MX2012014552A - Conjugados de farmaco y anticuerpo humano contra factor de tejido. - Google Patents

Conjugados de farmaco y anticuerpo humano contra factor de tejido.

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Abstract

La invención describe conjugados de fármaco y anticuerpo contra factor de tejido. También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos y conjugados de fármaco y anticuerpo, y métodos terapéuticos y de diagnóstico para usar los anticuerpos y los conjugados de fármaco y anticuerpo.

Description

CONJUGADOS DE FARMACO Y ANTICUERPO HUMANO CONTRA FACTOR DE TEJIDO Campo de la Invención La presente invención se refiere a conjugados de fármaco y anticuerpo (ADC, por sus siglas en inglés) , donde los anticuerpos se unen a un epítopo en el factor de tejido. Estos ADC son útiles en particular en el tratamiento de cáncer, inflamación y enfermedades vasculares.
Antecedentes de la Invención El factor de tejido (TF, por sus siglas en inglés), también llamado tromboplastina, factor III o CD142 es una proteína presente en tejido subendotelial , plaquetas, y leucocitos, necesario para el inicio de la formación de trombina a partir de protrombina de zimógeno. La formación de trombina conduce finalmente a la coagulación de la sangre. El factor de tejido permite que las células inicien las cascadas de coagulación sanguínea, y funciona como el receptor de alta afinidad para el factor VII de coagulación (FVII) , una serina-proteasa. El complejo resultante proporciona un evento catalítico que es responsable del inicio de las cascadas de proteasa de coagulación por proteólisis limitada específica. Diferente de los otros cofactores de estas cascadas de proteasa, que circulan como precursores no funcionales, este factor es un potente inhibidor que es completamente funcional Ref . :237615 cuando se expresa en las superficies celulares.
El factor de tejido es el receptor de superficie celular para el factor Vlla (FVIIa) de serina-proteasa. La unión de FVIIa al factor de tejido inicia los procesos de señalización dentro de la célula, esta función de señalización que juega un papel en la angiogénesis . En tanto que la angiogénesis es un proceso normal en el crecimiento y desarrollo, así como en la curación de heridas, también es un paso fundamental en la transición de tumores desde un estado inactivo a un estado maligno: cuando las células de cáncer dañan la capacidad de producir proteínas que participan en la angiogénesis, llamados factores de crecimiento angiogénicos, estas proteínas se liberan por el tumor en tejidos cercanos, y estimulan que broten nuevos vasos sanguíneos a partir de los vasos sanguíneos saludables existentes hacia y en el tumor . Una vez que los nuevos vasos sanguíneos entran al tumor, pueden expandir rápidamente su tamaño e invadir los órganos y tej idos locales . A través de los nuevos vasos sanguíneos, las células de cáncer pueden escapar adicionalmente a la circulación y alojarse en otros órganos para formar nuevos tumores (metástasis) .
Adicionalmente, el TF juega un papel en la inflamación. Se asume que el papel de TF se media por la coagulación sanguínea (A. J Chu: (A. J. Chu: "Tissue factor mediates inflammation" en Archives of biochemistry and biophysics, 2005, volumen 440, No. 2, páginas 123-132) . Por consiguiente, la inhibición de TF, por ejemplo, por un anticuerpo monoclonal antiTF es de significado en la interrupción del ciclo coagulación- inflamación en contribución no sólo a la antiinflamación, sino también a enfermedades vasculares.
Se observa la expresión de FT en muchos tipos de cáncer y está asociada con una enfermedad más agresiva.
Adicionalmente, TF humano también existe en una forma soluble alternativamente empalmada, asHTF. Recientemente se ha encontrado que asHTF promueve el crecimiento tumoral (Hobbs et al., 2007 Thrombosis Res. 120(2) S13-S21) .
Aunque se ha hecho mucho progreso, permanece la necesidad de métodos mejorados para tratar enfermedades serías, por ejemplo, tratamiento mejorado de cáncer, inflamación y enfermedad vascular a base de anticuerpos terapéuticos .
Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF altamente específicos y efectivos, en particular para el uso en el tratamiento de cáncer.
Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a nuevos conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF que son útiles para el tratamiento de cáncer, inflamación y enfermedades vasculares, Los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención son altamente efectivos en aniquilar células que expresan factor de tejido (TF) . Adicionalmente , los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF son ventajosos al tener inhibición limitada o ninguna inhibición de coagulación.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Alineación de secuencias de los anticuerpos de la presente invención. Los SEQ Ip NOs se listan en paréntesis a la derecha de la secuencia. CDRl, CDR2 y CDR3 de acuerdo a Kabat se indican como sigue: secuencias en cursivas y negritas representan la región CDRl, secuencias subrayadas representan la región CDR2 , secuencias en negritas representan la región CDR3.
Figura 2: Secuencias de IgG4 (SEQ ID NO: 81-82). SEQ ID NO: 81: La secuencia de aminoácidos de la región CH tipo silvestre de IgG4 humana. Las secuencias en cursivas representan la región CH1, las secuencias resaltadas representan la región bisagra, las secuencias regulares representan la región CH2 y las secuencias subrayadas representan la región CH3. SEQ ID NO: 82: La secuencia de aminoácidos de la región CH sin bisagra, de una IgG4 humana.
Figura 3 : Unión de Hu ab antiTF al dominio extracelular de TF. La unión se determinó por ELISA. Los valores de EC50 son la media de 3 experimentos .
Figuras 4A-4C: Unión de HuMab antiTF a. TF unido a membrana en células MDA-MD-231. La unión se determinó por análisis por FACS y los anticuerpos se dividieron en tres grupos mostrados en las Figuras 4A-4C, ver también WO 10/066803 donde los anticuerpos se dividieron en grupos de bloques cruzados.
Figura 5 : Inhibición de la unión FVIIa por HuMab antiTF, se midió por análisis por FACS. Los datos mostrados son las intensidades medias de fluorescencia (MFI, por sus siglas en inglés) para la unión de FVIIa en la presencia de concentraciones crecientes de HuMab antiTF. MFI para FVIIa 100 nM en la ausencia de HuMab antiTF fue 149,942. Se muestra un experimento representativo.
Figuras 6A-6C: Inducción dependiente de la dosis de la aniquilación celular de HuMab antiTF conjugados a antikappa-ETA' .
Figuras 7A-7B: Unión de HuMab antiTF y ADC a proteína recombinante del dominio extracelular de TF, determinado por ELISA. Se muestra un. experimento representativo.
Figuras 8A-8C: Inducción dependiente de la dosis in vi tro de aniquilación celular por ADC antiTF. Se muestra un experimento representativo para cada línea de células: A43K8A), HPAF-II (8B) y NC H441(8C). Los datos mostrados son porcentajes de supervivencia ± S.E.M. de concavidades duplicados de células tratadas con ADC antiTF.
Figuras 9A-9B: Eficacia in vivo de los ADC antiTF en tratamiento terapéutico de xenoinjertos A 31 y HPAF-II en ratones SCID. Los ratones con tumores A431(9A) o HPAF-II (9B) establecidos se trataron con ADC antiTF. Los datos mostrados son valores tumorales medios ± S.E.M. por grupo (n = 7 ratones por grupo) .
