MX2014006529A - Mutaciones de erbb3 en cancer. - Google Patents

Abstract

Esta invención se refiere a mutaciones de ErbB3 somáticas en cáncer incluyendo métodos de identificación, diagnóstico y pronóstico de cánceres de ErbB3, así como métodos para tratar el cáncer, incluyendo ciertas subpoblaciones de pacientes.

Description

MUTACIONES DE ERBB3 EN CANCER CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere a mutaciones de ErbB3 somáticas en cáncer incluyendo métodos para identificar, diagnosticar y pronosticar cánceres de ErbB3 , así como métodos para tratar el cáncer, incluyendo ciertas subpoblaciones de pacientes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La familia del receptor de factor de crecimiento epidérmico (HER, por sus siglas en inglés) de tirosina cinasas receptoras (RTK, por sus siglas en inglés) , también conocidas como receptores ERBB, consiste en cuatro miembros: EGFR/ERBBl/HERl, ERBB2/HER2 , ERBB3/HER3 y ERBB4/HER4 (Hynes et al. Nature Reviews Cáncer 5, 341 a 354 (2005); Baselga et al. Nature Reviews Cáncer 9, 463 a 475 (2009)). Los miembros de familia de ERBB contienen un dominio extracelular (ECD, por sus siglas en inglés) , una región de un solo dominio transmembrana, un dominio de tirosina cinasa intracelular y una cola de señalización C-terminal (Burgess et al. Mol Cell 12, 541 a 552 (2003) ; Ferguson. Annual Review of Biophysics 37, 353 a 373 (2008)). El ECD es una estructura de cuatro dominios que consiste en dos dominios L (I y III) y dos dominios ricos en cisteína (II y IV) (Burgess et al. Mol Cell 12, 541 a 552 (2003) ; Ferguson. Annual Review of Biophysics 37, 353 a 373 (2008)). Los receptores ERBB se activan por REF.:248686 múltiples ligandos que incluyen el factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés) , factor de crecimiento transformante a (TFG-a) y neuregulinas (Yarden et al. Nat Rev Mol Cell Biol 2, 127 a 137 (2001)). La activación del receptor implica una unión de una única molécula ligando simultáneamente con los dominios I y III, que conduce a la heterodimerización u homodimerización a través de una rama de dimerizacion del dominio II (Burgess et al. Mol Cell 12, 541 a 552 (2003); Ogiso et al. Cell 110, 775 a 787 (2002); Cho. Science 297, 1330 a 1333 (2002); Dawson et al. Molecular and Cellular Biology 25, 7734 a 7742 (2005); Alvarado et al. Cell 142, 568 a 579 (2010); Lemmon et al. Cell 141, 1117 a 1134 (2010)). En ausencia del ligando, la rama de dimerizacion del dominio II se oculta mediante una interacción intramolecular con el dominio IV, que conduce a una configuración autoinhibida, "ligada", (Burgess et al. Mol Cell 12, 541 a 552 (2003); Cho. Science 297, 1330 a 1333 (2002); Lemmon et al. Cell 141, 1117 a 1134 (2010); Ferguson et al. Mol Cell 11, 507 a 517 (2003)).

Aunque los cuatro receptores ERBB comparten una organización de dominio similar, los estudios funcionales y estructurales muestran que ERBB2 no se une con ninguno de los ligandos de la familia ERBB conocidos y está de forma constitutiva en una conformación "desligada" (abierta) adecuada para dimerizacion (Garrett et al. Mol Cell 11, 495 a 505 (2003)) . Por el contrario, ERBB3 , aunque tiene capacidad de unión con el ligando, heterodimerización y señalización, tiene un dominio cinasa alterado (Baselga et al. Nature Reviews Cáncer 9, 463 a 475 (2009); Jura et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 21608 a 21613 (2009); Shi et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 107, 7692 a 7697 (2010)). Aunque, ERBB2 y ERBB3 son funcionalmente incompletos por sí solos, sus heterodímeros son potentes activadores de la señalización celular (Pinkas-Kramarski et al. The EMBO Journal 15, 2452 a 2467 (1996); Tzahar et al. Molecular and Cellular Biology 16, 5276 a 5287 (1996); Holbro et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 100, 8933 a 8938 (2003)).

Aunque los receptores ERBB son reguladores críticos del crecimiento y desarrollo normales, su desregulación también se ha implicado en el desarrollo y progresión de cánceres (Baselga et al. Nature Reviews Cáncer 9, 463 a 475 (2009); Sithanandam et al. Cáncer Gene Ther 15, 413 a 448 (2008); Hynes et al. Current Opinión in Cell Biology 21, 177 a 184 (2009) ) . En particular, se sabe que la amplificación génica que conduce a sobreexpresión de receptor y activación de mutaciones somáticas sucede en ERBB2 y EGFR en diversos cánceres (Sithanandam et al. Cáncer Gene Ther 15, 413 a 448 (2008); Hynes et al. Current Opinión in Cell Biology 21, 177 a 184 (2009); Wang et al. Cáncer Cell 10, 25 a 38 (2006); Yamauchi et al. Biomark Med 3, 139 a 151 (2009)). Esto ha conducido al desarrollo de múltiples productos terapéuticos basados en anticuerpos y moléculas pequeñas que se dirigen a EGFR y ERBB2 (Baselga et al. Nature Reviews Cáncer 9, 463 a 475 (2009); Alvarez et al. Journal of Clinical Oncology 28, 3366 a 3379 (2010)). Aunque el papel preciso de ERBB4 en la oncogénesis no está bien establecido (Koutras et al. Critical Reviews in Oncology/Hematology 74, 73 a 78 (2010)), se han indicado mutaciones somáticas transformantes en ERBB4 en melanoma (Prickett et al. Nature Genetics 41, 1127 a 1132 (2009) ) . Recientemente, ERBB3 ha surgido como una diana terapéutica de cáncer potencial, dado que desempeña un papel importante en la señalización de ERBB2 y también está implicada en la promoción de la resistencia a productos terapéuticos existentes (Baselga et al. Nature Reviews Cáncer 9, 463 a 475 (2009); Amin et al. Semin Cell Dev Biol 21, 944 a 950 (2010)). Aunque se conoce amplificación y/o sobreexpresión de ERBB3 en algunos cánceres, solo se ha indicado aparición esporádica de mutaciones somáticas de ERBB3, aunque la relevancia funcional de estas mutaciones no se ha estudiado. La invención proporcionada en este documento se refiere a la identificación de mutaciones somáticas de ERBB3 frecuentes en cánceres humanos .

SUMARIO DE LA INVENCION Esta invención se basa al menos en parte en el descubrimiento de múltiples eventos mutacionales somáticos en el receptor ERBB3 de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER) de tirosina cinasas receptoras (RTK) , que se asocian con diversos tumores humanos, incluyendo, sin limitación, tumores gástricos y de colon. Se cree que estas mutaciones predisponen y/o contribuyen directamente a la tumorigénesis humana. De hecho, como se describe en este documento, hay pruebas de que algunas de las mutaciones promueven la oncogénesis in vivo.

En un aspecto, esta invención proporciona agentes detectores de cáncer de ErbB3. En una modalidad, el agente detector de cáncer de ErbB3 es un agente detector de cáncer gastrointestinal de ErbB3. En otra modalidad, el agente detector comprende un reactivo capaz de unirse específicamente con una mutación de ErbB3 en una secuencia de ácido nucleico de ErbB3. En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico de ErbB3 comprende SEC ID N° : 3 o 1.

En algunas modalidades, el reactivo comprende un polinucleótido de la fórmula 5' Xa-Y-Zb 3' Fórmula I, en la que X es cualquier ácido nucleico y a está entre aproximadamente 0 y aproximadamente 250; Y es un codón de mutación de ErbB3 ; y Z es cualquier ácido nucleico y b está entre aproximadamente 0 y aproximadamente 250.

En otra modalidad, el codón de mutación codifica (i) un aminoácido en una posición de SEC ID N° : 2 seleccionada del grupo que consiste en 104, 809, 232, 262, 284, 325, 846, 928, 60, 111, 135, 295, 406, 453, 498, 1089 y 1164; o (ii) un codón de parada en la posición 193. En otra modalidad, el cáncer gastrointestinal es cáncer gástrico o cáncer de colon.

En otro aspecto, esta invención proporciona un método para determinar la presencia de cáncer gastrointestinal de ErbB3 en un sujeto. En una modalidad, el método comprende detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto una mutación en una secuencia de ácido nucleico que codifica ErbB3, en el que la mutación da como resultado un cambio de aminoácidos en al menos una posición de la secuencia de aminoácidos de ErbB3 y en el que la mutación es indicativa de un cáncer gastrointestinal de ErbB3 en el sujeto. En otra modalidad, la mutación que da como resultado un cambio de aminoácidos es en una posición de SEC ID N° : 2 seleccionada del grupo que consiste en 104, 809, 232, 262, 284, 325, 846, 928, 60, 111, 135, 295, 406, 453, 498, 1089, 1164 y 193. En otras modalidades, el cáncer gastrointestinal es cáncer gástrico o cáncer de colon.

En otro aspecto, esta invención proporciona un método para determinar la presencia de cáncer de ErbB3 en un sujeto. En una modalidad, el método comprende detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto la presencia o ausencia de una mutación de aminoácidos en una secuencia de ácido nucleico que codifique ErbB3 , en el que la mutación da como resultado un cambio de aminoácidos en al menos una posición en SEC ID N° : 2 seleccionada del grupo que consiste en 104, 809, 232, 262, 284, 325, 846, 928, 60, 111, 135, 295, 406, 453, 498, 1089, 1164, 193, 492 y 714, y en el que la presencia de la mutación es indicativa de un cáncer de ErbB3 en el sujeto. En otra modalidad, el cáncer de ErbB3 se selecciona del grupo que consiste en gástrico, de colon, esofágico, rectal, de ciego, adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , NSCLC (carcinoma escamoso) , carcinoma renal, melanoma, ovárico, de pulmón de células grandes, de pulmón de células pequeñas (SCLC) , hepatocelular (HCC) , de pulmón y pancreático .

En otro aspecto más, los métodos de determinación comprenden además una de las siguientes etapas adicionales: administrar un agente terapéutico al sujeto, identificar el sujeto que lo necesite, obtener la muestra de un sujeto que lo necesite o cualquier combinación de éstas. En una modalidad, el agente terapéutico es un inhibidor de ErbB. En otras modalidades, el inhibidor de ErbB se selecciona del grupo que consiste en un antagonista de EGFR, un antagonista de ErbB2 , un antagonista de ErbB3 , un antagonista de ErbB4 y un antagonista de EGFR/ErbB3. En otra modalidad, el inhibidor es una molécula pequeña inhibidora. En una modalidad, el antagonista es un anticuerpo antagonista. En otra modalidad más, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y un fragmento de anticuerpo.

En otro aspecto, la etapa de detección comprende amplificar o secuenciar. En una modalidad, la detección comprende amplificar o secuenciar la mutación y detectar la mutación o secuencia de la misma. En otra modalidad, la amplificación comprende mezclar un cebador de amplificación o par de cebadores de amplificación con un molde de ácido nucleico aislado de la muestra. En otras modalidades, el cebador o par de cebadores es complementario o parcialmente complementario de una región próxima a o que incluye la mutación y que es capaz de iniciar la polimerización de ácido nucleico por una polimerasa en el molde de ácido nucleico. En otra modalidad, la amplificación comprende además extender el cebador o par de cebadores en una reacción de polimerización de ADN que comprende una polimerasa y el ácido nucleico molde para generar un amplicón. En otra modalidad, en la amplificación o secuenciación, la mutación se detecta por un procedimiento que incluye uno o más de: secuenciar la mutación en un ADN genómico aislado de la muestra biológica, hibridar la mutación o un amplicón de la misma con una matriz, digerir la mutación o un amplicón de la misma con una enzima de restricción, o amplificación por PCR en tiempo real de la mutación. En otra modalidad más, la amplificación o secuenciación comprende además secuenciar parcial o completamente la mutación en un ácido nucleico aislado de la muestra biológica. En otras modalidades, la amplificación comprende realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PC ) , PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) o reacción en cadena de la ligasa (LCR) usando un ácido nucleico aislado de la muestra biológica como un molde en la PCR, RT-PCR o LCR.

En otro aspecto, esta invención proporciona un método para tratar el cáncer gastrointestinal en un sujeto que lo necesite. En una modalidad, el método comprende a) detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto una mutación en una secuencia de ácido nucleico que codifica ErbB3 , en el que la mutación da como resultado un cambio de aminoácidos en al menos una posición de la secuencia de aminoácidos de ErbB3 y en el que la mutación es indicativa de un cáncer gastrointestinal de ErbB3 en el sujeto. En otra modalidad, el método comprende además b) administrar un agente terapéutico al sujeto. En otras modalidades, la mutación que da como resultado un cambio de aminoácidos está en una posición de SEC ID N°: 2 seleccionada del grupo que consiste en 104, 809, 232, 262, 284, 325, 846, 928, 60, 111, 135, 295, 406, 453, 498, 1089, 1164 y 193. En otra modalidad, el cáncer gastrointestinal es cáncer gástrico o cáncer de colon.

En un aspecto, esta invención proporciona un método para tratar un cáncer de ErbB3 en un sujeto. En una modalidad, el método comprende a) detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto la presencia o ausencia de una mutación de aminoácidos en una secuencia de ácido nucleico que codifica ErbB3 , en el que la mutación da como resultado un cambio de aminoácidos en al menos una posición en SEC ID N° : 2 seleccionada del grupo que consiste en 104, 809, 232, 262, 284, 325, 846, 928, 60, 111, 135, 295, 406, 453, 498, 1089, 1164, 193, 492 y 714, y en el que la presencia de la mutación es indicativa de un cáncer de ErbB3 en el sujeto. En otra modalidad, el método comprende además b) administrar un agente terapéutico al sujeto. En algunas modalidades, el cáncer de ErbB3 se selecciona del grupo que consiste en gástrico, de colon, esofágico, rectal, de ciego, colorrectal, adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , NSCLC (carcinoma escamoso) , carcinoma renal, melanoma, ovárico, de pulmón de células grandes, cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) , hepatocelular (HCC) , de pulmón y pancreático.

En otro aspecto, los métodos de tratamiento implican inhibidores de ErbB3. En una modalidad adicional, el agente terapéutico es un inhibidor de ErbB. En otra modalidad, el inhibidor de ErbB se selecciona del grupo que consiste en un antagonista de EGFR, un antagonista de ErbB2 , un antagonista de ErbB3, un antagonista de ErbB4, y un antagonista de EGFR/ErbB3. En otra modalidad más, el antagonista es una molécula pequeña inhibidora. En una modalidad, el antagonista es un anticuerpo antagonista. En otras modalidades, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y un fragmento de anticuerpo.

Modalidades adicionales En un aspecto, esta invención proporciona métodos para determinar la presencia de cáncer de ErbB3 en un sujeto que lo necesite. En una modalidad, el método comprende la etapa de detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto la presencia o ausencia de una mutación de aminoácidos en una secuencia de ácido nucleico que codifica ErbB3 , en el que la mutación da como resultado un cambio de aminoácidos en al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en M60, R193, A232, P262, V295, G325, M406, D492, V714, Q809, R1089, T1164. En otra modalidad, el método comprende además administrar un agente terapéutico al sujeto. En otra modalidad, el método comprende además identificar al sujeto que lo necesite. En otra modalidad más, el método comprende además obtener la muestra de un sujeto que lo necesite. En una modalidad, el cáncer de ErbB3 se selecciona del grupo que consiste en gástrico, de colon, esofágico, rectal, de ciego, adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC, por sus siglas en inglés) , NSCLC (carcinoma escamoso) , carcinoma renal, melanoma, ovárico, de pulmón de células grandes, cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC, por sus siglas en inglés), hepatocelular (HCC) , de pulmón y pancreático.

En otro aspecto, esta invención proporciona métodos para determinar la presencia de cáncer gastrointestinal de ErbB3 en un sujeto que lo necesite que comprenden detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto una mutación en una secuencia de ácido nucleico que codifique ErbB3 , en el que la mutación da como resultado un cambio de aminoácidos en al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en V104, Ylll, A232, P262, G284, T389 y Q809. En otra modalidad, el método comprende además administrar un agente terapéutico al sujeto. En otra modalidad, el método comprende además identificar al sujeto que lo necesite. En otra modalidad más, el método comprende además obtener la muestra de un sujeto que lo necesite. En otra modalidad, el cáncer gastrointestinal de ErbB3 es cáncer gástrico o cáncer de colon .

En otro aspecto, esta invención proporciona métodos para identificar cáncer gastrointestinal de ErbB3 en un sujeto que lo necesite que probablemente responda a un antagonista de ErbB, comprendiendo el método detectar en una célula de cáncer gastrointestinal obtenida del sujeto una mutación en una secuencia de ácido nucleico que codifica ErbB3 , en el que la mutación está en al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en V104, Ylll, A232, P262, G284, T389 y Q809. En otra modalidad, el método comprende además administrar un agente terapéutico al sujeto. En otra modalidad, el método comprende además obtener la muestra de un sujeto que lo necesite. En otra modalidad, el cáncer gastrointestinal de ErbB3 es cáncer gástrico o cáncer de colon .

En otro aspecto, esta invención proporciona métodos para tratar cáncer de ErbB3 en un sujeto que lo necesite. En una modalidad, el método comprende la etapa de detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto la presencia o ausencia de una mutación de aminoácidos en una secuencia de ácido nucleico que codifica ErbB3, en el que la mutación da como resultado un cambio de aminoácidos en al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en M60, R193, A232, P262, V295, G325, M406, D492, V714, Q809, R1089, T1164. En otra modalidad, el método comprende además la etapa de administrar un agente terapéutico al sujeto.

En otro aspecto, esta invención proporciona métodos para tratar cáncer gastrointestinal de ErbB3 en un sujeto que lo necesite. En una modalidad, el método comprende la etapa de detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto una mutación en una secuencia de ácido nucleico que codifica ErbB3, en el que la mutación da como resultado un cambio de aminoácidos en al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en V104, Ylll, A232, P262, G284, T389 y Q809. En otra modalidad, el método comprende además la etapa de administrar un agente terapéutico al sujeto.

En una modalidad, el agente terapéutico administrado en los métodos de esta invención es un inhibidor de ErbB. En otra modalidad, el inhibidor de ErbB se selecciona del grupo que consiste en un antagonista de EGFR, un antagonista de ErbB2, un antagonista de ErbB3 , un antagonista de ErbB4 y un antagonista de EGFR/ErbB3. En otra modalidad, el inhibidor es una molécula pequeña inhibidora. En algunas modalidades, el inhibidor de ErbB es un antagonista de EGFR. En otras modalidades, el inhibidor de ErbB es un antagonista de ErbB2. En otra modalidad, el inhibidor de ErbB es un antagonista de ErbB3. En otra modalidad, el inhibidor de ErbB es un antagonista de ErbB4. En algunas modalidades, el inhibidor de ErbB es un antagonista de EGFR/ErbB3. En otras modalidades, el antagonista es un anticuerpo antagonista. En algunas modalidades, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y un fragmento de anticuerpo.

En otro aspecto, los métodos de esta invención comprenden una etapa de detección en la que la secuencia de ácido nucleico obtenida de la muestra se analiza con respecto a la presencia o ausencia de la mutación o las mutaciones. En una modalidad, la detección comprende amplificar o secuenciar la mutación y detectar la mutación o secuencia de ésta. En otra modalidad, la amplificación comprende mezclar un cebador de amplificación o par de cebadores de amplificación con un molde de ácido nucleico aislado de la muestra. En otra modalidad, el cebador o par de cebadores es complementario o parcialmente complementario de una región próxima a o que incluye la mutación, y es capaz de iniciar la polimerización de ácido nucleico por una polimerasa en el molde de ácido nucleico. En otra modalidad más, el método comprende además extender el cebador o par de cebadores en una reacción de polimerización de ADN que comprenden una polimerasa y el ácido nucleico molde para generar un amplicón. En algunas modalidades, la mutación se detecta por un procedimiento que incluye uno o más de: secuenciar la mutación en un ADN genómico aislado de la muestra biológica, hibridar la mutación o un amplicón de ésta con una matriz, digerir la mutación o un amplicón de ésta con una enzima de restricción, o amplificación por PCR en tiempo real de la mutación. En otras modalidades, el método comprende secuenciar parcial o completamente la mutación en un ácido nucleico aislado de la muestra biológica. En una modalidad, la amplificación comprende realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) o reacción en cadena de la ligasa (LCR) usando un ácido nucleico aislado de la muestra biológica como un molde en la PCR, RT-PCR o LCR.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS El archivo de esta patente contiene al menos una figura ejecutada en color. Se proporcionarán copias de esta patente con figuras a color por la Oficina de Patentes y Marcas tras la petición y pago de las tasas necesarias.

Figuras 1A-1M. Muestras. Proporcionan una lista de las muestras de tej ido humano usadas en el estudio de ERBB3 en cánceres humanos .

Figuras 2A-2B. Secuencias de ácido nucleico de ERBB3 de tipo silvestre representativa (N° de Referencia: NM_001982) (SEC ID N° : 1) .

Figura 3. Secuencia de aminoácidos de ERBB3 de tipo silvestre representativa (N° de Referencia: NM_001973) (SEC ID N° : 2) .

Figuras 4A-4F: Mutaciones somáticas de ERBB3. (4A-4B) Se muestran alteraciones proteicas resultantes de mutaciones somáticas de ERBB3 mapeadas sobre los dominios de la proteína ERBB3. Mutaciones de puntos calientes representadas como cambios de aminoácidos repetitivos en un fondo rojo claro. La altura de la barra vertical del fondo en torno al resto mutado es proporcional a la frecuencia de mutación en esa posición particular. (4C-4D) Mutaciones somáticas no sinónimas de ERBB3 (triángulos invertidos; triángulos rojos representan puntos calientes) representadas sobre dominios de la proteína ERBB3. El histograma en la parte superior representa el recuento de mutaciones en cada posición detectada observadas en muestras en este estudio y otros estudios publicados (las barras rojas indican mutaciones de puntos calientes y las barras azules representan mutaciones no de puntos calientes adicionales ensayadas con respecto a actividad) . (4E-4F) Vista expandida y complementada de las Figuras 4A-4B. La Figura 4A-4F proporciona una vista lineal de ErbB3 en la que las Figuras 4A, 4C y 4E muestran una mitad N-terminal, y las Figuras 4B, 4D y 4F muestran una mitad C-terminal.

Figuras 5A-5B. Expresión de mutantes de ERBB3 (5A, 5B) y expresión de ERBB2 (5B) en las muestras de colon mutantes de ERBB3 como se evalúa usando datos de secuenciación de ARN (Seshagiri, S. et al. Comprehensive analysis of colon cáncer genomes identifies recurrent mutations and R-spondin f sions . (Manuscrito en Preparación 2011)).

Figura 6. Alineamiento de múltiples secuencias de ortólogos de ERBB3 que representan conservación entre sitios mutados. H. sapiens (NP_001973.2 (la secuencia de longitud completa se describe como SEC ID N° : 126 y las diversas regiones se describen como SEC ID N° : 132 a 151, respectivamente, en orden de aparición) ) , P. troglodytes (XP_509131.2 (la secuencia de longitud completa se describe como SEC ID N° : 130 y las diversas regiones se describen como SEC ID N° : 212 a 229, respectivamente, en orden de aparición)), C. lupus (XP_538226.2 (SEC ID N° : 131)), B . taurus (NP_001096575.1 (la secuencia de longitud completa se describe como SEC ID N° : 129 y las diversas regiones se describen como SEC ID N° : 192 a 211, respectivamente, en orden de aparición)), M. musculus (NP_034283.1 (la secuencia de longitud completa se describe como SEC ID N° : 127 y las diversas regiones se describen como SEC ID N° : 152 a 171, respectivamente, en orden de aparición)) y R. norvegicus ( P_058914.2 (la secuencia de longitud completa se describe como SEC ID N° : 128 y las diversas regiones se describen como SEC ID N° : 172 a 191, respectivamente, en orden de aparición)) se alinearon usando Clustal W (Larkin, M. A. et al. Bioinformatics (Oxford, Inglaterra) 23, 2947 a 2948 (2007)). Los restos imitados se muestran en un fondo oval rojo.

Figuras 7A-7C. Mutaciones de ECD somáticas frecuentes (o de puntos calientes) mostradas en rojo, mapeadas en (7A) una estructura cristalina de ERBB3 ECD "ligado" [pdb 1M6B] (7B) , o (7B) en un modelo de heterodímero de ERBB3/ERBB2 ECD "no ligado" basado en el dímero de EGFR ECD (pdb 1IVO) , usando ERBB3 [pdb 1M6B] y ERBB2 [pdb 1N8Z] . El ligando de ERBB3 mostrado como una superficie gris, basado en EGF [pdb 1IV0] (7C) . Mutaciones somáticas de dominio de cinasa ERBB3 mostradas en rojo, mapeadas en una estructura del dominio cinasa de ERBB3 [pdb 3LMG] .* = codón de parada.

Figura 8. Mutaciones somáticas de ERBB3 mapeadas en la estructura cristalina de ECD de ERBB3 (pdb 1M6B) coloreadas por dominio.

