JP2015510510A - Csf1r阻害剤を用いるための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
「抗IL−34抗体」及び「IL−34に結合する抗体」という用語は、抗体が、IL−34のターゲティングにより診断剤及び/又は治療剤として有用であるように、IL−34に十分なアフィニティーで結合することが可能な抗体を指す。幾つかの実施態様では、抗IL−34抗体の、非類縁の非IL−34タンパク質への結合の程度は、例えば、BIACOREアッセイ又はBLIアッセイにより測定される、この抗体のIL−34への結合の約10%未満である。幾つかの実施態様では、IL−34に結合する抗体の解離定数(Kd)は、≦1μM、≦500nM、≦250nM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、又は≦0.001nM(例えば、10−8M以下、例えば、10−8M〜10−13M、例えば、10−9M〜10−13M)である。幾つかの実施態様では、抗IL−34抗体は、IL−34のエピトープであって、異なる種に由来するIL−34の間で保存されているエピトープに結合する。
A)24〜34(L1)、50〜56(L2)、89〜97(L3)、26〜32(H1)、52〜56(H2)、及び95〜102(H3)(Chothia及びLesk、J.Mol.Biol.、196:901〜917(1987));
B)L1の24〜34、L2の50〜56、L3の89〜97、H1の31〜35B、H2の50〜65、及びH3の95〜102(Kabatら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、5版、Public Health Service、National Institutes of Health、BetheSDa、MD(1991));並びに
C)30〜36(L1)、46〜55(L2)、89〜96(L3)、30〜35(H1)、47〜58(H2)、93〜101(H3)(MacCallumら、J.Mol.Biol.、262:732〜745(1996))を包含しうる。
100×割合X/Y
[式中、Xは、配列アライメントプログラムであるALIGN−2により、そのプログラムによるA及びBのアライメントにおいて同一なマッチとして評定されたアミノ酸残基の数であり、Yは、B内のアミノ酸残基の総数である]。アミノ酸配列Aの長さが、アミノ酸配列Bの長さと等しくない場合は、AのBに対するアミノ酸配列同一性%は、BのAに対するアミノ酸配列同一性%と等しくないことが察知されるであろう。別段に具体的に言明されない限り、本明細書で用いられる全てのアミノ酸配列同一性%の値は、直前の段落で記載した通りに、ALIGN−2コンピュータプログラムを用いて得られる。
本発明は、IL−34に結合する抗体、IL−34に対する第1の結合特異性及びCSF−1に対する第2の結合特異性を伴う二重特異性抗体(本明細書では更に、二重特異性抗IL−34/CSF−1抗体とも称する)、並びにCSF−1Rに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、例えば、炎症性腸疾患、関節リウマチ、及び多発性硬化症が含まれるがこれらに限定されない骨髄病原性免疫疾患を診断又は治療するのに有用である。幾つかの実施態様では、抗IL−34抗体は、哺乳動物(例えば、ヒト)IL−34に結合する。幾つかの実施態様では、二重特異性抗IL−34/CSF−1抗体は、哺乳動物(例えば、ヒト)IL−34に対する第1の結合特異性及び哺乳動物(例えば、ヒト)CSF−1に対する第2の結合特異性を含む。幾つかの実施態様では、抗CSF−1R抗体は、哺乳動物(例えば、ヒト)CSF−1Rに結合する。
抗IL−34抗体
一態様では、本発明は、IL−34に結合する単離抗体(例えば、ヒトIL−34)を提供する。本明細書で記載される抗IL−34抗体は、以下の特徴:(i)IL−34(例えば、ヒトIL−34)の、CSF−1R(例えば、ヒトCSF−1R)への結合の阻害;(ii)IL−34活性(例えば、ヒトIL−34活性)の中和;(iii)末梢血単核細胞の、IL−34誘導性増殖の阻害;(iv)IL−34(例えば、ヒトIL−34)の二量体への結合;(v)IL−34(例えば、ヒトIL−34)の両方のプロトマーにわたるエピトープへの結合;(vi)CSF−1(例えば、ヒトCSF−1)の、CSF−1R(例えば、ヒトCSF−1R)への結合の阻害が見られないことのうちの1又は複数を有しうる。幾つかの実施態様では、抗IL−34抗体の、非類縁の非IL−34タンパク質への結合の程度は、例えば、BIACOREアッセイ又はバイオレイヤー干渉(BLI)アッセイにより測定される、この抗体のIL−34への結合の約10%未満である。幾つかの実施態様では、IL−34に結合する抗体の解離定数(Kd)は、≦1μM、≦500nM、≦250nM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、又は≦0.001nM(例えば、10−8M以下、例えば、10−8M〜10−13M、例えば、10−9M〜10−13M)である。幾つかの実施態様では、抗IL−34抗体のKd値は、約500nM未満である。幾つかの実施態様では、抗IL−34抗体のKd値は、約100nM又は10nM未満である。幾つかの実施態様では、抗IL−34抗体のKd値は、約1nM未満である。幾つかの実施態様では、IL−34抗体のKd値は、約100pM未満である。幾つかの実施態様では、抗IL−34抗体のKdは、約100〜200pM、約100〜500pM、約100pM−1nM、又は約1nM〜50nMである。幾つかの実施態様では、抗IL−34抗体のKdは、約17nMである。幾つかの実施態様では、抗IL−34抗体のKdは、約120nMである。幾つかの実施態様では、抗IL−34抗体は、異なる種に由来するIL−34の間で保存されているIL−34のエピトープに結合する。
HVR−H1:SX1X2IH[配列中、X1は、N又はTであり、X2は、Y又はWである](配列番号64);
HVR−H2:X1IX2PX3X4X5X6X7X8YADSVKG[配列中、X1は、S又はRであり;X2は、T又はSであり;X3は、A又はYであり;X4は、S又はYであり;X5は、G又はYであり;X6は、D又はYであり;X7は、T又はSであり;X8は、D又はNである](配列番号65);
HVR−H3:SRGAYRFAY(配列番号56)、又はGX1X2X3GSKRGAMDY[配列中、X1は、L又はIであり;X2は、G又はNであり;X3は、K又はQである](配列番号66);
HVR−L1:RASQDVSTAVA(配列番号50);
HVR−L2:SASFLYS(配列番号53);
HVR−L3:QQX1IX2PX3X4X5X6T[配列中、X1は、S又はYであり;X2は、Y、T、S、F、又はRであり;X3は、T、A、D、又はYであり;X4は、T、L、V、F、又はAであり;X5は、P又はRであり;X6は、P、Y、又はNである](配列番号67)
のHVRのうちの何れか1つ、又はこれらのうちの2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは6つの任意の組合せを含む。
別の態様では、本発明は、CSF−1R(例えば、ヒトCSF−1R)に結合する単離抗体を提供する。一態様では、ヒトCSF−1Rのアミノ酸残基Arg144、Gln248、Gln249、Ser250、Phe252、及びAsn254のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つ、又は6つの少なくとも何れか1つを含むエピトープに結合する抗CSF−1R抗体が本発明において提供される。一態様では、ヒトCSF−1Rのアミノ酸残基Arg144を含むエピトープに結合する抗CSF−1R抗体が本発明において提供される。一態様では、ヒトCSF−1Rのアミノ酸残基Arg144、Arg142、Arg146、及びArg250のうちの1つ、2つ、又は3つ、又は4つの少なくとも何れか1つを含むエピトープに結合する抗CSF−1R抗体が本発明において提供される。上記の態様のうちの何れかの抗CSF−1R抗体は、ヒトCSF−1Rの少なくとも一つ又は2つのアミノ酸残基Ser172及びArg192を更に含むエピトープに結合しうる。上記の態様のうちの何れかの抗CSF−1R抗体は、ヒトCSF−1Rのアミノ酸残基Arg146、Met149、Arg150、Phe169、Ile170、及びGln173のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つ、又は6つの少なくとも何れか1つを更に含むエピトープに結合しうる。幾つかの実施態様では、抗CSF−1R抗体は、CSF−1Rの142〜150及び169〜172位内のアミノ酸に結合する。本明細書で用いられる、本明細書における残基位置は、配列番号2における残基位置に対応する。幾つかの実施態様では、抗CSF−1R抗体は、ヒトIL−34及び/又はヒトCSF−1の、ヒトCSF−1Rへの結合を阻害する。
幾つかの実施態様では、本明細書で提示される抗体の解離定数(Kd)は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、又は≦0.001nM(例えば、10−8M以下、例えば、10−8M〜10−13M、例えば、10−9M〜10−13M)である。
幾つかの実施態様では、本明細書で提示される抗体は、抗体断片である。抗体断片には、Fab断片、Fab’断片、Fab’−SH断片、F(ab’)2断片、Fv断片、及びscFv断片、並びに下記で記載される他の断片が含まれるがこれらに限定されない。ある種の抗体断片の総説については、Hudsonら、Nat.Med.、9:129〜134(2003)を参照されたい。scFv断片の総説については、例えば、Plueckthun、「Pharmacology of Monoclonal Antibodies」、113巻、Rosenburg及びMoore編、(Springer−Verlag、New York)、269〜315ページ(1994)を参照されたい。また、WO93/16185;並びに米国特許第5,571,894号及び同第5,587,458号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、in vivoにおける半減期を延長させたFab断片及びF(ab’)2断片の議論については、米国特許第5,869,046号を参照されたい。
幾つかの実施態様では、本明細書で提示される抗体は、キメラ抗体である。ある種のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号;及びMorrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:6851〜6855(1984))において記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサルなどの非ヒト霊長動物に由来する可変領域)とヒト定常領域とを含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスを、親抗体のクラス又はサブクラスから変化させた、「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を包含する。
幾つかの実施態様では、本明細書で提示される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で知られている多様な技法を用いて作製することができる。ヒト抗体は、van Dijk及びvan de Winkel、Curr.Opin.Pharmacol.、5:368〜74(2001);並びにLonberg、Curr.Opin.Immunol.、20:450〜459(2008)において一般に記載されている。