Figuras 10A-10H: Análisis por SDS-PAGE de los ADC e IgGl no conjugada para probar estabilidad. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE al inicio del estudio (t = 0) (10A-10D) o después del almacenamiento a 5o C y < -65 °C durante tres meses (10E-10H) . (10A,10C), senda 1,9: marcados de peso molecular (MW) , senda 2: control interno de IgGl, senda 3: HuMab-TF-098 , senda 4: HuMab-TF- 098 -vcMMAE, senda 5: HuMab-TF-098-mcMMAF, senda 6: HuMab-TF- 011 , senda 7: HuMab-TF- 011-vcMMAE, senda 8: HuMab-TF-mcMMAF . (10B,10D), sendas 1, 9, 10: marcador de MW, senda 2: control interno de IgGl, senda 3: HuMab-TF-111, senda 4: HuMab-TF- 111-vcMMAE, senda 5: HuMab-TF-lll-mcMMAF, senda 6: IgGl-bl2, senda 7: IgGl-bl2-vcMMAE , senda 8: IgGl-bl2-mcMMAF. (10E,10G) sendas 1,11: marcador de MW, senda 2: control interno de IgGl, senda 3: HuMab-TF- 098 -vcMMAE después de 3 meses a < -65°C, senda 4: HuMab-TF- 098 -vcMMAE después de 3 meses a 5°C, senda 5: HuMab-TF- 098 -mcMMAF después de 3 meses a < -65°C, senda 6: HuMab-TF- 098 -mcMMAF después de 3 meses a 5°C, senda 7: HuMab-TF-011-vcMMAE después de 3 meses a < -65°C, senda 8: HuMa - F- 011- cMMAE después de 3 meses a 5°C, senda 9: HuMab-TF- 011-mcMMAF después de 3 meses a < -65°C, senda 10: HuMab-TF-011-mcMMAF después de 3 meses a 5°C. (10F,10H) sendas 1, 11, 12: marcador M , senda 2: control interno de IgGl, senda 3: HuMab-TF-111-vcMMAE después de 3 meses a < -65°C, senda 4: HuMab- F-111-vcMMAE después de 3 meses a 5°C, senda 5: HuMab-TF-111-mcMMAF después de 3 meses a < -65°C, senda 6: HuMab-TF- 111-mcMMAF después de 3 meses a 5°C, senda 7: IgGl-bl2 -vcMMAE después de 3 meses a < -65°C, senda 8: IgGl-bl2 -vcMMAE después de tres meses a 5°C, senda 9: IgGl-bl2 -mcMMAF después de 3 meses a < -65 °C, senda 10: IgGl-bl2 -mcMMAF después de 3 meses a 5°C. Para condiciones no reductoras, se indican los tamaños de las diferentes combinaciones de cadena pesada (H) - cadena ligera (L) : 148 kDa (HHLL) , 125 kDa (HHL) , 99 kDa (HH) , 67 kDa (HL) , 51 kDa (H) y 25 kDa (L) .
Figuras 11A-11H: Perfiles de cromatografía de exclusión de tamaño de alto desempeño (HP-SEC) de HuMab-TF-098 -VCMMAE (HA), HuMab-TF- 098 -mcMMAF (11B) , HuMa - F-011- cMMAE (11C), HuMab-TF- 011 -mcMMAF (11D) , HüMab-TF- 111-VCMMAE (HE) , HuMab-TF -111-mcMMAF (11F) , IgGl-bl2 -vcMMAE (11G) y IgGl-bl2 -mcMMAF (11H) al inicio del estudio y después del almacenamiento a < -65 °C o 5°C durante tres meses.
Figura 12 : Ensayo de unión de los ADC e IgGl no conjugada a TF-ECDHis para probar estabilidad. Las muestras se analizaron para unión al inicio del estudio (t = 0) o después del almacenamiento a 5°C y < -65 °C durante tres meses .
Figura 13: Dosis-respuesta in vivo de los ADC antiTF en tratamiento terapéutico de xenoinjertos HPAF-II en ratones SCID. Ratones con tumores HPAF-II establecidos se trataron con los ADC vcMMAE antiTF. Los datos mostrados son volúmenes tumorales medios + S.E.M. por grupo (n = 8 ratones por grupo) .
Descripción Detallada de la Invención Definiciones Los términos "factor de tejido", "TF" , "CD142" , "antígeno de factor de tejido", "antígeno de TF" y "antígeno CD142" se usan de manera indistinta en la presente, y, a menos que se especifique de otro modo, incluyen cualesquiera de las variantes, isoformas y homólogos de especie del factor de tejido humano que se expresan de manera natural por células o se expresan en las células transfectadas con el gen del factor de tejido. El factor de tejido puede ser la secuencia con el número de acceso a Genbank NP_001984 usada en el ejemplo 1.
El término "inmunoglobulina" se refiere a una clase de glicoproteínas estructuralmente relacionadas que consisten de dos pares de cadenas de polipéptido, un par de cadenas ligeras (L) de bajo peso molecular, y un par de cadenas pesadas (H) , todas las cuatro interconectadas por enlaces de disulfuro. La estructura de las inmunoglobulinas se ha caracterizado bien. Ver, por ejemplo Fundamental Ch. Inmunology. Ch. 7 (Paul, W., ed., 2a edición, Raven Press, Nueva York (1989) ) . En forma breve, cada cadena pesada está comprendida típicamente en una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH o VH) y una región constante de cadena pesada (CH o CH) . La región constante de cadena pesada está comprendida típicamente de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida típicamente de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL o VL) y una región constante de cadena ligera (CL o CL) . La región constante de cadena ligera está comprendida típicamente de un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad (o regiones hipervariables , que pueden ser hipervariables en secuencia y/o forma de asas estructuralmente definidas) , también llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), intercaladas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones base o menos variables (FR, por sus siglas en inglés) . Cada VH y VL está compuesta típicamente de tres CDR y cuatro FR, arregladas desde el amino-término al carboxi-término en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 , FR4 (ver también Chothia y Lesk J. Mol. Biol . 196 , 901-917 (1987) ) . Típicamente, la numeración de los residuos de aminoácido en esta región se realiza por el método descrito en Kabat et al., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- Edición. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (las frases tal como numeración de residuos de dominio variable como en Kabat o de acuerdo a Kabat en la presente se refieren a este sistema de numeración para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera) . Al usar este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos, lineal, real de un péptido puede contener menos o adicionales aminoácidos que corresponden a un acortamiento de, o inserción en, una FR o CDR del dominio variable, por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una inserción aminoácido individual (residuo 52a de acuerdo a Kabat) después del residuo 52 de VHCDR2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b, y 82c, etcétera, de acuerdo a Kabat) después del residuo 82 de FR de cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos se puede determinar para un anticuerpo determinado por alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia "normal" numeradas según Kabat.
El término "anticuerpo" (Ab) en el contexto de la presente invencipn se refiere a una molécula de inmunoglobulina, un fragmento de una molécula de inmunoglobulina, o un derivado de cualquiera de estos, que tiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno bajo condiciones fisiológicas típicas con una vida media de períodos significativos de tiempo, tal como al menos aproximadamente 30 minutos, al menos aproximadamente 45 minutos, al menos aproximadamente una hora, al menos aproximadamente dos horas, al menos aproximadamente cuatro horas, al menos aproximadamente 8 horas, al menos aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas o más, aproximadamente 48 horas o más, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7 o más días, etcétera, o cualquier otro período pertinente definido funcionalmente (tal como un tiempo suficiente para inducir, promover, mejorar y/o modular una respuesta fisiológica asociada con la unión del anticuerpo al antígeno y/o tiempo suficiente para que el anticuerpo reclute una actividad efectora) . Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de la molécula de inmunoglobulina contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos (Ab) pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, incluyendo varias células del sistema inmunitario (tal como células efectoras) y componentes del sistema de complemento tal como Clq, el primer componente en la ruta clásica de activación de complemento. Como se indica anteriormente, el término anticuerpo en la presente, a menos que se señale de otro modo o se contradiga claramente por el contexto, incluye fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para unirse específicamente al antígeno. Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "anticuerpo" incluyen (i) un fragmento Fab' o Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1 , o un anticuerpo monovalente como se describe en WO2007059782 (Genmab A/S) ; (ii) fragmentos F(ab' )2/ fragmentos bivalentes que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región bisagra, (iii) un fragmento Fd que consiste esencialmente de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste esencialmente de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb ( ard et al., Nature 341, 544-546 (1989)), que consiste esencialmente de un dominio VH y también los llamados anticuerpos de dominio (Holt et al; Trends Biotechnol . Noviembre del 2003 ,-21 (11) : 484-90) , (vi) anticuerpos camélidos o nanocuerpos (Revets et al; Expert Opin. Biol . Ther. Enero del 2005 ; 5(1) : 111-24) y (vii) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento de Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes , por un ligador sintético que les permite hacerlos como una cadena individual de proteína en la cual el par de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes (conocido como anticuerpos de cadena individual o Fv de cadena individual (scFv) , ver por ejemplo Bird et al., Science 242, 423-426(1988) y Huston et al., PNAS EUA 85, 5879-5883(1988)). Estos anticuerpos de cadena individual se abarcan dentro del término anticuerpo a menos que se señales de otro modo o se indique claramente por el contexto. Aunque estos fragmentos se incluyen en general dentro del significado de anticuerpo, colectivamente y cada uno independientemente son características únicas de la presente invención, que exhiben propiedades biológicas diferentes y utilidad. Estos y otros fragmentos útiles de anticuerpos en el contexto de la presente invención se analizan adicionalmente en la presente. Se debe entenderse que el término anticuerpo, a menos que se especifique de otro modo, también incluye anticuerpos policlonales , anticuerpos monoclonales (mAb) , péptidos tipo anticuerpo, tal como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados y fragmentos de anticuerpo que retienen la capacidad para unirse específicamente al antígeno (fragmentos de unión a antígeno) proporcionado por cualquier técnica conocida, tal como escisión enzimática, síntesis peptídica, y técnicas recombinantes . Un anticuerpo como se genera puede poseer cualquier isotipo.
