JP2018085998A - 癌におけるｅｒｂｂ３変異 - Google Patents

癌におけるｅｒｂｂ３変異 Download PDF

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ビジェイ シャンカル ジェイスワール，
ソマセカー セシャギリ，
Seshagiri Somasekar
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Abstract

【課題】癌における体細胞ＥｒｂＢ３変異に関し、ＥｒｂＢ３癌検出薬、診断及び予後診断の方法、並びに、癌を治療する方法の提供。【解決手段】特定式で表わされるポリヌクレオチドを含み、ＥｒｂＢ３核酸配列中のＥｒｂＢ３変異に特異的に結合できる試薬を含む、ＥｒｂＢ３消化管癌検出薬を用いる方法。【選択図】図４ａ

Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１１年１１月３０日に出願された米国仮出願第６１／６２９，９５１号に対する優先権の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、癌における体細胞ＥｒｂＢ３変異に関し、ＥｒｂＢ３癌を特定、診断、および予後診断する方法、ならびに癌を治療する方法を含み、患者のある亜集団を含む。
ＥＲＢＢ受容体としても知られる、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーは、４つのメンバー、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１／ＨＥＲ１、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３／ＨＥＲ３、およびＥＲＢＢ４／ＨＥＲ４からなる（Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ５，３４１−３５４（２００５）、Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ９，４６３−４７５（２００９））。ＥＲＢＢファミリーメンバーは、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、単スパン膜貫通領域、細胞内チロシンキナーゼドメイン、およびＣ末端シグナル伝達尾部を含む（Ｂｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １２，５４１−５５２（２００３）、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ３７，３５３−３７３（２００８））。ＥＣＤは、２つのＬドメイン（ＩおよびＩＩＩ）ならびに２つの高システインドメイン（ＩＩおよびＩＶ）からなる４つのドメイン構造である（Ｂｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １２，５４１−５５２（２００３）、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ３７，３５３−３７３（２００８））。ＥＲＢＢ受容体は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、およびニューレグリンを含む複数のリガンドにより活性化される（Ｙａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２，１２７−１３７（２００１））。受容体の活性化は、ドメインＩおよびＩＩＩに同時に結合する単一リガンド分子を必要とし、ドメインＩＩにおける二量体化アームを介したヘテロ二量体化またはホモ二量体化につながる（Ｂｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １２，５４１−５５２（２００３）、Ｏｇｉｓｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １１０，７７５−７８７（２００２）、Ｃｈｏ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７，１３３０−１３３３（２００２）、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５，７７３４−７７４２（２００５）、Ａｌｖａｒａｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １４２，５６８−５７９（２０１０）、Ｌｅｍｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １４１，１１１７−１１３４（２０１０））。リガンドの不在化で、ドメインＩＩ二量体化アームは、ドメインＩＶとの分子内相互作用を介して挟み込まれ、「繋留された」自己抑制構成をもたらす（Ｂｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １２，５４１−５５２（２００３）、Ｃｈｏ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２９７，１３３０−１３３３（２００２）、Ｌｅｍｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １４１，１１１７−１１３４（２０１０）、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １１，５０７−５１７（２００３））。
４つのＥＲＢＢ受容体は、類似のドメイン組織を共有するが、機能的および構造的研究は、ＥＲＢＢ２が既知のＥＲＢＢファミリーリガンドのいずれにも結合せず、構成的に二量体化に適した「非繋留」（オープン）構造であることを示す（Ｇａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １１，４９５−５０５（２００３））。対照的に、ＥＲＢＢ３は、リガンド結合、ヘテロ二量体化、およびシグナル伝達が可能であるが、傷害のあるキナーゼドメインを有する（Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ９，４６３−４７５（２００９）、Ｊｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０６，２１６０８−２１６１３（２００９）、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０７，７６９２−７６９７（２０１０））。ＥＲＢＢ２およびＥＲＢＢ３は、それら自体は機能的に不完全であるが、それらのヘテロ二量体は、細胞シグナル伝達の強力な活性剤である（Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １５，２４５２−２４６７（１９９６）、Ｔｚａｈａｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６，５２７６−５２８７（１９９６）、Ｈｏｌｂｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １００，８９３３−８９３８（２００３））。
ＥＲＢＢ受容体は、正常な成長および発達の重要な調節因子であるが、それらの脱制御も癌の発達および進行に関与している（Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ９，４６３−４７５（２００９）、Ｓｉｔｈａｎａｎｄａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １５，４１３−４４８（２００８）、Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２１，１７７−１８４（２００９））。具体的には、受容体過剰発現をもたらし、体細胞変異を活性化する遺伝子増幅は、様々な癌においてＥＲＢＢ２およびＥＧＦＲ内で発生することが知られている（Ｓｉｔｈａｎａｎｄａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １５，４１３−４４８（２００８）、Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２１，１７７−１８４（２００９）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １０，２５−３８（２００６）、Ｙａｍａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｒｋ Ｍｅｄ ３，１３９−１５１（２００９））。これは、ＥＧＦＲおよびＥＲＢＢ２を標的とする複数の低分子および抗体に基づく治療法の開発をもたらした（Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ９，４６３−４７５（２００９）、Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２８，３３６６−３３７９（２０１０））。腫瘍形成におけるＥＲＢＢ４の正確な役割は、十分に確立されていないが（Ｋｏｕｔｒａｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ７４，７３−７８（２０１０））、ＥＲＢＢ４内の形質転換体細胞変異が黒色腫において報告されている（Ｐｒｉｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１，１１２７−１１３２（２００９））。近年、ＥＲＢＢ２シグナル伝達において重要な役割を果たし、既存の治療法に対する耐性を促進することにも関与することを考慮し、ＥＲＢＢ３が有力な癌治療標的として浮上した（Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ９，４６３−４７５（２００９）、Ａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍｉｎ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２１、９４４−９５０（２０１０））。ＥＲＢＢ３増幅および／または過剰発現は、いくつかの癌において知られているが、ＥＲＢＢ３体細胞変異の散発的発生のみが報告されており、これらの変異の機能的関連は研究されていない。本明細書に提供される発明は、ヒト癌における頻繁なＥＲＢＢ３体細胞変異の特定に関する。
本発明は、胃および結腸腫瘍を含むが、これらに限定されない様々なヒト腫瘍と関連付けられる、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーのＥＲＢＢ３受容体内の複数の体細胞変異事象の発見に少なくとも部分的に基づく。これらの変異は、ヒト腫瘍発生の素因があり、および／または直接寄与すると考えられる。実際に、本明細書に記載されるとおり、変異の一部は腫瘍発生をインビボで促進するという証拠がある。
一態様では、本発明は、ＥｒｂＢ３癌検出薬を提供する。一実施形態では、ＥｒｂＢ３癌検出薬は、ＥｒｂＢ３消化管癌検出薬である。別の実施形態では、検出薬は、ＥｒｂＢ３核酸配列中のＥｒｂＢ３変異に特異的に結合することができる試薬を含む。他の一実施形態では、ＥｒｂＢ３核酸配列は、配列番号３または１を含む。
いくつかの実施形態では、この試薬は、式
Figure 2018085998
のポリヌクレオチドを含み、式中、
Ｘは任意の核酸であり、ａは約０〜約２５０であり、
ＹはＥｒｂＢ３変異コドンであり、
Ｚは任意の核酸であり、ｂは約０〜約２５０である。
他の一実施形態では、変異コドンが、（ｉ）１０４、８０９、２３２、２６２、２８４、３２５、８４６、９２８、６０、１１１、１３５、２９５、４０６、４５３、４９８、１０８９、および１１６４からなる群から選択される、配列番号２の位置のアミノ酸、または（ｉｉ）１９３位の終止コドンをコードする。他の一実施形態では、消化管癌は、胃癌または結腸癌である。
別の態様では、本発明は、対象におけるＥｒｂＢ３消化管癌の存在を決定する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、対象から得られる生体試料においてＥｒｂＢ３をコードする核酸配列中の変異を検出することであって、この変異は、ＥｒｂＢ３アミノ酸配列の少なくとも１つの位置にアミノ酸変化をもたらし、この変異は、対象におけるＥｒｂＢ３消化管癌を示す。別の実施形態では、アミノ酸変化を生じる変異は、１０４、８０９、２３２、２６２、２８４、３２５、８４６、９２８、６０、１１１、１３５、２９５、４０６、４５３、４９８、１０８９、１１６４、および１９３からなる群から選択される、配列番号２の位置にある。他の実施形態では、消化管癌は、胃癌または結腸癌である。
別の態様では、本発明は、対象におけるＥｒｂＢ３癌の存在を決定する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、対象から得られる生体試料においてＥｒｂＢ３をコードする核酸配列中のアミノ酸変異の存在または不在を検出することを含み、この変異は、配列番号２の１０４、８０９、２３２、２６２、２８４、３２５、８４６、９２８、６０、１１１、１３５、２９５、４０６、４５３、４９８、１０８９、１１６４、１９３、４９２、および７１４からなる群から選択される少なくとも１つの位置にアミノ酸変化をもたらし、変異の存在は、対象におけるＥｒｂＢ３癌を示す。別の実施形態では、ＥｒｂＢ３癌は、胃癌、結腸癌、食道癌、直腸癌、盲腸癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）腺癌、ＮＳＣＬＣ（扁平上皮癌）、腎臓腺癌、黒色腫、卵巣癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肺癌、および膵臓癌からなる群から選択される。
さらに別の態様では、決定方法は、以下の追加のステップ：治療薬を該対象に投与すること、必要とする対象を特定すること、必要とする対象から試料を得ることのうちの１つ、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。一実施形態では、治療薬はＥｒｂＢ阻害剤である。他の実施形態では、このＥｒｂＢ阻害剤は、ＥＧＦＲ拮抗薬、ＥｒｂＢ２拮抗薬、ＥｒｂＢ３拮抗薬、ＥｒｂＢ４拮抗薬、およびＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３拮抗薬からなる群から選択される。別の実施形態では、阻害剤は、低分子阻害剤である。一実施形態では、拮抗薬は、拮抗薬抗体である。さらに別の実施形態では、この抗体は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、および抗体断片からなる群から選択される。
別の態様では、検出ステップは、増幅または配列決定を含む。一実施形態では、この検出は、変異を増幅させるか、または配列決定することと、変異またはその配列を検出することと、を含む。別の実施形態では、増幅は、増幅プライマーまたは増幅プライマー対を、試料から単離された核酸鋳型と混合することを含む。他の実施形態では、プライマーまたはプライマー対は、該変異の近位にあるか、またはそれを含む領域に相補的であるか、または部分的に相補的であり、核酸鋳型上でポリメラーゼによる核酸重合を開始することができる。他の一実施形態では、ポリメラーゼおよび核酸鋳型を含むＤＮＡ重合反応においてプライマーまたはプライマー対を伸長させて増幅産物を生成することをさらに含む。別の実施形態では、増幅または配列決定において、変異は、生体試料から単離されたゲノムＤＮＡ中の変異を配列決定すること、変異もしくはその増幅産物をアレイにハイブリダイズすること、変異もしくはその増幅産物を制限酵素で消化すること、または変異のリアルタイムＰＣＲ増幅のうちの１つ以上を含むプロセスにより検出される。さらに別の実施形態では、増幅または配列決定は、生体試料から単離された核酸中の変異を部分的または完全に配列決定することをさらに含む。他の実施形態では、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、またはＬＣＲにおける鋳型としての生体試料から単離された核酸を用いて行うことを含む。
他の一態様では、本発明は、必要とする対象における消化管癌を治療する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、ａ）対象から得られる生体試料においてＥｒｂＢ３をコードする核酸配列中の変異を検出することを含み、この変異は、ＥｒｂＢ３アミノ酸配列の少なくとも１つの位置にアミノ酸変化をもたらし、この変異は、ＥｒｂＢ３消化管癌を示す。別の実施形態では、この方法は、ｂ）治療薬を該対象に投与することをさらに含む。他の実施形態では、アミノ酸変化をもたらす変異は、配列番号２の１０４、８０９、２３２、２６２、２８４、３２５、８４６、９２８、６０、１１１、１３５、２９５、４０６、４５３、４９８、１０８９、１１６４、および１９３からなる群から選択される位置に存在する。別の実施形態では、消化管癌は、胃癌または結腸癌である。
一態様では、本発明は、対象におけるＥｒｂＢ３癌を治療する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、ａ）対象から得られる生体試料においてＥｒｂＢ３をコードする核酸配列中のアミノ酸変異の存在または不在を検出することを含み、この変異は、配列番号２の１０４、８０９、２３２、２６２、２８４、３２５、８４６、９２８、６０、１１１、１３５、２９５、４０６、４５３、４９８、１０８９、１１６４、１９３、４９２、および７１４からなる群から選択される少なくとも１つの位置にアミノ酸変化をもたらし、変異の存在は、対象におけるＥｒｂＢ３癌を示す。別の実施形態では、この方法は、ｂ）治療薬を該対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ３癌は、胃癌、結腸癌、食道癌、直腸癌、盲腸癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）腺癌、ＮＳＣＬＣ（扁平上皮癌）、腎癌、黒色腫、卵巣癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肺癌、および膵臓癌からなる群から選択される。
別の態様では、治療方法は、ＥｒｂＢ３阻害剤を必要とする。１つの追加の実施形態では、治療薬は、ＥｒｂＢ阻害剤である。別の実施形態では、このＥｒｂＢ阻害剤は、ＥＧＦＲ拮抗薬、ＥｒｂＢ２拮抗薬、ＥｒｂＢ３拮抗薬、ＥｒｂＢ４拮抗薬、およびＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３拮抗薬からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、拮抗薬は、低分子阻害剤である。一実施形態では、拮抗薬は、拮抗薬抗体である。他の実施形態では、この抗体は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、および抗体断片からなる群から選択される。
追加の実施形態
一態様では、本発明は、必要とする対象におけるＥｒｂＢ３癌の存在を決定する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、対象から得られる生体試料においてＥｒｂＢ３をコードする核酸配列中のアミノ酸変異の存在または不在を検出するステップを含み、この変異は、Ｍ６０、Ｒ１９３、Ａ２３２、Ｐ２６２、Ｖ２９５、Ｇ３２５、Ｍ４０６、Ｄ４９２、Ｖ７１４、Ｑ８０９、Ｒ１０８９、Ｔ１１６４からなる群から選択される少なくとも１つの位置にアミノ酸変化をもたらす。別の実施形態では、この方法は、治療薬を対象に投与することをさらに含む。他の一実施形態では、この方法は、必要とする対象を特定することをさらに含む。さらに別の実施形態では、この方法は、必要とする対象から試料を得ることをさらに含む。一実施形態では、ＥｒｂＢ３癌は、胃癌、結腸癌、食道癌、直腸癌、盲腸癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）腺癌、ＮＳＣＬＣ（扁平上皮癌）、腎癌、黒色腫、卵巣癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肺癌、および膵臓癌からなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、対象から得られる生体試料においてＥｒｂＢ３をコードする核酸配列中の変異を検出することを含む、必要とする対象におけるＥｒｂＢ３消化管癌の存在を決定する方法を提供し、この変異は、Ｖ１０４、Ｙ１１１、Ａ２３２、Ｐ２６２、Ｇ２８４、Ｔ３８９、およびＱ８０９からなる群から選択される少なくとも１つの位置にアミノ酸変化をもたらす。別の実施形態では、この方法は、治療薬を対象に投与することをさらに含む。他の一実施形態では、この方法は、必要とする対象を特定することをさらに含む。さらに別の実施形態では、この方法は、必要とする対象から試料を得ることをさらに含む。他の一実施形態では、ＥｒｂＢ３消化管癌は、胃癌または結腸癌である。
他の一態様では、本発明は、必要とする対象における、ＥｒｂＢ拮抗薬に応答する可能性のあるＥｒＢＢ３消化管癌を特定する方法を提供し、該方法は、対象から得られる消化管癌細胞においてＥｒｂＢ３をコードする核酸配列中の変異を検出することを含み、この変異は、Ｖ１０４、Ｙ１１１、Ａ２３２、Ｐ２６２、Ｇ２８４、Ｔ３８９、およびＱ８０９からなる群から選択される少なくとも１つの位置に存在する。別の実施形態では、この方法は、治療薬を対象に投与することをさらに含む。他の一実施形態では、この方法は、必要とする対象から試料を得ることをさらに含む。他の一実施形態では、ＥｒｂＢ３消化管癌は、胃癌または結腸癌である。
別の態様では、本発明は、必要とする対象におけるＥｒｂＢ３癌を治療する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、対象から得られる生体試料においてＥｒｂＢ３をコードする核酸配列中のアミノ酸変異の存在または不在を検出するステップを含み、この変異は、Ｍ６０、Ｒ１９３、Ａ２３２、Ｐ２６２、Ｖ２９５、Ｇ３２５、Ｍ４０６、Ｄ４９２、Ｖ７１４、Ｑ８０９、Ｒ１０８９、Ｔ１１６４からなる群から選択される少なくとも１つの位置にアミノ酸変化をもたらす。別の実施形態では、この方法は、治療薬を該対象に投与するステップをさらに含む。
別の態様では、本発明は、必要とする対象におけるＥｒｂＢ３消化管癌を治療する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、対象から得られる生体試料においてＥｒｂＢ３をコードする核酸配列中の変異を検出するステップを含み、この変異は、Ｖ１０４、Ｙ１１１、Ａ２３２、Ｐ２６２、Ｇ２８４、Ｔ３８９、およびＱ８０９からなる群から選択される少なくとも１つの位置にアミノ酸変化をもたらす。別の実施形態では、この方法は、治療薬を該対象に投与するステップをさらに含む。
一実施形態では、本発明の方法において投与される治療薬は、ＥｒｂＢ阻害剤である。別の実施形態では、このＥｒｂＢ阻害剤は、ＥＧＦＲ拮抗薬、ＥｒｂＢ２拮抗薬、ＥｒｂＢ３拮抗薬、ＥｒｂＢ４拮抗薬、およびＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３拮抗薬からなる群から選択される。他の一実施形態では、阻害剤は、低分子阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤は、ＥＧＦＲ拮抗薬である。他の実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤は、ＥｒｂＢ２拮抗薬である。他の一実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤は、ＥｒｂＢ３拮抗薬である。別の一実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤は、ＥｒｂＢ４拮抗薬である。いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ阻害剤は、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３拮抗薬である。他の実施形態では、拮抗薬は、拮抗薬抗体である。いくつかの実施形態では、この抗体は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、および抗体断片からなる群から選択される。
別の態様では、本発明の方法は、試料から得られる核酸配列が、変異（複数可）の存在または不在について分析される検出ステップを含む。一実施形態では、この検出は、変異を増幅させるか、または配列決定することと、変異またはその配列を検出することと、を含む。別の実施形態では、増幅は、増幅プライマーまたは増幅プライマー対を、試料から単離された核酸鋳型と混合することを含む。他の一実施形態では、プライマーまたはプライマー対は、該変異の近位にあるか、またはそれを含む領域に相補的であるか、または部分的に相補的であり、核酸鋳型上でポリメラーゼによる核酸重合を開始することができる。さらに別の実施形態では、この方法は、ポリメラーゼおよび核酸鋳型を含むＤＮＡ重合反応においてプライマーまたはプライマー対を伸長させて増幅産物を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この変異が、生体試料から単離されたゲノムＤＮＡ中の変異を配列決定すること、変異もしくはその増幅産物をアレイにハイブリダイズすること、変異もしくはその増幅産物を制限酵素で消化すること、または変異のリアルタイムＰＣＲ増幅のうちの１つ以上を含むプロセスにより検出される。他の実施形態では、この方法は、生体試料から単離された核酸中の変異を部分的または完全に配列決定することをさらに含む。一実施形態では、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、またはＬＣＲにおける鋳型としての生体試料から単離された核酸を用いて行うことを含む。
この特許の出願は、色付けされた少なくとも１つの図面を含む。この特許の複製は、色図面（複数可）と共に、必要に応じて必要な料金の支払い時に特許商標庁により提供される。
試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 代表的な野生型ＥＲＢＢ３核酸配列（受入番号ＮＭ＿００１９８２）（配列番号１）。 代表的な野生型ＥＲＢＢ３核酸配列（受入番号ＮＭ＿００１９８２）（配列番号１）。 代表的な野生型ＥＲＢＢ３核酸配列（受入番号ＮＰ＿００１９７３）（配列番号２）。 ＥＲＢＢ３体細胞変異。（ａ〜ｂ）ＥＲＢＢ３タンパク質ドメイン上でマップされるＥＲＢＢ３体細胞変異から生じるタンパク質変化を示す。薄赤色の背景で反復するアミノ酸変化として描かれる多発点変異。変異残基の周りの背景縦線の高さは、その特定の位置における変異の頻度に比例する。 ＥＲＢＢ３体細胞変異。（ａ〜ｂ）ＥＲＢＢ３タンパク質ドメイン上でマップされるＥＲＢＢ３体細胞変異から生じるタンパク質変化を示す。薄赤色の背景で反復するアミノ酸変化として描かれる多発点変異。変異残基の周りの背景縦線の高さは、その特定の位置における変異の頻度に比例する。 ＥＲＢＢ３体細胞変異。（ｃ〜ｄ）ＥＲＢＢ３タンパク質ドメイン上に描かれるＥＲＢＢ３非同義的体細胞変異（逆三角形、赤色の三角形は多発点を描く）。上のヒストグラムは、本研究および他の公表された研究において、試料において観測された、各検出位置での変異の数を表す（赤色の棒は、多発点変異を示し、青色の棒は、活性について試験した追加の非多発点変異を示す）。 ＥＲＢＢ３体細胞変異。（ｃ〜ｄ）ＥＲＢＢ３タンパク質ドメイン上に描かれるＥＲＢＢ３非同義的体細胞変異（逆三角形、赤色の三角形は多発点を描く）。上のヒストグラムは、本研究および他の公表された研究において、試料において観測された、各検出位置での変異の数を表す（赤色の棒は、多発点変異を示し、青色の棒は、活性について試験した追加の非多発点変異を示す）。 ＥＲＢＢ３体細胞変異。（ｅ〜ｆ）図４（ａ〜ｂ）の拡大および補足図。図４（ａ〜ｆ）は、ＥｒｂＢ３の線形図を提供し、図４ａ、ｃ、およびｅは、Ｎ末端の半分を示し、図４ｂ、ｄ、およびｆは、Ｃ末端の半分を示す。 ＥＲＢＢ３体細胞変異。（ｅ〜ｆ）図４（ａ〜ｂ）の拡大および補足図。図４（ａ〜ｆ）は、ＥｒｂＢ３の線形図を提供し、図４ａ、ｃ、およびｅは、Ｎ末端の半分を示し、図４ｂ、ｄ、およびｆは、Ｃ末端の半分を示す。 ＲＮＡ配列データを用いて評価される、ＥＲＢＢ３変異結腸試料におけるＥＲＢＢ３変異（Ａ、Ｂ）の発現およびＥＲＢＢ２（Ｂ）の発現（Ｓｅｓｈａｇｉｒｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ ｆｕｓｉｏｎｓ．（Ｍａｎｓｕｓｃｒｉｐｔ ｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ２０１１））。 変異部位に渡る保護を描く、複数の配列アラインメントＥＲＢＢ３相同分子種。人類（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）（ＮＰ＿００１９７３．２（完全長配列は、配列番号１２６として開示され、様々な領域は、出現する順にそれぞれ配列番号１３２〜１５１として開示される））、チンパンジー（Ｐ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）（ＸＰ＿５０９１３１．２（完全長配列は、配列番号１３０として開示され、様々な領域は、出現する順にそれぞれ配列番号２１２〜２２９として開示される））、ハイイロオオカミ（Ｃ．ｌｕｐｕｓ）（ＸＰ＿５３８２２６．２（配列番号１３１））、ウシ（Ｂ．ｔａｕｒｕｓ）（ＮＰ＿００１０９６５７５．１（完全長配列は、配列番号１２９として開示され、様々な領域は、出現する順にそれぞれ配列番号１９２〜２１１として開示される））、ハツカネズミ（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ＮＰ＿０３４２８３．１（完全長配列は、配列番号１２７として開示され、様々な領域は、出現する順にそれぞれ配列番号１５２〜１７１として開示される））、およびラット（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ＮＰ＿０５８９１４．２（完全長配列は、配列番号１２８として開示され、様々な領域は、出現する順にそれぞれ配列番号１７２〜１９１として開示される））を、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて整列させた（Ｌａｒｋｉｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ） ２３，２９４７〜２９４８（２００７））。変異残基は、赤色の楕円背景で示される。 ＥＲＢＢ３［ｐｄｂ １Ｍ６Ｂ］およびＥＲＢＢ２［ｐｄｂ １Ｎ８Ｚ］を使用して、（Ａ）「繋留」ＥＲＢＢ３ ＥＣＤ［ｐｄｂ １Ｍ６Ｂ］（Ｂ）の結晶構造、または（Ｂ）ＥＧＦＲ ＥＣＤ二量体（ｐｄｂ １ＩＶＯ）に基づく「非繋留」ＥＲＢＢ３／ＥＲＢＢ２ ＥＣＤヘテロ二量体のモデル上にマップされる、赤色で示される頻繁な（または多発点）体細胞ＥＣＤ変異。ＥＧＦ［ｐｄｂ １ＩＶＯ］（Ｃ）に基づいて、灰色表面として示されるＥＲＢＢ３リガンド。ＥＲＢＢ３キナーゼドメイン［ｐｄｂ ３ＬＭＧ］の構造上にマップされる、赤色で示されるＥＲＢＢ３キナーゼドメイン体細胞変異。＊＝終止コドン ドメイン別に色付けされたＥＲＢＢ３（ｐｄｂ １Ｍ６Ｂ）のＥＣＤ結晶構造上にマップされる、ＥＲＢＢ３体細胞変異。 ＥＲＢＢ３変異は、３Ｄ培地におけるＭＣＦ１０Ａ細胞のＥＧＦ非依存性増殖を支援する。単独またはＥＧＦＲもしくはＥＲＢＢ２のいずれかと一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＭＣＦ１０Ａ細胞は、ＥＧＦ非依存性増殖を示す。ＭＣＦ１０Ａを必要とする研究は、血清、ＥＧＦ、およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ−空ベクター。 ＥＲＢＢ３変異体は、ＥＧＦおよび血清非依存性の足場非依存性増殖を促進する。単独またはＥＧＦＲもしくはＥＲＢＢ２との組み合わせのいずれかで、ＥＲＢＢ３を発現するＭＣＦ１０Ａにより形成されるコロニーを描く代表的画像が示される（ａ）。（ａ）に描かれるアッセイからのコロニーの定量は、ＥＲＢＢ３変異体についてＥＧＦＲ（ｂ）またはＥＲＢＢ２（ｃ）との組み合わせで示される。 単独（Ａ）またはＥＧＦＲ（Ｂ）もしくはＥＲＢＢ２（Ｃ）のいずれかと一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＭＣＦ１０Ａ細胞は、ウェスタンブロットにより評価されるとおり、下流シグナル伝達の上昇を示す。ＭＣＦ１０Ａを必要とする研究は、血清、ＥＧＦ、およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ−空ベクター。 ＥＲＢＢ３変異は、３Ｄ培地におけるＭＣＦ１０Ａ細胞のＥＧＦ非依存性増殖を支援する。単独またはＥＧＦＲもしくはＥＲＢＢ２のいずれかと一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＭＣＦ１０Ａ細胞は、ＥＲＢＢ３／ＥＲＢＢ２を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞と比較して、大きな腺房構造、Ｋｉ６７染色の増加、および移行指数の増加を示す。データは、３つの独立した実験の平均±標準誤差を表す。ＭＣＦ１０Ａを必要とする研究は、血清、ＥＧＦ、およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ−空ベクター。 移動アッセイにおけるトランスウェルからの移動（ａ）、およびこの移動効果の定量（ｂ）に続いて、ＥＲＢＢ２と共に表示のＥＲＢＢ３変異体を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞の代表的な画像を示す。 