Figura 9. Mutantes de ERBB3 apoyan la proliferación independiente de EGF de células MCFIOA en cultivo tridimensional. Las células MCFIOA que expresan de forma estable mutantes de ERBB3 solos o junto con EGFR o ERBB2 muestran proliferación independiente de EGF. Se realizaron estudios que implicaban MCFIOA en ausencia de suero, EGF y NRG1. EV - vector vacío.

Figuras 10A-10C. Los mutantes de ERBB3 promueven el crecimiento independiente de anclaje independiente de suero y EGF. Se muestran imágenes representativas que representan colonias formadas por MCFIOA que expresan ERBB3 solo o en combinación con EGFR o ERBB2 (10A) . Se muestra cuantificación de las colonias del ensayo representado en (10A) para mutantes de ERBB3 en combinación con EGFR (10B) o ERBB2 (10C) .

Figuras 11A-11C. Células MCFIOA que expresan de forma estable mutantes de ERBB3 solo (11A) o junto con EGFR (11B) o ERBB2 (11C) muestran señalización dirección 3' elevada como se evalúa por Western Blot. Se realizaron estudios que implicaban MCFIOA en ausencia de suero, EGF y NRG1. EV - vector vacío.

Figuras 12A-12C. Los mutantes de ERBB3 soportan la proliferación independiente de EGF de células MCFIOA en cultivo tridimensional. Las células MCFIOA que expresan de forma estable mutantes de ERBB3 solos o junto con EGFR o ERBB2 muestran arquitectura acinar grande, aumento de la tinción de Ki67 y aumento del índice de migración en comparación con células MCF10A que expresan ERBB3/ERBB2. Los datos representan la media ± ETM de los tres experimentos independientes. Se realizaron estudios que implicaban MCF10A en ausencia de suero, EGF y NRG1. EV - vector vacio.

La Figura 13Aa-13Ab muestran imágenes representativas de células MCF10A que expresan los mutantes de ERBB3 indicados junto con ERBB2 después de la migración desde un transwell en el ensayo de migración (13Aa), y la cuantificación de este efecto de migración (13Ab) .

La Figura 13Ba-13Be muestran que los mutantes de ERBB3 soportan el crecimiento independiente de anclaje de células epiteliales colónicas IMCE. Las células epiteliales colónicas IMCE que expresan ERBB3 por si solo o en combinación con ERBB2 mostraron crecimiento independiente de anclaje (13Ba), aumento del número de colonias (13Bb), fosfo señalización elevada (13Bc, 13Bd) y crecimiento in vivo (13Be) en comparación con células IMCE que expresan ERBB3-WT/ERBB2. EV - vector vacio.

Figura 14. Los mutantes de ERBB3 transforman y promueven la supervivencia independiente de IL3 de células BaF3. Las células BaF3 que expresan de forma estable mutantes de ERBB3 solos o junto con EGFR o ERBB2 promueven la supervivencia independiente de IL3. Se realizaron estudios de BaF3 en ausencia de IL3 y NRG1. EV = vector vacio; M = monómero y D = dimero.

Figuras 15A-15C. Los mutantes de ERBB3 transforman y promueven la supervivencia independiente de IL3 de células BaF3. Las células BaF3 que expresan de forma estable mutantes de ERBB3 bien solo (15A) o bien junto con EGFR (15B) o ERBB2 (15C) promueven un aumento de la fosforilación de ERBB3 y sus efectores dirección 3'. Se realizaron estudios de BaF3 en ausencia de IL-3 y NRG1. EV = vector vacío; M = monómero y D = dlmero.

Figura 16. Una imagen representativa del crecimiento independiente de anclaje de células BaF3 que expresan de forma estable mutantes de ERBB3 solos o en combinación con EGFR o ERBB2. Se realizaron estudios de BaF3 en ausencia de IL-3 y NRG1. EV = vector vacío; = monómero y D = dímero.

Figura 17. Anti-NRGl, un anticuerpo neutralizador de NRG1, no afecta a la supervivencia independiente de IL-3 de células BaF3 promovida por mutantes de ERBB3 coexpresados con ERBB2. Se realizaron estudios de BaF3 en ausencia de IL-3 y NRG1. EV = vector vacío; M = monómero y D = dímero.

Figura 18. Niveles elevados de heterodímeros ERBB3 mutante/ERBB2 en células BaF3 en ausencia de NRG1 como se observa en material inmunoprecipitado derivado después de entrecruzar las proteínas de superficie celular usando BS3. Se realizaron estudios de BaF3 en ausencia de IL-3 y NRG1. EV = vector vacío; M = monómero y D = dímero.

Figura 19. Niveles elevados de heterodímeros de ERBB3 mutante/ERBB2 en células BaF3 en ausencia de NRG1 como se observa en la superficie celular detectados usando un ensayo de ligación de proximidad 40. Se realizaron estudios de BaF3 en ausencia de IL-3 y NRG1. EV = vector vacío; M = monómero y D = dímero.

Figuras 20A-20C. Cuantificación de heterodímeros de ERBB3-ERBB2. Se analizaron imágenes del ensayo de ligación de proximidad (Figura 17) usando la herramienta de software de imágenes Duolink (Uppsala, Suecia) . Se analizaron al menos 100 células de 5 a 6 campos de imágenes para la combinación indicada de células que expresan ERBB3 y ERBB2 con respecto a señal (puntos rojos) resultante de dímeros ERBB2/ERBB3. El ensayo se realizó con anticuerpo de FLAG (ERBB3) y gD (ERBB2) (20A) o ERBB3 nativo y anticuerpos de ERBB3 (20B) . Los datos se muestran como la media + ETM. La Figura 20C muestra que NRG1 no pudo apoyar la supervivencia de las células BaF3 que expresaban ERBB3- T o mutantes solamente.

Figura 21. Los mutantes de ERBB3 ECD muestran aumento de la supervivencia de BaF3 independiente de IL-3 en respuesta a diferentes dosis del ligando exógeno NRG1. Se realizaron estudios de BaF3 en ausencia de IL-3. EV = vector vacío; M = monómero y D = dímero.

Figura 22. Los mutantes de ERBB3 promueven la oncogénesis y conducen a supervivencia general reducida. Las curvas de supervivencia de Kaplan- eier para cohortes de ratones a los que se ha implantado células BaF3 que expresan combinación de ERBB3 mutante/ERBB2 indicada muestran supervivencia general reducida en comparación con células BaF3 de control (vector) (n = 10 para las ramas; ensayo de rangos logarítmicos p<0.0001) .

Figuras 23A-23B. Análisis citométrico de flujo de células de médula ósea total (23A) y células del bazo (23B) aisladas de ratones que recibieron células BaF3 marcadas con GFP que expresaban los diversos mutantes de ERBB3/ERBB2-WT.

Figuras 24A-24B. Se muestra el número medio de células positivas para GFP en la médula ósea (24A) y bazo (24B) de ratones (n = 3) de las ramas de estudio indicadas.

Figuras 25A-25B. Se representa el peso medio del bazo (25A) y el hígado (25B) de los ratones (n=3) en las ramas de estudio indicadas.

Figura 26. Secciones de médula ósea (superior), bazo (media) e hígado (inferior) teñidas con H y E representativas de los mismos ratones analizados en la Figura 21. La médula ósea de animales de vector vacío consiste en células hematopoyéticas normales. * = células tumorales de infiltración, R = pulpa roja, W = folículos linfoides de pulpa blanca. En la sección de bazo no marcada, hay una pérdida de arquitectura de pulpa roja/blanca debido a alteración por células tumorales de infiltración. La barra de escala corresponde a 100 µt?.

Figura 27. Se muestran imágenes representativas del bazo y el hígado de ratones a los que se han trasplantado células BaF3 que expresan ERBB3 mutante.

Figura 28. Eficacia de los anticuerpos anti-ERBB y moléculas pequeñas inhibidoras en la actividad oncogénica de mutantes de ERBB3. Efecto de los productos terapéuticos dirigidos en la proliferación independiente de IL-3 de células BaF3 que expresan de forma estable mutantes de ERBB3 junto con ERBB2 como se indica en la figura.

Figura 29. Imágenes representativas del efecto de los productos terapéuticos dirigidos en el crecimiento independiente de anclaje de células BaF3 que expresan de forma estable mutantes de ERBB3 junto con ERBB2 como se indica en la figura.

Figura 30. Esquema que representa los receptores ERBB y diversos agentes dirigidos que se ensayaron en este estudio.

Figuras 31A-31B. Los anticuerpos anti-ERBB3 se dirigen eficazmente a mutantes de ERBB3 in vivo. Eficacia de anticuerpos trastuzumab (Tmab) 10 mg/kg QW, anti -ERBB3.1 50 mg/kg QW y anti-ERBB3.2 100 mg/kg QW en el bloqueo de enfermedad de tipo leucemia inducida por células BaF3 que expresan el mutante de ERBB3 G284R (31A) o Q809R (3IB) en combinación con ERBB2. El grupo tratado con anticuerpo de control (Ab de control) recibe anticuerpo anti-ambrosía 40 mg/kg QW.

Figura 32. Efecto de los productos terapéuticos dirigidos en células BaF3 que expresan de forma estable mutantes de ERBB3 junto con ERBB2 como se indica en la figura. La concentración de anticuerpos y moléculas pequeñas inhibidoras usadas para el tratamiento es la misma que se indica en la Figura 27.

Figura 33. Se muestra el efecto de anticuerpos de ERBB y moléculas pequeñas inhibidoras en la fosforilación de ERBB3 y moléculas de señalización dirección 3' en BaF3 a las 8 h después del tratamiento. Se muestra el efecto de estos mismos agentes a las 24 h en la Fig. 30.

Figuras 34A-34B. Proporción de células BaF3 de infiltración que expresan ERBB3 imitante, G284R (34A) y Q809R (34B) , en médula ósea (BM) y bazo después del tratamiento con los anticuerpos como se indica en la figura.

Figuras 35A-35B. Peso del hígado y del bazo del animal al que se han implantado células mutantes para ERBB3, G284R (35A) y Q809R (35B) , después del tratamiento con los anticuerpos como se ha indicado.

Figura 36. Se muestran células BaF3 positivas para GFP de infiltración que expresan motante de ERBB3 aislado de bazo y médula ósea de ratones a los que se han implantado estas células.

Figuras 37A-37H. Los mutantes de ERBB3 transforman y promueven la supervivencia independiente de IL3 de células BaF3. (37A) Supervivencia independiente de IL3 de células BaF3 que expresan de forma estable mutantes de ERBB3 solos o junto con ERBB2 o ERBB2-KD. (37B) Una imagen representativa del crecimiento independiente de anclaje de las células BaF3 que expresan de forma estable mutantes de ERBB3 solos o en combinación con ERBB2 o ERBB2-KD. (37C) Gráfico de barras que muestra el número de colonias formado por células BaF3 que expresan los mutantes de ERBB3 junto con ERBB2 mostrado en (37B) . Se formaron muy pocas colonias por células que expresaban mutantes de ERBB3 solos o en combinación con ERBB2-KD. (37D-37F) Western Blot que muestra el estado de pERBB3, pERBB2 , pAKT y pERK de células BaF3 que expresan mutantes de ERBB3 solos (37D) o en combinación con ERBB2 (37E) o ERBB2-KD (37F) . (37G) Anti-NRGl, un anticuerpo neutralizador de NRG1, no afecta a la supervivencia independiente de IL-3 de células BaF3 promovida por mutantes de ERBB3 co-expresados con ERBB2. (37H) Los mutantes de ERBB3 ECD muestran aumento de la supervivencia de BaF3 independiente de IL-3 en respuesta a aumento de la dosis de NRG1 exógeno. Se realizaron estudios de BaF3 en ausencia de IL-3 (37A-37H) y NRG1 (37A-37F) . EV = vector vacío, M = monómero y D = dímero.

Figura 38A-38J. La anulación de ERBB3 mediada por AR hp retarda el crecimiento tumoral . (38A-38J) CW-2 y DV-90 que expresan de forma estable ARNhp que se dirige a ERBB3 inducible tras inducción por dox mostraron niveles menores de ERBB3 y pERK (38A, 38B) , crecimiento independiente de anclaje (38C-38F) y crecimiento in vivo reducido (38H, 38J) en comparación con células no inducidas (38A-38F) o células que expresan ARNhp que se dirige a luciferasa (38A-38F, 38G e 381) . Los datos en (38E, 38F) representan el número de colonias independientes de anclaje formadas cuantificadas a partir de múltiples archivos de imágenes como el mostrado en (38C, 38D) . Los datos se muestran como media ± ETM.

La Figura 39 proporciona una secuencia de ácido nucleico (SEC ID N° : 3) y secuencia de aminoácidos (SEC ID N° : 2) para ErbB3. Las mutaciones de esta invención se indican por los aminoácidos encuadrados y codones encuadrados/subrayados.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La práctica de esta invención empleará, a no ser que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes) , microbiología, biología celular, y bioquímica, que están dentro de la experiencia de la técnica. Las técnicas se explican completamente en la bibliografía, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed. , 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed. , 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" , 4a edición (D.M. eir y C.C. Blackwell, eds . , Blackwell Science Inc., 1987); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); y "PCR: The Polymerase Chain Reaction" , (Mullís et al., eds., 1994).

Definiciones A no ser que se defina de otro modo, se pretende que todos los términos de la técnica, notaciones y otra terminología científica usada en este documento tengan los significados habitualmente entendidos por los expertos en la materia a la que pertenece esta invención. En algunos casos, se definen en este documento términos con significados habitualmente entendidos para mayor claridad y/o para una referencia fácil, y no debería interpretarse necesariamente que la inclusión de las definiciones en este documento represente una diferencia sustancial sobre lo que se entiende generalmente en la técnica. Las técnicas y procedimientos descritos o a los que se hace referencia en este documento se entienden generalmente bien y se emplean habitualmente usando metodología convencional por los expertos en la materia, tal como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook efc al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. Según sea apropiado, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos disponibles en el mercado generalmente se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante a no ser que se indique de otro modo. Antes de describir los presentes métodos, kits y usos de éstos debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, los protocolos, las líneas celulares, las especies o los géneros animales, construcciones y reactivos particulares descritos ya que éstos pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en este documento es para el fin de describir solamente modalidades particulares y no se pretende que limite el alcance de esta invención que estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.

Debe observarse que como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", «y" y "el" incluyen referentes plurales a no ser que el contexto claramente dicte otra cosa.

A lo largo de esta descripción y reivindicaciones, se entenderá que la palabra "comprender" , o variaciones tales como "comprende" o "comprendiendo", implica la inclusión de un número entero o grupo de números enteros indicado pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros .

La expresión "polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usa de forma intercambiable en este documento, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluye ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos , ribonucleótidos , nucleótidos o bases modificados y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse en un polímero por ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación de la estructura de nucleótidos puede transmitirse antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede interrumpirse por componentes no nucleotídicos . Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de polimerización, tal como por conjugación con un componente de mareaje. Otros tipos de modificación incluyen, por ejemplo, "extremos recubiertos", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, las que tienen enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres , fosfoamidatos , carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos , fosforoditioatos , etc.), los que contienen restos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), los que tienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), los que contienen quelantes (por ejemplos, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), los que contienen alquilantes, los que tienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido o los polinucleótidos . Además, cualquiera de los grupos hidroxilo habitualmente presentes en los azúcares puede reemplazarse, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse por grupos de protección convencionales o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o puede conjugarse con soportes sólidos. El OH 5' y 3' terminal puede fosforilarse o sustituirse con aminas o restos de grupos de protección orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivatizarse a grupos protectores convencionales. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa que generalmente se conocen en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2 ' -0-metil-2 ' -0-alilo, 2'-fluoro- o 2 ' -azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos , azúcares alfa-anoméricos , azúcares epiméricos, tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos tales como metil ribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden reemplazarse por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, a título enunciativo, modalidades en las que el fosfato se reemplaza por P(0)S ("tioato"), P(S)S ( "ditioato" ) , "(0)NR 2" ( "amidato" ) , P(0)R, P(0)0R'; CO o CH2 ( »formacetal " ) , en los que cada R o R' es independientemente H o alquilo (1 a 20 C) sustituido o no sustituido que contiene opc ionalmente un enlace éter (--0--), arilo, alquenilo, cicloalqui lo , cicloalquenilo o araldilo.

No es necesario que todos los enlaces en un polinucleótido sean idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos a los que se ha hecho referencia en este documento, incluyendo ARN y ADN.

"Oligonucleótido" , como se usa en este documento, se refiere a polinucleótidos monocatenarios cortos que son de al menos aproximadamente siete nucleótidos de longitud y de menos de aproximadamente 250 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden ser sintéticos. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente excluyentes. La descripción anterior para polinucleótidos es igual y completamente aplicable a oligonucleótidos .

El término "cebador" se refiere a un polinucleótido monocatenario que es capaz de hibridar con un ácido nucleico y permitir la polimerización de un ácido nucleico complementario, generalmente proporcionando un grupo 3' --0H libre.

Como se usa en este documento, el término "gen" se refiere a una secuencia de ADN que codifica mediante su molde o ARN mensajero una secuencia de aminoácidos característica de un péptido, polipéptido o proteína específico. El término "gen" también se refiere a una secuencia de ADN que codifica un producto de ARN. El término gen como se usa en este documento con referencia al ADN genómico incluye regiones intermedias, no codificantes, así como regiones reguladoras y puede incluir extremos 5' y 3'.

La expresión "mutación somática" o "variación somática" se refiere a un cambio en una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, una inserción, deleción, inversión o sustitución de uno o más nucleótidos) , que se adquiere en una célula del cuerpo a diferencia de una célula de línea germinal. La expresión también abarca el cambio correspondiente en el complemento de la secuencia de nucleótidos, a no ser que se indique de otro modo.

La expresión "variación de aminoácidos" se refiere a un cambio en una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, una inserción, sustitución o deleción de uno o más aminoácidos, tal como una deleción interna o un truncamiento N o C-terminal) en relación con una secuencia de referencia.

El término "variación" se refiere a una variación de nucleótidos o una variación de aminoácidos.

La expresión "una variación genética en una posición de nucleótido correspondiente a una mutación somática", "una variación de nucleótido en una posición de nucleótido correspondiente a una mutación somática" y variantes gramaticales de éstas se refieren a una variación de nucleótido en una secuencia polinucleotídica en la posición de ADN correspondiente relativa ocupada por la mutación somática. La expresión también abarca la variación correspondiente en el complemento de la secuencia de nucleótidos, a no ser que se indique de otro modo.

El término "matriz" o "micromatriz" se refiere a una disposición ordenada de elementos de matriz hibridable, preferentemente sondas polinucleotídicas (por ejemplo, oligonucleótidos) , en un sustrato. El sustrato puede ser un sustrato sólido, tal como un portaobjetos de vidrio, o un sustrato semi-sólido, tal como membrana de nitrocelulosa .

El término "amplificación" se refiere al proceso de producir una o más copias de una secuencia de ácido nucleico de referencia o su complemento. La amplificación puede ser lineal o exponencial (por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ) . Una "copia" no significa necesariamente complementariedad o identidad de secuencia perfecta en relación con la secuencia molde. Por ejemplo, las copias pueden incluir análogos de nucleótidos tales como desoxiinosina, alteraciones de secuencia intencionadas (tales como alteraciones de secuencia introducidas mediante un cebador que comprende una secuencia que es hibridable, pero no completamente complementaria, con el molde) y/o errores de secuencia que aparecen durante la amplificación.

La expresión "oligonucleótido específico de mutación" se refiere a un oligonucleótido que híbrida con una región de un ácido nucleico diana que comprende una variación de nucleótidos (con frecuencia una sustitución) . "Hibridación específica de mutación somática" significa que, cuando un oligonucleótido específico de mutación híbrida con su ácido nucleico diana, un nucleótido en el oligonucleótido específico de mutación forma par de bases específicamente con la variación de nucleótidos. Se dice que un oligonucleótido específico de mutación somática capaz de hibridación específica de mutación con respecto a una variación de nucleótidos particular es "específico para" esa variación.

La expresión "cebador específico de mutación" se refiere a un oligonucleótido específico de mutación que es un cebador.

La expresión "ensayo de extensión de cebadores" se refiere a un ensayo en el que se añaden nucleótidos a un ácido nucleico, dando como resultado un ácido nucleico más largo o "producto de extensión", que se detecta directa o indirectamente. Los nucleótidos pueden añadirse para extender el extremo 5' o 3' del ácido nucleico.

La expresión "ensayo de incorporación de nucleótidos específica de mutación" se refiere a un ensayo de extensión de cebadores en el que un cebador (a) se híbrida con un ácido nucleico diana en una región que está 3' o 5' de una variación de nucleótidos y (b) se extiende por una polimerasa, incorporando de este modo en el producto de extensión un nucleótido que es complementario de la variación de nucleótidos.

La expresión "ensayo de extensión de cebadores específicos de mutación" se refiere a un ensayo de extensión de cebadores en el que un cebador específico de mutación se híbrida con un ácido nucleico diana y se extiende.

La expresión "ensayo de hibridación de oligonucleótidos específico de mutación" se refiere a un ensayo en el que (a) un oligonucleótido específico de mutación se híbrida con un ácido nucleico diana y (b) se detecta la hibridación directa o indirectamente.

La expresión "ensayo de 5' nucleasa" se refiere a un ensayo en el que la hibridación de un oligonucleótido específico de mutación con un ácido nucleico diana permite la escisión nucleotídica de la sonda hibridada, dando como resultado una señal detectable.

La expresión "ensayo que emplea balizas moleculares" se refiere a un ensayo en el que la hibridación de un oligonucleótido específico de mutación con un ácido nucleico diana da como resultado un nivel de señal detectable que es superior al nivel de señal detectable emitida por el oligonucleótido libre.

La expresión "ensayo de ligamiento de oligonucleótidos" se refiere a un ensayo en el que un oligonucleótido específico de mutación y un segundo oligonucleótido se hibridan adyacentes entre sí en un ácido nucleico diana y se ligan entre sí (directa o indirectamente mediante nucleótidos intermedios), y el producto de ligamiento se detecta directa o indirectamente.

La expresión "secuencia diana" , "ácido nucleico diana" , o "secuencia de ácido nucleico diana" se refiere en general a una secuencia polinucleotídica de interés en la que se sospecha o se sabe que reside una variación de nucleótidos, incluyendo copias del ácido nucleico diana generadas por amplificación.

El término "detección" incluye cualquier medio de detección, incluyendo detección directa e indirecta.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular desregulado. El cáncer diagnosticado de acuerdo con esta invención es cualquier tipo de cáncer caracterizado por la presencia de una mutación de ErbB3, que incluye específicamente cáncer no resecable metastásico o localmente avanzado, incluyendo, sin limitación, gástrico, de colon, esofágico, rectal, de ciego, colorrectal, adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , NSCLC (carcinoma escamoso) , carcinoma renal, melanoma, ovárico, de pulmón de células grandes, cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) , hepatocelular (HCC) , cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello y cáncer pancreático.

Como se usa en este documento, un sujeto "en riesgo" de desarrollar cáncer puede tener o no enfermedad o síntomas de enfermedad detectables, y puede tener o no enfermedad o síntomas de enfermedad detectables presentados antes de los métodos de diagnóstico descritos en este documento. "En riesgo" indica que un sujeto tiene uno o más factores de riesgo, que son parámetros medibles que se correlacionan con el desarrollo del cáncer, como se describen en este documento y se conocen en la técnica. Un sujeto que tiene uno o más de estos factores de riesgo tiene una mayor probabilidad de desarrollar cáncer que un sujeto sin uno o más de estos factores de riesgo.

El término "diagnóstico" se usa en este documento para referirse a la identificación o clasificación de un estado molecular o patológico, enfermedad o afección, por ejemplo, cáncer. "Diagnóstico" también puede referirse a la clasificación de un subtipo de cáncer particular, por ejemplo, por características moleculares (por ejemplo, un subpoblación de pacientes caracterizada por una variación o variaciones de nucleótidos en una región de ácido nucleico o gen particular) .

La expresión "ayudar al diagnóstico" se usa en este documento para referirse a métodos que ayudan a realizar una determinación clínica con respecto a la presencia, o naturaleza, de un tipo particular de síntoma o afección de cáncer. Por ejemplo, un método de ayuda al diagnóstico de cáncer puede comprender medir la presencia o ausencia de uno o más marcadores genéticos indicativos de cáncer o un mayor riesgo de tener cáncer en una muestra biológica de un individuo.

El término "pronóstico" se usa en este documento para referirse a la predicción de la probabilidad de desarrollar cáncer. El término "predicción" se usa en este documento para referirse a la probabilidad de que un paciente responda favorablemente o desfavorablemente a un fármaco o conjunto de fármacos. En una modalidad, la predicción se refiere al alcance de esas respuestas. En una modalidad, la predicción se refiere a si y/o la probabilidad de que un paciente sobreviva o mejore después del tratamiento, por ejemplo, tratamiento con un agente terapéutico particular, y durante un cierto período de tiempo sin reaparición de la enfermedad. Los métodos predictivos de la invención pueden usarse clínicamente para tomar decisiones de tratamiento eligiendo las modalidades de tratamiento más apropiadas para cualquier paciente particular. Los métodos predictivos de esta invención son herramientas valiosas para predecir si un paciente probablemente responde favorablemente a un régimen de tratamiento, tal como un régimen terapéutico dado, incluyendo por ejemplo, administración de un agente terapéutico o combinación dado, intervención quirúrgica, tratamiento con esteroides, etc., o si es probable la supervivencia a largo plazo del paciente, después de un régimen terapéutico.