本発明の抗体は、コンビナトリアルライブラリーを、1又は複数の所望の活性を伴う抗体についてスクリーニングすることにより単離することができる。例えば、当技術分野では、ファージディスプレイライブラリーを創成し、このようなライブラリーを、所望の結合特徴を保有する抗体についてスクリーニングするための様々な方法が知られている。このような方法は、例えば、Hoogenboomら、「Methods in Molecular Biology」、178:1〜37(O’Brienら編、Humana Press、Totowa、NJ、2001)において総説されており、例えば、McCaffertyら、Nature、348:552〜554;Clacksonら、Nature、352:624〜628(1991);Marksら、J.Mol.Biol.、222:581〜597(1992);Marks及びBradbury、「Methods in Molecular Biology」、248:161〜175(Lo編、Humana Press、Totowa、NJ、2003);Sidhuら、J.Mol.Biol.、338(2):299〜310(2004);Leeら、J.Mol.Biol.、340(5):1073〜1093(2004);Fellouse、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、101(34):12467〜12472(2004);及びLeeら、J.Immunol.Methods、284(1〜2):119〜132(2004)において更に記載されている。
二重特異性抗体
二重特異性抗体とは、2つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。幾つかの実施態様では、二重特異性抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。幾つかの実施態様では、結合特異性のうちの1つは、IL−34(例えば、ヒトIL−34)に対する結合特異性であり、他の結合特異性は、任意の他の抗原に対する結合特異性である。幾つかの実施態様では、二重特異性抗体は、IL−34(例えば、ヒトIL−34)の2つの異なるエピトープに結合しうる。幾つかの実施態様では、二重特異性抗体は、IL−34に対する第1の結合特異性(例えば、ヒトIL−34)及びCSF−1に対する第2の結合特異性(例えば、ヒトCSF−1)を含む。幾つかの実施態様では、二重特異性抗体は、本明細書で記載される抗IL−34抗体のうちの何れかと同じIL−34上のエピトープに結合する。幾つかの実施態様では、二重特異性抗体は、本明細書で記載される抗IL−34抗体のうちの何れか1つの1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つ、又は6つのHVRのうちの少なくとも何れか1つを含む。二重特異性抗体は、全長抗体として調製することもでき、抗体断片(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)として調製することもできる。
幾つかの実施態様では、本明細書で提示される抗体のアミノ酸配列の変異体が想定される。例えば、抗体の結合アフィニティー及び/又は他の生物学的特性を改善することが所望でありうる。抗体のアミノ酸配列の変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列へと、適切な修飾を導入することにより調製することもでき、ペプチド合成により調製することもできる。このような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、及び/又は抗体のアミノ酸配列への挿入、及び/又は抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴、例えば、抗原結合特徴を保有するという条件で、欠失、挿入、及び置換を任意に組み合わせて、最終構築物に到達することができる。
幾つかの実施態様では、1又は複数のアミノ酸置換を有する抗体の変異体が提供される。置換突然変異誘発のための対象の部位には、HVR及びFRを組み入れる。保存的置換を、表1の「好ましい置換」の見出しの下に示す。より実質的な変化を、表1の「例示的な置換」の見出しの下に提示し、下記で更に記載される通り、アミノ酸側鎖のクラスに言及しながら提示する。アミノ酸置換を対象の抗体へと導入し、生成物を所望の活性についてスクリーニングすることができる。例えば、抗原への結合の保持/改善、免疫原性の減少、又はADCCもしくはCDCの改善。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖の配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe
幾つかの実施態様では、本明細書で提示される抗体を変化させて、抗体がグリコシル化される程度を増大又は減少させる。グリコシル化部位の、抗体への付加又は欠失は、1又は複数のグリコシル化部位を創出又は除去するようにアミノ酸配列を変化させることにより、簡便に達成することができる。
幾つかの実施態様では、1又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提示される抗体のFc領域へと導入し、これにより、Fc領域変異体を創成することができる。Fc領域変異体は、1又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾(例えば、置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のFc領域)を含みうる。
幾つかの実施態様では、システインで操作した抗体、例えば、抗体の1又は複数の残基をシステイン残基で置換した「チオmAb」を創出することが所望でありうる。特定の実施態様では、置換された残基は、抗体の接触可能な部位において生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基をそれにより抗体の接触可能な部位に配置し、これを用いて、抗体を、薬物部分又はリンカー−薬物部分などの他の部分へとコンジュゲートし、本明細書で更に記載されるイムノコンジュゲートを創出することができる。幾つかの実施態様では、以下の残基:軽鎖のV205(Kabatによる番号付け);重鎖のA118(EUによる番号付け);及び重鎖Fc領域のS400(EUによる番号付け)のうちの任意の1又は複数を、システインで置換することができる。システインで操作した抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号において記載される通りに創成することができる。
幾つかの実施態様では、本明細書で提示される抗体を、当技術分野で知られており、たやすく利用可能な、さらなる非タンパク質性部分を含有するように、更に修飾することができる。抗体の誘導体化に適する部分には、水溶性ポリマーが含まれるがこれらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1、3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(N−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中のその安定性に起因して製造における利点を有しうる。ポリマーは、任意の分子量のポリマーであることが可能であり、分枝状の場合もあり、非分枝状の場合もある。抗体へと接合されるポリマーの数は、変化させることができ、複数のポリマーを接合する場合、それらは、同じ分子の場合もあり、異なる分子の場合もある。一般に、誘導体化のために用いられるポリマーの数及び/又は種類は、改善される抗体の特定の特性又は機能、抗体の誘導体が規定された条件下における治療で用いられるのかどうかなどが含まれるがこれらに限定されない検討事項に基づき決定することができる。
抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号において記載されている組換え法及び組換え組成物を用いて作製することができる。幾つかの実施態様では、本明細書で記載される抗IL−34抗体、二重特異性抗IL−34/CSF−1抗体、又は抗CSF−1R抗体をコードする単離核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列及び/又は抗体のVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖及び/又は重鎖)をコードしうる。幾つかの実施態様では、このような核酸を含む1又は複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。幾つかの実施態様では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。幾つかの実施態様では、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、これらで形質転換されている)。幾つかの実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はリンパ細胞(例えば、Y0細胞、NS0細胞、Sp20細胞)である。幾つかの実施態様では、抗IL−34抗体、二重特異性抗IL−34/CSF−1抗体、又は抗CSF−1R抗体を作製する方法であって、抗体の発現に適する条件下で、上記で提示した抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、場合によって、抗体を宿主細胞(又は宿主細胞の培養培地)から回収することとを含む方法が提供される。
本明細書で提示される抗IL−34抗体、二重特異性抗IL−34/CSF−1抗体、及び抗CSF−1R抗体は、当技術分野で知られている多様なアッセイにより、同定することもでき、それらの物理的/化学的特性及び/又は生物学的活性についてスクリーニングすることもでき、これらについて特徴付けることもできる。
一態様では、本発明の抗体を、例えば、ELISA、ウェスタンブロットなどなど、知られている方法により、その抗原結合活性について調べる。
幾つかの実施態様では、本明細書で提示される抗IL−34抗体及び抗CSF−1Rのうちの何れかが、生物学的試料中のIL−34又はCSF−1Rの存在を検出するのに有用である。本明細書で用いられる「〜を検出すること」という用語は、定量的検出又は定性的検出を包摂する。幾つかの実施態様では、生物学的試料は、細胞又は組織を含む。
一実施態様では、CSF1−R経路阻害剤で治療されるRA患者は、RAの骨髄亜型又は線維亜型(F1及び/又はF2)に対応するRA患者である。ある種の実施態様では、M亜型の治療標的が、WO2011/028945の表6に列挙されている1つの遺伝子又は遺伝子の組合せから選択される。ある種の実施態様では、M亜型の治療標的が、WO2011/028945の表2に列挙されている1つの遺伝子又は遺伝子の組合せから選択される。ある種の実施態様では、M亜型の治療標的が、WO2011/028945の表11に列挙されている1つの遺伝子又は遺伝子の組合せから選択される。ある種の実施態様では、M亜型の治療標的が、WO2011/028945の表6に列挙されている1つの遺伝子又は遺伝子の組合せによりコードされる1つのタンパク質又はタンパク質の組合せから選択される。ある種の実施態様では、M亜型の治療標的が、WO2011/028945の表2に列挙されている1つの遺伝子又は遺伝子の組合せによりコードされる1つのタンパク質又はタンパク質の組合せから選択される。ある種の実施態様では、M亜型の治療標的が、WO2011/028945の表11に列挙されている1つの遺伝子又は遺伝子の組合せによりコードされる1つのタンパク質又はタンパク質の組合せから選択される。ある種の実施態様では、RAのM亜型の治療標的が、CLEC5A、CLEC7A、ALCAM、IL1RAP、IRAK1、NRP2、TREM1、及びVEGFのうちの1又は複数から選択される。
本明細書で記載される抗IL−34抗体、二重特異性抗IL−34/CSF−1抗体、又は抗CSF−1R抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するこのような抗体を、1又は複数の任意選択の薬学的に許容される担体(「Remington’s Pharmaceutical Sciences」、16版、Osol,A.編(1980))と、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で混合することにより調製する。薬学的に許容される担体は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して一般に非毒性であり、これらには、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸及びメチオニンを含めた抗酸化剤;保存剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;ベンゼトニウム塩化物;フェノール、ブチルアルコール、又はベンジルアルコール;メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸;単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含めた他の炭水化物;EDTAなどのキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);及び/又はポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤が含まれるがこれらに限定されない。本明細書の例示的な、薬学的に許容される担体には、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、rHuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International,Inc.)などのヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの間質用薬物分散剤が更に含まれる。rHuPH20を含めたある種の例示的なsHASEGP及び使用法は、米国特許公開第2005/0260186号及び同第2006/0104968号において記載されている。一態様では、sHASEGPを、コンドロイチナーゼなどの1又は複数のさらなる糖アミノグリカナーゼと組み合わせる。