移動アッセイにおけるトランスウェルからの移動（ａ）、およびこの移動効果の定量（ｂ）に続いて、ＥＲＢＢ２と共に表示のＥＲＢＢ３変異体を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞の代表的な画像を示す。 ＥＲＢＢ３変異体が、ＩＭＣＥコロニー上皮細胞の足場非依存性増殖を支援することを示す。ＥＲＢＢ３自体またはＥＲＢＢ２との組み合わせのいずれかで発現するＩＭＣＥコロニー上皮細胞は、ＥＲＢＢ３−ＷＴ／ＥＲＢＢ２を発現するＩＭＣＥ細胞と比較して、足場非依存性増殖（ａ）、増加したコロニー数（ｂ）、上昇したリン酸シグナル伝達（ｃ、ｄ）、およびインビボ増殖（ｅ）を示した。ＥＶ−空ベクター。 ＥＲＢＢ３変異体が、ＩＭＣＥコロニー上皮細胞の足場非依存性増殖を支援することを示す。ＥＲＢＢ３自体またはＥＲＢＢ２との組み合わせのいずれかで発現するＩＭＣＥコロニー上皮細胞は、ＥＲＢＢ３−ＷＴ／ＥＲＢＢ２を発現するＩＭＣＥ細胞と比較して、足場非依存性増殖（ａ）、増加したコロニー数（ｂ）、上昇したリン酸シグナル伝達（ｃ、ｄ）、およびインビボ増殖（ｅ）を示した。ＥＶ−空ベクター。 ＥＲＢＢ３変異体が、ＩＭＣＥコロニー上皮細胞の足場非依存性増殖を支援することを示す。ＥＲＢＢ３自体またはＥＲＢＢ２との組み合わせのいずれかで発現するＩＭＣＥコロニー上皮細胞は、ＥＲＢＢ３−ＷＴ／ＥＲＢＢ２を発現するＩＭＣＥ細胞と比較して、足場非依存性増殖（ａ）、増加したコロニー数（ｂ）、上昇したリン酸シグナル伝達（ｃ、ｄ）、およびインビボ増殖（ｅ）を示した。ＥＶ−空ベクター。 ＥＲＢＢ３変異体が、ＩＭＣＥコロニー上皮細胞の足場非依存性増殖を支援することを示す。ＥＲＢＢ３自体またはＥＲＢＢ２との組み合わせのいずれかで発現するＩＭＣＥコロニー上皮細胞は、ＥＲＢＢ３−ＷＴ／ＥＲＢＢ２を発現するＩＭＣＥ細胞と比較して、足場非依存性増殖（ａ）、増加したコロニー数（ｂ）、上昇したリン酸シグナル伝達（ｃ、ｄ）、およびインビボ増殖（ｅ）を示した。ＥＶ−空ベクター。 ＥＲＢＢ３変異体は、形質転換し、ＢａＦ３細胞のＩＬ３非依存性生存を促進する。単独またはＥＧＦＲもしくはＥＲＢＢ２のいずれかと一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＢａＦ３細胞は、ＩＬ３非依存性生存を促進する。ＢａＦ３研究は、ＩＬ−３およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ＝空ベクター、Ｍ＝モノマー、およびＤ＝二量体。 ＥＲＢＢ３変異体は、形質転換し、ＢａＦ３細胞のＩＬ３非依存性生存を促進する。単独（Ａ）またはＥＧＦＲ（Ｂ）もしくはＥＲＢＢ２（Ｃ）のいずれかと一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＢａＦ３細胞は、ＥＲＢＢ３およびその下流エフェクターのリン酸化の増加を促進する。ＢａＦ３研究は、ＩＬ−３およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ＝空ベクター、Ｍ＝モノマー、およびＤ＝二量体。 単独またはＥＧＦＲもしくはＥＲＢＢ２との組み合わせのいずれかで、ＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＢａＦ３細胞の足場非依存性増殖の代表的画像。ＢａＦ３研究は、ＩＬ−３およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ＝空ベクター、Ｍ＝モノマー、およびＤ＝二量体。 抗ＮＲＧ１、ＮＲＧ１中和抗体は、ＥＲＢＢ２と共発現したＥＲＢＢ３変異体により促進されるＢａＦ３細胞のＩＬ−３非依存性生存に影響を及ぼさない。ＢａＦ３研究は、ＩＬ−３およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ＝空ベクター、Ｍ＝モノマー、およびＤ＝二量体。 ＢＳ３を使用して細胞表面タンパク質を架橋することに続いて誘導された免疫沈降材料において観測されるとおり、ＮＲＧ１の不在下で、ＢａＦ３細胞におけるＥＲＢＢ３変異体／ＥＲＢＢ２ヘテロ二量体の上昇レベル。ＢａＦ３研究は、ＩＬ−３およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ＝空ベクター、Ｍ＝モノマー、およびＤ＝二量体。 近接結紮アッセイ４０を使用して検出される細胞表面上で観測されるとおり、ＮＲＧ１の不在下で、ＢａＦ３細胞におけるＥＲＢＢ３変異体／ＥＲＢＢ２ヘテロ二量体の上昇レベル。ＢａＦ３研究は、ＩＬ−３およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ＝空ベクター、Ｍ＝モノマー、およびＤ＝二量体。 ＥＲＢＢ３−ＥＲＢＢ２ヘテロ二量体の定量化。近接結紮アッセイからの画像（図１７）を、Ｄｕｏｌｉｎｋ画像ソフトウェアツール（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して分析した。ＥＲＢＢ３およびＥＲＢＢ２を発現する細胞の表示の組み合わせについて、５〜６個の画像フィールドの少なくとも１００個の細胞を、ＥＲＢＢ２／ＥＲＢＢ３二量体から生じるシグナル（赤色の点）を分析した。このアッセイは、ＦＬＡＧ（ＥＲＢＢ３）およびｇＤ（ＥＲＢＢ２）抗体（Ａ）または天然のＥＲＢＢ３およびＥＲＢＢ３抗体（Ｂ）を用いて行った。データは、平均±標準誤差として示される。図２０Ｃは、ＮＲＧ１が、ＥＲＢＢ３−ＷＴまたは変異体を単独で発現するＢａＦ３細胞の生存を支援できなかったことを示す。 ＥＲＢＢ３ ＥＣＤ変異体は、異なる用量の外因性リガンドＮＲＧ１に応答して、増加したＩＬ−３非依存性ＢａＦ３生存を示す。ＢａＦ３研究は、ＩＬ−３の不在下で行った。ＥＶ＝空ベクター、Ｍ＝モノマー、およびＤ＝二量体。 ＥＲＢＢ３変異体は、腫瘍発生を促進し、全体生存の低下につながる。表示のＥＲＢＢ３変異体／ＥＲＢＢ２の組み合わせを発現するＢａＦ３細胞を埋め込んだマウス群のカプランマイヤー生存曲線は、対照ＢａＦ３（ベクター）細胞と比較して、全体生存の低下を示す（アームの場合ｎ＝１０、ログランク検定ｐ＜０．０００１）。 様々なＥＲＢＢ３変異体／ＥＲＢＢ２−ＷＴを発現するＧＦＰ標識されたＢａＦ３細胞を受けるマウスから単離された総骨髄細胞（Ａ）および脾臓細胞（Ｂ）のフローサイトメトリー分析。 表示の研究アームのマウス（ｎ＝３）の骨髄（Ａ）および脾臓（Ｂ）におけるＧＦＰ陽性細胞の平均数が示される。 表示の研究アームのマウス（ｎ＝３）からの脾臓（Ａ）および肝臓（Ｂ）の平均重量が示される。 図２１において分析された同一のマウスからの代表的なＨ＆Ｅ染色された骨髄（上）、脾臓（中）、および肝臓（下）部分。空ベクター動物からの骨髄は、正常な造血細胞からなる。＊＝腫瘍浸潤細胞、Ｒ＝赤脾髄、Ｗ＝白脾髄のリンパ濾胞。無標の脾臓部分において、腫瘍浸潤細胞による破壊に起因する赤／白脾髄構造の喪失がある。スケールバーは、１００μｍに対応する。 ＥＲＢＢ３変異体を発現するＢａＦ３細胞を移植したマウスからの脾臓および肝臓の代表的画像を示す。 ＥＲＢＢ３変異体の発癌活性に対する抗ＥＲＢＢ抗体および低分子阻害剤の有効性。図面に示されるとおり、ＥＲＢＢ２と一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＢａＦ３細胞のＩＬ−３非依存性増殖に対する標的治療の影響。 図面に示されるとおり、ＥＲＢＢ２と一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＢａＦ３細胞の足場非依存性増殖に対する標的治療の影響の代表的画像。 本研究において試験したＥＲＢＢ受容体および様々な標的薬剤を示す概略図。 抗ＥＲＢＢ３抗体は、ＥＲＢＢ３変異体をインビボで効果的に標的する。ＥＲＢＢ２との組み合わせで、ＥＲＢＢ３変異体Ｇ２８４Ｒ（Ａ）またはＱ８０９Ｒ（Ｂ）を発現するＢａＦ３細胞により誘導される白血病様疾患を遮断することにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ ＱＷトラスツズマブ（Ｔｍａｂ）、５０ｍｇ／ｋｇ ＱＷ抗ＥＲＢＢ３．１、および１００ｍｇ／ｋｇ ＱＷ 抗ＥＲＢＢ３．２抗体の有効性。対照抗体治療群（対照Ａｂ）は、４０ｍｇ／ｋｇ ＱＷ抗ブタクサ抗体を受ける。 図面に示されるとおり、ＥＲＢＢ２と一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＢａＦ３細胞の標的治療の影響。治療に使用される抗体および低分子阻害剤の濃度は、図２７に示されるものと同一である。 治療後８時間のＢａＦ３におけるＥＲＢＢ３および下流シグナル伝達分子のリン酸化に対するＥＲＢＢ抗体および低分子阻害剤の影響を示す。２４時間でのこれらの同一薬剤の影響は、図３０に示される。 図面に示されるとおり、抗体による治療に続いて、骨髄（ＢＭ）および膵臓において変異体ＥＲＢＢ３、Ｇ２８４Ｒ（Ａ）、およびＱ８０９Ｒ（Ｂ）を発現する浸潤ＢａＦ３細胞の比率。 示されるとおり、抗体による治療に続いて、ＥＲＢＢ３変異体細胞、Ｇ２８４Ｒ（Ａ）、およびＱ８０９Ｒ（Ｂ）を埋め込まれた動物からの肝臓および脾臓重量。 これらの細胞を埋め込まれたマウスの脾臓および骨髄から単離されたＥＲＢＢ３変異体を発現する浸潤ＧＦＰ陽性ＢａＦ３細胞を示す。 ＥＲＢＢ３変異体は、形質転換し、ＢａＦ３細胞のＩＬ３非依存性生存を促進する。（Ａ）単独またはＥＲＢＢ２もしくはＥＲＢＢ２−ＫＤと一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＢａＦ３細胞のＩＬ３非依存性生存。 ＥＲＢＢ３変異体は、形質転換し、ＢａＦ３細胞のＩＬ３非依存性生存を促進する。（Ｂ）単独またはＥＲＢＢ２もしくはＥＲＢＢ２−ＫＤとの組み合わせのいずれかで、ＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＢａＦ３細胞の足場非依存性増殖の代表的画像。（Ｃ）（Ｂ）に示されるＥＲＢＢ２と共に、ＥＲＢＢ３変異体を発現するＢａＦ３細胞により形成されるコロニーの数を示す棒グラフ。単独またはＥＲＢＢ２−ＫＤとの組み合わせで、ＥＲＢＢ３変異体を発現する細胞により形成されるコロニーはほとんどなかった。 ＥＲＢＢ３変異体は、形質転換し、ＢａＦ３細胞のＩＬ３非依存性生存を促進する。（Ｄ〜Ｆ）単独（Ｄ）またはＥＲＢＢ２（Ｅ）もしくはＥＲＢＢ２−ＫＤ（Ｆ）との組み合わせのいずれかで、ＥＲＢＢ３変異体を発現するＢａＦ３細胞のｐＥＲＢＢ３、ｐＥＲＢＢ２、ｐＡＫＴ、およびｐＥＲＫ状態を示す、ウェスタンブロット。 ＥＲＢＢ３変異体は、形質転換し、ＢａＦ３細胞のＩＬ３非依存性生存を促進する。（Ｇ）抗ＮＲＧ１、ＮＲＧ１中和抗体は、ＥＲＢＢ２と共発現したＥＲＢＢ３変異体により促進されるＢａＦ３細胞のＩＬ−３非依存性生存に影響を及ぼさない。（Ｈ）ＥＲＢＢ３ ＥＣＤ変異体は、漸増用量の外因性ＮＲＧ１に応答して、増加したＩＬ−３非依存性ＢａＦ３生存を示す。ＢａＦ３研究は、ＩＬ−３（Ａ〜Ｈ）およびＮＲＧ１（Ａ〜Ｆ）の不在下で行った。ＥＶ＝空ベクター、Ｍ＝モノマー、およびＤ＝二量体。 ｓｈＲＮＡ媒介性ＥＲＢＢ３ノックダウンは、腫瘍増殖を遅延させる。（Ａ〜Ｊ）ＤＯＸ誘導時にｓｈＲＮＡを標的とする誘導ＥＲＢＢ３を安定的に発現するＣＷ−２およびＤＶ−９０は、非誘導細胞（Ａ〜Ｆ）またはｓｈＲＮＡを標的とするルシフェラーゼを発現する細胞（Ａ〜Ｆ、ＧおよびＩ）と比較して、低レベルのＥＲＢＢ３およびｐＥＲＫ（Ａ、Ｂ）、足場非依存性増殖（Ｃ〜Ｆ）、および低減したインビボ増殖（Ｈ、Ｊ）を示した。（Ｅ、Ｆ）におけるデータは、（Ｃ、Ｄ）に示されるものと同様の画像の複数ファイルから定量化される、形成された足場非依存性コロニーの数を表す。データは、平均±標準誤差として示される。 ｓｈＲＮＡ媒介性ＥＲＢＢ３ノックダウンは、腫瘍増殖を遅延させる。（Ａ〜Ｊ）ＤＯＸ誘導時にｓｈＲＮＡを標的とする誘導ＥＲＢＢ３を安定的に発現するＣＷ−２およびＤＶ−９０は、非誘導細胞（Ａ〜Ｆ）またはｓｈＲＮＡを標的とするルシフェラーゼを発現する細胞（Ａ〜Ｆ、ＧおよびＩ）と比較して、低レベルのＥＲＢＢ３およびｐＥＲＫ（Ａ、Ｂ）、足場非依存性増殖（Ｃ〜Ｆ）、および低減したインビボ増殖（Ｈ、Ｊ）を示した。（Ｅ、Ｆ）におけるデータは、（Ｃ、Ｄ）に示されるものと同様の画像の複数ファイルから定量化される、形成された足場非依存性コロニーの数を表す。データは、平均±標準誤差として示される。 ｓｈＲＮＡ媒介性ＥＲＢＢ３ノックダウンは、腫瘍増殖を遅延させる。（Ａ〜Ｊ）ＤＯＸ誘導時にｓｈＲＮＡを標的とする誘導ＥＲＢＢ３を安定的に発現するＣＷ−２およびＤＶ−９０は、非誘導細胞（Ａ〜Ｆ）またはｓｈＲＮＡを標的とするルシフェラーゼを発現する細胞（Ａ〜Ｆ、ＧおよびＩ）と比較して、低レベルのＥＲＢＢ３およびｐＥＲＫ（Ａ、Ｂ）、足場非依存性増殖（Ｃ〜Ｆ）、および低減したインビボ増殖（Ｈ、Ｊ）を示した。（Ｅ、Ｆ）におけるデータは、（Ｃ、Ｄ）に示されるものと同様の画像の複数ファイルから定量化される、形成された足場非依存性コロニーの数を表す。データは、平均±標準誤差として示される。 ＥｒｂＢ３の核酸配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号２）を提供する。本発明の変異は、枠で囲まれたアミノ酸および枠で囲まれた／下線の付いたコドンにより示される。 ＥｒｂＢ３の核酸配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号２）を提供する。本発明の変異は、枠で囲まれたアミノ酸および枠で囲まれた／下線の付いたコドンにより示される。 ＥｒｂＢ３の核酸配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号２）を提供する。本発明の変異は、枠で囲まれたアミノ酸および枠で囲まれた／下線の付いたコドンにより示される。
本発明の実施は、別段の指示がない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、および生化学の従来技術を用い、これらは当該技術分野の技術の範囲内である。そのような技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｔ．，１９８４）、“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｔ．，１９８７）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，４ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，１９８７）、“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）、および“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）等の文献において完全に説明されている。
定義
別段に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術、表記、および他の科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって広く理解される意味を有する。場合によっては、一般に理解される意味を持つ用語は、明確にするため、および／または即時参照のために本明細書において定義され、本明細書におけるそのような定義の包含は、必ずしも当該技術分野において概して理解されるものを越える実質的な差を表すと解釈されるべきではない。本明細書において説明または参照される技術および手技は、概して、当業者により十分に理解され、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載される分子クローニング方法等の従来の方法論を使用して一般に用いられる。必要に応じて、市販のキットおよび試薬の使用を必要とする手技は、概して、別段の記載がない限り、製造者が定義したプロトコルおよび／またはパラメータに従って実行される。したがって本方法、キット、および使用を説明する前に、本発明が、記載される特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種または属、構成、および試薬に限定されず、それらは当然のことながら異なり得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するよう意図されないことも理解されたい。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数指示対象を含むことに留意すべきである。
本明細書および請求項全体で、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の変型は、述べられた整数または整数の群の包含を暗示するが、任意の他の整数または整数の群の除外を暗示しないことが理解されるであろう。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、本明細書において同義的に使用する際、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによりポリマーに組み込まれ得る任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体等の修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組立て前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって妨害され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識構成成分との共役によって重合後にさらに修飾され得る。他のタイプの修飾として、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上の類似体との置換、例えば、非荷電性連結を持つもの（例えば、メチルリン酸塩、ホスホトリエステル、ホスホアミド酸塩、カルバミン酸塩等）、および荷電性連結を持つもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート）等のヌクレオチド間修飾、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシン等）のペンダント部分を含むもの、挿入剤を持つもの（例えば、アクリジン、ソラレン等）、キレート化剤を含むもの（例えば、金属、放射活性金属、ホウ素、酸化金属等）、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を持つもの（例えば、αアノマー核酸等）、ならびに非修飾形態のポリヌクレオチド（複数可）が挙げられる。さらに、通常は糖に存在するヒドロキシル基のいずれかは、例えば、ホスホン酸基、リン酸基と置き換えられ得るか、標準保護基により保護され得るか、もしくは追加のヌクレオチドへの追加の連結を調製するように活性化され得るか、または固体支持体に共役され得る。５’および３’末端ＯＨは、リン酸化されるか、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分と置換されることができる。他のヒドロキシルは、標準保護基に誘導体化されてもよい。ポリヌクレオチドは、概して当該技術分野において知られている、リボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含むこともでき、例えば、２’−Ｏ−メチル−２’−Ｏ−アリール、２’−フルオロ−もしくは２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、アラビノース、キシロース、またはリキソース等のエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、およびメチルリボシド等の脱塩基ヌクレオシド類似体を含む。１つ以上のホスホジエステル連結は、代替の連結基により置き換えられ得る。これらの代替連結基としては、限定されないが、リン酸塩は、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、”（Ｏ）ＮＲ２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）により置換される実施形態が挙げられ、各ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）であり、任意選択によりエーテル（−−Ｏ−−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含む。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書において言及される全てのポリヌクレオチドに適用する。
「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において使用する際、少なくとも約７ヌクレオチド長および約２５０ヌクレオチド長未満の短い一本鎖ポリヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドは、合成され得る。「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、相互排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の説明は、オリゴヌクレオチドに等しく、完全に適用可能である。
「プライマー」という用語は、核酸にハイブリダイズし、一般に遊離３’−−ＯＨ基を提供することによって、相補的核酸の重合化を可能にすることができる、一本鎖ポリヌクレオチドを指す。
本明細書で使用する際、「遺伝子」という用語は、その鋳型またはメッセンジャーＲＮＡを介して、特定のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に特徴的なアミノ酸の配列をコードする、ＤＮＡ配列を指す。「遺伝子」という用語は、ＲＮＡ産物をコードするＤＮＡ配列も指す。遺伝子という用語は、本明細書においてゲノムＤＮＡを参照して使用する際、介在する非コード領域ならびに調節領域を含み、５’および３’末端を含むことができる。
「体細胞変異」または「体細胞変化」という用語は、ヌクレオチド配列中の変化（例えば、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、変換、または置換）を指し、生殖系細胞とは対照的に、体細胞内で獲得される。この用語は、別段の指示がない限り、ヌクレオチド配列の相補体中の対応する変化も包含する。
「アミノ酸変化」という用語は、参照配列に対して、アミノ酸配列中の変化（例えば、１つ以上のアミノ酸の挿入、置換、または欠失、例えば、内部欠失またはＮ−もしくはＣ−末端切断）を指す。
「変化」という用語は、ヌクレオチド変化またはアミノ酸変化のいずれかを指す。
「体細胞変異に対応するヌクレオチド位置での遺伝的変化」、「体細胞変異に対応するヌクレオチド位置でのヌクレオチド変化」という用語、およびそれらの文法的変形は、該体細胞変異により占拠される相対対応ＤＮＡ位置でのポリヌクレオチド配列中のヌクレオチド変化を指す。この用語は、別段の指示がない限り、ヌクレオチド配列の相補体中の対応する変化も包含する。
「アレイ」または「マイクロアレイ」という用語は、基質上のハイブリダイズ可能なアレイ要素、好ましくはポリヌクレオチドプローブ（例えば、オリゴヌクレオチド）の秩序配置を指す。この基質は、ガラススライド等の固体基質、またはニトロセルロース膜等の半固体基質であり得る。
「増幅」という用語は、参照核酸配列またはその相補体の１つ以上の複製を生成するプロセスを指す。増幅は、線形または指数関数的であり得る（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））。「複製」は、必ずしも鋳型配列に対して完全な配列相補性または同一性を意味しない。例えば、複製は、デオキシイノシン等のヌクレオチド類似体、意図的な配列変化（例えば、鋳型に対してハイブリダイズ可能であるが、完全に相補的ではない配列を含むプライマーを介して導入される配列変化）、および／または増幅中に発生する配列エラーを含むことができる。
「変異特異的オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド変化を含む標的核酸の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指す（多くの場合、置換）。「体細胞変異特異的ハイブリダイゼーション」は、変異特異的オリゴヌクレオチドが、その標的核酸に対してハイブリダイズされるとき、変異特異的オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドが、ヌクレオチド変化と特異的に塩基対合することを意味する。特定のヌクレオチド変化に対して変異特異的ハイブリダイゼーション可能な体細胞変異特異的オリゴヌクレオチドは、その変化に「特異的」であると言われる。
「変異特異的プライマー」という用語は、プライマーである変異特異的オリゴヌクレオチドを指す。
「プライマー伸長アッセイ」という用語は、ヌクレオチドが核酸に付加され、直接または間接的に検出される、より長い核酸または「伸長産物」をもたらすアッセイを指す。ヌクレオチドを付加して、核酸の５’または３’末端を伸長させることができる。
「変異特異的ヌクレオチド取り込みアッセイ」という用語は、プライマーが、（ａ）ヌクレオチド変異の３’または５’である領域での標的核酸にハイブリダイズされ、（ｂ）ポリメラーゼにより伸長され、それによりヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを伸長産物の中に取り込む、プライマー伸長アッセイを指す。
「変異特異的プライマー伸長アッセイ」という用語は、変異特異的プライマーが、標的核酸にハイブリダイズされて伸長される、プライマー伸長アッセイを指す。
「変異特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ」という用語は、（ａ）変異特異的オリゴヌクレオチドが、標的核酸にハイブリダイズされ、（ｂ）ハイブリダイゼーションが、直接または間接的に検出される、アッセイを指す。
「５’ヌクレアーゼアッセイ」という用語は、変異特異的オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションが、ハイブリダイズされたプローブの核酸分解切断を許可し、検出可能なシグナルをもたらす、アッセイを指す。
「分子指標を用いるアッセイ」という用語は、変異特異的オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションが、遊離オリゴヌクレオチドにより放出される検出可能なシグナルのレベルより高い検出可能なシグナルのレベルをもたらす、アッセイを指す。
「オリゴヌクレオチド結紮アッセイ」という用語は、変異特異的オリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが、互いに隣接して標的核酸上でハイブリダイズされ、（介在ヌクレオチドを介して直接または間接的に）一緒に結紮され、結紮産物が、直接または間接的に検出される、アッセイを指す。
「標的配列」、「標的核酸」、または「標的核酸配列」という用語は、概して、ヌクレオチド変化が存在することが疑われるか、または知られている、関心のポリヌクレオチド配列を指し、増幅により生成されるそのような標的核酸の複製を含む。
「検出」という用語は、直接および間接検出を含む、任意の検出手段を含む。
「癌」および「癌性」という用語は、典型的に未制御の細胞増殖により特徴付けられる哺乳類において生理学的状態を指すか、または説明する。本発明により診断される癌は、ＥｒｂＢ３変異の存在により特徴付けられる任意のタイプの癌であり、特に転移性または局所的に進行した切除不可能な癌を含み、制限なしに、胃癌、結腸癌、食道癌、直腸癌、盲腸癌、直腸結腸癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）腺癌、ＮＳＣＬＣ（扁平上皮癌）、腎臓腺癌、黒色腫、卵巣癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肺癌、頭頸部癌、および膵臓癌を含む。
本明細書で使用する際、癌を発症する「危険性のある」対象は、検出可能な疾患または疾患の症状を有しても有しなくてもよく、本明細書に記載される診断方法の前に、検出可能な疾患または疾患の症状を呈しても呈しなくてもよい。「危険性のある」とは、本明細書に記載され、当業者に既知のとおり、癌の発症に相関する測定可能なパラメータである、１つ以上の危険因子を有することを意味する。これらの危険因子のうちの１つ以上を有する対象は、これらの危険因子（複数可）のうちの１つ以上を有しない対象より癌を発症する可能性が高い。
「診断」という用語は、本明細書において、分子または病理状態、疾患、もしくは状態の特定または分類、例えば、癌を指すように使用される。「診断」は、例えば、分子特徴による癌の特定の亜型の分類も指し得る（例えば、特定の遺伝子または核酸領域内のヌクレオチド変異（複数可）により特徴付けられる患者の亜集団）。
「診断を補助する」という用語は、本明細書において、癌の特定型の症状または状態の存在または性質に関する臨床決定を支援する方法を指すように使用される。例えば、癌の診断を補助する方法は、癌を示す１つ以上の遺伝子マーカーの存在もしくは不在、または個人からの生体試料において癌を有する危険性の増加を測定することを含み得る。
「予後診断」という用語は、本明細書において、癌を発症する可能性の予測を指すように使用される。「予測」という用語は、本明細書において、患者が薬物または一式の薬物に好ましく、または好ましくなく応答する可能性を指すように使用される。一実施形態では、この予測は、それらの応答の程度に関する。一実施形態では、予測は、患者が、治療、例えば、特定の治療薬による治療後に、疾患の再発なしに所定の期間の間生存もしくは改善するか否か、および／またはその可能性に関する。本発明の予測方法を臨床的に用いて、任意の特定患者に最適な治療法を選択することにより治療決定を行うことができる。本発明の予測方法は、患者が、例えば、指定の治療薬または組み合わせの投与、外科的介入、ステロイド治療等を含む指定の治療計画等の治療計画に好ましく応答する可能性があるかどうか、または治療計画後の患者の長期生存が可能であるか否かを予測する際に有益なツールである。
本明細書で使用する際、「治療」は、治療される個人または細胞の自然経過を変更させる試みにおける臨床介入を指し、臨床病理学の経過前または経過中に行うことができる。治療の望ましい効果は、疾患またはその状態もしくは症状の発生もしくは再発を防ぐこと、その疾患の状態または症状を軽減すること、その疾患の任意の直接または間接的病理的帰結を低下させること、疾患の進行速度を減少させること、疾患状態を改善または緩和すること、および寛解または改善した予後を達成することを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、疾患または障害の発達を遅延させる試みにおいて有用である。
「癌治療薬」、「癌を治療するために有効な治療薬」、およびそれらの文法的変型は、本明細書において使用する際、有効な量で提供されるとき、癌を有する対象において治療的利益を提供することが知られているか、臨床的に示されているか、または医師により予想される薬剤を指す。一実施形態では、この表現は、有効な量で提供されるとき、癌を有する対象において治療効果を提供することが予想される臨床的に許容されている薬剤として、製造者により市販されているか、または有資格の臨床医により他の方法で使用されている任意の薬剤を含む。様々な非限定的実施形態では、癌治療薬は、化学療法薬、ＨＥＲ二量体化阻害剤、ＨＥＲ抗体、腫瘍関連抗原に対して配向された抗体、抗ホルモン化合物、サイトカイン、ＥＧＦＲ標的薬、抗血管形成剤、チロシンキナーゼ阻害剤、増殖阻害剤および抗体、細胞毒性薬、アポトーシスを誘導する抗体、ＣＯＸ阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、腫瘍胎児性タンパク質ＣＡ１２５を結合する抗体、ＨＥＲ２ワクチン、Ｒａｆまたはｒａｓ阻害剤、リポソームドキソルビシン、トポテカン、タキセン、二重チロシンキナーゼ阻害剤、ＴＬＫ２８６、ＥＭＤ−７２００、ペルツズマブ、トラスツズマブ、エルロチニブ、およびベバシズマブを含む。