Como se usa en este documento, "tratamiento" se refiere a intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo o célula que se trate, y puede realizarse antes o durante el transcurso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen evitar la aparición o reaparición de una enfermedad o una afección o síntoma de éste, aliviar una afección o síntoma de la enfermedad, disminuir cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, reducir la velocidad de progresión de la enfermedad, aliviar o paliar la patología, y conseguir remisión o pronóstico mejorado. En algunas modalidades, los métodos y composiciones de la invención son útiles en intentos de retardar el desarrollo de una enfermedad o trastorno.

Un "agente terapéutico de cáncer", un "agente terapéutico eficaz para tratar el cáncer" y variaciones gramaticales de éstas, como se usan en este documento, se refieren a un agente que cuando se proporciona una cantidad eficaz, se sabe, se muestra clínicamente o se espera por los especialistas clínicos que proporcione un beneficio terapéutico en un sujeto que tenga cáncer. En una modalidad, la frase incluye cualquier agente que se comercialice por un fabricante, o se use de otro modo por especialistas clínicos licenciados, como un agente aceptado clínicamente que cuando se proporciona en una cantidad eficaz se esperaría que proporcione un efecto terapéutico en un sujeto que tiene cáncer. En diversas modalidades no limitantes, un agente terapéutico de cáncer comprende agentes quimioterapéuticos , inhibidores de dimerización de HE , anticuerpos de HER, anticuerpos dirigidos contra antígenos asociados a tumor, compuestos antihormonales, citocinas, fármacos dirigidos a EGFR, agentes antiangiogénicos , inhibidores de tirosina cinasa, agentes inhibidores del crecimiento y anticuerpos, agentes citotóxicos, anticuerpos que inducen la apoptosis, inhibidores de COX, inhibidores de farnesil transferasa, anticuerpos que se unen con la proteína oncofetal CA 125, vacunas de HER2 , inhibidores de Raf o ras, doxorrubicina liposómica, topotecán, taxeno, inhibidores de tirosina cinasa dobles, TLK286, EMD-7200, pertuzumab, trastuzumab, erlotinib y bevacizumab.

Una "quimioterapia" es el uso de un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos, usados en quimioterapia, incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida CYTOXAN®,-alquil sulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; TLK 286 (TELCYTA™) ; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) ; delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®) ,- beta-lapachona; lapachol; colchicinas ; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán (HYCAMTIN®) , CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina , escopolectina, y 9-aminocamptotecina) ; briostatina ; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; podofilotoxina ; ácido podofiínico; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1) ; eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina , fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina bisfosfonatos , tales como clodronato; antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammall y caliqueamicina omegall (véase, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl . , 33: 183 a 186 (1994)) y antraciclinas tales como annamicina, AD 32, alcarubicina, daunorrubicina, dexrazoxano, DX-52-1, epirubicina, GPX-100, idarubicina, KRN5500, menogarilo, dinemicina, incluyendo dinemicina A, una esperamicina, cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos de cromoproteína enediina relacionados, aclacinomisinas , actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomiciñas, dactinomicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina, doxorrubicina liposómica y desoxidoxorrubicina) , esorubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina , olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina y zorubicina; análogos de ácido fólico tales como denopterina, pteropterina y trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina y tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina y floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostañolona epitiostanol , mepitiostano y testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano y trilostano; reforzador de ácido fólico tal como ácido folínico (leucovorina) ; aceglatona; agentes antineoplásicos anti-folato tales como ALIMTA®, pemetrexed LY231514, inhibidores de dihidrofolato reductasa tales como metotrexato, anti-metabolitos tales como 5-fluorouracilo (5-FU) y sus profármacos tales como UFT, S-l y capecitabina , e inhibidores de timidilato sintasa e inhibidores de glicinamida ribonucleótido formiltransferasa tales como raltitrexed (TOMUDEXRM, TDX) ; inhibidores de dihidropirimidina deshidrogenase tales como eniluracilo; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina ; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol ,-nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2 -etilhidrazida ; procarbazina; complejo de polisacárido PSK7 (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2 , 2 ' , 2 ' ' -triclorotrietilamina ; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol ,-mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides y taxenos, por ejemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXA E™ sin Cremophor, formulación de nanopartículas modificadas con albúmina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) y docetaxel TAXOTERE® (Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; clorambucilo; gemcitabina (GEMZAR®) ; 6-tioguanina; mercaptopurina; platino; análogos de platino o análogos basados en platino tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino vinblastina (VELBAN®) ; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®) ; alcaloides de la vinca; vinorelbina (NAVELBINE®) ; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda ibandronato ; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinoico; sales, ácidos o derivados de cualquier de los anteriores farmacéuticamente aceptables; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona, y FOLPOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina.

La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permita que la actividad biológica de un principio activo contenido en ella sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un principio activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, a título enunciativo, un amortiguador, excipiente, estabilizador o conservante.

Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente terapéutico puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para inducir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del agente terapéutico se compense por los efectos terapéuticamente beneficiosos. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño tumoral; inhibir (es decir, ralentizar en algún grado y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en algún grado y preferentemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, en algún grado, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en algún grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la medida en que el fármaco pueda prevenir el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Típicamente, pero no necesariamente, dado que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o en un estadio de enfermedad más temprano, la cantidad profilácticamente eficaz será inferior a la cantidad terapéuticamente eficaz.

Un "individuo", "sujeto" o "paciente" es un vertebrado. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero. Los mamíferos incluyen, a título enunciativo, primates (incluyendo primates humanos y no humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En ciertas modalidades, un mamífero es un ser humano.

Una "subpoblación de pacientes" , y variaciones gramaticales de la misma, como se usa en este documento, se refiere a un subconjunto de pacientes caracterizado por tener una o más características medibles y/o identificables distintivas que distinguen al subconjunto de pacientes de otros en la categoría de enfermedad más amplia a la que pertenecen. Las características incluyen subcategorías de enfermedad, sexo, estilo de vida, historial sanitario, órganos/tejidos implicados, historial del tratamiento, etc. En una modalidad, una subpoblación de pacientes se caracteriza por identificaciones de ácidos nucleicos, incluyendo variaciones de nucleótidos en posiciones y/o regiones de nucleótidos particulares (tales como mutaciones somáticas) .

Un "sujeto de control" se refiere a un sujeto sano al que no se le ha diagnosticado que tenga cáncer y que no padece ninguna señal o síntoma asociado al cáncer.

El término "muestra", como se usa en este documento, se refiere a una composición que se obtiene o deriva de un sujeto de interés que contiene una entidad celular y/u otra molecular que va a caracterizarse y/o identificarse, por ejemplo, basándose en características físicas, bioquímicas, químicas y/o fisiológicas. Por ejemplo, la frase "muestra de enfermedad" y variaciones de ésta se refieren a cualquier muestra obtenida de un sujeto de interés que se esperaría o se sabe que contiene la entidad celular y/o molecular que va a caracterizarse.

Por "muestra tisular o celular" se entiende una colección de células similares obtenidas de un tejido de un sujeto o paciente. La fuente de la muestra tisular o celular puede ser tejido sólido como de una muestra de órgano o tisular nueva, congelada y/o conservada o biopsia o aspirado; sangre o cualquier constituyente de la sangre; fluidos corporales tales como suero, orina, esputo o saliva. La muestra tisular también puede ser células o líneas celulares primarias o cultivadas. Opcionalmente , la muestra tisular o celular se obtiene de un tejido/órgano enfermo. La muestra tisular puede contener compuestos que no se entremezclan de forma natural con el tejido en la naturaleza tales como conservantes, anticoagulantes, amortiguadores, fijadores, nutrientes, antibióticos o similares. Una "muestra de referencia", "célula de referencia", "tejido de referencia", "muestra de control" , "célula de control" o "tejido de control" , como se usa en este documento, se refiere a una muestra, célula o tej ido obtenido de una fuente que se sabe, o se cree, que no está aquejado de la enfermedad o afección para cuya identificación se usa un método o composición de la invención . En una modalidad, una muestra de referencia , célula de referencia , tej ido de referencia , muestra de control , célula de control o tej ido de control se obtienen de una parte sana del cuerpo del mismo suj eto o paciente en el que se identifica una enfermedad o afección usando una composición o un método de la invención. En una modalidad, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control se obtiene de una parte sana del cuerpo de un individuo que no es el sujeto o paciente en el que se identifica una enfermedad o afección usando una composición o método de la invención .

Para los f ines de este documento, se entiende que una "sección" de una muestra tisular es una parte o trozo de individual de una muestra tisular , por ej emplo , un corte f ino de tej ido o células cortadas de una muestra tisular . Se entiende que pueden tomarse múltiples secciones de muestras tisulares y someterse a análisis de acuerdo con esta invención, siempre que se entienda que esta invención comprende un método por el que la misma sección de muestra tisular se analiza a los niveles tanto morfológico como molecular , o se analiza con respecto tanto a proteína como a ácido nucleico .

Por "correlacionar" o "correlacionando" se entiende comparar, de cualquier manera, el rendimiento y/o resultados de un primer análisis o protocolo con el rendimiento y/o los resultados de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, se pueden usar los resultados de un primer análisis o protocolo al llevar a cabo un segundo protocolo y/o se pueden usar los resultados de un primer análisis o protocolo para determinar si debería realizarse un segundo análisis o protocolo. Con respecto a la modalidad del análisis o protocolo de expresión génica, se pueden usar los resultados del análisis o protocolo de expresión génica para determinar si debería realizarse un régimen terapéutico específico.

Una "molécula pequeña" o "molécula orgánica pequeña" se define en este documento como una molécula orgánica que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 500 Dalton.

La palabra "marcador" cuando se usa en este documento se refiere a un compuesto o una composición detectable. El marcador puede ser detectable en sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisotópicos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que dé como resultado un producto detectable. Los radionúclidos que pueden actuar como marcadores detectables incluyen, por ejemplo, 1-131, 1-123, 1-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212 y Pd-109.

La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en este documento incluye (y describe) modalidades que se dirigen a ese valor o parámetro en sí mismo. Por ejemplo, la descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X" .

El término "prospecto" se usa para hacer referencia a instrucciones habitualmente incluidas en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosificación, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias con respecto al uso de los productos terapéuticos.

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan de forma intercambiable en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos) , anticuerpos policlonales , anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos siempre que muestren la actividad biológica deseada) y también pueden incluir ciertos fragmentos de anticuerpo (como se describe en más detalle en este documento) . Un anticuerpo puede ser quimérico, humano, humanizado y/o madurado por afinidad. Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una parte de un anticuerpo intacto, preferentemente que comprende la región de unión a antígeno de éste. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarias; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Un anticuerpo de esta invención "que se une" con un antígeno de interés es uno que se une con el antígeno con suficiente afinidad para que el anticuerpo sea útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico en la dirección de una proteína o una célula o te ido que expresa el antígeno. Con respecto a la unión del anticuerpo con una molécula diana, la expresión "unión específica" o "se une específicamente con" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo en una diana polipeptídica particular significa unión que es notablemente diferente de una interacción no específica. La unión específica puede medirse, por ejemplo, determinando la unión de una molécula en comparación con la unión de una molécula de control. Por ejemplo, la unión específica puede determinarse por competición con una molécula de control que es similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana no marcada. En este caso, la unión específica se indica si la unión de la diana marcada con una sonda se inhibe de forma competitiva por exceso de diana no marcada. En una modalidad particular, "se une específicamente" se refiere a la unión de un anticuerpo con sus receptores HER diana específicos y no otros receptores HER no diana específicos. Por ejemplo, un anticuerpo anti-HER3 se une específicamente con HER3 pero no se une específicamente con EGFR, HER2 o HER4. Un anticuerpo biespecífico de EGFR/HER3 se une específicamente con EGFR y HER3 pero no se une específicamente con HER2 o HER4.

Un "receptor HER" o "receptor ErbB" es una proteína tirosina cinasa receptora que pertenece a la familia de receptores HER e incluye receptores EGFR (ErbBl, HERI), HER2 (ErbB2) , HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4) . El receptor HER generalmente comprenderá un dominio extracelular, que puede unirse con un ligando de HER y/o dimerizar con otra molécula receptora HER; un dominio transmembrana lipófilo; un dominio tirosina cinasa intracelular conservado; y un dominio de señalización carboxilo terminal que alberga varios restos de tirosina que pueden fosforilarse. El receptor HER puede ser un receptor HER de "secuencia nativa" o una "variante de secuencia de aminoácidos" de éste. Preferentemente, el receptor HER es un receptor HER humano de secuencia nativa. La "ruta de HER" se refiere a la red de señalización mediada por la familia del receptor HER.

Los términos "ErbBl", "HERI", "receptor del factor de crecimiento epidérmico" y "EGFR" se usan de forma intercambiable en este documento y se refieren a EGFR como se describe, por ejemplo, en Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56: 881 a 914 (1987), incluyendo formas mutantes de origen natural de éstos (por ejemplo, un EGFR de mutante de deleción como en Ullrich et al., Nature (1984) 309: 418425 y Humphrey et al. PNAS (USA) 87: 4207 a 4211 (1990)), así como las variantes de éstos, tales como EGFRvIII. Las variantes de EGFR también incluyen variantes de deleción, sustitución e inserción, por ejemplo las descritas en Lynch et al (New England Journal of Medicine 2004, 350: 2129), Paez et al (Science 2004, 304: 1497), y Pao et al (PNAS 2004, 101: 13306). En este documento, "dominio extracelular de EGFR" o "EGFR ECD" se refiere a un dominio de EGFR que está fuera de una célula, bien anclado en una membrana celular, o bien en circulación, incluyendo fragmentos de éste. En una modalidad, el dominio extracelular de EGFR puede comprender cuatro dominios. "Dominio I" (restos de aminoácidos de aproximadamente 1 a 158) , "Dominio II" (restos de aminoácidos 159 a 336) , "Dominio III" (restos de aminoácidos 337 a 470) y "Dominio IV" (restos de aminoácidos 471 a 645) , en el que los límites son aproximados y pueden variar en aproximadamente 1 a 3 aminoácidos.

Las expresiones "ErbB2" y "HER2" se usan de forma intercambiable en este documento y se refieren a la proteína HER2 humana descrita, por ejemplo, en Semba et al., PNAS (EEUU) 82: 6497 a 6501 (1985) y Yamamoto et al. Nature 319: 230 a 234 (1986) (número de referencia de GenBank X03363) . El término "erbB2" se refiere al gen que codifica HER2 humano y "neu" se refiere al gen que codifica pi 85" ea de rata. El HER2 preferido es HER2 humano de secuencia nativa.

En este documento, el "dominio extracelular de HER2" o "HER2 ECD" se refiere a un dominio de HER2 que está fuera de una célula, bien anclado a una membrana celular o bien en circulación, incluyendo fragmentos de éste. En una modalidad, el dominio extracelular de HER2 puede comprender cuatro dominios: "Dominio I" (restos de aminoácidos de aproximadamente 1 a 195) , "Dominio II" (restos de aminoácidos de aproximadamente 196 a 319) , "Dominio III" (restos de aminoácidos de aproximadamente 320 a 488) y "Dominio IV" (restos de aminoácidos de aproximadamente 489 a 630) , (numeración de restos sin péptido señal) . Véase Garrett et al. Mol. Cell. 11: 495 a 505 (2003), Cho et al Nature All: 756 a 760 (2003), Franklin et al Cáncer Cell 5: 317 a 328 (2004), y Plowman et al Proc. Nati. Acad. ScL 90: 1746 a 1750 (1993) .

"ErbB3" y "HER3" se refieren al polipéptido receptor como se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 5.183.884 y 5.480.968 así como Kraus et al. PNAS (EEUU) 86: 9193 a 9197 (1989) (véase también Figuras 2 y 3) .

En este documento, "dominio extracelular de HER3" o "HER3 ECD" o "dominio extracelular de ErbB3" se refieren a un dominio de HER3 que está fuera de una célula, bien anclado en una membrana celular, o bien en circulación, incluyendo fragmentos de éste. En una modalidad, el dominio extracelular de HER3 puede comprender cuatro dominios : Dominio I , Dominio II, Dominio III y Dominio IV. En una modalidad, el HER3 ECD comprende los aminoácidos 1 a 636 (numeración que incluye el péptido señal) . En una modalidad, el dominio III de HER3 comprende los aminoácidos 382 a 532 (numeración que incluye el péptido señal) .

Los términos "ErbB4" y "HER4" en este documento se refieren al polipéptido receptor como se describe, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de EP N° 599.274; Plowman et al., Proc. Nati. Acad. ScL USA, 90: 1746 a 1750 (1993); y Plowman et al., Nature, 366: 473 a 475 (1993), incluyendo isoformas de éste, por ejemplo, como se describe en el documento W099/19488, publicado el 22 de abril de 1999. Por "ligando de HER" se entiende un polipéptido que se une con y/o activa un receptor HER. El ligando de HER de interés particular en este documento es un ligando de HER humano de secuencia nativa tal como factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Savage et al., J. Biol Chem. 247: 7612 a 7621 (1972)),· factor de crecimiento transformante alfa (TGF-oc) (Marquardt et al., Science 223: 1079 a 1082 (1984)); anfiregulina también conocida como factor de crecimiento autocrino de queratinocitos o schwanoma (Shoyab et al. Science 243: 1074 a 1076 (1989); Kimura et al. Nature 348: 257 a 260 (1990); y Cook et al. Mol Cell Biol. 11: 2547 a 2557 (1991)); betacelulina (Shing et al., Science 259: 1604 a 1607 (1993); y Sasada et al. Biochem. Biophys . Res. Commun. 190: 1173 (1993)); factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science 251: 936 a 939 (1991)); epiregulina (Toyoda et al . , J. Biol . Chem. 270: 7495 a 7500 (1995); y Komurasaki et al . Oncogene 15: 2841 a 2848 (1997)),-una heregulina (véase posteriormente) ; neuregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al . , Nature 387: 512 a 516 (1997)); neuregulina-3 (NRG-3) (Zhang et al, Proc . Natl . Acad. ScL 94: 9 562 a 9567 (1997)); neuregulina-4 (NRG-4) (Harari et al . Oncogene 18: 2681 a 89 (1999)); y cripto (CR-I) (Kanmm et al . J. Biol . Chem. 272(6: 3330 a 3335 (1997)). Los ligandos de HER que se unen con EGFR incluyen EGF, TGF-a, anfiregulina, betacelulina, HB-EGF y epiregulina. Los ligandos de HER que se unen con HER3 incluyen heregulinas y NRG-2. Los ligandos de HER capaces de unirse con HER4 incluyen betacelulina, epiregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 y heregulinas.

La "heregulina" (HRG) cuando se usa en este documento se refiere a un polipéptido codificado por el producto génico de heregulina como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5.641.869 o Marchionni et al., Nature, 362: 312 a 318 (1993) . Los ejemplos de heregulinas incluyen heregulina-a, heregulina-ß? , heregulina-P2 y heregulina- 3 (Holmes et al., Science, 256: 1205 a 1210 (1992); y Patente de Estados Unidos N° 5.641.869); factor de diferenciación neu (NDF) (Peles et al. Cell 69: 205 a 216 (1992)); actividad inductora del receptor de acetilcolina (ARIA) (Falls et al. Cell 72: 801 a 815 (1993)); factores de crecimiento gliales (GGF) (Marchionni et al., Nature, 362: 312 a 318 (1993)); factor derivado de neuronas sensoras y motoras (SMDF) (Ho et al. J.

Biol. Chem. 270: 14523 a 14532 (1995)); ?-heregulina (Schaefer et al . Oncogene 15: 1385 a 1394 (1997)). Un "dímero de HER" en este documento es un dímero asociado de forma no covalente que comprende al menos dos receptores HER. Los complejos pueden formarse cuando una célula que expresa dos o más receptores HER se expone a un ligando de HER y puede aislarse por inmunoprecipitación y analizarse por SDS-PAGE como se describe en Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661 a 14665 (1994), por ejemplo. Otras proteínas, tales como una subunidad del receptor de citocinas (por ejemplo gpl30) pueden asociarse con el dímero.

Un "heterodímero de HER" en este documento es un heterodímero asociado de forma no covalente que comprende al menos dos receptores HER diferentes, tales como heterodímeros EGFR-HER2, EGFR-HER3 , EGFR-HER4, HER2-HER3 o HER2-HER4.

Un "inhibidor de HER" o "inhibidor de ErbB" o "antagonista de ErbB" es un agente que interfiere con la activación o función de HER. Los ejemplos de inhibidores de HER incluyen anticuerpos de HER (por ejemplo, anticuerpos de EGFR, HER2, HER3 o HER4); fármacos dirigidos a EGFR; moléculas pequeñas antagonistas de HER; inhibidores de tirosina cinasa de HER2 ; inhibidores de tirosina cinasa dobles de HER2 y EGFR tales como lapatinib/G 572016 ,-moléculas antisentido (véase, por ejemplo, documento WO2004/87207) ; y/o agentes que se unen con, o interfieren con la función de, moléculas de señalización dirección 3', tales como MAPK o Akt . Preferentemente, el inhibidor de HER es un anticuerpo que se une con un receptor HER. En general, un inhibidor de HER se refiere a los compuestos que se unen específicamente con un receptor HER particular y evitan o reducen su actividad de señalización, pero no se unen específicamente con otros receptores HER. Por ejemplo, un antagonista de HER3 se une específicamente para reducir su actividad, pero no se une específicamente con EGFR, HER2 o HER4.

Un "inhibidor de dimerización de HER" o "HDI" es un agente que inhibe la formación de un homodímero de HER o heterodímero de HER. Preferentemente, el inhibidor de dimerización de HER es un anticuerpo. Sin embargo, los inhibidores de dimerización de HER también incluyen moléculas pequeñas peptídicas y no peptídicas, y otras entidades químicas que inhiben la formación de homo o heterodímeros de HER.

Un anticuerpo que "inhibe la dimerización de HER" es un anticuerpo que inhibe, o interfiere con, la formación de un dímero de HER, independientemente del mecanismo subyacente. En una modalidad, el anticuerpo se une con HER2 en el sitio heterodimérico de éste. Un ejemplo particular de un anticuerpo inhibidor de la dimerización es pertuzumab (Pmab) o MAb 2C . Otros ejemplos de inhibidores de la dimerización de HER incluyen anticuerpos que se unen con EGFR e inhiben la dimerización de éste con uno o más receptores HER adicionales (por ejemplo el anticuerpo monoclonal de EGFR 806, MAb 806, que se unen con EGFR activado o "desligado"; véase Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29): 30375 a 30384 (2004)); anticuerpos que se unen con HER3 e inhiben la dimerización de éste con uno o más receptores HER adicionales; anticuerpos que se unen con HER4 e inhiben la dimerización de éste con uno o más receptores HER adicionales; inhibidores de dimerización peptídicos (Patente de Estados Unidos N° 6.417.168); inhibidores de dimerización antisentido; etc.

Como se usa en este documento, "antagonista de HER2" o "inhibidor de EGFR" se refiere a los compuestos que se unen específicamente con EGFR y evitan o reducen su actividad de señalización, y no se unen específicamente con HER2 , HER3 , o HER4. Los ejemplos de los agentes incluyen anticuerpos y moléculas pequeñas que se unen con EGFR. Los ejemplos de anticuerpos que se unen con EGFR incluyen.

Como se usa en este documento, "antagonista de EGFR" o "inhibidor de EGFR" se refieren a los compuestos que se unen específicamente con EGFR y evitan o reducen su actividad de señalización y no se unen específicamente con HER2 , HER3 o HER4. Los ejemplos de los agentes incluyen anticuerpos y moléculas pequeñas que se unen con EGFR. Los ejemplos de anticuerpos que se unen con EGFR incluyen MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507) , MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (véase, Patente de Estados Unidos N° 4.943.533, endelsohn et al.) y variantes de éstos, tales como 225 quimerizado (C225 o Cetuximab; ERBITUX®) y 225 humano remodelado (H225) (véase, documento WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, un anticuerpo dirigido a EGFR, completamente humano (Imclone) ; anticuerpos que se unen con EGFR mutante de tipo II (Patente de Estados Unidos N° 5.212.290); anticuerpos humanizados y quiméricos que se unen con EGFR como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5.891.996; y anticuerpos humanos que se unen con EGFR, tales como ABX-EGF o Panitumumab (véase, documento WO98/50433, Abgenix/Amgen) ; EMD 55900 (Stragliotto et al. Eur. J. Cáncer 32A: 636 a 640 (1996)); EMD7200 (matuzumab) , un anticuerpo de EGFR humanizado dirigido contra EGFR que compite tanto con EGF como TGF-alfa por la unión con EGFR (EMD/Merck) ; anticuerpo de EGFR humano, HuMax-EGFR (GenMab) ; anticuerpos completamente humanos conocidos como El .1 , E2.4 , E2.5, E6.2 , E6.4, E2.ll, E6.3 y E7.6.3 y descritos en el documento US 6.235.883; MDX-447 (Medarex Inc) ; y mAb 806 o mAb 806 humanizado (Johns et al., J. Biol . Chem. 279(29) : 30375 a 30384 (2004)). El anticuerpo anti-EGFR puede conjugarse con un agente citotóxico, generando de este modo un inmunoconjugado (véase, por ejemplo, documento EP659. 39A2, Merck Patent GmbH) . Los antagonistas de EGFR incluyen moléculas pequeñas tales como compuestos descritos en las Patentes de Estados Unidos N° : 5.616.582, 5.457.105, 5.475.001, 5.654.307, 5.679.683 , 6.084 .095, 6 .265.410, 6.455.534, 6.521.620, 6.596.726, 6.713 .484, 5 .770.599, 6.140.332, 5.866.572, 6.399.602, 6.344 .459, 6 .602.863, 6.391.874, 6.344.455, 5.760.041, 6.002.008 y 5. 747. 498, así como las siguientes publicaciones de PCT: W098/14451, WO98/50038, WO99/09016 y WO99/24037. Las moléculas pequeñas antagonistas de EGFR particulares incluyen OSI-774 (CP-358774, erlotinib, TARCEVA® Genentech/OSI Pharmaceuticals) ; PD 183805 (CI 1033, 2 -propenamida, N- [4- [ (3-cloro-4-fluorofenil) amino] -7- [3- (4-morfolinil) propoxi] -6-quinazolinil] , diclorhidrato, Pfizer Inc.); ZD1839, gefitinib (IRESSA®) 4- (3' -cloro-4' -fluoroanilino) -7-metoxi-6- (3-morfolinopropoxi) quinazolina, AstraZeneca) ; ZM 105180 ( (6-amino-4- (3-metilfenil-amino) -quinazolina, Zeneca) ; BIBX-1382 (N8- (3-cloro-4-fluoro-fenil) -N2- (l-metil-piperidin-4-il) -pirimido[5,4-d]pirimidina-2, 8-diamina, Boehringer Ingelheim) ; PKI-166 ( (R) -4- [4- [ (1-feniletil)amino] -lH-pirrolo[2,3-d]pirimidin-6-il] -fenol) ; (R) -6- (4-hidroxifenil) -4- [ (1-feniletil) amino] -7H-pirrolo [2, 3-d]pirimidina) ; CL-387785 (N- [4- [ (3-bromofenil) amino] -6-quinazolinil] -2-butinamida) ; EB-569 (N- [4- [ (3-cloro-4-fluorofenil) amino] -3-ciano-7-etoxi-6-quinolinil] -4- (dimetilamino) -2 -butenamida) (Wyeth) ; AG1478 (Sugen) ; y AG1571 (SU 5271; Sugen) .