本明細書で提示される抗IL−34抗体、二重特異性抗IL−34/CSF−1抗体、又は抗CSF−1R抗体のうちの何れかを、治療法において用いることができる。
候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増多症、気管支肺アスペルギルス症、アスペルギルス腫、又は好酸球を含有する肉芽腫などの好酸球関連障害、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節炎、多腺性内分泌性自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜炎、上強膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ブルトン症候群、乳児期一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット−アルドリッチ症候群、毛細管拡張性運動失調症、膠原病と関連した自己免疫性障害、リウマチ、神経疾患、虚血再灌流障害、血圧反応の低減、血管機能不全、血管拡張症、組織損傷、心血管虚血症、痛覚過敏、脳虚血症、及び血管新生に随伴する疾患、アレルギー性過敏性障害、糸球体腎炎、再灌流傷害、心筋組織又は他の組織の再灌流傷害、急性炎症性成分を伴う皮膚疾患、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性障害、眼球炎症性障害及び眼窩炎症性障害、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘導毒性、急性漿液性炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺硬変、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈障害、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、並びに子宮内膜症が含まれるがこれらに限定されない。
本発明の別の態様では、上記で記載した障害を治療、防止、及び/又は診断するのに有用な材料を含有する製造品又はキットが提供される。製造品は、容器及び容器上の表示又は容器に付随する添付文書を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV溶液用バッグなどが含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなど、様々な材料から形成することができる。容器は、それ自体で、又は別の組成物と組み合わせて、状態を治療、防止、及び/又は診断するために有効な組成物を保持し、滅菌の接続ポートを有しうる(例えば、容器は、皮下注射針により穿刺可能な止栓を有する静脈内注入溶液用のバッグ又はバイアルでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性薬剤は、本発明の抗体である。表示又は添付文書は、組成物が、選り抜きの状態を治療するために用いられることを示す。また更に、製造品は、(a)本発明の抗体を含む組成物をその中に含有する第1の容器;及び(b)細胞傷害剤又は他の形で治療的な薬剤を含む組成物をその中に含有する第2の容器を含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物を、用いて、特定の状態を治療しうることを示す添付文書も更に含みうる。幾つかの実施態様では、製造品は、本明細書で記載される抗IL−34抗体を含む。幾つかの実施態様では、製造品は、本明細書で記載される二重特異性IL−34/CSF−1抗体を含む。幾つかの実施態様では、製造品は、本明細書で記載される抗CSF−1R抗体を含む。幾つかの実施態様では、製造品は、本明細書で記載される抗IL−34抗体及び抗CSF−1抗体を含む。代替的に、又は加えて、製造品は、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩液、リンゲル液及びデキストロース溶液など、薬学的に許容される緩衝剤を含む第2の(又は第3の)容器を更に含みうる。製造品には更に、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、注射針、及びシリンジを含め、販売上の観点及び使用者の観点から所望される他の材料も組み入れることができる。
方法
タンパク質の発現及び精製
C末端のFlagタグ又はHis6タグと融合させたヒトIL−34の活性コア(hIL−34sでは、残基N21〜V193であり、hIL−34flでは、残基N21〜P242である)、及びC末端のHis6タグと接合されたヒトCSF−1Rの細胞外ドメイン(ドメインD1〜D3では、残基20〜299であり、ドメインD1〜D5では、残基20〜512である)のコード配列を、pAcGP67ベクター(BD Biosciences)へとクローニングした。組換えバキュロウイルスは、sf9細胞を、製造元(Pharmingen)の指示書に従い、BaculoGold(商標)Expression Systemを用いて、ESF 921培地(Expression System LLC、Woodland、CA)中のpAcGP67A構築物及び直鎖化されたバキュロウイルスDNAで共トランスフェクトすることにより創成した。ウイルスは、3ラウンドの増幅を介して発生させ、4mlのラウンド3原液を用いて、1ml当たり2×106個の細胞の密度で、1リットルのTni.PRO細胞に感染させた。細胞は、27℃で48時間にわたり成長させ、遠心分離により培地から除去した。上清を細胞から除去し、50mMのトリス−HCl、pH7.5中に1mMのNiCl2、5mMのCaCl2を補充した。上清中のタンパク質は、重力流を用いてNi−NTAカラム(Qiagen)により捕捉し、30mlの洗浄緩衝液(50mMのトリス−HCl、pH7.5、300mMのNaCl、10mMのイミダゾール)で洗浄し、溶出緩衝液(50mMのトリス−HCl、pH7.5、300mMのNaCl、300mMのイミダゾール)でカラムから溶出させた。タンパク質を濃縮し、5mMのトリス−HCl、pH7.5及び100mMのNaClで平衡化させたサイズ除外カラム(HiLoad 16/60 Superdex 200、GE Biosciences)により更に精製した。対象のタンパク質を含有する画分は、SDS−PAGEにより解析し、プールし、濃度は、280nmにおける吸光度により決定した。
1mg/mlの濃度のタンパク質試料500μlを、PBSで平衡化させたSuperdex 200 10/300 GLカラム(GE Biosciences)へと、逐次的に注入した。同じカラムを、タンパク質の分子量基準物質(Bio−Rad)の混合物により較正し、対象のタンパク質の溶出容量を用いて、それらの対応する分子量を推定した。
ITC実験の前に、Superdex 200 10/300 GLカラムを用いて、全てのタンパク質試料を、PBS緩衝剤へと緩衝剤交換して、緩衝液の希釈効果を最小化した。VP−ITC 200熱量測定計(MicroCal、Northampton、MA)上で、熱量測定のための滴定を実行し、MicroCal Origin 7.0ソフトウェアでデータを処理した。注入物質であるIL−34タンパク質又はCSF−1タンパク質を、CSF−1R D1〜D3又はCSF−1R D1〜D5へと、受容体が完全に飽和するまで、多数回の注入過程にわたり添加した。注入物質であるCSF−1R D1〜D3又はD1〜D5を、IL−34、CSF−1、又はIL−34/CSF−1R D1〜D3複合体を含有する細胞へと、受容体が完全に飽和するまで、多数回の注入過程にわたり添加した。
IL−34又はCSF−1の、CSF−1R D1〜D3への結合
Octet RED384(商標)BLI測定器(forteBio)を用いて、結合アッセイを実行した。ビオチン化IL−34又はビオチン化CSF−1を、ストレプトアビジンでコーティングしたバイオセンサー上に固定化し、洗浄し、CSF−1R D1〜D3の4倍の希釈系列(IL−34のためには、1600nM〜25nMであり、CSF−1のためには、3200nM〜50nMである)を含有する反応緩衝液(1倍濃度の反応速度アッセイ緩衝液、forteBio;型番18−5032)へと移した。結合が定常状態に達するまで、会合反応をモニタリングした。その後、結合した材料を、反応緩衝液へと移し、解離反応をモニタリングして、サイトカインとCSF−1R D1〜D3との間の可逆性の結合を確認した。会合速度(kon)及び解離速度(koff)は、単純な単一部位結合式を用いて計算した。平衡解離定数(Kd)は、比koff/konとして計算した。結合反応速度は、30℃で測定し、試料は、1000rpmで撹拌した。
hIL−34s_CFlag/YW405.3 Fab
等モル比のhIL−34s_CFlagとYW405.3 Fabとを混合し、HiLoad 16/60 Superdex 200カラムを用いる最後のゲル濾過ステップにかけ、30mg/mlまで濃縮してから、結晶化試験を行った。hIL−34s_CFlag/YW405.3 Fab複合体の斜方晶は、19℃で、0.2Mの酒石酸カリウムナトリウム四水和物、20%w/vのポリエチレングリコール3,350を含有するHampton Research Index HT H02(86)から成長させた。
hIL−34s_CFlagの二次元プレートは、19℃で、等容量、10mg/mlのタンパク質と、0.1MのHepes、pH7.5、10%w/vのポリエチレングリコール6,000、5%v/vの(+/−)−2−メチル−2,4−ペンタンジオール(Hampton Research Crystal Screen HT G06(78))を含有する貯留槽溶液とを混合することにより得た。
hIL−34s_CHisとHCSF−1R D1〜D3_CHisとを昆虫細胞内で共発現させ、HiLoad 16/60 Superdex 200カラムを用いるニッケルアフィニティーサイズ除外クロマトグラフィーで精製した。複合体は、20mg/mlまで濃縮し、シッティングドロップ蒸気拡散法でスクリーニングした。hIL−34s_CHis/hCSF−1R D1〜D3 CHis複合体の紡錘形結晶は、19℃で、0.1MのCaAcet、0.1MのMes、pH6、15%のPEG 400を含有するQiagen Protein Complex SCReen A02(2)から成長させた。
YW404.33.56のFab断片を、hIL−34s_CFlagと、1:1のモル比で混合し、HiLoad 16/60 Superdex 200カラムで更に精製し、20mg/mlまで濃縮した。単一のhIL−34s_CFlag/YW404.33.56 Fab複合体の結晶は、1カ月後に、19℃で、0.2Mの一塩基性リン酸アンモニウム、0.1Mのトリス、pH8.5、50%v/vの(+/−)−2−メチル−2,4−ペンタンジオールによる貯留槽溶液上で成長させた。
全ての低温安定化結晶を、液体窒素中で瞬時凍結させてから、データ収集を行った。全てのデータセットは、ADSC Q315 CCD検出器を用いるALS BL 5.0.2により収集した。回折画像は、HKL2000(Otwinowskiら、Methods in Enzymology、276:307〜326(1997))を用いてインデクシングし、統合し、スケーリングした。データ収集、位相決定、及び結晶構造の精密化についての全ての統計の概要を、表2に示す。