「化学療法」は、癌の治療において有用な化学化合物の使用である。化学療法において使用される化学療法薬の例として、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド等のアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン等のアルキルスルホン酸塩；ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ、およびウレドーパ等のアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロールメラミン等のエチレンイミンおよびメチルアメルアミン；ＴＬＫ２８６（ＴＥＬＣＹＴＡ（商標））；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；δ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルチシン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン等のニトロソウレア；クロドロネート等のビスホスホネート；エネジイン抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンγＩＩおよびカリケアミシンωＩＩ等の抗生物質（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）参照）およびアンナマイシン、ＡＤ３２、アルカルビシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ＤＸ−５２−１、エピルビシン、ＧＰＸ−１００、イダルビシン、ＫＲＮ５５００、メノガリル、ダイネミシン（ダイネミシンＡを含む）、エスペラミシン、ネオカルジノスタチン発色団、および関連クロモプロテイン系エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エソルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシンＣ等のミトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、およびゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）等のアントラサイクリン；デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、およびトリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、等の葉酸類似体；フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニン等のプリン類似体、アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、およびフロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）等のピリミジン類似体；カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）等のアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、およびトリロスタン等の抗アドレナル、フォリン酸（ロイコボリン）等の葉酸補液；アセグラトン；ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）等の抗葉酸塩抗新生物薬、ＬＹ２３１５１４ペメトレキセド、メトトレキセート等のジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の抗代謝物、およびＵＦＴ、Ｓ−１およびカペシタビン等のそのプロドラッグ、およびチミジル酸シンターゼ阻害薬、およびラルチトレキセド等のグリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ阻害剤（ＴＯＭＵＤＥＸＲＭ、ＴＤＸ）；エニルウラシル等のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの阻害剤；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルニチン；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサミトシン等のメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモル；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ７ポリサッカリド錯体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡ、およびアングジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；デカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（“Ａｒａ−Ｃ”）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイドおよびタキセン（例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）パクリタキセルのクレモホルを含まないアルブミン設計されたナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ），およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；プラチナ；プラチナ類似体またはシスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン等のプラチナベースの類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；エトポシド（ＶＰ−１６；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標）；ビンカアルカロイド；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸塩；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸等のレチノイド；上記のうちのいずれかの製薬的に許容される塩、酸、または誘導体；ならびにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニソロンの複合療法の省略形）およびＦＯＬＦＯＸ（オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））と５−ＦＵおよびロイコボリンとの組み合わせを用いる治療計画の省略形）が挙げられる。
「医薬製剤」という用語は、その中に含まれる活性成分の生物活性を有効にすることを許すようにそのような形態を取り、製剤が投与される対象に対して受け入れられないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。
「製薬的に許容される担体」は、対象に対して非毒性である、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。製薬的に許容される担体として、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。
「有効な量」は、所望の治療または予防結果を達成するために必要な用量および期間で有効な量を指す。治療薬の「治療上有効な量」は、個人の疾患状態、年齢、性別、および体重等の要因、ならびに抗体が個人において所望の応答を引き出す能力に従って異なり得る。治療上有効な量は、治療上有益な効果が、その治療薬の任意の毒性または悪影響を上回る量でもある。癌の場合、薬物の治療上有効な量は、癌細胞の数を低減し、腫瘍サイズを低減し、周辺器官への癌細胞の浸潤を阻害し（すなわち、ある程度遅延させ、このましくは停止する）、腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止する）、腫瘍増殖をある程度阻害し、および／または癌と関連付けられる症状のうちの１つ以上をある程度軽減し得る。薬物が増殖を防ぎ、および／または既存の癌細胞を殺傷し得る範囲で、細胞増殖抑制性および／または細胞毒性であり得る。「予防上有効な量」は、所望の予防結果を達成するために必要な用量および期間で有効な量を指す。必ずしもそうではないが典型的に、予防的用量は、疾患に先立って、または早期段階で対象において使用されるため、予防上有効な量は、治療上有効な量未満である。
「個人」、「対象」、または「患者」は、脊椎動物である。ある実施形態では、脊椎動物は哺乳類である。哺乳類として、霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類を含む）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、哺乳類はヒトである。
「患者の亜集団」、およびその文法的変型は、本明細書において使用する際、それが属する広義の疾患カテゴリーにおいて患者のサブセットをその他から区別する、１つ以上の独特の測定可能および／または特定可能な特徴を有するとして特徴付けられる患者のサブセットを指す。そのような特徴は、疾患のサブカテゴリー、性別、ライフスタイル、健康履歴、関与する臓器／組織、治療履歴等を含む。一実施形態では、患者の亜集団は、特定のヌクレオチド位置および／または領域にヌクレオチド変異（例えば、体細胞変異）を含む、核酸署名により特徴付けられる。
「対照対象」は、癌を有すると診断されていない、および癌と関連付けられる任意の兆候または症状を患っていない健常な対象を指す。
「試料」という用語は、本明細書において使用する際、例えば、身体的、生化学的、化学的、および／または生理学的特徴に基づいて特徴付けられる、および／または特定される、細胞および／または他の分子的実体を含む、関心の対象から得られる、または派生する組成物を指す。例えば、「疾患試料」という表現およびその変型は、特徴付けられる細胞および／または分子的実体を含むことが予想されるか、または知られている関心の対象から得られる任意の試料を指す。
「組織または細胞試料」は、対象または患者の組織から得られる類似の細胞の集団を意味する。組織または細胞試料の源は、新鮮な、凍結された、および／または保存された器官もしくは組織試料、または生検または吸引物；血液または任意の血液成分；血清、尿、痰、または唾液等の体液からの固体組織であり得る。組織試料は、一次または培養された細胞または細胞株であってもよい。任意選択により、組織または細胞試料は、疾患組織／器官から得られる。組織試料は、保存剤、抗凝結剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質等の自然界において組織と自然に混合されない成分を含み得る。「参照試料」、「参照細胞」、「参照組織」、「対照試料」、「対照細胞」、または「対照組織」は、本明細書において使用する際、本発明の方法または組成物を用いて特定する疾患または状態を患っていないことが知られているか、またはそう考えられている源から得られる試料、細胞、または組織を指す。一実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対象組織は、本発明の組成物または方法を使用して、疾患または状態が特定される同一対象または患者の身体の健常な部分から得られる。一実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対象組織は、本発明の組成物または方法を使用して、疾患または状態が特定される対象または患者ではない個人の身体の健常な部分から得られる。
本明細書における目的で、組織試料の「部分」は、組織試料の単一部分または一片、例えば、組織試料から切断される組織または細胞の薄片を意味する。組織試料の複数区分を採取し、本発明に従って分析にかけてよいことが理解されるが、本発明は、組織試料の同一区分が形態学的および分子的レベルの両方で分析されるか、またはタンパク質および核酸の両方に関して分析される方法を含む。
「相関する（ｃｏｒｒｅｌａｔｅ）」または「相関している（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｎｇ）」は、任意の方法で、第１の分析またはプロトコルの性能および／または結果を、第２の分析またはプロトコルの性能および／または結果と比較することを意味する。例えば、第２のプロトコルを実行する際に第１の分析またはプロトコルの結果を使用してよく、および／または第２の分析またはプロトコルが行われるべきか否かを決定するために、第１の分析またはプロトコルの結果を使用してもよい。遺伝子発現分析またはプロトコルの実施形態に関して、特定の治療計画が行われるべきか否かを決定するために、遺伝子発現分析またはプロトコルの結果を使用してよい。
「低分子」または「有機低分子」は、本明細書において、約５００ダルトン以下の分子量を有する有機分子として定義される。
「標識」という語は、本明細書において使用されるとき、検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能であり得るか（例えば、放射性同位元素標識もしくは蛍光標識）、または酵素標識の場合は、検出可能な産物をもたらす基質化合物もしくは組成物の化学的変化を触媒し得る。検出可能な標識として機能することができる放射性核種として、例えば、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、およびＰｄ−１０９が挙げられる。
本明細書における「約」値またはパラメータに関する言及は、その値またはパラメータ自体を対象にする実施形態を含む（および説明する）。例えば、「約Ｘ」に関する記述は、「Ｘ」に関する記述を含む。
「添付文書」という用語は、治療薬の市販のパッケージに習慣的に含まれる、適応、用途、用量、投与、複合療法、禁忌、および／またはそのような治療薬の使用に関する警告に関する情報を含む指示書を指すように使用される。
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、最も広い意味において同義的に使用され、モノクローナル抗体（例えば、完全長または正常なモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多特異性抗体（例えば、所望の生物活性を呈する限り、二特異性抗体）を含み、（本明細書においてさらに詳述されるとおり）ある抗体断片を含んでもよい。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化、および／または親和性成熟であり得る。「抗体断片」は、正常な抗体の一部分を含み、好ましくは、その抗原結合領域を含む。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体；線形抗体；一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。
関心の抗原に「結合する」本発明の抗体は、その抗体が、抗原を発現するタンパク質または細胞もしくは組織を標的する際に診断および／または治療薬として有用であるように十分な親和性を持つ抗原に結合するものである。抗体の標的分子への結合に関して、特定のポリペプチド標的上の特定のポリペプチドまたはエピトープに「特異的結合」または「特異的に結合する」または「特異的である」という用語は、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することにより測定することができる。例えば、特異的結合は、標的、例えば、過剰な非標識標的に類似する対照分子との競合により決定することができる。この場合、特異的結合は、標識された標的のプローブへの結合が、過剰な非標識標的により競合して阻害される場合に示される。特定の一実施形態では、「特異的に結合する」は、他の特定された非標的ＨＥＲ受容体ではなく、抗体のその特定された標的ＨＥＲ受容体への結合を指す。例えば、抗ＨＥＲ３抗体は、ＨＥＲ３に特異的に結合するが、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ４には特異的に結合しない。ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３二重特異性抗体は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３に特異的に結合するが、ＨＥＲ２またはＨＥＲ４には特異的に結合しない。
「ＨＥＲ受容体」または「ＥｒｂＢ受容体」は、ＨＥＲ受容体ファミリーに属する受容体タンパク質チロシンキナーゼであり、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）受容体を含む。ＨＥＲ受容体は、概して、ＨＥＲリガンドに結合し、および／または別のＨＥＲ受容体分子を用いて二量体化し得る、細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；およびホスホリル化され得るいくつかのチロシン残基を内包するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含む。ＨＥＲ受容体は、「天然配列」ＨＥＲ受容体またはその「アミノ酸配列変異体」であってよい。好ましくは、ＨＥＲ受容体は、天然配列ヒトＨＥＲ受容体である。「ＨＥＲ経路」は、ＨＥＲ受容体ファミリーにより媒介されるシグナル伝達ネットワークを指す。
「ＥｒｂＢ１」、「ＨＥＲ１」、「上皮増殖因子受容体」、および「ＥＧＦＲ」という用語は、本明細書において同義的に使用され、例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：８８１−９１４（１９８７）において開示されるＥＧＦＲを指し、その天然に存在する変異体形態（例えば、Ｕｌｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０９：４１８４２５およびＨｕｍｐｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８７：４２０７−４２１１（１９００）に記載される欠失変異体ＥＧＦＲ）、ならびにＥＧＦＲｖＩＩＩ等のその変異体を含む。ＥＧＦＲの変異体は、欠失、置換、および挿入変異体、例えば、Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００４，３５０：２１２９）、Ｐａｅｚ ｅｔ ａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４，３０４：１４９７）、およびＰａｏ ｅｔ ａｌ（ＰＮＡＳ２００４，１０１：１３３０６）に記載されるものも含む。本明細書において、「ＥＧＦＲ細胞外ドメイン」または「ＥＧＦＲ ＥＣＤ」は、細胞の外側にあり、細胞膜に係留されるか、または循環中のいずれかにあるＥＧＦＲのドメインを指し、その断片を含む。一実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインは、４つのドメイン：「ドメインＩ」（約１〜１５８のアミノ酸残基）、「ドメインＩＩ」（アミノ酸残基１５９〜３３６）、「ドメインＩＩＩ」（アミノ酸残基３３７〜４７０）、および「ドメインＩＶ」（アミノ酸残基４７１〜６４５）を含んでよく、これらの境界は近接し、約１〜３個のアミノ酸だけ異なり得る。
「ＥｒｂＢ２」および「ＨＥＲ２」という表現は、本明細書において同義的に使用され、例えば、Ｓｅｍｂａ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８２：６４９７−６５０１（１９８５）およびＹａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３１９：２３０−２３４（１９８６）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ０３３６３）に記載されるヒトＨＥＲ２タンパク質を指す。「ｅｒ£Ｂ２」という用語は、ヒトＨＥＲ２をコードする遺伝子を指し、「ｎｅｕ」は、ラットｐｉ８５”ｅａをコードする遺伝子を指す。好適なＨＥＲ２は、天然配列ヒトＨＥＲ２である。
本明細書において、「ＨＥＲ２細胞外ドメイン」または「ＨＥＲ２ ＥＣＤ」は、細胞の外側にあり、細胞膜に係留されるか、または循環中のいずれかにあるＨＥＲ２のドメインを指し、その断片を含む。一実施形態では、ＨＥＲ２の細胞外ドメインは、４つのドメイン：「ドメインＩ」（約１〜１９５のアミノ酸残基）、「ドメインＩＩ」（約１９６〜３１９のアミノ酸残基）、「ドメインＩＩＩ」（約３２０〜４８８のアミノ酸残基）、および「ドメインＩＶ」（約４８９〜６３０のアミノ酸残基）（シグナルペプチドを含まない残基番号付け）を含んでよい。Ｇａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１１：４９５−５０５（２００３）、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ａｌｌ：７５６−７６０（２００３）、Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ９０：３１７−３２８（２００４）、およびＰｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ９０：１７４６−１７５０（１９９３）を参照されたい。
「ＥｒｂＢ３」および「ＨＥＲ３」は、例えば、米国特許第５，１８３，８８４号および第５，４８０，９６８号、ならびにＫｒａｕｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８６：９１９３−９１９７（１９８９）に開示される受容体ポリペプチドを指す（図２および３も参照）。
本明細書において、「ＨＥＲ３細胞外ドメイン」または「ＨＥＲ３ ＥＣＤ」、または「ＥｒｂＢ３細胞外ドメイン」は、細胞の外側にあり、細胞膜に係留されるか、または循環中のいずれかにあるＨＥＲ３のドメインを指し、その断片を含む。一実施形態では、ＨＥＲ３の細胞外ドメインは、４つのドメイン：ドメインＩ、ドメインＩＩ、ドメインＩＩＩ、およびドメインＩＶを含み得る。一実施形態では、ＨＥＲ３ ＥＣＤは、アミノ酸１〜６３６（シグナルペプチドを含む番号付け）を含む。一実施形態では、ＨＥＲ３ドメインＩＩＩは、アミノ酸３２８〜５３２（シグナルペプチドを含む番号付け）を含む。
「ＥｒｂＢ４」および「ＨＥＲ４」という用語は、本明細書において、例えば、欧州特許出願第５９９，２７４号、Ｐｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ，９０：１７４６−１７５０（１９９３）、およびＰｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３６６；４７３−４７５（１９９３）に開示される、受容体ポリぺプチドを指し、例えば、１９９９年４月２２日に公開された国際特許第ＷＯ９９／１９４８８号に開示される、そのアイソフォームを含む。「ＨＥＲリガンド」は、ＨＥＲ受容体に結合し、および／または活性化するポリペプチドを意味する。本明細書における特定の関心のＨＥＲリガンドは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）等の天然配列ヒトＨＥＲリガンド（Ｓａｖａｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２４７：７６１２−７６２１（１９７２））、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１０７９−１０８２（１９８４））、神経鞘腫またはケラチノサイト自己分泌増殖因子としても知られるアンフィレグリン（Ｓｈｏｙａｂ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１０７４−１０７６（１９８９）、Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ３４８：２５７−２６０（１９９０）、およびＣｏｏｋ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：２５４７−２５５７（１９９１））、ベタセルリン（Ｓｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１６０４−１６０７（１９９３）、およびＳａｓａｄａ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９０：１１７３（１９９３））、ヘパリン結合上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：９３６−９３９（１９９１））、エピレグリン（Ｔｏｙｏｄａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７４９５−７５００（１９９５）、およびＫｏｍｕｒａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １５：２８４１−２８４８（１９９７））、ヘレグリン（以下参照）、ネウレグリン−２（ＮＲＧ−２）（Ｃａｒｒａｗａｙ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３８７：５１２−５１６（１９９７））、ネウレグリン−３（ＮＲＧ−３）（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ９４：９５６２−９５６７（１９９７））、ネウレグリン−４（ＮＲＧ−４）（Ｈａｒａｒｉ ｅｔ ａｌ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：２６８１−８９（１９９９））、およびクリプト（ＣＲ−Ｉ）（Ｋａｎｍｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３３３０−３３３５（１９９７））である。ＥＧＦＲに結合するＨＥＲリガンドとして、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ベタセルリン、ＨＢ−ＥＧＦ、およびエピレグリンが挙げられる。ＨＥＲ３に結合するＨＥＲリガンドとして、ヘレグリンおよびＮＲＧ−２が挙げられる。ＨＥＲ４に結合可能なＨＥＲリガンドとして、ベタセルリン、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、ＮＲＧ−４、およびヘレグリンが挙げられる。
「ヘレグリン」（ＨＲＧ）は、本明細書において使用するとき、米国特許第５，６４１，８６９号、またはＭａｒｃｈｉｏｎｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：３１２−３１８（１９９３）に開示される、ヘレグリン遺伝子産物によりコードされるポリペプチドを指す。ヘレグリンの例として、ヘレグリン−α、ヘレグリン−β１、ヘレグリン−β２、およびヘレグリン−β３（Ｈｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１２０５−１２１０（１９９２）、および米国特許第５，６４１，８６９号）、ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）（Ｐｅｌｅｓ ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ ６９：２０５−２１６（１９９２）、アセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）（Ｆａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ７２：８０１−８１５（１９９３））、グリア増殖因子（ＧＧＦ）（Ｍｒｃｈｉｏｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：３１２−３１８（１９９３））、感覚および運動神経由来因子（ＳＭＤＦ）（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４５２３−１４５３２（１９９５））、γ−ヘレグリン（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １５：１３８５−１３９４（１９９７））が挙げられる。本明細書において「ＨＥＲ二量体」は、少なくとも２つのＨＥＲ受容体を含む非共有結合した二量体である。そのような錯体は、２つ以上のＨＥＲ受容体を発現する細胞が、ＨＥＲリガンドに曝露され、免疫沈降により単離され、例えば、Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（２０）：１４６６１−１４６６５（１９９４）に記載される、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析されることができるときに形成され得る。サイトカイン受容体サブユニット（例えば、ｇｐｌ３０）等の他のタンパク質は、二量体と関連付けられ得る。
本明細書において「ＨＥＲヘテロ二量体」は、少なくとも２つの異なるＨＥＲ受容体、例えば、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ４、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、またはＨＥＲ２−ＨＥＲ４ヘテロ二量体等を含む非共有結合した二量体である。
「ＨＥＲ阻害剤」または「ＥｒｂＢ阻害剤」または「ＥｒｂＢ拮抗薬」は、ＨＥＲ活性または機能を干渉する薬剤である。ＨＥＲ阻害剤の例として、ＨＥＲ抗体（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４抗体）；ＥＧＦＲ標的薬物；低分子ＨＥＲ拮抗薬；ＨＥＲチロシンキナーゼ阻害剤；ＨＥＲ２およびＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ラパチニブ／ＧＷ５７２０１６）；アンチセンス分子（例えば、ＷＯ２００４／８７２０７参照）；および／またはＭＡＰＫもしくはＡｋｔ等の下流シグナル伝達分子に結合するか、またはその機能を干渉する薬剤が挙げられる。好ましくは、ＨＥＲ阻害剤は、ＨＥＲ受容体に結合する抗体である。一般に、ＨＥＲ阻害剤は、特定のＨＥＲ受容体に特異的に結合し、そのシグナル伝達活性を防止または低減するが、他のＨＥＲ受容体には特異的に結合しない。例えば、ＨＥＲ３拮抗薬は、特異的に結合してその活性を低減するが、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ４には特異的に結合しない。
「ＨＥＲ二量体化阻害剤」または「ＨＤＩ」は、ＨＥＲホモ二量体またはＨＥＲヘテロ二量体の形成を阻害する薬剤である。好ましくは、ＨＥＲ二量体化阻害剤は抗体である。しかしながら、ＨＥＲ二量体化阻害剤は、ペプチドおよび非ペプチド低分子、ならびにＨＥＲホモ二量体またはヘテロ二量体の形成を阻害する他の化学的実体も含む。
「ＨＥＲ二量体化を阻害する」抗体は、基礎となる機序に関わらず、ＨＥＲ二量体の形成を阻害するか、または干渉する抗体である。一実施形態では、そのような抗体は、そのヘテロ二量体結合部位においてＨＥＲ２に結合する。抗体を阻害する二量体化の特定の一例は、ペルツズマブ（Ｐｍａｂ）またはＭＡｂ ２Ｃ４である。ＨＥＲ二量体阻害剤の他の例として、ＥＧＦＲに結合し、１つ以上の他のＨＥＲ受容体とのその二量体化を阻害する抗体（例えば、活性化または非繋留ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６、Ｍａｂ８０６；例えば、Ｊｏｈｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（２９）：３０３７５−３０３８４（２００４））；ＨＥＲ４に結合し、１つ以上の他のＨＥＲ受容体とのその二量体化を阻害する抗体；ペプチド二量体化阻害剤（米国特許第６，４１７，１６８号）；アンチセンス二量体阻害剤等が挙げられる。
本明細書において使用する際、「ＨＥＲ２拮抗薬」または「ＥＧＦＲ阻害剤」は、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そのシグナル伝達活性を予防または低減し、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４に特異的に結合しない化合物を指す。そのような薬剤の例として、ＥＧＦＲに結合する抗体および低分子が挙げられる。ＥＧＦＲに結合する抗体の例
本明細書において使用する際、「ＥＧＦＲ拮抗薬」または「ＥＧＦＲ阻害剤」は、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そのシグナル伝達活性を予防または低減し、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４に特異的に結合しない化合物を指す。そのような薬剤の例として、ＥＧＦＲに結合する抗体および低分子が挙げられる。ＥＧＦＲに結合する抗体の例として、ＭＡｂ ５７９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ ８５０６）、Ｍａｂ ４５５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０７）、Ｍａｂ ２２５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０８）、Ｍａｂ ５２８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０９）（米国特許第４，９４３，５３３号、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ｅｔ ａｌ．参照）、およびキメラ化２２５（Ｃ２２５またはセツキシマブ；ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）および再形成ヒト２２５（Ｈ２２５）（ＷＯ９６／４０２１０、Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．参照）；ＩＭＣ−１１Ｆ８、完全ヒトＥＧＦＲ標的抗体（Ｉｍｃｌｏｎｅ）；ＩＩ型変異体ＥＧＦＲに結合する抗体（米国特許第５，２１２，２９０）；米国特許第５，８９１，９９６号に記載されるＥＧＦＲに結合するヒト化およびキメラ化抗体；およびＡＢＸ−ＥＧＦまたはパニツムマブ等のＥＧＦＲに結合するヒト抗体（ＷＯ９８／５０４３３、Ａｂｇｅｎｉｘ／Ａｍｇｅｎ参照）；ＥＭＤ ５５９００（Ｓｔｒａｇｌｉｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３２Ａ：６３６−６４０（１９９６））；ＥＧＦＲ結合のためにＥＧＦおよびＴＧＦ−αの両方と競合するＥＧＦＲに対して配向されたＥＭＤ７２００（マツズマブ）ヒト化ＥＧＦＲ抗体（ＥＭＤ／Ｍｅｒｃｋ）；ヒトＥＧＦＲ抗体、ＨｕＭａｘ−ＥＧＦＲ（ＧｅｎＭａｂ）；Ｅ１．１、Ｅ２．４、Ｅ２．５、Ｅ６．２、Ｅ２．１１、Ｅ６．３、およびＥ７．６．３として知られ、米国特許６，２３５，８８３号に記載される完全ヒト抗体；およびｍＡｂ ８０６またはヒト化ｍＡｂ ８０６（Ｊｏｈｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．−４４７（Ｍｅｄａｒｅｘ Ｉｎｃ）；およびｍＡｂ ８０６もしくはヒト化ｍＡｂ ８０６（Ｊｏｈｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（２９）：３０３７５−３０３８４（２００４））が挙げられる。抗ＥＧＦＲ抗体は、細胞毒性剤と共有結合され得、したがって免疫抱合体を生成する（例えば、ＥＰ６５９，４３９Ａ２、Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ ＧｍｂＨ参照）。ＥＧＦＲ拮抗薬として、米国特許第５，６１６，５８２号、第５，４５７，１０５号、第５，４７５，００１号、第５，６５４，３０７号、第５，６７９，６８３号、第６，０８４，０９５号、第６，２６５，４１０号、第６，４５５，５３４号、第６，５２１，６２０号、第６，５９６，７２６号、第６，７１３，４８４号、第５，７７０，５９９号、第６，１４０，３３２号、第５，８６６，５７２号、第６，３９９，６０２号、第６，３４４，４５９号、第６，６０２，８６３号、第６，３９１，８７４号、第６，３４４，４５５号、第５，７６０，０４１号、第６，００２，００８号、および第５，７４７，４９８号、ならびに以下のＰＣＴ公開第ＷＯ９８／１４４５１号、第ＷＯ９８／５００３８号、第ＷＯ９９／０９０１６号、および第ＷＯ９９／２４０３７号に記載の化合物等の低分子を含む。特定の低分子ＥＧＦＲ拮抗薬としては、ＯＳＩ−７７４（ＣＰ−３５８７７４、エルロチニブ、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＰＤ １８３８０５（ＣＩ １０３３、２−プロペンアミド、Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］−６−キナゾリニル］−、ジヒドロクロリド、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）；ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）４−（３’−クロロ−４’−フルオロアニリノ）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＺＭ １０５１８０（（６−アミノ−４−（３−メチルフェニル−アミノ）−キナゾリン、Ｚｅｎｅｃａ）；ＢＩＢＸ−１３８２（Ｎ８−３−クロロ−４−フルオロ−フェニル）−Ｎ２−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン−２，８−ジアミン、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）；ＰＫＩ−１６６（（Ｒ）−４−［４−［（１−フェニルエチル）アミノ］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−］−フェノール）；（Ｒ）−６−（４−ヒドロキシフェニル）−４−［（（１−フェニルエチル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン）；ＣＬ−３８７７８５（Ｎ−［４−［（３−ブロモフェニル）アミノ］−６−キナゾリニル］−２−ブチナミド）；ＥＫＢ−５６９（Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−３−シアノ−７−エトキシ−６−キノリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテンアミド）（Ｗｙｅｔｈ）；ＡＧ１４７８（Ｓｕｇｅｎ）；およびＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）が挙げられる。