Un "anticuerpo de HER" es un anticuerpo que se une con un receptor HER. Opcionalmente, el anticuerpo de HER interfiere además con la activación o función de HER. Los anticuerpos de HER2 particulares incluyen pertuzumab y trastuzumab. Los ejemplos de anticuerpos de EGFR particulares incluyen cetuximab y panitumumab . Las publicaciones de patente relacionadas con anticuerpos de HER incluyen: documentos US 5.677.171, US 5.720.937, US 5.720.954, US 5.725.856, US 5.770.195, US 5.772.997, US 6.165.464, US 6.387.371, US 6.399.063, US2002/019221 IAl . US 6.015.567, US 6.333.169, US 4.968.603, US 5.821.337, US 6.054.297, US 6.407.213, US 6.719.971, US 6.800.738, US2004/0236078A1 , US 5.648.237, US 6.267.958, US 6.685.940, US 6.821.515, W098/17797, US 6.333.398, US 6.797.814, US 6.339.142, US 6.417.335, US 6.489.447, WO99/31140, US2003/0147884A1 , US2003/0170234A1, US2005/0002928A1, US 6.573.043, US2003/0152987A1 , W099/48527, US2002/0141993A1, WO01/00245, US2003/0086924 , US2004/0013667A1, WO00/69460, O01/00238, WOOl/15730, US 6.627.196B1, US 6.632.979B1, WO01/00244, US2002/0090662A1 , O01/89566, US2002/0064785 , US2003/0134344 , WO04/24866, US2004/0082047, US2003/0175845A1, WO03/087131, US2003/0228663, WO2004/008099A2 , US2004/0106161, WO2004/048525, US2004/0258685A1 , US 5.985.553, US 5.747.261, US 4.935.341, US 5.401.638, US 5.604.107, WO 87/07646, WO 89/10412, WO 91/05264, EP 412.116 Bl , EP 494.135B1, US 5.824.311, EP 444.181B1, EP 1.006.194 A2 , US 2002/0155527A1, WO 91/02062, US 5.571.894, US 5.939.531, EP 502.812B1, WO 93/03741, EP 554.441 Bl, EP 656.367 Al , US 5.288.477, US 5.514.554, US 5.587.458, WO 93/12220, WO 93/16185, US 5.877.305, WO 93/21319, WO 93/21232, US 5.856.089, WO 94/22478, US 5.910.486, US 6.028.059, WO 96/07321, US 5.804.396, US 5.846.749, EP 711.565, WO 96/16673, US 5.783.404, US 5.977.322, US 6.512.097, WO 97/00271, US 6.270.765, US 6.395.272, US 5.837.243, WO 96/40789, US 5.783.186, US 6.458.356, WO 97/20858, WO 97/38731, US 6.214.388, US 5.925.519, O 98/02463, US 5.922.845, WO 98/18489, WO 98/33914, US 5.994.071, WO 98/45479, US 6.358.682 Bl, US 2003/0059790, WO 99/55367, WO 01/20033, US 2002/0076695 Al , WO 00/78347, WO 01/09187, WO 01/21192, WO 01/32155, WO 01/53354, WO 01/56604, WO 01/76630, WO02/05791, WO 02/11677, US 6.582.919, US2002/0192652A1 , US 2003/0211530A1, WO 02/44413, US 2002/0142328, US 6.602.670 B2, WO 02/45653, WO 02/055106, US2003/0152572 , US 2003/0165840, WO 02/087619, WO 03/006509, WO03/012072, O 03/028638, US 2003/0068318, WO 03/041736, EP 1.357.132, US 2003/0202973, US 2004/0138160, US 5.705.157, US 6.123.939, EP 616.812 Bl, US 2003/0103973, US 2003/0108545, US 6.403.630 Bl, WO 00/61145, O 00/61185, US 6.333.348 Bl, WO 01/05425, O 01/64246, US 2003/0022918, US 2002/0051785 Al , US 6.767.541, WO 01/76586, US 2003/0144252, WO 01/87336, US 2002/0031515 Al , WO 01/87334, WO 02/05791, WO 02/09754, US 2003/0157097, US 2002/0076408, O 02/055106, WO 02/070008, WO La "activación de HER" se refiere a la activación, o fosforilación, de uno cualquiera o más receptores HER. Generalmente, la activación de HER da como resultado transducción de señal (por ejemplo, la provocada por un dominio cinasa intracelular de un receptor HER que fosforila restos de tirosina en el receptor HER o un polipéptido sustrato) . La activación de HER puede estar mediada por la unión del ligando de HER con un dímero de HER que comprende el receptor HER de interés. La unión del ligando de HER con un dímero de HER puede activar un dominio cinasa de uno o más de los receptores HER en el dímero y de este modo da como resultado la fosforilación de restos de tirosina en uno o más de los receptores HER y/o fos orilación de los restos de tirosina en un polipéptido o polipéptidos sustrato adicionales, tales como cinasas intracelulares MAPK o Akt .

La "fosforilación" se refiere a la adición de uno o más grupos fosfato a una proteína, tal como un receptor HER, o sustrato de éste.

Un "sitio de unión heterodimérico" en HER2 , se refiere a una región en el dominio extracelular de HER2 que entra en contacto, o forma una interfase con, una región en el domino extracelular de EGFR, HER3 o HER4 tras la formación de un dímero con éste. La región se encuentra en el Dominio II de HER2. Franklin et al. Cáncer Cell 5: 317 a 328 (2004) .

Un anticuerpo de HER2 que "se une con un sitio de unión heterodimérico" de HER2, se une con restos en el dominio II (y opcionalmente también se une con restos en otro de los dominios del dominio extracelular HER2 , tales como dominios I y III) y puede impedir de forma estérica, al menos en algún grado, la formación de un heterodímero HER2-EGFR, HER2-HER3 o HER2-HER4. Franklin et al. Cáncer Cell 5: 317 a 328 (2004) caracteriza la estructura cristalina de HER2-pertuzumab, depositada en el Banco de Datos de Proteínas RCSB (Código ID IS78) , que ilustra un anticuerpo ejemplar que se une con el sitio de unión heterodimérico de HER2. Un anticuerpo que "se une con el dominio II" de HER2 se une con los restos en el dominio II y opcionalmente restos en otro dominio u otros dominios de HER2 , tales como dominios I y III.

"Aislado" , cuando se usa para describir los diversos anticuerpos descritos en este documento, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de una célula o cultivo celular del que se expresaba. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que típicamente interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) en un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa rotatoria o (2) hasta su homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye anticuerpos in situ dentro de células recombinantes , porque al menos un componente del ambiente natural del polipéptido no estará presente. Habitualmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.

Un "agente de detección de cáncer de ErbB3" se refiere a un agente que es capaz de detectar una mutación asociada con un cáncer de ErbB3 dentro de una secuencia de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos de ERBB3. Típicamente, el agente de detección comprende un reactivo capaz de unirse específicamente con una secuencia de ERBB3. En una modalidad preferida, el reactivo es capaz de unirse específicamente con una mutación de ErbB3 en una secuencia de ácido nucleico de ERBB3. En una modalidad, el agente de detección comprende un polinucleótido capaz de hibridar específicamente con una secuencia de ácido nucleico de ERBB3 (por ejemplo, SEC ID N° : 1 o 3) . En algunas modalidades, el polinucleótido es una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico que híbrida específicamente con una secuencia de ErbB3 que comprende una mutación. En otra modalidad, el agente de detección comprende un reactivo capaz de unirse específicamente con una secuencia de aminoácidos de ERBB3. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos comprende una mutación como se describe en este documento. Los agentes de detección pueden comprender además un marcador. En una modalidad preferida, el agente de detección de cáncer de ErbB3 es un agente de detección de cáncer gastrointestinal de ErbB3.

Mutaciones somáticas de ErbB3 En un aspecto, la invención proporciona métodos para detectar la presencia o ausencia de mutaciones somáticas de ErbB3 asociadas con el cáncer en una muestra de un sujeto, así como métodos para diagnosticar y pronosticar el cáncer detectando la presencia o ausencia de una o más de estas mutaciones somáticas en una muestra de un sujeto, en el que la presencia de la mutación somática indica que el sujeto tiene cáncer. Se identificaron mutaciones somáticas de ErbB3 asociadas con el riesgo de cáncer usando estrategias que incluían estudios de asociación de todo el genoma, exploraciones de modificadores y exploración basada en familias .

Las mutaciones somáticas o variaciones para su uso en los métodos de la invención incluyen variaciones en ErbB3 , o los genes que codifican esta proteína. En algunas modalidades, la mutación somática es en ADN genómico que codifica un gen (o su región reguladora) . En diversas modalidades, la mutación somática es una sustitución, una inserción o una deleción en un ácido nucleico que codifica ErbB3 (SEC ID N° : 1; N° de referencia MM_001982) . En una modalidad, la variación es una mutación que da como resultado una sustitución de aminoácidos en uno o más de M60, G69, M91, V104, Ylll, R135, R193, A232, P262, 0281, G284, V295, 0298, G325, T389, R453, 406, V438, D492, K498, V714, Q809, S846, E928, S1046, R1089, T1164 y D1194 en la secuencia de aminoácidos de ErbB3 (SEC ID N° : 2; N° de referencia NP_001973). En una modalidad, la sustitución es en al menos uno de M60K, G69R, M91I, V104L, V104M, Y111C, R135L, R193*, A232V, P262S, P262H, Q281H, G284R, V295A, Q298*, G325R, T389K, M406K, V438I, R453H, D492H, K498I, V714M, Q809R, S846I, E928G, S1046N, R1089W, T1164A y D1194E (*indica un codón de parada) . En diversas modalidades, la al menos una variación es una sustitución, inserción, truncamiento o deleción de aminoácidos en ErbB3. En algunas modalidades, la variación es una sustitución de aminoácidos.

Identificación de mutaciones de ErbB3 En un aspecto significativo de esta invención, se ha identificado un grupo de restos de aminoácidos de ErbB3 como un punto caliente mutacional. En particular, se ha descubierto que ErbB3 que comprende al menos una sustitución en la interfase entre los dominios I (posiciones 1 a 213 de SEC ID N° : 2) y II (posiciones 214 a 284 de SEC ID N° : 2) es indicativo de un cáncer de ErbB3. En particular, se ha encontrado un grupo de dominio extracelular notable (ECD) de mutaciones somáticas en la interfase de dominio I/II determinada al menos por los restos de aminoácidos de ErbB3 104, 232 y 284. En una modalidad, el dominio se determina además por el resto de aminoácido 60. En otra modalidad, el grupo de mutaciones somáticas incluye V104 a L o M; A232 a V; y G284 a R. En otra modalidad, el grupo incluye además M60 a K.

En un aspecto, esta invención proporciona métodos para determinar la presencia de cáncer gastrointestinal en un sujeto que lo necesite que comprende detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto la presencia o ausencia de una mutación de aminoácidos en la interfase, determinada por las posiciones de aminoácidos 104, 232 y 284, entre los dominios II y III de ErbB3 humano. La interfase puede determinarse además por la posición 60.

Detección de mutaciones somáticas El ácido nucleico, como se usa en cualquiera de los métodos de detección descritos en este documento, puede ser ADN genómico; ARN transcrito de ADN genómico; o ADNc generado de ARN. El ácido nucleico puede derivar de un vertebrado, por ejemplo, un mamífero. Se dice que un ácido nucleico "deriva de" una fuente particular si se obtiene directamente de esa fuente o si es una copia de un ácido nucleico hallado en esa fuente .

El ácido nucleico incluye copias del ácido nucleico, por ejemplo, copias que resultan de la amplificación. La amplificación puede ser deseable en ciertos casos, por ejemplo, para obtener una cantidad deseada de material para detectar variaciones. Los amplicones pueden someterse después a un método de detección de variación, tal como los descritos posteriormente, para determinar si está presente una variación en el amplicón.

Pueden detectarse mutaciones o variaciones somáticas por ciertos métodos conocidos por los expertos en la materia. Los métodos incluyen, a título enunciativo, secuenciación de ADN; ensayos de extensión de cebadores, incluyendo ensayos de incorporación de nucleótidos específicos de mutación somática y ensayos de extensión de cebadores específicos de mutación somática (por ejemplo, PCR específica de mutación somática, reacción en cadena de ligamiento (LCR) específica de mutación somática y gap-LCR) ; ensayos de hibridación de oligonucleótidos específicos de mutación (por ejemplo, ensayos de ligamento de oligonucleótidos) ; ensayos de protección de escisión en los que se usa protección de los agentes de escisión para detectar bases desapareadas en dobles cadenas de ácido nucleico; análisis de la unión de proteína MutS; análisis electroforático que compara la movilidad de moléculas de ácido nucleico variantes y de tipo silvestre; electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE, como en, por ejemplo, Myers et al. (1985) Nature 313: 495); análisis de la escisión de RNasa en pares de bases desapareados; análisis de escisión química o enzimática de ADN de heterodú lex; espectrometría de masas (por ejemplo, MALDI-TOF) ; análisis de bit genético (GBA) ; ensayos de nucleasa 5' (por ejemplo, TaqMan™) ; y ensayos que emplean balizas moleculares. Algunos de estos métodos se analizan en más detalle posteriormente.

Puede conseguirse detección de variaciones en ácidos nucleicos diana mediante clonación molecular y secuenciación de los ácidos nucleicos diana usando técnicas bien conocidas en este campo. Como alternativa, pueden usarse técnicas de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias de ácido nucleico diana directamente de una preparación de ADN genómico de tejido tumoral . La secuencia de ácido nucleico de las secuencias amplificadas puede determinarse después e identificarse variaciones a partir de éstas. Las técnicas de amplificación se conocen bien en este campo, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa se describe en Saiki et al., Science 239: 487, 1988; Patentes de Estados Unidos N° 4.683.203 y 4.683.195.

La reacción en cadena de la ligasa, que se conoce en la técnica, también puede usarse para amplificar secuencias de ácido nucleico diana. Véase, por ejemplo, u et al., Genomics 4: 560 a 569 (1989). Además, también puede modificarse una técnica conocida como PCR específica de alelos y usarse para detectar mutaciones somáticas (por ejemplo, sustituciones) .

Véase, por ejemplo, Ruano y Kidd (1989) Nucleic Acids Research 17: 8392; McClay et al. (2002) Analytical Biochem. 301: 200 a 206. En ciertas modalidades de esta técnica, se usa un cebador específico de mutación en el que el nucleótido 3' terminal del cebador es complementario de (es decir, capaz de formar pares de bases específicamente con) una variación particular en el ácido nucleico diana. Si la variación particular no está presente, no se observa un producto de amplificación. También puede usarse el Sistema de Mutación Refractario a Amplificación (ARMS) para detectar variaciones (por ejemplo, sustituciones) . El ARMS se describe, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente Europea N° 0332435 y en Newton et al., Nucleic Acids Research, 17: 7, 1989.

Otros métodos útiles para detectar variaciones (por ejemplo, sustituciones) incluyen, a título enunciativo (1) ensayos de incorporación de nucleótidos específicos de mutación, tales como ensayos de extensión de una única base (véase, por ejemplo, Chen et al. (2000) Genome Res. 10:549 a 557; Fan et al. (2000) Genome Res. 10: 853 a 860; Pastinen et al. (1997) Genome Res. 7: 606 a 614; y Ye et al. (2001) Hum. Mut . 17: 305 a 316); (2) ensayos de extensión de cebadores específicos de mutación (véase, por ejemplo, Ye et al. (2001) Hum. Mut. 17: 305 a 316; y Shen eü al. Genetic Engineering News, vol . 23, 15 mar 2003), incluyendo PCR específica de alelos; (3) ensayos de nucleasa 5' (véase, por ejemplo, De La Vega et al. (2002) BioTechniques 32: S48-S54 (que describen el ensayo de TaqMan . RTM .) ; Ranade et al. (2001) Genome Res. 11: 1262 a 1268; y Shi (2001) Clin. Chem. 47: 164 a 172); (4) ensayos que emplean balizas moleculares (véase, por ejemplo, Tyagi et al. (1998) Nature Biotech. 16: 49 a 53; y Mhlanga et al. (2001) Methods 25: 463 a 71); y (5) ensayos de ligamiento de oligonucleótidos (véase, por ejemplo, Grossman et al. (1994) Nuc. Acids Res. 22: 4527 a 4534; Publicación de Solicitud de Patente N° US 2003/0119004 Al; Publicación Internacional de PCT N° WO 01/92579 A2 ; y Patente de Estados Unidos N° 6.027.889) .

También pueden detectarse variaciones por métodos de detección de desapareamiento. Los desapareamientos son dobles cadenas de ácido nucleico hibridadas que no son 100 % complementarias. La falta de complementariedad total puede deberse a deleciones, inserciones, inversiones o sustituciones. Un ejemplo de un método de detección de desapareamiento es el Ensayo de Detección de Reparación de Desapareamiento (MRD, por sus siglas en inglés) descrito, por ejemplo, en Faham et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 102: 14717 a 14722 (2005) y Faham et al., Hum. Mol. Genet . 10: 1657 a 1664 (2001) . Otro ejemplo de una técnica de escisión de desapareamiento es el método de protección de RNasa, que se describe en detalle en Winter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 7575, 1985, y Myers et al., Science 230: 1242, 1985. Por ejemplo, un método de la invención puede implicar el uso de una ribosonda marcada que es complementaria del ácido nucleico diana de tipo silvestre humano. La ribosonda y el ácido nucleico diana derivados de la muestra de tejido se hibridan entre sí y posteriormente se digieren con la enzima RNasa A que es capaz de detectar algunos desapareamientos en una estructura de ARN bicatenaria. Si se detecta un desapareamiento por RNasa A, ésta escinde en el sitio del desapareamiento. Por lo tanto, cuando la preparación de ARN hibridada se separa en una matriz de gel de electroforesis , si se ha detectado un desapareamiento y se escinde por RNasa A, se verá un producto de ARN que es menor que el ARN bicatenario de longitud completa para la ribosonda y el ARNm o ADN. No es necesario que la ribosonda sea la longitud completa del ácido nucleico diana, sino que puede ser una parte del ácido nucleico diana, siempre que abarque la posición que se sospecha que tiene una variación .

De una manera similar, pueden usarse sondas de ADN para detectar desapareamientos, por ejemplo mediante escisión enzimática o química. Véase, por ejemplo, Cotton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 4397, 1988; y Shenk et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 72: 989, 1975. Como alternativa, pueden detectarse desapareamientos por desplazamientos en la movilidad electroforética de dobles cadenas desapareadas en relación con dobles cadenas coincidentes. Véase, por ejemplo, Cariello, Human Genetics, 42: 726, 1988. Con ribosondas o sondas de ADN, el ácido nucleico diana que se sospecha que comprende una variación puede amplificarse antes de la hibridación. También pueden detectarse cambios en el ácido nucleico diana usando hibridación de Southern, especialmente si los cambios son reordenamientos generales, tales como deleciones e inserciones.

Pueden usarse sondas de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) para el ácido nucleico diana o genes marcadores circundantes para detectar variaciones, por ejemplo, inserciones o deleciones. También pueden detectarse inserciones y deleciones por clonación, secuenciación y amplificación de un ácido nucleico diana. También puede usarse el análisis de polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP, por sus siglas en inglés) para detectar variantes de cambio de base de un alelo. Véase, por ejemplo Orita et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 86: 2766 a 2770, 1989, y Genomics, 5: 874 a 879, 1989. El SSCP puede modificarse para la detección de mutaciones somáticas de ErbB3. El SSCP identifica diferencias de bases por alteración en la migración electroforética de productos de PCR monocatenarios . Los productos de PCR monocatenarios pueden generarse calentando o desnaturalizando de otro modo productos de PCR bicatenarios . Los ácidos nucleicos monocatenarios pueden replegarse o formar estructuras secundarias que dependen parcialmente de la secuencia de bases. Las diferentes movilidades electroforéticas de productos de amplificación monocatenarios están relacionadas con diferencias de secuencias de bases en posiciones de SNP. La electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) diferencia alelos de SNP basándose en las estabilidades dependientes de secuencia diferentes y propiedades de fusión inherentes en el ADN polimórfico y las diferencias correspondientes en patrones de migración electroforéticos en un gel de gradiente desnaturalizante.

También pueden detectarse mutaciones somáticas o variaciones con el uso de micromatrices . Una microtnatriz es una tecnología de multiplicación que usa típicamente una serie en matriz de miles de sondas de ácido nucleico para hibridar con, por ejemplo, una muestra de ADNc o AR c en condiciones de alta rigurosidad. Típicamente la hibridación sonda-diana se detecta y cuantifica por detección de dianas marcadas con fluoróforos, plata o quimioluminiscencia para determinar la abundancia relativa de secuencias de ácidos nucleico en la diana. En micromatrices típicas, las sondas se unen a una superficie sólida por un enlace covalente con una matriz química (mediante epoxi -silano, amino-silano, lisina, poliacrilamida u otros) . La superficie sólida es, por ejemplo, vidrio, una microplaca de silicio o perlas microscópicas. Diversas micromatrices están disponibles en el mercado, incluyendo las fabricadas, por ejemplo, por Affymetrix, Inc. e Illumina, Inc.

Otro método para la detección de mutaciones somáticas se basa en la espectrometría de masas. La espectrometría de masas aprovecha la masa única de cada uno de los cuatro nucleótidos de ADN. Los ácidos nucleicos de ErbB3 que contienen mutaciones potenciales pueden analizarse de forma inequívoca por espectrometría de masas midiendo las diferencias en la masa de los ácidos nucleicos que tienen una mutación somática. La tecnología de espectrometría de masas MALDI-TOF (Desorción e Ionización por Láser Asistida por Matriz-Tiempo de Vuelo) es útil para determinaciones extremadamente precisas de la masa molecular, tales como los ácidos nucleicos que contienen una mutación somática. Se han desarrollado numerosos enfoques para el análisis de ácidos nucleicos basándose en la espectrometría de masas. Los métodos basados en espectrometría de masas ejemplares incluyen ensayos de extensión de cebadores, que también pueden utilizarse en combinación con otros enfoques, tales como formatos basados en gel tradicionales y micromatrices .

También pueden usarse las ribozimas específicas de secuencia (Patente de Estados Unidos N° 5.498.531) para detectar mutaciones somáticas basándose en el desarrollo o pérdida de un sitio de escisión de ribozimas. Pueden distinguirse secuencias perfectamente coincidentes de secuencias desapareadas por ensayos de digestión de escisión con nucleasa o por diferencias en la temperatura de fusión. Si la mutación afecta a un sitio de escisión por enzima de restricción, la mutación puede identificarse por alteraciones en los patrones de digestión de enzimas de restricción, y los cambios correspondientes en las longitudes de fragmentos de ácido nucleico determinadas por electroforesis en gel .