1.85Å、3.0Å、2.6Å、及び3.0Åの完全なデータセットを、h−IL−34s、hIL−34s/CSF−1R D1〜D3複合体、hIL−34s/YW405.3 Fab複合体、及びhIL−34s/YW404.33.56 Fab複合体のそれぞれの単一の結晶から収集した(表2)。
hIL−34s_CFlag/YW405.3 Fab複合体の構造は、FabのFv領域及びFc領域について逐次的に検索することにより単一のFab(Protein Data Bank(PDB)受託番号:2QQN)から創成された検索モデルを伴うPHASERプログラム(Storoniら、Acta crystallographica Section D、Biological crystallography、60:432〜438(2004))を用いる分子置換により解明した。2 Fabを含め単一の明瞭な解が見出されたことから、FabのCDR領域の外部のIL−34については、極めて限定的な電子密度が明らかとなる。この初期解に由来する位相は、PHENIX AutoBuild(Adamsら、Acta crystallographica Section D、Biological crystallography、66:213〜221(2010))のプライムアンドスイッチマッププロットルーチンを用いて、溶媒平滑化、2倍のNCS平均化をかけることにより根本的に改善した。結果としてもたらされるマップは、Cootによる、IL−34の全骨格の手作業での追跡を可能とするのに十分に高品質のマップであった。この部分的なIL−34モデルを、分子置換により、hIL−34s_CFlagの、分解能1.85Åのデータセットへとフィードし、Cootを用いるモデルの再構築(Emsleyら、Acta crystallographica Section D、Biological crystallography、66:486〜501(2010))、及びRefmacを用いる精密化(Murshudovら、Acta crystallographica Section D、Biological crystallography、53:240〜255(1997))に繰り返しかけた。精密化の最終ラウンドでは、4つのN−アセチル−グルコサミン基及び4つのマンノース部分を、IL−34の残基Asn75へと付加したところ、486個の水分子が、最終モデルに組み入れられた。次いで、完成したIL−34モデルを、2.6Åの分解能で収束する、hIL−34s_CFlag/YW405.3 Fab複合体構造の再構築及び精密化に用いた。
hIL−34s_CHis/hCSF−1R D1〜D3 CHis複合体の個々の成分を、hIL−34s、マウスCSF−1R D1〜D2、及びマウスCSF−1R D3(PDB ID:3EJJ)を検索モデルとする、PHASER分子置換プログラムを用いて逐次的に位置特定した。CSF−1R D1〜D3を、ヒトアミノ酸配列に従い再構築及び精密化し、Refmacによるインタラクティブ型の精密化、及びCootによるモデル構築を介して、最終のhIL−34s_CHis/hCSF−1R D1〜D3 CHisモデルを完成させた。
遮断Fabである、YW405.33.56と複合したhIL−34s_CFlagを、hIL−34s並びにFabのFv領域及びFc領域の構造を伴うPHASERプログラム内に実装された分子置換法により、同様のフレームワークで決定した後、YW404.33.56 FabのCDR領域を手作業により近似した。収束に達するまで、3.0Åのデータセットを用いて、数ラウンドにわたるモデルの再構築及び構造の精密化を実行した。
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)は、Ficoll上の勾配遠心分離により単離した。細胞生存率/増殖アッセイでは、96ウェルプレート内のウェル1つ当たり1×104個の、単離されたばかりのPBMCを、希釈系列中のIL−34(全長形及び短鎖形)又はCSF−1で刺激した。37℃で72時間にわたるインキュベーション後、細胞生存率/増殖を決定するため、細胞内のATPレベルを、CellTiter−Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit(Promega;型番G7571)により測定した。増殖は、相対発光単位(RLU)として示した。
hIL−34活性を中和するのに要請される最適の抗体濃度は、サイトカインの量、細胞型、及びアッセイの種類に依存する。hIL−34又はmIL−34の、PBMCに対する生物活性を中和する抗体の能力を測定するために、本発明者らは、CellTiter−Gloによる細胞増殖アッセイを用いた。IL−34の希釈系列に対する細胞の応答に基づき、抗体の中和活性を決定するための、100ng/mlというIL−34量を選択した。50%阻害濃度(IC50)は、IL−34が、70〜80%の増殖応答を誘発する濃度で存在する場合に、細胞上のIL−34活性の50%阻害をもたらすのに要請される抗体濃度と定義される。100ng/mlのhIL−34又はmIL−34を、抗IL−34mAb又は抗CSF1抗体の希釈系列と混合してから、100ulの総容量で細胞へと添加した。抗体阻害活性は、37℃で72時間にわたりプレートをインキュベートした後で、RLUを測定することにより得た。IC50値は、KaleidaGraphで計算した。
抗IL−34抗体を同定するための、ライブラリーの分取及びスクリーニング
マウスIL−34(PRO307278)を、ライブラリー分取のための抗原として用いた。Nunc96ウェルMaxisorpイムノプレートを、4℃で一晩にわたり、標的抗原(10μg/ml)でコーティングし、室温で1時間にわたり、ファージブロッキング緩衝液であるPBST(リン酸緩衝生理食塩液(PBS)及び1%(w/v)のウシ血清アルブミン(BSA)及び0.05%(v/v)のTween−20)でブロッキングした。選択されたCDR内に合成による多様性を伴う、VH(例えば、Leeら、J.Immunol.Meth.、284:119〜132、2004を参照されたい)及びVH/VL(Liangら、Journal of molecular biology、366:815〜829(2007)を参照されたい)のヒト合成抗体ファージライブラリーを、抗原プレートへと個別に添加し、室温で一晩にわたりインキュベートした。翌日、抗原でコーティングしたプレートを、PBT(0.05%のTween−20を含むPBS)で10回にわたり洗浄し、結合したファージを、50mMのHCl及び500mMのNaClで30分間にわたり溶出させ、等容量の1Mトリス塩基(pH7.5)で中和した。回収されたファージは、大腸菌XL−1 Blue細胞内で増幅した。後続の選択ラウンドでは、抗体ファージの、抗原でコーティングしたプレートを伴うインキュベーションを、2〜3時間へと短縮し、プレート洗浄の厳密性を、段階的に増大させた。
ファージミドpW0703(M13バクテリオファージの表面上に一価Fabを提示するファージミドpV0350−2b(Lee、2004)に由来する)が、アフィニティー成熟のために、YW404.33の軽鎖可変ドメイン(VL)及び重鎖可変ドメイン(VH)を移植するためのライブラリーの鋳型として用いられた。次いで、終止コドンを、ライブラリー鋳型のCDR−L3内に組み込んだ。アフィニティー成熟のために、野生型のヌクレオチドを選好する70:10:10:10の塩基混合によるポイズンドオリゴヌクレオチド戦略(Gallopら、Journal of medicinal chemistry、37:1233〜1251(1994))を用いることにより選択された位置において、約50%の突然変異率を導入する、ソフトランダム化戦略を用いた。とりわけ、CDR−L1の28〜32位、CDR−L2の50及び53〜55位、CDR−L3の91〜94及び96位、CDR−H1の28〜35位、CDR−H2の50〜58位、CDR−H3の95〜100位における残基をターゲティングした。そして、ソフトランダム化されたCDRループ、L1/L2/L3、L3/H1/H2、及びL3/H3の組合せによる3つの異なるライブラリーを構築した。
アフィニティーの改善された選択のために、ファージライブラリーを、最初のラウンドでプレート分取にかけた後、4ラウンドの溶液分取にかけた。最初のラウンドのプレート分取では、3つのライブラリーを、マウスIL−34でコーティングされたプレート(NUNC;Maxisorpプレート)に対して、室温で2時間にわたり分取した。次に、更に4ラウンドの溶液分取を、選択の厳密性を増大させる2つの方法と併せて実行した。それらのうちの第1は、ビオチン化された標的タンパク質の濃度を、50nMから0.5nMへと低下させることによる、オン速度による選択のための方法であり、それらのうちの第2は、室温で、過剰量(100〜500倍)の非ビオチン化標的タンパク質を添加して、弱い結合剤を競合除去(compete off)することによる、オフ速度による選択のための方法である。各ファージライブラリーはまた、非ビオチン化mIL−34と共にインキュベートして、各ラウンドのパニングの濃縮度を推定するためのバックグラウンドのファージ結合としても用いられた。
5ラウンドのパニングの後、記載される(Sidu、2004)通りに、ハイスループットの一点競合ファージELISAを用いて、高アフィニティーのクローンについて迅速にスクリーニングした。5nMのmIL−34の存在下では、mIL−34の非存在下と対比して、固定化mIL−34に対する結合率が低いクローンを、さらなる特徴付けのために選び出した。
ストレプトアビジン(SA)バイオセンサーチップ(forteBio、Menlo park、CA、USA)を装備したOctet QKを、アフィニティー測定のために用いた。SAバイオセンサーチップは、アッセイ緩衝液(1倍濃度の反応速度アッセイ緩衝液、forteBio)中で10分間にわたり平衡化させてから、解析にかけた。結合反応速度は、30℃で測定し、試料は、1000rpmで撹拌した。SAチップは、5ug/mlのビオチン化ヒトIL−34(R&D;型番5265−IL−010/CF)で200秒間にわたり飽和させたが、この結果として、6つのチップのカラム内で0.22±0.02nMの捕捉レベルがもたらされた。抗IL−34抗体の3倍の希釈系列(100nM、33.3nM、11.1nM、3.7nM、1.2nM)のほか、緩衝剤ブランクを調製した。会合及び解離のいずれも、300秒間にわたりモニタリングした。全ての反応及び測定は、室温で実施した。データは、Octetデータ解析ソフトウェア6.4(forteBio)を用いて解析した。
本研究では、ヒトIL−34単独及びCSF−1Rと複合したヒトIL−34の最初の結晶構造が提示されるが、それらの溶液中の結合特性も特徴付けられた。IL−34は、実際に短鎖へリックス型サイトカインファミリーに属し、ファミリーメンバーの中でも二量体化界面が最も小さいことが示される。IL−34/CSF−1R複合体の構造は、関与するドメインに関して、CSF−1複合体について見られたのと同様の、全体的なリガンド/受容体アセンブリーの類似を示した。しかし、関与する受容体ドメインは、異なる界面組成を結果としてもたらす、予測外の再配列を受ける。これらの2つのサイトカインによるシグナル伝達複合体の間で注意深い比較を行うことにより、CSF−1Rが、2つの構造的に類縁のリガンドであるが、進化の点では疎遠なリガンドであるIL−34及びCSF−1に無差別的に結合することを可能とする分子的決定因子についての理解がもたらされた。更にまた、2つのファージに由来する抗IL−34モノクローナル抗体のFab断片と複合したIL−34の共結晶構造により、それらのそれぞれの非遮断活性及び中和活性の構造的根拠ももたらされたが、これにより、治療剤開発への新たな洞察も与えられる。