En el contexto de la presente invención el término "ADC" se refiere a un conjugado de fármaco y anticuerpo, que en el contexto de la presente invención se refiere a un anticuerpo antiTF, que se acopla a otra porción, como se describe en la presente solicitud.
Un "anticuerpo antiTF" es un anticuerpo como se describe anteriormente, que se une de manera específica al factor de tejido de antígeno o al antígeno de factor de tej ido .
El término "anticuerpo humano" , como se usa en la presente, se propone que incluya anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo) . Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, no se propone que incluya anticuerpos en los cuales en las secuencias base humanas se han insertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie mamífera, tal como un ratón.
En una modalidad preferida, el anticuerpo del conjugado de fármaco y anticuerpo, o el conjugado de fármaco y anticuerpo de la invención, está aislado. Un "anticuerpo aislado" o "conjugado de fármaco y anticuerpo aislado", como se usa en la presente, se propone para referirse a un anticuerpo o conjugado de fármaco y anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo un anticuerpo aislado que se une específicamente al factor de tejido está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen de manera específica a antígenos diferentes del factor de tejido) . Un conjugado de fármaco y anticuerpo aislado como se usa en la presente, se propone para referirse a un conjugado de fármaco y anticuerpo que está también sustancialmente libre de "toxina libre", en donde "toxina libre" se propone que signifique toxina que no está conjugada al anticuerpo. El término "sustancialmente libre de" como se usa con relación a la toxina puede significar en particular que está presente menos de 5 %, tal como menos de 4 %, o menos de 3 %, o menos de 2 %, o menos de 1.5 ¾-, o menos de 1 %, o menos de 0.5 % de fármaco no conjugado cuando se determina como se describe en el ejemplo 16. Un anticuerpo aislado o conjugado de fármaco y anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de factor de tejido humano puede tener, sin embargo, reactividad cruzada a otros antígenos relacionados, por ejemplo de otras especies (tal como homólogos de especie de factor de tejido) . Además, un anticuerpo aislado o conjugado de fármaco y anticuerpo puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos. En una modalidad de la presente invención, en una composición bien definida se combinan dos o más anticuerpos monoclonales "aislados" o conjugados de fármaco y anticuerpo que tienen diferentes especificidades de unión a antígeno.
Cuando se usa en la presente en el contexto de dos o más anticuerpos, el término "compite con" o "compite de forma cruzada con" indica que los dos o más anticuerpos compiten para la unión a TF, por ejemplo, compiten para la unión a TF en el ensayo como se describe en el ejemplo 12 de la O 10/066803. Para algunos pares de anticuerpos, la competición como en el ensayo del ejemplo 12 de la WO 10/066803 solo se observa cuando se reviste un anticuerpo en la placa y el otro se usa para competir, y no viceversa. El término "compite con" cuando se usa en la presente también se propone que cubra estas combinaciones de anticuerpos .
Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" tal como se usa en la presente, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular individual. El anticuerpo monoclonal o composición del mismo puede ser anticuerpos conjugados a fármaco de acuerdo a la presente invención. Una composición de anticuerpo monoclonal presenta una especificidad de unión y afinidad, individual, para un epítopo particular. Por consiguiente, el término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que presentan una especificidad de unión individual que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden generar por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico o transcromosómico, tal como un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgen humano de cadena pesada y un transgen de cadena ligera, fusionado a una células inmortalizada.
Como se usa en la presente, los términos "que se une" " que se une específicamente" en el contexto de la unión de un anticuerpo a un antígeno predeterminado típicamente es una unión con una afinidad que corresponde a una KD de aproximadamente 10"7 M o menos, tal como aproximadamente 10"8 M o menos, tal como aproximadamente 10" 9 M o menos, aproximadamente 10"10 M o menos, o aproximadamente de 10"11 M o menos cuando se determina por ejemplo por tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) en un instrumento BIAcore 3000 usando el antígeno como el ligando y el anticuerpo como el analito, y se une al antígeno predeterminado con una afinidad qúe corresponde a una KD que es al menos diez veces menor, tal como al menos 100 veces menor, por ejemplo al menos 1,000 veces menor, tal como al menos 10,000 veces menor, por ejemplo al menos 100,000 veces menor que su afinidad por la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) diferentes del antígeno predeterminado o un antígeno cercanamente relacionado. La cantidad con la cual la afinidad es menor es dependiente de la KD del anticuerpo, de modo que cuando es muy baja la KD del anticuerpo (es decir, el anticuerpo es altamente específico) , entonces la cantidad con la cual es menor la afinidad al antígeno que la afinidad para un antígeno no específico puede ser al menos 10,000 veces.
El término "kd" (seg"1) , como se usa en la presente, se refiere a una constante de velocidad de disociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno. Este valor también se refiere como el valor kdisociación.
El término "ka" (M"1 x seg"1) , como se usa en la presente, se refiere a la constante de velocidad de asociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno .
El término "KD" (M) , como se usa en la presente, se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno.
El término " A" (M"1) , como se usa en la presente, se refiere a la constante de equilibrio de asociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno y se obtiene al dividir la ka por la kd.
Como se usa en la presente, el término "internalización" , cuando se usa en el contexto de un anticuerpo de TF incluye cualquier mecanismo por el cual el anticuerpo se internaliza en una célula que expresa TF desde la superficie celular. La internalización de un anticuerpo se puede evaluar en un ensayo directo o indirecto, donde se mida el efecto de un complejo o conjugado de anticuerpo-toxina, internalizado (tal como, por ejemplo, el ensayo antikappa-ETA' del ejemplo 15 o el ensayo de internalización y aniquilación celular del ejemplo 18) . En general, se usa un ensayo directo para medir la internalización de los conjugados de fármaco y anticuerpo, tal como el ensayo descrito en el ejemplo 18 de la presente, en tanto que se pueden usar ensayos indirectos para medir la internalización de anticuerpos que entonces se pre-incuban con un anticuerpo conjugado, secundario, tal como el ensayo descrito en el ejemplo 15 de la presente.
La presente invención también proporciona, en una modalidad, anticuerpos que comprenden variantes funcionales de la región VL, región VH, una o más CDR de los anticuerpos de los ejemplos. Una variante funcional de una VL, VH, o CDR usada en el contexto de un anticuerpo antiTF permite aun que el anticuerpo retenga al menos una proporción sustancial (al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más) de la afinidad/avidez y/o la especificidad/selectividad del anticuerpo de origen y en algunos casos este anticuerpo antiTF se puede asociar con mayor afinidad, selectividad y/o especificidad que el anticuerpo de origen.
Estas variantes funcionales retienen típicamente identidad significativa de secuencia al anticuerpo de origen. El por ciento de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100) , tomando en cuenta el número de separaciones, y la longitud de cada separación, que se necesitan introducir para alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del por ciento de identidad entre dos secuencias se pueden lograr usando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes posteriores El por ciento de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en htt : //www. gcg . com) , usando una matriz WSgapdna . CMP y un peso de separación de 40, 50, 60, 70, o 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. El por ciento de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos también se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17(1988)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una Tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad de longitud de separación de 12 y una penalidad se separación de 4. Además, el por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol . 48, 444-453(1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando ya sea una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de separación de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6.