En otras modalidades de la invención, se usan técnicas de detección basadas en proteínas para detectar proteínas variantes codificadas por los genes que tienen variaciones genéticas como se describen en este documento. La determinación de la presencia de la forma variante de la proteína puede llevarse a cabo usando cualquier técnica adecuada conocida en este campo, por ejemplo, electroforesis (por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante o no desnaturalizante, electroforesis en gel bidimensional , electroforesis capilar e isoelectroenfoque) , cromatografía (por ejemplo, cromatografía de calibrado, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC, por sus siglas en inglés) y HPLC de intercambio catiónico) , y espectroscopia de masas (por ejemplo, espectroscopia de masas MALDI-TOF, espectroscopia de masas de ionización por electronebulización (ESI) y espectroscopia de masas en tándem) . Véase, por ejemplo, Ahrer y Jungabauer (2006) J. Chromatog. B. Analyt . Technol . Biomed. Life Sci. 841: 110 a 122; y ada (2002) J. Chromatog . B. 781: 291 a 301). Pueden seleccionarse técnicas adecuadas basándose en parte en la naturaleza de la variación para detectar. Por ejemplo, pueden detectarse variaciones que dan como resultado sustituciones de aminoácidos en las que el aminoácido sustituido tiene una carga diferente que el aminoácido original, mediante isoelectroenfoque. El isoelectroenfoque del polipéptido a través de un gel que tiene un gradiente de pH a tensiones altas separa proteínas por su pl. El gel de gradiente de pH puede compararse con un gel procesado simultáneamente que contiene la proteína de tipo silvestre. En casos en los que la variación dé como resultado la generación de un nuevo sitio de escisión proteolítica, o la anulación de uno existente, la muestra puede someterse a digestión proteolítica seguida de mapeo de péptidos usando una técnica electroforética, cromatográfica o de espectroscopia de masas apropiada. La presencia de una variación también puede detectarse usando técnicas de secuenciación de proteínas tales como degradación de Edman o ciertas formas de espectroscopia de masas.

También pueden usarse métodos conocidos en la técnica usando combinaciones de estas técnicas. Por ejemplo, en la técnica de espectrometría de masas en tándem de microscopía-HPLC, se realiza digestión proteolítica en una proteína, y la mezcla de péptidos resultante se separa por separación cromatográfica de fase inversa. Después se realiza espectrometría de masas en tándem y se analizan los datos recogidos de esta (Gatlin et al. (2000) Anal. Chem. , 72: 757 a 763) . En otro ejemplo, se combina la electroforesis en gel no desnaturalizante con espectroscopia de masas MALDI (Mathe et al. (2011) Anal. Biochem. 416: 135 a 137).

En algunas modalidades, la proteína puede aislarse de la muestra usando un reactivo, tal como un anticuerpo o péptido que se une específicamente con la proteína, y después se analiza adicionalmente para determinar la presencia o ausencia de la variación genética usando cualquiera de las técnicas descritas anteriormente.

Como alternativa, la presencia de la proteína variante en una muestra puede detectarse por ensayos de inmunoafinidad basándose en anticuerpos específicos para proteínas que tienen variaciones genéticas de acuerdo con esta invención, es decir, anticuerpos que se unen específicamente con la proteína que tiene la variación, pero no con una forma de la proteína que carece de la variación. Los anticuerpos pueden producirse por cualquier técnica adecuada conocida en este campo. Los anticuerpos pueden usarse para inmunoprecipitar las proteínas específicas de muestras en solución o para inmunotransferir proteínas separadas por, por ejemplo, geles de poliacrilamida . También pueden usarse métodos inmunocitoquímicos en la detección de variantes de proteínas específicas en tejidos o células. También pueden usarse otras técnicas basadas en anticuerpos conocidas, incluyendo, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) , radioinmunoensayo (RIA) , ensayos inmunorradiométricos (IRMA) y ensayos inmunoenzimáticos (IEMA) , incluyendo ensayos de tipo sandwich usando anticuerpos monoclonales o policlonales . Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 4.376.110 y 4.486.530.

Identificación de Marcadores Genéticos La relación entre mutaciones somáticas y mutaciones de línea germinal se ha investigado en el cáncer (véase, por ejemplo, Zauber et al. J. Pathol . feb 2003; 199(2): 146 a 51) . Las mutaciones somáticas de ErbB3 descritas en este documento son útiles para identificar marcadores genéticos asociados con el desarrollo del cáncer. Por ejemplo, las mutaciones somáticas descritas en este documento pueden usarse para identificar polimorfismos de un único nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés) en la línea germinal y cualquier SNP adicional que esté en desequilibrio de enlace. De hecho, cualquier SNP adicional en desequilibrio de enlace con un primer SNP asociado a cáncer se asociará con el cáncer. Una vez que se ha demostrado la asociación entre un SNP dado y cáncer, el descubrimiento de SNP adicionales asociados con cáncer puede ser de gran interés para aumentar la densidad de SNP en esta región particular.

Se conocen bien en la técnica métodos para identificar SNP adicionales y realizar análisis de desequilibrio de enlace. Por ejemplo, la identificación de SNP adicionales en desequilibrio de enlace con los SNP descritos en este documento puede implicar las etapas de: (a) amplificar un fragmento de la región genómica que comprende o rodea a un primer SNP de una pluralidad de individuos; (b) identificar los segundos SNP en la región genómica que albergan o rodean al primer SNP; (c) realizar un análisis de desequilibrio de enlace entre los primer SNP y segundos SNP; y (d) seleccionar los segundos SNP que están en desequilibrio de enlace con el primer marcador. Este método puede modificarse para incluir ciertas etapas que preceden a la etapa (a) , tales como amplificar un fragmento de la región genómica que comprende o rodea una mutación somática de una pluralidad de individuos e identificar los SNP en la región genómica que albergan o rodean a la mutación somática.

Agentes de Detección de Cáncer de ErbB3 En un aspecto, esta invención proporciona agentes de detección de cáncer de ErbB3. En una modalidad, el agente de detección comprende un reactivo capaz de unirse específicamente con un secuencia de ErbB3 mostrada en la Figura 39 (secuencia de aminoácidos de SEC ID N° : 2 o secuencia de ácido nucleico de SEC ID N° : 3) . En otra modalidad, el agente de detección comprende un polinucleótido capaz de hibridar específicamente con una secuencia de ácido nucleico de ERBB3 mostrada en la Figura 2 (SEC ID N° : 1) o Figura 39 (SEC ID N° : 3). En una modalidad preferida, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que híbrida específicamente con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que comprende una mutación mostrada en la Figura 39 (SEC ID N° : 3) .

En otro aspecto, los agentes detectores de cáncer de ErbB3 comprenden un polinucleótido que tiene una fórmula particular. En una modalidad, la fórmula polinucleotídica es 5' Xa-Y-Zb 3' Fórmula I en la que X es cualquier ácido nucleico y a está entre aproximadamente 0 y aproximadamente 250 (es decir, en la dirección 5 ' ) ; Y representa un codón de mutación de E bB3 ; y Z es cualquier ácido nucleico y b es entre aproximadamente 0 y aproximadamente 250 (es decir, en la dirección 3 ' ) .

En otra modalidad, a o b es aproximadamente 250 o menos en la dirección 5' (si es a) o 3' (si es b) . En algunas modalidades, a o b está entre aproximadamente 0 y aproximadamente 250, a o b está entre aproximadamente 0 y aproximadamente 245, aproximadamente 0 y aproximadamente 240, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 230, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 220, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 210, entre aproximadamente 0 Y aproximadamente 200, entre aproximadamente 0 Y aproximadamente 190, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 180, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 170, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 160, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 150, entre aproximadamente 0 Y aproximadamente 140, entre aproximadamente 0 Y aproximadamente 130, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 120, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 110, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 90, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 80, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 70, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 60, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 50, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 45, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 40, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 35, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 30, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 25, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 20, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 15, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 10 o entre aproximadamente 0 y aproximadamente 5.

En otra modalidad, a o b es aproximadamente 35 o menos. En algunas modalidades, a o b es entre aproximadamente 0 y aproximadamente 35 , entre aproximadamente 0 y aproximadamente 34 , entre aproximadamente 0 y aproximadamente 33 , entre aproximadamente 0 y aproximadamente 32 , entre aproximadamente 0 y aproximadamente 31 , entre aproximadamente 0 y aproximadamente 30 , entre aproximadamente 0 y aproximadamente 29 , entre aproximadamente 0 y aproximadamente 28 , entre aproximadamente 0 y aproximadamente 27 , entre aproximadamente 0 y aproximadamente 26 , entre aproximadamente 0 y aproximadamente 25 , entre aproximadamente 0 y aproximadamente 24 , entre aproximadamente 0 y aproximadamente 23 , entre aproximadamente 0 y aproximadamente 22 , entre aproximadamente 0 y aproximadamente 21, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 20, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 19, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 18, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 17, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 16, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 15, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 14, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 13 , entre aproximadamente 0 y aproximadamente 12, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 11, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 10, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 9, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 8, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 7, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 6 , entre aproximadamente 0 y aproximadamente 5, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 4 , entre aproximadamente 0 y aproximadamente 3 o entre aproximadamente 0 y aproximadamente 2 .

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 60 de SEC ID N° : 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en AAA y AAG. Ésta corresponde a la mutación M60K asociada con el cáncer de colon.

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 104 de SEC ID N°: 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en ATG, CTT, CTC, CTA, CTG, TTA y TTG. Ésta corresponde a la mutación V104M o V104L asociada con cáncer de colon, gástrico, ovárico y de mama.

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 111 de SEC ID N° : 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en GT y TGC. Ésta corresponde a la mutación YlllC asociada con el cáncer de gástrico.

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 135 de SEC ID N° : 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en CTT, CTC, CTA, CTG, TTA y TTG. Ésta corresponde a la mutación R135L asociada con cáncer gástrico.

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 193 de SEC ID N°: 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en TAA, TAG y TGA. Ésta corresponde a la mutación R193* (en la que el * es un codón de parada) asociada con el cáncer de colon.

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 232 de SEC ID N°: 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en GTT, GTC, GTA y GTG. Ésta corresponde a la mutación A232V asociada con cáncer gástrico.

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 262 de SEC ID N° : 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en CAT, CAC, TCT, TCC, TCA, TCG, AGT y AGC. Ésta corresponde a la mutación P262H o P262S asociada con el cáncer de colon y/o gástrico.

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 284 de SEC ID N° : 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en CGT, CGC, CGA, CGG, AGA y AGG. Ésta corresponde a la mutación G284R asociada con el cáncer de colon o de pulmón (adenocarcinoma NSCLC) .

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 295 de SEC ID N° : 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en GCT, GCC, GCA y GCG. Ésta corresponde a la mutación V295A asociada con el cáncer de colon.

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 325 de SEC ID N° : 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en CGT, CGC, CGA, CGG, AGA y AGG. Ésta corresponde a la mutación G325R asociada con el cáncer de colon.

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 406 de SEC ID N° : 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en ACT, ACC, ACA, ACG, AAA y AAG. Ésta corresponde a la mutación M406K o M406T asociada con el cáncer gástrico.

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 453 de SEC ID N° : 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en CAT y CAC. Ésta corresponde a la mutación R453H asociada con el cáncer gástrico.

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 498 de SEC ID N° : 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en ATT, ATC y ATA. Ésta corresponde a la mutación K498I asociada con el cáncer gástrico.

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 809 de SEC ID N° : 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en CGT, CGC, CGA, CGG, AGA y AGG. Ésta corresponde a la mutación Q809R asociada con el cáncer gástrico.

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 846 de SEC ID N° : 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en ???, ATC y ATA. Ésta corresponde a la mutación S846I asociada con el cáncer de colón.

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 928 de SEC ID N° : 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en GGT, GGC, GGA y GGG. Ésta corresponde a la mutación E928G asociada con cáncer gástrico y cáncer de mama.

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 1089 de SEC ID N° : 2, en la que Y es TGG. Ésta corresponde a la mutación R1098W asociada con el cáncer gástrico.

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 1164 de SEC ID N°: 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en GCT, GCC, GCA y GCG. Ésta corresponde a la mutación T116A4 asociada con el cáncer de colón.

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 492 de SEC ID N° : 2, en la que Y se selecciona del grupo que consiste en CAT y CAC . Ésta corresponde a la mutación D492H asociada con el cáncer de colón (adenocarcinoma NSCLC) .

En otra modalidad, el polinucleótido híbrida con una secuencia de ácido nucleico de ErbB3 que codifica un aminoácido en la posición 714 de SEC ID N° : 2, en la que Y es ATG. Ésta corresponde a la mutación V714M asociada con el cáncer de pulmón (carcinoma escamoso NSCLC) .

Diagnóstico, pronóstico y tratamiento del cáncer La invención proporciona métodos para el diagnóstico o pronóstico del cáncer en un sujeto detectando la presencia en una muestra del sujeto de una o más mutaciones o variaciones somáticas asociadas con el cáncer como se describe en este documento. Las mutaciones o variaciones somáticas para su uso en los métodos de la invención incluyen variaciones en ErbB3, o los genes que codifican esta proteína. En algunas modalidades, la mutación somática es ADN genómico que codifica un gen (o su región reguladora) . En diversas modalidades, la mutación somática es una sustitución, una inserción o una deleción en el gen que codifica ErbB3. En una modalidad, la variación es una mutación que da como resultado una sustitución de aminoácidos en uno o más de M60, G69, M91, V104, Ylll, R135, R193, A232, P262, Q281, G284, V295, Q298, G325, T389, M406, V438, R453, D492, K498, V714, Q809, S846, E928, S1046, R1089, T1164 y D1194 en la secuencia de aminoácidos de ErbB3 (SEC ID N° : 2). En una modalidad, la sustitución es al menos una de M60K, G69R, M91I, V104L, V104M, Y111C, R135L, R193*, A232V, P262S, P262H, Q281H, G284R, V295A, Q298*, G325R, T389K, M406 , V438I, R453H, D492H, K498I, V714M, Q809R, S846I, E928G, S1046N, R1089W, T1164A y D1194E (*indica un codón de parada) en la secuencia de aminoácidos de ErbB3 (SEC ID N" : 2) . En una modalidad, la mutación indica la presencia de un cáncer de ErbB3 seleccionado del grupo que consiste en gástrico, de colon, esofágico, rectal, del ciego, colorrectal, adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , NSCLC (carcinoma escamoso), carcinoma renal, melanoma, ovárico, de pulmón de células grandes, cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) , hepatocelular (HCC) , cáncer de pulmón y cáncer pancreático.

En otra modalidad, la variación es una mutación que da como resultado una sustitución de aminoácidos en uno o más de M60, VI04, Ylll, R153, R193, A232, P262, V295, G325, M406, R453, D492, K498, V714, Q809, R1089 y T1164 en la secuencia de aminoácidos de ErbB3 (SEC ID N° : 2) . En otra modalidad, la sustitución es al menos una de M60K, V104M, V104L, Y111C, R153L, R193*, A232V, P262S, P262H, V295A, G325R, M406K, R453H, D492H, K498I, V714M, Q809R, R1089W y D1194E (*indica un codón de parada) en la secuencia de aminoácidos de ErbB3 (SEC ID N° : 2). En una modalidad, la mutación indica la presencia de un cáncer de ErbB3 seleccionado del grupo que consiste en gástrico, de colon, esofágico, rectal, de ciego, colorrectal, adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , NSCLC (carcinoma escamoso) , carcinoma renal, melanoma, ovarico, de pulmón de células grandes, cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) , hepatocelular (HCC) , cáncer de pulmón y cáncer pancreático.

En otra modalidad, la variación es una mutación que da como resultado una sustitución de aminoácidos en uno o más de V104, Ylll, R153, A232, P262, G284, T389, R453, K498 y Q809 en la secuencia de aminoácidos de ErbB3 (SEC ID N° : 2). En otra modalidad, la sustitución es al menos una de V104L, V104M, Y111C, R153L, A232V, P262S, P262H, G284R, T389K, R453H, K498I y Q809R en la secuencia de aminoácidos de ErbB3 (SEC ID N°: 2) . En una modalidad, la mutación de ErbB3 indica la presencia de cáncer gastrointestinal. En otra modalidad, un cáncer gastrointestinal es uno o más de cáncer gástrico, de colon, esofágico, rectal, de ciego y colorrectal.

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en M60. En otra modalidad, la sustitución es M60K. En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer de colon.

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en V104. En otra modalidad, la sustitución es V104L o V104M. En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer gástrico o cáncer de colon.

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en VIH. En otra modalidad, la sustitución es V111C. En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer gástrico.

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en R135. En otra modalidad, la sustitución es R135L. En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer gástrico.

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en R193. En otra modalidad, la sustitución es R193*. En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer de colon.

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en A232. En otra modalidad, la sustitución es A232V. En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer gástrico.

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en P262. En otra modalidad, la sustitución es P262S o P262H. En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer de colon o cáncer gástrico.

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en G284. En otra modalidad, la sustitución es G284R. En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer de pulmón (adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) ) o cáncer de colon.

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en V295. En otra modalidad, la sustitución es V295A. En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer de colon.

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en G325. En otra modalidad, la sustitución es G325R. En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer de colon.

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en M406. En otra modalidad, la sustitución es M406K. En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer gástrico .

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en R453 . En otra modalidad, la sustitución es R453H. En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer gástrico o cáncer de colon.

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en K498 . En otra modalidad, la sustitución es K498I . En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer gástrico .

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en D492 . En otra modalidad, la sustitución es D492H . En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer de pulmón (adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) ) .

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en V714 . En otra modalidad, la sustitución es V714M . En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer de pulmón (carcinoma escamoso de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) ) .

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en Q809. En otra modalidad, la sustitución es Q809R. En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer gástrico .

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en S846 . En otra modalidad, la sustitución es S846I . En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer de colon.

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en R1089. En otra modalidad, la sustitución es R1089W. En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer gástrico .

En una modalidad, la sustitución de ErbB3 es en T1164. En otra modalidad, la sustitución es T1164A. En otra modalidad, la mutación indica la presencia de cáncer de colon.

En diversas modalidades, la al menos una variación es una sustitución, inserción, truncamiento o deleción de aminoácidos en ErbB3. En algunas modalidades, la variación es una sustitución de aminoácidos. Puede usarse una cualquiera o más de estas variaciones en cualquiera de los métodos de detección, diagnóstico o pronóstico descritos posteriormente.

En una modalidad, la invención proporciona un método para detectar la presencia o ausencia de una mutación somática indicativa de cáncer en un sujeto, que comprende: (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un reactivo capaz de detectar la presencia o ausencia de una mutación somática en un gen de ErbB3 ; y (b) determinar la presencia o ausencia de la mutación, en el que la presencia de la mutación indica que el sujeto está aquejado de, o en riesgo de desarrollar, cáncer .

El reactivo para su uso en el método puede ser un oligonucleótido, una sonda de ADN, una sonda de ARN y una ribozima. En algunas modalidades, el reactivo está marcado. Los marcadores pueden incluir, por ejemplo, marcadores radioisotópicos , marcadores fluorescentes, marcadores bioluminiscentes o marcadores enzimáticos. Los radionúclidos que pueden actuar como marcadores detectables incluyen, por ejemplo, 1-131, 1-123, 1-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212 y Pd-109.

También se proporciona un método para detectar una mutación somática indicativa de cáncer en un sujeto, que comprende: determinar la presencia o ausencia de una mutación somática en un gen de ErbB3 en una muestra biológica de un sujeto, en el que la presencia de la mutación indica que el sujeto está aquejado de, o está en riesgo de desarrollar, cáncer. En diversas modalidades del método, la detección de la presencia de la o las mutaciones somáticas se lleva a cabo por un proceso seleccionado del grupo que consiste en secuenciación directa, hibridación de sondas específicas de mutación, extensión de cebadores específicos de mutación, amplificación específica de mutación, incorporación de nucleótidos específica de mutación, digestión con nucleasa 5', ensayo de balizas moleculares, ensayo de ligamiento de oligonucleótidos , análisis de tamaño y polimorfismo de conformación monocatenaria . En algunas modalidades, se amplifican ácidos nucleicos de la muestra antes de determinar la presencia de la o las mutaciones.

La invención proporciona además un método para diagnosticar o pronosticar el cáncer en un sujeto, que comprende: (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un reactivo capaz de detectar la presencia o ausencia de una mutación somática en un gen de ErbB3 ; y (b) determinar la presencia o ausencia de la mutación, en el que la presencia de la mutación indica que el sujeto está aquejado de, o en riesgo de desarrollar, cáncer.

La invención proporciona además un método para diagnosticar o pronosticar el cáncer en un sujeto, que comprende: determinar la presencia o ausencia de una mutación somática en un gen de ErbB3 en una muestra biológica de un sujeto, en el que la presencia de la variación genética indica que el sujeto está aquejado de, o está en riesgo de desarrollar, cáncer.

La invención también proporciona un método para diagnosticar o pronosticar el cáncer en un sujeto, que comprende: (a) obtener una muestra que contiene ácido nucleico del sujeto y (b) analizar la muestra para detectar la presencia de al menos una mutación somática en un gen de ErbB3 , en el que la presencia de la variación genética indica que el sujeto está aquejado de, o está en riesgo de desarrollar, cáncer.

En algunas modalidades, el método de diagnóstico o pronóstico comprende además someter al sujeto a uno o más ensayos de diagnóstico adicionales para cáncer, por ejemplo, explorar con respecto a uno o más marcadores adicionales, o someter al sujeto a procedimientos de captura de imágenes.

Se contempla además que cualquiera de los métodos anteriores puede comprender además tratar al sujeto para cáncer basándose en los resultados del método. En algunas modalidades, los métodos anteriores comprenden además detectar en la muestra la presencia de al menos una mutación somática. En una modalidad, la presencia de una primera mutación somática junto con la presencia de al menos una mutación somática adicional es indicativa de un riesgo aumentado de cáncer en comparación con un sujeto que tiene la primera mutación somática y carece de la presencia de la al menos una mutación somática adicional.

También se proporciona un método para identificar a un sujeto que tenga un riesgo aumentado de diagnóstico de cáncer, que comprende: (a) determinar la presencia o ausencia de una primera mutación somática en un gen de ErbB3 en una muestra biológica de un sujeto; y (b) determinar la presencia o ausencia de al menos una mutación somática adicional, en el que la presencia de la primera y al menos una mutación somática adicional indica que el sujeto tiene un riesgo aumentado de diagnóstico de cáncer en comparación con un sujeto que carece de la presencia de la primera y al menos una mutación somática adicional.

También se proporciona un método para ayudar al diagnóstico y/o pronóstico de un subfenotipo de cáncer en un sujeto, comprendiendo el método detectar en una muestra biológica derivada del sujeto la presencia de una mutación somática en un gen que codifica ErbB3. En una modalidad, la mutación somática da como resultado la sustitución de aminoácidos G284R en la secuencia de aminoácidos de ErbB3 (SEC ID N° : 2) y el subfenotipo de cáncer se caracteriza al menos en parte por la señalización independiente de ligando de HER de una célula que expresa el mutante de ErbB3 G284R. En otra modalidad, la mutación somática da como resultado la sustitución de aminoácidos Q809R en la secuencia de aminoácidos de ErbB3 (SEC ID N° : 2) y el subfenotipo de cáncer se caracteriza al menos en parte por señalización independiente de ligando de HER de una célula que expresa el mutante de ErbB3 Q809R.

La invención proporciona además un método para predecir la respuesta de un sujeto a un agente terapéutico de cáncer que se dirige a un receptor ErbB, que comprende detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto una mutación somática que da como resultado una variación de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de ErbB3 (SEC ID N° .· 2) , en el que la presencia de la mutación somática es indicativa de una respuesta a un agente terapéutico que se dirige a un receptor ErbB. En una modalidad, el agente terapéutico es un antagonista o agente de unión de ErbB, por ejemplo, un anticuerpo anti-ErbB.

Puede obtenerse una muestra biológica para su uso en cualquiera de los métodos descritos anteriormente usando ciertos métodos conocidos por los expertos en la materia.

Pueden obtenerse muestras biológicas de animales vertebrados y, en particular, mamíferos. En ciertas modalidades, una muestra biológica comprende una célula o tejido. Pueden detectarse variaciones en ácidos nucleicos diana (o polipéptidos codificados) de una muestra tisular o de otras muestras corporales tales como sangre, suero, orina, esputo, saliva, mucosa y te ido. Explorando las muestras corporales, puede conseguirse un diagnóstico temprano sencillo para enfermedades tales como cáncer. Además, el progreso de la terapia puede controlarse más fácilmente ensayando las muestras corporales con respecto a variaciones en ácidos nucleicos diana (o polipéptidos codificados) . En algunas modalidades, la muestra biológica se obtiene de un individuo que se sospecha que tiene cáncer.

Después de la determinación de que un sujeto, o muestra biológica obtenida del sujeto, comprende una mutación somática descrita en este documento, se contempla que puede administrarse una cantidad eficaz de un agente terapéutico de cáncer apropiado al sujeto para tratar el cáncer en el sujeto.

También se proporcionan métodos para ayudar en el diagnóstico del cáncer en un mamífero detectando la presencia de una o más variaciones en ácido nucleico que comprende una mutación somática en ErbB3 , de acuerdo con el método descrito anteriormente.

En otra modalidad, se proporciona un método para predecir si un sujeto con cáncer responderá a un agente terapéutico determinando si el sujeto comprende una mutación somática en ErbB3 , de acuerdo con el método descrito anteriormente.

También se proporcionan métodos para evaluar la predisposición de un sujeto a desarrollar cáncer detectando la presencia o ausencia en el sujeto de una mutación somática en ErbB3.

También se proporcionan métodos para subclasificar el cáncer en un mamífero, comprendiendo el método detectar la presencia de una mutación somática en ErbB3.

También se proporcionan métodos para identificar un agente terapéutico eficaz para tratar el cáncer en una subpoblación de pacientes, comprendiendo el método correlacionar la eficacia del agente con la presencia de una mutación somática en ErbB3.