成熟全長ヒトIL−34は、222アミノ酸を含むが、その最後の約50残基は、Jpred 3(Coleら、Nucleic acids research、36:W197〜201(2008))及びPsiPRED(McGuffinら、Bioinformatics、16:404〜405(2000))で弁別可能な微細な二次構造により大きく攪乱されることが予測されている。なお更に、最初の202又は182残基を含有するIL−34の構築物は、TF−1−fms細胞成長の活性化において、全長タンパク質と識別不可能であるのに対し、最初の162残基だけを包摂する構築物は、活性の著明な減弱を示した(Chiharaら、Cell death and differentiaton、17:1917〜1927(2010))。加えて、ヒトIL−34では、7つのシステイン残基(35、168、177、179、180、191、及び199)が見出されるが、それらのうちの6つ(C199以外の全て)は、種を越えた保存が良好である(図1A、図7)。したがって、成熟ポリペプチドの残基N21〜V193を含む切断型IL−34構築物であって、本明細書でhIL−34sと称する構築物を、後続の研究のために選び出した。別段に言及しない限り、hIL−34sは、C末端のFlagタグへと融合させ、昆虫細胞内で組換えにより発現させ、方法において記載されている通りに精製し、後続の全ての研究で用いた。hIL−34sは、CSF−1と同程度に活性であり、ヒト単球の生存能力を促進するその能力において、組換え全長IL−34よりわずかに活性が大きかった(図1B)。ヒトIL−34遺伝子は、認識可能な膜会合領域を含有しないが、マウスオルソログは、代替的なRNAスプライシング及びタンパク質分解によるプロセシングの結果として、天然で、GPIでアンカーされ、可溶性のアイソフォームとして存在する(図1A)。
溶液中のhIL−34sのオリゴマー状態をプローブするため、解析用サイズ除外クロマトグラフィーを用いた(図2A)。hIL−34s単量体の理論的分子量は、22kDaであるが、タンパク質は、44kDaの基準物質より早く溶出したことから、hIL−34sは、溶液中で二量体を形成し、これは、hIL−34sの結晶において観察される2倍の非結晶学的対称性二量体構造と符合することが示される。IL−34リガンド/受容体複合体の分子サイズを評価するために、受容体の免疫グロブリンドメインD1〜D5(hCSF−1R D1〜D5)を含め、細胞外ドメイン(ECD)のほぼ全体を含有する構築物を、IL−34と共に、1:1のプロトマーモル比で混合し、同じ技法で解析した。この複合体の見かけのサイズは、2:2の複合体について計算されるサイズと符合した(図2A)。同様に、複合体の形成に必要な最小の受容体構築物の範囲を狭めるために、hIL−34sの、最初の3つの免疫グロブリンドメインだけを含有する受容体構築物(hCSF−1R D1〜D3)との混合物を、サイズ除外解析にかけたところ、見かけのサイズが158kDaより大きいことが明らかとなり、これは、2:2複合体と符合する(図2A)。
hCSF−1R D1〜D3に結合したhIL−34sの、3.0Åの分解能による構造を、hIL−34s及びマウスCSF−1Rの構造を検索プローブとして用いる分子置換(Chenら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、105:18267〜18272(2008))により解明した(表2)。本研究において試みられる全ての生物物理的方法は、hCSF−1R D1〜D3が、溶液中のhIL−34sとの2:2複合体を形成することを示したが、結晶構造は、1つのCSF−1R D1〜D3が、非対称ユニット内の1つのhIL−34sホモ二量体に結合することを明快に明らかにした。構造解析は、隣接するプロトマー上の類似の受容体結合部位が、結晶のパッキングに関与し、この結晶構造形態において予測される2:2複合体の形成を妨げることを示唆した。しかし、この構造は、IL−34/受容体間界面を申し分なく明らかにした。これは、IL−34が、CSF−1RのD2及びD3により形成される凹面に、CSF−1R受容体に結合したときのCSF−1により用いられる立体配置に相似する立体配置で結合することを示した。CSF−1サイトカイン/受容体複合体において見られたのと類似する2部位結合方式が、IL−34/CSF−1R間界面においてもまた保存されている。これらの結果は、部位1が、IL−34と受容体のIgドメインD2との間の相互作用を伴い、部位2が、IL−34と受容体ドメインD3との間の相互作用を伴うことを示した。各部位はそれぞれ、1280Å2及び1160Å2の総包埋表面積をもたらす。D2とD3との間のリンカーは、構造内で完全に秩序付けられているが、IL−34との相互作用を免れることから、IL−34/CSF−1R間界面を、2つの空間的に分離された部位へと有効に分解する。
構造解析は、部位1が、CDループ及びEFループ(それぞれ、残基142〜150及び169〜173)を含む受容体D2ドメイン残基により主に形成され、これが、IL−34のへリックスαB(残基100〜108)、αC(116〜134)、介在ループ(残基109)、及びα3(残基150)(図3A)によりもたらされる、起伏の大きな表面へとドッキングすることを明らかにした。この領域内のIL−34の負に帯電した表面と、CSF−1R上の正に帯電した表面との間の相補的静電相互作用が、この部位におけるIL−34への結合を媒介するのに重要であると考えられた。特に、CSF−1Rの塩基性のアミノ酸R142、R146と、IL−34上の酸性アミノ酸E103との間では、中央に位置する塩架橋が形成される。CSF−1RのCDループの縁辺部におけるR144及びR150は、N150の側鎖酸素並びにQ106及びL109それぞれの骨格カルボニル酸素との水素結合相互作用に関与する。IL−34内のL127の脂肪族側鎖により形成される小さな疎水性のパッチは、CSF−1RのF169とI170との間にぴったりと適合する。表3で詳細に示す通り、この部位では、極性相互作用が優越すると考えられる一方で、多数の分子間ファンデルワールス接触もまた、界面を裏打ちしている。
結果は、わずかに小型の部位2が、BCループ及びDEループに由来する受容体D3の残基(それぞれ、残基231及び254)及びストランドD(残基248〜252)により主に形成され、IL−34のへリックスαA、αC、及びα4(それぞれ、残基36〜44、121〜128、184〜187)の部分により創成される表面に対してパッキングされることを更に示した(図3C)。この界面は、IL−34の残基F40及びL125、並びにCSF−1Rの残基V231、Y257、及びF252により形成される疎水性帯域で隔てられた、2つの極性相互作用領域へと更に分けることができる。第1の領域は、CSF−1R D3 Dストランドの先頭部分と、IL−34のα4との間の、骨格と側鎖とを組み合わせた水素結合相互作用により形成される。IL−34のN187の側鎖アミドの水素及び酸素は、受容体との最大3つの水素結合であって、CSF−1Rの、Q249の側鎖アミド、並びに骨格のS248の窒素及びカルボニル酸素を伴う水素結合に関与する。加えて、CSF−1RのQ248と、IL−34のS184及びL186との間では、2つの骨格間水素結合も形成される。IL−34内のα4領域を構成する残基の欠失は、タンパク質発現レベルの大幅な低減、及びTF−1−fms細胞の増殖を刺激する能力に関する活性の著明な低下を結果としてもたらす(Chiharaら、Cell death and differentiaton、17:1917〜1927(2010))。本研究で報告される結果により、α4に包摂される残基は、IL−34の活性コアドメインの不可欠の一部であり、したがって、その活性に重要であることが確認された。部位2内の第2の極性領域は、側鎖により媒介される3つの水素結合であって、IL−34のN128、K44、及びE121の末端側鎖原子と、CSF−1Rの、Y257のヒドロキシル基、F252のカルボニル酸素、及びN254の骨格アミドとの間の水素結合を包摂する。ファンデルワールス接触により媒介されるさらなる相互作用を、表3に列挙する。
IL−34及びCSF−1の個別の機能を腑分けし、IL−34シグナル伝達の遮断からの治療的利益を探索するために、ファージディスプレイ技術を用いて、ヒトIL−34及びマウスIL−34の両方を特異的にアンタゴナイズする抗体を創成し、ヒト患者及び齧歯動物モデルの両方におけるIL−34機能の精査を可能とした。YW404.33は、VHファージディスプレイライブラリー及びVH/VLファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより同定し、ヒトIL−34に対するその高度な結合アフィニティー(Kd=17nM、表4)及びその遮断活性に基づき、96のクローンによるパネルから選択した。その後、方法において記載されているソフトランダム化戦略を用いて、YW404.33をアフィニティー成熟させた。YW404.33.56は、BLI実験により測定される通り、親クローンと比較して、結合アフィニティーの140倍の改善(Kd=120pM)を示す。生存率アッセイ(図4A)及びヒト単球増殖アッセイ(図8)では、IL−34の生物学的活性が、この抗体により、受容体のFc融合体による場合と同様に完全に遮断されたが、抗CSF−1抗体によって完全に遮断されることはなかった。
受容体への結合時におけるIL−34内のコンフォメーショナル変化
本研究では、IL−34の最初の三次元構造であって、それ自体において解明された三次元構造、及びその受容体であるCSF−1Rとの複合において解明された三次元構造の両方が報告される。その非結合形態におけるIL−34のプロトマー構造と、CSF−1Rとの結合形態におけるIL−34のプロトマー構造とを比較することにより、その受容体へと結合しても、サイトカインの構造は、ほとんど変化しないことが明らかとなった。受容体界面の残基により採用される、側鎖の回転異性体のコンフォメーションさえも、驚くべきことに、遊離状態と結合状態との間でわずかな差違しか示さなかったことから、結合していないIL−34プロトマーも、受容体への結合と高度に適合性であり、結合の寸前にあることが示される。本明細書で提示される4つの構造の比較に基づく、IL−34プロトマー構造の見かけの剛直性は、近年決定されたFlt3L構造と符合した(Verstraeteら、Blood、118:60〜68(2011))が、受容体の結合を受け入れるには、著明な局所的構造変化を受けなければならない、塑性の大きなCSF−1(Chenら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、105:18267〜18272(2008))又はSCF(Liuら、The EMBO Journal、26:891〜901(2007);Yuzawaら、Cell、130:323〜334(2007))の構造とは全く異なる。にもかかわらず、複合体の形成時の二量体界面近傍では、一方のIL−34プロトマーの配向の、他方のプロトマーと比べた著明な変化が観察された。αCの傾斜角により記載すると、受容体の結合又はYW404.33.56の結合は、IL−34プロトマー間の角度の、それぞれ、6.6°又は4.6°の増大を誘導した。以前に、同様のヒンジ様剛体の運動が、CSF−1/CSF−1R系、SCF/Kit系、及びFlt3L/Flt3系において報告された。予測外なことに、別の抗体であるYW405.3も、同様の回転を誘発したが、反対方向の回転であった結果、傾斜角の6.4°の減少がもたらされた。このような高度の塑性は、他の二量体の4へリックスバンドルのサイトカインでは前例を見ず、小型で極めて疎水性のIL−34二量体化界面に帰せられる可能性が高い。
IL−34とCSF−1とは、一次配列のレベルではほとんど類似しないが、それらは実際、類似する4へリックスバンドルによるコアフォールド、類縁の二量体化、及び受容体への結合界面を採用しており、差違は、コア外のループ及び構造的装飾に割り当てられる(へリックス型サイトカイン構造の比較においてしばしばみられる知見である)ことが見出された(Bazan、Neuron、7:197〜208(1991b);Hillら、Journal of molecular biology、322:205〜233(2002);Rozwarskiら、Structure、2:159〜173(1994))。実際、へリックス型サイトカインの祖型に取りつく遺残物(三次元フォールド関係を別とすれば)は、それらのそれぞれの遺伝子のエクソン/イントロン構造における類似性であり(Bazan、Cell、65:9〜10(1991a);Bettsら、The EMBO Journal、20:5354〜5360(2001))、この点で、IL−34遺伝子の構造は、CSF−1遺伝子、SCF遺伝子、及びFlt3L遺伝子と相同である。
