tal como púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) incluyendo ITP aguda o crónica, enfermedad autoinmune de los testículos y ovarios incluyendo orquitis y ooforitis autoinmune, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas autoinmunes incluyendo tiroiditis tal como tiroiditis autoinmune, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto) , o tiroiditis subaguda, enfermedad de la tiroides autoinmune, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares tales como síndromes poliglandulares autoinmunes (o síndromes de endocrinopatía poliglandular) , síndromes paraneoplásticos , incluyendo síndromes paraneoplásticos neurológicos tales como síndrome miasténico Lambert-Eaton o síndrome Eaton-Lambert, síndrome de hombre rígido o persona rígida, encefalomielitis tal como encefalomielitis alérgica y encefalomielitis alérgica experimental (EAE) , miastenia gravis tal como míastenia gravis asociada a timoma, degeneración cerebelar, neuromiotonia, opsoclonus o síndrome opsoclonus mioclonus (OMS) , y neuropatía sensorial, neuropatía motriz multifocal, síndrome de Sheehan, hepatitis autoinmune, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, hepatitis de célula gigante, hepatitis activa crónica o hepatitis activa crónica autoinmune, pneumonitis intersticial linfoide, bronquiolitis obliterans (sin trasplante) vs NSIP, síndrome Guillain-Barré, enfermedad de Berger (nefropatía de IgA) , nefropatía de IgA idiopática, dermatosis de IgA lineal, cirrosis biliar primaria, pneumonocirrosis , síndrome de enteropatía autoinmune, enfermedad celíaca, esprúe celíaco (enteropatia sensible a gluten) , esprúe refractario, esprúe idiopático, crioglobulinemia, esclerosis lateral amilotrófica (ALS; enfermedad de Lou Gehrig) , enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad del oído autoinmune tal como enfermedad del oído interno autoinmune (AIED) , pérdida de audición autoinmune, síndrome opsoclonus mioclonus (OMS) , policondritis tal como policondritis refractaria o por recaída, proteinosis alveolar pulmonar, amiloidosis, escleritis, una linfocitosis no cancerosa, una linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis de célula B monoclonal (por ejemplo, gammapatía monoclonal benigna y gammapatía monoclonal de significado no determinado, MGUS) , neuropatía periférica, síndrome paraneoplástico, canalopatías tales como epilepsia, migraña, arritmia, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica, y canalopatías del CNS, autismo, miopatía inflamatoria, glomeruloesclerosis segmental focal (FSGS) , oftalmopatía endocrina, uveoretinitis , corioretinitis, trastorno hepatológico autoinmune, fibromialgia, falla endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades de desmielinización tales como enfermedades de desmielinización autoinmunes, nefropatía diabética, síndrome de Dressler, alopecia areata, síndrome CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactilia, y telangiectasia) , infertilidad autoinmune masculina y femenina, enfermedad de tejido conectivo mezclado, enfermedad de Chagas, fiebre reumática, aborto recurrente, pulmón del granjero, eritema multiforme, síndrome post-cardiotomía, síndrome de Cushing, pulmón de la persona interesada en pájaros, angeítis granulomatosa alérgica, angeítis linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolitis tales como alveolitis alérgica y alveolitis fibrosante, enfermedad de pulmón intersticial, reacción de transfusión, leprosía, malaria, leishmaniasis, tripanosomiasis, esquistosomiasis, ascariasis, aspergilosis , síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocardial , fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis cística, endoeftalmitis , eritema elevatum y diutinum, eritroblastosis fetalis, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flariasis, ciclitis tal como ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, iridociclitis, o ciclitis de Fuch, púrpura Henoch-Schonlein, infección por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , infección por ecovirus, cardiomiopatía, enfermedad de Alzheimer, infección por parvovirus, infección por virus de rubéola, síndromes post-vacunación, infección por rubéola congénita, infección por virus Epstein-Barr, parotiditis, síndrome de Evan, falla gonadal autoinmune, corea de Sydenham, nefritis post-estreptococal, tromboangeítis obliterante, tirotoxicosis, tabes dorsal, corioiditis, polimialgia de célula gigante, oftamopatía endocrina, neumonitis de hipersensibilidad crónica, queratoconjunctivitis seca, queratoconjunctivitis epidémica, síndrome nefrítico idiopático, nefropatía de cambio mínimo, lesión de reperfusión por isquemia y familiar benigna, autoinmunidad retinal, inflamación de articulación, bronquitis, enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias, silicosis, afta, estomatitis aftosa, trastornos arterioescleróticos, espermiogénesis, hemolisis autoinmune, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoeftalmia facoanafiláctica, enteritis alérgica, eritema nodoso leproso, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, enfermedad de Hamman-Rich, pérdida de audición sensoneural, hemoglobinuria paroxística, hipogonadismo, ileitis regional, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversal, mixedema idiopática primaria, nefrosis, oftalmía simpática, orquitis granulomatosa, pancreatitis, polirradiculitis aguda, pioderma gangrenoso, tireoiditis de Quervain, atrofia esplénica adquirida, interfilidad debido a anticuerpos antiesperma, timoma no maligno, vitíligo, SCID y enfermedades asociadas al virus Epstein-Barr, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) , enfermedades parásitas tales como Lesihmania, síndrome de choque tóxico, envenenamiento por comida, condiciones que incluyen infiltración de células T, deficiencia de adhesión a leucocito, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad retrasada y aguda mediada por citoquinas y T-linfocitos , enfermedades que incluyen diapédesis de leucocito, síndrome de lesión de órgano múltiple, enfermedades mediadas por complejo de antígeno-anticuerpo, enfermedad de membrana base antiglomerular, neuritis alérgica, poliendocrinopatías autoinmunes, ooforitis, mixedema primaria, gastritis atrófica autoinmune, oftalmía simpatética, enfermedades reumáticas, enfermedad de tejido conector mezclado, síndrome nefrótico, insulitis, falla poliendócrina, neuropatía periférica, síndrome poliglandular autoinmune tipo I, hipoparatiroidismo idiopático con inicio adulto (AOIH) , alopecia total, cardiomiopatía dilatada, epidermolisis hullosa acquisita (EBA) , hemocromatosis, miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o crónica, etmoide, sinusitis frontal, maxilar, o esfenoide, un trastorno relacionado con eosinófilo tales como eosinofilia, eosinofilia por infiltración pulmonar, síndrome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler, neumonía eosinofílica crónica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis broncopneumónico, aspergiloma, o granulomas que contienen eosinofilos, anafilaxis, espondiloartropatias seronegativas, enfermedad autoinmune poliendócrina, colangitis esclerosante, esclera, epiesclera, candidiasis mucocutánea crónica, síndrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de infancia, síndrome Wiskott-Aldrich, ataxia telangiectasia, trastornos autoinmunes asociados con enfermedad de colágeno, reumatismo, enfermedad neurológica, trastorno de re-perfusión isquémica, reducción en respuesta de presión sanguínea, disfunción vascular, angiectasia, lesión de tejido, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral, y vascularización que acompaña a la enfermedad, trastornos de hipersensibilidad alérgica, glomerulonefritis , lesión por reperfusión, lesión por reperfusión de miocardio u otros tejidos, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, - - meningitis purulenta aguda u otros trastornos inflamatorios del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios orbitales y oculares, síndromes asociados a transfusión de granulocito, toxicidad inducida por citoquina,' inflamación seria aguda, inflamación incurable crónica, pielitis, pneumonocirrosis , retinopatía diabética, trastorno de arteria larga diabética, hiperplasia endoarterial, úlcera péptica, valvulitis, y endometriosis .

Un anticuerpo de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) puede administrarse por cualquier medio adecuado, incluyendo parenteral, intrapulmonar, e intranasal, y, si se desea para tratamiento local, administración intralesional . Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal , o subcutánea. La dosificación puede ser cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo de la parte en si la administración es breve o crónica. Se contemplan en la presente varios horarios de dosificación incluyendo pero no limitándose a administraciones únicas o múltiples durante varios puntos en el tiempo, administración por bolo, e infusión por impulso.

Los anticuerpos de la invención se formularían, dosificarían, y administrarían en una manera consistente con buena práctica médica. Los factores para consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, el horario de administración, y otros factores conocidos por los practicantes médicos . El anticuerpo no necesita formularse, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes actualmente utilizados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de tales otros agentes depende de la cantidad anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores tratados arriba. Estos se utilizan generalmente en las mismas dosificaciones y con vías de administración como se describe en la presente, o aproximadamente de 1 a 99% de las dosificaciones descritas en la presente, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determina empírica/clínicamente para ser apropiada.

Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo de la invención (cuando se utiliza sólo o en combinación con uno o más otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad a tratarse, el tipo de anticuerpo, la severidad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico que atiende. El anticuerpo se administra de manera adecuada al paciente en una sola vez o durante una serie de tratamientos . Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0. lmg/kg-10mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosificación candidata inicial para administración al paciente, si, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continúa. Una dosificación diaria típica debe variar de aproximadamente 1 g/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados arriba. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento generalmente se sostendría hasta que ocurra una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosificación ej emplificativa del anticuerpo estaría en el rango de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. De esta manera, una o más dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg o 10 mg/kg (° cualquier combinación de las mismas) pueden administrarse al paciente. Tales dosis pueden administrarse intermitentemente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo) . Una dosis de carga más alta inicial, seguida por una o más dosis inferiores pueden administrarse. Un régimen de dosificación ejemplificativo comprende la administración. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se monxtorea fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Artículos de fabricación o it En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de fabricación o kit que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos arriba. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una marca o folleto de paquete en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente conserva una composición que está por sí misma o se combina con otra composición efectiva para tratar, prevenir y/o diagnosticar la condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La marca o folleto de paquete indica que la composición se utiliza para tratar la condición de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, - - en donde la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un agente adicional citotóxico o de otra manera terapéutico. El artículo de fabricación en esta modalidad de la invención puede comprender además un folleto de paquete que indica que las composiciones pueden utilizarse para tratar una condición particular. En algunas modalidades, el artículo de fabricación comprende un anticuerpo anti-IL-34 como se describe en la presente. En algunas modalidades, el artículo de fabricación comprende un anticuerpo biespecífico IL-34/CSF-l como se describe en la presente. En algunas modalidades, el artículo de fabricación comprende un anticuerpo anti-CSF-lR como se describe en la presente. En algunas modalidades, el artículo de fabricación comprende un anti-I-34 como se describe en la presente y un anticuerpo anti-CSF-1. Alternativamente, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón químico farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacterioestática para inyección (BWFI) , salina con tampón químico de fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones químicos, diluyentes, filtros, agujas, y jeringas.

EJEMPLOS Los siguientes son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Debe entenderse que varias otras modalidades pueden practicarse, dada la descripción general proporcionada arriba.

Ejemplo 1: Estructuras de IL-34, compuestos IL-34/CSF-1R y compuestos IL-34/anticuerpo Métodos Purificación y Expresión de Proteína Las secuencias de codificación de núcleo activo de IL-34 humana (residuos N21-V193 para hIL-34s y residuos N21-P242 para hIL-34fl) fusionadas con una Flag-tag o His6-tag C-terminal, y los dominios extracelulares de CSF-1R humano (residuos 20-299 para dominios D1-D3 y residuos 20-512 para dominios D1-D5) unidos con un His6-tag C-terminal, se clonaron en el vector pAcGP67 (BD Biosciences) . Baculovirus recombinante se generó al co-cortar transversalmente las células sf9 con las construcciones pAcGP67A y ADN de baculovirus linealizado en medio ESF 921 (Expression Systems LLC, Woodland, CA) utilizando el Sistema de Expresión BaculoGold™ de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Pharmingen) . El virus se generó a través de tres vueltas de amplificación y 4 mi de la reserva de 3 vueltas se utilizaron para infectar 1 litro de células Tni . PRO a una densidad de 2 x 106 células/ml. Las células se desarrollaron 48 h a 27°C y se removieron de los medios por centrifugación. El sobrenadante se remueve de las células y complementa con 1 mM NiCl2/ 5 mM CaCl2, en 50 mM Tris-HCl pH 7.5. Las proteínas en el sobrenadante se capturan por columna Ni-NTA (Qiagen) utilizando flujo de gravedad, se enjuagan con 30 mi tampón químico de enjuague (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol) , y se eluye de la columna con tampón químico de elución (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 300 mM imidazol) . La proteína se concentró y se purificó además sobre una columna de exclusión por tamaño (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Biosciences) equilibrada con 5 mM Tris-HCl pH 7.5 y 100 mM NaCl. Las fracciones que contienen proteínas de interés se analizan por SDS-PAGE, agrupan, y la concentración se determinó por la absorbancia a 280 nm.