「ＨＥＲ抗体」は、ＨＥＲ受容体に結合する抗体である。随意選択により、ＨＥＲ抗体は、ＨＥＲ活性化または機能をさらに干渉する。特定のＨＥＲ２抗体として、ペルツズマブおよびトラスツズマブが挙げられる。特定のＥＧＦＲ抗体の例として、セツキシマブおよびパニツムマブが挙げられる。ＨＥＲ抗体に関する特許公開として、ＵＳ５，６７７，１７１、ＵＳ５，７２０，９３７、ＵＳ５，７２０，９５４、ＵＳ５，７２５，８５６、ＵＳ５，７７０，１９５、ＵＳ５，７７２，９９７、ＵＳ６，１６５，４６４、ＵＳ６，３８７，３７１、ＵＳ６，３９９，０６３、ＵＳ２００２／１９２２１ ＩＡ１、ＵＳ６，０１５，５６７、ＵＳ６，３３３，１６９、ＵＳ４，９６８，６０３、ＵＳ５，８２１，３３７、ＵＳ６，０５４，２９７、ＵＳ６，４０７，２１３、ＵＳ６，７１９，９７１、ＵＳ６，８００，７３８、ＵＳ２００４／０２３６０７８Ａ１、ＵＳ５，６４８，２３７、ＵＳ６，２６７，９５８、ＵＳ６，６８５，９４０、ＵＳ６，８２１，５１５、ＷＯ９８／１７７９７，ＵＳ６，３３３，３９８，ＵＳ６，７９７，８１４、ＵＳ６，３３９，１４２、ＵＳ６，４１７，３３５、ＵＳ６，４８９，４４７、ＷＯ９９／３１１４０、ＵＳ２００３／０１４７８８４Ａ１、ＵＳ２００３／０１７０２３４Ａ１、ＵＳ２００５／０００２９２８Ａ１、ＵＳ６，５７３，０４３、ＵＳ２００３／０１５２９８７Ａ１、ＷＯ９９／４８５２７、ＵＳ２００２／０１４１９９３Ａ１、ＷＯ０１／００２４５、ＵＳ２００３／００８６９２４、ＵＳ２００４／００１３６６７Ａ１、ＷＯ００／６９４６０、ＷＯ０１／００２３８、ＷＯ０１／１５７３０、ＵＳ６，６２７，１９６Ｂ１、ＵＳ６，６３２，９７９Ｂ１、ＷＯ０１／００２４４、ＵＳ２００２／００９０６６２Ａ１、ＷＯ０１／８９５６６、ＵＳ２００２／００６４７８５、ＵＳ２００３／０１３４３４４、ＷＯ０４／２４８６６、ＵＳ２００４／００８２０４７、ＵＳ２００３／０１７５８４５Ａ１、ＷＯ０３／０８７１３１、ＵＳ２００３／０２２８６６３、ＷＯ２００４／００８０９９Ａ２、ＵＳ２００４／０１０６１６１、ＷＯ２００４／０４８５２５、ＵＳ２００４／０２５８６８５Ａ１、ＵＳ５，９８５，５５３、ＵＳ５，７４７，２６１、ＵＳ４，９３５，３４１、ＵＳ５，４０１，６３８、ＵＳ５，６０４，１０７、ＷＯ８７／０７６４６、ＷＯ８９／１０４１２、ＷＯ９１／０５２６４、ＥＰ４１２，１１６Ｂ１、ＥＰ４９４，１３５Ｂ１、ＵＳ５，８２４，３１１、ＥＰ４４４，１８１Ｂ１、ＥＰ１，００６，１９４Ａ２、ＵＳ２００２／０１５５５２７Ａ１、ＷＯ９１／０２０６２、ＵＳ５，５７１，８９４、ＵＳ５，９３９，５３１、ＥＰ５０２，８１２Ｂ１、ＷＯ９３／０３７４１、ＥＰ５５４，４４１ Ｂ１、ＥＰ６５６，３６７ Ａ１、ＵＳ５，２８８，４７７、ＵＳ５，５１４，５５４、ＵＳ５，５８７，４５８、ＷＯ９３／１２２２０、ＷＯ９３／１６１８５、ＵＳ５，８７７，３０５、ＷＯ９３／２１３１９、ＷＯ９３／２１２３２、ＵＳ５，８５６，０８９、ＷＯ９４／２２４７８、ＵＳ５，９１０，４８６、ＵＳ６，０２８，０５９、ＷＯ９６／０７３２１、ＵＳ５，８０４，３９６、ＵＳ５，８４６，７４９、ＥＰ ７１１，５６５、ＷＯ９６／１６６７３、ＵＳ５，７８３，４０４、ＵＳ５，９７７，３２２、ＵＳ６，５１２，０９７、ＷＯ９７／００２７１、ＵＳ６，２７０，７６５、ＵＳ６，３９５，２７２、ＵＳ５，８３７，２４３、ＷＯ９６／４０７８９、ＵＳ５，７８３，１８６、ＵＳ６，４５８，３５６、ＷＯ９７／２０８５８、ＷＯ９７／３８７３１、ＵＳ６，２１４，３８８、ＵＳ５，９２５，５１９、ＷＯ９８／０２４６３、ＵＳ５，９２２，８４５、ＷＯ９８／１８４８９、ＷＯ９８／３３９１４、ＵＳ５，９９４，０７１、ＷＯ９８／４５４７９、ＵＳ６，３５８，６８２Ｂ１、ＵＳ２００３／００５９７９０、ＷＯ９９／５５３６７、ＷＯ０１／２００３３、ＵＳ２００２／００７６６９５ Ａ１、ＷＯ００／７８３４７、ＷＯ０１／０９１８７、ＷＯ０１／２１１９２、ＷＯ０１／３２１５５、ＷＯ０１／５３３５４、ＷＯ０１／５６６０４、ＷＯ０１／７６６３０、ＷＯ０２／０５７９１、ＷＯ０２／１１６７７、ＵＳ６，５８２，９１９、ＵＳ２００２／０１９２６５２Ａ１、ＵＳ２００３／０２１１５３０Ａ１、ＷＯ０２／４４４１３、ＵＳ２００２／０１４２３２８、ＵＳ６，６０２，６７０ Ｂ２、ＷＯ０２／４５６５３、ＷＯ０２／０５５１０６、ＵＳ２００３／０１５２５７２、ＵＳ２００３／０１６５８４０、ＷＯ０２／０８７６１９、ＷＯ０３／００６５０９、ＷＯ０３／０１２０７２、ＷＯ０３／０２８６３８、ＵＳ２００３／００６８３１８、ＷＯ０３／０４１７３６、ＥＰ１，３５７，１３２、ＵＳ２００３／０２０２９７３、ＵＳ２００４／０１３８１６０、ＵＳ５，７０５，１５７、ＵＳ６，１２３，９３９、ＥＰ６１６，８１２ Ｂ１、ＵＳ２００３／０１０３９７３、ＵＳ２００３／０１０８５４５、ＵＳ６，４０３，６３０ Ｂ１、ＷＯ００／６１１４５、ＷＯ００／６１１８５、ＵＳ６，３３３，３４８ Ｂ１、ＷＯ０１／０５４２５、ＷＯ０１／６４２４６、ＵＳ２００３／００２２９１８、ＵＳ２００２／００５１７８５ Ａ１、ＵＳ６，７６７，５４１、ＷＯ０１／７６５８６、ＵＳ２００３／０１４４２５２、ＷＯ０１／８７３３６、ＵＳ２００２／００３１５３５ Ａ１、ＷＯ０１／８７３３４、ＷＯ０２／０５７９１、ＷＯ０２／０９７５４、ＵＳ２００３／０１５７０９７、ＵＳ２００２／００７６４０８、ＷＯ０２／０５５１０６、ＷＯ０２／０７０００８、ＷＯ０２／０８９８４２、ＷＯ１１／０７６６８３、およびＷＯ０３／８６４６７が挙げられる。
「ＨＥＲ活性化」は、任意の１つ以上のＨＥＲ受容体の活性化またはリン酸化を指す。一般に、ＨＥＲ活性化は、シグナル変換をもたらす（例えば、ＨＥＲ受容体または基質ポリペプチド中のＨＥＲ受容体ホスホリル化チロシン残基の細胞内キナーゼドメインにより引き起こされる）。ＨＥＲ活性化は、関心のＨＥＲ受容体を含むＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドにより媒介され得る。ＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドは、二量体中のＨＥＲ受容体のうちの１つ以上のキナーゼドメインを活性化し得、それによりＨＥＲ受容体のうちの１つ以上におけるチロシン残基のホスホリル化、および／またはＡｋｔまたはＭＡＰＫ細胞内キナーゼ等の追加の基質ポリペプチド（複数可）におけるチロシン残基のホスホリル化をもたらす。
「ホスホリル化」は、１つ以上のリン酸基（複数可）のＨＥＲ受容体等のタンパク質、またはその基質への付加を指す。
ＨＥＲ２上の「ヘテロ二量体結合部位」は、二量体をそれと共に形成する時にＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４の細胞外ドメイン内の領域と接触するか、または干渉する、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン内の領域を指す。この領域は、ＨＥＲ２のドメインＩＩにおいて見出される。Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５：３１７−３２８（２００４）。
ＨＥＲ２の「ヘテロ二量体結合部位に結合する」ＨＥＲ２抗体は、ドメインＩＩ内の残基に結合し（および任意選択により、ドメインＩおよびＩＩＩ等のＨＥＲ２細胞外ドメインの他のドメイン内の残基にも結合し）、ＨＥＲ２−ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、またはＨＥＲ２−ＨＥＲ４ヘテロ二量体の形成を少なくともある程度立体的に妨害され得る。Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５：３１７−３２８（２００４）は、ＲＣＳＢ タンパク質データバンクに預けられている（ＩＤコードＩＳ７８）ＨＥＲ２−ペルツズマブ結晶構造を特徴付け、ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に結合する例示の抗体を示す。ＨＥＲ２の「ドメインＩＩに結合する」抗体は、ドメインＩＩ内の残基、および任意選択により、ドメインＩおよびＩＩＩ等のＨＥＲ２の他のドメイン（複数可）内の残基に結合する。
本明細書において開示される様々な抗体を説明するために使用されるとき、「単離された」とは、それが発現した細胞または細胞培養から特定され、分離および／または回復された抗体を意味する。その自然環境の汚染成分は、典型的に、ポリペプチドの診断または治療的使用を干渉する材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好適な実施形態では、抗体は、（１）スピニングカップ配列決定器の使用により、Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度で精製されるか、または（２）クマシーブルー、もしくは好ましくは銀染色を使用して、非還元もしくは還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質に精製される。単離した抗体は、ポリペプチド自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組み換え細胞内の原位置に抗体を含む。しかしながら、通常、単離したポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程により調製される。
「ＥｒｂＢ３癌検出薬」は、ＥＲＢＢ３核酸配列またはアミノ酸配列内のＥｒｂＢ３癌と関連付けられる変異を検出することができる薬剤を指す。典型的に、検出薬は、ＥＲＢＢ３配列に特異的に結合することができる試薬を含む。好適な実施形態では、この試薬は、ＥＲＢＢ３核酸配列中のＥｒｂＢ３変異に特異的に結合することができる。一実施形態では、検出薬は、ＥＲＢＢ３核酸配列（例えば、配列番号１または３）に特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、このポリヌクレオチドは、変異を含むＥｒｂＢ３配列に特異的にハイブリダイズする核酸配列を含むプローブである。別の実施形態では、検出薬は、ＥＲＢＢ３アミノ酸配列に特異的に結合することができる試薬を含む。別の実施形態では、アミノ酸配列は、本明細書に記載されるとおり、変異を含む。検出薬は、標識をさらに含み得る。好適な一実施形態では、ＥｒｂＢ３癌検出薬は、ＥｒｂＢ３消化管癌検出薬である。
ＥｒｂＢ３体細胞変異
一態様では、本発明は、対象からの試料において癌と関連付けられるＥｒｂＢ３体細胞変異の存在または不在を検出する方法、ならびに対象からの試料においてこれらの体細胞変異のうちの１つ以上の存在または不在を検出することにより、癌を診断および予後診断する方法を提供し、体細胞変異の存在は、対象が癌を有することを示す。癌の危険性と関連付けられるＥｒｂＢ３体細胞変異は、ゲノム希望の関連研究、修飾因子スクリーン、および家族に基づくスクリーニングを含む戦略を使用して特定した。
本発明の方法において使用するための体細胞変異または変化は、ＥｒｂＢ３中の変化、またはこのタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、この体細胞変異は、遺伝子（またはその調節領域）をコードするゲノムＤＮＡ中に存在する。様々な実施形態では、体細胞変異は、ＥｒｂＢ３（配列番号１、受入番号ＮＭ＿００１９８２）をコードする核酸における置換、挿入、または欠失である。一実施形態では、変化は、ＥｒｂＢ３（配列番号２、受入番号ＮＭ＿００１９７３）のアミノ酸配列中のＭ６０、Ｇ６９、Ｍ９１、Ｖ１０４、Ｙ１１１、Ｒ１３５、Ｒ１９３、Ａ２３２、Ｐ２６２、Ｑ２８１、Ｇ２８４、Ｖ２９５、Ｑ２９８、Ｇ３２５、Ｔ３８９、Ｒ４５３、Ｍ４０６、Ｖ４３８、Ｄ４９２、Ｋ４９８、Ｖ７１４、Ｑ８０９、Ｓ８４６、Ｅ９２８、Ｓ１０４６、Ｒ１０８９、Ｔ１１６４、およびＤ１１９４のうちの１つ以上にアミノ酸置換をもたらす変異である。一実施形態では、置換は、Ｍ６０Ｋ、Ｇ６９Ｒ、Ｍ９１Ｉ、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｍ、Ｙ１１１Ｃ、Ｒ１３５Ｌ、Ｒ１９３＊、Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｓ、Ｐ２６２Ｈ、Ｑ２８１Ｈ、Ｇ２８４Ｈ、Ｇ２８４Ｒ、Ｖ２９５Ａ、Ｑ２９８＊、Ｇ３２５Ｒ、Ｔ３８９Ｋ、Ｍ４０６Ｋ、Ｖ４３８Ｉ、Ｒ４５３Ｈ、Ｄ４９２Ｈ、Ｋ４９８Ｉ、Ｖ７１４Ｍ、Ｑ８０９Ｒ、Ｓ８４６Ｉ、Ｅ９２８Ｇ、Ｓ１０４６Ｎ、Ｒ１０８９Ｗ、Ｔ１１６４Ａ、およびＤ１１９４Ｅ（＊は終止コドンを示す）のうちの少なくとも１つである。様々な実施形態では、少なくとも１つの変化は、ＥｒｂＢ３におけるアミノ酸置換、挿入、切断、または欠失である。いくつかの実施形態では、変化は、アミノ酸置換である。
ＥｒｂＢ３変異の特定
本発明の重要な態様では、ＥｒｂＢ３アミノ酸残基のクラスターが変異多発点として特定されている。具体的には、ドメインＩ（配列番号２の１位〜２１３位）とＩＩ（配列番号２の２１４位〜２８４位）との間のインターフェースに少なくとも１つの置換を含むＥｒｂＢ３は、ＥｒｂＢ３癌を示すことが見出されている。具体的には、体細胞変異の顕著な細胞外ドメイン（ＥＣＤ）クラスターは、少なくともＥｒｂＢ３アミノ酸残基１０４、２３２、および２８４により決定されるドメインＩ／ＩＩインターフェースにおいて見出されている。一実施形態では、このドメインは、アミノ酸残基６０によりさらに決定される。別の実施形態では、体細胞変異のクラスターは、Ｖ１０４〜ＬまたはＭ、Ａ２３２〜Ｖ、およびＧ２８４〜Ｒを含む。他の一実施形態では、このクラスターは、Ｍ６０〜Ｋを含む。
一態様では、本発明は、対象から得られる生体試料において、ヒトＥｒｂＢ３のドメインＩＩとＩＩＩとの間のアミノ酸位置１０４、２３２、および２８４により決定される、インターフェースにおけるアミノ酸変異の存在または不在を決定する方法を提供する。このインターフェースは、６０位によりさらに決定され得る。
体細胞変異の検出
本明細書に記載される検出方法のいずれかにおいて使用する際、核酸は、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡから転写されるＲＮＡ、ＲＮＡから生成されるｃＤＮＡであり得る。核酸は、脊椎動物、例えば、哺乳類に由来し得る。核酸は、それがその源から直接得られるか、またはその源において見出される核酸の複製である場合、特定の源「に由来する」と言われる。
核酸は、その核酸の複製、例えば、増幅から生じる複製を含む。増幅は、ある例では、例えば、変型を検出するための所望の量の材料を得るために望ましい場合がある。次に、増幅産物を以下に記載されるもの等の変型検出法に供して、増幅産物中に変型が存在するかどうかを決定する。
体細胞変異または変型は、当業者に既知のある方法により検出され得る。そのような方法とし、ＤＮＡ配列決定；体細胞変異特異的ヌクレオチド組み込みアッセイおよび体細胞変異特異的プライマー伸長アッセイ等のプライマー伸長分析（例えば、体細胞変異特異的ＰＣＲ、体細胞変異特異的結紮連鎖反応（ＬＣＲ）、およびギャップ−ＬＣＲ）；変異特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、オリゴヌクレオチド結紮アッセイ）；切断剤からの保護を使用して核酸二本鎖中のミスマッチ塩基を検出する切断保護アッセイ；ＭｕｔＳタンパク質結合の分析； 変型および野生型核酸分子の移動性を比較する電気泳動分析；変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ、例えば、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５）；ミスマッチ塩基対におけるＲＮａｓｅ切断の分析；ヘテロ二本鎖ＤＮＡの化学的または酵素的切断の分析；質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）；遺伝子ビット分析（ＧＢＡ）；５’ヌクレアーゼ分析（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標））、および分子指標を用いるアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法の一部は、以下でさらに詳述される。
標的核酸中の変型の検出は、当該技術分野において周知の技術を使用して、標的核酸の分子クローニングおよび配列決定により達成され得る。代替として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の増幅技術を使用して、腫瘍組織からのゲノムＤＮＡ調製から直接標的核酸配列を増幅させることができる。次に、増幅した配列の核酸配列を決定し、そこから変型を特定することができる。増幅技術は当該技術分野において周知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応は、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７，１９８８、米国特許第４，６８３，２０３号、および第４，６８３，１９５号に記載される。
当該技術分野において既知のリガーゼ連鎖反応を使用して、標的核酸配列を増幅させることもできる。例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９（１９８９）を参照されたい。さらに、対立遺伝子特異的ＰＣＲとして知られる技術を修正して、体細胞変異（例えば、置換）を検出するために使用することもできる。例えば、Ｒｕａｎｏ ａｎｄ Ｋｉｄｄ（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：８３９２、ＭｃＣｌａｙ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０１：２００−２０６を参照されたい。この技術のある実施形態では、変異特異的プライマーは、プライマーの３’末端ヌクレオチドが、標的核酸中の特定の変型に相補的である（すなわち、それと特異的に塩基対合することができる）。特定の変型が存在しない場合、増幅産物は観測されない。増幅抵抗変異システム（ＡＲＭＳ）を使用して、変型（例えば、置換）を検出することもできる。ＡＲＭＳは、例えば、欧州特許出願公開第０３３２４３５号において、およびＮｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：７，１９８９において説明される。
変型（例えば、置換）を検出するために有用な他の方法として、（１）変異特異的ヌクレオチド組み込みアッセイ、例えば、単一塩基伸長アッセイ（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０：５４９−５５７、Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０：８５３−８６０、Ｐａｓｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６０６−６１４、およびＹｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．１７：３０５−３１６参照）、（２）変異特異的プライマー伸長アッセイ（例えば、Ｙｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．１７：３０５−３１６、およびＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ，ｖｏｌ．２３，Ｍａｒ．１５，２００３参照）（対立遺伝子特異的ＰＣＲを含む）、（３）５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、Ｄｅ Ｌａ Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３２：Ｓ４８−Ｓ５４（ＴａｑＭａｎ．ＲＴＭ．アッセイについて説明する）、Ｒａｎａｄｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１：１２６２−１２６８、およびＳｈｉ（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：１６４−１７２参照）、（４）分子指標を用いるアッセイ（例えば、Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：４９−５３、およびＭｈｌａｎｇａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４６３−７１）、および（５）オリゴヌクレオチド結紮アッセイ（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４５２７−４５３４、特許出願公開第ＵＳ２００３／０１１９００４ Ａ１、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ０１／９２５７９ Ａ２、および米国特許第６，０２７，８８９号参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
変型は、ミスマッチ検出法により検出されてもよい。ミスマッチは、１００％相補的でないハイブリダイズされた核酸二本鎖である。総相補性の欠損は、欠失、挿入、変換、または置換に起因し得る。ミスマッチ検出法の一例は、ミスマッチ修復検出（ＭＲＤ）アッセイであり、例えば、Ｆａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１４７１７−１４７２２（２００５）およびＦａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１６５７−１６６４（２００１）に記載されている。ミスマッチ切断技術の別の例は、ＲＮａｓｅ保護法であり、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：７５７５，１９８５、およびＭｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２，１９８５に詳細に記載されている。例えば、本発明の方法は、ヒト野生型標的核酸に相補的な標識リボプローブの使用を必要とし得る。組織試料に由来するリボプローブおよび標的核酸は、一緒にアニール（ハイブリダイズ）され、次に二本鎖ＲＮＡ構造中のいくつかのミスマッチを検出することができる、酵素ＲＮａｓｅ Ａを用いて分解される。ミスマッチがＲＮａｓｅ Ａにより検出される場合、ミスマッチの部位で切断する。したがって、アニールされたＲＮＡ調製物が電気泳動ゲルマトリックス上で分離されるとき、ミスマッチが検出され、ＲＮａｓｅ Ａにより切断された場合、リボプローブおよびｍＲＮＡまたはＤＮＡの完全長二本鎖ＲＮＡより小さいＲＮＡ産物が見られる。リボプローブは、変型を有することが疑われる位置を包含するならば、完全長の標的核酸である必要はないが、標的核酸の一部分であり得る。
同様の方法で、ＤＮＡプローブを使用して、例えば、酵素的または化学的切断を介してミスマッチを検出することができる。例えば、Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：４３９７，１９８８、およびＳｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２：９８９，１９７５を参照されたい。代替として、ミスマッチは、マッチ二本鎖に対して、ミスマッチ二本鎖の電気泳動移動度の変動により検出されることができる。例えば、Ｃａｒｉｅｌｌｏ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４２：７２６，１９８８を参照されたい。リボプローブまたはＤＮＡプローブのいずれかを用いて、変型を含むことが疑われる標的核酸は、ハイブリダイゼーション前に増幅され得る。標的核酸の変化は、特にこの変化が欠失および挿入等のグロス再配置である場合、サザンハイブリダイゼーションを使用して検出することもできる。
標的核酸または周囲のマーカー遺伝子の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）プローブを使用して、変型（例えば、挿入または欠失）を検出することができる。挿入および欠失は、標的核酸のクローニング、配列決定、および増幅により検出することもできる。一本鎖構成多型（ＳＳＣＰ）分析を使用して、対立遺伝子の塩基変化変異体を検出することもできる。例えば、Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２７６６−２７７０，１９８９、およびＧｅｎｏｍｉｃｓ，５：８７４−８７９，１９８９を参照されたい。ＳＳＣＰは、ＥｒｂＢ３体細胞変異の検出のために修飾されることができる。ＳＳＣＰは、一本鎖ＰＣＲ産物の電気泳動移行の変化により塩基差を特定する。一本鎖ＰＣＲ産物は、二本鎖ＰＣＲ産物を加熱するか、または他の方法で変性させることにより生成されることができる。一本鎖核酸は、塩基配列に部分的に依存する二次構造を理フォールディングまたは形成し得る。一本鎖増幅産物の異なる電気泳動移動度は、ＳＮＰ位置での塩基配列差に関連する。変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）は、多型ＤＮＡに特融の異なる配列依存性安定度および溶解特性、ならびに変性勾配ゲル中の電気泳動移行パターンにおける対応する差に基づいて、ＳＮＰ対立遺伝子を区別する。
体細胞変異または変型は、マイクロアレイの使用により検出されてもよい。マイクロアレイは、典型的に数千の核酸プローブの配列を使用して、高度に厳密な条件下で、例えば、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ試料を用いてハイブリダイズする、多重技術である。プローブ標的ハイブリダイゼーションは、典型的に、フルオロフォア、銀、または化学発光標識された標的の検出により検出および定量化されて、標的中の核酸配列の相対存在度を決定する。典型的なマイクロアレイでは、プローブは、化学マトリックス（エポキシ−シラン、アミノ−シラン、リシン、ポリアクリルアミド、またはその他）への共有結合により個体表面に取り付けられる。個体表面は、例えば、ガラス、シリコンチップ、または微小ビーズである。様々なマイクロアレイは、市販されており、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．およびＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．により製造されるものを含む。
体細胞変異の検出のための別の方法は、質量分析に基づく。質量分析は、ＤＮＡの４つのヌクレオチドのそれぞれの固有質量を利用する。潜在的な変異含有ＥｒｂＢ３核酸は、体細胞変異を有する核酸の質量の差を測定することにより質量分析によって明確に分析されることができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型）質量分析技術は、体細胞変異を含む核酸等の分枝質量の極めて精密な決定に有用である。核酸分析に対する多数の手法は、質量分析に基づいて開発された。例示の質量分析に基づく方法は、伝統的なゲルベースのフォーマットおよびマイクロアレイ等の他の手法と併せて利用することもできる、プライマー伸長アッセイを含む。
配列特異的リボザイム（米国特許第５，４９８，５３１号）を使用して、リボザイム切断部位の開発または喪失に基づいて体細胞変異を検出することもできる。完全にマッチした配列は、ヌクレアーゼ切断消化アッセイまたは溶解温度の差により、ミスマッチ配列から区別され得る。変異が制限酵素切断部位に影響を及ぼす場合、変異は、制限酵素消化パターンにおける変化、およびゲル電気泳動により決定される核酸断片長の対応する変化により特定することができる。
本発明の他の実施形態では、タンパク質に基づく検出技術を使用して、本明細書に開示される遺伝的変型を有する遺伝子によりコードされる変異タンパク質を検出する。タンパク質の変異形態の存在の決定は、当該技術分野において既知の任意の適切な技術、例えば、電気泳動（例えば、変性または非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動；２次元ゲル電気泳動；キャピラリー電気泳動、および等電点電気泳動）、クロマトグラフィー（例えば、サイジングクロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および陽イオン交換ＨＰＬＣ）、および質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析、およびタンデム質量分析）を使用して実行することができる。例えば、Ａｈｒｅｒ ａｎｄ Ｊｕｎｇａｂａｕｅｒ（２００６）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ｂ．Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．８４１：１１０−１２２、およびＷａｄａ（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ｂ．７８１：２９１−３０１）を参照されたい。適切な技術は、検出される変型の性質に部分的に基づいて選択され得る。例えば、置換アミノ酸が元のアミノ酸とは異なる電荷を有するアミノ酸置換をもたらす変型は、等電点電気泳動法により検出されることができる。高電圧でｐＨ勾配を有するゲルを介したポリペプチドの等電点電気泳動法は、それらのｐＨによりタンパク質を分離する。ｐＨ勾配ゲルは、野生型タンパク質を含む同時走行ゲルと比較することができる。変型が新たなタンパク質分解切断部位の生成、または既存のものの廃絶をもたらす場合、試料は、適切な電気泳動、クロマトグラフィー、または質量分析技術を使用して、タンパク分解に供された後、ペプチドマッピングに供され得る。変型の存在は、エドマン分解またはある形態の質量分析等のタンパク質配列決定技術を使用して検出されてもよい。
これらの技術の組み合わせを使用する当該技術分野において既知の方法が使用されてもよい。例えば、ＨＰＬＣ顕微鏡タンデム質量分析技術では、タンパク分解は、タンパク質上で行われ、得られるペプチド混合物は、逆相クロマトグラフ分離により分離される。次にタンデム質量分析を行い、そこから収集したデータを分析する。（Ｇａｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７２：７５７−７６３）。別の例では、非変性ゲル電気泳動は、ＭＡＬＤＩ質量分析と組み合わされる（Ｍａｔｈｅｗ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１６：１３５−１３７）。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、タンパク質に特異的に結合する抗体またはペプチド等の試薬を使用して、試料から単離されてよく、次にさらに分析して、上で開示された技術のうちのいずれかを使用して、遺伝的変型の存在または不在を決定する。