受容体ドメインD1及びD2の配向は、何れのサイトカイン/受容体複合体でも保存されているが、2つの複合体を比較すると、受容体ドメインD3の配向は、D1〜D2と比べて、著明な27°の変化を示した。IL−34が係合すると、CSF−1RのD2とD3との間で回転が誘発され、CSF−1への結合形態の、ねじれた立体配置とは著明に異なる、細長い、ほとんど直鎖状の構成がもたらされた。このCSF−1Rの全体的再配向は、少なくとも部分的に、顕著に異なるIL−34の分子表面であって、本研究で報告される構造において観察される新たな配向を誘導せずにCSF−1Rと立体的に衝突する分子表面に帰することができよう。受容体接触残基を、両方のサイトカインの二次構造上にマッピングすると、何れの相互作用部位も、IL−34上では、CSF−1におけるより大きく散開することが明確に示された(図5A、B)。これは、4へリックスバンドルコア、すなわち、α3及びα4の外部で顕著に異なる構造的特色に主に起因する。よって、IL−34上では、よりフラットな界面が創出され、受容体の拡張型のコンフォメーションが要請されるのに対し、CSF−1は、それらのより「屈曲した」配向から創出される、CSF−1R D2とCSF−1R D3との間のくぼみへと突き出ている。CSF−1/受容体複合体でも、近接するドメインであるD2とD3との間の界面は最小限であるが、IL−34/受容体複合体では、CSF−1/受容体複合体内のD3 E230とD2 K194との間の唯一の塩架橋が破断することから、D2及びD3は、IL−34と結合すると、より拡張型の、ほとんど直鎖状の配置を採用することが可能となる。受容体D2〜D3のヒンジ配列である196NKVIPGP202が、2つの回転軸点としてのK197及びG201を用いて完全に再構成される一方で、N196で終わるD1〜D2及びP202で始まるD3は、構造的攪乱を最小限としてそのまま残される。したがって、D2ドメインとD3ドメインとの間の屈曲部の実質的な柔軟性により、CSF−1R分子は、IL−34及びCSF−1によりもたらされる、顕著に異なる結合表面へと適合することが可能となる(図5A、B)。これに対し、D4及びD5が再編成され、2つのSCFに結合したKIT分子の間の受容体間相互作用を媒介する、KIT受容体のD1〜D2〜D3領域は、SCFと結合すると、剛体として挙動すると考えられた(Yuzawaら、Cell、130:323〜334(2007))。Kitには、ドメインD2〜D3間に、CSF−1Rには存在しない著明な疎水性の界面が存在する。ドメイン間の柔軟性は、複数のウイルスタンパク質が、侵入のために同じ宿主細胞受容体を使用するときの適合機構として用いられている。2つの構造的に非類縁のタンパク質である麻疹ウイルスのヘマグルチニンと11/21型アデノウイルスのノブとは、CD46の最初の2つのSCRドメインを共有し、その間のリンカーは、構造的な塑性が大きい(Cupelliら、Journal of virology、84:3189〜3200(2010);Perssonら、Nature structural & molecular biology、14:164〜166(2007);Santiagoら、Nature structural & molecular biology、17:124〜129(2010))。なお更に、受容体のドメイン配向の攪乱は、合成のアゴニストペプチド及びアンタゴニストペプチドと複合したエリスロポエチン受容体(EPOR)における14°の回転により顕示される、顕著な機能的帰結をもたらしうる(Livnahら、Nature structural biology、5:993〜1004(1998))。IL−34は、CSF−1Rの、強力であるがより一過性の活性化を誘導し、CSF−1Rレベルを、CSF−1と比較して、より迅速に下方調節することが報告された(Chiharaら、Cell death and differentiaton、17:1917〜1927(2010))。このCSF−1R受容体ドメインの再配向によれば、おそらく、これらの2つのサイトカインに対する異なるアフィニティーと組み合わせて、そのシグナル伝達効力が調節されうるであろう。
受容体により媒介される同型の相互作用であって、III型RTKの活性化における不可欠の役割を果たす相互作用が提起されている。このような相互作用は、KIT D4(Yuzawaら、Cell、130:323〜334(2007))及びVEGFR2 D7(Yangら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、107:1906〜1911(2010))の場合には構造的に捕捉されているか、又はPDGFRβ(Shimら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、107:11307〜11312(2010))の場合には生化学的に特徴付けられている。これらの相互作用の本質は、2つの受容体KITのD4ドメイン(VEGFR内のD7又はPDGFR内のD4)の間のEFループ内の相反的塩架橋の対である。CSF−1R D4内で保存されるこのイオン性対により中断される、CSF−1RとKITとの間の比較的高度な配列同一性に起因して、おそらく、類似する受容体による同型の相互作用もまた、膜を越えてリガンド結合シグナルを中継するときに、CSF−1Rの二量体化を駆動する。本明細書で記載される生物物理的解析により、溶液中のIL−34/CSF−1R複合体の2:2の化学量論比が示されることを踏まえるなら、結晶構造において観察される2:1のIL−34/CSF−1R複合体は、結晶パッキング力の影響を受けた可能性が極めて高い。したがって、2つのIL−34プロトマーの間の2回対称性を、CSF−1Rへと適用することにより、予測される完全な2:2のリガンド/受容体シグナル伝達複合体をモデル化した。存在しないCSF−1Rのコピーを、IL−34二量体上の非占有部位へと付加すると、この2:2のIL−34/CSF−1Rモデルにおける、CSF−1R D3の2つのC末端の間の距離(60Å)は、2:2のCSF−1/CSF−1Rモデルにおける距離(62Å)、及び2:2のSCF/Kit構造における距離(64Å)と極めて類似する(図6)。まとめると、CSF−1R D2〜D3間のヒンジは、2つのサイトカインの顕著に異なる表面トポグラフィーに適合させるために、全く異なるコンフォメーションを採用しうるが、にもかかわらず、D2〜D3の再配向は、2つのサイトカイン/受容体シグナル伝達複合体内で間隔が等しいD3〜D4接合部を結果としてもたらし、CSF−1 D4を、下流において縮重応答を誘発する同型の相互作用のための収束点として提示する。
多数の共有サイトカイン受容体については、それらの全ては、少なくとも2つの異なるリガンド結合状態において構造的に捕捉されているので、共通のガンマ鎖(γc)、gp130、及びインターフェロンα受容体(IFNAR1/2)など、サイトカイン結合の無差別性の分子機構が解読されている(Thomasら、Cell、146:621〜632(2011);Wangら、Annual review of immunology、27:29〜60(2009))。γc及びgp130の何れの細胞外ドメインも、III型フィブロネクチン(FNIII)の2つのIg様ドメインからなる1つのサイトカイン結合相同性領域(CHR)を含有する(Wangら、Annual review of immunology、27:29〜60(2009))。サイトカイン結合部位は、いずれにも共有されるクラスIのサイトカイン受容体内のドメイン内接合部に格納されているが、IL−2/γc四元複合体を、IL−4/γc三元複合体と比較して(LaPorteら、Cell、132:259〜272(2008);Wangら、Science、310:1159〜1163(2005))も、リガンド結合していないgp130を、3つのgp130ファミリーのサイトカイン複合体と比較しても、著明な屈曲部の運動が観察されることはなかった(Boulangerら、Molecular cell、12:577〜589(2003a);Boulangerら、Science、300:2101〜2104(2003b);Bravoら、The EMBO Journal、17:1665〜1674(1998);Chowら、Science、291:2150〜2155(2001))。異なるサイトカインへと結合したときの、γc内及びgp130内の界面残基の回転異性体状態であってもなお、依然として大きくは変化しない(Wangら、Annual review of immunology、27:29〜60(2009))。γc及びgp130は、共有される疎水性コア領域を周縁部の極性パッチにより取り囲んだ「化学的に不活性の相補性表面」を用いて、それぞれ、短鎖のサイトカイン及び長鎖のサイトカインを認識する(Boulangerら、Molecular cell、12:577〜589(2003a);Wangら、Annual review of immunology、27:29〜60(2009))。近年決定されたI型IFN受容体複合体は、パラログであるIFNα2及びIFNωが、IFNAR1の最初の3つのFNIIIドメイン(SD1〜SD3)と、よりコンパクトなIFNAR2の2つのFNIII様ドメイン(D1、D2)との間に挟み込まれていることを明らかにした(Thomasら、Cell、146:621〜632(2011))。興味深いことに、IFNに結合するとき、IFNAR1のN末端のSD1ドメインは、SD2〜SD3セグメントと比べて回転するが、ひとたびIFNに結合してしまうと、IFNAR1は、結合したサイトカインの識別にかかわらず、ほとんど同一なコンフォメーションを呈示する。IFNAR1及びIFNAR2のいずれも、交差反応性のために、I型IFNの残基表面上の少数の保存的な「アンカー点」に依拠する(Thomasら、Cell、146:621〜632(2011))。しかし、多数のそれほど保存的でないアミノ酸は、受容体に対するそれらの個別の結合アフィニティーを微調整するために、保存的なIFN結合表面群の一面に散在する。
方法
競合ELISAによるエピトープマッピング
ELISAプレートを、PBS中の1H muIL−34flag(1ug/ml)により、4℃で一晩にわたり、又は室温で2時間にわたりコーティングし、1%のBSA及び0.15%のTween20を含むPBSを用いてブロッキングした。30ナノモルの濃度のビオチン化されたYW404.33抗体を、300ナノモルの濃度で始める被験抗IL−34抗体の7点の希釈系列へと添加した。抗体混合物を、短時間にわたり室温でプレインキュベートした。次いで、混合物を、コーティングされたELISAプレートへと添加し、室温で約30分間〜約1時間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、結合したビオチン化抗体をSA−HRPで検出した。このアッセイでは、抗muIL−34及びHerceptinを、対照として用いた。
ヒト抗IL−34抗体は、ファージディスプレイ技術を用いて創成し、実施例1で記載した細胞ベースのアッセイにより、IL−34活性を中和するそれらの能力について調べた。抗IL−34抗体であるYW404.1、YW404.6、及びYW404.33の中和活性を、例えば、図9Aに示す。これらの抗体のヒトIL−34に対する特異性を、マウスIL−34に対する特異性と対比して比較したほか、それらの遮断活性、及び結合アフィニティーについても比較した(表7)。更にまた、これらの抗体を、競合ELISAによって調べ、それらが、IL−34上の重複エピトープに結合するのかどうかも決定した(表7)。
方法
処置の前に、Balb/cマウスの体重をあらかじめ測り、これらを無作為化し、以下の通りに処置した。群1(1群当たりのn=8)には、実験を通して、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を含まない通常の飲用水を施した。群2〜6には、実験の0日目〜6日目において、3%のDSS(3g/100ml(3%)のデキストラン硫酸ナトリウム)を含む飲用水を施した。6日後、群2〜6には、屠殺するまで、DSSを含まない通常の飲用水を施した。群2は、400ugの抗ブタクサ抗体(a−RW−mIgG2a)で、0日目の前日に始めて8日目までの隔日、陰性対照として処置した。群3は、0日目の前日に始めて8日目までの毎日、0.9%の塩化ナトリウム(CSA)中に25mg/kgのシクロスポリンAで、腹腔内処置した。群4は、0日目の前日に始めて8日目までの隔日、200ugの抗CSF−1抗体(ATCC受託番号:CRL−2702のラット抗体;クローン5A1)及び200ugのa−RW抗体で処置した。群5は、0日目の前日に始めて8日目までの隔日、200ugの抗IL−34抗体(YW 404.33.12)及び200ugのa−RW抗体で処置した。群6は、0日目の前日に始めて8日目までの隔日、200ugの抗CSF−1抗体(ATCC受託番号:CRL−2702のラット抗体;クローン5A1)及び200ugの抗IL−34抗体(YW 404.33.12)で処置した。全てのマウスは、8日目に屠殺し、それらの大腸炎重症度スコアは、陰窩喪失、並びにT細胞、B細胞、及びマクロファージを含めた炎症性細胞の浸潤などのパラメータに基づき決定した。