Filtración Analítica de Gel 500 µ? de muestras de proteína a una concentración de 1 mg/mL se inyectan secuencialmente en una columna Superdex 200 10/300 GL (GE Biosciences) equilibrada con PBS . La misma columna se calibró por una mezcla de estándares de peso molecular de proteína (Bio-Rad) , y los volúmenes de elución de las proteínas de interés se utilizaron para estimar su peso molecular correspondiente.

Calorimetría de Valoración Isotérmica Todas las muestras de proteína se intercambian por tampón químico en tampón químico PBS utilizando una columna Superdex 200 10/300 GL antes de los experimentos ITC para minimizar los efectos de dilución de tampón químico. Las valoraciones calorimétricas se llevan a cabo en un calorímetro VP-ITC 200 (MicroCal, Northampton, MA) , y los datos se procesan con software MicroCal Origin 7.0. la proteína CSF-1 o IL-34, la sustancia que se inyecta, se agrega a CSF-IR D1-D3, o CSF-IR D1-D5, durante el curso de un número de inyecciones hasta que los receptores se saturaron completamente. CSF-IR D1-D3 o D-D5, la sustancia que se inyecta, se agrega a células que contienen IL-34, CSF-1, o compuesto IL-34/CSF-1R D1-D3 durante el curso de un número de inyecciones hasta que todos los receptores se saturaron completamente .

Mediciones de afinidad utilizando Interferometría Bio-Capa (BLI) Unión de IL-34 o CSF-1 a CSF-1RD1-D3 Los ensayos de unión se conducen utilizando un instrumento Octet RED384™ BLI (fortéBio) . CSF-1 o IL-34 biotinilada se inmovilizan en biosensor revestido con estreptavidina, se enjuagan y transfieren hacia tampón químico de reacción (lx tampón químico de ensayo Cinético, fortéBio #18-5032) que contiene cuatro diluciones seriales de CSF-1RD1-D3 (1600 nM a 25 nM para IL-34 y 3200 nM para 50 nM para CSF-1) . Las reacciones de asociación se monitorean hasta que la unión alcanzó el estado fijo.

Subsiguientemente, los materiales unidos se transfieren hacia el tampón químico de reacción y las reacciones de disociación se monitorean para asegurar la unión reversible entre citocinas y CSF-1RD1-D3. Las tasas de asociación (kactiva) y tasas de disociación (kinactiva) se calculan utilizando una ecuación de unión de sitio único simple. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la proporción kinactiva/kactiva. Las cinéticas de unión se miden a 30°C y las muestras se agitaron @ 1000 rpm.

Las afinidades de anticuerpo también se evaluaron utilizando BIACORE 3000. La afinidad estuvo generalmente en línea con la medición BLI. igGs humanas anti-IL-34 se capturaron por IgG anti-humana de ratón revestida en el chip sensor CM5 para lograr aproximadamente 250 unidades de respuesta (RU) . Para mediciones cinéticas, dos diluciones seriales de IL-34 de ratón y humana (3.9nM a 500nM) se inyectan en el tampón químico PBT (PBS con 0.05% Tween 20) a 25 °C con una velocidad de flujo de 30 ml/min. Las tasas de asociación (kactiva) y tasas de disociación (kinactiva) se calculan utilizando un modelo de unión Langmuir uno a uno simple (Software BIAcore Evaluation versión 3.2). La constante de disociación de equilibrio (KD) se calculó como la proporción Kinactiva/kactiva.

Cristalización y Determinación de Estructura hIL-34s_CFlag/YW405.3 Fab Las proporciones molares iguales de hIL-3 s_CFlag y YW405.3 Fab se mezclan y sujetan a una etapa de filtración de gel final utilizando la columna HiLoad 16/60 Superdex 200, y se concentran a 30 mg/ml antes de las pruebas de cristalización. Los cristales ortorómbicos del compuesto hIL-34s_CFlag/YW405.3 Fab se desarrollaron a 19°C del índice de Búsqueda Hampton HT H02 (86) que contiene 0.2 M Tetrahidrato tartrato de sodio de potasio, 20% p/v Polietilenglicol 3,350. hIL-34s_CFlag Placas bidimensionales de hIL-34s_CFlag se obtienen a 19 °C al mezclar volúmenes iguales de la proteína en 10 mg/ml y solución de depósito que contiene 0.1 M Hepes pH 7.5, 10% p/v Polietilenglicol 6,000, 5% v/v (+/-) -2-Metil-2, 4-pentanodiol (Pantalla de Cristal de Búsqueda Hampton HT G06 (78) ) . hIL-34s_CHis/hCSF-lR D1-D3 CHis hIL-34s_CHis y hCSF-lR Dl-D3_CHis se co-expresan en células de insecto y se purifican por afinidad de níquel y cromatografía de exclusión por tamaño utilizando columna HiLoad 16/60 Superdex 200. El compuesto se concentró a 20 mg/ml y se selección con la técnica de difusión de vapor de caída en turno. Los cristales en forma de huso del compuesto hIL-34s_CHis/hCSF-lR D1-D3 CHis se desarrollaron a 19°C de Pantalla de Compuesto de Proteína Qiagen A02 (2) que contiene 0.1M CaAcet, 0.1M Mes pH 6, 15% PEG 400. hIL-34s_CFlag/YW404.33.56 Fab El fragmento Fab de YW404.33.56 se mezcló con hlL-34s_CFlag a una proporción molar 1:1 y se purificó además por una columna HiLoad 16/60 Superdex 200 y se concentra a 20 mg/ml . Un cristal de compuesto único hlL- 34s_CFlag/YW404.33.56 Fab se desarrolló después de mes a 19 °C durante una solución de depósito de 0.2 M fosfato de amonio monobásico, 0.1 M Tris pH 8.5, 50% v/v (+/-) -2-Metil-2, 4-pentanpdiol .

Recolección de Datos Todos los cristales crioestabilizados se congelan instantáneamente en nitrógeno líquido antes de la recolección de datos. Todos los conjuntos de datos se recolectan a ALS BL 5.0.2, utilizando detectores ADSC Q315 CCD. Las imágenes de difracción se indexan, integran y escalan utilizando HKL2000 (Otwinowski et al., Methods in Enzymology 276: 307-326 (1997) ) . Un sumario de todas las estadísticas para la recolección de datos, realización de fases, y refinamiento cristalográfico se da en la Tabla 2.

Tabla 2. Estadísticas de recolección de datos rayos X, realización de fases y refinamiento Los valores en paréntesis representan la cubierta resolución más alta aRsym(I) = ?hkl?i |li(hkl) - <(hkl)> | /?hkl?ili (hkl) donde las sumas están arriba de observaciones i de cada reflexión y todo hkl . <I(hkl)> es la intensidad promedio de las observaciones i observations . Rtrabajo = |F(obs) F(calc) I /F(obs) bRiibre se caicuia para 5% de reflejos aleatoriamente seleccionados no utilizados en el refinamiento Determinación de Estructura y Refinamiento Los conjuntos de datos completes a 1.85 Á, 3.0 Á, 2.6 Á( y 3.0 Á se recolectaron de cristales únicos de h-IL-34s, compuesto hIL-34s/CSF-lR D1-D3, compuesto hlL-34s/YW405.3 Fab, y compuesto hIL-34s/YW404.33.56 Fab, respectivamente (Tabla 2) . hIL-34s_CFlag/YW405.3 Fab y hIL-34s_CFlag La estructura de compuesto hIL-34s_CFlag/YW405.3 Fab se resolvió por reemplazo molecular utilizando el programa PHASER (Storoni et al., Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 60: 432-438 (2004)) con modelos de búsqueda generados de un Fab único (Banco de Datos de Proteína (PDB) número de acceso 2QQN) al buscar Fv y la región Fe de Fab secuencialmente . Una solución no ambigua única incluyendo 2 Fabs se encontró revelando densidad de electrón muy limitada para IL-34 fuera de las regiones CDR de Fab. Las fases de esta solución inicial se mejoraron drásticamente al imponer aplanamiento solvente, promedio NCS dos veces utilizando rutina de mapa de primo y cambio en PHENIX AutoBuild (Adams et al., Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 66: 213-221 (2010)). El mapa resultante fue de calidad suficientemente alta para permitir el trazado manual de la estructura completa de IL-34 en Coot. Este modelo IL-34 parcial se alimentó en el conjuntos de datos de resolución 1.85 Á de hIL-34s_CFlag por reemplazo molecular y se somete a reconstrucción de modelo utilizando Coot (Emsley et al., Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 66: 486-501 (2010)), y refinamiento utilizando Refmac (Murshudov et al., Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 53: 240-255 (1997)) interactivamente. En las vueltas finales de refinamiento 4 grupos N-acetil-glucosamina y 4 porciones de mañosa se agregan a residuos Asn75 de IL-34 y 486 moléculas de agua se incluyen en el modelo final. El modelo IL-34 completo se utilizó entonces para reconstrucción y refinamiento de la estructura de compuesto hlL-34s_CFlag/YW405.3 Fab para convergencia a resolución 2.6 Á. hIL-34s_CHis/hCSF-lR D1-D3 CHis Los componentes individuales del compuesto hIL-34s_CHis/hCSF-1R D1-D3 CHis se ubican secuencialmente utilizando el programa de reemplazo molecular PHASER, con hIL-34s, CSF-1R D1-D2 de murino y CSF-1R D3 (PDB ID 3EJJ) de murino como los modelos de búsqueda. CSF-1R D1-D3 se reconstruyó y refino de acuerdo a la secuencia de aminoácidos de humano y el modelo hIL-34s_CHis/hCSF-lR D1-D3 CHis final se completó por refinamiento interactivo en Refmac y formación de modelo en Coot . hIL-34s_CFlag/YW404.33.56 Fab hIL-34s_CFlag en composición con el bloqueo Fab YW405.33.56 se determinó por el método de reemplazo molecular implementado en el programa PHASER con la estructura de hlL-34s y la región Fv y Fe de Fab con estructura similar, seguido por ajuste manual de las regiones CDR de YW404.33.56 Fab. Varias vueltas de reconstrucción de modelo y refinamiento de estructura se llevan a cabo utilizando los conjuntos de datos 3.0 Á hasta que se alcanzó la convergencia .

Un sumario de las estadísticas de refinamiento y el análisis de estereoquímica de todas las cuatro estructuras se dan en la Tabla 2. El programa MolProbity (Chen et al.. Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 66: 12-21 (2010) ) se utilizó para inspeccionar la calidad de los modelos finales. Los coordinados se han depositado con Bancos de Datos de Proteína (www.rcsb.org) con códigos de acceso xxx, yyy, zzz, www para hlL-34s, hIL-34s/hCSF-lR Dl-D3, hIL-34s/Y 404.33.56 Fab y hIL-34s/Y 405.3 , respectivamente. Las figuras se preparan utilizando el programa PyMol (En la Red en pymol.sourceforge.net) Células mononucleares de humano y la viabilidad cellular/ensayo de proliferación Las células mononucleares de sangre periférica de humano (PBMC) se aislan por centrifugación de gradiente sobre Ficoll . En la viabilidad celular/ensayo de proliferación, lxlO4 PBMC recientemente aisladas por cavidad en placa de 96 cavidades se estimulan con IL-34 (longitud completa y versión corta) o CSF-l en diluciones seriales. Después de la incubación a 37 °C por 72 horas, los niveles ATP en las células se miden por Kit de Ensayo de Viabilidad Celular Luminescente CellTiter-Glo (Promega, cat. #G7571) para determinar la viabilidad/proliferación celular. La proliferación se muestra como Unidad Luminescente Relativa (RLU) .

Neutralización de bioactividad de IL-34 humana La concentración óptima del anticuerpo requerido para neutralizar la actividad de hIL-34 es dependiente de la cantidad de citocina, tipo celular y el tipo de ensayo. Para medir la habilidad del anticuerpo para neutralizar la bioactividad de hIL-34 o mIL-34 en PBMC, utilizamos un ensayo de proliferación celular por CellTiter-Glo . En base a la respuesta celular a diluciones seriales de IL-34, 100 ng/ml de cantidad de IL-34 se seleccionaron para determinar la actividad neutralizante de anticuerpo. La Concentración Inhibidora Máxima Media (IC50) se define como la concentración de anticuerpo requerida para producir la inhibición máxima media de actividad de IL-34 en células, cuando IL-34 está presente en una concentración para producir 70-80% de respuesta de proliferación. 100 ng/ml hIL-34 o mIL-34 se combinó con diluciones seriales de mAbs anti-IL-34 o anticuerpos anti-CSFl antes de agregar sobre células en un volumen total de 100 ul . La actividad de inhibición de anticuerpo se obtuvo al medir RLU después de incubar las placas a 37 °C por 72 horas. Los valores IC50 se calculan con KaleidaGraph.