La secuencia de las variantes de CDR puede diferir de la secuencia de la CDR de las secuencias del anticuerpo de origen a través de sustituciones principalmente conservadoras, por ejemplo al menos aproximadamente 35 %, aproximadamente 50 % o más, aproximadamente 60 % o más, aproximadamente 70 % o más, aproximadamente 75 % o más, aproximadamente 80 % o más, aproximadamente 85 % o más, aproximadamente 90 % o más, aproximadamente 95 % o más (por ejemplo, aproximadamente de 65 99 %, tal como aproximadamente 96 %, 97 % o 98 %) de las sustituciones en la variante son reemplazas conservadores de residuos de aminoácido.
La secuencia de variantes de CDR pueden diferir de la secuencia de la CDR de las secuencias de anticuerpo de origen a través de sustituciones principalmente conservadoras, por ejemplo al menos 10, tal como al menos 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o l de las sustituciones en la variante son reemplazos conservadores de residuos de aminoácido.
En el contexto de la presente invención, las sustituciones conservadoras se pueden definir por sustituciones dentro de las clases de aminoácidos reflejadas en una o más de las siguientes tres tablas : Clases de residuos de aminoácido para sustituciones conservadoras Clases alternativas de sustituciones conservadoras de residuos de aminoácido Clasificaciones físicas y funcionales alternativas de residuos de aminoácido Los agrupamientos de sustituciones más conservadoras se incluyen: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina .
También se pueden formular grupos adicionales de aminoácidos usando los principios descritos en, por ejemplo, Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2- Edición, 1993) , W.H. Freeman and Company.
En una modalidad de la presente invención, la conservación en términos de propiedades hidropáticas/hidrófilas y peso/ tamaño de residuo también se retiene sustancialmente en una CDR variante en comparación a una CDR de un anticuerpo de los ejemplos (por ejemplo, la clase de peso, puntuación hidropática, o ambas de las secuencias son al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximádamente 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, o más (por ejemplo, aproximadamente de 65-99 %) retenidas) . Por ejemplo, las sustituciones conservadoras de residuos también o de manera alternativa se pueden basar en el reemplazo de grupos de conservación a base de peso fuerte o débil que se conocen en la técnica.
La retención de residuos similares también o de manera alternativa se puede medir por una puntuación de similitud, como se determina por el uso de un programa BLAST (por ejemplo, BLAST 2.2.8 disponible a través del NCBI que usa ajustes normales BLOSUM62, separación abierta = 11 y separación extendida = 1) . Las variantes adecuadas exhiben típicamente al menos aproximadamente 45 %, tal como al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o más (por ejemplo, aproximadamente 70-99 %) de similitud al péptido de origen.
Como se usa en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de inmunoglobulina (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, o IgM) que se codificada por los genes de la región constante de cadena pesada.
El término "epitopo" significa a un determinante de proteína capaz de unión específica a un anticuerpo. Los epítopos consisten usualmente de agrupamientos superficiales de moléculas tal como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen usualmente características estructurales tridimensionales específicas, así como características específicas de carga. Los epítopos conformacionales y no conformacional se distinguen ya que la unión de los anteriores pero no de los últimos se pierde en la presencia de solventes desnaturalizantes. Los epítopos pueden comprender residuos de aminoácido directamente comprendidos en la unión (también llamado componente inmunodominante del epitopo) y otros residuos de aminoácido, que no están comprendidos directamente en la unión, tal como residuos de aminoácido que se bloquean de manera efectiva por el péptido específicamente de unió a antígeno (en otras palabras, el residuo de aminoácido está dentro del espacio del péptido específicamente de unión a antígeno) .
Como se usa en la presente, un anticuerpo humano se "deriva de" una secuencia de línea germinal particular si el anticuerpo se obtiene de un sistema que usa secuencias de inmunoglobulinas humanas, por ejemplo al inmunizar un ratón transgénico que tiene genes de inmunoglobulina humana o al examinar una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana, y en donde el anticuerpo humano seleccionado es al menos 90 %, tal como al menos 95 %, por ejemplo al menos 96 %, tal como al menos 97 %, por ejemplo al menos 98 %, o al menos 99 % idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal. Típicamente, fuera de la CDR3 de cadena pesada, un anticuerpo humano derivado de una secuencia particular de línea germinal humana presentará no más de 20 diferencias de aminoácido, por ejemplo, no más de 10 diferencias de aminoácido, tal como no más de 9, 8, 7, 6 o 5, por ejemplo no más de 4, 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal.
Como se usa en la presente, el término "inhibe el crecimiento" (por ejemplo, con referencia a células, tal como células tumorales) se propone que incluya cualquier disminución medible en el crecimiento de celular cuando se pone en contacto con un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF en comparación al crecimiento de las mismas células sin el contacto con un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF, por ejemplo, la inhibición de crecimiento de un cultivo celular por al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % , 90 %, 99 %, O 100 %. Esta disminución en el crecimiento celular puede presentarse por una variedad de mecanismos ejercidos por el anticuerpo antiTF y el fármaco, ya sea de manera individua o en combinación, por ejemplo, fagocitosis mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCP, por sus siglas en inglés) , citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) , citotoxicidad mediada por complemento (CDC, por sus siglas en inglés) , y/o apoptosis, o detención del ciclo celular G2/M y apoptosis, tal como se pueda inducir por una interacción de la auristatina con tubulina.
El término "anticuerpo tipo IgG4 estabilizado" se refiere a un anticuerpo tipo IgG4 que se ha modificado para reducir el intercambio de media molécula (ver el O 2008/145142 (Genmab A/S) o van der Neut Kolfschoten M et al., (2007) Science 14/317(5844) y referencias en los mismos) .
Como se usa en la presente, el término "célula efectora" se refiere a una célula inmunitaria que está comprendida en la fase efectora de una respuesta inmunitaria, como lo opuesto en las fases cognitiva y de activación de una respuesta inmunitaria. Las células inmunitarias de ejemplo incluyen una célula de un origen mieloide o linfoide, por ejemplo, linfocitos (tal como células B y células T, que incluyen células T citolíticas (CTL) ) , células aniquiladoras, células aniquiladoras naturales, macrófagos, monocitos, eosinófilos, células polimorfonucleares, tal como neutrófilos, granulocitos , células cebadas y basófilos.
Algunas células efectoras expresan receptores Fe específicos (FcR) y llevan a cabo funciones inmunitarias específicas. En algunas modalidades, una célula efectora es capaz de inducir ADCC, tal como una célula aniquiladora natural, capaz de inducir ADCC. Por ejemplo, los monocitos, macrófagos, que expresan FcR están comprendidos en la aniquilación específica de células objetivo o diana y que presentan antígenos a otros componentes del sistema inmunitario, o unión a células que presentan antígenos. En algunas modalidades, una célula efectora puede fagocitozar un antígeno objetivo o célula objetivo. La expresión de un FcR particular en una célula efectora se puede regular por factores humorales tal como citocinas. Por ejemplo, se ha encontrado que la expresión de FcyRI se favorece por interferón ? (IFN-?) y/o factor estimulador de colonia de granulocitos (G-CSF) . Esta expresión mejorada incrementa la actividad citotóxica de células que tienen FcyRI contra células objetivo. Una célula efectora puede fagocitozar o lisar un antígeno objetivo o una célula objetivo.
El término "vector", como se usa en la presente, se propone que se refiera a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido" , que se refiere a una asa de ADN de doble hebra circular en la cual se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, donde se pueden ligar segmentos adicionales de ADN en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicacion autónoma en una célula hospedadora en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicacion y vectores mamíferos episomales) . Se pueden integrar otros vectores (tal como, vectores mamíferos no episomales) en el genoma de una célula hospedadora en la introducción en la célula hospedadora, y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están enlazados operativamente. Estos vectores se refieren en la presente como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión") . En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante frecuentemente están en la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" se pueden usar de manera indistinta puesto que el plásmido es la forma más comúnmente usada del vector. Sin embargo, la presente invención se propone que incluya estas otras formas de vectores de expresión, tal como vectores virales (tal como virus aden-asociados , adenovirus y retrovirus defectuosos en la replicacion), que sirven para funciones equivalentes.