Métodos adicionales proporcionan información útil para determinar etapas de intervención clínica apropiada, si es y según sea apropiado. Por lo tanto, en una modalidad de un método de la invención, el método comprende además una etapa de intervención clínica basada en los resultados de la evaluación de la presencia o ausencia de una mutación somática de ErbB3 asociada con el cáncer como se describe en este documento. Por ejemplo, la intervención apropiada puede implicar etapas profilácticas y de tratamiento, o ajuste o ajustes de cualquier etapa profiláctica o de tratamiento actual en ese momento basada en información genética obtenida por un método de la invención.

Como resultará evidente para un experto en la materia, en cualquier método descrito en este documento, aunque la detección de la presencia de una mutación somática indicaría de forma concluyente una característica de una enfermedad (por ejemplo, presencia o subtipo de una enfermedad) , la ausencia de detección de una mutación somática también sería informativa proporcionando la caracterización recíproca de la enfermedad.

Más métodos adicionales incluyen métodos de tratamiento del cáncer en un mamífero, que comprenden las etapas de obtener una muestra biológica del mamífero, examinar la muestra biológica con respecto a la presencia o ausencia de una mutación somática de ErbB3 como se describe en este documento, y tras la determinación de la presencia o ausencia de la mutación en la muestra tisular o celular, administrar una cantidad eficaz de un agente terapéutico apropiado al mamífero. Opcionalmente , los métodos comprenden administrar una cantidad eficaz de un agente terapéutico de cáncer dirigido al mamífero.

También se proporcionan métodos para tratar el cáncer en un sujeto en el que se sabe que está presente una mutación somática de ErbB3 , comprendiendo el método administrar al sujeto un agente terapéutico eficaz para tratar el cáncer.

También se proporcionan métodos para tratar a un sujeto que tiene cáncer, comprendiendo el método administrar al sujeto un agente terapéutico que se ha mostrado previamente que es eficaz para tratar el cáncer en al menos un estudio clínico en el que el agente se administró a al menos cinco sujetos humanos que tenían cada uno una mutación somática de ErbB3. En una modalidad, los al menos cinco sujetos tenían dos o más mutaciones somáticas diferentes en total para el grupo de al menos cinco sujetos. En una modalidad, los al menos cinco sujetos tenían las mismas mutaciones somáticas para el grupo completo de al menos cinco sujetos.

También se proporcionan métodos para tratar a un sujeto de cáncer que es de una subpoblación de pacientes de cáncer específica que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agente terapéutico que está aprobado como un agente terapéutico para la subpoblación, en el que la subpoblación se caracteriza al menos en parte por la asociación con una mutación somática de ErbB3.

En una modalidad, la subpoblación es de origen europeo. En una modalidad, la invención proporciona un método que comprende fabricar un agente terapéutico de cáncer, y envasar el agente con instrucciones para administrar el agente a un sujeto que tiene o se cree que tiene cáncer y que tiene una mutación somática de ErbB3.

También se proporcionan métodos para seleccionar un paciente que padece cáncer para el tratamiento con un agente terapéutico de cáncer que comprende detectar la presencia de una mutación somática de ErbB3.

Un agente terapéutico para el tratamiento de cáncer puede incorporarse en composiciones, que en algunas modalidades son adecuadas para su uso farmacéutico. Las composiciones típicamente comprenden el péptido o polipéptido, y un vehículo aceptable, por ejemplo uno que es farmacéuticamente aceptable. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes retardantes de la absorción e isotónicos, y similares, compatibles con la administración farmacéutica (Gennaro, Remington: The science and practice of pharmacy. Lippincott, Williams y Wilkins, Filadelfia, Pa. (2000)). Los ejemplos de los vehículos o diluyentes incluyen, a título enunciativo, agua, solución salina, soluciones de Finger, solución de dextrosa y albúmina de suero humano al 5 %. También pueden usarse liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijos. Excepto cuando un medio o agente convencional es incompatible con un compuesto activo, se contempla el uso de estas composiciones. También pueden incorporarse compuestos complementarios activos a las composiciones .

Un agente terapéutico de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional para el tratamiento del cáncer) puede administrarse por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar, intratecal e intranasal, y, si se desea para el tratamiento local, intralesional . Las infusiones parenterales incluyen, por ejemplo, administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Se contemplan en este documento diversos programas de dosificación incluyendo a título enunciativo administraciones individuales o múltiples a lo largo de diversos puntos temporales, administración de embolada e infusión por pulsos.

Pueden determinarse de forma empírica dosificaciones y programas eficaces para administrar agentes terapéuticos de cáncer, y realizar las determinaciones está dentro de la experiencia de la técnica. Pueden emplearse dosificaciones individuales o múltiples. Cuando se emplea administración in vivo de un agente terapéutico de cáncer, las cantidades de dosificación normal pueden variar de aproximadamente 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal del mamífero o más por día, preferentemente de aproximadamente 1 µg/kg/día a 10 mg/kg/día, dependiendo de la vía de administración. En la bibliografía se proporcionan instrucciones con respecto a dosificaciones y métodos particulares de suministro; véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212.

Un aspecto de la invención proporciona un método para tratar a un individuo que tiene un cáncer de HER3/ErbB3 identificado por una o más de las mutaciones somáticas descritas en este documento. En una modalidad, el método comprende la etapa de administrar al individuo una cantidad eficaz de un inhibidor de HER. En otra modalidad, el inhibidor de HER es un anticuerpo que se une con un receptor HER. En una modalidad preferida, el anticuerpo se une con un receptor ErbB3. En una modalidad, el anticuerpo de HER es un anticuerpo multiespecífico que comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente con HER3 y al menos un receptor HER adicional, tal como los descritos en Fuh et al. Documento WO10/108127 incorporado en este documento por referencia en su totalidad. En una modalidad, el cáncer de ErbB3 tratado por el inhibidor de HER comprende células que expresan HER3. En una modalidad, el cáncer tratado por el inhibidor de HER es gástrico, de colon, esofágico, rectal, de ciego, colorrectal, adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , NSCLC (carcinoma escamoso) , carcinoma renal, melanoma, ovárico, de pulmón de células grandes, cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) , hepatocelular (HCC) , cáncer de pulmón y cáncer pancreático.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para inhibir una actividad biológica de un receptor HER en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un inhibidor de HER. En una modalidad, el receptor HER es un receptor HER3 expresado por células cancerosas en el individuo. En otra modalidad, el inhibidor de HER es un anticuerpo de HER que comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente con al menos HER3.

Un aspecto de la invención proporciona un anticuerpo de HER para su uso como un medicamento. Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo de HER para su uso en la fabricación de un medicamento. El medicamento puede usarse, en una modalidad, para tratar un cáncer de ErbB3/HER3 identificado por una o más de las mutaciones somáticas descritas en este documento. En una modalidad, el medicamento es para inhibir una actividad biológica del receptor HER3. En una modalidad, el anticuerpo de HER comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente con HER3 o con HER3 y al menos un receptor HER adicional.

En otro aspecto, esta invención proporciona varios tipos diferentes de inhibidor de HER adecuado para los métodos de tratamiento. En una modalidad, el inhibidor de HER se selecciona de grupo que consiste en trastuzumab, un anticuerpo anti-ERBB2 que se une con el dominio IV de ERBB2, pertuzumab, un anticuerpo anti-ERBB2 que se une con el dominio II de ERBB2 y evita la dimerización; anti -ERBB3.1 , un anti-ERBB3 que bloquea la unión del ligando (se une con el dominio III); anti-ERRB3.2 , un anticuerpo anti-ERBB3 , que se une con el dominio III y bloquea la unión del ligando; MEHD7945A, un anticuerpo doble de ERBB3/EGFR que bloquea la unión del ligando (se une con el dominio III de EGFR y ERBB3) ; cetuximab, un anticuerpo de EGFR que bloquea la unión del ligando (se une con el dominio III de EGFR) ; Lapatinib, una molécula pequeña inhibidora doble de ERBB2/EGFR; Y GDC-094148, un inhibidor de PI3K.

En otro aspecto, esta invención proporciona un agente terapéutico antineoplásico para su uso en un método para tratar un cáncer de ErbB3 en un sujeto, comprendiendo el método (i) detectar en una muestra biológica del sujeto la presencia o ausencia de una mutación de aminoácidos en una secuencia de ácido nucleico que codifica ErbB3 , en el que la mutación da como resultado un cambio de aminoácidos en al menos una posición de la secuencia de aminoácidos de ErbB3 (como se describe en este documento), en el que la presencia de la mutación es indicativa de la presencia de cáncer en el sujeto del que se obtuvo la muestra; y (ii) si se detecta una ntutación en la secuencia de ácido nucleico, administrar al sujeto una cantidad eficaz del agente terapéutico antineoplásico .

Terapia de combinación Se contempla que pueden emplearse terapias de combinación en los métodos. La terapia de combinación puede incluir a título enunciativo, la administración de dos o más agentes terapéuticos de cáncer. La administración de los agentes terapéuticos en combinación típicamente se lleva a cabo durante un periodo de tiempo definido (habitualmente minutos, horas, días o semanas dependiendo de la combinación seleccionada). Se pretende que la terapia de combinación abarque la administración de estos agentes terapéuticos de una manera secuencial, es decir, en la que cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos, de una manera sustancialmente simultánea.

El agente terapéutico puede administrarse por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, puede administrarse un antagonista de ErbB en la combinación por inyección intravenosa mientras que puede administrarse un agente quimioterapéutico en la combinación por vía oral. Como alternativa, por ejemplo, ambos de los agentes terapéuticos pueden administrarse por vía oral, o ambos agentes terapéuticos pueden administrarse por inyección intravenosa, dependiendo de los agentes terapéuticos específicos. La secuencia en la que se administran los agentes terapéuticos también varía dependiendo de los agentes específicos.

En un aspecto, esta invención proporciona un método para tratar a un individuo que tiene un cáncer de HER3/ErbB3 identificado por una o más de las mutaciones somáticas descritas en este documento, en el que el método de tratamiento comprende administrar más de un inhibidor de ErbB. En una modalidad, el método que comprende administrar un inhibidor de ErbB3 , por ejemplo, un antagonista de ErbB3, y al menos un inhibidor de ErbB adicional, por ejemplo, un antagonista de EGFR, ErbB2 o ErbB4. En otra modalidad, el método comprende administrar un antagonista de ErbB3 y un antagonista de EGFR. En otra modalidad, el método comprende administrar un antagonista de ErbB3 y un antagonista de ErbB2. En otra modalidad más, el método comprende administrar un antagonista de ErbB3 y un antagonista de ErbB4. En algunas modalidades, al menos uno de los antagonistas de ErbB es un anticuerpo. En otra modalidad, cada uno de los antagonistas de ErbB es un anticuerpo.

Kits Para su uso en las aplicaciones descritas o sugeridas en este documento, se proporcionan también kits o artículos de fabricación. Los kits pueden comprender un medio vehículo que se compartimentaliza para recibir en confinamiento estrecho uno o más medios recipientes tales como frascos, tubos y similares, comprendiendo cada uno de los medios recipientes uno de los elementos separados para usar en el método. Por ejemplo, uno de los. medios recipientes puede comprender una sonda que está marcada o puede marcarse de forma detectable. La sonda puede ser un polinucleótido específico para un polinucleótido que comprende una mutación somática de ErbB3 asociada con cáncer como se describe en este documento. Cuando el kit utiliza hibridación de ácido nucleico para detectar un ácido nucleico diana, el kit también puede tener recipientes que contienen nucleótido o nucleótidos para amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana y/o un recipiente que comprende un medio indicador, tal como una proteína de unión a biotina, tal como avidina o estreptavidina, unida con una molécula indicadora, tal como un marcador enzimático, fluorescente o radioisotópico. En una modalidad, los kits de esta invención comprenden uno o más agentes de detección de cáncer de ErbB3 como se describen en este documento. En una modalidad preferida, el kit comprende uno o más agentes de detección de cáncer gastrointestinal de ErbB3, o uno o más agentes de detección de cáncer de pulmón de ErbB3, como se describen en este documento. En otra modalidad, el kit comprende además un agente terapéutico (por ejemplo, un inhibidor de ErbB3) , como se describe en este documento.

En otras modalidades, el kit puede comprender un agente marcado capaz de detectar un polipéptido que comprende una mutación somática de ErbB3 asociada con el cáncer como se describe en este documento. El agente puede ser un anticuerpo que se une con el polipéptido. El agente puede ser un péptido que se une con el polipéptido. El kit puede comprender, por ejemplo, un primer anticuerpo (por ejemplo, unido a un soporte sólido) que se une con un polipéptido que comprende una variante genética como se describe en este documento; y, opcionalmente , un segundo anticuerpo diferente que se une con el polipéptido o el primer anticuerpo y se conjuga con un marcador detectable.

Los kits típicamente comprenderán el recipiente descrito anteriormente y uno o más recipientes adicionales que comprenden materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones para su uso. Un marcador puede estar presente en el recipiente para indicar que la composición se usa para una terapia específica o aplicación no terapéutica, y también puede indicar instrucciones para su uso in vivo o in vitro, tal como los descritos anteriormente. Otros componentes opcionales en el kit incluyen uno o más amortiguadores (por ejemplo, amortiguador de bloqueo, amortiguador de lavado, amortiguador de sustrato, etc.), otros reactivos tales como sustrato (por ejemplo, cromógeno) que están alterados químicamente por un marcador enzimático, solución de recuperación de epítopos, muestras de control (controles positivos y/o negativos) , portaobjeto o portaobjetos de control, etc.

En otro aspecto, esta invención proporciona el uso de un agente de detección del cáncer de ErbB3 en la fabricación de un kit para detectar el cáncer en un sujeto. En una modalidad, la detección de un cáncer de ErbB3 comprende detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto la presencia o ausencia de una mutación de aminoácidos en una secuencia de ácido nucleico que codifica ErbB3 , en el que la mutación da como resultado un cambio de aminoácidos en al menos una posición de la secuencia de aminoácidos de ErbB3 (como se describe en este documento) , en el que la presencia de la mutación es indicativa de la presencia de cáncer en un sujeto del que se obtuvo la muestra .

Métodos de comercialización La invención en este documento también abarca un método para comercializar los métodos descritos de diagnóstico o pronóstico de cáncer que comprende anunciar, instruir y/o especificar a un público diana, el uso de los métodos descritos.

La comercialización generalmente es comunicación remunerada a través de un medio no personal en el que el patrocinador se identifica y el mensaje está controlado. La comercialización para fines de este documento incluye publicidad, relaciones públicas, publicidad indirecta, patrocinio, suscripción y similares. Este término también incluye anuncios públicos informativos patrocinados que aparezcan en cualquiera de los medios de comunicación impresos .

La comercialización del método de diagnóstico de este documento puede conseguirse por cualquier medio. Los ejemplos de medios de comercialización usados para comunicar estos mensajes incluyen televisión, radio, películas, revistas, periódicos, Internet, y vallas publicitarias, incluyendo anuncios, que son mensajes que aparecen en los medios de difusión.

El tipo de comercialización usada dependerá de muchos factores, por ejemplo, de la naturaleza de público objetivo para alcanzar, por ejemplo, hospitales, compañías aseguradoras, clínicas, doctores, enfermeros y pacientes, así como consideraciones de coste y las leyes y regulaciones jurisdiccionales relevantes que gobiernan la comercialización de medicamentos y diagnósticos. La comercialización puede ser individualizada o adaptada basándose en las caracterizaciones de los usuarios definidas por la interacción del servicio y/u otros datos tales como demografía de usuarios y localización geográfica.

Los siguientes ejemplos se ofrecen solamente para fines ilustrativos, y no se pretende que limiten el alcance de esta invención de ninguna manera.

Todas las referencias de patentes y bibliografía citadas en esta descripción se incorporan por la presente por referencia en su totalidad.

EJEMPLOS Ejemplo - Mutaciones de ERBB3 oncogénicas en cánceres humanos Dada la importancia de ERBB3 en cánceres humanos, los inventores estudiaron sistemáticamente los cánceres humanos e identificaron mutaciones somáticas recurrentes y también muestran que esas mutaciones son transformantes. Además, los inventores evaluaron los productos terapéuticos dirigidos en modelos animales conducidos por mutante de ERBB3 de cáncer y muestran que una mayoría de ellos son eficaces en el bloqueo de la oncogénesis conducida por mutante de ERBB3.

Materiales y métodos ADN tumoral, mutación y amplificación genómica Se obtuvieron muestras de tumor humano primario con consentimiento apropiado de fuentes comerciales (Figura 1) . Las muestras tisulares humanas usadas en el estudio se desidentificaron (doble codificación) antes de su uso y, por lo tanto, el estudio que usa estas muestras no se considera investigación de sujeto humano según las regulaciones del Departamento de Estados Unidos de Servicios Humanos y de Salud y las directrices relacionadas (45 CFR Parte 46) . Se confirmó que el contenido tumoral en todos los tumores usados era de >70 % por revisión de patología. Se extrajo ADN tumoral usando el kit Qiagen Tissue easy (Qiagen, CA) . Todos los exones codificantes de ERBB3 se amplificaron usando cebadores enumerados en la Tabla 1 posterior (Applied Biosystems, CA) . Los productos de PCR se generaron usando dos pares de cebadores, un par externo y un par interno para aumentar la especificidad (Tabla 1) , usando condiciones de PCR convencionales se secuenciaron usando un secuenciador 3730x1 ABI . Los datos de secuenciación se analizaron con respecto a la presencia de variantes no presentes en la base de datos dbSNP usando Mutation Surveyor ( Softgenet ics , PA) y programas de alineamiento de secuencias automáticos adicionales. Las variantes potenciales identificadas se confirmaron por secuenciación de ADN o análisis de espectrometría de masas (Sequenom, CA) del ADN tumoral original seguido de confirmación de su ausencia en el ADN normal coincidente adyacente por un proceso similar aplicado al ADN tumoral. Se proporcionan secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de ERBB3 normales representativas en las Figuras 2 y 3, respectivamente.

Tabla 1 - Cebadores usados para PCR y secuenciación Fl = TCACTGGCCCCAGTT ; Rl = GCAGGAAGACATGGACT; R2 CTCTTCCTCTAACCCG La Tabla 1 describe las secuencias de "Cebador Externo 5p" como SEC ID N° : 3 a 32, las secuencias de "Cebador Externo 3p" como SEC ID N° : 33 a 62, las secuencias de "Cebador Interno 5p" como SEC ID N° : 63 a 92, las secuencias de "Cebador Interno 3p" como SEC ID N° : 93 a 122, y las secuencias "Fl" , "Rl" y "R2" como SEC ID N° : 123 a 125, todas respectivamente, en orden de aparición.

Líneas celulares La línea celular pro-B de ratón dependiente de IL-3 BaF3 y MCF10A, una célula epitelial mamaria, se obtuvo de la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA) . Las células BaF3 se mantuvieron en RP I 1640 complementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v) (Thermo Fisher Scientific, IL) , L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 mg/ml (RP I completo) e IL-3 de ratón 2 ng/mL. Las células MCF10A se mantuvieron en DMEM: F12 complementado con suero de caballo al 5 % (v/v), hidrocortisona 0.5 Mg/ml, toxina del cólera 100 ng/ml, insulina 10 µg/ml , EGF 20 ng/ml, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 mg/ml.

Plás idos y anticuerpos Se usó un vector retroviral, pRetro-IRES-GFP (Jaiswal, B. S. et al. Cáncer Cell 16, 463 a 474 (2009)), para expresar de forma estable ERBB3 marcado con FLAG C-terminal de tipo silvestre y mutantes . Los mutantes de ERBB3 usados en el estudio se generaron usando el Kit de Mutagénesis Dirigida Quick Change (Stratagene, CA) . Se expresaron construcciones retrovirales que expresaban ERBB2 de longitud completa con una secuencia señal de herpes simple de marcador N-terminal de glucoproteína D (gD) o EGFR fusionado con secuencia codificante de gD después de retirar la secuencia señal de secreción nativa, como se ha realizado con ERBB2 previamente, usando el vector retroviral pLPCX (Clontech, CA) (Schaefer et al. J Biol Chem 274, 859 a 866 (1999)) .

Se usaron en el estudio anticuerpos que reconocían pERBB3 (Y1289), pEGFR (Y1068), pERBB2 (T1221/2), pAKT (Ser473), pMAPK, MAPK total y AKT (Cell Signaling Technology, MA) , gD (Genentech Inc., CA) , ß-ACTINA y FLAG M2 (Sigma Life Science, MO) y anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Pierce Biotechnology, IL) para transferencias de western.

Generación de líneas celulares estables Se transfectaron construcciones retrovirales que codificaban ERBB3-FLAG y gD-EGFR o gD ERBB2 mutantes o de tipo silvestre en células anfotéricas Pheonix usando Fugene 6 (Roche, Basal) . El virus resultante se transdució después en células BaF3 o MCF10A. El 10 % superior de las células infectadas por vector vacío, tipo silvestre o retrovirus mutante para ERBB3 basándose en la expresión de GFP conducido por IRES retroviral fue clasificado de forma estéril por citometría de flujo y se caracterizó con respecto a expresión de proteínas por Western Blot . Para generar líneas estables que expresan mutantes de ERBB3 junto con EGFR o ERBB2 , se infectaron células que expresaban mutantes o tipo silvestre de ERBB3 clasificados por FACS con virus de EGFR o ERBB2 de tipo silvestre. Después se seleccionaron células infectadas con puromicina 1 g/ml durante 7 días. Después se usaron grupos de estas células en estudios adicionales.

Ensayo de supervivencia y proliferación Se lavaron células BaF3 que expresaban de forma estable el ERBB3 de tipo silvestre y mutante solo o junto con EGFR o ERBB2, dos veces en PBS y se sembraron en placas en 3 x 96 pocilios en repeticiones de ocho en medio RPMI completo sin IL3. Según fue necesario las células se trataron después con diferente concentración de NRG1 y anticuerpo anti-NRGl o diferentes anticuerpos de ERBB, tirosina cinasa o moléculas pequeñas inhibidoras de PI3K para ensayar los efectos en la supervivencia o proliferación celular, cuando fue relevante como se representa en las figuras. Las células viables a las 0 h y 120 h se determinaron usando el kit de viabilidad celular de luminiscencia Cell Titer-Glo (Promega Corp., WI) y el lector de placas de luminiscencia Synergy 2 (Biotek Instrument, CA) . Todos los valores de números de células se normalizaron frente a valores de 0 h. Para evaluar la proliferación de MCF10A que expresaban de forma estable ERBB3-WT o mutantes se lavaron dos veces en PBS y se sembraron 5000 células en placas de 96 pocilios en repeticiones de ocho en medio sin suero por triplicado y se permitió que proliferaran durante 5 días. Los números de células se midieron el día 0 y el día 5 usando el kit de viabilidad celular de luminiscencia. Los datos presentados muestran la medida ± ETM de la supervivencia el día 5 en relación con el día 0. Se determinó la significación media y estadística usando software GraphPad (GraphPad, CA) .

Inmunoprecipitación y Western Blot Para evaluar el nivel del complejo de receptor ERBB3-ERBB2 heterodimérico expresado en la superficie celular, los inventores entrecruzaron las proteínas de superficie celular usando entrecruzadores impermeables a membrana bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3) (Thermo scientific, IL) , antes de la inmunoprecipitación . Se lavaron células BaF3 con o sin tratamiento de ligando (NRG1) dos veces en HEPES 50 mM pH 7.5 frío y NaCl 150 mM, se trataron con BS3 1 mM en amortiguador de HEPES durante 60 min a 4 °C. El entrecruzamiento se detuvo lavando las células dos veces con Tris-Cl 50 mM y NaCl 150 mM, pH 7.5. Las células se lisaron después en amortiguador de lisis I (Tris HC1 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Tritón X-100 1 %) . Para inmunoprecipitación, se incubaron lisados clarificados durante una noche a 4 °C con perlas acopladas a anticuerpo anti-FLAG-M2 (Sigma, MO) . Las perlas de FLAG se lavaron tres veces usando el amortiguador de lisis I. Las proteínas inmunoprecipitadas que permanecían en las perlas se hirvieron en amortiguador de carga de SDS-PAGE, se resolvieron en un SDS-PAGE a 4 a 12 % (Invitrogen, CA) y se transformaron en una membrana de nitrocelulosa. Se detectaron proteínas inmunoprecipitadas o proteínas de lisados usando anticuerpo secundario conjugado con HRP primario apropiado y sustrato de detección de quimioluminiscencia Super signal West Dura (Thermo Fisher Scientific, IL) .

Para estudios de Western Blot se privó de suero a células MCF10A y éstas se cultivaron en ausencia de EGF o NRG1. De forma similar, el estado de los receptores de ERBB y componentes de señalización dirección 3' se evaluó en células BaF3 cultivadas en ausencia de IL-3.

Ensayo de ligamiento de proximidad Se cultivaron hasta subconfluencia líneas celulares de BaF3 que expresaban de forma estable el tipo silvestre o los mutantes de ERBB3 , P262H, G284R y Q809R con ERBB2. Las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron durante una noche en medio RPMI sin IL3. Se realizaron preparaciones de Cytospin de estas células, se secaron al aire y se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 15 min y después se permeabilizaron con Tritón 0.05 % en PBS durante 10 min. Después de bloquear durante 60 min con solución de bloqueo de Duolink (Soderberg et al. Nat Methods 3, 995 a 1000 (2006) ) , las células se incubaron con anticuerpos anti-FLAG (conejo) y anti-gD (ratón) o anti -ERBB3 (ratón) (Labvision, CA) y ant -ERBB2 (conejo) (Dako, Dinamarca) durante 1 h a temperatura ambiente. Se realizó tinción de Duolink usando sondas Duolink anti-conejo más y anti-ratón menos PLA y reactivos de detección de Duolink II (Uppsala, Suecia) de rojo lejano siguiendo los protocolos del fabricante (Soderberg et al. Nat Methods 3, 995 a 1000 (2006) ) . La adquisición de imágenes se realizó usando el miscroscopio Axioplan2, Zeiss y filtro apropiado para DAPI y Texas red con un objetivo de 63X. Para la medición cuantitativa de la señal, se analizaron archivos de imágenes tiff con el software de herramienta de imágenes Duolink después de aplicar el umbral definido por el usuario.