Generación de anticuerpo por despliegue de fago Clasificación de Biblioteca y Selección para Identificar los Anticuerpos Anti-IL-34 IL-34 de murino (PRO307278) se utilizó como antígeno para clasificación de biblioteca. Las inmunoplacas Maxisorp de 96 cavidades Nunc se revisten durante la noche a 4°C con antígeno objetivo (10ug/ml) y se bloquean por 1 hora a temperatura ambiente con tampón químico de bloqueo de fago PBST (salina con tampón químico de fosfato (PBS) y 1% (p/v) albúmina de suero bovino (BSA) y 0.05% (v/v) tween-20) . Las bibliotecas de fago de anticuerpo sintético de humano VH (ver, por ejemplo, Lee et al., J. Immunol. Meth. 284:119-132, 2004) y VH/VL (ver Liang et al., Journal of molecular biology 366: 815-829 (2007)) con diversidades sintéticas en CDRs seleccionadas se agregan a placas de antígeno por separado e incuban durante la noche a temperatura ambiente. Al siguiente día las placas revestidas con antígeno se enjuagan diez veces con PBT (PBS con 0.05% Tween-20) , y fago unido se eluye con un volumen igual de 1 M Tris base (pH7.5) . El fago recuperado se amplifica en células Azul E. coli XL-1. Durante las vueltas de selección subsiguientes, la incubación de fago de anticuerpo con las placas revestidas con antígeno se reduce a 2-3 horas, y la severidad de lavado de placa se incrementó gradualmente .

Después de 4 vueltas de cribado, se observó el enriquecimiento significativo. 96 clones se escogen cada uno de la clasificación de biblioteca VH y VH/VL para determinar si fueron cruza de IL-34 humano/murino o aglutinantes específicos de IL-34 de murino. Las regiones variables de estos clones se secuenciaron por PCR para identificar los clones de secuencia única. Estos clones de fago único se reformatearon subsiguientemente en IgGs al clonar las regiones VL y VH de clones individuales en el vector LPG3 y LPG4 respectivamente (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992)), expresándose transitoriamente en células CHO de mamífero, y purificando con una columna A de proteína.

Bibliotecas de Construcción para Mejora de Afinidad de YW404.33 El fagémido pW0703 (derivado de fagémido pV0350-2b (Lee, 2004) que despliega Fab monovalente en la superficie de bacteriófago M13) sirvió como el patrón de biblioteca para injertar dominios variables de cadena pesada (VH) y cadena ligera de YW404.33 para maduración por afinidad. Los codones de detención se incorporan entonces en CDR-L3 del patrón de biblioteca. La estrategia de aleatorización suave se utilizó para maduración por afinidad, que introdujo una tasa de mutación de aproximadamente 50% en las posiciones seleccionadas al utilizar una estrategia de oligonucleótido envenenada con 70-10-10-10 mezclas de bases que favorecen los nucleótidos tipo silvestre (Gallop et al., Journal of medicinal chemistry 37: 1233-1251 (1994)). Específicamente los residuos en las posiciones 28-32 de CDR-L1, 50 y 53-55 de CDR-L2 , 91-94 y 96 de CDR-L3, 28-35 de CDR-H1, 50-58 de CDR-H2, 95-100 de CDR-H3, se tuvieron como objetivo. Y se construyen tres diferentes bibliotecas con combinaciones de bucles CDR aleatorizados suaves, L1/L2/L3, L3/H1/H2 y L3/H3. Estrategia de Clasificación de Fago para Generar Mejora de Afinidad Para la selección de mejora de afinidad, las bibliotecas de fago se someten a clasificación de placa para la primera vuelta, seguida por cuatro vueltas de clasificación de solución. En la primer vuelta de clasificación de placa, se clasifican tres bibliotecas contra placa revestida con IL-34 de murino (placa Maxisorp NU C) por 2 horas a temperatura ambiente. Después, se llevan a cabo cuatro vueltas más de clasificación de solución junto con dos métodos para incrementar la severidad de selección. El primero de los cuales es para selección en tasa al disminuir la concentración de proteína objetivo biotinilada de 50 nM a 0.5 nM, y el segundo del cual es para selección fuera de tasa al agregar cantidades en exceso de proteína objetivo no biotinilada (100~500 veces más) para competir con aglutinantes más débiles a temperatura ambiente. Cada biblioteca de fago también se incuba con mIL-34 no biotinilada para servir como unión de fago anterior para estimar el enriquecimiento de cada vuelta de cribado.

ELISA de Selección de Afinidad de Alto Rendimiento (Competencia de Punto único) Después de cinco vueltas de cribado, ELISA de fago competitivo de punto único de alto rendimiento se utilizó para seleccionar rápidamente clones de alta afinidad como se describe (Sidu, 2004) . Los clones con baja proporción de unión a mIL-34 inmovilizado en la presencia de 5nM mIL-34 en la ausencia de mIL-34 se eligen para caracterización adicional .

Medición de Afinidad Un QK Octet equipado con puntas biosensoras de estreptavidina (SA) (fortéBio, Menlo park, CA, USA) se utilizó para medición de afinidad. Las puntas biosensoras SA se equilibran en tampón químico de ensayo (tampón químico de ensayo lx Cinéticas, fortéBio) por 10 min antes de análisis. Las cinéticas de unión se miden a 300C y las muestras se agitan @ 1000 rpm. Las puntas SA se saturan con 5ug/ml de IL-34 humana biotinilada (R&D, Cat #5265-IL-010/CF) para 200s, que resultó en niveles de captura de 0.22± 0.02 nm dentro de una columna de seis puntas . Se prepararon tres diluciones seriales de anticuerpos anti-IL-34 (lOOnM, 33.3nM, ll.lnM, 3.7nM, l.2nM), así como vacío de tampón químico. Tanto la asociación como disociación se monitorean por 300s. Todas las reacciones y mediciones se realizan a temperatura ambiente. Los datos se analizan utilizando software de análisis de datos Octet 6.4 (fortéBio).

.Resultados En la presente se presenta la primera estructura de cristal de IL-34 humana sola y en compuesto con CSF-1R, y se caracterizan sus propiedades de unión en solución. Se muestra que IL-34 ciertamente pertenece a la familia de citocina helicoidad de cadena corta, con la interfase de dimerización más pequeña entre los miembros de la familia. La estructura del compuesto IL-34/CSF-1R mostró un ensamble de ligando/receptor total similar en los términos de los dominios incluidos, como se observa para el complejo CSF-1. Sin embargo, los dominios receptores incluidos experimentan un reordenamiento inesperado, resultando en diferentes composiciones de interfase . Una comparación cuidadosa entre estos dos compuestos de señalización de citocina proporcionaron un entendimiento de los determinantes moleculares que permiten que CSF-1R se una de manera promiscua a dos ligandos estructuralmente relacionados, aún evolucionariamente distantes IL-34 y CSF-1. Además, las estructuras de co-cristal de IL-34 en compuesto con fragmentos Fab de dos anticuerpos monoclonales anti-IL-34 derivados de fago proporcionaron un racional estructural para sus actividades de no bloqueo u neutralizante, respectivas, y ofrecen nuevas percepciones en el desarrollo terapéutico.

Estructura del núcleo activo de IL-34 humana IL-34 humana de longitud complete Madura se compone de 222 aminoácidos, pero sus últimos -50 residuos se predicen para desordenarse grandemente con poca estructura secundaria discernible por Jpred 3 (Colé et al., Nucleic acids research 36: W197-201 (2008)) y PsiPRED (McGuffin et al., Bioinformatics 16: 404-405 (2000)). Además, las construcciones de IL-34 que contienen los primeros 202 o 182 residuos fueron indistinguibles de la proteína de longitud completa para activar el crecimiento de células TF-l-fms, mientras las construcciones que incluyen solamente los primeros 162 residuos mostraron actividad significativamente disminuida (Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010)). Además, siete residuos de cisteína - 1 - (35, 168, 177, 179, 180, 191, y 199) se encontraron en IL-34 humana y seis de ellos (todos pero C199) se conservaron bien a través de las especies (Figura 1A, Figura 7A-B) . Por lo tanto, una construcción de IL-34 truncada comprendida de residuos N21-V193 del polipéptido maduro, en la presente referida como hIL-34s, se eligió para estudios subsiguientes. hIL-34s se fusiona a una marca de señal C-terminal, expresada recombinantemente en células de insecto, purificadas como se describe en los métodos, y se utilizan en todos los estudios subsiguientes, al menos que se observe de otra manera. hlL-34s fue como activo como CSF-1 y ligeramente más activo que IL-34 de longitud completa recombinante en su habilidad para promover la viabilidad del monocito humano (Figura IB) . El gen de IL-34 humana no contiene regiones de asociación a membrana reconocibles, mientras existe el ortólogo de ratón naturalmente como isoformas solubles y sujetas a GPI como un resultado de división de AR alternativa y procesamiento proteolítico (Figura 1A) .

La estructura del dominio de núcleo activo de IL-34 humana se determina por reemplazo molecular de su compuesto con un fragmento de anticuerpo de no bloqueo YW405.3 Fab (Tabla 6) a resolución 2.6 Á, y se refine utilizando un conjunto de datos de resolución 1.85 Á recolectados de un cristal hIL-34s única (Tabla 2) . No sorprendentemente, el análisis de estructura indicó que IL-34 tiene el doblez de citocina de haz de cuatro hélices antiparalelo, distintivo que consiste de A, o¡B, aC, y aD (Sprang et al., Curr Opin Struc Biol 3: 815-827 (1993)), pero la estructura contiene un número de características notables fuera de esta porción de núcleo (Figura 1C) . Los ß-filamentos 1 y 2 de cruce son mucho más cortos y se sustituyen parcialmente por tres hélices cortas (al, a2, y o¡3) se comparan con CSF-1 (Chen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 18267-18272 (2008); Pandit et al., Science 258: 1358-1362 (1992)) (Figura ID). Además, dos pares de disulfuro intramolecular ubicados en el polo de cada protómero, y lejos de la interfase de dímero, no comparten similitudes estructurales con enlaces de disulfuro encontrados en las estructuras de las citocinas helicoidales de "cadena corta" diméricas relacionadas CSF-1, SCF, y Flt3L (Jiang et al., The EMBO journal 19: 3192-3203 (2000); Savvides et al., Nature structural biology 7: 486-491 (2000); Zhang et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97: 7732-7737 (2000)). El primer enlace de disulfuro (entre C35 y C180) conecta las hélices aA y aD, mientras el otro enlace de disulfuro (entre C177 y C191) conecta aD a la hélice a4 C-terminal, consecuentemente, el extremo C-terminal incluyendo a4 se invierte, en comparación con aquel de CSF-1, y se empaca sobre la superficie de aA y aD. Las otras dos cisteínas C168 - - y C179 permanecen sin emparejar y consecuentemente no son esenciales para el doblez apropiado de IL-34. En general, como se juzga por la superposición estructural PDBeFOLD (Krissinel et al., Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 60: 2256-2268 (2004)), se mostró que IL-34 es estructuralmente más similar a SCF (desviación de raíz cuadrada media (rmsd: 2.6 Á) , aún más divergente de CSF-1 funcionalmente relacionada (rmsd: 3.2 Á) .

Los resultados de este análisis de estructura también mostraron que los dos protómeros de IL-34 en la unidad asimétrica se ensamblan además en un dímero no covalente en una manera similar a aquella observada para CSF-1, SCF, y Flt3L. En la formación del dímero IL-34, cada subunidad esconde 656 Á2, con el bucle ?-ß? y bucle a?-aC de un monómero interfijándose con los segmentos recíprocos del otro monómero. Se forma un parche hidrofóbico relativamente plano y compacto centrado en P58/P58' al empacar las cadenas laterales de H56, Y57, F58, P59, y Y62 de un promotor contra residuos P114', H113', L110', L109' , V108', Y62', P59', y F58' del monómero cercano. Estas interacciones pueden conferir formación de dímero IL-34 obligada a pesar del área de superficie escondida más pequeña (1310 Á2) comparada con los dímeros SCF and Flt3L no covalentes relacionados, comprendidos de 1690 Á2 y 1640 Á2 , respectivamente. Los residuos en la interfase de dímero IL-34 se conservan altamente entre ortólogos de otras especies (Figura 7A-B) . La organización dimérica de IL-34 observada en los cristales hIL-34s probablemente deba ser representativa de la organización de la proteína en solución ya que el mismo orden dimérico "cabeza a cabeza" estuvo también presente en las tres estructuras complejas de IL-34 tratadas en la presente. Un sitio de glicosilación N-enlazado predicho en IL-34 madura ubicada en N76 se incluyó en la construcción que se cristalizó, y densidad de electrón para (GlcNAc)2 an se observó unida a la cadena lateral. Los resultados indicaron que la orientación del carbohidrato se fija al apilar las interacciones entre el anillo aromático de Y68 y la cara hidrofóbica del segundo residuo GlcNAc, junto con interacciones polares mediadas por tres residuos conservados en IL-34, E69, R79, y K157, sugiriendo que esta porción de azúcar es una parte íntegra de la estructura IL-34. El sitio de glicosilación análogo se conserva en IL-34 de roedor, que también contiene un sitio de glicosilación N-enlazado predicho, adicional en una posición equivalente a S100 de humano, que es accesible en solvente en la estructura hlL-34s.