El término "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora"), como se usa en la presente, se propone para referirse a una célula en la cual se ha introducido un vector de expresión. Se debe entender que estos términos se proponen para referirse no solo a la célula sujeta particular, sino también a la progenie de esta célula. Debido a que pueden presentarse ciertas modificaciones en las generaciones sucesoras debido ya sea a mutación o influencias ambientales, esta progenie no puede ser en realidad idéntica a la célula de origen, pero aun se incluyen dentro del alcance del término "célula hospedadora" como se usa en la presente. Las células hospedadoras recombinantes incluyen, por ejemplo, transfectomas , tal como células CHO, células HEK293, células NS/0, y células linfocíticas .
El término "transfectoma" , como se usa en la presente, incluye células hospedadoras eucarióticas recombinantes que expresan el anticuerpo, tal como células CHO, células NS/0, células HEK293, células vegetales, u hongos, incluyendo células de levadura.
El término "animal no humano transgénico" se refiere a un animal no humano que tiene un genoma que comprende uno o más transgenes humanos de cadena pesada y/o ligera o transcromosomas (ya sea integrados o no integrados en el ADN genómico natural del animal) y que es capaz de expresar anticuerpos completamente humanos. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgén humano de cadena ligera y, ya sea un transgén humano de cadena pesada o transcromosoma humano de cadena pesada, tal que el ratón produzca los anticuerpos humanos antiTF cuando se inmunice con antígeno de TF y/o células que expresan TF. El transgen humano de cadena pesada se puede integrar en el ADN cromosómico del ratón, como es el caso para ratones transgénicos , por ejemplo ratones HuMAb, tal como ratones HCo7, HCol7, HCo20 o HCol2, o el transgén humano de cadena pesada se puede mantener de manera extracromosómica, como sea el caso para ratón KM transcromosómico como se describe en la WO02/43478. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos (referidos colectivamente en la presente como "ratones transgénicos") son capaces de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos a un antígeno dado (tal como, IgG, IgA, IgM, IgD y/o IgE) al sufrir recombinación V-D-J y cambio de isotipo. El animal no humano transgénico también se puede usar para la producción de anticuerpos contra un antígeno específico al introducir genes que codifican para este anticuerpo específico, por ejemplo, al enlazar operativamente los genes a un gen que se expresa en la leche del animal .
"Tratamiento" se refiere a la administración de una cantidad efectiva de un compuesto terapéuticamente activo de la presente invención con el propósito de facilitar, mejorar, detener o erradicar (curar) síntomas o estados de enfermedad.
Una "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF puede variar de acuerdo a factores tal como el estado de la enfermedad, edad, género, y peso del individuo, y la capacidad del conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual se ponderan cualquiera de los efectos tóxicos o perjudiciales del anticuerpo o porción de anticuerpo por los efectos terapéuticamente benéficos.
Un "anticuerpo antiidiotípico" (Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos en general asociados con el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. Aspectos y Modalidades Adicionales de la Invención La invención proporciona un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF.
En un aspecto, la invención proporciona un conjugado de fármaco y anticuerpo que comprende un anticuerpo que se une al factor de te ido y que comprende (i) una región VH que comprende una región CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 6, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 7, y una región CDR3 que tiene la región que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO : 8 , y una región VL que comprende una región CDRl que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 46, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 47, y una región CDR3 que tiene la región que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 48, O (ii) una región VH que comprende una región CDRl que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 34, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 35, y una región CDR3 que tiene la región que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 36, y una región VL que comprende una región CDRl que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 74, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 75, y una región CDR3 que tiene la región que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 76, o (iii) una región VH que comprende una región CDRl que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 38, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 39, y una región CDR3 que tiene la región que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 40, y una región VL que comprende una región CDRl que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 78, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 79, y una región CDR3 que tiene la región que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 30, O (iv) una región VH que comprende una región CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 2, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 3, y una región CDR3 que tiene la región que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO : 4 , y una región VL que comprende una región CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 42, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 43, y una región CDR3 que tiene la región que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 44, o (v) una variante de cualquiera de los anticuerpos, en donde la variante tiene de manera preferente a lo mucho 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, de manera más preferente sustituciones de aminoácidos, tal como sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias, en donde el anticuerpo se ha conjugado a una auristatina o un análogo o derivado peptídico funcional de la misma mediante un ligador.
En una modalidad, el anticuerpo comprende (i) una región VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una región VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, o (ii) una región VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y una región VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, o (iii) una región VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 y una región VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, o (iv) una región VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.
En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.
En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal tipo IgGl completamente humano, tal como un IgGl,K. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal estabilizado tipo IgG4 completamente humano.
En una modalidad, la auristatina es monometil-auristatina E (MMAE) : donde la línea ondeada indica el sitio de unión para el gador .
En una modalidad la auristatina es monometil- auristatina F (MMAF) : en donde la línea ondeada indica el sitio de unión para el ligador .
En una modalidad, el ligador se une a residuos de sulfhidrilo del anticuerpo antiTF obtenido por reducción (parcial) del anticuerpo antiTF.
En una modalidad, el ligador-auristatina es MC-vc- PAB-MMAF (también designado como vcM AF) o MC-vc-PAB-MMAE (también designado como vcMMAE) : Ab-MC-vc-PAB-MMAE (vcMMAE) en donde p denota un número de 1 a 8 , por ejemplo p puede ser de 3-5, S representa un residuo de sulfhidrilo del anticuerpo antiTF, y Ab designa el anticuerpo antiTF. En una modalidad, el ligador-auristatina es c MAE.
En una modalidad, el ligador-conjugado es mcMMAF (donde mc/MC es una abreviación de maleimido-caproilo) : Ab-MC-MMAF (mcM AF) en donde p denota un número de 1 a 8, por ejemplo p puede ser de 3-5, S representa un residuo de sulfhidrilo del anticuerpo antiTF, y Ab designa el anticuerpo antiTF.
En una modalidad, el anticuerpo bloquea la unión de FVIIa a factor de tejido determinado por ejemplo como se describe en el Ejemplo 14.
En una modalidad, el anticuerpo inhibe la unión de FVIIa a factor de tejido, de manera preferente con un valor máximo de inhibición IC50 de entre 0.01- 3.0 g/mL, o tal como 0.1-2.0 yg/mL, o tal como 0.2-1.2 \iq/mL cuando se determina como se describe en el Ejemplo 14.
En una modalidad, el anticuerpo compite para la unión del factor de tejido con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 73, o con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO : 1 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 41, o con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 45, o con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 49, o con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 13 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 53, o con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 17 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 57, o con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 61, o con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 25 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 65, o con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 29 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 69, o con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 37 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 77.
En una modalidad, el anticuerpo comprende: a) una región VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 34, 35 y 36 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 74, 75 y 76, o b) una región VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 2, 3 y 4 y una región VL que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de SEQ ID NO: 42, 43 y 44, o c) una región VH que comprende las secuencias de CDRl , 2 y 3 de SEQ ID NO : 6 , 7 y 8 y una región VL que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de SEQ ID NO: 46, 47 y 48, o d) una región VH que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y una región VL que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de SEQ ID NO: 50, 51 y 52, o e) una región VH que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de SEQ ID NO: 14, 15 y 16 y una región VL que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de SEQ ID NO: 54, 55 y 56, o f) una región VH que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de SEQ ID NO: 18, 19 y 20 y una región VL que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de SEQ ID NO: 58, 59 y 60, o g) una región VH que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de SEQ ID NO: 22, 23 y 24 y una región VL que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de SEQ ID NO: 62, 63 y 64, o h) una región VH que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de SEQ ID NO: 26, 27 y 28 y una región VL que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de SEQ ID NO: 66, 67 y 68, o i) una región VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 30, 31 y 32 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 70, 71 y 72, o j ) una región VH que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de SEQ ID NO:38, 39 y 40 y una región VL que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de SEQ ID NO: 78, 79 y 80, o k) una variante de cualquiera de estos anticuerpos, en donde la variante tiene de manera preferente a lo mucho 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácido, de manera más preferente sustituciones de aminoácido, tal como sustituciones conservadoras de aminoácido en estas secuencias.