代替として、試料中の変異タンパク質の存在は、本発明による遺伝的変異を有するタンパク質に特異的な抗体、つまり、変型を有するタンパク質に特異的に結合するが、変型を欠失するタンパク質の形態には結合しない抗体に基づいて、免疫親和性アッセイにより検出され得る。そのような抗体は、当該技術分野において既知の任意の適切な技術により生成されることができる。抗体を使用して、溶液試料からの特定タンパク質を免疫沈降させるか、または、例えば、ポリアクリルアミドゲルにより分離されたタンパク質を免疫ブロットすることができる。免疫細胞化学的方法は、組織または細胞中の特定のタンパク質変型を検出する際に使用することもできる。例えば、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量測定アッセイ（ＩＲＭＡ）、および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）を含む、免疫結合他の周知の抗体に基づく技術を使用することもでき、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用するサンドイッチアッセイを含む。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号および第４，４８６，５３０号を参照されたい。
遺伝子マーカーの特定
体細胞変異と生殖細胞変異との間の関係は、癌において調査した（例えば、Ｚａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２００３ Ｆｅｂ；１９９（２）：１４６−５１参照）。本明細書に開示されるＥｒｂＢ３体細胞変異は、癌の発達と関連付けられる遺伝子マーカーを特定するために有用である。例えば、本明細書に開示される体細胞変異を使用して、生殖細胞中の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）および連鎖不均衡である任意の追加のＳＮＰを特定することができる。実際に、癌と関連付けられる第１のＳＮＰと連鎖不均衡である任意の追加のＳＮＰは、癌と関連付けられる。指定のＳＮＰと癌との間の関連が実証されると、癌と関連付けられる追加のＳＮＰの発見は、この特定領域内のＳＮＰの密度を増加させるために非常な関心であり得る。
追加のＳＮＰを特定し、連鎖不均衡分析を行うための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、本明細書に開示されるＳＮＰと連鎖不均衡である追加のＳＮＰの特定は、（ａ）複数の個人からの第１のＳＮＰを含むか、または取り囲むゲノム領域からの断片を増幅させるステップと、（ｂ）該第１のＳＮＰを内包するか、または取り囲むゲノム領域内の第２のＳＮＰを特定するステップと、（ｃ）該第１のＳＮＰと該第２のＳＮＰとの間の連鎖不均衡分析を行うステップと、（ｄ）該第２のＳＮＰを、該第１のマーカーと連鎖不均衡であるとして選択するステップと、を必要とし得る。この方法は、ステップ（ａ）に先行して、複数の個人からの体細胞変異を含むか、または取り囲むゲノム領域からの断片を増幅させること、および該体細胞変異を内包するか、または取り囲むゲノム領域内のＳＮＰを特定すること等の、あるステップを含むように修正され得る。
ＥｒｂＢ３癌検出薬
一態様では、本発明は、ＥｒｂＢ３癌検出薬を提供する。一実施形態では、この検出薬は、図３９に示されるＥｒｂＢ３配列（配列２のアミノ酸配列または配列番号３の核酸配列）に特異的に結合することができる試薬を含む。別の実施形態では、検出薬は、図２（配列番号１）または図３９（配列番号３）に示されるＥＲＢＢ３核酸配列に特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを含む。好適な実施形態では、ポリヌクレオチドは、図３９に示される変異を含むＥｒｂＢ３核酸配列に特異的にハイブリダイズする、核酸配列を含む（配列番号３）。
別の態様では、ＥｒｂＢ３癌検出薬は、特定の式を有するポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、ポリヌクレオチド式は、
Figure 2018085998
であり、式中、
Ｘは任意の核酸であり、ａは約０〜約２５０（すなわち、５’方向）であり、
ＹはＥｒｂＢ３変異コドンを表し、
Ｚは任意の核酸であり、ｂは約０〜約２５０（すなわち、３’方向）である。
別の実施形態では、ａまたはｂは、約２５０以下、または５’（ａの場合）もしくは３’（ｂの場合）方向である。いくつかの実施形態では、ａまたはｂは、約０〜約２５０であり、ａまたはｂは、約０〜約２４５、約０〜約２４０、約０〜約２３０、約０〜約２２０、約０〜約２１０、約０〜約２００、約０〜約１９０、約０〜約１８０、約０〜約１７０、約０〜約１６０、約０〜約１５０、約０〜約１４０、約０〜約１３０、約０〜約１２０、約０〜約１１０、約０〜約１００、約０〜約９０、約０〜約８０、約０〜約７０、約０〜約６０、約０〜約５０、約０〜約４５、約０〜約４０、約０〜約３５、約０〜約３０、約０〜約２５、約０〜約２０、約０〜約１５、約０〜約１０、または約０〜約５である。
他の一実施形態では、ａまたはｂは、約３５以下である。いくつかの実施形態では、ａまたはｂは、約０〜約３５、約０〜約３４、約０〜約３３、約０〜約３２、約０〜約３１、約０〜約３０、約０〜約２９、約０〜約２８、約０〜約２７、
約０〜約２６、約０〜約２５、約０〜約２４、約０〜約２３、約０〜約２２、約０〜約２１、約０〜約２０、約０〜約１９、約０〜約１８、約０〜約１７、約０〜約１６、約０〜約１５、約０〜約１４、約０〜約１３、約０〜約１２、約０〜約１１、約０〜約１０、約０〜約９、約０〜約８、約０〜約７、約０〜約６、約０〜約５、約０〜約４、約０〜約３、または約０〜約２である。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の６０位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＡＡＡおよびＡＡＧからなる群から選択される。これは、結腸癌と関連付けられるＭ６０Ｋ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の１０４位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＡＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、およびＴＴＧからなる群から選択される。これは、結腸癌、胃癌、卵巣癌および乳癌と関連付けられるＶ１０４ＭまたはＶ１０４Ｌ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の１１１位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＴＧＴおよびＴＧＣからなる群から選択される。これは、胃癌と関連付けられるＹ１１１Ｃ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の１３５位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、およびＴＴＧからなる群から選択される。これは、胃癌と関連付けられるＲ１３５Ｌ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の１９３位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＴＡＡ、ＴＡＧ、およびＴＧＡからなる群から選択される。これは、結腸癌と関連付けられるＲ１９３＊（＊は終止コドンである）変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の２３２位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ、およびＧＴＧからなる群から選択される。これは、胃癌と関連付けられるＡ２３２Ｖ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の２６２位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＣＡＴ、ＣＡＣ、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、およびＡＧＣからなる群から選択される。これは、結腸癌および／または胃癌と関連付けられるＰ２６２ＨまたはＰ２６２Ｓ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の２８４位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧからなる群から選択される。これは、結腸癌または肺癌（ＮＳＣＬＣ腺癌）と関連付けられるＧ２８４Ｒ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の２９５位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、およびＧＣＧからなる群から選択される。これは、結腸癌と関連付けられるＶ２９５Ａ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の３２５位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧからなる群から選択される。これは、結腸癌と関連付けられるＧ３２５Ｒ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の４０６位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＧＡ、ＡＣＧ、ＡＡＡおよびＡＡＧからなる群から選択される。これは、胃癌と関連付けられるＭ４０６ＫまたはＭ４０６Ｔ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の４５３位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＣＡＴおよびＣＡＣからなる群から選択される。これは、胃癌と関連付けられるＲ４５３Ｈ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の４９８位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＡＴＴ、ＡＴＣ、およびＡＴＡからなる群から選択される。これは、胃癌と関連付けられるＫ４９８Ｉ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の８０９位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧからなる群から選択される。これは、胃癌と関連付けられるＱ８０９Ｒ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の８４６位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＡＴＴ、ＡＴＣ、およびＡＴＡからなる群から選択される。これは、結腸癌と関連付けられるＳ８４６Ｉ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の９２８位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、およびＧＧＧからなる群から選択される。これは、胃癌および乳癌と関連付けられるＥ９２８Ｇ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の１０８９位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＴＧＧである。これは、胃癌と関連付けられるＲ１０８９Ｗ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の１１６４位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、およびＧＣＧからなる群から選択される。これは、結腸癌と関連付けられるＴ１１６４Ａ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の４９２位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＣＡＴおよびＣＡＣからなる群から選択される。これは、肺癌（ＮＳＣＬＣ腺癌）と関連付けられるＤ４９２Ｈ変異に対応する。
他の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の７１４位においてアミノ酸をコードするＥｒｂＢ３核酸配列にハイブリダイズし、Ｙは、ＡＴＧである。これは、肺癌（ＮＳＣＬＣ腺癌）と関連付けられるＶ７１４Ｍ変異に対応する。
癌の診断、予後診断、および治療
本発明は、対象からの試料中の本明細書に開示される癌と関連付けられる１つ以上の体細胞変異または変型の存在を検出することにより、対象における癌の診断または予後診断の方法を提供する。本発明の方法において使用するための体細胞変異または変型は、ＥｒｂＢ３中の変型、またはこのタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、この体細胞変異は、遺伝子（またはその調節領域）をコードするゲノムＤＮＡ中に存在する。様々な実施形態では、体細胞変異は、ＥｒｂＢ３をコードする核酸における置換、挿入、または欠失である。一実施形態では、変型は、ＥｒｂＢ３（配列番号２）のアミノ酸配列中のＭ６０、Ｇ６９、Ｍ９１、Ｖ１０４、Ｙ１１１、Ｒ１３５、Ｒ１９３、Ａ２３２、Ｐ２６２、Ｑ２８１、Ｇ２８４、Ｖ２９５、Ｑ２９８、Ｇ３２５、Ｔ３８９、Ｒ４５３、Ｍ４０６、Ｖ４３８、Ｄ４９２、Ｋ４９８、Ｖ７１４、Ｑ８０９、Ｓ８４６、Ｅ９２８、Ｓ１０４６、Ｒ１０８９、Ｔ１１６４、およびＤ１１９４のうちの１つ以上にアミノ酸置換をもたらす変異である。一実施形態では、置換は、ＥｒｂＢ３（配列番号２）のアミノ酸配列中のＭ６０Ｋ、Ｇ６９Ｒ、Ｍ９１Ｉ、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｍ、Ｙ１１１Ｃ、Ｒ１３５Ｌ、Ｒ１９３＊、Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｓ、Ｐ２６２Ｈ、Ｑ２８１Ｈ、Ｇ２８４Ｈ、Ｇ２８４Ｒ、Ｖ２９５Ａ、Ｑ２９８＊、Ｇ３２５Ｒ、Ｔ３８９Ｋ、Ｍ４０６Ｋ、Ｖ４３８Ｉ、Ｒ４５３Ｈ、Ｄ４９２Ｈ、Ｋ４９８Ｉ、Ｖ７１４Ｍ、Ｑ８０９Ｒ、Ｓ８４６Ｉ、Ｅ９２８Ｇ、Ｓ１０４６Ｎ、Ｒ１０８９Ｗ、Ｔ１１６４Ａ、およびＤ１１９４Ｅ（＊は終止コドンを示す）のうちの少なくとも１つである。一実施形態では、変異は、胃癌、結腸癌、食道癌、直腸癌、盲腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）腺癌、ＮＳＣＬＣ（扁平上皮癌）、腎癌、黒色腫、卵巣癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肺癌、および膵臓癌からなる群から選択される、ＥｒｂＢ３癌の存在を示す。
他の一実施形態では、変化は、ＥｒｂＢ３（配列番号２）のアミノ酸配列中のＭ６０、Ｖ１０４、Ｙ１１１、Ｒ１５３、Ｒ１９３、Ａ２３２、Ｐ２６２、Ｖ２９５、Ｇ３２５、Ｍ４０６、Ｒ４５３、Ｄ４９２、Ｋ４９８、Ｖ７１４、Ｑ８０９、Ｒ１０８９、およびＴ１１６４のうちの１つ以上にアミノ酸置換をもたらす変異である。別の実施形態では、置換は、ＥｒｂＢ３（配列番号２）のアミノ酸配列中のＭ６０Ｋ、Ｖ１０４Ｍ、Ｖ１０４Ｌ、Ｙ１１１Ｃ、Ｒ１５３Ｌ、Ｒ１９３＊、Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｓ、Ｐ２６２Ｈ、Ｖ２９５Ａ、Ｇ３２５Ｒ、Ｍ４０６Ｋ、Ｒ４５３Ｈ、Ｄ４９２Ｈ、Ｋ４９８Ｉ、Ｖ７１４Ｍ、Ｑ８０９Ｒ、Ｒ１０８９Ｗ、およびＤ１１９４Ｅ（＊は終止コドンを示す）のうちの少なくとも１つである。一実施形態では、変異は、胃癌、結腸癌、食道癌、直腸癌、盲腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）腺癌、ＮＳＣＬＣ（扁平上皮癌）、腎癌、黒色腫、卵巣癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肺癌、および膵臓癌からなる群から選択される、ＥｒｂＢ３癌の存在を示す。
他の一実施形態では、変化は、ＥｒｂＢ３（配列番号２）のアミノ酸配列中のＶ１０４、Ｙ１１１、Ｒ１５３、Ａ２３２、Ｐ２６２、Ｇ２８４、Ｔ３８９、Ｒ４５３、Ｋ４９８、およびＱ８０９のうちの１つ以上にアミノ酸置換をもたらす変異である。別の実施形態では、置換は、ＥｒｂＢ３（配列番号２）のアミノ酸配列中のＶ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｍ、Ｙ１１１Ｃ、Ｒ１５３Ｌ、Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｓ、Ｐ２６２Ｈ、Ｇ２８４Ｒ、Ｔ３８９Ｋ、Ｒ４５３Ｈ、Ｋ４９８Ｉ、およびＱ８０９Ｒのうちの少なくとも１つである。一実施形態では、ＥｒｂＢ３変異は、消化管癌の存在を示す。別の実施形態では、消化管癌は、胃癌、結腸癌、食道癌、直腸癌、盲腸癌、および結腸直腸癌のうちの１つである。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｍ６０に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｍ６０Ｋである。他の一実施形態では、変異は、結腸癌の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｖ１０４に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｖ１０４ＬまたはＶ１０４Ｍである。他の一実施形態では、変異は、胃癌または結腸癌の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｖ１１１に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｖ１１１Ｃである。他の一実施形態では、変異は、胃癌の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｒ１３５に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｒ１３５Ｌである。他の一実施形態では、変異は、胃癌の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｒ１９３に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｒ１９３＊である。他の一実施形態では、変異は、結腸癌の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ａ２３２に存在する。別の実施形態では、置換は、Ａ２３２Ｖである。他の一実施形態では、変異は、胃癌の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｐ２６２に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｐ２６２ＳまたはＰ２６２Ｈである。他の一実施形態では、変異は、結腸癌または胃癌の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｇ２８４に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｇ２８４Ｒである。他の一実施形態では、変異は、肺癌（非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）腺癌）または結腸癌の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｖ２９５に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｖ２９５Ａである。他の一実施形態では、変異は、結腸癌の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｇ３２５に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｇ３２５Ｒである。他の一実施形態では、変異は、結腸癌の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｍ４０６に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｍ４０６Ｋである。他の一実施形態では、変異は、胃癌の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｒ４５３に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｒ４５３Ｈである。他の一実施形態では、変異は、胃癌または結腸癌の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｋ４９８に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｋ４９８Ｉである。他の一実施形態では、変異は、胃癌の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｄ４９２に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｄ４９２Ｈである。他の一実施形態では、変異は、肺癌（非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）腺癌）の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｖ７１４に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｖ７１４Ｍである。他の一実施形態では、変異は、肺癌（非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）扁平上皮癌）の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｑ８０９に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｑ８０９Ｒである。他の一実施形態では、変異は、胃癌の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｓ８４６に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｓ８４６Ｉである。他の一実施形態では、変異は、結腸癌の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｒ１０８９に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｒ１０８９Ｗである。他の一実施形態では、変異は、胃癌の存在を示す。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３置換は、Ｔ１１６４に存在する。別の実施形態では、置換は、Ｔ１１６４Ａである。他の一実施形態では、変異は、結腸癌の存在を示す。
様々な実施形態では、少なくとも１つの変型は、ＥｒｂＢ３におけるアミノ酸置換、挿入、切断、または欠失である。いくつかの実施形態では、変型は、アミノ酸置換である。これらの変型のうちの任意の１つ以上は、以下に記載される検出、診断、および予後診断の方法のうちのいずれかにおいて使用され得る。
一実施形態では、本発明は、対象における癌を示す体細胞変異の存在または不在を検出するための方法を提供し、（ａ）対象からの試料を、ＥｒｂＢ３遺伝子における体細胞変異の存在または不在を検出することができる試薬と接触させることと、（ｂ）変異の存在または不在を決定することと、を含み、変異の存在は、対象が、癌を患っているか、または発症する危険性があることを示す。
本方法において使用するための試薬は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、およびリボザイムであり得る。いくつかの実施形態では、試薬は標識される。標識としては、例えば、放射性同位元素標識、蛍光標識、生物発光標識、または酵素標識が挙げられ得る。検出可能な標識として機能することができる放射性核種として、例えば、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、およびＰｄ−１０９が挙げられる。
対象における癌を示す体細胞変異を検出するための方法も提供され、対象からの生体試料を、ＥｒｂＢ３遺伝子における体細胞変異の存在または不在を検出することを含み、変異の存在は、対象が、癌を患っているか、または発症する危険性があることを示す。本方法の様々な実施形態では、１つ以上の体細胞変異の存在の検出は、直接配列決定、変異特異的プローブハイブリダイゼーション、変異特異的プライマー伸長、変異特異的増幅、変異特異的ヌクレオチド組み込み、５’ヌクレアーゼ分解、分子指標アッセイ、オリゴヌクレオチド結紮アッセイ、サイズ分析、および一本鎖構成多型からなる群から選択されるプロセスにより実行される。いくつかの実施形態では、試料からの核酸は、１つ以上の変異の存在を決定する前に増幅される。
本発明は、対象における癌を診断または予後診断するための方法をさらに提供し、（ａ）対象からの試料を、ＥｒｂＢ３遺伝子における体細胞変異の存在または不在を検出することができる試薬と接触させることと、（ｂ）変異の存在または不在を決定することと、を含み、変異の存在は、対象が、癌を患っているか、または発症する危険性があることを示す。
本発明は、対象における癌を診断または予後診断する方法をさらに提供し、対象からの生体試料を、ＥｒｂＢ３遺伝子における体細胞変異の存在または不在を検出することを含み、遺伝子変異の存在は、対象が、癌を患っているか、または発症する危険性があることを示す。
本発明は、対象における癌を診断または予後診断する方法も提供し、（ａ）対象からの試料を含む核酸を得ることと、（ｂ）その試料を分析して、ＥｒｂＢ３遺伝子における少なくとも１つの体細胞変異の存在を検出することと、を含み、遺伝的変異の存在は、対象が、癌を患っているか、または発症する危険性があることを示す。
いくつかの実施形態では、診断または予後診断の方法は、対象を癌について１つ以上の追加の診断検査に供すること、例えば、１つ以上の追加のマーカーをスクリーニングすること、または対象を撮像手技に供することをさらに含む。
上記方法のうちのいずれかは、この方法の結果に基づいて、対象の癌を治療することをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、試料中の少なくとも１つの体細胞変異の存在を検出することをさらに含む。一実施形態では、第１の体細胞変異の存在は、少なくとも１つの追加の体細胞変異の存在と一緒に、第１の体細胞変異を有し、少なくとも１つの追加の体細胞変異の存在を欠く対象と比較して、癌の危険性の増加を示す。
癌の診断の危険性が高い対象を特定する方法も提供され、（ａ）対象からの生体試料を、ＥｒｂＢ３遺伝子における第１の体細胞変異の存在または不在を検出することと、（ｂ）少なくとも１つの追加の体細胞変異の存在または不在を決定することと、を含み、第１および少なくとも１つの追加の体細胞変異の存在は、対象が、この第１および少なくとも１つの追加の体細胞変異の存在を欠く対象と比較して、癌の診断の危険性が高いことを示す。
対象における癌の亜表現型の診断および／または予後診断を補助する方法も提供され、この方法は、対象に由来する生体試料においてＥｒｂＢ３をコードする遺伝子における体細胞変異の存在を検出することを含む。一実施形態では、体細胞変異は、ＥｒｂＢ３（配列番号２）のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｇ２８４Ｒをもたらし、癌の亜表現型は、Ｇ２８４Ｒ変異体ＥｒｂＢ３を発現する細胞のＨＥＲリガンド非依存性シグナル伝達により少なくとも部分的に特徴付けられる。別の実施形態では、体細胞変異は、ＥｒｂＢ３（配列番号２）のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｑ８０９Ｒをもたらし、癌の亜表現型は、Ｑ８０９Ｒ変異体ＥｒｂＢ３を発現する細胞のＨＥＲリガンド非依存性シグナル伝達により少なくとも部分的に特徴付けられる。
本発明は、ＥｒｂＢ受容体を標的とする癌治療薬に対する対象の応答を予測する方法をさらに提供し、対象から得られる生体試料においてＥｒｂＢ３（配列番号２）のアミノ酸配列中のアミノ酸変異をもたらし、体細胞変異の存在は、ＥｒｂＢ受容体を標的とする治療薬に対する応答を示す。一実施形態では、治療薬は、ＥｒｂＢ拮抗薬または結合剤、例えば、抗ＥｒｂＢ抗体である。
上記の方法のいずれかにおいて使用するための生体試料は、当業者に既知のある方法を使用して得られ得る。生体試料は、脊椎動物、具体的には、哺乳類から得られ得る。ある実施形態では、生体試料は、細胞または組織を含む。標的核酸（またはコードされるポリペプチド）の変化は、組織試料から検出され得るか、または血液、血清、尿、痰、唾液、粘膜、および組織等の他の体試料から検出され得る。そのような体試料をスクリーニングすることにより、癌等の疾患について簡素な早期診断を達成することができる。さらに、治療の進行は、標的核酸（またはコードされるポリペプチド）の変化についてそのような体試料を検査することにより、より容易に監視されることができる。いくつかの実施形態では、生体試料は、癌を有することが疑われる個人から得られる。
対象または該対象から得られる生体試料が、本明細書に開示される体細胞変異を含むことを決定した後、有効な量の適切な癌治療薬が、対象における癌を治療するために対象に投与され得ることが企図される。
上記の方法に従って、ＥｒｂＢ３中に体細胞変異を含む核酸における１つ以上の変異の存在を検出することにより、哺乳類における癌の診断を補助するための方法も提供される。
別の実施形態では、上記の方法に従って、対象がＥｒｂＢ３における体細胞変異を含むか否かを決定することにより、癌を有する対象が、治療薬に応答するか否かを予測するための方法が提供される。
対象におけるＥｒｂＢ３中の体細胞変異の存在または不在を検出することにより、対象が癌を発症する素因を評価するための方法も提供される。
哺乳類における癌を亜分類する方法も提供され、この方法は、ＥｒｂＢ３中の体細胞変異の存在を検出することを含む。
患者の亜集団における癌を治療するために有効な治療薬を特定する方法も提供され、この方法は、薬剤の有効性をＥｒｂＢ３中の体細胞変異の存在と相関させることを含む。
追加の方法は、適切な場合、および必要に応じて、適切な臨床介入ステップを決定するために有用な情報を提供する。したがって、本発明の方法の一実施形態では、この方法は、本明細書に開示される、癌と関連付けられるＥｒｂＢ３体細胞変異の存在または不在の評価の結果に基づく臨床介入ステップをさらに含む。例えば、適切な介入は、予防的および治療ステップ、または本発明の方法により得られる遺伝的情報に基づく任意の同時最新の予防または治療ステップの調整（複数可）を必要とし得る。
当業者に明らかとなるように、本明細書に記載の任意の方法では、体細胞変異の存在の検出は、疾患の特徴（例えば、疾患の存在または亜型）を明確に示し、体細胞変異の非検出もまた、疾患の相互特性化を提供することにより有益である。
なおもさらなる方法は、哺乳類における癌を治療する方法を含み、哺乳類から生体試料を得るステップと、この生体試料を、本明細書に開示されるＥｒｂＢ３体細胞変異の存在について調べるステップと、該組織または細胞試料中の変異の存在または不在を決定するときに、有効な量の適切な治療薬を該哺乳類に投与するステップと、を含む。任意選択により、この方法は、有効な量の標的された癌治療薬を該哺乳類に投与することを含む。
ＥｒｂＢ３体細胞変異が存在することが知られている対象における癌を治療する方法も提供され、この方法は、癌を治療するために有効な治療薬を対象に投与することを含む。
癌を有する対象を治療する方法も提供され、この方法は、少なくとも１つの臨床研究における該癌を治療するために有効であることが以前に示された治療薬を対象に投与することを含み、この薬剤は、それぞれがＥｒｂＢ３体細胞変異を有している少なくとも５人のヒト対象に投与された。一実施形態では、少なくとも５人の対象は、少なくとも５人の対象群について合計で２つ以上の異なる体細胞変異を有した。一実施形態では、少なくとも５人の対象は、少なくとも５人の対象群全体で同一の体細胞変異を有した。
特定の癌患者亜集団の癌対象を治療する方法も提供され、該亜集団に対する治療薬として承認される有効な量の治療薬を対象に投与することを含み、この亜集団は、ＥｒｂＢ３体細胞変異との少なくとも部分的な関連により特徴付けられる。
一実施形態では、亜集団はヨーロッパ系である。一実施形態では、本発明は、癌治療薬を製造することと、癌を有するか、または有すると考えられる、およびＥｒｂＢ３体細胞変異を有する対象に薬剤を投与するための指示書と共に薬剤をパッケージ化することと、を含む。
癌治療薬で治療するために、癌を患う患者を選択する方法も提供され、ＥｒｂＢ３体細胞変異の存在を検出することを含む。
癌の治療のための治療薬は、いくつかの実施形態では、製薬学的用途に適切な組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、典型的に、ペプチドまたはポリペプチド、および許容される担体、例えば、製薬学的に許容されるものを含む。「製薬学的に許容される担体」として、医薬投与に適合する、任意および全ての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が挙げられる（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（２０００））。そのような担体または希釈剤の例として、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび固定油等の非水性媒体を使用してもよい。従来の媒質または薬剤が活性化合物と適合しないときを除いて、これらの組成物の使用が企図される。補助的な活性化合物もまた、組成物中に組み込むことができる。
本発明の治療薬（および癌の治療のための任意の追加の治療薬）は、非経口、肺内、髄腔内および鼻腔内、ならびに必要に応じて、局所治療、病巣内投与を含む、任意の適切な手段により投与され得る。非経口注入として、例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。投与は、任意の適切な経路により、例えば、静脈内または皮下注入等の注入により、投与が短期であるか、または長期であるかに部分的に依存して行うことができる。様々な時点に渡る単回または複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投与計画は、本明細書において企図される。