Biophysical characterization de la IL-34/CSF-1R complex Para probar el estado oligomérico de hIL-34s en solución, se utilizó cromatografía de exclusión de tamaño analítico (Figura 2A) . La masa molecular teórica para el monómero hIL-34s es 22 kDa, todavía la proteína se eluye antes que la referencia 44kDa, indicando que hIL-34s forma dímeros en solución, de acuerdo con la estructura de dímero simétrica no cristalográfica doble observada en el cristal hIL-34s. Para valorar el tamaño molecular de los compuestos ligando/receptor de IL-34, una construcción que contiene casi el dominio extracelular completo (ECD) incluyendo dominios Di a D5 de inmunoglobulina del receptor (hCSF-lR D1-D5) se mezcló con IL-34 en 1:1 proporciones molares promotoras y se analizó por la misma técnica. El tamaño aparente de este compuesto fue consistente con el tamaño calculado para un compuesto 2:2 (Figura 2A) . De manera similar, para estrechar la construcción receptora mínima necesaria para formación de compuesto, una mezcla de hIL-34s con una construcción receptora que contiene solamente los primeros tres dominios de inmunoglobulina (hCSF-lR D1-D3) se somete a análisis de exclusión por tamaño, revelando un tamaño aparente que es más grande que 158 kDa, de acuerdo con un compuesto 2:2 (Figura 2A) .

Para determinar de manera exacta la estoiquiometría y energéticas de unión de IL-34 a CSF-1R y las compara con la unión CSF-1, los parámetros termodinámicos para unión se valoran por calorimetría de valoración isotérmica (ITC) (Figura 2B, 2D) . La valoración del receptor CSF-1R en la citocina IL-34 confirmó que tanto las formas de longitud completa como truncadas del receptor, CSF-IR D1-D5 y D1-D3, se saturaron por cantidades molares iguales de monómero IL-34. Este, junto con los tamaños aparentes determinados por cromatografía de exclusión por tamaño analítica, soportó fuertemente una estoiquimetría 2:2 citocina/receptor en solución para el compuesto (Figura 2D) . Ya que la alta afinidad de la interacción IL-34/CSF-1R D1-D5 produjo una transición de valoración inclinada que se excluye determinando la constante de disociación con alta exactitud (Figura 2B, panel izquierdo) , ITC de desplazamiento se llevó a cabo al valorar CSF-IR D1-D5 en una mezcla de IL-34 con CSF-IR D1-D3 (Figura 2B, panel derecho) . Los isotermos de unión determinados en la presente indicaron que la unión de IL-34 a su receptor se conduce principalmente por términos entálpicos . La naturaleza exotérmica de unión de IL-34 tanto a CSF-IR D1-D3 como D1-D5 indicó que la formación del compuesto IL-34/CSF-1R incluye probablemente las interacciones polares clave. La inclusión de los dominios próximos a membrana CSF-IR D4-D5 condujo a un gran incremento en afinidad (1.6 y 94 nM ¾ para D1-D5 y D1-D3, respectivamente) , que es significativamente más favorable entálpicamente , aunque ligeramente desfavorecido entrópicamente . Estos resultados sugirieron que aunque hCSF-1R D1-D3 es suficiente para conferir unión de ligando de alta afinidad, CSF-IR D4-D5 probablemente contiene sitios de interacción de receptor hemotípico adicionales en la formación del compuesto de señalización completo de citocina/receptor, como se observa en la estructura compuesta de SCF unido a los ectodominios completos de un dímero de receptor KIT (Yuzawa et al., Cell 130: 323-334 (2007)). Sorprendentemente, el ligando mejor caracterizado CSF-1 mostró afinidad 9.5 y 13 veces inferior en comparación con IL-34 para unión a hCSF-lR D1-D3 y D1-D5, respectivamente (Figura 2C, 2D) . En comparación con IL-34, los resultados indicaron que los compuestos CSF-1 se conducen tanto por entalpia como entropía favorable. Similar a IL-34, la valoraciones de CSF-1 humano también sugirieron estoiquiometrias 2:2 ligando/receptor para ambas formas de los receptores. Aunque consistente con un reporte anterior (Guilbert et al., The Journal of biological chemistry 261: 4024-4032 (1986)), este representa una diferencia clave entre CSF-1 de humano y murino. En la ausencia de D4 y D5, CSF-1 de murino se reportó para formar un complejo parcial 2:1 con CSF-1R de murino dejando la mitad de la superficie de unión al receptor en CSF-1 de murino no ocupada en solución (Chen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 18267-18272 (2008)). Para entender además las cinéticas de unión de citocina/receptor en este sistema, IL-34 o CSF-1 biotiniladas se inmovilizan en puntas biosensores revestidas con estreptavidina para medir las tasas de asociación y disociación con diluciones receptores seriales utilizando la técnica Interferometría Bio-Layer (BLI) . Los resultados de este método ortogonal también confirman que IL-34 (^activa = 2.9 x 105 s^ "1, Jfinactiva = 3.5 x 10"2 s"1, J¾ = 120 nM) une CSF-IR de manera más hermética que CSF-1 (Jcactiva = 7.7 x 104 s^ "1, ^inactiva = 5.4 x 10~2 s-, i¾ = 720 nM) principalmente debido a 3.8 veces más rápido "activo acoplado a ^inactivo ligeramente inferior.

Estructura del compuesto IL-34/CSF-1R D1-D3 La estructura de resolución 3.0 Á de hIL-34s unida a hCSF-11 D1-D3 se resolvió por reemplazo molecular utilizando estructuras de hIL-34s y CSF-IR de murino (Chen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 18267-18272 (2008)) como sondas de búsqueda (Tabla 2) . Aunque todos los métodos biofísicos probados en este estudio indicaron que hCSF-lR D1-D3 forma un compuesto 2:2 con hIL-34s en solución, la estructura de cristal reveló de manera inambigua un CSF-IR D1-D3 unido a un homodímero hIL-34s en la unidad asimétrica. El análisis de estructura sugirió que el sitio de unión de receptor análogo en el promotor adyacente se incluye en empacado de cristal, prohibiendo la formación del compuesto 2:2 esperado en la forma de estructura de cristal. Sin embargo, esta estructura reveló amablemente que IL-34/receptor interactúan. Se mostró que IL-34 se unió a una superficie cóncava formada por D2 y - - D3 de CSF-IR en una configuración parecida a aquella empleada por CSF-1 cuando se une al receptor CSF-IR. Un modo de unión de dos sitios similar observado en el compuesto de citocina/receptor CSF-1 también se conserva en la interfase IL-34/CSF-1R. Estos resultados indicaron que el Sito 1 incluyó interacciones entre IL-34 y dominio Ig D2 del receptor, y Sitio 2 entre IL-34 y dominio del receptor D3. Cada sitio proporciona 1280 Á2 y 1160 Á2 total de área de superficie escondida, respectivamente. El enlazador entre D2 y D3, aunque completamente ordenado en la estructura, se conserva de la interacción con IL-34, que analiza de manera efectiva la interfase IL-34/CSF-1R en dos sitios espacialmente separados.

Sitio 1 de Unión de Ligando/Receptor de IL-34 Tal análisis de estructura reveló que el Sitio 1 se forma principalmente por los residuos de dominio D2 receptor que comprenden los bucles CD y EF (residuos 142-150 y 169-173, respectivamente) que se acoplan sobre la superficie vidfgd por las hélices o¡B de IL-34 (residuos 100-108) , aC (116-134) , el bucle de intervención (residuo 109) , y a3 (residuo 150) (Figura 3A) . Las interacciones electroestáticas complementarias entre la superficie negativamente cargada de IL-34 y la superficie positivamente cargada en CSF-IR en esta región aparecieron importantes para mediar la unión de IL-34 en este sitio. En particular, se forman los puentes de sal centralmente ubicados entre los aminoácidos básicos R142, R146 de CSF-lR con E103 ácido en IL-34. R144 y R150 de CSF-lR en la periferia del bucle CD se embragan en las interacciones de unión a hidrógeno con el oxígeno de cadena lateral de N150 y el oxígeno de carbonilo de estructura de Q106 y L109, respectivamente. Un parche hidrofóbico pequeño formado por la cadena lateral alifática de L127 en IL-34 se ajusta cómodamente entre F169 y 1170 de CSF-lR. Aunque este sitio apareció dominado por interacciones polares, un número de contactos intermoleculares van der Waals también cubren la interfase según se detalla en la Tabla 3.

Sitio 2 de Unión de Ligando/Receptor de IL-34 Los resultados indicaron además que el Sitio 2 ligeramente más pequeño se forma principalmente por los residuos D3 receptores de los bucles de los bucles BC y DE (residuos 231 y 254, respectivamente) y filamento D (residuos 248-252), empacados contra la superficie generada por porciones de hélices de IL-34 a?, OÍC, y o¡4 (residuos 36-44, 121-128, 184-187, respectivamente) (Figura 3C) . Esta interfase puede dividirse además en dos regiones de interacción polares, separadas por un área hidrofóbica formada por los residuos F40 y L125 de IL-34, y residuos V231, Y257, y F252 de CSF-lR. La primera región se forma por una combinación de estructura e interacciones de unión a hidrógeno de cadena lateral entre el comienzo del filamento D CSF-1R D3 y IL-34 a4. El oxígeno e hidrógeno de amida de cadena literal de N187 de IL-34 participa en hasta tres enlaces de hidrógeno con el receptor incluyendo la amida de cadena lateral de Q249, y la estructura de nitrógeno y oxígeno de carbonil de S248 de CSF-1R. Adicionalmente, dos enlaces de hidrogeno de estructura-estructura se forman entre CSF-1R Q248 y IL-34 S184 y L186. La eliminación de residuos que comprenden la región OÍ4 en IL-34 resulta en reducción drástica en niveles de expresión de proteína, y actividad significativamente más débil en términos de la habilidad para estimular el crecimiento de las células TF-l-fms (Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010)). Los resultados reportados aquí confirmaron que los residuos que comprenden a4 son una parte integral del dominio de núcleo activo de IL-34, y por lo tanto son importantes para su actividad. La segunda región polar en el Sitio 2 comprende tres enlaces de hidrógeno mediados por cadena lateral entre los átomos de cadena lateral terminales de IL-34 N128, K44 y E121, y el grupo hidroxilo de Y257, el grupo carbonilo de F252 y la amida de estructura de N254 de CSF-1R. Las interacciones adicionales mediadas por los contactos van der Waals se enlistan en la Tabla 3.

Tabla 3. Interacciones de IL-34/CSF-1R y CSF-l/CSF-lR.

Bases estructurales para antagonismo de IL-34 por mAb YW404.33.56 Para analizar las funciones discretas de IL-34 y CSF-1 y explorar el beneficio terapéutico de bloquear la señalización de IL-34, la tecnología de despliegue de fago se utilizó para generar anticuerpos que antagonizan específicamente tanto IL-34 de raurino y humano, permitiendo la interrogación de la función de IL-34 en tanto pacientes humanos como modelos roedores. YW404.33 se identificó al seleccionar las bibliotecas de despliegue de fago VH y VH/Vl y se selecciona de un panel de 96 clones en base a su alta afinidad de unión (¾ = 17 nM, Tabla 4) y su actividad de bloqueo para IL-34 humana. YW404.33 se midió subsiguientemente por afinidad utilizando una estrategia de aleatorización suave como se describe en los Métodos. YW404.33.56 muestra una mejora de 140 veces en afinidad de unión (¾ = 120 pM) según se midió por los experimentos BLI cuando se compara con el clon de origen. En los ensayos de viabilidad del monocito humano (Figura 4A) y proliferación (Figura 8) , la actividad biológica de IL-34 se bloqueó completamente por este anticuerpo, similar a la fusión Fe receptora, pero no por un anticuerpo anti-CSF-1.

Tabla 4. Medición de octeto de cinéticas de unión para el anticuerpo no neutralizante YW405.3/hIL-34 , y anticuerpos neutralizantes YW404.33/hIL-34 , YW404.33.56/hIL-34.