En una modalidad, el anticuerpo comprende una VH que tiene a) al menos 80% de identidad, tal como al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% o 100% de identidad a una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:33, 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 37 y 29, o b) a lo mucho 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácido, de manera más preferente sustituciones de aminoácido, tal como sustituciones conservadoras de aminoácido en comparación a una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 33, 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 37 y 29.
En una modalidad, el anticuerpo comprende una VL que tiene a) al menos 80% de identidad, tal como al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% o 100% de identidad a una secuencia de región VL seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:73, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 77 y 69, O b) a lo mucho 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácido, de manera más preferentemente sustituciones de aminoácido, tal como sustituciones conservadoras de aminoácido en comparación a una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:73, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 77 y 69.
En una modalidad, el anticuerpo comprende: a) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 73, o b) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:l y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 41, O c) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO : 45 , o d) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 49, O e) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 13 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 53, o f) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 17 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 57, O g) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:61, O h) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 25 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 65, o i) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 29 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO : 69 , o j ) una región VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 37 y una región VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 77.
En una modalidad, el anticuerpo se une al dominio extracelular del factor de tejido con una afinidad aparente (EC50) de 3.0 nM o menos, tal como 0.50 nM o menos, por ejemplo 0.35 nM o menos, tal como 0.20 nM o menos, por ejemplo 0.1 nM o menos, cuando se determina como se describe en el ensayo en el Ejemplo 12.
En una modalidad, el anticuerpo se une a las células mamíferas que expresan factor de tejido, tal como células A431 transfectadas con una construcción que codifica para el factor de tejido, de manera preferente con una afinidad aparente (EC50) de 10 nM o menos, por ejemplo 8 nM o menos, tal como 5 nM o menos, por ejemplo 2 nM o menos, tal como 1 nM o menos, por ejemplo 0.5 nM o menos, tal como 0.3 nM o menos, cuando se determina como se describe en el ensayo en el Ejemplo 13.
En un aspecto diferente o alternativo, el anticuerpo se conjuga a una porción terapéutica seleccionada del grupo que consiste de taxol; citocalasina B; gramicidina D; bromuro de etidio; emetina; mitomicina; etoposido; tenoposido; vincristina; vinblastina; colquicina; doxorubicina; daunorubicina; dihidroxi-antracina-diona; un inhibidor de tubulina tal como maitansina o un análogo o derivado de esta; mitoxantrona; mitramicina; actinomicina D; 1-deshidrotestosterona; un glucocorticoide; procaína; tetracaína; lidocaína; propranolol ; puromicina; caliqueamicina o un análogo derivado de estos, un compuesto intermedio tal como metotrexato, 6 -mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, gemcitabina, o cladribina; un agente de alquilación tal como mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) , lomustina (CCNU) , ciclofosfamida, busulfan, dibromomannitol , estreptozotocina, dacarbazina (DTIC) , procarbazina, raitoraicina C, cisplatina, carboplatina, duocarmicina A, duocarmicina SA, raquelmicina (CC-1065) , o un análogo derivado de estos; pirrólo [2, 1-c] [1, 4] benzodiazepinas (PDBs) o análogo de las mismas; un antibiótico tal como dactinomicina, bleomicina, daunorubicina, doxorubicina, idarubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC) ) ; toxina de difteria y moléculas relacionadas tal como cadena de difteria A y fragmentos activos de la misma y moléculas híbridas, toxina de ricino tal como ricino A o una toxina de cadena de ricino A desglicosilada, toxina de cólera, una toxina tipo Shiga tal como SLT I, SLT II, SLT IIV, toxina LT, toxina C3 , toxina Shiga, toxina de tosferina, toxina de tétano, inhibidor de proteasa de Bowman-Birk de soja, exotoxina de Pseudomonas, alorina, saporina, modeccina, gelanina, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleuritis fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana tal como PAPI, PAPII, y PAP S, inhibidor de momordica charantia, curcina, . crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogellina, restrictocina, fenomicína, y toxinas de enomicina; ribonucleasa (R ase) ; DNasa I, enterotoxina Estafilocócica A; proteína antiviral de yerba carmesí; toxina de difterina; y endotoxina de Pseudomonas . En una modalidad alternativa adicional el anticuerpo se conjuga a una porción citotóxica seleccionada del grupo que consiste de dolastatina, maitansina, caliqueamicina, duocarmicina, raquelmicina (CC-1065) , o un análogo, derivado, o profármaco de cualquiera de estos.
En una modalidad adicional alternativa, el anticuerpo se conjuga a una citocina seleccionada del grupo que consiste de IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNOÍ, IFN , IFNy, GM-CSF, CD40L, ligando Flt3, factor de células madre, ancestim, y TNF .
En una modalidad adicional preferida, el anticuerpo se conjuga a un radioisótopo.
En una modalidad, el anticuerpo es capaz de inducir citotoxicidad por internalización del anticuerpo acoplado a una toxina en A431, BxPC3 o MDA-MB-23 como se describe en el Ejemplo 15.
En una modalidad, el anticuerpo induce citotoxicidad por internalización como se describe en el Ejemplo 15, con un valor de EC50 entre 9 x 10"5 y 4 x 10"4 g/mL en células A431.
En una modalidad, la preparación del conjugado de fármaco y anticuerpo da por resultado menos de 2%, tal como menos de 1.5%, o menos de 1%, o menos de 0.5% de fármaco no conjugado cuando se determina como se describe en el Ejemplo 16.
En una modalidad, la preparación del conjugado de fármaco y anticuerpo da por resultado menos de 10%, tal como menos de 8%, o menos de 7% o menos de 6% o menos de 5.5% de agregados cuando se determina como se describe en el Ejemplo 16.
En una modalidad, la preparación del conjugado de fármaco y anticuerpo da por resultado menos de 1%, tal como menos de 0.5%, o menos de 0.25%, o menos de 0.2% de endotoxinas cuando se determina como se describe en el Ejemplo 16.
En una modalidad, la preparación del conjugado de fármaco y anticuerpo da por resultado una concentración de conjugado de fármaco y anticuerpo en el intervalo de 1-100 mg/mL, tal como en el intervalo de 2-50 mg/mL, o en el intervalo de 5-25 mg/mL, o en el intervalo de 5-15 mg/mL, o en el intervalo de 7.5-15 mg/mL, o en el intervalo de 8-12 mg/mL, o en el intervalo de 9-11 mg/mL cuando se determina como se describe en el Ejemplo 16.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo se une al dominio extracelular del factor de tejido con una afinidad aparente (EC50) de 600 ng/mL o menos, tal como 550 ng/mL o menos, o 500 ng/mL o menos, tal como con un valor de EC50 en el intervalo de 200-600 ng/mL, por ejemplo un valor de EC50 en el intervalo de 300-600 ng/mL, o un valor de EC50 en el intervalo de 350-550 ng/mL, o un valor de EC50 en el intervalo de 400-500 ng/mL, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo induce citotoxicidad por internalización como se describe en el Ejemplo 18, con un valor de EC50 de entre 1 y 100 ng/mL en células A431.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo induce citotoxicidad por internalización como se describe en el Ejemplo 18, con un valor de EC50 entre 0.5 y 20 ng/mL en células HPAF-II.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo induce citotoxicidad por internalización como se describe en el Ejemplo 18, con un valor de EC50 entre 0.5 y 500 ng/mL, tal como entre 0.5 y 20 ng/mL en células NCI-H441.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo induce citotoxicidad por internalización como se describe en el Ejemplo 18, por ejemplo en células tumorales que expresan más de 200,000 moléculas de factor de tejido por célula, tal como entre 200,000-1,000,000 moléculas de factor de tejido por célula, por ejemplo entre 200,000 y 500,000 moléculas de factor de tejido por célula. El valor de EC50 puede estar en una modalidad entre 0.1 y 100 ng/mL.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo induce citotoxicidad por internalización como se describe en el Ejemplo 18, en por ejemplo células tumorales, que expresan más de 20,000 moléculas de factor de tejido por célula, tal como entre 20,000-200,000 moléculas de factor de tejido por célula. El valor de EC50 puede estar en una modalidad entre 0.5 y 500 ng/mL, tal como entre 0.5 y 20 ng/mL.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo inhibe el crecimiento tumoral como se describe en el Ejemplo 19.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo inhibe el crecimiento tumoral de una línea celular que expresa más de 1000 moléculas de factor de tejido por célula, tal como más de 10,000 moléculas de factor de tejido por células, por ejemplo más de 100,000 moléculas de factor de tejido por célula, o tal como entre 1000-20,000 moléculas de factor de tejido por célula, o entre 20,000-200,000 moléculas de factor de tejido por célula, o entre 200,000-500,000 moléculas de factor de tejido por célula, o entre 200,000-1,000,000 moléculas de factor de tejido por célula, cuando el crecimiento tumoral se determina como se describe en el Ejemplo 19.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo es estable a -65°C durante al menos tres meses, donde estable se refiere a que al menos 95% del conjugado de fármaco y anticuerpo está presente como moléculas monoméricas cuando se determina como se describe en el Ejemplo 20.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo es estable a 5°C durante al menos, tres meses, donde estable se refiere que al menos 95% del conjugado de fármaco y anticuerpo está presente como moléculas monoméricas cuando se determina como se describe en el Ejemplo 20.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el conjugado de fármaco y anticuerpo como se define en cualquiera de las modalidades anteriores. En una modalidad, la composición f rmacéutica comprende además un portador farmacéuticamente aceptable .