癌治療薬を投与するための有効な投与量および計画は、経験的に決定されてよく、このような決定は、当該技術分野の範囲内である。単回または複数回投与が用いられてもよい。癌治療薬の生体内投与が用いられるとき、通常な投与量は、投与経路に応じて、１日当たり哺乳類の体重１ｋｇ当たり約１０ｎｇ〜最大１００ｍｇ、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日まで異なり得る。特定の投与量および送達方法に関するガイダンスは、文献において提供されており、例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、または第５，２２５，２１２号を参照されたい。
本発明の一態様は、本明細書に記載される体細胞変異のうちの１つ以上により特定される、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３癌を有する個人を治療する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、有効な量のＨＥＲ阻害剤を個人に投与するステップを含む。別の実施形態では、ＨＥＲ阻害剤は、ＨＥＲ受容体に結合する抗体である。好適な実施形態では、抗体は、ＥｒｂＢ３受容体に結合する。一実施形態では、ＨＥＲ抗体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＦｕｈらのＷＯ１０／１０８１２７に記載されるもの等のＨＥＲ３および少なくとも１つの追加ＨＥＲ受容体に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、多特異的抗体である。一実施形態では、ＨＥＲ阻害剤により治療されるＥｒｂＢ３癌は、ＨＥＲ３を発現する細胞を含む。一実施形態では、ＨＥＲ阻害剤により治療される癌は、胃癌、結腸癌、食道癌、直腸癌、盲腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）腺癌、ＮＳＣＬＣ（扁平上皮癌）、腎癌、黒色腫、卵巣癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肺癌、および膵臓癌である。
本発明の別の態様は、個人におけるＨＥＲ受容体の生体活性を阻害する方法を提供し、有効な量のＨＥＲ阻害剤を個人に投与することを含む。一実施形態では、ＨＥＲ受容体は、個人における癌細胞により発現されるＨＥＲ３受容体である。別の実施形態では、ＨＥＲ阻害剤は、少なくともＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＨＥＲ抗体である。
本発明の一態様は、薬剤として使用するためのＨＥＲ抗体を提供する。本発明の一態様は、薬剤の製造において使用するためのＨＥＲ抗体を提供する。薬剤は、一実施形態では、本明細書に記載される体細胞変異のうちの１つ以上により特定されるＨｅｒｂＢ３／ＨＥＲ３癌を治療することができる。一実施形態では、薬剤は、ＨＥＲ３受容体の生体活性を阻害するためのものである。一実施形態では、ＨＥＲ抗体は、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ３および少なくとも１つの追加のＨＥＲ受容体に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。
別の態様では、本発明は、いくつかの異なる種類の治療の方法に適切なＨＥＲ阻害剤を提供する。一実施形態では、ＨＥＲ阻害剤は、トラスツズマブ−ＥＲＢＢ２ドメインＩＶに結合する抗ＥＲＢＢ２；ペルツズマブ−ＥＲＢＢ２ドメインＩＩに結合し、二量体化を防ぐ抗ＥＲＢＢ２抗体；抗ＥＲＢＢ３．１−リガンド結合を遮断する（ドメインＩＩＩに結合する）抗ＥＲＢＢ３；抗ＥＲＢＢ３．２−ドメインＩＩＩに結合し、リガンド結合を遮断する抗ＥＲＢＢ３；ＭＥＨＤ７９４５Ａ−リガンド結合を遮断する（ＥＧＦＲおよびＥＲＢＢ３のドメインＩＩＩに結合する）二重ＥＲＢＢ３／ＥＧＦＲ抗体；ラパチニブ−二重ＥＲＢＢ２／ＥＧＦＲ低分子阻害剤；およびＧＤＣ−０９４１４８−ＰＩ３Ｋ阻害剤からなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、対象におけるＥｒｂＢ３癌を治療する方法において使用するための抗癌治療薬を提供し、該方法は、（ｉ）対象から得られる生体試料においてＥｒｂＢ３をコードする核酸配列中のアミノ酸変異の存在または不在を検出することであって、この変異が、（本明細書に記載される）ＥｒｂＢ３アミノ酸配列の少なくとも１つの位置にアミノ酸変化をもたらし、変異の存在が、試料を得た対象における癌の存在を示すことと、（ｉｉ）核酸配列中に変異が検出される場合、有効な量の抗癌治療薬を対象に投与することと、を含む。
併用療法
本方法において複合療法が用いられ得ることが企図される。併用療法として、２つ以上の癌治療薬の投与が挙げられるが、これに限定されない。治療薬の組み合わせでの投与は、典型的に、定義された期間に渡って行われる（通常、選択される組み合わせに応じて、数分、数時間、数日、または数週間）。併用療法は、これらの治療薬の連続様式での投与、つまり、各治療薬が異なる時点に投与される場合、ならびにこれらの治療薬または治療薬のうちの少なくとも２つの実質的に同時投与を包含することが意図される。
治療薬は、同一経路または異なる経路により投与され得る。例えば、組み合わせでのＥｒｂＢ拮抗薬は、静脈内注入により投与され得るが、組み合わせでの化学療法薬は、経口投与され得る。代替として、例えば、治療薬の両方は、経口投与され得るか、または両方の治療薬は、特定の治療薬に応じて、静脈内注入により投与され得る。治療薬が投与される配列もまた、特定の薬剤に応じて変化する。
一態様では、本発明は、本明細書に記載される体細胞変異のうちの１つ以上により特定される、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３癌を有する個人を治療する方法を提供し、この治療方法は、複数のＥｒｂＢ阻害剤を投与することを含む。一実施形態では、この方法は、ＥｒｂＢ３阻害剤、例えば、ＥｒｂＢ３拮抗薬、および少なくとも１つの追加のＥｒｂＢ阻害剤、例えば、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、またはＥｒｂＢ４拮抗薬を投与することを含む。別の実施形態では、この方法は、ＥｒｂＢ３拮抗薬およびＥＧＦＲ拮抗薬を投与することを含む。他の一実施形態では、この方法は、ＥｒｂＢ３拮抗薬およびＥｒｂＢ２拮抗薬を投与することを含む。さらに別の実施形態では、この方法は、ＥｒｂＢ３拮抗薬およびＥｒｂＢ４拮抗薬を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ拮抗薬のうちの少なくとも１つは、抗体である。別の実施形態では、ＥｒｂＢ拮抗薬のそれぞれは抗体である。
キット
本明細書に記載されるか、または示唆される適用における使用のために、キットまたは製造物品も提供される。このようなキットは、バイアル瓶、管等の１つ以上の容器手段を受容して厳重に封じ込めるように区画化されているキャリア手段を含んでよく、容器手段のそれぞれは、本方法において使用される分離要素のうちの１つを含む。例えば、容器手段のうちの１つは、検出可能に標識されるか、または標識することができるプローブを備え得る。このようなプローブは、本明細書に開示される癌と関連付けられるＥｒｂＢ３体細胞変異を含むポリヌクレオチドに特異的なポリヌクレオチドであり得る。このキットが、標的核酸を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、キットは、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチド（複数可）を含む容器、および／またはレポーター手段、例えば、酵素、蛍光、または放射性同位元素標識等のレポーター分子に結合される、アビジンまたはストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質を含む容器も有し得る。一実施形態では、本発明のキットは、本明細書に記載される１つ以上のＥｒｂＢ３癌検出薬を含む。好適な実施形態では、キットは、本明細書に記載される、１つ以上のＥｒｂＢ３消化管癌検出薬または１つ以上のＥｒｂＢ３肺癌検出薬を含む。別の実施形態では、キットは、本明細書に記載される、治療薬（例えば、ＥｒｂＢ３阻害剤）を含む。
他の実施形態では、キットは、本明細書に開示される癌と関連付けられるＥｒｂＢ３体細胞変異を含むポリペプチドを検出することができる標識薬を含み得る。このような薬剤は、ポリペプチドに結合する抗体であり得る。このような薬剤は、ポリペプチドに結合するペプチドであり得る。キットは、例えば、本明細書に開示される遺伝子変異体を含むポリペプチドに結合する第１の抗体（例えば、固体支持体に付着した）、および任意選択により、ポリペプチドまたは第１の抗体のいずれかに結合し、検出可能な標識に共役される第２の異なる抗体を含み得る。
キットは、典型的に、上記の容器、および緩衝液、希釈剤、フィルター、針、カテーテル、シリンジ、および使用のための指示書を有するパッケージ挿入物を含む、商業的およびユーザの立場から望ましい材料を含む１つ以上の他の容器を含む。組成物が特定の治療または非治療適用に使用されることを示すために、ラベルが容器上に存在してよく、上記のもの等の生体内または生体外使用のいずれかについて指示を示してもよい。キット中の他の任意の成分としては、１つ以上の緩衝剤（例えば、ブロック緩衝剤、洗浄緩衝剤、基質緩衝剤等）、酵素標識により化学的に変化される、基質等の他の試薬（例えば、クロモゲン）、エピトープ抽出溶液、対照試料（陽性および／または陰性対照）、対象スライド（複数可）等が挙げられる。
別の態様では、本発明は、対象における癌を検出するためのキットの製造において、ＥｒｂＢ３癌検出薬の使用を提供する。一の実施形態では、対象から得られる生体試料においてＥｒｂＢ３をコードする核酸配列中のアミノ酸変異の存在または不在を検出することを含み、この変異は、（本明細書に記載される）ＥｒｂＢ３アミノ酸配列の少なくとも１つの位置にアミノ酸変化をもたらし、変異の存在は、試料が得られた対象における癌の存在を示す。
マーケティングの方法
本明細書における発明は、癌の診断または予後診断の開示される方法をマーケティングするための方法も包含し、開示される方法の使用をターゲットオーディエンスに宣伝、指示、および／または特定化することを含む。
マーケティングは、概して、スポンサーが特定され、メッセージが制御される非個人的な媒体を介する有料通信である。本明細書における目的で、マーケティングとしては、公告、広報、プロダクトプレイスメント、資金提供、引受業務等が挙げられる。この用語は、印刷通信媒体のいずれかに出現する資金提供された情報公示も含む。
本明細書における診断方法のマーケティングは、任意の手段により達成され得る。これらのメッセージを送達するために使用されるマーケティング媒体の例としては、テレビ、ラジオ、映画、雑誌、新聞、インターネット、および掲示板が挙げられ、放送媒体に出現するメッセージであるコマーシャルを含む。
使用されるマーケティングの種類は、多くの因子、例えば、病院、保険会社、診療所、医師、看護婦、および患者等の対象となるターゲットオーディエンス、ならびに費用考慮および薬剤および診断のマーケティングを規制する関連管轄法に依存する。マーケティングは、サービスインタラクションおよび／またはユーザの人工統計および地理的場所等の他のデータにより定義されるユーザの特徴に基づいて個別化またはカスタマイズされ得る。
以下の実施例は、説明するためだけに提供され、本発明の範囲をいかようにも限定するよう意図されない。
本明細書に引用される全ての患者および参考文献は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
実施例−ヒト癌における腫瘍形成ＥＲＢＢ３
ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の重要性を考慮して、ヒト癌について組織的に調査し、再発する体細胞変異を特定し、これらの変異が形質転換することも示す。さらに、癌のＥＲＢＢ３変異体駆動型動物モデルにおける標的治療薬を評価し、それらの大部分が、ＥＲＢＢ３変異体駆動型腫瘍形成を遮断する際に有効であることを示す。
材料および方法
腫瘍ＤＮＡ、変異、およびゲノム増幅
適切に承諾された一次ヒト腫瘍試料は、市販の供給源から得た（図１）。この研究において使用されるヒト組織試料は、使用前に非識別化（二重コード化）されたため、これらの試料を使用する研究は、米国保健社会福祉省規則および関連ガイダンス（４５ ＣＦＲ Ｐａｒｔ ４６）の下で、ヒト対象研究として考慮されない。使用される全ての腫瘍中の腫瘍含有量は、病理学レビューにより７０％未満であることが確認された。腫瘍ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｔｉｓｓｕｅ簡易キット（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を使用して抽出した。ＥＲＢＢ３の全てのコーディングエキソンは、以下の表１に列挙されるプライマーを使用して増幅した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）。ＰＣＲ製品は、外側対および内側対の２つのプライマー対を使用して生成し（表１）、標準ＰＣＲ条件を使用して、３７３０ｘｌ ＡＢＩシーケンサーを使用して配列決定した。配列決定データは、ｄｂＳＮＰデータベースに存在しない変異体の存在について、Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（Ｓｏｆｔｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＰＡ）および追加の自動化配列整列プログラムを使用して分析した。特定される推定変異体は、元の腫瘍ＤＮＡのＤＮＡ配列決定または質量分析（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，ＣＡ）により確認した後、腫瘍ＤＮＡに適用される類似のプロセスにより隣接したマッチ正常ＤＮＡにおけるその不在を確認した。代表的な正常ＥＲＢＢ３核酸およびアミノ酸配列は、図２および３にそれぞれ提供される。
Figure 2018085998
細胞株
ＩＬ−３依存性マウスｐｒｏ−Ｂ細胞株ＢａＦ３およびＭＣＦ１０Ａ、哺乳類上皮細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。ＢａＦ３細胞は、１０％（ｖ／ｃ）ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＩＬ）、２ｍＭ Ｌグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（完全ＲＰＭＵ）、および２ｎｇ／ｍＬマウスＩＬ−３を補充したＲＰＭＩ １６４０中で維持した。ＭＣＦ１０Ａ細胞は、５％（ｖ／ｖ）ウマ血清、０．５μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン、１００ｎｇ／ｍＬコレラ毒、１０μｇ／ｍＬインスリン、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、２ｍＭ Ｌグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ：Ｆ１２中で維持した。
プラスミドおよび抗体
レトロウイルスベクター、ｐＲｅｔｒｏ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｊａｉｓｗａｌ，Ｂ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １６，４６３−４７４（２００９））を使用して、ｃ末端ＦＬＡＧタグ付ＥＲＢＢ３野生型および変異体を安定的に発現した。この研究で使用されるＥＲＢＢ３変異体はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）を使用して生成した。ＥＲＢＢ２を用いて以前に行われたとおり、天然分泌シグナル配列を除去した後、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）Ｎ末端タグまたはｇＤコーディング配列に溶融されたＥＧＦＲ単純ヘルペスシグナル配列を持つ完全長ＥＲＮＮ２を発現するレトロウイルス構成は、ｐＬＰＣＸレトロウイルスベクターを使用して発現した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４，８５９−８６６（１９９９））。
ウェスタンブロットの場合、ｐＥＲＢＢ３（１２８９）、ｐＥＧＦＲ（Ｙ１０６８）、ｐＲＴＢＢ２（Ｔ１２２１／２）、ｐＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ｐＭＡＰＫ、総ＭＡＰＫおよびＡＫＴ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭＡ）、ｇＤ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ，ＣＡ）、β−アクチンおよびＦＬＡＧ Ｍ２（Ｓｉｇｍａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＭＯ）、およびＨＲＰ共役二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＩＬ）を認識する抗体をこの研究に使用した。
安定した細胞株の生成
野生型または変異体ＥＲＢＢ３ＦＬＡＧおよびｇＤ−ＥＧＦＲまたはｇＤ ＥＲＢＢ２をコードするレトロウイルス構成体を、Ｆｕｇｅｎｅ ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓａｌ）を使用して、Ｐｈｅｏｎｉｘ両性細胞にトランスフェクトした。次に得られるウイルスを、ＢａＦ３またはＭＣＦ１０Ａ細胞のいずれかに形質導入した。レトロウイルスＩＲＥＳ駆動型ＧＦＰの発現に基づいて、いずれかの空ベクター、野生型、またはＥＲＢＢ３変異体レトロウイルス感染した細胞の上位１０％は、フローサイトメトリーにより無菌分類し、ウェスタンブロットによりタンパク質の発現について特性化した。ＥＧＦＲまたはＥＲＢＢ２と一緒にＥＲＢＢ３変異体を発現する安定株を生成するために、ＦＡＣＳ分類されたＥＲＢＢ３野生型または変異体発現細胞を、野生型ＥＧＦＲまたはＥＲＢＢ２ウイルスのいずれかに感染させた。次に、感染した細胞を、１μｇ／ｍＬピューロマイシンを用いて７日間選択した。次に、これらの細胞のプールさらなる研究に使用した。
生存および増殖アッセイ
野生型および変異体ＥＲＢＢ３を安定的に発現するＢａＦ３細胞を単独で、またはＥＧＦＲもしくはＥＲＢＢ２と一緒に、ＰＢＳ中で２回洗浄し、ＩＬ３を含まない完全ＲＰＭＩ培地中、８個の複製で３×９６ウェルプレートに置いた。次に、必要に応じて、異なる濃度のＮＲＧ１および抗ＮＲＧ１抗体または異なるＥＲＢＢ抗体、チロシンキナーゼ、またはＰＩ３Ｋ低分子阻害剤を用いて細胞を処置し、生存または細胞増殖に対するそれらの効果を試験し、関連を図面に表した。０時間および１２０時間において、生きた細胞を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，ＷＩ）およびＳｙｎｅｒｇｙ ２（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，ＣＡ）を使用して決定した。細胞番号値の全てを、０時間の値に対して正規化した。ＥＲＢＢ３−ＷＴを安定的に発現するＭＣＦ１０Ａの増殖を評価するために、変異体をＰＢＳ中で２回洗浄し、５０００個の細胞を、３通の無血清培地中、８個の複製で９６ウェルプレートに置き、５日間増幅させた。細胞番号は、発光細胞生存キットを使用して、０日目および５日目に測定した。提示されたデータは、０日目に対して５日目の生存の平均±標準誤差を示す。平均および統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｖソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，ＣＡ）を使用して決定した。
免疫沈降およびウェスタンブロット
細胞表面上で発現したヘテロ二量体ＥＲＢＢ３−ＥＲＢＢ２受容体錯体のレベルを評価するために、免疫沈降の前に、膜不透過性架橋剤ビス（スルホスクシニミジル）基質（ＢＳ３）（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＩＬ）を使用して、細胞表面タンパク質を架橋した。リガンド（ＮＲＧ１）処置したか、処置していないＢａＦ３細胞を、冷たい５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５中で２回洗浄し、１５０ｍＭ ＮａＣｌを、１ｍＭ ＢＳ３を用いて、ＨＥＰＥＳ緩衝剤中で６０分間４℃で処置した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を用いて２回細胞を洗浄することにより、架橋を停止させた。次に、溶解緩衝液Ｉ中で細胞を 溶解した（５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）。免疫沈降の場合、浄化溶解物を、一晩４℃で、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体連結尾０図（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）でインキュベートした。ＦＬＡＧビーズを、溶解緩衝液Ｉを使用して３回洗浄した。ビーズ上に残留する免疫沈降タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液中で沸騰させ、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）上で溶解し、ニトロセルロース膜の上に移した。免疫沈降タンパク質または溶解物からのタンパク質を、適切な一次ＨＲＰ共役二次抗体、および化学発光Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ化学発光検出基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＩＬ）を使用して検出した。
ウェスタンブロット研究の場合、ＭＣＦ１０Ａ細胞を血清飢餓させ、ＥＧＦまたはＮＲＧ１の不在下で増殖させた。同様に、ＥＲＢＢ受容体および下流シグナル伝達成分の状態を、ＩＬ−３の不在下で増殖させたＢａＦ３細胞中で評価した。
近接結紮アッセイ
野生型またはＰ２６２Ｈ、Ｇ２８４Ｒ、およびＱ８０９Ｒ ＥＲＢＢ３変異体をＥＲＢＢ２と一緒に安定した発現するＢａＦ３細胞株を、準培養密度に増殖させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＩＬ３を含まないＲＰＭＩ培地中で一晩インキュベートした。これらの細胞のサイトスピン調製物を作製し、空気乾燥させて、４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した後、ＰＢＳ中０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎを用いて１０分間透過させた。Ｄｕｏｌｉｎｋ遮断溶液（Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３，９９５−１０００（２００６））を用いて６０分間遮断した後、抗ＦＬＡＧ（ウサギ）および抗ｇＤ（マウス）または抗ＥＲＢＢ３（マウス）（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ，ＣＡ）および抗ＥＲＢＢ２（ウサギ）（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）抗体のいずれかを用いて、１時間室温で細胞をインキュベートした。Ｄｕｏｌｉｎｋ抗ウサギ＋および抗マウス−ＰＬＡプローブ、およびＤｕｏｌｉｎｋ ＩＩ検出試薬（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）遠赤を使用して、製造者のプロトコルに従ってＤｕｏｌｉｎｋ染色を行った（Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３，９９５−１０００（２００６））。Ａｘｉｏｐｌａｎ２、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡、およびＤＡＰＩ／Ｔｅｘａｓ ｒｅｄに適切なフィルターを使用して、６３倍対物レンズで画像取得を行った。シグナルの定量測定の場合、ユーザ定義された閾値を適用した後、Ｄｕｏｌｉｎｋ画像ツールソフトウェアを用いて、ｔｉｆｆ画像ファイルを分析した。
コロニー形成アッセイ
ＥＧＦＲ（２×１０５）またはＥＲＢＢ２（５０，０００）を安定的に発現するＢａＦ３細胞を、ＥＲＢＢ３野生型または変異体と一緒に、２ｍＬのＩＬ３を含まないメチルセルロース（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｎａｄａ）と混合し、６ウェルプレートの上に置き、指示されるときは、置く前に、異なるＥＲＢＢ抗体またはチロシンキナーゼまたはＰＩ３Ｋ低分子阻害剤を用いて細胞を処置した。次に、プレートを３７℃で２週間インキュベートした。ＭＣＦ１０Ａコロニー形成の場合、ＥＲＢＢ３−ＷＴまたは変異体を、単独で、またはＥＧＦＲまたはＥＲＢＢ２との組み合わせで安定的に発現する２０，０００個のＭＣＦ１０Ａ細胞は、ＤＭＥＭ：Ｆ１２欠損血清、ＥＧＦ、およびＮＲＧ１中の０．３５％寒天と混合し、０．５％ベース寒天上に置いた。次に、プレートを３７℃で３週間インキュベートした。コロニーの存在は、Ｇｅｌカウント撮像装置（Ｏｘｆｏｒｄ Ｏｐｔｒｏｎｉｘ Ｌｔｄ，ＵＫ）を使用して評価した。各プレート中のコロニーの数を、Ｇｅｌカウントソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｏｐｔｒｏｎｉｘ Ｌｔｄ，ＵＫ）を使用して定量化した。
３次元形態形成または腺房形成アッセイ
野生型および変異体ＥＲＢＢ３を安定的に発現するＭＣＦ１０Ａ細胞を単独で、またはＥＧＦＲもしくはＥＲＢＢ２のいずれかと一緒に、既に記載されているプロトコルに従って、８ウェルチャンバスライド中の増殖因子還元マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）上に播種した（Ｄｅｂｎａｔｈｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３０，２５６−２６８（２００３））。腺房の形態形成を、１０倍対物レンズを使用するＺｅｉｓｓ顕微鏡を使用して、１２〜１５日目に撮影する。
１３日目の３Ｄ培地の完全抽出、固定、および免疫染色は、以前に記載されるとおり行った（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，３５９−３６５（２００７））。手短に言うと、抽出後、腺房をメタノール−アセトン（１：１）で固定し、ラット抗−α６インテグリン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ ＭＡ）、ウサギ抗Ｋｉ６７（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、およびＤＡＰＩで染色した。ヤギ抗ラットＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）およびヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）二次抗体をこの研究に使用した。４０ｘ油浸漬対物レンズを用いて、Ｌｅｉｃａ ＳＰＥ共焦点顕微鏡を使用して共焦点像を行った。
トランスウェル移行研究
空ベクターを安定的に発現するＭＣＦ−１０Ａ細胞、野生型ＥＲＢＢ３、またはＥＲＢＢ３の様々な変異体（５０，０００細胞）を、８μｍトランスウェル移行チャンバ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３４２２）の上に播種した。無血清アッセイ培地中で２０時間細胞を移行させた。綿棒を使用して膜の上部分の細胞をこすり取り、移行した細胞を３．７％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド中で固定し、０．１％クリスタルバイオレットで染色した。全てのトランスウェルから、２０倍の拡大で位相差顕微鏡下、５つの異なるフィールドから画像を撮影し、移行した細胞の数をカウントした。得られた数もまた、Ｈｏｅｃｈｓｔ染料により核を染色することにより検証した。ＥＲＢＢ３変異体発現細胞中で観測される移行の倍率増加を、野生型ＥＲＢＢ３発現細胞と比較して計算し、プリズムパッドソフトウェアを用いてスチューデントのｔ検定を行い、その有意性を検査した。
動物研究
ＥＲＢＢ２と一緒にＥＲＢＢ３野生型または変異体を発現するＢａＦ３細胞（２ｘ１０６）を、尾静脈注入により８〜１２週齢のＢａｌｂ／Ｃヌードマウスに埋め込んだ。生体内抗体有効性研究の場合、マウスを、４０ｍｇ／ｋｇ ＱＷ抗ブタクサ（対照）、１０ｍｇ／ｋｇ ＱＷトランスツズマブ、５０ｍｇ／ｋｇ ＱＷ抗ＥＲＢＢ３．１、および１００ｍｇ／ｋｇ ＱＷ抗ＥＲＢＢ３．２を用いて、細胞移植後４日目から治療した。治療につき合計１３匹の動物に注入した。この１０匹のマウスの生存を追跡し、うち３匹を２０日目に剖検に使用して、骨髄、脾臓、および肝臓の組織学的分析により疾患の進行を評価した。これらの動物から得られる骨髄および脾臓単一細胞懸濁液も、ＦＡＣＳ分析によりＧＦＰ陽性ＢａＦ３細胞の存在および比率について分析した。可能な場合、生存研究において死亡した動物または瀕死の動物を解剖して、死因を確認した。脾臓、肝臓、および骨髄の形態学的および組織学的分析も、これらの動物に対して行った。骨髄、脾臓、および肝臓を、１０％中性緩衝ホルマリン中に固定した後、自動化組織プロセッサ（ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ，ＣＡ）内で処理し、パラフィンに埋め込んだ。４ミクロン厚区分をＨ＆Ｅ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）で染色し、浸潤する腫瘍細胞の存在について組織学的に分析した。Ｎｉｋｏｎ ＤＳ−Ｒカメラを用いて、Ｎｉｋｏｎ ８０ｉ複合顕微鏡上で組織構造の写真を撮影した。全ての動物研究は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの研究機関の動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）承認されたプロトコルの下で行った。
統計分析
提示されるエラーバーは、平均±標準誤差を表す。スチューデントのｔ検定（両側）を統計分析に使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．００（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用する治療群と比較した。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であると考慮した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。生存分析のカプラン−マイヤー法の場合、ログランク統計を使用して、生存の差を検査した。
結果
ＥＲＢＢ３変異の特定
マッチした正常試料と一緒に、７０個の一次結腸腫瘍の全エキソーム配列決定を行う際に、ＥＲＢＢ３中の体細胞変異を特定した（Ｓｅｓｈａｇｉｒｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ ｆｕｓｉｏｎｓ．（Ｍａｎｓｕｓｃｒｉｐｔ ｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ２０１１））。ヒト固体腫瘍におけるＥＲＢＢ３変異の普及をさらに理解するために、ＥＲＢＢ３のコーディングエキソンを、１０２（全エキソームスクリーニングからの７０試料（Ｓｅｓｈａｇｉｒｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ ｆｕｓｉｏｎｓ．（Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ ｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ２０１１））および３２追加結腸試料）結腸直腸癌、９２胃癌、７４非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）腺癌（アデノ）、６７ＮＳＣＬＣ（扁平上皮癌）、４５腎癌、３７黒色腫、３２卵巣癌、１６肺大細胞癌、１５食道癌、１２小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、１１肝細胞癌（ＨＣＣ）、および９他の癌［４肺癌（その他）、２盲腸癌、１肺癌（神経内分泌）、１膵臓癌、および１直腸癌］からなる合計５１２のヒト一次腫瘍試料中で配列決定した（図１）。胃癌の１２％（１１／９２）、結腸癌の１１％（１１／１０２）、ＮＳＣＬＣの１％（アデノ、１／７４）、およびＮＳＣＬＣの１％（扁平上皮、１／６７）においてＥＲＢＢ３変異を変化させるタンパク質を発見した（図４）。以前の研究は、ＮＳＣＬＣ（扁平上皮、０．５％［３／１８８］）、膠芽腫（１％［１／９１］）、ホルモン陽性乳癌（５％［３／６５］）、結腸癌（１％［１／１００］）、卵巣癌（１％［３／３３９］）、および頭頸部癌（１％［１／７４］）において、ＥＲＢＢ３変異を変化させる散発性タンパク質を報告しているが、再発変異について報告されておらず、癌におけるこれらの変異の機能的関連も評価されていない（図４、および表２、３）。追加の配列決定および質量分析を介して、元の腫瘍ＤＮＡにおけるそれらの存在およびマッチした隣接する正常組織における不在について検査することにより、この研究で報告された全ての変異は、体細胞性であることを確認した。ミスセンス変異に加えて、３つの同義的（非タンパク質変化）変異も発見し、それぞれ結腸癌、胃癌、および卵巣がんにおける変異である。さらに、結腸腫瘍では、ＲＮＡ配列データを使用して、（Ｓｅｓｈａｇｉｒｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ ｆｕｓｉｏｎｓ．（Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ ｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ２０１１））、これらの試料中のＥＲＢＢ３変異体の発現およびＥＲＢＢ２の発現を確認した（図５）。