Para entender mejor el mecanismo mediante el cual YW404.33.56 mAb bloquea la actividad biológica de IL-34, la estructura de hIL-34s en composición con el fragmento Fab de Y 404.33.56 se resuelve en resolución 3.0 Á (Tabla 2). Los cristales contuvieron un dimero hIL-3 s unido a dos YW404.33.56 Fabs en la unidad asimétrica. De manera interesante, el análisis de estructura mostró que cada YW404.33.56 Fab reconoce un área grandemente continua en la unión de dos promotores IL-34. En el lado de dímero IL-34, la mayoría de la interfase (786 Á2 o 79%) se contribuye por las hélices o¡B, C, y su bucle de intervención, de un promotor, mientras una fracción más pequeña (215 Á2 o 21%) se contribuye por el bucle a?-ß? del otro promotor IL-34 (Figura 4B) . En el lado YW404.33.56 Fab, el volumen de las interacciones se medían por CDR-H1 de cadena pesada (55 Á2) , CDR-H2 (267 Á2) , y CDR-H3 (316 Á2) con contribuciones más pequeñas de CDRs de cadena ligera (303 Á2) . Cuatro puentes de sal (R50YW404.33.56_E111IL-34Í Rl0 Ob™404 '33 '56-E111IL~34 , R100bYW404-33 56-D107IL-34, y K100aYW404-33-56-E103IL-34) forman una "cremallera electroestática" a lo largo de la ranura entre aB y aC de IL-34. Este principio complementario electroestático fuerte entre IL-34 y YW404.33.56 Fab fue reminiscente de las interacciones de carga-carga Sitio 1 en el compuesto IL-34/CSF-1R descrito arriba. Adicionalmente, W33™ 0 .33.56F ?54™404·33·56, K98™404-33-56, y siOO™404"33-56 forman enlaces de hidrógeno específicos de cadena lateral con D107IL"34, D107IL" 34 , S104IL"34, y Q120IL"34, respectivamente. Además, otros grupos carbonilo de estructura YW404.33.56 median los enlaces de hidrógeno, y varias otras interacciones van der Waals como se detalla en la Tabla 5. La cadena de carbohidrato del N76 glicosilado de IL-34 se extiende lejos de la interfase de interacción, y no tiene contacto directo con YW404.33.56 Fab. Inesperadamente, el paquete hidrofóbico a través de la interfase, que con frecuencia media interacciones de proteína-proteína de alta afinidad, está ausente en este sistema de anticuerpo/antígeno. El principio complementario de forma entre el paratope Fab y el epítope IL-34 fue 0.61, que es ligeramente más pequeño que el valor promedio (0.64-0.68) para otros compuestos de anticuerpo/antígeno (Lawrence et al., Journal of molecular biology 234: 946-950 (1993)), sugiriendo el paratope de YW404.33.56 mAb en teoría, podría optimizarse además para lograr principios complementarios de forma y químicos más altos para unión más hermética a IL-34.

La superposición de las moléculas IL-34 en los compuestos IL-34/YW404.33.56 y IL-34/CSF-1R mostró que ambas cadenas, pesada y ligera, de Fab no combina con CSF-1R. Estos resultados indicaron que YW404.33.56 se une a un epítope que se sobrepone grandemente con epítopes de unión responsables de Sitio 1, unión a CSF-1R D2, e incluye residuos de hélices B y aC de un promotor IL-34. 6 fuera de 11 residuos o 220 Á2 fuera de 600 Á2 de las áreas de superficie accesibles a solvente escondido de IL-34 en el Sitio 1 de unión IL-34/CSF-1R se ocupan por interacciones con Y 404.33.56 en el compuesto IL-34/Fab. Por lo tanto, la unión de Y 404.33.56 a IL-34 competiría directamente para asociación con el receptor CSF-1R, que explica el mecanismo - - molecular de la inhibición de la señalización de IL-34 por Y 40 .33.56.

Tabla 5. Interacciones IL-34/YW404.33.56 Fab - - Tabla 6. Interacciones IL-34/YW405.3 - - Discusión Cambio conformacional en IL-34 en la unión al receptor En la presente se reportan las primeras estructuras tridimensionales de IL-34, se resolvieron tanto por su cuenta como compuesto con su receptor CSF-IR. La comparación de la estructura de protómero IL-34 en sus formas unidas a CSF-IR y no unidas reveló que la estructura de la citocina casi no se cambia en la unión a su receptor. Incluso las conformaciones de rotámero de cadena lateral adoptadas por los residuos interfaciales receptores mostraron sorprendentemente poca diferente entre estados, libre y unido, indicando que el promotor IL-34 no unido es altamente compatible con, y se cepa para unión a receptor. La rigidez aparente de la estructura promotora de IL-34 en base a las comparaciones de las cuatro estructuras presentadas en la presente, fue consistente con la estructura Flt3L recientemente determinada (Verstraete et al., Blood 118: 60-68 (2011)), pero muy diferente de estructuras CSF-1 más plásticas (Chen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 18267-18272 (2008)) o SCF (Liu et al., The EMBO journal 26: 891-901 (2007); Yuzawa et al., Cell 130: 323-334 (2007) ) , que deben experimentar cambios estructurales locales significativos para acomodar la unión a receptor. Sin embargo, se observaron los cambios significativos en la orientación de un promotor IL-34 relativo al otro protómero acerca de la interfase de dímero en la formación del compuesto. Cuando se describe por el ángulo de inclinación de aC, la unión a receptor o unión a YW404.33.56 inducida a 6.6° o 4.6° aumentó en los ángulos entre los promotores IL-34, respectivamente. Los movimientos similares del cuerpo rígido como articulación, se reportaron previamente en los sistemas CSF-1/CSF-1R, SCF/Kit y Flt3L/Flt3.

Inesperadamente, otro anticuerpo YW405.3 activó una rotación similar, pero a lo largo de la dirección inversa, resultando en 6.4° de disminución en el ángulo de inclinación. Tal alto grado de plasticidad no tiene precedente en otras citocinas de haz de cuatro hélices dimérico, y probablemente puede atribuirse a la interfase de dimerización de IL-34 muy hidrofóbica más pequeña.

El reconocimiento dual de IL-34 y CSF-1 por CSF-IR Aunque IL-34 y CSF-1 son escasamente similares en el nivel de secuencia primario, se encontró que en realidad adoptan un pliegue de núcleo de haz de cuatro hélices similar e interfases de unión a receptor y dimerización relacionadas, con diferencias asignadas a bucles de núcleo extra y embellecimiento estructural - un descubrimiento recurrente en la comparación de estructuras de citocina helicoidal (Bazan, Neuron 7: 197-208 (1991b); Hill et al., Journal of molecular biology 322: 205-233 (2002); Rozwarski et al., Structure 2: 159-173 (1994)). De hecho, un resto revelador de citocina helicoidal ancestral (fuera de la relación de doblez tridimensional) es la similitud en estructuras exón/intrón de sus genes respectivos (Bazan, Cell 65: 9-10 (1991a); Betts et al., The EMBO journal 20: 5354-5360 (2001)); en este aspecto, la estructura del gen IL-34 es homologa a los genes CSF-1, SCF y Flt3L.

Tanto IL-34 como CSF-1 unieron el receptor CSF-IR receptor con alta afinidad y actividad biológica similar inducida, si no idéntica (Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010); Lin et al., Science 320: 807-811 (2008)). Este fenómeno sorprendente condujo a la comparación directa de la estructura del compuesto IL-34 humana/CSF-IR con aquella del compuesto CSF-1 de murino/CSF-1R para determinar los mecanismos moleculares que gobiernan el compartir el receptor por estos ligandos estructuralmente similares pero evolucionalmente divergentes. Este análisis indicó que, CSF-1R utiliza un "modo de interfase dual" común para sus interacciones con ambas citocinas. El área de superficie accesible a solvente total escondida en la interfase entre IL-34 y CSF-1R es aproximadamente 2400 Á2, significativamente más grande que 1700 Á2 escondida en la interfase CSF-1/CSF-1R. Notablemente, las regiones de CSF-1R que interactúan con IL-34 y CSF-1 grandemente sobrepuestas, aún no son idénticas. Consistente con este resultado, el clon anti-CSF-lR mAb 12-2D6 que bloquea la señalización por ambas citocinas (Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010)), reconoce un epltope entre los residuos 1-308 dentro de los primeros tres dominios del receptor CSF-1R. 12-2D6 más probablemente funciona por la unión a un sitio en el receptor superponiendo los sitios de unión IL-34/CSF-1, y por lo tanto abroga la señalización del receptor irrespectiva de los ligandos. En contraste, el clon mAb 2-4A5 bloqueó CSF-1, pero no IL-34 que se une a células TF-l-fms al reconocer un epítope que reside entre residuos 349-512 (Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010)). Considerando que ese epítope es remoto de los sitios de unión a ligando de ambas citocinas, la habilidad de 2-4A5 para distinguir CSF-1 de IL-34 permanece un enigma. Sin embargo, el obstáculo estérico podría crearse por la geometría específica de este compuesto anticuerpo/CSF-1R, que afecta solamente la unión a CSF-1.

Los análisis adicionales revelaron diferencias sustanciales en tanto los números como los tipos de interacciones entre los dos compuestos de señalización CSF-1R. Las secuencias de CSF-1R de ratón y humano son más de 70% idénticas sin espacios dentro de D1-D3; permitiendo por lo tanto la comparación estructural directa de CSF-1R en el compuesto de IL-34 humana con aquel del compuesto CSF-1 de murino (Chen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 18267-18272 (2008)). Las interfaces del Sitio comparten un número de características comunes . La mayoría de las interacciones polares entre el bucle CSF-1R CD y hélice OÍB de ambas citocinas se medían por el mismo grupo de residuos básicos en el receptor (R142, R146, y R150) , que dictan el principio complementario de carga compartida en esta región (Figura 3A, B) . De modo interesante, estos tres residuos en CSF-1R permanecen invariantes mientras otros contactos interfaciales compartidos son más divergentes entre ortólogos CSF-1R en otras especies eucarióticas . Un residuo ácido centralmente ubicado (E103 en IL-34 y D59 en CSF-1) en la segunda vuelta de hélice B participa en puentes de sal en ambas estructuras . Las interacciones de unión a hidrógeno entre el bucle EF de CSF-IR y N85 en CSF-1 se sustituyen por un parche hidrofóbico cercano en el compuesto IL-34/CSF-1R.

Las diferencias más prominentes se ubican en los bordes de los bucles CD y EF de CSF-IR. Los puentes de sal ubicados en el borde inferior de los dos bucles de conexión entre K151CSF"1R, K168CSF"1R y E78CSF_1 están ausentes en IL-34/CSF-1R. En su lugar un puente de hidrógeno único que une N150IL"34 t R144CSF~1 lleva a IL-34 a contacto cercano con el borde superior del bucle CD. Las diferencias entre las interfases de Sitio 2 son aún más sorprendentes. En donde una red de unión a hidrógeno extensa entre el bucle CD, filamento D y bucles DE de CSF-IR y hélices aA, aC, y a4 en IL-34 forma el núcleo de la interfase en el Sitio 2. Aún, tales interacciones están completamente ausentes en el compuesto CSF-1/CSF-1R, resultando en una interfase de Sitio 2 mucho más pequeña. Sin embargo, las interacciones hidrofóbicas incluyendo V231 en el receptor se observaron en ambos compuestos .