Ensayo de formación de colonias Se mezclaron células BaF3 que expresaban de forma estable EGFR (2 x 105) o ERBB2 (50,000) junto con ERBB3 de tipo silvestre o imitantes, con 2 mi de metilcelulosa sin IL3 (STEMCELL Technologies, Canadá) y se sembraron en placas de 6 pocilios y, cuando se indicó, las células se trataron con diferentes anticuerpos de ERBB o tirosina cinasa o moléculas pequeñas inhibidoras de PI3K antes de sembrar en placas. Las placas se incubaron después a 37 °C durante 2 semanas. Para la formación de colonias de MCF10A, se mezclaron 20.000 células MCF10A que expresaban de forma estable ERBB3 -WT o mutantes solos o en combinación con EGFR o ERBB2 con agar 0,35 % en DMEM: F12 sin suero, EGF y NRG1 y se sembraron en placas de agar de base 0,5 %. Las placas se incubaron después a 37 °C durante 3 semanas. La presencia de colonias se evaluó usando una cámara de recuento de Gel (Oxford Optronix Ltd, Reino Unido) . El número de colonias en cada placa se cuantificó usando software de recuento de Gel (Oxford Optronix Ltd, Reino Unido) .

Morfogénesis tridimensional o ensayo de formación de acinos Se sembraron células MCF10A que expresaban de forma estable ERBB3 de tipo silvestre o mutantes solos o en combinación con EGFR o ERBB2 en Matrigel con factor de crecimiento reducido (BD Biosciences, CA) en portaobjetos de cámara de 8 pocilios siguiendo el protocolo descrito previamente (Debnath et al. Methods 30, 256 a 268 (2003)). Se fotografió la morfogénesis de acinos el día 12 a 15 usando un microscopio zeiss usando un objetivo lOx.

Se realizó la extracción completa, fijación e inmunotinción de cultivos tridimensionales del día 13 como se ha descrito previamente (Lee et al. Nat Methods 4, 359 a 365 (2007) ) . Brevemente, después de la extracción, los acinos se fijaron con metanol-acetona (1:1) y se tiñeron con integrina anti-oc6 de rata (Millipore, Billerica MA) , anti Ki67 de conejo (Vector Labs, Burlingame, CA) y DAPI . Se usaron en el estudio los anticuerpos secundarios Alexa Fluor 647 de cabra anti-rata (Invitrogen, CA) y Alexa Fluor 532 de cabra anticonejo (Invitrogen, CA) . Se realizó captura de imágenes confocal con un objetivo de inmersión en aceite 40x, usando un microscopio confocal Leica SPE.

Estudio de migración de transwell Se sembraron células MCF-10A que expresaban de forma estable vector vacío, ERBB3 de tipo silvestre o diversos mutantes de ERBB3 (50,000 células) en cámaras de migración de transwell de 8 µ?t? (Corning, n° 3422) . Se permitió que las células migraran durante 20 h en medio de ensayo sin suero. Las células en la parte superior de la membrana se rasparon usando un hisopo de algodón y las células migradas se fijaron en paraformaldehído al 3.7 % (v/v) y se tiñeron con Cristal Violeta 0.1 %. De cada transwell, se tomaron imágenes de cinco campos diferentes bajo un microscopio de contraste de fases a aumento 20X y se contó el número de células migradas . Los números obtenidos también se verificaron tiñendo los núcleos por colorante de Hoechst . El factor de aumento en la migración observada en células que expresaban mutante de ERBB3 en comparación con las células que expresaban ERBB3 de tipo silvestre se calculó y se realizó ensayo de t de Student para ensayar con respecto a la significación con software prism pad.

Estudios animales Se implantaron células BaF3 (2 x 106) que expresaban el ERBB3 de tipo silvestre o mutantes junto con ERBB2 en ratones desnudos Balb/C de 8 a 12 semanas de edad por inyección en la vena de la cola. Para el estudio de eficacia de los anticuerpos in vivo, los ratones se trataron con anti-ambrosía 40 mg/kg QW (control) , trastuzumab 10 mg/kg QW, anti-ERBB3.1 50 mg/kg QW y anti-ERBB3.2 100 mg/kg QW comenzando el día 4 después del implante celular. Se inyectó un total de 13 animales por tratamiento. De éstos se siguió a 10 ratones con respecto a supervivencia y 3 se usaron para necropsia el día 20 para evaluar la progresión de enfermedad por análisis histológico de la médula ósea, bazo e hígado. También se analizó la suspensión de una única célula de médula ósea y bazo obtenida de estos animales con respecto a la presencia y proporción de células BaF3 positivas para GFP por análisis de FACS. Cuando fue posible se diseccionó a animales muertos o moribundos en el estudio de supervivencia para confirmar la causa de la muerte. También se realizaron análisis morfológicos e histológicos de bazo, hígado y médula ósea en estos animales. Se fijaron médula ósea, bazo e hígado en formalina amortiguada neutra al 10 %, después se procesó en un procesador de tejido automático (TissueTek, CA) y se incluyó en parafina. Se tiñeron secciones de cuatro micrómetros de grosor con H y E (Sigma, MO) y se analizaron histológicamente con respecto a la presencia de células tumorales de infiltración. Se tomaron fotografías de histología en un microscopio compuesto Nikon 80i con una cámara Nikon DS-R. Todos los estudios animales se realizaron según los protocolos aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales Institucional de Genentech (IACUC) .

Análisis estadísticos Las barras de error cuando se presentan representan la media ± ETM. Se usó el ensayo de t de Student (de dos colas) para análisis estadísticos para comparar grupos de tratamiento usando GraphPad Prism 5.00 (GraphPad Software, San Diego, CA) . Un P-valor <0,05 se consideró estadísticamente significativo (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 y ****p<0.0001) . Para el método de Kaplan-Meier de análisis de supervivencia, se usó estadística de rangos logarítmicos para ensayar con respecto a diferencia de supervivencia.

Resultados Identificación de mutaciones ERBB3 Al realizar secuenciación de exorna completo de setenta tumores de colon primario junto con sus muestras normales coincidentes, los inventores identificaron mutaciones somáticas en ERBB3 (Seshagiri, S. et al. Comprehensive analysis of colon cáncer genomes identifies recurrent mutations and R-spondin fusions. [Manuscrito en Preparación 2011) ) . Para entender adicionalmente la prevalencia de la mutación de ERBB3 en tumores sólidos humanos, los inventores secuenciaron exones codificantes de ERBB3 en un total de 512 muestras de tumor primario humano consistente en 102 (70 muestras de la exploración de exorna completo (Seshagiri, S. et al. Comprehensive analysis of colon cáncer genomes identifies recurrent mutations and R-spondin fusions. (Manuscrito en Preparación 2011) ) y 32 muestras de colon adicionales) colorrectales , 92 gástricas, 74 de adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) (adeno) , 67 de NSCLC (carcinoma escamoso) , 45 de carcinoma renal, 37 de melanoma, 32 ováricas, 16 de células grandes de pulmón, 15 esofágicas, 12 de cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) , 11 hepatocelulares (HCC) y 9 de otros cánceres [4 de cáncer de pulmón (otros) , 2 de ciego, 1 de pulmón (neuroendocrino) , 1 pancreático y 1 de cáncer rectal] (Figura 1) . Los inventores descubrieron mutaciones de ERBB3 que alteraban proteínas en el 12 % de cánceres gástricos (11/92), 11 % de colon (11/102), 1 % de NSCLC (adeno; 1/74) y 1 % de NSCLC (escamoso; 1/67) (Figuras 4A-4F) . Aunque estudios previos indican mutaciones de ERBB3 que albergan proteínas esporádicas en NSCLC (escamoso; 0.5 % [3/188]), glioblastoma (1 % [1/91] ) , cáncer de mama positivo para hormonas (5 % [3/65]), colon (1 % [1/100]), cáncer ovárico (1 % [3/339] ) , y cáncer de cabeza y cuello (1 % [1/74] ) , ninguno han indicado mutaciones recurrentes ni han evaluado la relevancia funcional de estas mutaciones en el cáncer (Figuras 4A-4F y Tablas 2 y 3) . Los inventores confirmaron que todas las mutaciones presentadas en este estudio son somáticas ensayando con respecto a su presencia en el ADN tumoral original y ausencia en el tejido normal adyacente coincidente mediante secuenciación adicional y/o análisis de espectrometría de masas. Además de las mutaciones de sentido erróneo, los inventores también descubrieron tres mutaciones sinónimas (que no alteran la proteína) , una en cada uno de cánceres de colon, gástrico y ovárico. Además, en tumores de colon, usando datos de secuenciación de AR (Seshagiri, S. et al. Comprehensive analysis of colon cáncer genomes identifies recurrent mutations and R-spondin fusions. (Manuscrito en Preparación 2011) ) , los inventores confirmaron la expresión de los mutantes de ERBB3 y la expresión de ERBB2 en estas muestras (Figuras 5A-5B) .

Una mayoría de las mutaciones se agruparon principalmente en la región ECD aunque algunas se mapearon en el dominio cinasa y la cola intracelular de ERBB3. Resulta interesante que entre los mutantes de ECD había cuatro posiciones, V104, A232, P262 y G284 que contenían sustituciones recurrentes entre múltiples muestras, lo que indica que éstos son puntos calientes mutacionales . Se había indicado previamente que dos de las cuatro posiciones de puntos calientes de ECD identificadas en el análisis de los inventores, V104 y G284, estaban mutadas en una muestra ovárica y una de pulmón (adenocarcinoma) respectivamente (Greenman et al. Nature 446, 153 a 158 (2007); Ding et al. Nature 455, 1069 a 1075 (2008) ) . Además, la mayoría de las sustituciones de sentido erróneo recurrentes en cada una de las posiciones de puntos calientes dio como resultado el mismo cambio de aminoácidos indicativo de un papel conductor potencial de estas mutaciones. Los inventores también identificaron una mutación de punto caliente, S846I, en el dominio cinasa cuando combinaron sus datos con una mutación de ERBB3 individual previamente publicada en cáncer de colon (Jeong et al. International Journal of Cáncer 119, 2986 a 2987 (2006)) .

Resulta interesante observar que una mayoría de los restos mutados identificados se conversaron entre ortólogos de ERBB3 (mostrados en la Figura 6, así como la secuencia de C. lupus (XP_538226.2) de SEC ID N° : ) y algunos de los restos estaban conservados entre miembros de la familia ERBB, lo que sugiere adicionalmente que estas mutaciones probablemente tengan un efecto funcional.

Tabla 2 - Mutaciones somáticas de ERBB3 + 5 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + *Posiciones genómicas basadas en la versión NCBI R37 WES = secuenciación de exorna completo Tabla 3 - Mutaciones de ERBB3 publicadas en cánceres humanos Diagnóstico de # de # de % de Mutaciones (cambio Tejido mutantes muestras frecuencia de aminoácido) Referencia Q281H, T389R, Cáncer de Mama (HR+) 65 E928G Nature (2010) 466: 869 G69R, G284R, NSCLC (Adeno) 0298* Nature (2008) 455: 1069 Glioblastoma 91 10 S1046N Nature (2008) 455: 1061 V104M, V438I, Nature (2007) 446: 153 [23 Ovario 339 88 D1149E samples] ; (23 Nature+316) Int J of Ca (2006) 119: 5 colon 100 00 S846I 2986 Cáncer de cabe Science (2011) Epub date Cuello 74 35 M90I 2011/07/30 Para entender adicionalmente las mutaciones los inventores las mapearon en estructuras cristalinas de ERBB3 ECD7 y dominio cinasa publicadas (Jura et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 21608 a 21613 (2009); Shi et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 107, 7692 a 7697 (2010)) (Figura 7 y Figura 8). Resulta interesante que las mutaciones de puntos calientes en V104, A232 y G284 se agrupan en la interfase de los dominios I/II. El agrupamiento de estos tres sitios en la interfase entre los dominios II y III sugiere que pueden actuar por un mecanismo común. El dominio II comprende varios módulos ricos en cisteína dispuestos como vértebras. Se ha asignado a cambios pequeños en la relación entre estas características semi- independientes importancia funcional entre miembros de la familia (Alvarado et al. Nature 461, 287 a 291 (2009). Las mutaciones V104/A232/G284 pueden desplazar uno o más de estos módulos y provocar un fenotipo alterado. La mutación en P262 está en la base del dominio II, cerca de Q271 implicado en la interacción de dominio II/IV requerida para la conformación cerrada, ligada. Las mutaciones de dominio cinasa en los restos 809 y 846 son homologas de posiciones próximas a la ruta tomada por la cola C-terminal en la estructura de cinasa de EGFR, un segmento al que se le ha asignado un papel en la endocitosis. Aparecen sitios de otras mutaciones en la Figura 8.

Los mutantes de ERBB3 promueven la proliferación independiente del ligando de células epiteliales mamarias MCF10A Las células epiteliales mamarias MCF-10A requieren EGF para proliferación (Soule, H. D. et al. Cáncer Res 50, 6075 a 6086 (1990); Petersen et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89, 9064 a 9068 (1992)). Los oncogenes cuando se expresan en células MCF10A, pueden hacerlas independientes de EGF (Debnath et al. The Journal of cell biology 163, 315 a 326 (2003); Muthus amy et al. Nat Cell Biol 3, 785 a 792 (2001)). Para entender el potencial oncogénico de las mutaciones de ERBB3 los inventores ensayaron la capacidad de un conjunto selecto de los mutantes de ERBB3 para apoyar la transformación y proliferación celular. Los inventores ensayaron seis (V104M, A232V, P262H, P262S, G284R y T389K) mutantes de ERBB3 ECD incluyendo los cuatro mutantes de puntos calientes de ECD y dos (V714M y Q809R) mutantes de dominio de cinasa de ERBB3 con respecto a sus efectos en la proliferación celular, señalización, formación acinar, crecimiento independiente de anclaje y migración expresándolos de forma estable en células MCF10A. Dado que los miembros de la familia de ERBB actúan como heterodímeros en la señalización y transformación celular, los inventores también ensayaron los efectos funcionales de mutantes de ERBB3 coexpresándolos con EGFR o ERBB2 de tipo silvestre (WT) . Los inventores descubrieron que los mutantes de ERBB3 cuando se expresan solos en MCF10A, en ausencia de ligando de ERBB3 exógeno NRG1 o EGF, mostraron muy poco aumento de la proliferación independiente de ligando (Figura 9) , formación de colonias (Figuras 10A-10C) o elevación en marcadores del estado de activación de señalización como pERBB3, pAKT y pERK (Figura 11A) en comparación con ERBB3-WT. Sin embargo, la expresión de mutantes de ERBB3 en combinación con EGFR o ERBB2 mostró un aumento significativo en la proliferación y formación de colonias en comparación con ERBB3-WT (Figura 9 y Figuras 10A-10C) . Además, la mayoría de los mutantes de ERBB3 en combinación con EGFR o ERBB2 condujeron a pERBB3 , pAKT y pERK elevados (Figura 11B y 11C) .

Las células MCF10A forman esferoides de células acinares cuando se cultivan en cultivos de gel en membrana basal tridimensional (3D) reconstituidos, en presencia de EGF (Muthuswamy et al. Nat Cell Biol 3, 785 a 792 (2001); Muthuswamy Breast Cáncer Research 13, 103 (2011)). Sin embargo, la expresión de algunos oncogenes puede hacerlos independientes de EGF y también dar como resultado estructuras multiacinares complejas Debnath et al. The Journal of cell biology 163, 315 a 326 (2003); Brummer et al. Journal of Biological Chemistry 281, 626 a 637 (2005); Bundy et al. Molecular Cáncer 4, 43 (2005)). En estudios de cultivo 3D sin suero EGF y NRG1, la expresión ectópica de imitantes de ERBB3 en combinación con EGFR o ERBB2 en células MCF10A promovió estructuras acinares grandes, en comparación con células MCF10A que coexpresan ERBB3-WT con EGFR o ERBB2 (Figura 12A) . La tinción con respecto a Ki67, un marcador para proliferación, en acinos derivados de células MCF10 que coexpresan ERBB2/mutante de ERBB3 mostró proliferación aumentada en todos los mutantes ensayados (Figura 12B) . Además, las mismas células MCF10A que expresaban un subcon unto del ERBB3 mutante/ERBB2 también mostraron migración aumentada (Figura 12C y Figura 13A) en comparación con células ERBB3 -WT/ERBB2. Estos resultados tomados juntos confirman la naturaleza oncogénica de los mutantes de ERBB3. Los mutantes de ERBB3 promueven el crecimiento independiente de anclaje de células epiteliales colónicas Las IMCE son células epiteliales colónicas de ratón inmortalizadas que pueden transformarse por expresión de Ras oncogénico (D'Abaco et al. (1996). Mol Cell Biol 16, 884 a 891; Whitehead et al. (1993). PNAS 90, 587 a 591). Los inventores usaron células IMCE y ensayaron mutantes de ERBB3 con respecto a crecimiento independiente de anclaje, señalización y tumorigénesis in vivo expresando de forma estable los mutantes de ERBB3 solos o en combinación con ERBB2. Como se muestra en las Figuras 13Ba-13Bb, los inventores descubrieron que el ERBB3- T o los mutantes por sí solos, cuando se expresaron no promovieron el crecimiento independiente de anclaje. Sin embargo, una mayoría de los mutantes de ERBB3, a diferencia de ERBB3-WT, cuando se coexpresaron con ERBB2 promovieron el crecimiento independiente de anclaje (Figuras 13Ba-13Bb) . De forma coherente con el crecimiento independiente de anclaje observado, una mayoría de las células IMCE que expresaban mutantes de ERBB3 junto con ERBB2 mostraron pERBB3 y/o pERBB2 elevados y un aumento conjunto en pAKT y/o pERK (Figura 13Bc-13Bd) . Aunque algunos de los mutantes de ERBB3 por sí mismos mostraron mutantes de ERBB3 elevados, no promovieron el crecimiento independiente de anclaje o la señalización dirección 3'. Para confirmar adicionalmente esa actividad oncogénica de los mutantes de ERBB3 , los inventores ensayaron varias células que expresaban mutantes de ECD de puntos calientes con respecto a su capacidad para promover el crecimiento tumoral in vivo. De forma coherente con su capacidad para soportar el crecimiento independiente de anclaje y la señalización, las células IMCE que coexpresaban ERBB3 V104M, P262H o G284R, a diferencia de WT, junto con ERBB2 promovieron el crecimiento tumoral (Figura 13B (e) ) . Los mutantes de ERBB3 promueven la supervivencia y transformación de células independiente de IL3 Para confirmar adicionalmente la relevancia oncogénica de las mutaciones de ERBB3 los inventores ensayaron los mutantes de ERBB3 con respecto a sus efectos en la señalización, supervivencia celular y crecimiento independiente de anclaje expresándolos de forma estable solos o en combinación con EGFR o ERBB2 en células BaF3 dependientes de IL-3. BaF3 es una línea celular pro-B dependiente de interleucina (IL) -3 que se ha usado ampliamente para estudiar la actividad oncogénica de genes y el desarrollo de fármacos que se dirigen a conductores oncogénicos (Lee et al. (2006). PLoS medicine 3, e485; armuth et al. (2007) Current opinión in oncology 19, 55 a 60) . Aunque los mutantes de ERBB3 promovieron poca o ninguna supervivencia independiente de IL-3 de células BaF3 cuando se expresaron solos, fueron mucho más eficaces que WT-ERBB3, cuando se coexpresaron en combinación con EGFR-WT o ERBB2- T (Figura 14 y Figura 15A,15B). Los mutantes de ERBB3 , co-expresados con ERBB2 , fueron -10 a 50 veces más eficaces en la promoción de la supervivencia independiente de IL-3 que cuando se coexpresaron con EGFR (Figura 14) . Esto es coherente con estudios previos que muestran que los heterodímeros de ERBB3-ERBB2, formados después de la activación, están entre los activadores más potentes de la señalización celular (Pinkas-Kramarski et al. The EMBO journal 15, 2452 a 2467 (1996); Tzahar et al. Molecular and cellular biology 16, 5276 a 5287 (1996); Holbro et al. PNAS 100, 8933 a 8938 (2003)). Resulta interesante que el mutante de dominio cinasa Q809R, en combinación con ERBB2 o EGFR fue el más eficaz en la promoción de la supervivencia independiente de IL-3 de células BaF3 , que cualquiera de los mutantes de ECD ensayados. De forma coherente con la actividad de supervivencia celular independiente de IL-3 observada, una mayoría de los mutantes de ERBB3 mostraron fosforilación aumentada, una identificación de receptores ERBB activos, cuando se expresaron solos o en combinación con ERBB2 o EGFR (Figura 15A-15C) . Además, los mutantes de ERBB3 coexpresados con ERBB2 mostraron p-ERBB2 elevado (Y1221/2) , en comparación con el ERBB3 -WT (Figura 15C) . Además, en combinación con EGFR o ERBB2 , una mayoría de las mutaciones de ERBB3 mostraron niveles de p-AKT y p-ERK elevados, coherentes con la señalización dirección 3' constitutiva por los mutantes de ERBB3 (Figura 15B-15C) . Habiendo establecido la capacidad de los mutantes de ERBB3 para promover la supervivencia independiente de IL3 de células BaF3 , los inventores investigaron a continuación la capacidad de estos mutantes para promover el crecimiento independiente de anclaje. Los inventores descubrieron que las células BaF3 que expresaban de forma estable mutantes de ERBB3 P262H, G284R y Q809R en combinación con ERBB2 promovieron el crecimiento independiente de anclaje robusto en comparación con ERBB3 -WT (Figura 16) . Aunque varios de los mutantes promovieron algún crecimiento independiente de anclaje cuando se expresaron con EGFR, el efecto no fue tan pronunciado como se observó en combinación con ERBB2. Esto es coherente con informes previos que establecen el requisito de ERBB3 en señalización oncogénica mediada por ERBB2 (Holbro efc al. PNAS 100, 8933 a 8938 (2003); Lee-Hoeflich et al. Cáncer Research 68, 5878 a 5887 (2008) ) .

El sistema de BaF3 se usó para ensayar varios mutantes de ERBB3 ECD (V104M, A232V, P262H, P262S, G284R y T389K) que incluía seis mutantes de puntos calientes de ECD y cuatro mutantes de dominio cinasa de ERBB3 (V714 , Q809R, S846I y E928G) con respecto a sus efectos en la supervivencia celular independiente de IL-3, señalización y crecimiento independiente de anclaje expresando de forma estable los mutantes de ERBB3 solos o en combinación con ERBB2. ERBB3 tiene deficiencia de cinasa y después de la unión con el ligando preferentemente forma heterodímeros con ERBB2 para promover la señalización (Holbro et al. (2003) mencionado anteriormente; Karunagaran et al. (1996). The EMBO journal 15, 254 a 264; Lee-Hoeflich et al. (2008) mencionado anteriormente; Sliwkowski et al. (1994) mencionado anteriormente) . De forma coherente con esto, en ausencia del ligando exógeno, ERBB3 de tipo silvestre (WT) y los mutantes de ERBB3 por sí solos no promovieron la supervivencia independiente de IL-3 de células BaF3 (Figura 37A) . Sin embargo, en ausencia del ligando de ERBB3 exógeno, los mutantes de ERBB3, a diferencia de ERBB3-WT, promovieron la supervivencia de células BaF3 independiente de IL3 cuando se coexpresaron con ERBB2 (Figura 37A) , lo que indica que los mutantes de ERBB3 pueden actuar de una manera independiente de ligando. La actividad de supervivencia celular de mutantes de ERBB3 se anuló cuando se coexpresaron con un mutante K735M de ERBB2 con cinasa muerta (KD) , confirmando el requisito de un ERBB2 de cinasa activa (Figura 37A) . Los inventores investigaron además los mutantes de ERBB3 con respecto a su capacidad para promover el crecimiento independiente de anclaje. Los mutantes de ERBB3, como se observa en el ensayo de supervivencia, por sí solos no apoyan el crecimiento independiente de anclaje (Figura 37B) . Sin embargo, los inventores descubrieron que una mayoría de los mutantes de ERBB3 ensayados en combinación con ERBB2 , promovieron el crecimiento independiente de anclaje en comparación con células BaF3 que expresaban ERBB3 -WT/ERBB2 (Figura 37B-37C) . Se confirmó que el crecimiento independiente de anclaje promovido por ERBB3 dependía de esa actividad cinasa de ERBB2, ya que los mutantes de ERBB3 en combinación con ERBB2-KD no promovieron la formación de colonias (Figura 37B-37C) . El análisis de Western Blot de las células BaF3 mostró que la expresión de mutantes de ERBB3 en combinación con ERBB2 condujo a un aumento en pERBB3 , pERBB2 , pAKT y/o pERK en comparación con ERBB3-WT (Figura 37D-37F) . De forma coherente con la falta de actividad de supervivencia celular o crecimiento independiente de anclaje, los mutantes de ERBB3 por sí solos o en combinación con ERBB2-KD no mostraron pERBB2 y/o pAKT/pERK elevado (Figura 37D-37F) , aunque los mutantes de ERBB3 por sí solos mostraron algunos niveles de pERBB3 elevados que probablemente se debe a ERBB2 endógeno expresado por células BaF3. En combinación con ERBB2, el mutante de dominio cinasa ERBB3 V714M coherente con su señalización débil mostró solamente una actividad de supervivencia celular modesta y ningún crecimiento independiente de anclaje (Figura 37A-37C) . En contraste, el mutante Q809R más activo en combinación con ERBB2 mostró señalización dirección 3' robusta en comparación con ERBB3-WT (Figura 37A-37C) .