DSS誘導性IBDを伴うマウスであって、抗IL−34抗体又は抗CSF−1抗体で処置されたマウスは、対照のa−RW抗体で処置されたマウスと比較して、大腸炎重症度スコアの低減を示した。このIBDモデルでは、抗CSF−1抗体と抗IL−34抗体との組合せを用いるCSF−1及びIL−34の両方の阻害は、なおいっそう有効であった(図11)。
関節リウマチ患者に由来する血清、滑液、及び組織中のCSF−1タンパク質、IL−34タンパク質、及びTNFアルファタンパク質の発現を、図13に示す。これらの体液では、IL−34が、CSF−1及びTNFアルファより低レベルで発現する。RA患者に由来する滑膜組織の、抗IL34抗体によるIHC染色は、IL−34が、組織/細胞外マトリックス(ECM)中で濃縮されている可能性が高いことを示す。
抗CSF1抗体による治療の、抗IL34抗体による治療との組合せを、マウスCIAモデルにおいて、TNFRII−Fcに対して比較した(図15)。DBA−1Jマウスに、CFA中のウシII型コラーゲンを、0及び21日目にi.d.注射した。次いで、関節炎スコアを毎日モニタリングした。抗体による治療は、24日目又は31日目に開始し(確立された関節炎:臨床スコア=4)、終了まで7週間にわたって行った。抗体による治療は、a−ブタクサ(抗体のmIgG2aアイソタイプ:対照)、TNFRII−Ig(mIgG2a)、抗muCSF1(自家製;mIgG2a)、抗IL34(YW404.33.12;mIgG2a)、抗mCSF1+抗IL34(3及び4の組合せ)、抗mCSF1(DANA)+抗IL34(YW404.33.12 DANA)であり、全ての動物(1群当たりのn=10)は、動物1匹当たり200ugの上記の試薬で、毎週3回、終了まで7週間にわたり腹腔内処置した。エンドポイントPDには、縦断的臨床スコア、組織病理学(四肢及び類縁の組織)、FACS(組織単球サブセット及びMf)、及び骨容量(uCT)解析が含まれる。
IBDについての別のモデルでは、6〜8週齢の雌C57BL/6Jマウスにおいて、DSS誘導性大腸炎を誘導した(図16)。C57B6マウスに、3%のDSSを、5日間にわたり経口投与して、上皮の損傷、可逆性の体重の減少、及び大腸における好中球浸潤を特徴とする急性大腸炎を誘導した。抗体による治療は、−1日目に開始し、のべ4回の投与を伴った。研究は、解析のために8日目に終了させた。治療群(1群当たりのn=10):3%のDSS+a−ブタクサ(mIgG2a対照、マウス1匹当たり400ug;腹腔内)、3%のDSS+a−mCSF1 Ab(自家製、マウス1匹当たり200ug;腹腔内)、3%のDSS+a−IL34 Ab(YW404.33.12、マウス1匹当たり200ug;腹腔内)、3%のDSS+a−mCSF1/a−IL34(マウス1匹当たり200ug a−CSF1及びマウス1匹当たり200ug a−IL34、;腹腔内)であった。デキサメタゾンは、0.5mg/kg、QDで、腹腔内投与した。ナイーブマウスは、DSSで治療しなかった。抗ブタクサ抗体を、陰性対照として用いた。終了後、このモデルのために、結腸組織学スコアを読み取った。
クローン病又は潰瘍性大腸炎を患うヒト患者の血清及び組織に由来するCSF−1タンパク質及びIL−34タンパク質の解析は、IL−34が、血清中では極めて低レベルで発現するが、組織内では高レベルで発現することを示した。他方、CSF−1は、血清中及び組織内で十分に発現する(図17)。この組織データは、潰瘍性大腸炎及びクローン病を含めた炎症性腸疾患において、IL−34及びCSF1の両方を阻害すれば、何れか単独の阻害剤によるIBD患者の治療よりも優れているであろうという考えを更に裏付ける。
マウスCIAは、既に言及されている通りに準備した。動物の関節滑膜細胞/組織を、a−CSF1+a−IL34の組合せAb又は抗ブタクサにより、39日目に始めて7日間で2回にわたり処置されたマウス(確立されたCIA:臨床スコア=4)(試料1例当たりのn=3)から収集した。動物は、7日間にわたる処置の後に安楽死させた。関節滑膜組織/細胞を収集し、単一の細胞懸濁液のために、コラゲナーゼにより消化した。細胞は、標識された抗CD11b抗体、抗Ly6C抗体、抗Ly6G抗体、及び抗F4/80抗体(BD Biosystemから購入)で染色した。標識された細胞は、フローサイトメーターで解析して、骨髄サブセット(Mf:CD11b+/F480+、炎症性単球:CD11b+/Ly6C+/Ly6Glow、及び在住単球:CD11b+/Ly6G+/Ly6Clow)を規定した。
Claims (92)
- ヒトIL−34に結合する単離抗体であって、ヒトIL−34のアミノ酸残基Glu103、Leu109、Gln106、Asn150、Leu127、Asn128、Ser184、Leu186、Asn187、Lys44、Glu121、Asp107、Glu111、Ser104、Gln120、Trp116、及びAsn61のうちの少なくとも一つを含むエピトープに結合し、アミノ酸残基の位置が配列番号1における位置に基づき、前記抗体が、ヒトIL−34とヒトCSF−1Rとの間の結合を阻害する、抗体。
- ヒトIL−34に結合する単離抗体であって、ヒトIL−34のアミノ酸残基Glu103〜Asn150のうちの少なくとも一つを含むエピトープに結合し、アミノ酸残基の位置が配列番号1に基づき、前記抗体が、ヒトIL−34とヒトCSF−1Rとの間の結合を阻害する、抗体。
- ヒトIL−34のアミノ酸残基Glu103、Leu109、Gln106、及びAsn150のうちの少なくとも一つを含むエピトープに結合し、アミノ酸残基の位置が配列番号1における位置に基づく、請求項1又は請求項2に記載の抗体。
- 前記エピトープが、ヒトIL−34のアミノ酸残基Ser100、Glu123、Trp116、Thr124、Leu127、Asn128、Gln131、及びThr134のうちの少なくとも一つを更に含み、アミノ酸残基の位置が配列番号1における位置に基づく、請求項3に記載の抗体。
- ヒトIL−34の100〜108、116〜134、109、及び150位内のアミノ酸に結合し、アミノ酸残基の位置が配列番号1における位置に基づく、請求項3又は請求項4に記載の抗体。
- ヒトIL−34のアミノ酸残基Asn128、Ser184、Leu186、Asn187、Lys44、及びGlu121のうちの少なくとも一つを含むエピトープに結合し、アミノ酸残基の位置が配列番号1における位置に基づく、請求項1に記載の抗体。
- 前記エピトープが、ヒトIL−34のアミノ酸残基Phe40、Asp43、Leu125、Gln189、Thr36、及びVal185のうちの少なくとも一つを更に含み、アミノ酸残基の位置が配列番号1における位置に基づく、請求項6に記載の抗体。
- ヒトIL−34の36〜44、121〜128、及び184〜187位内のアミノ酸に結合し、アミノ酸残基の位置が配列番号1における位置に基づく、請求項6又は請求項7に記載の抗体。
- ヒトIL−34のアミノ酸残基Glu103〜Leu127のうちの少なくとも一つを含むエピトープに結合し、アミノ酸残基の位置が配列番号1における位置に基づく、請求項1又は請求項2に記載の抗体。
- ヒトIL−34のアミノ酸残基Asp107、Glu111、Ser104、Gln120、Glu103、Leu109、Trp116、及びAsn61のうちの少なくとも一つを含むエピトープに結合し、アミノ酸残基の位置が配列番号1における位置に基づく、請求項1に記載の抗体。
- 前記エピトープが、ヒトIL−34のアミノ酸残基Pro152、Val108、Leu110、Gln106、Glu123、Leu127、Lys117、Ile60、及びLys55のうちの少なくとも一つを更に含み、アミノ酸残基の位置が配列番号1における位置に基づく、請求項10に記載の抗体。
- ヒトIL−34の55〜61、100〜108、109、111〜127、及び152位内のアミノ酸に結合し、アミノ酸残基の位置が配列番号1における位置に基づく、請求項10又は請求項11に記載の抗体。
- 配列番号3のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも90%である重鎖可変領域配列、及び/又は配列番号4のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも90%である軽鎖可変領域配列を含む、請求項10から12の何れか一項に記載の抗体。
- 配列番号3のアミノ酸配列である重鎖可変領域配列、及び/又は配列番号4のアミノ酸配列である軽鎖可変領域配列を含む、請求項10から13の何れか一項に記載の抗体。
- (a)アミノ酸配列GLGKGSKRGAMDY(配列番号33)を含むHVR−H3;(b)アミノ酸配列QQSFYFPNT(配列番号39)を含むHVR−L3;及び(c)アミノ酸配列RISPYYYYSDYADSVKG(配列番号52)を含むHVR−H2を含む、請求項10から12の何れか一項に記載の抗体。
- (a)アミノ酸配列STWIH(配列番号59)を含むHVR−H1;(b)アミノ酸配列RISPYYYYSDYADSVKG(配列番号52)を含むHVR−H2;及び(c)アミノ酸配列GLGKGSKRGAMDY(配列番号33)を含むHVR−H3を含む、請求項10から12の何れか一項に記載の抗体。
- (a)アミノ酸配列RASQDVSTAVA(配列番号50)を含むHVR−L1;(b)アミノ酸配列SASFLYS(配列番号53)を含むHVR−L2;及び(c)アミノ酸配列QQSFYFPNT(配列番号39)を含むHVR−L3を含む、請求項10から12及び16の何れか一項に記載の抗体。
- IL−34の二量体に結合する、請求項1から17の何れか一項に記載の抗体。
- ヒトIL−34二量体の両方のプロトマーにわたるエピトープに結合する、請求項18に記載の抗体。
- ヒトIL−34に結合する単離抗体であって、ヒトIL−34とヒトCSF−1Rとの間の結合を阻害し、IL−34の二量体に結合する抗体。
- (a)アミノ酸配列GLGKGSKRGAMDY(配列番号33)又はGINQGSKRGAMDY(配列番号32)を含むHVR−H3;(b)アミノ酸配列QQSFYFPNT(配列番号39)又はQQSYTTPPT(配列番号43)又はQQYTALPYT(配列番号49)又はQQYSDLPYT(配列番号45)又はQQYSDVPYT(配列番号47)又はQQSRTARPT(配列番号41)を含むHVR−L3;及び(c)アミノ酸配列RISPYYYYSDYADSVKG(配列番号52)又はRISPYSGYTNYADSVKG(配列番号51)を含むHVR−H2を含む、請求項20に記載の抗体。
- (a)アミノ酸配列STWIH(配列番号59)を含むHVR−H1;(b)アミノ酸配列RISPYYYYSDYADSVKG(配列番号52)又はRISPYSGYTNYADSVKG(配列番号51)を含むHVR−H2;及び(c)アミノ酸配列GLGKGSKRGAMDY(配列番号33)又はGINQGSKRGAMDY(配列番号32)を含むHVR−H3を含む、請求項20に記載の抗体。
- (a)アミノ酸配列RASQDVSTAVA(配列番号50)を含むHVR−L1;(b)アミノ酸配列SASFLYS(配列番号53)を含むHVR−L2;及び(c)アミノ酸配列QQSFYFPNT(配列番号39)又はQQSYTTPPT(配列番号43)又はQQYTALPYT(配列番号49)又はQQYSDLPYT(配列番号45)又はQQYSDVPYT(配列番号47)又はQQSRTARPT(配列番号41)又はQQSFYFPN(配列番号38)又はQQSYTTPP(配列番号42)又はQQYTALPY(配列番号48)又はQQYSDLPY(配列番号44)又はQQYSDVPY(配列番号46)又はQQSRTARP(配列番号40)を含むHVR−L3を含む、請求項20又は請求項22に記載の抗体。
- (a)アミノ酸配列GLGKGSKRGAMDY(配列番号33)を含むHVR−H3;(b)アミノ酸配列QQYSDLPYT(配列番号45)を含むHVR−L3;及び(c)アミノ酸配列RISPYSGYTNYADSVKG(配列番号51)を含むHVR−H2を含む、請求項20に記載の抗体。
- (a)STWIH(配列番号59)のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)アミノ酸配列RISPYSGYTNYADSVKG(配列番号51)を含むHVR−H2;及び(c)アミノ酸配列GLGKGSKRGAMDY(配列番号33)を含むHVR−H3を含む、請求項20に記載の抗体。
- (a)RASQDVSTAVA(配列番号50)のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)アミノ酸配列SASFLYS(配列番号53)を含むHVR−L2;及び(c)アミノ酸配列QQYSDLPYT(配列番号45)を含むHVR−L3を含む、請求項20又は請求項25に記載の抗体。