変異の大部分は、一部はＥＲＢＢ３のキナーゼドメインおよび細胞内尾部にマップされるが、主にＥＣＤ領域内に集合した。興味深いことに、ＥＣＤ変異体の中で４つの位置Ｖ１０４、Ａ２３２、Ｐ２６２、およびＧ２８４は、複数の試料に渡って再発置換を含み、これらが変異多発点であることを示す。分析で特定された４つのＥＣＤ多発点位置のうち２つＶ１０４およびＧ２８４は、それぞれ卵巣および肺（腺癌）試料において変異したことが以前に報告されている（Ｇｒｅｅｎｍａｎｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４４６，１５３−１５８（２００７）、Ｄｉｎｇｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４５５，１０６９−１０７５（２００８））。さらに、多発点位置のそれぞれにおける再発ミスセンス置換の大部分は、これらの変異の潜在的なドライバーの役割を示す同一のアミノ酸変化をもたらした。データを結腸癌に関して以前に公開された単一ＥＲＢＢ３変異と組み合わせたとき、キナーゼドメインにおける多発点変異、Ｓ８４６Ｉも特定した（Ｊｅｏｎｇｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ １１９，２９８６−２９８７（２００６））。
興味深いことには、特定された変異残基の大部分は、ＥＲＢＢ３相同分子種を越えて保存され（図６に示される、ならびにＣ．ｌｕｐｕｓ（配列番号のＸＰ＿５３８２２６．２）配列）、残基の一部は、ＥＲＢＢファミリーメンバー間で保存され、これらの変異が機能的効果を有する可能性があることをさらに示唆する。
Figure 2018085998
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変異についてさらに理解するために、公開されたＥＲＢＢ３ ＥＣＤ７およびキナーゼドメイン（Ｊｕｒａｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０６，２１６０８−２１６１３（２００９）、Ｓｈｉｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ １０７，７６９２−７６９７（２０１０））結晶構造（図７および図８）にそれらをマッピングした。興味深いことに、Ｖ１０４、Ａ２３２、およびＧ２８４での多発点変異は、ドメインＩ／ＩＩインターフェース内に集合する。ドメインＩＩとＩＩＩとの間のインターフェースにおけるこれら３つの部位の集合は、それらが共通機序により作動し得ることを示唆する。ドメインＩＩは、脊椎動物のように配列されたいくつかの高システインモジュールを含む。これらの半非依存性特徴の中で、関係のわずかな変化には、ファミリーメンバー間で機能的重要性が割り当てられている。（Ａｌｖａｒａｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４６１，２８７−２９１（２００９））。Ｖ１０４／Ａ２３２／Ｇ２８４変異は、これらのモジュールのうちの１つ以上を移動させ、変化した表現型を生じ得る。Ｐ２６２での変異は、ドメインＩＩの基部にＱ２７１に近接して存在し、繋留された閉じた構成に必要なドメインＩＩ／ＩＶ相互作用に関与する。残基８０９および８４６でのキナーゼドメイン変異は、エンドサイトーシスにおいて役割を与えられた区分である、ＥＧＦＲキナーゼ構造内のＣ末端尾部により取られる経路に近接する位置に相同である。他の変異部位は、図８に現れる。
ＥＲＢＢ３変異体は、ＭＣＦ１０Ａ哺乳類上皮細胞のリガンド非依存性増殖を促進する。
ＭＣＦ−１０Ａ哺乳類上皮細胞は、増殖のためにＥＧＦを必要とする（Ｓｏｕｌｅ，Ｈ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５０，６０７５−６０８６（１９９０）、Ｐｅｔｅｒｓｅｎｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ８９，９０６４−９０６８（１９９２））。ＭＣＦ１０Ａ細胞中で発現するとき、腫瘍遺伝子は、それらをＥＧＦ非依存性にすることができる（Ｄｅｂｎａｔｈｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １６３，３１５−３２６（２００３）、Ｍｕｔｈｕｓｗａｍｙｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３，７８５−７９２（２００１））。ＥＲＢＢ３変異の腫瘍形成性を理解するために、選択したＥＲＢＢ３変異体群が、細胞形質転換および増殖を支援する能力を検査した。４つのＥＣＤ多発点変異体および２つの（Ｖ７１４ＭおよびＱ８０９Ｒ）ＥＲＢＢ３キナーゼドメイン変異体を含む、６つの（Ｖ１０４Ｍ、Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｈ、Ｐ２６２Ｓ、Ｇ２８４Ｒ、およびＴ３８９Ｋ）ＥＲＢＢ３ ＥＣＤ変異体を、それらの細胞増殖、シグナル伝達、腺房形成、アンカレッジ非依存性増殖、および移行について、ＭＣＦ１０Ａ細胞中でそれらを安定的に発現することにより検査した。ＥＲＢＢファミリーメンバーは、シグナル伝達および細胞形質転換においてヘテロ二量体として機能するため、それらを野生型（ＷＴ）ＥＧＦＲまたはＥＲＢＢ２と共発現させることにより、ＥＲＢＢ３変異体の機能効果も検査した。ＥＲＢＢ３変異体は、ＭＣＦ１０Ａにおいて単独で発現されるとき、外因性ＥＲＢＢ３リガンドＮＲＧ１またはＥＧＦの不在下で、ＥＲＢＢ３−ＷＴと比較して、リガンド非依存性増殖の非常にわずかな増加（図９）、コロニー形成（図１０）、またはｐＥＲＢＢ３、ｐＡＫＴ、およびｐＥＲＫのようなシグナル伝達活性化状態マーカーの上昇（図１１Ａ）を示した。しかしながら、ＥＧＦＲまたはＥＲＢＢ２との組み合わせでのＥＲＢＢ３変異体の発現は、ＥＲＢＢ３−ＷＴと比較して、増殖およびコロニー形成の著しい増加を示した（図９および図１０）。さらに、ＥＲＢＢ３変態の大部分は、ＥＧＦＲまたはＥＲＢＢ２との組み合わせで、ｐＥＲＢＢ３、ｐＡＫＴ、およびｐＥＲＫの上昇につながる（図１１ＢおよびＣ）。
ＭＣＦ１０Ａ細胞は、再構成された３次元（３Ｄ）基底膜ゲル培地上で、ＥＧＦの存在下で培養されるとき、腺房細胞楕円体を形成する（Ｍｕｔｈｕｓｗａｍｙｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３，７８５−７９２（２００１）、ＭｕｔｈｕｓｗａｍｙＢｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３，１０３（２０１１））。しかしながら、いくつかの腫瘍遺伝子の発現は、それらをＥＧＦ非依存性にし、複雑な多腺房構造ももたらす（Ｄｅｂｎａｔｈｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １６３，３１５−３２６（２００３）、Ｂｒｕｍｍｅｒｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８１，６２６−６３７（２００５）、Ｂｕｎｄｙｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ ４，４３（２００５））。血清、ＥＧＦ、およびＮＲＧ１を欠く３Ｄ培養研究において、ＥＲＢＢ３変異体の異所的発現は、ＥＧＦＲまたはＭＣＦ１０Ａ細胞中のＥＧＦＲまたはＥＲＢＢ２との組み合わせで、ＥＲＢＢ３−ＷＴをＥＧＦＲまたはＥＲＢＢ２と共発現するＭＣＦ１０Ａ細胞と比較して、大きな腺房構造を促進した（図１２Ａ）。ＭＣＦ１０細胞を共発現するＥＲＢＢ３変異体／ＥＲＢＢ２に由来する腺房中のＫｉ６７の染色、増殖のマーカーは、検査した全ての変異体内の増殖の増加を示した（図１２Ｂ）。さらに、ＥＲＢＢ３変異体／ＥＲＢＢ２のサブセットを発現する同一のＭＣＦ１０Ａ細胞は、ＥＲＢＢ３−ＷＴ／ＥＲＢＢ２細胞と比較して、移行の増加も示した（図１２Ｃおよび図１３Ａ）。これらの結果を踏まえて、ＥＲＢＢ３変異体の腫瘍形成性質を確認する。
ＥＲＢＢ３変異体は、結腸上皮細胞のアンカレッジ非依存性増殖を促進する。
ＩＭＣＥは、腫瘍形成Ｒａｓの発現により形質転換され得る、不死化マウス結腸上皮細胞である（Ｄ’Ａｂａｃｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６，８８４−８９１、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）．ＰＮＡＳ９０，５８７−５９１）。ＩＭＣＥ細胞を使用して、ＥＲＢＢ３変異体を、ＥＲＢＢ３変異体を単独で、またはＥＲＢＢ２との組み合わせのいずれかで安定した発現させることにより、アンカレッジ非依存性増殖、シグナル伝達、および成体内腫瘍発生について検査した。図１３Ｂ（ａ〜ｂ）に示されるように、ＥＲＢＢ３−ＷＴまたは変異体は、それ自体が発現されるとき、アンカレッジ非依存性増殖を促進しないことが分かった。しかしながら、ＥＲＢＢ３変異体の大部分は、ＥＲＢＢ３−ＷＴとは異なり、ＥＲＢＢ２と共発現されるとき、アンカレッジ非依存性増殖を促進した（図１３Ｂ（ａ〜ｂ））。観測されるアンカレッジ非依存性増殖と一致して、ＥＲＢＢ２と一緒にＥＲＢＢ３変異体を発現するＩＭＣＥ細胞の大部分は、ｐＥＲＢＢ３および／またはｐＥＲＢＢ２の上昇、ならびにｐＡＫＴおよび／またはｐＥＲＫの同時増加を示した（図１３Ｂ（ｃ〜ｄ））。ＥＲＢＢ３変異体の一部は、それ自体がＥＲＢＢ３変異体の上昇を示したが、アンカレッジ非依存性増殖または下流シグナル伝達を促進しなかった。ＥＲＢＢ３変異体の腫瘍形成活性をさらに確認するために、いくつかの多発点ＥＣＤ変異体発現細胞を、それらが生体内の腫瘍増殖を促進する能力を検査した。それらがアンカレッジ非依存性増殖およびシグナル伝達を支援する能力と一致して、ＥＲＢＢ３ Ｖ１０４Ｍ、Ｐ２６２Ｈ、またはＧ２８４Ｒを共発現するＩＭＣＥ細胞は、ＷＴとはｋとなり、ＥＲＢＢ２と一緒に腫瘍増殖を促進する（図１３Ｂ（ｅ））。
ＥＲＢＢ３変異体は、ＩＬ３非依存性細胞生存および形質転換を促進する。
ＥＲＢＢ３変異の腫瘍形成の関連をさらに確認するために、ＥＲＢＢ３変異体を、シグナル伝達、細胞生存、およびアンカレッジ非依存性増殖に対するそれらの影響について、それらを単独で、またはＥＧＦＲもしくはＥＲＢＢ２との組み合わせでのいずれかで、ＩＬ−３依存性ＢａＦ３細胞中でそれらを安定した発現させることにより検査した。ＢａＦ３は、遺伝子の腫瘍形成活性、および標的腫瘍形成ドライバーを標的とする薬物の開発を研究するために広く使用されているインターロイキン（ＩＬ）−３依存性ｐｒｏ−Ｂ細胞株である（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）．ＰＬｏＳ ｍｅｄｉｃｉｎｅ３，ｅ４８５、Ｗａｒｍｕｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ１９，５５−６０）。ＥＲＢＢ３変異体は、単独で発現されたとき、ＢａＦ３細胞のＩＬ−３非依存性生存をほとんど、または全く促進しなかったが、ＥＧＦＲ−ＷＴまたはＥＲＢＢ２−ＷＴとの組み合わせで共発現されたとき、ＷＴ−ＥＲＢＢ３よりもはるかに有効であった（図１４および図１５Ａ、Ｂ）。ＥＲＢＢ２と共発現されたＥＲＢＢ３変異体は、約１０〜５０倍以上、ＩＬ−３非依存性生存を促進することにおいて、ＥＧＦＲと共発現されたときよりはるかに有効であった（図１４）。これは、活性化後に形成されるＥＲＢＢ３−ＥＲＢＢ２ヘテロ二量体が、細胞シグナル伝達の最も有力な活性因子に含まれることを示す以前の研究と一致する（Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎａｌ １５，２４５２−２４６７（１９９６）、Ｔｚａｈａｒｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １６，５２７６−５２８７（１９９６）、Ｈｏｌｂｒｏｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １００，８９３３−８９３８（２００３））。興味深いことに、Ｑ８０９Ｒキナーゼドメイン変異体は、ＥＲＢＢ２またはＥＧＦＲとの組み合わせで、ＢａＦ３細胞のＩＬ−３非依存性生存を促進することにおいて、検査したＥＣＤ変異体のどれよりも有効であった。観測されるＩＬ−３非依存性細胞生存活性と一致して、ＥＲＢＢ３変異体の大部分は、単独で、またはＥＲＢＢ２またＥＧＦＲとの組み合わせで発現されるとき、リン酸化の増加、活性ＥＲＢＢ受容体の署名を示した（図１５Ａ〜Ｃ）。さらに、ＥＲＢＢ２と共発現したＥＲＢＢ３変異体は、ＥＲＢＢ３−ＷＴと比較して、ｐ−ＥＲＢＢ２（Ｙ１２２１／２）の上昇を示した（図１５Ｃ）。またＥＧＦＲまたはＥＲＢＢ２との組み合わせで、ＥＲＢＢ３変異の大部分は、ＥＲＢＢ３変異体による構成的下流シグナル伝達と一致して、ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＥＲＫレベルの上昇を示した（図１５Ｂ、Ｃ）。ＥＲＢＢ３変異体がＢａＦ３細胞のＩＬ３非依存性生存を促進する能力を確認し、次に、これらの変異体がアンカレッジ非依存性増殖を促進する能力を調べた。Ｐ２６２Ｈ、Ｇ２８４Ｒ、およびＱ８０９Ｒ ＥＲＢＢ３変異体を、ＥＲＢＢ２との組み合わせで安定的に発現するＢａＦ３細胞は、ＥＲＢＢ３−ＷＴと比較して、頑強なアンカレッジ非依存性増殖を促進したことが分かった（図１６）。変異体のいくつかは、ＥＧＦＲを用いて発現されると、いくつかのアンカレッジ非依存性増殖を促進したが、この影響は、ＥＲＢＢ２との組み合わせで観測されるほど顕著ではなかった。これは、ＥＲＢＢ２媒介性腫瘍形成シグナル伝達におけるＥＲＢＢ３の要件を確立する、以前の報告と一致する（Ｈｏｌｂｒｏｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １００，８９３３−８９３８（２００３）、Ｌｅｅ−Ｈｏｅｆｌｉｃｈｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６８，５８７８−５８８７（２００８））。
ＢａＦ３システムを使用して、６つのＥＣＤ多発点変異体および４つのＥＲＢＢ３キナーゼドメイン変異体（Ｖ７１４Ｍ、Ｑ８０９Ｒ、Ｓ８４６Ｉ、およびＥ９２８Ｇ）を含む、いくつかのＥＲＢＢ３ ＥＣＤ変異体（Ｖ１０４Ｍ、Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｈ、Ｐ２６２Ｓ、Ｇ２８４Ｒ、およびＴ３８９Ｋ）を、ＩＬ−３非依存性細胞生存、シグナル伝達、およびアンカレッジ非依存性増殖に対するそれらの影響について、ＥＲＢＢ３変異体を単独で、またはＥＲＢＢ２との組み合わせで安定した発現することにより検査した。ＥＲＢＢ３は、キナーゼ不全であり、リガンド結合に続いて、ＥＲＢＢ２とのヘテロ二量体を選好的に形成して、シグナル伝達を促進する（Ｈｏｌｂｒｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）上記、Ｋａｒｕｎａｇａｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｔｈｅ ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎａｌ１５，２５４−２６４；Ｌｅｅ−Ｈｏｅｆｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００８）上記、Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）上記）。これと一致して、外因性リガンドの不在下で、ＥＲＢＢ３野生型（ＷＴ）およびＥＲＢＢ３変異体は、それ自体がＢａＦ３細胞のＩＬ−３非依存性生存を促進しなかった（図３７Ａ）。しかしながら、外因性ＥＲＢＢ３の不在下で、ＥＲＢＢ３変異体は、ＥＲＢＢ３−ＷＴとは異なり、ＥＲＢＢ２と共発現されたとき、ＩＬ３依存性ＢａＦ３細胞生存を促進し（図３７Ａ）、ＥＲＢＢ３変異体が、リガンド非依存的様式で機能し得ることを示す。ＥＲＢＢ３変異体の細胞生存活性は、それらがキナーゼ死（ＫＤ）ＥＲＢＢ２ Ｋ７５３Ｍ変異体と共発現したときに廃止され、キナーゼ活性ＥＲＢＢ２の要件を確認する（図３７Ａ）。ＥＲＢＢ３変異体を、それらがアンカレッジ非依存性増殖を促進する能力についてさらに調べた。ＥＲＢＢ３変異体は、生存アッセイにおいて観測されるとおり、それ自体はアンカレッジ非依存性増殖を支援しなかった（図３７Ｂ）。しかしながら、ＥＲＢＢ２との組み合わせで検査されるＥＲＢＢ３変異体の大部分は、ＥＲＢＢ３−ＷＴ／ＥＲＢＢ２を発現するＢａＦ３細胞と比較して、アンカレッジ非依存性増殖を促進した（図３７Ｂ〜Ｃ）。ＥＲＢＢ３により促進されたアンカレッジ非依存性増殖は、ＥＲＢＢ３変異体がＥＲＢＢ２−ＫＤとの組み合わせでコロニー形成を促進しなかったため、ＥＲＢＢ２のキナーゼ活性に依存することが確認された（図３７Ｂ〜Ｂ）。ＢａＦ３細胞のウェスタンブロット分析は、ＥＲＢＢ３変異体の発現が、ＥＲＢＢ２との組み合わせで、ＥＲＢＢ３−ＷＴと比較して、ｐＥＲＢＢ３、ｐＥＲＢＢ２、ｐＡＫＴ、および／またはｐＥＲＫの増加につながったことを示した（図３７Ｄ〜Ｆ）。細胞生存活性またはアンカレッジ非依存性増殖の欠失と一致して、ＥＲＢＢ３変異体は、それ自体またはＥＲＢＢ２−ＫＤとの組み合わせで、ｐＥＲＢＢ２および／またはｐＡＫＴ／ｐＥＲＫの上昇を示さなかったが（図３７Ｄ〜Ｆ）、ＥＲＢＢ３変異体は、それ自体が、ＢａＦ３細胞により発現された内因性ＥＲＢＢ２に起因する可能性があるｐＥＲＢＢ３レベルのいくらかの上昇を示した。ＥＲＢＢ２との組み合わせで、その弱いシグナル伝達と一致するＥＲＢＢ３ Ｖ７１４Ｍキナーゼドメイン変異体は、わずかな細胞生存活性を示し、アンカレッジ非依存性増殖を示さなかった（図３７Ａ〜Ｃ）。対照的に、最も活性なＱ８０９Ｒ変異体は、ＥＲＢＢ２との組み合わせで、ＥＲＢＢ３−ＷＴと比較して、頑強な下流シグナル伝達を示した（図３７Ａ〜Ｃ）。
ＥＲＢＢ３変異体によるリガンド非依存性腫瘍形成シグナル伝達
ＥＲＢＢ３変異体が腫瘍形成シグナル伝達を促進する機序を理解する目的で、ＢａＦ３系を使用してＥＲＢＢ３変異体のリガンド依存性を検査した。
ＥＲＢＢ３変異体によりリガンド非依存性シグナル伝達を確立するために、それらがＩＬ−３非依存性ＢａＦ３生存を、漸増用量の抗ＮＲＧ１抗体、ＥＲＢＢリガンド中和抗体下で促進する能力を検査した。ＮＲＧ１中和抗体の付加（Ｈｅｇｄｅｅｔ ａｌ．Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ（２０１１）は、ＥＲＢＢ３変異体がＩＬ−３非依存性生存またはアンカレッジ非依存性コロニー形成を促進する能力に対して悪影響を及ぼさなかった（図１７）。これと一致して、細胞表面受容体架橋に続いて行われる免疫沈降において、リガンドの不在下、ＥＲＢＢ３−ＷＴおよびＥＲＢＢ２を架橋するＢａＦ３細胞と比較して、ＥＲＢＢ３変異体／ＥＲＢＢ２ヘテロ二量体のレベルの増加についての証拠を発見した（図１８）。これは、ＥＲＢＢ３−ＷＴ／ＥＲＢＢ２を発現する細胞と比較したときに、近接結紮アッセイを使用して、ＩＬ−３またはＮＲＧ１の不在下で培養されたＥＲＢＢ３変異体／ＥＲＢＢ２を発現するＢａＦ３細胞中の細胞表面ヘテロ二量体のレベルの上昇によりさらに確認された（Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３，９９５−１０００（２００６））（図１９および図２０Ａ〜Ｂ）。これらのデータは、ＥＲＢＢ３変異体が、ＥＲＢＢ２との組み合わせで、ＢａＦ３のＩＬ−３生存を、ＮＲＧ１非依存的に促進できることを示唆する。
ＥＲＢＢ３変異体がリガンドに非依存的にシグナル伝達することができることが確立されたため、それらの活性がリガンド付加により補助され得るかどうかを検査した。ＮＲＧ１が、ＥＲＢＢ３−ＷＴまたは変異体を単独で発現するＢａＦ３細胞の生存を支援できないことが分かった（図２０Ｃ）。しかしながら、検査した最高濃度では、ＥＲＢＢ３変異体の対部分をＥＲＢＢ２と一緒に発現するＢａＦ３細胞のＩＬ−３非依存性生存は、ＥＲＢＢ３−ＷＴ／ＥＲＢＢ２発現細胞と同様の方法で増加した（図２１）。興味深いことに、Ａ２３２Ｖ ＥＲＢＢ３変異体は、ＷＴ ＥＲＢＢ３のように、ＮＲＧ１用量依存性ＩＬ−３非依存性生存応答を示した（図２１）。対照的に、Ｇ２８４ＲおよびＱ８０９Ｒは、これらの変異体を発現する未治療細胞と比較したときに、リガンド付加に続いて生存の著しい増加を示さなかった。Ｇ２８４Ｒ ＥＣＤおよびＱ８０９Ｒキナーゼドメイン変異体によるリガンド付加に対する最小応答は、これらの変異体によるシグナル伝達のリガンド非依存性モードの支配的役割を示唆する（図２１）。これと一貫して、リガンド付加に続いて、Ｐ２６２ＨおよびＷＴ ＥＲＢＢ３は、ヘテロ二量体形成の増加を示したが、Ｇ２８４Ｒ ＥＣＤ変異体およびＱ８０９Ｒキナーゼドメイン変異体は、未刺激細胞と比較したときに、ヘテロ二量体形成のわずかな増加を示した（図１８）。これらの結果は、全てのＥＲＢＢ３変異体はリガンド非依存性シグナル伝達することができるが、それらのうちの一部は、依然としてリガンド刺激に応答することができることを示す。
ＥＲＢＢ３変異体が腫瘍形成シグナル伝達を促進する機序をさらに理解するために、抗ＮＲＧ１抗体を中和する漸増用量のＥＲＢＢ３リガンドでこれらの細胞を処置することにより、ＢａＦ３系中のＥＲＢＢ３変異体のリガンド依存性を検査した（Ｈｅｇｄｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）上記）。ＮＲＧ１中和抗体（Ｉｄ）の付加は、ＥＲＢＢ３変異体がＩＬ−３依存性生存を促進する能力に影響を及ぼさないことが分かった（図３７Ｇ）。図３７Ｈでは、ＥＲＢＢ３ ＥＣＤ変異体は、漸増用量の外因性ＮＲＧ１に応答して、ＩＬ−３非依存性ＢａＦ３生存を示す。
ＥＲＢＢ３変異体は、生体内で腫瘍形成を促進する。
ＢａＦ３細胞が、腫瘍遺伝子の異所性発現によりＩＬ−３非依存性にし、マウスに埋め込まれたときに白血病様疾患を促進し、全体的な生存の低下につながることを示した（Ｈｏｒｎｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２７，４０９６−４１０６（２００８）、Ｊａｉｓｗａｌｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １６，４６３−４７４（２００９））。ＥＲＢＢ３−ＷＴを発現するＢａＦ３細胞、ＥＣＤ変異体（Ｐ２６２ＨまたはＧ２８４Ｒ）、またはキナーゼドメインＥＲＢＢ３変異体（Ｑ８０９Ｒ）が、ＥＲＢＢ２との組み合わせで、白血病様疾患を促進する能力について検査した。ＥＲＢＢ−ＷＴ単独で形質導入されたＢａＦ３細胞、またはＥＲＢＢ２を空ベクターと一緒に対照として使用した。ＥＲＢＢ３変異体を発現するＢａＦ３細胞を、ＥＲＢＢ２と一緒に移植したマウスは、２２〜２７日の平均生存を示したことが分かった（図２２）。対照的に、ＥＲＢＢ３−ＷＴ単独またはＥＲＢＢ２を空ベクターと共に発現するＢａＦ３細胞を受けるマウスは、６０日間の研究期間の最後に全て生きていた。しかしながら、ＥＲＢＢ３−ＷＴおよびＥＲＢＢ２を共発現するＢａＦ３細胞を受ける動物は、著しく長い潜伏期間と共に白血病様疾患を発症した（３９日、図２２）。ＥＲＢＢ３−ＷＴ／ＥＲＢＢ２ ＢａＦ３細胞は、生体外でＩＬ−３非依存性を示さなかったが、動物モデルにおけるそれらの活性は、ＥＲＢＢ３−ＷＴ／ＥＲＢＢ２二量体を活性化することができる生体内環境における増殖因子およびサイトカインの存在に起因する可能性があり、ＥＲＢＢ３−ＥＲＢＢ２ヘテロ二量体について報告されたリガンド依存性シグナル伝達に部分的に起因する（Ｊｕｎｔｔｉｌａｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １５，４２９−４４０（２００９））。疾患の進行を追跡するために、処置につき３匹のマウスの追加集団に対して、２０日目に剖検を行った。これらの動物からの骨髄、脾臓、および肝臓試料を病理的異常について検討した。ＢａＦ３細胞はｅＧＦＰでタグ付けされたため、単離した骨髄および脾臓を、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により浸潤細胞について調べた。生存の減少と一致して、ＥＲＢＢ３変異体／ＥＲＢＢ２を発現する細胞を移植したマウスからの骨髄および脾臓は、ＥＲＢＢ３−ＷＴまたはＥＲＢＢ２／空ベクター対照細胞を受けたマウスからの骨髄および脾臓と比較して、著しい比率の浸潤するｅＧＦＰ陽性細胞を示した（図２３〜２６）。さらに、観測された長い潜伏機関と一致して、非常に低いレベルの浸潤ｅＧＦＰ陽性細胞は、ＥＲＢＢ３−ＷＴ／ＥＲＢＢ２−ＷＴ細胞を受ける動物からの肝臓および脾臓において検出された。またＥＲＢＢ３変異体／ＥＲＢＢ２アームからの動物は、２０日目の空ベクター対照またはＥＲＢＢ３−ＷＴ／ＥＲＢＢ２と比較して、脾臓（図２５Ａおよび図２７）および肝臓（図２５Ｂおよび図２７）のサイズおよび重量の増加を示し、さらに浸潤細胞の存在を確認する。加えて、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色された骨髄、脾臓、および肝臓区分の組織学的評価は、２０日目の対照と比較したときに、ＥＲＢＢ３変異体／ＥＲＢＢ２を発現する細胞を有する動物における芽細胞の著しい浸潤を示した（図２６）。これらの結果は、ＥＲＢＢ３変異体の生体内腫瘍形成能力を実証する。
標的治療は、ＥＲＢＢ３変異体に対して有効である。
ＥＲＢＢ受容体を直接標的とする複数の薬剤は、様々な癌を治療するために承認される（Ｂａｓｅｌｇａ ａｎｄ ＳｗａｉｎＮａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ９，４６３−４７５（２００９）、Ａｌｖａｒｅｚｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２８，３３６６−３３７９（２０１０））。ＥＲＢＢ３を含むＥＲＢＢファミリーメンバー、およびそれらの下流成分を標的とするいくつかの追加の候補薬は、臨床試験および開発の様々な段階にある（Ａｌｖａｒｅｚｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２８，３３６６−３３７９（２０１０））。トラスツズマブ−ＥＲＢＢ２ドメインＩＶに結合する抗ＥＲＢＢ２抗体（Ｊｕｎｔｔｉｌａｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １５，４２９−４４０（２００９）），ペルツズマブ−ＥＲＢＢ２ドメインＩＩに結合し、二量体化を防ぐ抗ＥＲＢＢ２抗体（Ｊｕｎｔｔｉｌａｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １５，４２９−４４０（２００９）），抗ＥＲＢＢ３１−リガンド結合を遮断する（ドメインＩＩＩに結合する）抗ＥＲＢＢ３（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２０１１））、抗ＥＲＢＢ３２−ドメインＩＩＩに結合し、リガンド結合を遮断する抗ＥＲＢＢ３抗体（Ｗｉｌｓｏｎｅｔ ａｌ．．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２０，１５８−１７２（２０１１））、ＭＥＨＤ７９４５Ａ−リガンド結合を遮断する（ＥＧＦＲおよびＥＲＢＢ３のドメインＩＩＩに結合する）二重ＥＲＢＢ３／ＥＧＦＲ抗体（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２０１１））、セツキシマブ−リガンド結合を遮断する（ＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合する）ＥＧＦＲ抗体（Ｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ７，３０１−３１１（２００５））、ラパチニブ（Ｍｅｄｉｎａ，Ｐ．Ｊ．＆ Ｇｏｏｄｉｎ，Ｓ．Ｃｌｉｎ Ｔｈｅｒ ３０，１４２６−１４４７（２００８））−二重ＥＲＢＢ２／ＥＧＦＲ低分子阻害剤およびＧＤＣ−０９４１（Ｅｄｇａｒ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７０，１１６４−１１７２（２０１０））−ＰＩ３Ｋ阻害剤を、ＢａＦ３系を使用して、細胞増殖およびコロニー形成を遮断することに対するそれらの影響について検査した（図２８、図２９、および図３０）。抗体のサブセットを、生体内の有効性についても検査した（図３１）。増殖およびコロニー形成アッセイの両方において、Ｑ８０９Ｒに対する場合を除いて、試験される全ての変異体に対して非常に有効である低分子阻害剤ラパチニブ、および全ての変異体に対して有効であるＧＤＣ−０９４１は、検査される用量で部分的に有効であるに過ぎないことが分かった（図２８および２９）。コロニー形成アッセイにおいて検査される抗体の中で、トラスツズマブ抗ＥＲＢＢ３．２およびＭＥＨＤ７９４５は、検査される全ての変異体に対して全て有効であった（図２８および２９）。しかしながら、ペルツズマブ、抗ＥＲＢＢ３．１およびＧＤＣ−０９４１は、ＥＲＢＢ３ ＥＣＤ変異体により誘導される増殖およびコロニー形成を遮断することにおいて非常に有効であるが、Ｑ８０９ＲキナーゼドメインＥＲＢＢ３変異体に対して中度に有効であるに過ぎなかった（図２８および２９）。これと一致して、変異体ＥＲＢＢ３およびＥＲＢＢ２を共発現するＢａＦ３細胞中、生体外で効果的であるとき、これらの薬剤は、ｐＡＫＴおよび／またはｐＥＲＫレベル、およびＥＲＢＢ３および／またはｐＥＲＢＢ３のレベルも遮断または低減した（図３２および図３３）。
トラスツズマブ、抗ＥＲＢＢ３．１および抗ＥＲＢＢ３．２も、Ｇ２８４ＲおよびＱ８０９Ｒ ＥＲＢＢ３変異体に対して、ＢａＦ３系を生体内で使用して検査した（図３１、３４、および３５）。生体外で観測されるように、トラスツズマブは、Ｇ２８４ＲまたはＱ８０９Ｒ ＥＲＢＢ３／ＥＲＢＢ２を発現するＢａＦ３を受けるマウスにおける白血病様疾患を遮断することにおいて非常に有効であった（図３１Ａ）。同様に、抗ＥＲＢＢ３．１および抗ＥＲＢＢ３．２は、Ｇ２８４Ｒ ＥＲＢＢ３−ＥＣＤおよびＥＲＢＢ２を共発現するＢａＦ３を受けるマウスにおける白血病様疾患の発症を遮断した（図３１Ａ）。しかしながら、これらの抗ＥＲＢＢ３抗体は、未治療の対照動物と比較して、生存を著しく改善したが、Ｑ８０９Ｒ ＥＲＢＢ３／ＥＲＢＢ２を発現するＢａＦ３細胞を受けるマウスにおける疾患の発症を遮断することにおいて部分的に有効であるに過ぎなかった（図３１Ｂ）。標的治療について観測された有効性と一致して、脾臓および骨髄においてＥＲＢＢ３変異体を発現する浸潤ＢａＦ３細胞の著しい減少を発見した（図３４および図３６）。観測されるＢａＦ３細胞の浸潤の低下と一致して、脾臓および肝臓重量は、Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウスについて予想される正常範囲内であった（図３５および図２５）。これらのデータは、開発中であるか、またはヒト使用のために承認された複数の治療薬が、ＥＲＢＢ３変異体駆動型腫瘍に対して有効であり得ることを示す。
この研究では、結腸癌および胃癌における頻繁なＥＲＢＢ３体細胞変異の特定を報告する。特定した変異のいくつかは、腫瘍形成変異の特徴である多発点を形成する複数の非依存性試料において発生する。
これらの生体外および生体内機能研究は、ＥＣＤおよびキナーゼドメインＥＲＢＢ３変異体の両方の腫瘍形成性質を実証する。さらに、リガンド滴定実験を使用して、ＥＣＤ変異体の一部、Ｖ１０４Ｍ、Ｐ２６２Ｈ、Ｑ２８４Ｒ、およびＴ３８９Ｋが、ＥＲＢＢ３リガンドＮＲＧ１の不在下で腫瘍形成性であるが、ＮＲＧ１の付加によりさらに刺激され得ることを示す。ＥＣＤ変異は、ＷＴに対して非繋留確認に対して繋留されたＥＲＢＢ ＥＣＤと非繋留ＥＲＢＢ３ ＥＣＤとの間の均衡を移行させ得る。
いくつかの治療薬を、ＥＲＢＢ３変異体駆動型腫瘍形成シグナル伝達を標的とすることにおける生体外および生体内の両方でのそれらの利用性について検査したところ、複数の低分子阻害剤、抗ＥＲＢＢ２および抗ＥＲＢＢ３ ＥＣＤ抗体は、検査したＥＲＢＢ３変異体の大部分により腫瘍形成シグナル伝達を遮断することにおいて非常に有効であることが分かった。興味深いことに、ペルツズマブ、抗ＥＲＢＢ３．１およびＧＤＣ−０９４１は、キナーゼドメイン変異体Ｑ８０９Ｒを遮断することにおいて有効ではなく、この変異による顕著な作用機序を示す。以前の研究は、ペルツズマブがリガンド媒介性ＥＲＢＢ３／ＥＲＢＢ２二量体化を遮断することにおいて非常に有効であるが、トラスツズマブは、リガンド非依存性ＥＲＢＢ２／ＥＲＢＢ３二量体形成を遮断することにおいてより有効であることを示した（Ｊｕｎｔｔｉｌａ，Ｔ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １５，４２９−４４０（２００９））。これと一致して、リガンド非応答性キナーゼドメインＥＲＢＢ３変異体Ｑ８０９Ｒは、ペルツズマブと比較して、トラスツズマブによる阻害に対してはるかに応答性が高く、Ｑ８０９Ｒ ＥＲＢＢ３シグナル伝達における非リガンドヘテロ二量体錯体に対する潜在的な役割を示唆する。ＰＩ３Ｋ阻害剤ＧＤＣ−０９４１は、検査したＥＲＢＢ３変異体の大部分に対して非常に活性であるが、キナーゼドメイン変異体Ｑ８０９Ｒを遮断することにおけるその低い有用性は、ＰＩ３キナーゼに加えて、他の下流シグナル伝達分子の関与を示唆する。
ｓｈＲＮＡ媒介性ＥＲＢＢ３ノックダウンは、生体内増殖に影響を及ぼす。