Señalización oncogénica independiente de ligando por mutantea de ERBB3 En un intento de entender el mecanismo por el que los mutantes de ERBB3 promueven la señalización oncogénica, los inventores ensayaron la dependencia del ligando de los mutantes de ERBB3 usando su sistema de BaF3.

Para establecer la señalización independiente de ligando por los mutantes de ERBB3 los inventores ensayaron su capacidad para promover la supervivencia de BaF3 independiente de IL-3 en una dosis creciente de anticuerpo anti-NRGl, un anticuerpo neutralizador de ligando de ERBB.

Los inventores descubrieron que la adición de un anticuerpo neutralizador de NRG1 (Hegde et al. Manuscrito presentado (2011) ) no tuvo ningún efecto adverso en la capacidad de los mutantes de ERBB3 para promover la supervivencia independiente de IL-3 o formación de colonias independiente de anclaje (Figura 17) . De forma coherente con esto, en la inmunoprecipitación realizada después del entrecruzamiento del receptor de superficie celular, los inventores descubrieron pruebas de los niveles aumentados de heterodímeros de ERBB3 -mutante/ERBB2 , en ausencia de ligando, en comparación con las células BaF3 que coexpresaban ERBB3-WT y ERBB2 (Figura 18) . Esto se confirmó adicionalmente por los niveles elevados de heterodímeros de superficie celular en células BaF3 que expresaban ERBB3-mutante/ERBB2 , cultivadas en ausencia de IL-3 o NRG1, usando un ensayo de ligamiento de proximidad (Soderberg et al. Nat Methods 3, 995 a 1000 (2006) ) (Figura 19 y Figura 20A-20B) en comparación con células que expresaban ERBB3-WT/ERBB2. Estos datos sugieren que los mutantes de ERBB3 , en combinación con ERBB2 , son capaces de promover la supervivencia de IL-3 de BaF3 de una manera independiente de NRG1.

Habiendo establecido que los mutantes de ERBB3 pueden señalizar independientemente del ligando, los inventores ensayaron si su capacidad podría aumentarse por adición de ligandos. Los inventores descubrieron que NRG1 era incapaz de apoyar la supervivencia de células BaF3 que expresaban ERBB3-WT o los mutantes solos (Figura 20C) . Sin embargo, a la mayor concentración ensayada, se aumentó la supervivencia independiente de IL-3 de células BaF3 que expresaban una mayoría de los mutantes de ERBB3 junto con ERBB2, de una manera similar a las células que expresaban ERBB3 -WT/ERBB2 (Figura 21) . Resulta interesante que el mutante de ERBB3 A232V, como el ERBB3 WT, mostró una respuesta de supervivencia independiente de IL-3 dependiente de dosis de NRG1 (Figura 21) . Por el contrario, G284R y Q809R no mostraron un aumento significativo de la supervivencia después de la adición de ligando en comparación con células no tratadas que expresaban estos mutantes. La respuesta mínima a adición de ligando por mutantes de ECD G284R y dominio cinasa Q809R sugiere un papel dominante para el modo independiente de ligando de señalización por estos mutantes (Figura 21) . De forma coherente con esto, después de la adición de ligando, aunque el ERBB3 P262H y el WT mostraron formación de heterodímeros elevada, el mutante de ECD G284R y el mutante de dominio cinasa Q809R mostraron un aumento solamente modesto en la formación de heterodímeros en comparación con las células no estimuladas (Figura 18) . Estos resultados muestran que aunque todos los mutantes de ERBB3 son capaces de señalización independiente de ligando, algunos de ellos aún son capaces de responder a la estimulación del ligando.

Para entender adicionalmente el mecanismo por el que los mutantes de ERBB3 promueven la señalización oncogénica, los inventores ensayaron la dependencia de ligando de los mutantes de ERBB3 en su sistema de BaF3 tratando estas células con dosis crecientes de un anticuerpo anti-NRGl neutralizador del ligando de ERBB3 (Hedge et al. (2001) mencionado anteriormente) . Los inventores descubrieron que la adición de un anticuerpo neutralizador de NRG1 (misma referencia) no tuvo ningún efecto en la capacidad de los mutantes de ERBB3 para promover la supervivencia independiente de IL-3 (Figura 37G) . En la Figura 37H, los mutantes de ERBB3 ECD muestran supervivencia de BaF3 independiente de IL-3 aumentada en respuesta a dosis creciente de NRG1 exógeno.

Los mutantes de ERBB3 promueven la oncogénesis in vivo Los inventores y otros han mostrado que las células BaF3 , hechas independientes de IL-3 por expresión ectópica de oncogenes, promueven la enfermedad de tipo leucemia cuando se implantan en ratones y conducen a supervivencia general reducida (Horn et al. Oncogene 27, 4096 a 4106 (2008); Jaiswal et al. Cáncer Cell 16, 463 a 474 (2009)). Los inventores ensayaron la capacidad de las células BaF3 que expresaban ERBB3-WT, mutantes de ECD (P262H o G284R) o el mutante de ERBB3 de dominio cinasa (Q809R) en combinación con ERBB2 con respecto a su capacidad para promover la enfermedad de tipo leucemia. Las células BaF3 transducidas con ERBB3-WT solamente o ERBB2 junto con vector vacío se usaron como controles. Los inventores descubrieron que los ratones a los que se habían trasplantado células BaF3 que expresaban mutantes de ERBB3 junto con ERBB2 mostraron una mediana de la supervivencia de 22 a 27 días (Figura 22) . Por el contrario, los ratones que recibieron BaF3 que expresaban ERBB3-WT solamente o ERBB2 con vector vacío estaban todos vivos al final del periodo de estudio de 60 días. Sin embargo, los animales que recibieron células BaF3 que coexpresaban ERBB3- T y ERBB2 desarrollaron enfermedad de tipo leucemia con un periodo de espera significativamente más largo (39 días; Figura 22) . Aunque las células BaF3 ERBB3 -WT/ERBB2 in vitro no mostraron independencia de IL-3, su actividad en el modelo animal se debe probablemente a la presencia de factores de crecimiento y citocinas en el ambiente in vivo que puede activar dímeros de ERBB3 -WT/ERBB2 y en parte debido a la señalización dependiente de ligando indicada para heterodímeros de ERBB3 -ERBB2 (Junttila et al. Cáncer Cell 15, 429 a 440 (2009) ) . Para seguir la progresión de la enfermedad los inventores realizaron necropsias a los 20 días en una cohorte adicional de tres ratones por tratamiento. La médula ósea, bazo y muestras de hígado de estos animales se revisaron con respecto a anomalías patológicas. Dado que las células BaF3 estaban marcadas con eGFP, los inventores examinaron la médula ósea aislada y el bazo con respecto a células de infiltración por separación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) . De forma coherente con la supervivencia reducida, la médula ósea y el bazo de los ratones a los que se habían trasplantado células que expresaban mutantes de ERBB3/ERBB2 mostraron una proporción significativa de células positivas para eGFP de infiltración en comparación con médula ósea y bazo de ratones que recibieron células de control ERBB3-WT o ERBB2/vector vacío (Figuras 23A a 26) . Además, de forma concordante con el tiempo de espera más largo observado, se detectó un nivel muy bajo de células positivas para eGFP de infiltración en el hígado y el bazo de animales que recibieron células ERBB3-WT/ERBB2-WT. Además, los animales de la rama de ERBB3 mutante/ERBB2 mostraron tamaño y peso aumentado del bazo (Figura 25A y Figura 27) y el hígado (Figura 25B y Figura 27) en comparación con el control de vector vacío o ERBB3-WT/ERBB2 a los 20 días, confirmando adicionalmente la presencia de células de infiltración. Además, la evaluación histológica de secciones de médula ósea, bazo e hígado teñidas con hematoxilina y eosina (H y E) mostraron infiltración significativa de blastos en animales con células que expresaban ERBB3-mutante/ERBB2 en comparación con control el día 20 (Figura 26) . Estos resultados demuestran el potencial oncogénico in vivo de los mutantes de ERBB3.

Los productos terapéuticos dirigidos son eficaces contra imitantes de ERBB3 Múltiples agentes que se dirigen a los receptores ERBB directamente están aprobados para tratar diversos cánceres (Baselga y Swain Nature Reviews Cáncer 9 , 463 a 475 (2009) ; Álvarez et al. Journal of Clinical Oncology 28 , 3366 a 3379 (2010) ) . Varios fármacos candidatos adicionales que se dirigen a miembros de la familia de ERBB, incluyendo ERBB3 , y sus componentes dirección 3' están en diversos estadios de ensayo y desarrollo clínico (Álvarez et al. Journal of Clinical Oncology 28 , 3366 a 3379 (2010)). Los inventores ensayaron trastuzumab, un anticuerpo anti-ERBB2 que se une con el dominio IV de ERBB2 (Junttila et al. Cáncer Cell 15 , 429 a 440 (2009) ) , pertuzumab, un anticuerpo anti-ERBB2 que se une con el dominio II de ERBB2 y previene la dimerización (Junttila et al. Cáncer Cell 15 , 429 a 440 (2009)), anti-ERBB3.1, un anti-ERBB3 que bloquea la unión del ligando (se une con el dominio III) (Schaefer, G. et al. Cáncer Cell (2011) ), anti -ERBB3.2 , un anticuerpo anti-ERBB3, que se une con el dominio III y bloquea la unión del ligando (Wilson et al. Cáncer Cell 20 , 158 a 172 (2011)), MEHD7945A, un anticuerpo doble de ERBB3/EGFR que bloquea la unión del ligando (se une con el dominio III de EGFR y ERBB3 ) (Schaefer, G. et al. Cáncer Cell (2011)), cetuximab, un anticuerpo de EGFR que bloquea la unión del ligando (se une con el dominio III de EGFR) (Li, S. et al . Cáncer Cell 7, 301 a 311 (2005)), Lapatinib (Medina, P. J. y Goodin, S. Clin Ther 30, 1426 a 1447 (2008)), una molécula pequeña inhibidora doble de ERBB2/EGFR y GDC-0941 (Edgar, K. A. et al. Cáncer Research 70, 1164 a 1172 (2010) ) , un inhibidor de PI3 , con respecto a su efecto en el bloqueo de la proliferación celular y la formación de colonias usando el sistema de BaF3 (Figura 28, Figura 29 y Figura 30). Los inventores también ensayaron un subconjunto de los anticuerpos in vivo con respecto a eficacia (Figura 31A-31B) . Los inventores descubrieron que en los ensayos tanto de proliferación como de formación de colonias, la molécula pequeña inhibidora lapatinib es bastante eficaz frente a todos los mutantes y GDC-0941 es eficaz contra todos los mutantes ensayados excepto contra Q809R en el que solamente era parcialmente eficaz a la dosis ensayada (Figuras 28 y 29) . Entre los anticuerpos ensayados en el ensayo de formación de colonias, trastuzumab anti-ERBB3.2 y MEHD7945A eran todos eficaces contra todos los mutantes ensayados (Figuras 28 y 29) . Sin embargo, pertuzumab, anti-ERBB3.1 y GDC-0941 aunque son muy eficaces en el bloqueo de la proliferación y la formación de colonias inducida por mutantes de ERBB3 ECD, solo eran modestamente eficaces contra el mutante de dominio cinasa de ERBB3 Q809R (Figuras 28 y 29) . De forma coherente con esto, in vitro en células BaF3 que coexpresaban ERBB3 mutante y ERBB2, cuando eran eficaces, estos agentes bloquearon o redujeron los niveles de pAKT y/o pERK, y también los niveles de ERBB3 y/o pERBB3 (Figura 32 y Figura 33) .

Los inventores también ensayaron trastuzumab, anti-ERBB3.1 y anti-ERBB3.2 frente a mutantes de ERBB3 G284R y Q809R usando el sistema de BaF3 in vivo (Figuras 31A-31B, 34A-34B y 35A-35B) . Como se ha observado in vitro, trastuzumab fue muy eficaz en el bloqueo de la enfermedad de tipo leucemia en ratones que recibieron BaF3 que expresaban ERBB3/ERBB2 G284R o Q809R (figura 31A) . De forma similar, tanto anti -ERBB3.1 como anti-ERBB3.2 bloquearon el desarrollo de enfermedad de tipo leucemia en ratones que recibieron BaF3 que coexpresaba ERBB3-ECD G284R y ERBB2 (Figura 31A) . Sin embargo, estos anticuerpos anti-ERBB3 eran solamente parcialmente eficaces en el bloqueo del desarrollo de enfermedad en ratones que recibieron células BaF3 que expresaban ERBB3/ERBB2 Q809R, aunque mejoraron significativamente la supervivencia en comparación con animales de control no tratados (Figura 31B) . De forma coherente con la eficacia observada para los productos terapéuticos dirigidos los inventores descubrieron una reducción significativa en células BaF3 de infiltración que expresaban los mutantes de ERBB3 en el bazo y la médula ósea (Figuras 34A-34B y Figura 36) . De forma conjunta con la infiltración reducida de células BaF3 observada, los pesos del bazo y el hígado estuvieron dentro del rango normal esperado para ratones desnudos Balb/C (Figuras 35A-34B y Figuras 25A-25B) . Estos datos indican que múltiples productos terapéuticos, bien en desarrollo o bien aprobados para su uso humano, pueden ser eficaces contra tumores conducidos por mutantes de ERBB3.

En este estudio los inventores presentan la identificación de mutaciones somáticas de ERBB3 frecuentes en cánceres de colon y gástrico. Varias de las mutaciones que identificaron los inventores aparecen en múltiples muestras independientes formando puntos calientes característicos de mutaciones oncogénicas.

Estos estudios funcionales in vi tro e in vivo demuestran la naturaleza oncogénica de las mutaciones de ERBB3 tanto del ECD como del dominio cinasa. Además, usando experimentos de valoración de ligandos los inventores muestran que algunos de los mutantes de ECD V104 , P262H, Q284R y T389K, aunque son oncogénicos en ausencia del ligando de ERBB3 NRG1, pueden estimularse además por la adición de NRG1. Las mutaciones de ECD pueden desplazar el equilibrio entre el ERBB3 ECD ligado y desligado hacia una conformación desligada en relación con WT.

Habiendo ensayado varios agentes terapéuticos con respecto a su utilidad en la dirección de señalización oncogénica conducida por mutantes de ERBB3 tanto in vitro como in vivo, los inventores han descubierto que múltiples moléculas pequeñas inhibidoras, anticuerpos anti-ERBB2 y anti-ERBB3 ECD son bastante eficaces en el bloqueo de la señalización oncogénica por una mayoría de los mutantes de ERBB3 ensayados. Resulta interesante que, pertuzumab, anti- ERBB3.1 y GDC-0941 no fueron tan eficaces en el bloqueo del mutante de dominio cinasa Q809R, lo que indica un modo definido de acción por este mutante. Estudios previos han mostrado que aunque el pertuzumab es bastante eficaz en el bloqueo de la dimerización de ERBB3/ERBB2 mediada por ligando, el trastuzumab es más eficaz en el bloqueo de la formación de dímeros de ERBB2/ERBB3 independiente del ligando (Junttila, T. T. efc al. Cáncer Cell 15, 429 a 440 (2009)) . De forma coherente con esto, el mutante de ERBB3 de dominio cinasa no sensible al ligando Q809R es mucho más sensible a la inhibición por trastuzumab en comparación con pertuzumab lo que sugiere un papel potencial para un complejo heterodimérico sin ligando en señalización de ERBB3 Q809R. Aunque el inhibidor de PI3K GDC-0941 es bastante activo contra la mayoría de los mutantes de ERBB3 ensayados, su eficacia reducida en el bloqueo del mutante del dominio cinasa Q809R sugiere la interacción de otras moléculas de señalización dirección 3', además de la PI3 Cinasa.

La supresión de ERBB3 mediada por ARNhp afecta al crecimiento in vivo Habiendo establecido la actividad oncogénica de mutantes de ERBB3 en células IMCE, los inventores buscaron ensayar el efecto de la supresión de ERBB3 en líneas celulares tumorales . Un estudio reciente presentó CW-2, una línea celular de colon, y DV90, una línea de pulmón, que expresan mutantes de ERBB3 E928G y V104M, respectivamente. Los inventores generaron líneas celulares CW-2 y DV90 estables que expresan un ARNhp inducible por doxiciclina (dox) que se dirige a ERBB3 usando construcciones de dirección previamente publicadas (Garnett et al. (2012) Nature 483, 570 a 575). Los inventores también generaron líneas de control que expresaban una secuencia de dirección de luciferasa (luc) inducible por dox. Tras la inducción por dox, en contraste con las líneas que expresaban ARNhp luc, se redujeron los niveles de ERBB3 y pERK en células que expresaban el ARNhp de ERBB3 (Figura 38A-B) . De forma coherente con la pérdida de ERBB3 después de inducción por dox tanto DV90 como CW-2 mostraron crecimiento independiente de anclaje reducido en comparación con líneas de ARNhp de luciferasa o líneas no inducidas (Figura 38C-F) . A continuación los inventores ensayaron si la supresión de ERBB3 de células DV90 y CW-2 podría afectar a su capacidad para formar tumores in vivo. Tras la inducción mediada por dox de ARNhp que se dirige a ERBB3 , los inventores descubrieron que las células tanto DV90 como CW-2 mostraban una reducción significativa en el crecimiento tumoral en comparación con animales que portaban células DV90 o CW-2 que expresaban AR hp de luc o no se inducía que expresaran el ARNhp de ERBB3 (Figura 38G-38J) . Estos datos tomados untos confirman adicionalmente el papel de las mutaciones de ERBB3 en tumorigénesis .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (33)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un agente detector de cáncer gastrointestinal de ErbB3, caracterizado porque comprende un reactivo capaz de unirse específicamente con una mutación de ErbB3 en una secuencia de ácido nucleico de ErbB3.

2. El agente detector de cáncer de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de ErbB3 comprende SEC ID N°: 3 o 1.

3. El agente detector de cáncer de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el reactivo comprende un polinucleótido de fórmula 5' Xa-Y-Zb3' Fórmula I, donde X es cualquier ácido nucleico y a es entre aproximadamente 0 y aproximadamente 250; Y es un codón de mutación de ErbB3 ; y Z es cualquier ácido nucleico y b es entre aproximadamente 0 y aproximadamente 250.

4. El agente detector de cáncer de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el codón de mutación codifica (i) un aminoácido en una posición de SEC ID N° : 2 seleccionado del grupo que consiste en 104, 809, 232, 262, 284, 325, 846, 928, 60, 111, 135, 295, 406, 453, 498, 1089 y 1164; o (ii) un codón de parada en la posición 193.

5. Un método para determinar la presencia del cáncer gastrointestinal de ErbB3 en un sujeto caracterizado porque comprende detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto una mutación en una secuencia de ácido nucleico que codifica ErbB3 , donde la mutación da como resultado un cambio de aminoácidos en al menos una posición de la secuencia de aminoácidos de ErbB3 y caracterizado por el hecho de que la mutación es indicativa de un cáncer gastrointestinal de ErbB3 en un sujeto.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la mutación que da como resultado un cambio de aminoácidos es en una posición de SEC ID N° : 2 seleccionada del grupo que consiste en 104, 809, 232, 262, 284, 325, 846, 928, 60, 111, 135, 295, 406, 453, 498, 1089, 1164 y 193.

7. Un método para determinar la presencia de cáncer de ErbB3 en un sujeto caracterizado porque comprende detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto la presencia o ausencia de una mutación de aminoácidos en una secuencia de ácido nucleico que codifica ErbB3, donde la mutación da como resultado un cambio de aminoácidos en al menos una posición en SEC ID N° : 2 seleccionada del grupo que consiste en 104, 809, 232, 262, 284, 325, 846, 928, 60, 111, 135, 295, 406, 453, 498, 1089, 1164, 193, 492 y 714, donde la presencia de la mutación es indicativa de un cáncer de ErbB3 en el sujeto.

8. El método de conformidad con la reivindicación 5 o 7, caracterizado porque comprende además administrar un agente terapéutico al sujeto.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el agente terapéutico es un inhibidor de ErbB.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el inhibidor de ErbB se selecciona del grupo que consiste en un antagonista de EGFR, un antagonista de ErbB2 , un antagonista de ErbB3 , un antagonista de ErbB4 y un antagonista de EGFR/ErbB3.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el inhibidor es una molécula pequeña inhibidora .

12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el antagonista es un anticuerpo antagonista .

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y un fragmento de anticuerpo.

14. El agente detector de conformidad con la reivindicación 1 o el método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el cáncer gastrointestinal es cáncer gástrico o cáncer de colon.

15. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el cáncer de ErbB3 se selecciona del grupo que consiste en gástrico, de colon, esofágico, rectal, del ciego, adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , NSCLC (carcinoma escamoso), carcinoma renal, melanoma, ovárico, de pulmón de células grandes, cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) , hepatocelular (HCC) , de pulmón y pancreático.

16. El método de conformidad con la reivindicación 5 o 7, caracterizado porque comprende además (i) identificar el sujeto necesitado y/o (ii) obtener la muestra de un sujeto necesitado.

17. El método de conformidad con la reivindicación 5 o 7, caracterizado porque la detección comprende amplificar o secuenciar la mutación y detectar la mutación o secuencia de ésta .

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la amplificación comprende mezclar un cebador de amplificación o par de cebadores de amplificación con un molde de ácido nucleico aislado de la muestra.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el cebador o par de cebadores es complementario o parcialmente complementario de una región próxima a o que incluye la mutación, y es capaz de iniciar la polimerización de ácido nucleico por una polimerasa en el molde de ácido nucleico.

20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende además extender el cebador o par de cebadores en una reacción de polimerización de ADN que comprende una polimerasa y el ácido nucleico molde para generar un amplicón.

21. El método de conformidad con la reivindicación 17, en el que la mutación se detecta por un proceso caracterizado porque incluye uno o más de: secuenciar la mutación en un ADN genómico aislado de la muestra biológica, hibridar la mutación o un amplicón de ésta con una matriz, digerir la mutación o un amplicón de ésta con una enzima de restricción, o amplificación por PCR en tiempo de real de la mutación.

22. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende secuenciar parcial o completamente la mutación en un ácido nucleico aislado de la muestra biológica.

23. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la amplificación comprende realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) , o reacción en cadena de la ligasa (LCR) usando un ácido nucleico aislado de la muestra biológica como un molde en la PCR, RT-PCR o LCR.

24. Un método para tratar el cáncer gastrointestinal en un sujeto que lo necesite caracterizado porque comprende: a) detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto una mutación en una secuencia de ácido nucleico que codifique ErbB3 , caracterizado por el hecho de que la mutación da como resultado un cambio de aminoácidos en al menos una posición de la secuencia de aminoácidos de ErbB3 y caracterizado por el hecho de que la mutación es indicativa de un cáncer gastrointestinal de ErbB3 en un sujeto; y b) administrar un agente terapéutico al sujeto.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la mutación que da como resultado un cambio de aminoácidos está en una posición de SEC ID N°: 2 seleccionada del grupo que consiste en 104, 809, 232, 262, 284, 325, 846, 928, 60, 111, 135, 295, 406, 453, 498, 1089, 1164 y 193.

26. Un método para tratar un cáncer de ErbB3 en un sujeto, caracterizado porque comprende: a) detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto la presencia o ausencia de una mutación de aminoácidos en una secuencia de ácido nucleico que codifica ErbB3 , donde la mutación da como resultado un cambio de aminoácidos en al menos una posición en SEC ID N° : 2 seleccionada del grupo que consiste en 104, 809, 232, 262, 284, 325, 846, 928, 60, 111, 135, 295, 406, 453, 498, 1089, 1164, 193, 492 y 714, y donde la presencia de la mutación es indicativa de un cáncer de ErbB3 en el sujeto; y b) administrar un agente terapéutico al sujeto.

27. El método de conformidad con la reivindicación 24 o 26, caracterizado porque el agente terapéutico es un inhibidor de ErbB.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el inhibidor de ErbB se selecciona del grupo que consiste en un antagonista de EGFR, un antagonista de ErbB2, un antagonista de ErbB3, un antagonista de ErbB4 y un antagonista de EGFR/ErbB3.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el antagonista es una molécula pequeña inhibidora.

30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el antagonista es un anticuerpo antagonista .

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y un fragmento de anticuerpo.

32. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el cáncer gastrointestinal es cáncer gástrico o cáncer de colon.

33. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el cáncer de ErbB3 se selecciona del grupo que consiste en gástrico, de colon, esofágico, rectal, del ciego, colorrectal, adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , NSCLC (carcinoma escamoso) , carcinoma renal, melanoma, ovárico, de pulmón de células grandes, cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) , hepatocelular (HCC) , de pulmón y pancreático.