En otro aspecto, la invención proporciona el conjugado de fármaco y anticuerpo como se define en cualquiera de las modalidades anteriores para el uso como un medicamento .
En otro aspecto, la invención proporciona el conjugado de fármaco y anticuerpo como se define en cualquiera de las modalidades anteriores para el uso en el tratamiento de un trastorno.
En otro aspecto, la invención proporciona el conjugado de fármaco y anticuerpo como se define en cualquiera de las modalidades anteriores para el uso en el tratamiento de inflamación.
En otro aspecto, la invención proporciona el conjugado de fármaco y anticuerpo como se define en cualquiera de las modalidades anteriores para el uso en el tratamiento de cáncer.
En una modalidad, el cáncer se seleccionada del grupo que consiste de tumores del sistema nervioso central, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, tal como NSCLC, cáncer de mama, específicamente cáncer de mama triple negativo, cáncer de esófago, cáncer gástrico o de estómago, cáncer de hígado y biliar, cáncer pancreático, cáncer colorectal, cáncer de vejiga, cáncer de riñon, cáncer de próstata, cáncer endometrial, cáncer ovárico, melanoma maligno, sarcoma, tumores de origen primario desconocido, cáncer de médula ósea, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crónica y linfoma no de Hodgkin, cáncer de piel, glioma, cáncer del cerebro, útero, leucemia mieloide aguda y recto .
En una modalidad, el cáncer es cáncer pancreático.
En una modalidad, el cáncer es cáncer colorectal.
En una modalidad, el cáncer es cáncer ovárico.
En una modalidad, el cáncer es cáncer de mama.
En una modalidad, el cáncer es cáncer de próstata.
En una modalidad, el cáncer es cáncer de vejiga.
En una modalidad, el cáncer es un cáncer que es sensible al tratamiento con un inhibidor de tubulina.
En otro aspecto, la invención proporciona el conjugado de fármaco y anticuerpo de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el medicamento es para el tratamiento de cáncer en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, tal como un agente quimioterapéutico .
En otro aspecto, la invención proporciona el uso del conjugado de fármaco y anticuerpo de cualquiera de las modalidades anteriores para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de cáncer. En una modalidad, el cáncer se puede seleccionar de cualquiera de los cánceres descritos anteriormente .
En otro aspecto, la invención proporciona un método para inducir muerte celular, o para inhibir el crecimiento y/o proliferación de una célula tumoral que expresa factor de tejido, que comprende la administración, a un individuo en necesidad de lo mismo, de una cantidad efectiva de conjugado de fármaco y anticuerpo de cualquiera de las modalidades anteriores .
En otro aspecto, la invención proporciona un método de tratamiento de cualquiera de las enfermedades de cáncer anteriores por administración a un individuo en necesidad de lo mismo, una cantidad efectiva del conjugado de fármaco y anticuerpo de cualquiera de las modalidades anteriores. En una modalidad el conjugado de fármaco y anticuerpo se administra en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, tal como un agente quimioterapéutico .
Anticuerpo La presente invención se refiere a conjugados de fármacos de anticuerpo antiTF, que comprenden de este modo tanto un anticuerpo como un fármaco, que se pueden conjugar en particular entre sí mediante un ligador.
Los anticuerpos se pueden preparar por técnicas recombinantes bien conocidas usando sistemas de vector de expresión y células hospedadoras bien conocidas. En una modalidad los anticuerpos se preparan en una célula CHO usando el sistema de vector de expresión GS como se describe en De la Cruz Edmunds et al., 2006, Molecular Biotechnology 34: 179-190, EP216846, US5981216, WO 87/04462, EP323997, US5591639, US5658759, EP338841, US5879936, y US5891693.
Después de aislar y purificar los anticuerpos del medio celular usando técnicas bien conocidas, se conjugan con la auristina mediante un ligador como se describe adicionalmente más adelante.
Por ejemplo se pueden producir anticuerpos monoclonales de la presente invención por el método de hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature 256 , 495 (1975), o se pueden producir por métodos de ADN recombinante . Los anticuerpos monoclonales también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos de fago usando las técnicas descritas por ejemplo en Clackson et al., Nature 352 , 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). Se pueden obtener anticuerpos monoclonales se pueden obtener de cualquier fuente adecuada. De esta manera, por ejemplo, se pueden obtener anticuerpos monoclonales de hibridomas preparados de células B esplénicas murinas obtenidas de ratones inmunizados con un antígeno de interés, por ejemplo en la forma de células que expresan el antígeno en la superficie, o un ácido nucleico que codifica para un antígeno de interés . También se pueden obtener anticuerpos monoclonales de hibridomas derivados de células que expresan el anticuerpo de humanos inmunizados o mamíferos no humanos tal como ratas , perros , primates , etc .
En una modalidad, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo humano. Los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra factor de tejido se pueden generar usando ratones transgénicos o transcromosómicos que tienen partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones referidos en la presente como ratones HuMAfo y ratones KM, respectivamente, y se refieren colectivamente en la presente, "ratones transgénicos" .
El ratón HuMAb contiene un minilocus de gen humano de inmunoglobulina que codifica para secuencias de inmunoglobulina de cadena pesadas (µ y ?) y ligera ? humanas no arregladas, conjuntamente con mutaciones dirigidas que inactivan el locus de cadena µ y ? endógeno (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). Por consiguiente, los ratones exhiben expresión reducida de IgM de ratón o y en respuesta a inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera, humanos, introducidos sufren cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales tipo IgG,K humanos de alta afinidad (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisado en Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113 , 49-101 (1994), Lonberg, N. y Huszar, D., Intern. Rev. Immunol . Vol . 13 65-93 (1995) y Harding, F. y Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)) . La preparación de ratones Hu Ab se describe en detalle en Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology .5_, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6_, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Ver también US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 ay WO 01/09187.
Los ratones HCo7 tienen una interrupción JKD en sus genes de cadena ligera (kappa) endógenos (como se describen en el Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), la interrupción CMD en sus genes endógenos de cadena pesada (como se describe en el Ejemplo 1 de la WO 01/14424) , un transgen de cadena ligera kappa humano KCo5 (como se describe en Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), y un transgen de cadena pesada humano HCo7 (como se describe en US 5, 770, 429) .
Los ratones HCol2 tienen una interrupción JKD en sus genes endógenos de cadena ligera (kappa) (como se describe en Chen et al., E BO J. 12, 821-830 (1993)), una interrupción CMD en sus genes endógenos de cadena pesada (como se describe en el Ejemplo 1 de la WO 01/14424) , un transgen de cadena ligera kappa humano KCo5 (como se describe en Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), y un transgen de cadena pesada humano HCol2 (como se describe en el Ejemplo 2 de la WO 01/14424) .