ＩＭＣＥ細胞におけるＥＲＢＢ３変異体の腫瘍形成活性を確立した後、腫瘍細胞株におけるノックダウンＥＲＢＢ３の影響を検査しようとした。近年の研究は、ＣＷ−２、結腸細胞株、およびＤＶ９０、肺株が、それぞれＥＲＢＢ３ Ｅ９２８ＧおよびＶ１０４Ｍ変異体を発現することを報告した。以前に公表された標的構成を使用してＥＲＢＢ３を標的とするドキシサイクリン（ｄｏｘ）誘導性ｓｈＲＮＡを発現する、安定したＣＷ−２およびＤＶ９０細胞株を生成した（Ｇａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ４８３，５７０−５７５）。配列決定を標的とするｄｏｘ誘導性ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）を発現した対照株も生成した。ｄｏｘ誘導時に、ｌｕｃ ｓｈＲＮＡ発現株とは対照的に、ＥＲＢＢ３およびｐＥＲＫのレベルは、ＥＲＢＢ３ ｓｈＲＮＡを発現した細胞において減少した（図３８Ａ〜Ｂ）。ｄｏｘ誘導後のＥＲＢＢ３の喪失と一致して、ＤＶ９０およびＣＷ−２はいずれも、ルシフェラーゼｓｈＲＮＡ株または非誘導株と比較して、アンカレッジ非依存性増殖の低下を示した（図３８Ｃ〜Ｆ）。次に、ＤＶ９０およびＣＷ−２細胞中のＥＲＢＢ３のノックダウンが、腫瘍を生体内で形成する能力に影響を及ぼし得るかどうかを検査した。ｓｈＲＮＡを標的とするＥＲＢＢ３のｄｏｘ媒介性誘導時に、ＤＶ９０およびＣＷ−２細胞はいずれも、ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡを発現したか、またはＥＲＢＢ３ ｓｈＲＮＡを発現するように誘導されないＤＶ９０またはＣＷ−２細胞を担持する動物と比較して、腫瘍増殖の著しい減少を示した（図３８Ｇ〜Ｊ）。これらのデータを一緒に考慮して、腫瘍発生におけるＥＲＢＢ３変異の役割をさらに確認する。
一態様では、本発明は、ＥｒｂＢ３癌検出薬を提供する。一実施形態では、ＥｒｂＢ３癌検出薬は、ＥｒｂＢ３消化管癌検出薬である。別の実施形態では、検出薬は、ＥｒｂＢ３核酸配列中のＥｒｂＢ３変異に特異的に結合することができる試薬を含む。他の一実施形態では、ＥｒｂＢ３核酸配列は、配列番号２３０または１を含む。
「ＥｒｂＢ３癌検出薬」は、ＥＲＢＢ３核酸配列またはアミノ酸配列内のＥｒｂＢ３癌と関連付けられる変異を検出することができる薬剤を指す。典型的に、検出薬は、ＥＲＢＢ３配列に特異的に結合することができる試薬を含む。好適な実施形態では、この試薬は、ＥＲＢＢ３核酸配列中のＥｒｂＢ３変異に特異的に結合することができる。一実施形態では、検出薬は、ＥＲＢＢ３核酸配列（例えば、配列番号１または２３０）に特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、このポリヌクレオチドは、変異を含むＥｒｂＢ３配列に特異的にハイブリダイズする核酸配列を含むプローブである。別の実施形態では、検出薬は、ＥＲＢＢ３アミノ酸配列に特異的に結合することができる試薬を含む。別の実施形態では、アミノ酸配列は、本明細書に記載されるとおり、変異を含む。検出薬は、標識をさらに含み得る。好適な一実施形態では、ＥｒｂＢ３癌検出薬は、ＥｒｂＢ３消化管癌検出薬である。
試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 試料。ヒト癌におけるＥＲＢＢ３の研究に使用されるヒト組織試料の一覧を提供する。 代表的な野生型ＥＲＢＢ３核酸配列（受入番号ＮＭ＿００１９８２）（配列番号１）。 代表的な野生型ＥＲＢＢ３核酸配列（受入番号ＮＭ＿００１９８２）（配列番号１）。 代表的な野生型ＥＲＢＢ３核酸配列（受入番号ＮＰ＿００１９７３）（配列番号２）。 ＥＲＢＢ３体細胞変異。（ａ〜ｂ）ＥＲＢＢ３タンパク質ドメイン上でマップされるＥＲＢＢ３体細胞変異から生じるタンパク質変化を示す。薄赤色の背景で反復するアミノ酸変化として描かれる多発点変異。変異残基の周りの背景縦線の高さは、その特定の位置における変異の頻度に比例する。 ＥＲＢＢ３体細胞変異。（ａ〜ｂ）ＥＲＢＢ３タンパク質ドメイン上でマップされるＥＲＢＢ３体細胞変異から生じるタンパク質変化を示す。薄赤色の背景で反復するアミノ酸変化として描かれる多発点変異。変異残基の周りの背景縦線の高さは、その特定の位置における変異の頻度に比例する。 ＥＲＢＢ３体細胞変異。（ｃ〜ｄ）ＥＲＢＢ３タンパク質ドメイン上に描かれるＥＲＢＢ３非同義的体細胞変異（逆三角形、赤色の三角形は多発点を描く）。上のヒストグラムは、本研究および他の公表された研究において、試料において観測された、各検出位置での変異の数を表す（赤色の棒は、多発点変異を示し、青色の棒は、活性について試験した追加の非多発点変異を示す）。 ＥＲＢＢ３体細胞変異。（ｃ〜ｄ）ＥＲＢＢ３タンパク質ドメイン上に描かれるＥＲＢＢ３非同義的体細胞変異（逆三角形、赤色の三角形は多発点を描く）。上のヒストグラムは、本研究および他の公表された研究において、試料において観測された、各検出位置での変異の数を表す（赤色の棒は、多発点変異を示し、青色の棒は、活性について試験した追加の非多発点変異を示す）。 ＥＲＢＢ３体細胞変異。（ｅ〜ｆ）図４（ａ〜ｂ）の拡大および補足図。図４（ａ〜ｆ）は、ＥｒｂＢ３の線形図を提供し、図４ａ、ｃ、およびｅは、Ｎ末端の半分を示し、図４ｂ、ｄ、およびｆは、Ｃ末端の半分を示す。 ＥＲＢＢ３体細胞変異。（ｅ〜ｆ）図４（ａ〜ｂ）の拡大および補足図。図４（ａ〜ｆ）は、ＥｒｂＢ３の線形図を提供し、図４ａ、ｃ、およびｅは、Ｎ末端の半分を示し、図４ｂ、ｄ、およびｆは、Ｃ末端の半分を示す。 ＲＮＡ配列データを用いて評価される、ＥＲＢＢ３変異結腸試料におけるＥＲＢＢ３変異（Ａ、Ｂ）の発現およびＥＲＢＢ２（Ｂ）の発現（Ｓｅｓｈａｇｉｒｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ ｆｕｓｉｏｎｓ．（Ｍａｎｓｕｓｃｒｉｐｔ ｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ２０１１））。 変異部位に渡る保護を描く、複数の配列アラインメントＥＲＢＢ３相同分子種。人類（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）（ＮＰ＿００１９７３．２（完全長配列は、配列番号１２６として開示され、様々な領域は、出現する順にそれぞれ配列番号１３２〜１５１として開示される））、チンパンジー（Ｐ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）（ＸＰ＿５０９１３１．２（完全長配列は、配列番号１３０として開示され、様々な領域は、出現する順にそれぞれ配列番号２１２〜２２９として開示される））、ハイイロオオカミ（Ｃ．ｌｕｐｕｓ）（ＸＰ＿５３８２２６．２（配列番号１３１））、ウシ（Ｂ．ｔａｕｒｕｓ）（ＮＰ＿００１０９６５７５．１（完全長配列は、配列番号１２９として開示され、様々な領域は、出現する順にそれぞれ配列番号１９２〜２１１として開示される））、ハツカネズミ（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ＮＰ＿０３４２８３．１（完全長配列は、配列番号１２７として開示され、様々な領域は、出現する順にそれぞれ配列番号１５２〜１７１として開示される））、およびラット（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ＮＰ＿０５８９１４．２（完全長配列は、配列番号１２８として開示され、様々な領域は、出現する順にそれぞれ配列番号１７２〜１９１として開示される））を、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて整列させた（Ｌａｒｋｉｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ） ２３，２９４７〜２９４８（２００７））。変異残基は、赤色の楕円背景で示される。 ＥＲＢＢ３［ｐｄｂ １Ｍ６Ｂ］およびＥＲＢＢ２［ｐｄｂ １Ｎ８Ｚ］を使用して、（Ａ）「繋留」ＥＲＢＢ３ ＥＣＤ［ｐｄｂ １Ｍ６Ｂ］（Ｂ）の結晶構造、または（Ｂ）ＥＧＦＲ ＥＣＤ二量体（ｐｄｂ １ＩＶＯ）に基づく「非繋留」ＥＲＢＢ３／ＥＲＢＢ２ ＥＣＤヘテロ二量体のモデル上にマップされる、赤色で示される頻繁な（または多発点）体細胞ＥＣＤ変異。ＥＧＦ［ｐｄｂ １ＩＶＯ］（Ｃ）に基づいて、灰色表面として示されるＥＲＢＢ３リガンド。ＥＲＢＢ３キナーゼドメイン［ｐｄｂ ３ＬＭＧ］の構造上にマップされる、赤色で示されるＥＲＢＢ３キナーゼドメイン体細胞変異。＊＝終止コドン ドメイン別に色付けされたＥＲＢＢ３（ｐｄｂ １Ｍ６Ｂ）のＥＣＤ結晶構造上にマップされる、ＥＲＢＢ３体細胞変異。 ＥＲＢＢ３変異は、３Ｄ培地におけるＭＣＦ１０Ａ細胞のＥＧＦ非依存性増殖を支援する。単独またはＥＧＦＲもしくはＥＲＢＢ２のいずれかと一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＭＣＦ１０Ａ細胞は、ＥＧＦ非依存性増殖を示す。ＭＣＦ１０Ａを必要とする研究は、血清、ＥＧＦ、およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ−空ベクター。 ＥＲＢＢ３変異体は、ＥＧＦおよび血清非依存性の足場非依存性増殖を促進する。単独またはＥＧＦＲもしくはＥＲＢＢ２との組み合わせのいずれかで、ＥＲＢＢ３を発現するＭＣＦ１０Ａにより形成されるコロニーを描く代表的画像が示される（ａ）。（ａ）に描かれるアッセイからのコロニーの定量は、ＥＲＢＢ３変異体についてＥＧＦＲ（ｂ）またはＥＲＢＢ２（ｃ）との組み合わせで示される。 単独（Ａ）またはＥＧＦＲ（Ｂ）もしくはＥＲＢＢ２（Ｃ）のいずれかと一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＭＣＦ１０Ａ細胞は、ウェスタンブロットにより評価されるとおり、下流シグナル伝達の上昇を示す。ＭＣＦ１０Ａを必要とする研究は、血清、ＥＧＦ、およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ−空ベクター。 ＥＲＢＢ３変異は、３Ｄ培地におけるＭＣＦ１０Ａ細胞のＥＧＦ非依存性増殖を支援する。単独またはＥＧＦＲもしくはＥＲＢＢ２のいずれかと一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＭＣＦ１０Ａ細胞は、ＥＲＢＢ３／ＥＲＢＢ２を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞と比較して、大きな腺房構造、Ｋｉ６７染色の増加、および移行指数の増加を示す。データは、３つの独立した実験の平均±標準誤差を表す。ＭＣＦ１０Ａを必要とする研究は、血清、ＥＧＦ、およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ−空ベクター。 移動アッセイにおけるトランスウェルからの移動（ａ）、およびこの移動効果の定量（ｂ）に続いて、ＥＲＢＢ２と共に表示のＥＲＢＢ３変異体を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞の代表的な画像を示す。 移動アッセイにおけるトランスウェルからの移動（ａ）、およびこの移動効果の定量（ｂ）に続いて、ＥＲＢＢ２と共に表示のＥＲＢＢ３変異体を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞の代表的な画像を示す。 ＥＲＢＢ３変異体が、ＩＭＣＥコロニー上皮細胞の足場非依存性増殖を支援することを示す。ＥＲＢＢ３自体またはＥＲＢＢ２との組み合わせのいずれかで発現するＩＭＣＥコロニー上皮細胞は、ＥＲＢＢ３−ＷＴ／ＥＲＢＢ２を発現するＩＭＣＥ細胞と比較して、足場非依存性増殖（ａ）、増加したコロニー数（ｂ）、上昇したリン酸シグナル伝達（ｃ、ｄ）、およびインビボ増殖（ｅ）を示した。ＥＶ−空ベクター。 ＥＲＢＢ３変異体が、ＩＭＣＥコロニー上皮細胞の足場非依存性増殖を支援することを示す。ＥＲＢＢ３自体またはＥＲＢＢ２との組み合わせのいずれかで発現するＩＭＣＥコロニー上皮細胞は、ＥＲＢＢ３−ＷＴ／ＥＲＢＢ２を発現するＩＭＣＥ細胞と比較して、足場非依存性増殖（ａ）、増加したコロニー数（ｂ）、上昇したリン酸シグナル伝達（ｃ、ｄ）、およびインビボ増殖（ｅ）を示した。ＥＶ−空ベクター。 ＥＲＢＢ３変異体が、ＩＭＣＥコロニー上皮細胞の足場非依存性増殖を支援することを示す。ＥＲＢＢ３自体またはＥＲＢＢ２との組み合わせのいずれかで発現するＩＭＣＥコロニー上皮細胞は、ＥＲＢＢ３−ＷＴ／ＥＲＢＢ２を発現するＩＭＣＥ細胞と比較して、足場非依存性増殖（ａ）、増加したコロニー数（ｂ）、上昇したリン酸シグナル伝達（ｃ、ｄ）、およびインビボ増殖（ｅ）を示した。ＥＶ−空ベクター。 ＥＲＢＢ３変異体が、ＩＭＣＥコロニー上皮細胞の足場非依存性増殖を支援することを示す。ＥＲＢＢ３自体またはＥＲＢＢ２との組み合わせのいずれかで発現するＩＭＣＥコロニー上皮細胞は、ＥＲＢＢ３−ＷＴ／ＥＲＢＢ２を発現するＩＭＣＥ細胞と比較して、足場非依存性増殖（ａ）、増加したコロニー数（ｂ）、上昇したリン酸シグナル伝達（ｃ、ｄ）、およびインビボ増殖（ｅ）を示した。ＥＶ−空ベクター。 ＥＲＢＢ３変異体は、形質転換し、ＢａＦ３細胞のＩＬ３非依存性生存を促進する。単独またはＥＧＦＲもしくはＥＲＢＢ２のいずれかと一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＢａＦ３細胞は、ＩＬ３非依存性生存を促進する。ＢａＦ３研究は、ＩＬ−３およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ＝空ベクター、Ｍ＝モノマー、およびＤ＝二量体。 ＥＲＢＢ３変異体は、形質転換し、ＢａＦ３細胞のＩＬ３非依存性生存を促進する。単独（Ａ）またはＥＧＦＲ（Ｂ）もしくはＥＲＢＢ２（Ｃ）のいずれかと一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＢａＦ３細胞は、ＥＲＢＢ３およびその下流エフェクターのリン酸化の増加を促進する。ＢａＦ３研究は、ＩＬ−３およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ＝空ベクター、Ｍ＝モノマー、およびＤ＝二量体。 単独またはＥＧＦＲもしくはＥＲＢＢ２との組み合わせのいずれかで、ＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＢａＦ３細胞の足場非依存性増殖の代表的画像。ＢａＦ３研究は、ＩＬ−３およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ＝空ベクター、Ｍ＝モノマー、およびＤ＝二量体。 抗ＮＲＧ１、ＮＲＧ１中和抗体は、ＥＲＢＢ２と共発現したＥＲＢＢ３変異体により促進されるＢａＦ３細胞のＩＬ−３非依存性生存に影響を及ぼさない。ＢａＦ３研究は、ＩＬ−３およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ＝空ベクター、Ｍ＝モノマー、およびＤ＝二量体。 ＢＳ３を使用して細胞表面タンパク質を架橋することに続いて誘導された免疫沈降材料において観測されるとおり、ＮＲＧ１の不在下で、ＢａＦ３細胞におけるＥＲＢＢ３変異体／ＥＲＢＢ２ヘテロ二量体の上昇レベル。ＢａＦ３研究は、ＩＬ−３およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ＝空ベクター、Ｍ＝モノマー、およびＤ＝二量体。 近接結紮アッセイ４０を使用して検出される細胞表面上で観測されるとおり、ＮＲＧ１の不在下で、ＢａＦ３細胞におけるＥＲＢＢ３変異体／ＥＲＢＢ２ヘテロ二量体の上昇レベル。ＢａＦ３研究は、ＩＬ−３およびＮＲＧ１の不在下で行った。ＥＶ＝空ベクター、Ｍ＝モノマー、およびＤ＝二量体。 ＥＲＢＢ３−ＥＲＢＢ２ヘテロ二量体の定量化。近接結紮アッセイからの画像（図１７）を、Ｄｕｏｌｉｎｋ画像ソフトウェアツール（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して分析した。ＥＲＢＢ３およびＥＲＢＢ２を発現する細胞の表示の組み合わせについて、５〜６個の画像フィールドの少なくとも１００個の細胞を、ＥＲＢＢ２／ＥＲＢＢ３二量体から生じるシグナル（赤色の点）を分析した。このアッセイは、ＦＬＡＧ（ＥＲＢＢ３）およびｇＤ（ＥＲＢＢ２）抗体（Ａ）または天然のＥＲＢＢ３およびＥＲＢＢ３抗体（Ｂ）を用いて行った。データは、平均±標準誤差として示される。図２０Ｃは、ＮＲＧ１が、ＥＲＢＢ３−ＷＴまたは変異体を単独で発現するＢａＦ３細胞の生存を支援できなかったことを示す。 ＥＲＢＢ３ ＥＣＤ変異体は、異なる用量の外因性リガンドＮＲＧ１に応答して、増加したＩＬ−３非依存性ＢａＦ３生存を示す。ＢａＦ３研究は、ＩＬ−３の不在下で行った。ＥＶ＝空ベクター、Ｍ＝モノマー、およびＤ＝二量体。 ＥＲＢＢ３変異体は、腫瘍発生を促進し、全体生存の低下につながる。表示のＥＲＢＢ３変異体／ＥＲＢＢ２の組み合わせを発現するＢａＦ３細胞を埋め込んだマウス群のカプランマイヤー生存曲線は、対照ＢａＦ３（ベクター）細胞と比較して、全体生存の低下を示す（アームの場合ｎ＝１０、ログランク検定ｐ＜０．０００１）。 様々なＥＲＢＢ３変異体／ＥＲＢＢ２−ＷＴを発現するＧＦＰ標識されたＢａＦ３細胞を受けるマウスから単離された総骨髄細胞（Ａ）および脾臓細胞（Ｂ）のフローサイトメトリー分析。 表示の研究アームのマウス（ｎ＝３）の骨髄（Ａ）および脾臓（Ｂ）におけるＧＦＰ陽性細胞の平均数が示される。 表示の研究アームのマウス（ｎ＝３）からの脾臓（Ａ）および肝臓（Ｂ）の平均重量が示される。 図２１において分析された同一のマウスからの代表的なＨ＆Ｅ染色された骨髄（上）、脾臓（中）、および肝臓（下）部分。空ベクター動物からの骨髄は、正常な造血細胞からなる。＊＝腫瘍浸潤細胞、Ｒ＝赤脾髄、Ｗ＝白脾髄のリンパ濾胞。無標の脾臓部分において、腫瘍浸潤細胞による破壊に起因する赤／白脾髄構造の喪失がある。スケールバーは、１００μｍに対応する。 ＥＲＢＢ３変異体を発現するＢａＦ３細胞を移植したマウスからの脾臓および肝臓の代表的画像を示す。 ＥＲＢＢ３変異体の発癌活性に対する抗ＥＲＢＢ抗体および低分子阻害剤の有効性。図面に示されるとおり、ＥＲＢＢ２と一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＢａＦ３細胞のＩＬ−３非依存性増殖に対する標的治療の影響。 図面に示されるとおり、ＥＲＢＢ２と一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＢａＦ３細胞の足場非依存性増殖に対する標的治療の影響の代表的画像。 本研究において試験したＥＲＢＢ受容体および様々な標的薬剤を示す概略図。 抗ＥＲＢＢ３抗体は、ＥＲＢＢ３変異体をインビボで効果的に標的する。ＥＲＢＢ２との組み合わせで、ＥＲＢＢ３変異体Ｇ２８４Ｒ（Ａ）またはＱ８０９Ｒ（Ｂ）を発現するＢａＦ３細胞により誘導される白血病様疾患を遮断することにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ ＱＷトラスツズマブ（Ｔｍａｂ）、５０ｍｇ／ｋｇ ＱＷ抗ＥＲＢＢ３．１、および１００ｍｇ／ｋｇ ＱＷ 抗ＥＲＢＢ３．２抗体の有効性。対照抗体治療群（対照Ａｂ）は、４０ｍｇ／ｋｇ ＱＷ抗ブタクサ抗体を受ける。 図面に示されるとおり、ＥＲＢＢ２と一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＢａＦ３細胞の標的治療の影響。治療に使用される抗体および低分子阻害剤の濃度は、図２７に示されるものと同一である。 治療後８時間のＢａＦ３におけるＥＲＢＢ３および下流シグナル伝達分子のリン酸化に対するＥＲＢＢ抗体および低分子阻害剤の影響を示す。２４時間でのこれらの同一薬剤の影響は、図３０に示される。 図面に示されるとおり、抗体による治療に続いて、骨髄（ＢＭ）および膵臓において変異体ＥＲＢＢ３、Ｇ２８４Ｒ（Ａ）、およびＱ８０９Ｒ（Ｂ）を発現する浸潤ＢａＦ３細胞の比率。 示されるとおり、抗体による治療に続いて、ＥＲＢＢ３変異体細胞、Ｇ２８４Ｒ（Ａ）、およびＱ８０９Ｒ（Ｂ）を埋め込まれた動物からの肝臓および脾臓重量。 これらの細胞を埋め込まれたマウスの脾臓および骨髄から単離されたＥＲＢＢ３変異体を発現する浸潤ＧＦＰ陽性ＢａＦ３細胞を示す。 ＥＲＢＢ３変異体は、形質転換し、ＢａＦ３細胞のＩＬ３非依存性生存を促進する。（Ａ）単独またはＥＲＢＢ２もしくはＥＲＢＢ２−ＫＤと一緒にＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＢａＦ３細胞のＩＬ３非依存性生存。 ＥＲＢＢ３変異体は、形質転換し、ＢａＦ３細胞のＩＬ３非依存性生存を促進する。（Ｂ）単独またはＥＲＢＢ２もしくはＥＲＢＢ２−ＫＤとの組み合わせのいずれかで、ＥＲＢＢ３変異体を安定的に発現するＢａＦ３細胞の足場非依存性増殖の代表的画像。（Ｃ）（Ｂ）に示されるＥＲＢＢ２と共に、ＥＲＢＢ３変異体を発現するＢａＦ３細胞により形成されるコロニーの数を示す棒グラフ。単独またはＥＲＢＢ２−ＫＤとの組み合わせで、ＥＲＢＢ３変異体を発現する細胞により形成されるコロニーはほとんどなかった。 ＥＲＢＢ３変異体は、形質転換し、ＢａＦ３細胞のＩＬ３非依存性生存を促進する。（Ｄ〜Ｆ）単独（Ｄ）またはＥＲＢＢ２（Ｅ）もしくはＥＲＢＢ２−ＫＤ（Ｆ）との組み合わせのいずれかで、ＥＲＢＢ３変異体を発現するＢａＦ３細胞のｐＥＲＢＢ３、ｐＥＲＢＢ２、ｐＡＫＴ、およびｐＥＲＫ状態を示す、ウェスタンブロット。 ＥＲＢＢ３変異体は、形質転換し、ＢａＦ３細胞のＩＬ３非依存性生存を促進する。（Ｇ）抗ＮＲＧ１、ＮＲＧ１中和抗体は、ＥＲＢＢ２と共発現したＥＲＢＢ３変異体により促進されるＢａＦ３細胞のＩＬ−３非依存性生存に影響を及ぼさない。（Ｈ）ＥＲＢＢ３ ＥＣＤ変異体は、漸増用量の外因性ＮＲＧ１に応答して、増加したＩＬ−３非依存性ＢａＦ３生存を示す。ＢａＦ３研究は、ＩＬ−３（Ａ〜Ｈ）およびＮＲＧ１（Ａ〜Ｆ）の不在下で行った。ＥＶ＝空ベクター、Ｍ＝モノマー、およびＤ＝二量体。 ｓｈＲＮＡ媒介性ＥＲＢＢ３ノックダウンは、腫瘍増殖を遅延させる。（Ａ〜Ｊ）ＤＯＸ誘導時にｓｈＲＮＡを標的とする誘導ＥＲＢＢ３を安定的に発現するＣＷ−２およびＤＶ−９０は、非誘導細胞（Ａ〜Ｆ）またはｓｈＲＮＡを標的とするルシフェラーゼを発現する細胞（Ａ〜Ｆ、ＧおよびＩ）と比較して、低レベルのＥＲＢＢ３およびｐＥＲＫ（Ａ、Ｂ）、足場非依存性増殖（Ｃ〜Ｆ）、および低減したインビボ増殖（Ｈ、Ｊ）を示した。（Ｅ、Ｆ）におけるデータは、（Ｃ、Ｄ）に示されるものと同様の画像の複数ファイルから定量化される、形成された足場非依存性コロニーの数を表す。データは、平均±標準誤差として示される。 ｓｈＲＮＡ媒介性ＥＲＢＢ３ノックダウンは、腫瘍増殖を遅延させる。（Ａ〜Ｊ）ＤＯＸ誘導時にｓｈＲＮＡを標的とする誘導ＥＲＢＢ３を安定的に発現するＣＷ−２およびＤＶ−９０は、非誘導細胞（Ａ〜Ｆ）またはｓｈＲＮＡを標的とするルシフェラーゼを発現する細胞（Ａ〜Ｆ、ＧおよびＩ）と比較して、低レベルのＥＲＢＢ３およびｐＥＲＫ（Ａ、Ｂ）、足場非依存性増殖（Ｃ〜Ｆ）、および低減したインビボ増殖（Ｈ、Ｊ）を示した。（Ｅ、Ｆ）におけるデータは、（Ｃ、Ｄ）に示されるものと同様の画像の複数ファイルから定量化される、形成された足場非依存性コロニーの数を表す。データは、平均±標準誤差として示される。 ｓｈＲＮＡ媒介性ＥＲＢＢ３ノックダウンは、腫瘍増殖を遅延させる。（Ａ〜Ｊ）ＤＯＸ誘導時にｓｈＲＮＡを標的とする誘導ＥＲＢＢ３を安定的に発現するＣＷ−２およびＤＶ−９０は、非誘導細胞（Ａ〜Ｆ）またはｓｈＲＮＡを標的とするルシフェラーゼを発現する細胞（Ａ〜Ｆ、ＧおよびＩ）と比較して、低レベルのＥＲＢＢ３およびｐＥＲＫ（Ａ、Ｂ）、足場非依存性増殖（Ｃ〜Ｆ）、および低減したインビボ増殖（Ｈ、Ｊ）を示した。（Ｅ、Ｆ）におけるデータは、（Ｃ、Ｄ）に示されるものと同様の画像の複数ファイルから定量化される、形成された足場非依存性コロニーの数を表す。データは、平均±標準誤差として示される。 ＥｒｂＢ３の核酸配列（配列番号２３０）およびアミノ酸配列（配列番号２３１）を提供する。本発明の変異は、枠で囲まれたアミノ酸および枠で囲まれた／下線の付いたコドンにより示される。 ＥｒｂＢ３の核酸配列（配列番号２３０）およびアミノ酸配列（配列番号２３１）を提供する。本発明の変異は、枠で囲まれたアミノ酸および枠で囲まれた／下線の付いたコドンにより示される。 ＥｒｂＢ３の核酸配列（配列番号２３０）およびアミノ酸配列（配列番号２３１）を提供する。本発明の変異は、枠で囲まれたアミノ酸および枠で囲まれた／下線の付いたコドンにより示される。
ＥｒｂＢ３癌検出薬
一態様では、本発明は、ＥｒｂＢ３癌検出薬を提供する。一実施形態では、この検出薬は、図３９に示されるＥｒｂＢ３配列（配列番号２３１のアミノ酸配列または配列番号２３０の核酸配列）に特異的に結合することができる試薬を含む。別の実施形態では、検出薬は、図２（配列番号１）または図３９（配列番号２３０）に示されるＥＲＢＢ３核酸配列に特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを含む。好適な実施形態では、ポリヌクレオチドは、図３９に示される変異を含むＥｒｂＢ３核酸配列に特異的にハイブリダイズする、核酸配列を含む（配列番号２３０）。
興味深いことには、特定された変異残基の大部分は、ＥＲＢＢ３相同分子種を越えて保存され（図６に示される、ならびにＣ．ｌｕｐｕｓ（配列番号１３１のＸＰ＿５３８２２６．２）配列）、残基の一部は、ＥＲＢＢファミリーメンバー間で保存され、これらの変異が機能的効果を有する可能性があることをさらに示唆する。
Figure 2018085998
Figure 2018085998

Claims (33)

  1. ＥｒｂＢ３核酸配列中のＥｒｂＢ３変異に特異的に結合することができる試薬を含む、ＥｒｂＢ３消化管癌検出薬。
  2. 前記ＥｒｂＢ３核酸配列が、配列番号３または１を含む、請求項１に記載の癌検出薬。
  3. 前記試薬が、式
    Figure 2018085998
    のポリヌクレオチドを含み、式中、
    Ｘは任意の核酸であり、ａは約０〜約２５０であり、
    ＹはＥｒｂＢ３変異コドンであり、
    Ｚは任意の核酸であり、ｂは約０〜約２５０である、請求項１に記載の癌検出薬。
  4. 前記変異コドンが、（ｉ）配列番号２の１０４、８０９、２３２、２６２、２８４、３２５、８４６、９２８、６０、１１１、１３５、２９５、４０６、４５３、４９８、１０８９、および１１６４からなる群から選択される位置のアミノ酸、または（ｉｉ）１９３位の終止コドンをコードする、請求項３に記載の癌検出薬。
  5. 対象から得られる生体試料においてＥｒｂＢ３をコードする核酸配列中の変異を検出することを含む、前記対象におけるＥｒｂＢ３消化管癌の存在を決定する方法であって、前記変異が、前記ＥｒｂＢ３アミノ酸配列の少なくとも１つの位置にアミノ酸変化をもたらし、前記変異が、前記対象におけるＥｒｂＢ３消化管癌を示す、方法。
  6. アミノ酸変化をもたらす前記変異が、配列番号２の１０４、８０９、２３２、２６２、２８４、３２５、８４６、９２８、６０、１１１、１３５、２９５、４０６、４５３、４９８、１０８９、１１６４、および１９３からなる群から選択される位置に存在する、請求項５に記載の方法。
  7. 対象から得られる生体試料においてＥｒｂＢ３をコードする核酸配列中のアミノ酸変異の存在または不在を検出することを含む、前記対象におけるＥｒｂＢ３癌の存在を決定する方法であって、前記変異が、配列番号２の１０４、８０９、２３２、２６２、２８４、３２５、８４６、９２８、６０、１１１、１３５、２９５、４０６、４５３、４９８、１０８９、１１６４、１９３、４９２、および７１４からなる群から選択される少なくとも１つの位置にアミノ酸変化をもたらし、前記変異の存在が、前記対象におけるＥｒｂＢ３癌を示す、方法。
  8. 治療薬を前記対象に投与することをさらに含む、請求項５または７に記載の方法。
  9. 前記治療薬が、ＥｒｂＢ阻害剤である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ＥｒｂＢ阻害剤が、ＥＧＦＲ拮抗薬、ＥｒｂＢ２拮抗薬、ＥｒｂＢ３拮抗薬、ＥｒｂＢ４拮抗薬、およびＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３拮抗薬からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記阻害剤が、低分子阻害剤である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記拮抗薬が、拮抗薬抗体である、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記抗体が、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、および抗体断片からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記消化管癌が、胃癌または結腸癌である、請求項１に記載の検出薬または請求項５に記載の方法。
  15. 前記ＥｒｂＢ３癌が、胃癌、結腸癌、食道癌、直腸癌、盲腸癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）腺癌、ＮＳＣＬＣ（扁平上皮癌）、腎癌、黒色腫、卵巣、大細胞肺癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肺癌、および膵臓癌からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
  16. （ｉ）必要とする対象を特定すること、および／または（ｉｉ）必要とする対象から試料を得ることをさらに含む、請求項５または７に記載の方法。
  17. 前記検出が、前記変異を増幅するか、または配列決定することと、前記変異またはその配列を検出することと、を含む、請求項５または７に記載の方法。
  18. 前記増幅が、増幅プライマーまたは増幅プライマー対を、前記試料から単離された核酸鋳型と混合することを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記プライマーまたはプライマー対が、前記変異の近位にあるか、またはそれを含む領域に相補的であるか、または部分的に相補的であり、前記核酸鋳型上でポリメラーゼによる核酸重合を開始することができる、請求項１８に記載の方法。
  20. ポリメラーゼおよび前記核酸鋳型を含むＤＮＡ重合反応において前記プライマーまたはプライマー対を伸長させて増幅産物を生成することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記変異が、前記生体試料から単離されたゲノムＤＮＡ中の前記変異を配列決定すること、前記変異もしくはその増幅産物をアレイにハイブリダイズすること、前記変異もしくはその増幅産物を制限酵素で消化すること、または前記変異のリアルタイムＰＣＲ増幅のうちの１つ以上を含むプロセスにより検出される、請求項１７に記載の方法。
  22. 前記生体試料から単離された核酸中の前記変異を部分的または完全に配列決定することを含む、請求項１７に記載の方法。
  23. 前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を、前記ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、またはＬＣＲにおける鋳型としての前記生体試料から単離された核酸を用いて行うことを含む、請求項１７に記載の方法。
  24. 必要とする対象における消化管癌を治療する方法であって、
    ａ）前記対象から得られる生体試料においてＥｒｂＢ３をコードする核酸配列中の変異を検出することであって、前記変異が、前記ＥｒｂＢ３アミノ酸配列の少なくとも１つの位置にアミノ酸変化をもたらし、前記変異が、前記対象におけるＥｒｂＢ３消化管癌を示す、検出することと、
    ｂ）治療薬を前記対象に投与することと、を含む、方法。
  25. アミノ酸変化をもたらす前記変異が、配列番号２の１０４、８０９、２３２、２６２、２８４、３２５、８４６、９２８、６０、１１１、１３５、２９５、４０６、４５３、４９８、１０８９、１１６４、および１９３からなる群から選択される位置に存在する、請求項２４に記載の方法。
  26. 対象におけるＥｒｂＢ３癌を治療する方法であって、
    前記対象から得られる生体試料においてＥｒｂＢ３をコードする核酸配列中のアミノ酸変異の存在または不在を検出することであって、前記変異が、配列番号２の１０４、８０９、２３２、２６２、２８４、３２５、８４６、９２８、６０、１１１、１３５、２９５、４０６、４５３、４９８、１０８９、１１６４、１９３、４９２、および７１４からなる群から選択される少なくとも１つの位置にアミノ酸変化をもたらし、前記変異の存在が、前記対象におけるＥｒｂＢ３癌を示す、検出することと、
    ｂ）治療薬を前記対象に投与することと、を含む、方法。
  27. 前記治療薬が、ＥｒｂＢ阻害剤である、請求項２４または２６に記載の方法。
  28. 前記ＥｒｂＢ阻害剤が、ＥＧＦＲ拮抗薬、ＥｒｂＢ２拮抗薬、ＥｒｂＢ３拮抗薬、ＥｒｂＢ４拮抗薬、およびＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３拮抗薬からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記拮抗薬が、低分子阻害剤である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記拮抗薬が、拮抗薬抗体である、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記抗体が、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、および抗体断片からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記消化管癌が、胃癌または結腸癌である、請求項２４に記載の方法。
  33. 前記ＥｒｂＢ３癌が、胃癌、結腸癌、食道癌、直腸癌、盲腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）腺癌、ＮＳＣＬＣ（扁平上皮癌）、腎癌、黒色腫、卵巣癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肺癌、および膵臓癌からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
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