- 配列番号5のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも90%である重鎖可変領域配列、及び/又は配列番号6のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも90%である軽鎖可変領域配列を含む、請求項20から23の何れか一項に記載の抗体。
- 配列番号5のアミノ酸配列である重鎖可変領域配列、及び/又は配列番号6のアミノ酸配列である軽鎖可変領域配列を含む、請求項20から23の何れか一項に記載の抗体。
- 配列番号7のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも90%である重鎖可変領域配列、及び/又は配列番号8のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも90%である軽鎖可変領域配列を含む、請求項20から23の何れか一項に記載の抗体。
- 配列番号7のアミノ酸配列である重鎖可変領域配列、及び/又は配列番号8のアミノ酸配列である軽鎖可変領域配列を含む、請求項20から23の何れか一項に記載の抗体。
- 配列番号9のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも90%である重鎖可変領域配列、及び/又は配列番号10のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも90%である軽鎖可変領域配列を含む、請求項20から23の何れか一項に記載の抗体。
- 配列番号9のアミノ酸配列である重鎖可変領域配列、及び/又は配列番号10のアミノ酸配列である軽鎖可変領域配列を含む、請求項20から23の何れか一項に記載の抗体。
- 配列番号11のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも90%である重鎖可変領域配列、及び/又は配列番号12のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも90%である軽鎖可変領域配列を含む、請求項20から26の何れか一項に記載の抗体。
- 配列番号11のアミノ酸配列である重鎖可変領域配列、及び/又は配列番号12のアミノ酸配列である軽鎖可変領域配列を含む、請求項20から26の何れか一項に記載の抗体。
- 配列番号13のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも90%である重鎖可変領域配列、及び/又は配列番号14のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも90%である軽鎖可変領域配列を含む、請求項20から23の何れか一項に記載の抗体。
- 配列番号13のアミノ酸配列である重鎖可変領域配列、及び/又は配列番号14のアミノ酸配列である軽鎖可変領域配列を含む、請求項20から23の何れか一項に記載の抗体。
- ヒトIL−34二量体の両方のプロトマーにわたるエピトープに結合する、請求項20から36の何れか一項に記載の抗体。
- IL−34活性を中和する、請求項20から37の何れか一項に記載の抗体。
- ヒトIL−34に結合する単離抗体であって、ヒトIL−34とヒトCSF−1Rとの間の結合を阻害し、IL−34活性を中和する、抗体。
- (a)アミノ酸配列SRGAYRFAY(配列番号56)を含むHVR−H3;(b)アミノ酸配列QQSYTTPPT(配列番号43)を含むHVR−L3;及び(c)アミノ酸配列SITPASGDTDYADSVKG(配列番号54)を含むHVR−H2を含む、請求項39に記載の抗体。
- (a)アミノ酸配列SNYIH(配列番号55)を含むHVR−H1;(b)アミノ酸配列SITPASGDTDYADSVKG(配列番号54)を含むHVR−H2;及び(c)アミノ酸配列SRGAYRFAY(配列番号56)を含むHVR−H3を含む、請求項39に記載の抗体。
- (a)アミノ酸配列RASQDVSTAVA(配列番号50)を含むHVR−L1;(b)アミノ酸配列SASFLYS(配列番号53)を含むHVR−L2;及び(c)アミノ酸配列QQSYTTPPT(配列番号43)を含むHVR−L3を含む、請求項39又は請求項41に記載の抗体。
- 配列番号15のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも90%である重鎖可変領域配列、及び/又は配列番号16のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも90%である軽鎖可変領域配列を含む、請求項39から42の何れか一項に記載の抗体。
- 配列番号15のアミノ酸配列である重鎖可変領域配列、及び/又は配列番号16のアミノ酸配列である軽鎖可変領域配列を含む、請求項39から43の何れか一項に記載の抗体。
- ヒトCSF−1とヒトCSF−1Rとの間の結合を阻害しない、請求項1から44の何れか一項に記載の抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項1から45の何れか一項に記載の抗体。
- ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である、請求項1から46の何れか一項に記載の抗体。
- 二重特異性抗体である、請求項1から47の何れか一項に記載の抗体。
- 二重特異性抗体が、ヒトCSF−1に対する第2の結合特異性を含む、請求項48に記載の抗体。
- ヒトIL−34(配列番号1)に対する第1の結合特異性と、ヒトCSF−1に対する第2の結合特異性とを含む、二重特異性抗体。
- ヒトIL−34のヒトCSF−1Rへの結合を阻害し、ヒトCSF−1のヒトCSF−1Rへの結合を阻害する、請求項50に記載の二重特異性抗体。
- ヒトIL−34に結合する抗体断片である、請求項1から51の何れか一項に記載の抗体。
- Fab断片、Fab’断片、Fab’−SH断片、F(ab’)2断片、Fv断片、又はscFv断片である、請求項52に記載の断片。
- 1アーム抗体である、請求項1から51の何れか一項に記載の抗体。
- 線状抗体である、請求項1から51の何れか一項に記載の抗体。
- 全長IgG1又はIgG4抗体である、請求項1から55の何れか一項に記載の抗体。
- ヒトCSF−1Rに結合する単離抗体であって、ヒトCSF−1Rのアミノ酸残基Arg144、Gln248、Gln249、Ser250、Phe252、及びAsn254のうちの少なくとも一つを含むエピトープに結合し、アミノ酸残基の位置が配列番号2における位置に基づき、前記抗体が、ヒトIL−34とヒトCSF−1Rとの間の結合を阻害する、抗体。
- CSF−1Rのアミノ酸残基Arg144を含むエピトープに結合し、アミノ酸残基の位置が配列番号2における位置に基づく、請求項57に記載の抗体。
- 前記エピトープが、ヒトCSF−1Rのアミノ酸残基Arg142、Arg146、及びArg150のうちの少なくとも一つを更に含み、アミノ酸残基の位置が配列番号2における位置に基づく、請求項58に記載の抗体。
- 前記エピトープが、ヒトCSF−1Rのアミノ酸残基Ser172及びArg192のうちの少なくとも一つを更に含み、アミノ酸残基の位置が配列番号2における位置に基づく、請求項58又は59に記載の抗体。
- 前記エピトープが、ヒトCSF−1Rのアミノ酸残基Arg146、Met149、Arg150、Phe169、Ile170、及びGln173のうちの少なくとも一つを更に含み、アミノ酸残基の位置が配列番号2における位置に基づく、請求項58から60の何れか一項に記載の抗体。
- ヒトCSF−1Rの142〜150及び169〜173位内のアミノ酸に結合し、アミノ酸残基の位置が配列番号2における位置に基づく、請求項58から61の何れか一項に記載の抗体。
- ヒトCSF−1Rのアミノ酸残基Gln248、Gln249、Ser250、Phe252、及びAsn254のうちの少なくとも一つを含むエピトープに結合し、アミノ酸残基の位置が配列番号2における位置に基づく、請求項57に記載の抗体。
- 前記エピトープが、ヒトCSF−1Rのアミノ酸残基Tyr257を更に含み、アミノ酸残基の位置が配列番号2における位置に基づく、請求項63に記載の抗体。
- 前記エピトープが、ヒトCSF−1Rのアミノ酸残基Pro247、Gln258、及びLys259のうちの少なくとも一つを更に含み、アミノ酸残基の位置が配列番号2における位置に基づく、請求項63又は64に記載の抗体。
- 前記エピトープが、ヒトCSF−1Rのアミノ酸残基Val231、Asp251、及びTyr257のうちの少なくとも一つを更に含み、アミノ酸残基の位置が配列番号2における位置に基づく、請求項63から65の何れか一項に記載の抗体。
- ヒトCSF−1Rの231、248〜252、及び254位内のアミノ酸残基に結合し、アミノ酸残基の位置が配列番号2における位置に基づく、請求項63から66の何れか一項に記載の抗体。
- 請求項1から67の何れか一項に記載の抗体をコードする単離核酸。
- 請求項68に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項69に記載の核酸を含む宿主細胞。
- 抗体を作製する方法であって、請求項70に記載の宿主細胞を、抗体が産生されるように培養することを含む、方法。
- 宿主細胞により産生される抗体を回収することを更に含む、請求項71に記載の方法。
- 請求項1から67の何れか一項に記載の抗体と薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物。
- 医薬としての使用のための、請求項1から67の何れか一項に記載の抗体。
- 骨髄病原性免疫疾患の治療における使用のための、請求項1から67の何れか一項に記載の抗体。
- ヒトIL−34とヒトCSF−1Rとの間の結合の阻害における使用のための、請求項1から67の何れか一項に記載の抗体。
- 医薬の製造における、請求項1から67の何れか一項に記載の抗体の使用。
- 医薬が、骨髄病原性免疫疾患を治療するための医薬である、請求項77に記載の使用。
- 医薬が、ヒトIL−34とヒトCSF−1Rとの間の結合、及びヒトCSF1とヒトCSF1Rとの間の結合の両方を阻害する、請求項77に記載の使用。
- 骨髄病原性免疫疾患を有する個体を治療する方法において、請求項1から67の何れか一項に記載の抗体の有効量を該個体に投与することを含む、方法。
- 骨髄病原性免疫疾患を有する個体を治療する方法において、請求項1から47の何れか一項に記載の抗体の有効量を、ヒトCSF−1に結合する抗体と共に該個体に投与することを含む、方法。
- 前記抗体が、二重特異性抗体であり、ヒトIL−34及びヒトCSF−1の活性が阻害される、請求項80に記載の方法。
- ヒトIL−34及びヒトCSF−1の活性が阻害される、請求項81に記載の方法。
- ヒトIL−34のヒトCSF−1Rへの結合が阻害され、ヒトCSF−1とヒトCSF−1Rとの結合が阻害される、請求項82又は請求項83に記載の方法。
- 骨髄病原性免疫疾患が、関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、マクロファージ活性化症候群(MAS)、円板状ループス、サルコイドーシス、血管炎、及び移植片対宿主病である、請求項80から84の何れか一項に記載の方法。
- 個体におけるヒトIL−34とヒトCSF−1Rとの間の結合を阻害する方法であって、請求項1から67の何れか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、方法。
- 治療される個体において骨髄病原性疾患のためのTNF療法及び/又はリツキシマブ療法に対する応答が不十分である、請求項80から86の何れか一項に記載の方法。
- 請求項1から67の何れか一項に記載の抗体を含む製造品。
- 請求項1から47の何れか一項に記載の抗体を含み、ヒトCSF−1に結合する抗体を更に含む製造品。
- 個体における骨髄病原性免疫疾患を治療するために、有効量の抗体を個体に投与するための指示書を更に含む、請求項88に記載の製造品。
- 個体における骨髄病原性免疫疾患を治療するために、有効量の、請求項1から47の何れか一項に記載の抗体及びヒトCSF−1に結合する抗体を、個体へと投与するための指示書を更に含む、請求項88に記載の製造品。
- 骨髄病原性免疫疾患が、関節リウマチ、炎症性腸疾患、又は多発性硬化症である、請求項87から91の何れか一項に記載の製造品。
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