Reordenamiento grande en la orientación del dominio D2-D3 receptor CSF-IR en la IL-34 contra compuestos citocina de CSF-1/receptor La orientación de los dominios receptores DI y D2 se conserva en ambos complejos de citocina/receptor; sin embargo la orientación del dominio D3 receptor relativo a DI- D2 mostró un cambio de 27° significativo cuando se comparan los dos compuestos. El compromiso por IL-34 activó una rotación entre D2 y D3 de CSF-lR, produciendo una pose casi lineal, alargada que es significativamente diferente de la configuración en vuelta de la forma unida a CSF-1. Esta orientación total de CSF-lR podría atribuirse, al menos en parte, a las distintas superficies moleculares IL-34, las cuales estéricamente no combinarían con CSF-lR sin inducir la nueva orientación observada en la estructura reportada en la presente. Los residuos de contacto del receptor, cuando se trazan sobre la estructura secundaria de ambas citocinas mostraron claramente que ambos sitios de interacción se extienden más en IL-34 que en CSF-1 (Figura 5A, 5B) . Esto se debe principalmente a las distintas características estructurales fuera del núcleo de haz de cuatro hélices, principalmente, o¡3 y a4. Por lo tanto, se crea una interfase más plana en IL-34, requiriendo una conformación más extendida del receptor, mientras CSF-1 sobresale más hacia una hendidura entre CSF-lR D2 y D3 creada de su orientación más "inclinada" . La interfase entre dominios cercanos D2 y D3 es mínima en el compuesto CSF-l/receptor, aún el único puente de sal entre D3 E230 y D2 K194 en ese compuesto se rompe en el compuesto IL-34/receptor, permitiendo que D2 y D3 adopten un orden casi lineal, más extendido en la unión a IL-34. La secuencia de articulación D2-D3 receptora 196NKVIPGP202 se reconfigura por sí misma completamente, utilizando K197 y G201 como los dos puntos de giro, mientras deja D1-D2 terminando con N196 y D3 iniciando con P202 con perturbaciones estructurales mínimas. De esta manera, la flexibilidad sustancial del codo entre los dominios D2 y D3 permite que la molécula CSF-1R se adapte a las distintas superficies de unión proporcionadas por IL-34 y CSF-1 (Figura 5A, 5B) . En contraste, la región D1-D2-D3 receptora de KIT pareció comportarse como un cuerpo rígido en la unión a SCF, donde D4 y D5 realinean y median las interacciones de receptor-receptor entre las dos moléculas KIT unidas a SCF (Yuzawa et al., Cell 130: 323-334 (2007)). En Kit, existe una interfase hidrofóbica significativa entre los dominios D2-D3, que está ausente en CSF-1R. La flexibilidad de inter-dominio se ha utilizado como un mecanismo adaptador por el cual múltiples proteínas virales utilizan el mismo receptor de célula huésped para entrada. Dos proteínas estructuralmente no relacionadas, la hemaglutinina de virus de sarampión y nudos de adenovirus tipo 11/21 comparten los primeros dos dominios SCR de CD46, el enlazador entre los cuales es estructuralmente demasiado plástico (Cupelli et al., Journal of virology 84: 3189-3200 (2010); Persson et al., Nature structural & molecular biology 14: 164-166 (2007); Santiago et al., Nature structural & molecular biology 17: 124-129 (2010)). Además, la perturbación de las orientaciones del campo receptor puede conducir a consecuencias funcionales pronunciadas, como se demuestra por una rotación de 14° en receptor de eritropoyetina (EPOR) en composición con péptido antagonista y agonista sintético (Livnah et al., Nature structural biology 5: 993-1004 (1998)). Se reporta que IL-34 indujo una activación más fuerte pero más transitoria de CSF-1R, y subregula más rápidamente los niveles de CSF- IR en comparación con CSF-1 (Chihara et al., Cell death and diff rentiation 17: 1917-1927 (2010)). Posiblemente esta reorientación de los dominios del receptor CSF-IR podría modular su potencia de señalización en combinación con la diferente afinidad a estas dos citocinas.

Uniones D3-D4 CSF-1R igualmente separadas en los compuestos cebadores D4 , D5 de señalización de citocina/CSF-lR para señalización degenerativa Las interacciones homotípicas mediadas por receptor se han propuesto para jugar un papel indispensable en la activación de RTKs tipo III. Tales interacciones ya sea se han capturado estructuralmente en el caso de KIT D4 (Yuzawa et al., Cell 130: 323-334 (2007)) y VEGFR2 D7 (Yang et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107: 1906-1911 (2010)), o caracterizado bioquímicamente en el caso de ??T? ß (Shim et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107: 11307-11312 (2010)). La naturaleza de estas interacciones es un par de puentes de sal recíprocos en el bucle EF entre los dos dominios KIT D4 receptores (D7 en VEGFR o D4 en PDGFR) . Debido a la identidad de secuencia relativamente alta entre CSF-IR y KIT, enfatizada por este par iónico conservado en CSF-IR D4 , las interacciones homotxpicas de receptor similares probablemente también accionan la dimerización de CSF-IR al transmitir la señal de unión a ligando a través de la membrana. Dado que los análisis biofísicos descritos en la presente indicaron una estoquiometría 2:2 de compuestos IL-34/CSF-1R en solución, el 2:1 compuesto IL-34/CSF-1R observado en la estructura de cristal se influenció más probablemente por fuerzas de empacado de cristal. De esta manera, el compuesto de señalización de ligando/receptor 2:2 completo esperado se modeló al aplicar la simetría doble entre dos promotores de IL-34 a CSF-IR. Cuando la copia ausente de CSF-IR se agrega al sitio sin ocupar en el dímero IL-34, la Distancia (60 Á) entre los dos términos C de CSF-IR D3 en este modelo 2:2 IL-34/CSF-1R es muy similar a aquella en el modelo 2:2 CSF-1/CSF-1R (62 Á) , y a aquella en la estructura 2:2 SCF/Kit (64 Á) (Figura 6) . Tomados juntos, aunque la articulación entre CSF-IR D2-D3 puede adoptar conformaciones muy diferentes para adaptarse a distintas topografías de superficie de las dos citocinas, la reorientación de D2-D3 resulta sin embargo en la unión D3-D4 separándose equivalentemente en los dos - - compuestos de señalización de citocina/receptor, presentando CSF-1 D4 como un punto convergente para interacciones homotípicas para producir respuestas degenerativas corriente abaj o .

Promiscuidad de unión a ligando en CSF-1R utiliza distintos mecanismos de receptores de citocina hematopoyéticos compartidos El mecanismo molecular de promiscuidad de unión a citocina se ha descifrado para un número de receptores de citocina compartidos tales como la cadena gamma común (ye) , gpl30 y receptores de interferón (IFNAR1/2) , ya que se han capturado de manera estructura en al menos dos estados unidos a ligando diferentes (Thomas et al., Cell 146: 621-632 (2011); Wang et al., Annual review of immunology 27: 29-60 (2009) ) . Los ectodominios de tanto ye como gpl30 contienen una región de homología de unión a citocina (CHR) que consiste de dos dominios de fibronectina similar a Ig tipo-III (FNIII) (Wang et al., Annual review of immunology 27: 29-60 (2009) ) . Aunque el sitio de unión a citocina se aloja en la unión de interdominio en ambos receptores de citocina clase I compartidos, no se han observado movimientos de codo significativos al comparar el compuesto cuaternario IL-2/yc con complejo terciario IL-4/yc (LaPorte et al., Cell 132: 259-272 (2008); Wang et al., Science 310: 1159-1163 (2005)), o gpl30 no ligado con tres compuestos de citocina de la - - familia gpl30 (Boulanger et al., Molecular cell 12: 577-589 (2003a); Boulanger et al., Science 300: 2101-2104 (2003b); Bravo et al., The EMBO journal 17: 1665-1674 (1998); Chow et al., Science 291: 2150-2155 (2001)). Aún los estados rotaméricos de los residuos interfaciales en ye y gpl30 permanece grandemente sin cambiar en la unión a diferentes citocinas (Wang et al., Annual review of immunology 27: 29-60 (2009) ) . ye y gpl30 utilizan "superficies complementarias químicamente inertes" , con una región de núcleo hidrofóbico compartida rodeada por parches polares periféricos, para reconocer citocinas de cadena larga y cadena corta, respectivamente (Boulanger et al., Molecular cell 12: 577-589 (2003a); Wang et al., Annual review of immunology 27: 29-60 (2009) ) . Los compuestos de receptor IFN tipo I recientemente determinados revelaron que los parálogos IFNOÍ2 e IFNo se intercalan entre los primeros tres dominios FNIII de IFNAR1 (SD1-SD3) y los dos dominios similares a FNIII del IFNAR2 más compacto (DI, D2) (Thomas et al., Cell 146: 621-632 (2011)). De manera interesante, aunque el dominio SDl N-terminal gira relativa al segmento SD2-SD3 de IFNAR1 en unión a IFN, una vez que se une a IFN, IFNAR1 muestra conformaciones casi idénticas sin considerar la identidad de la citocina unida. Tanto IFNAR1 como IFNAR2 se basan en unos pocos residuos conservados de "punto de sujeción" en la superficie de IFNs tipo I para reactividad cruzada (Thomas et al., Cell 146: 621-632 (2011) ) . Sin embargo un número de aminoácidos menos conservados se intercalan a través de la constelación de IFNs conservados que se une a la superficie para cambiar de buena manera su afinidad de unión individual hacia el receptor.

En comparación, la base estructura de promiscuidad de CSF-IR es muy diferente de los receptores de citocina compartidos mencionados arriba. La arquitectura de núcleo e interfase de unión periférica en CSF-IR de alguna manera es similar al paradigma de reconcomiendo de citocina/receptor clase I, aunque CSF-IR utiliza interacciones principalmente polares en el Sitio 1 como su núcleo, en lugar de interacciones hidrofóbicas como se observó en ye y gpl30. CSF-IR se basa claramente en un mayor grado en su plasticidad conformacional para permitir la reactividad cruzada, una adaptación estructural no observada en otros receptores de citocina compartidos. Esto tal vez no es sorprendente, considerando que IL-34 comparte principalmente 11% de identidad de secuencia con CSF-1 ha eluido el reconocimiento por rutinas bioinformáticas predictivas (Conklin et al., Bioinformatics 21: 1776-1781 (2005)), aunque son mejores métodos de reconocimiento de pliegue más sensibles (JFB, sin publicar) . CSF-IR logra mantener la afinidad impactante hacia IL-34 y CSF-1 durante la evolución por una combinación de plasticidad estructural inter-dominio y cambios de composición de residuos interfaciales. Esto proporciona un mecanismo muy eficiente aunque no el único, como se atestigua en otros sistemas de citocina, de reconocimiento degenerado de citocinas helicoidales distantemente relacionadas.

Ejemplo 2 : Caracterización de anticuerpos anti-IL-34 de humano Métodos Trazado de epítope por ELISA de competencia Las placas ELISA se revisten con 1H muIL-34flag (1 ug/ml) en PBS a 4°C durante la noche o a temperatura ambiente por 2 horas y se bloquean utilizando PBS con 1%BSA y 0.15% Tween20. Anticuerpo YW404.33 biotinilado a una concentración de 30 nraolar se agregó a siete diluciones seriales de anticuerpo anti-IL-34 a probarse iniciando a una concentración de 300 nmolar. Las mezclas de anticuerpo se preincubaron brevemente a temperatura ambiente . Las mezclas se agregaron entonces a las placas ELISA revestidas y se incubaron por aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se enjugaron y el anticuerpo biotinilado unido se detectó con SA-HRP. Anti-muIL-34 y Herceptin se utilizaron como controles en este ensayo .

Resultados Los anticuerpos anti-IL-34 de humano se generaron utilizando tecnología de despliegue de fago y se probaron por su habilidad para neutralizar la actividad de IL-34 en ensayos a base celular como se describe en el Ejemplo 1. La actividad neutralizante de anticuerpo anti IL-34 YW404.1, YW404.6 y YW404.33, por ejemplo, se muestra en la Figura 9A. Se compara la especificidad de estos anticuerpos para IL-34 humana contra murino así como su actividad de bloqueo, y afinidad de unión (Tabla 7) . Además, estos anticuerpos se probaron en una ELISA de competencia para determinar si se unen a epítopes de sobreposición en IL-34 (Tabla 7) .

Tabla 7: Comparación de YW404.1, YW404.6, Y 404.33 Varios anticuerpos anti-IL-34 de humano son maduros entonces por afinidad utilizando estrategia de aleatorización suave y su afinidad se midió como se describió en el Ejemplo 1. Los anticuerpos madurados por afinidad se prueban además en ensayos de neutralización a base de célula como se describe en el Ejemplo 1. Como se muestra en la Figura 9B, la mejorada por afinidad correlacionada con mejor actividad de bloqueo celular para anti IL-34 Abs YW404.33, YW404.33.12 y YW404.33.56.

Además, se determinaron los valores IC50 en base a la habilidad del anticuerpo para neutralizar la bioactividad de IL-34 en células mononucleares M FS60. Para medir la habilidad del anticuerpo para neutralizar la bioactividad de mIL-34 marcado con señal en MNFS50, se utiliza un ensayo de proliferación celular por CellTiter-Glo® . En base a la respuesta celular a las diluciones seriales de IL-34, 50 ng/ml de cantidad de IL-34 se selección para determinar la actividad neutralizante del anticuerpo. La Concentración Inhibidora Máxima Media (IC50) se define como la concentración de anticuerpo requerida para producir inhibición máxima media de actividad de IL-34 en células, cuando IL-34 está presente en una concentración para producir 70-80% de respuesta a proliferación. 50 ng/ml hIL-34 se combinaron con diluciones seriales de mAbs anti-IL34 antes de agregar en células en un volumen total de 100 ul. La actividad de inhibición de anticuerpo se obtuvo al medir RLU después de incubar las placas a 37°C por 72 horas. IC50 se calculó con KaleidaGraph. Por ejemplo, anti IL-34 Abs YW404.33.56, 404.33 y YW 404.33.93 tuvo valores IC50 de 20.21 ng/ml, 77.42 ng/ml y 31.62 ng/ml, respectivamente.

Las secuencias de la cadena pesada y ligera variable y las regiones CDR de estos anticuerpos así como - - YW404.1, YW404.6, YW405.3, YW404.33.10 YW404.33.12 y YW404.33.il se muestran en las Figuras 10A y 10B.

E emplo 3 : Inhibición de enfermedad inflama oria intestinal inducida por DSS en ratones utilizando una combinación de anticuerpo anti-CSF-1 y anticuerpo anti-IL-34 Métodos Los ratones Balb/c se pre-pesaron y aleatorizaron antes del tratamiento y se trataron como sigue. Grupo 1 (n=8 por grupo) recibió agua para beber normal sin dextrán sulfato de sodio (DSS) a través del experimento. Los Grupos 2 - 6 se mantienen en agua para beber con 3% DSS (dextrán sulfato de sodio 3g/100 mi (3%)) del día 0 al día 6 del experimento. Después del día 6, los grupos 2 - 6 recibieron agua para beber normal sin DSS hasta que se sacrificaron. El Grupo 2 se trató con 400 ug anticuerpo anti-ambrosía (a-RW-mIgG2 a) cada otro día iniciando un día antes del día 0 hasta el día 8 como control negativo. El Grupo 3 se trató diariamente, iniciando un día antes del día del día 0 hasta el día 8, con 25 mg/kg ciclosporina A en 0.9% cloruro de sodio (CSA) , intraperitonealmente . El Grupo A se trató con 200 ug de un anticuerpo anti-CSF-1 (anticuerpo de rata de ATCC #CRL-2702, clon 5A1) y 200 ug anticuerpo a-RW cada otro día iniciando un día antes del día 0 hasta el día 8. El Grupo 5 se trató con 200 ug anticuerpo anti-IL-34 (YW 404.33.12) y 200 ug anticuerpo a-RW cada otro día iniciando un día antes del día O hasta el día 8. El Grupo 6 se trata con 200 ug anticuerpo anti-CSF-1 de rata de ATCC #CRL-2702, clon 5A1) y 200 ug anticuerpo anti-IL-34 (YW 404.33.12) cada otro día iniciando un día antes del día 0 hasta el día 8. Todos los ratones se sacrificaron el día 8 y su puntuación de severidad de colitis se determinó en base a los parámetros tales como cryptloss e infiltración de células inflamatorias incluyendo células T, células B y macrófagos.

Resultados Los ratones con IBD inducida con DSS que se trataron con ya sea el anticuerpo anti-IL-34 o el anticuerpo anti-CSF-1 mostraron una puntuación de severidad de colitis reducida en comparación con los ratones tratados con el anticuerpo a-R de control. La inhibición de tanto, CSF-1 como IL-34 utilizando una combinación del anticuerpo anti-CSF-1 y el anticuerpo anti-IL-34 fue aún más efectiva en este modelo IBD (Figura 11) .

La inclusión de IL-34 y CSF-1 en IBD se soportó además al medir los niveles de suero de IL-34 y CSF-1 en ratones de control (no DSS) y los ratones con IBD inducida con DSS se trataron con anticuerpo de control (a-RW) . Los niveles de CSF-1 e IL-34 se determinaron utilizando ELISAs . Los ratones con IBD inducida por DSS tratados con anticuerpo de control mostraron niveles elevados de IL-34 y CSF-1 en comparación con los ratones de control (Figura 12) .

Ejemplo 4 - IL-34 y CSF-1 en pacientes con AR humanos La expresión de CSF-1, IL-34 y proteína TNFalfa en el suero, fluido sinovial y tejido de pacientes con artritis reumatoide se muestra en la Figura 13. IL-34 se expresa a niveles inferiores que CSF-1 y TNFalfa en aquellos fluidos. La coloración ICH de tejido sinovial de pacientes con AR con anticuerpo anti-IL34 indica que IL-34 probablemente se enriquece en el tejido/matriz extracelular (ECM) .

Los resultados de microconjunto que miden la expresión genética de genes de subtipo Mieloide en las articulaciones de pacientes con AR quienes (A) respondieron a bloqueo TNF (TNF-R) o no respondieron a un bloqueo TNF (TNF-NR) o (B) quienes se trataron con rituximab después de tratamiento no responsivo con un bloqueo TNF se muestran en la Figura 14A-B. Los no respondedores de Rituximab son wRituximab-NR" y los respondedores de rituximab son "Rituximab-R. " El subtipo mieloide se enriquece para respondedores anti-TNF (TNF-R) . Los resultados también indican que la trayectoria CSF1/IL34 se incluye en pacientes TNF-NR primarios y secundarios con AR. Ya que las transcripciones de IL34 y CSF1 están presentes a niveles altos en TNF-NR y Rituximab-NR es probable que la trayectoria IL34/CSF1 contribuya significativamente a patogenicidad en estos pacientes que no responden a terapia con anti-TNFa o Rituximab. El bloqueo de ambas citocinas en estos pacientes probablemente debe requerirse para beneficio clínico.

Ejemplo 5 - Inhibición de tanto IL-34 como CSF-1 en modelos CIA La combinación de tratamiento de anticuerpo anti-CSF1 con anticuerpo anti-IL34 se compararon contra TNFRII-Fc en un modelo CIA de ratón (Figura 15) . Los ratones DBA-1J se inyectaron con colágeno bovino tipo II en CFA el día 0 y 21 por i.d. La puntuación de artritis se monitorea entonces diariamente . El tratamiento con anticuerpo inició en ya sea el día 24 o día 31 (artritis establecida, 'puntuación clínica = 4) por 7 semanas antes de la terminación. Los tratamientos con anticuerpo fueron: a-ambrosía (control de isotipo de mIgG2a de anticuerpo) , TNFRII-Ig (mIgG2a) , anti-muCSFl (local, mIgG2a) , anti-IL34 (YW404.33.12 , mIgG2a) , anti-mCSFl+anti-IL34 (combinación de 3 &4) , anti-mCSFl (DANA) +anti-IL34 (YW404.33.12 DANA). Todos los animales (n=10/grupo) se trataron con 200ug/animal, 3 veces/semanas de los reactivos anteriores por ip. por 7 semanas antes de la terminación. El punto final PD incluyendo puntuación clínica longitudinal, histopatología (pata y tejidos relacionados), FACS (subconjuntos de monocitos de tejido y Mf) y análisis de volumen óseo (uCT) .

El estudio muestra la mejor inhibición comparable o de tendencia de puntuaciones clínicas y puntuaciones de histología (inflamación, fibroplasia, cartílago) con la combinación de anticuerpo anti-CSFl y anticuerpo anti-IL-34 sobre TNFRII-Fc, especialmente con los anticuerpos que tienen actividad ADCC reducida (es decir, mutación DANA es D265A, N297A en la región Fe) . Además, el tratamiento con una combinación de aCSFl+aIL34 es claramente superior en comparación con TNFRII-Fc para proteger contra erosiones óseas, y además, el tratamiento con la combinación de anti-CSFl y anticuerpos anti-IL-34 es superior a cualquiera solo.

Ejemplo 6 - Inhibición de tanto IL-34 como CSF-1 en modelos IBD adicionales En otro modelo para IBD, colitis DSS se indujo en ratones C57BL/6J, ratones de 6-8 semanas de edad (Figura 16A-C) . A los ratones C57B6 se administró oralmente 3% DSS por 5 días para inducir colitis aguda, caracterizado por daño epitelial, pérdida reversible de peso e infiltración neutrofílica en intestino grueso. El tratamiento con anticuerpo inició en -1 día con 4 dosis totales. El estudio se terminó el día 8 para análisis. Los grupos de tratamiento (n=10/grupo) : 3% DSS + a-ambrosía (mIgG2a control, 400 ug/ratón. ip) , 3% DSS + a-mCSFl Ab (local, 200ug/mouse, ip) , 3% DSS + a-IL34 Ab (YW404.33.12 , 200ug/mouse ip.), 3% DSS + a-mCSFl/a-IL34 (200ug/mouse a-CSFl and 200ug/mouse a-IL34, ip.). Dexametasona se administró a 0.5 mg/kg, QD, ip. Los ratones simples no se tratan con DSS. El anticuerpo anti-ambrosía se utilizó como un control negativo. Después de la terminación de la puntuación de histología de colón se lee para este modelo.

El análisis de ratones con colitis TNFAARE mostró que hay una expresión más alta de CSF-1/IL-34 y CSF-IR y ARNm cuando hay una proliferación celular mieloide más alta y activación (datos no mostrados) . Mf y monocitos se proliferan y activan de manera significativa en bazo de ratones TNFAARE. Los ratones TNFAARE produjeron CSF-1 y IL-34 más alto en tejido gotoso en comparación con ratones tipo silvestre (wt) . Los niveles de expresión más altos de ARNm de CSF-IR, CSF1 & IL-34 se observaron en íleo de ratones TNFAARE en comparación con los ratones tipo silvestre.

Ejemplo 7 - IL-34 y CSF-1 en pacientes con ÜC y Crohn de humano Un análisis de CSF-1 y proteína IL-34 de suero y tejido de pacientes humanos que padecen enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa mostró que IL-34 se expresa en niveles muy bajos en el suero, pero se expresa a niveles más altos en tejido. CSF-1, por el otro lado, se expresa bien en los sueros y en tejido (Figura 17) . Este dato de tejido soporta además la creencia de que la inhibición de tanto IL-34 como CSF1 en enfermedad inflamatoria intestinal, incluyendo colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn, será superior a tratar pacientes con IBD con inhibidores de cualquiera solo.

En pacientes con AR, la expresión de proteína IL-34 - 34 - fue inferior a CSF1, pero fácilmente detectable en suero y fluido sinovial. En aquellos mismos pacientes, la expresión de proteína CSF-1 se expresó altamente tanto en el suero como el fluido sinovial (Figura 13) .

Un análisis de IL-34, CSF-1 y proteína TNFalfa en el fluido sinovial de pacientes con AR y osteoartritis mostró que no hay correlación entre los niveles de expresión de IL-34/CSF-1 y TNFa en aquellos fluidos en pacientes con artritis reumatoide y osteoartritis (Figura 18) . Por lo tanto, los datos indican que son pacientes que padecen de RA y osteoartritis que tienen distintos perfiles moleculares, es decir, expresión de TNFalfa contra expresión de CSF-l/IL-34, a pesar de sus fenotipos similares.

Ejemplo 8 - Inhibición de IL-34 y CSF-1 reduce la infiltración de células mieloides CIA de ratón se dispuso como se mencionó previamente. La célula/tejido sinovial de articulación animal se recolectan de los ratones tratados por una combinación a-CSFl+a-IL34 Abs o anti-ambrosía dos veces al inicio del día 39 (CIA establecida, puntuación clínica = 4) =en periodos de 7 días (n=3 / muestra) . Los animales se sacrificaron después de 7 días de tratamiento. El tej ido/células sinoviales de articulación se recolectan y se digieren en colagenasa para suspensión de célula única. Las células se colorean con anticuerpos marcados anti-CDllb, Ly6C, Ly6G y F4/80 (compra de BD Biosystem) . Las células marcadas se analizan por citometría de flujo para definir los subconjuntos mieloide (Mf: CDllb+/F480+, monocitos inflamatorios: CDllb+/Ly6C+/Ly6Glow y monocitos residenciales: CDllb+/Ly6G+/Ly6Clow) .

Este dato muestra la reducción de células mieloide de ratón (Mf y monocitos) que infiltran al articulación sinovial después de solamente 7 días de tratamiento de combinación anti-CSFl/IL-34 de animales ya artríticos antes de que pueda observarse cualquier beneficio clínico. Esto muestra que un mecanismo principal para inhibición de mieloide como el resultado de inhibición de terapia combo, es la reducción de migración de célula mieloide, infiltración y/o expresión en sinovia.

Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, las descripciones y ejemplos no deberían construirse como limitando el alcance de la invención. Las descripciones de todas las patentes y literatura científica citada en la presente se incorporan de manera expresa en su totalidad para referencia. Estas descripciones incluyen la publicación citada como Ma et al., (2012) Structure 20:676-687 y la Solicitud Provisional de Estados Unidos No. 61,595,658, presentada el 6 de Febrero de 2012 y Solicitud Provisional de Estados Unidos No. 61/680,674, presentada el 7 de Agosto de 2012, de la cual esta solicitud reclama beneficio, todas de las cuales se incorporan para referencia en su totalidad.

Claims (92)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado que se une a una IL-34 humana, cuyo anticuerpo se une a un epitope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido Glul03, Leul09, Glnl06, Asnl50, Leul27, Asnl28, Serl84, Leul86, Asnl87, Lys44, Glul21, Aspl07, Glulll, Serl04, Glnl20, Trpll6, y Asn61 de una IL-34 humana, en donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1, y en donde el anticuerpo inhibe la unión entre IL-34 humana y CSF- IR humano.

2. Un anticuerpo aislado que se une a una IL-34 humana, cuyo anticuerpo se une a un epitope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido desde Glul03 hasta Asnl50 de una IL-34 humana, en donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la SEC ID NO: 1, y en donde el anticuerpo inhibe la unión entre IL-34 humana y CSF-1R humano.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o reivindicación 2, cuyo anticuerpo se une a un epitope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido Glul03, Leul09, Glnl06, y Asnl50 de la IL-34 humana, en donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1.

4. El anticuerpo de la reivindicación 3, en donde el epitope comprende además al menos uno de los residuos de aminoácido SerlOO, Glul23, Trpll6, Thrl24, Leul27, Asnl28, Glnl31, y Thrl34 de la IL-34 humana, en donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1.

5. El anticuerpo de la reivindicación 3 o reivindicación 4, en donde el anticuerpo se une a aminoácidos dentro de las posiciones 100-108, 116-134, 109 y 150 de la IL-34 humana, y en donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1.

6. El anticuerpo de la reivindicación 1, cuyo anticuerpo se une a un epítope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido Asnl28, Serl84, Leul86, Asnl87, Lys44, y Glul21 de la IL-34 humana, en donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1.

7. El anticuerpo de la reivindicación 6, en donde el epítope comprende además al menos uno de los residuos de aminoácido Phe40, Asp43, Leul25, Glnl89, Thr36, y Vall85 de la IL-34 humana, en donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1.

8. El anticuerpo de la reivindicación 6 o reivindicación 7, en donde el anticuerpo se une a aminoácidos dentro de las posiciones 36-44, 121-128, y 184-187 de la IL-34 humana, y en donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1.

9. El anticuerpo de la reivindicación 1 o reivindicación 2, cuyo anticuerpo se une a un epítope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido de Glul03-Leul27 de la IL-34 humana, en donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1.

10. El anticuerpo de la reivindicación 1, cuyo anticuerpo se une a un epítope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido Aspl07, Glulll, Serl04, Glnl20, Glul03, Leul09, Trpll6, y Asn61 de la IL-34 humana, en donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1.

11. El anticuerpo de la reivindicación 10, en donde el epítope comprende además al menos uno de los residuos de aminoácido Prol52, Vall08, LeullO, Glnl06, Glul23, Leul27, Lysll7, Ile60 y Lys55 de la IL-34 humana, en donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1.

12. El anticuerpo de la reivindicación 10 o reivindicación 11, en donde el anticuerpo se une a aminoácidos dentro de las posiciones 55-61, 100-108, 109, 111-127 y 152 de la IL-34 humana, y en donde la posición de los residuos de aminoácidos se basa en la posición en la SEC ID NO: 1.

13. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 , en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4.

14. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4.

15. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde el anticuerpo comprende (a) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33); (b) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) ; y (c) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52) .

16. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos STWIH (SEC ID NO: 59) ; (b) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52) ; y (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) .

17. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 y 16, en donde el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ; (b) una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (c) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) .

18. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde el anticuerpo se une a un dímero de la IL-34.

19. El anticuerpo de la reivindicación 18, en donde el anticuerpo se une a un epítope que se extiende sobre ambos protomeros del dímero de la IL-34 humana.

20. Un anticuerpo aislado que se une a una IL-34 humana, en donde el anticuerpo inhibe la unión entre IL-34 humana y CSF-1R humano, y en donde el anticuerpo se une a un dímero de la IL-34.

21. El anticuerpo de la reivindicación 20, en donde el anticuerpo comprende (a) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) o GINQGSKRGAMDY (SEC ID NO: 32) ; (b) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) o QQSYTTPPT (SEC ID NO: 43) o QQYTALPYT (SEC ID NO: 49) o QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) o QQYSDVPYT (SEC ID NO: 47) o QQSRTARPT (SEC ID NO: 41) ; y (c) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52) o RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51) .

22. El anticuerpo de la reivindicación 20, en donde el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos STWIH (SEC ID NO: 59) ; (b) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYYYYSDYADSVKG (SEC ID NO: 52) o RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51) ; y (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) o GINQGSKRGAMDY (SEC ID NO: 32) .

23. El anticuerpo de la reivindicación 20 o reivindicación 22, en donde el anticuerpo comprende (a) una HVR-Ll que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ; (b) una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (c) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSFYFPNT (SEC ID NO: 39) O QQSYTTPPT (SEC ID NO: 43) O QQYTALPYT (SEC ID NO: 49) O QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) O QQYSDVPYT (SEC ID NO: 47) o QQSRTARPT (SEC ID NO: 41) o QQSFYFPN (SEC ID NO: 38) o QQSYTTPP (SEC ID NO: 42) O QQYTALPY (SEC ID NO: 48) o QQYSDLPY (SEC ID NO: 44) O QQYSDVPY (SEC ID NO: 46) o QQSRTARP (SEC ID NO: 40) .

24. El anticuerpo de la reivindicación 20, en donde el anticuerpo comprende (a) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33); (b) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) ; y (c) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51) .

25. El anticuerpo de la reivindicación 20, en donde el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos de STWIH (SEC ID NO: 59) ; (b) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos RISPYSGYTNYADSVKG (SEC ID NO: 51); y (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos GLGKGSKRGAMDY (SEC ID NO: 33) .

26. El anticuerpo de la reivindicación 20 o reivindicación 25, en donde el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ; (b) una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53) ; y (c) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQYSDLPYT (SEC ID NO: 45) .

27. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6.

28. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6.

29. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8.

30. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8.

31. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 9 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10.

32 El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 9 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10.

33. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 11 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 12.

34 El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 11 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 12.

35. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 13 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 14.

36. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 13 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 14.

37. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 20-36, en donde el anticuerpo se une a un epítope que se extiende sobre ambos protómeros del dímero de la IL-34 humana.

38. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 20-37, en donde el anticuerpo neutraliza la actividad de IL-34.

39. Un anticuerpo aislado que se une a una IL-34 humana, en donde el anticuerpo inhibe la unión entre IL-34 humana y CSF-1R humano, y en donde el anticuerpo neutraliza la actividad de IL-34.

40. El anticuerpo de la reivindicación 39, en donde el anticuerpo comprende (a) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos SRGAYRFAY (SEC ID NO: 56) ; (b) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSYTTPPT (SEC ID NO: 43) y (c) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos SITPASGDTDYADSVKG (SEC ID NO: 54) .

41. El anticuerpo de la reivindicación 39, en donde el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos SNYIH (SEC ID NO: 55) ; (b) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos SITPASGDTDYADSVKG (SEC ID NO: 54); y (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos SRGAYRFAY (SEC ID NO: 56) .

42. El anticuerpo de la reivindicación 39 o reivindicación 41, en donde el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos RASQDVSTAVA (SEC ID NO: 50) ; (b) una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos SASFLYS (SEC ID NO: 53); y (c) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos QQSYTTPPT (SEC ID NO: 43) .

43. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 39-42, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 15 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 16.

44. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 39-43, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 15 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 16.

45. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo no inhibe la unión entre CSF-1 humano y CSF-1R humano.

46. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

47. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

48. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

49. El anticuerpo de la reivindicación 48, en donde el anticuerpo biespecífico comprende una segunda especificidad de unión a CSF-1 humano.

50. Un anticuerpo biespecífico que comprende una primera especificidad de unión a IL-34 humana (SEC ID NO. 1) y una segunda especificidad de unión a CSF-1 humano.

51. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 50, en donde el anticuerpo inhibe la unión de IL-34 humana a CSF-1R humano e inhibe la unión de CSF-1 humano a CSF-1R humano.

52. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un fragmento de anticuerpo que se une a IL-34 humana.

53. El fragmento de la reivindicación 52, en donde el fragmento es un fragmento Fab, Fab' , Fab' -SH, F(ab')2, Fv o scFv.

54. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-51, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de un brazo.

55. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-51, en donde el anticuerpo es un anticuerpo lineal .

56. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un anticuerpo IgGl o IgG4 de longitud completa.

57. Un anticuerpo aislado que se une a CSF-1R humano, cuyo anticuerpo se une a un epítope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido Argl44, Gln248, Gln249, Ser250, Phe252, y Asn254 de CSF-1R humano, en donde la posición del residuo de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2, y en donde el anticuerpo inhibe la unión entre IL-34 humana y CSF-1R humano.

58. El anticuerpo de la reivindicación 57, en donde el anticuerpo se une a un epítope que comprende el residuo de aminoácido Argl44 de CSF-IR, en donde la posición del residuo de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2.

59. El anticuerpo de la reivindicación 58, en donde el epítope comprende además al menos uno de los residuos de aminoácido Argl42, Argl46, y Argl50 de CSF-IR humano, y en donde la posición de los residuos de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2.

60. El anticuerpo de las reivindicaciones 58 o 59, en donde el epítope comprende además al menos uno de los residuos de aminoácido Serl72 y Argl92 de CSF-IR humano, y en donde la posición de los residuos de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2.

61. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 58 a 60, en donde el epítope comprende además al menos uno de los residuos de aminoácido Argl46, Metl49, Argl50, Phel69, Ilel70, y Glnl73 de CSF-IR humano, y en donde la posición de los residuos de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2.

62. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 58 a 61, en donde el anticuerpo se une a aminoácidos dentro de las posiciones 142-150 y 169-173, y en donde la posición de los residuos de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2.

63. El anticuerpo de la reivindicación 57, en donde el anticuerpo se une a un epítope que comprende al menos uno de los residuos de aminoácido Gln248, Gln249, Ser250, Phe252, y Asn254 de CSF-1R humano, en donde la posición del residuo de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2.

64. El anticuerpo de la reivindicación 63, en donde el epítope comprende además el residuo de aminoácido Tyr257 de CSF-1R humano, y en donde la posición del residuo de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2.

65. El anticuerpo de las reivindicaciones 63 o 64, en donde el epítope comprende además al menos uno de los residuos de aminoácido Pro247, Gln258, y Lys259 de CSF-1R humano, y en donde la posición de los residuos de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2.

66. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 63 a 65, en donde el epítope comprende además al menos uno de los residuos de aminoácido Val231, Asp251, y Tyr257 de CSF-1R humano, y en donde la posición del residuo de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2.

67. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 63 a 66, en donde el anticuerpo se une a residuos de aminoácido dentro de las posiciones 231, 248-252, y 254, y en donde la posición de los residuos de aminoácido se basa en la posición en la SEC ID NO: 2.

68. Un ácido nucleico aislado que codifica para el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

69. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 68.

70. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 69.

71. Un método para producir un anticuerpo, que comprende cultivar las células huésped de la reivindicación 70 de manera que se produzca el anticuerpo.

72. El método de la reivindicación 71, que comprende además recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped.

73. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-67, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

74. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-67 para usarse como un medicamento.

75. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-67 para usarse en el tratamiento de una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide.

76. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-67 para usarse en la inhibición de la unión entre IL-34 humana y CSF-1R humano.

77. El uso del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-67 en la elaboración de un medicamento.

78. El uso de la reivindicación 77, en donde el medicamento es para tratar una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide.

79. El uso de la reivindicación 77, en donde el medicamento inhibe la unión entre tanto IL-34 humana y CSF-1R humano como CSF1 humano y CSF1R humano.

80. Un método para tratar a un individuo que tiene una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-67.

81. Un método para tratar a un individuo que tiene una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-47 junto con un anticuerpo que se une a CSF-1 humano.

82. El método de la reivindicación 80, en donde el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico y en donde se inhibe la actividad de IL-34 humana y CSF-1 humano.

83. El método de la reivindicación 81, en donde se inhibe la actividad de IL-34 humana y CSF-1 humano.

84. El método de la reivindicación 82 o la reivindicación 83, en donde se inhibe la unión de IL-34 humana a CSF-1R humano, y en donde se inhibe la unión de CSF-1 humano y CSF-1R humano.

85. El método de cualquiera de las reivindicaciones 80 a 84, en donde la enfermedad inmunológica patogénica, mieloide es artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, síndrome activado por macrófago (SAM) , lupus discoide, sarcoidosis, vasculitis, y enfermedad de injerto contra huésped.

86. Un método para inhibir la unión entre IL-34 humana y CSF-1R humano en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-67.

87. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 80-86, en donde el individuo a tratarse tiene respuesta inadecuada a una terapia de TNF y/o terapia de rituximab para la enfermedad patogénica mieloide.

88. Un artículo de manufactura que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-67.

89. Un artículo de manufactura que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-47, y que comprende además un anticuerpo que se une a CSF-1 humano.

90. El artículo de manufactura de la reivindicación 88, que comprende además instrucciones para administrar una cantidad efectiva del anticuerpo a un individuo para tratar una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide en el individuo.

91. El articulo de manufactura de la reivindicación 88, que comprende además instrucciones para administrar una cantidad efectiva del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-47 y el anticuerpo que se une a CSF-1 humano, a un individuo para tratar una enfermedad inmunológica patogénica, mieloide en el individuo.

92. El artículo de manufactura de cualquiera de las reivindicaciones 87 a 91, en donde la enfermedad inmunológica patogénica, mieloide es artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal o esclerosis múltiple.