La variedad de ratones transgénicos HCol7 (ver también US 2010/0077497) se generó por co-inyección de la inserción de 80 kb de pHC2 (Taylor et al. (1994) Int. Immunol . , 6: 579-591), la inserción de 25 Kb de pVX6 , y un fragmento de cromosoma artificial de levadura de -460 kb del cromosoma yIgH2 . Esta línea se designó (HCol7) 25950. La linea (HCol7) 25950 entonces se reprodujo con ratones que comprende la mutación CMD (descrito en el Ejemplo 1 de la Publicación PCT WO 01109187), la mutación JKD (Chen et al. (1993) EMBO J 12: 811-820), y el transgen (KC05) 9272 (Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851) . Los ratones resultantes se expresan transgenes humanos de cadena ligera kappa y pesada de inmunoglobulina en un homocigoto de fondo para interrupción de los locus de cadena ligera kappa y pesadas de ratón, endógenos.
La variedad de ratones transgénicos HCo20 es el resultado de una co- inyección del transgen pHC2 de cadena, pesada de minilocus 30, la YAC yIgHIO que contiene la región variable (Vh) de línea germinal, y la construcción de mini-locus pVx6 (descrito en O09097006) . La línea (HCo20) entonces se proliferó con ratones que comprenden la mutación CMD (descrito en el Ejemplo 1 de la Publicación PCT WO 01/09187) , la mutación J D (Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 811-820) , y el transgen (KC05) 9272 (Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851) . Los ratones resultantes se expresan 10 transgenes humanos de cadena ligera kappa y pesada de inmunoglobulina en un homocigoto de fondo para interrupción de los locus de cadena ligera kappa y pesada de ratón, endógenos .
A fin de generar ratones HuMab con los efectos ventajosos de la variedad Balb/c, los ratones HuMab se cruzaron con ratones KC05 [M1K] (Balb) que se generaron por retrocruce con la variedad KC05 (como se describe en Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851) a ratones Balb/c tipo silvestre para generar ratones como se describe en WO09097006. Usando este cruce, se criaron híbridos Balb/c para las variedades HCol2, HCol7, y HCo20.
En la variedad de ratón KM, el gen de cadena ligera kappa de ratón, endógeno se ha interrumpido homocigóticamente como se describe en Chen et al., EMBO J. 12_, 811-820 (1993) y el gen de cadena pesadas de ratón endógeno se ha interrumpido homocigotamente como se describe en el Ejemplo 1 de la O 01/09187. Esta variedad de ratón tiene un transgen de cadena ligera kappa humano, KCo5 , como se describe en Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Esta variedad de ratón también tiene un transe omosoma de cadena pesada humano compuesto del fragmento hCF (SC20) del cromosoma 14 como se describe en WO 02/43478.
Se pueden usar esplenocitos de estos ratones transgénicos para generar hibridomas que segregan anticuerpos monoclonales humanos de acuerdo a técnicas bien conocidas. También se pueden generar anticuerpos monoclonales o policlonales humanos de la presente invención, o anticuerpos de la presente invención que se originan de otras especies de forma transgenética a través de la generación de otro mamífero no humano o planta que es transgénico para las secuencias de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina, de interés, y para la producción del anticuerpo en una forma recuperable de esto. En unión con la producción transgénica en mamíferos, se pueden producir anticuerpos en, y recuperar de, la leche de cabras, vacas u otros mamíferos. Ver por ejemplo US 5,827,690, US 5,756,687, US 5,750,172 y US 5, 741, 957.
Adicionalmente , se pueden generar anticuerpos humanos de la presente invención o anticuerpos de la presente invención de otras especies a través de técnicas tipo visualización, que incluyen, sin limitación, visualización en fagos, visualización retroviral, visualización ribosómica y otras técnicas, usando técnicas bien conocidas y las moléculas resultantes se pueden someter a maduración adicional, tal como maduración por afinidad, tal como técnicas que son bien conocidas (ver por ejemplo Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227 , 381 (1991) (visualización en fago), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (visualización en fago) , Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (visualización ribosómica) , Parmley y Smith, Gene 305-318 (1988) (visualización en fago) , Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA jT7, 6378-6382 (1990) , Russel et al., Nucí. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom et al., Immunol . Reviews 130, 43-68 (1992), Chis ell and McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992) , y US 5,733,743) . Si se utilizan tecnologías de visualización para producir anticuerpos que no son humanos, estos anticuerpos se pueden humanizar.
El anticuerpo de la invención puede ser de cualquier isotipo. La elección del isotipo se guiará típicamente por las funciones efectoras deseadas, tal como inducción de ADCC. Los isotipos de ejemplo son IgGl, IgG2, IgG3 , e IgG . Se puede usar cualquiera de las regiones kappa o lambda constantes de cadena ligera humanas. Si se desea, la clase de un anticuerpo antiTF de la presente invención se puede cambiar por métodos conocidos. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención que fue originalmente IgM se puede cambiar por clase a un anticuerpo tipo IgG de la presente invención. Adicionalmente se pueden usar técnicas de cambio de clase para convertir una subclase de IgG a otra, por ejemplo de IgGl a IgG2. De esta manera, la función efectora de los anticuerpos de la presente invención se puede cambiar por cambio de isotipo a por ejemplo un anticuerpo tipo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, o IgM para varios usos terapéuticos. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo tipo IgGl, por ejemplo, una IgGl, .
En una modalidad, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo de longitud completa, de manera preferente un anticuerpo tipo IgGl, en particular un anticuerpo tipo IgGl, . El término anticuerpo de longitud completa se propone para que se entienda como que se refiere a lo que se conoce en general como un anticuerpo entero, natural, es decir, no un fragmento ni otros tipos de anticuerpos donde se han re-arreglado por el hombre las diferentes cadenas de un anticuerpo para generar un nuevo tipo de anticuerpo (ver por ejemplo Sidhu SS, Nature Biotechnology, 25_, 5, 537-538, (2007) que describe anticuerpos de longitud completa en la visualización) . En otra modalidad, el anticuerpo de la invención es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de cadena individual .
Los fragmentos de anticuerpo se pueden obtener por ejemplo por fragmentación usando técnicas convencionales, y los fragmentos examinados para utilidad de la misma manera como se describe en la presente para anticuerpos enteros . Por ejemplo, se pueden generar fragmentos F(ab' ) 2 al tratar el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab' )2 resultante se puede tratar para reducir los puentes de disulfuro para producir Fab1. Se pueden obtener fragmentos Fab al tratar un anticuerpo tipo igG con papaína; se pueden obtener fragmentos Fab' con digestión por pepsina del anticuerpo tipo IgG. También se puede producir un fragmento F(ab') al unir Fab1 descrito más adelante mediante un enlace de tioéter o un enlace de disulfuro. Un fragmento Fab' es un fragmento de anticuerpo obtenido al cortar un enlace de sulfuro de la región bisagra del F(ab')2- Se puede obtener un fragmento Fab' al tratar un fragmento F(ab')2 con un agente reductor, tal como ditiotreitol . También se pueden generar fragmentos de anticuerpo por expresión de ácidos nucleicos que codifican para estos fragmentos en células recombinantes (ver, por ejemplo Evans et al., J. Immunol . Meth. 184 , 123-38 (1995)). Por ejemplo, n gen quimérico que codifica para una porción de un fragmento F(ab')2 puede incluir secuencias de ADN que codifican para el dominio CH1 y región de bisagra de la cadena H, seguido por un codón de paro transduccional para producir una molécula truncada de fragmento de anticuerpo .
Los anticuerpos de la presente invención se describen adicionalmente y se caracterizan en la O 2010/066803 (Genmab A/S) .
En una modalidad el fragmento antiTF es un fragmento tipo IgG4 estabilizado. Los Ejemplos de anticuerpos tipo IgG4 estabilizados, adecuados son anticuerpos, en donde la arginina en la posición 409 en una región constante de cadena pesada de IgG4 humana, que se indica en el índice EU como en Kabat et al., se sustituye con lisina, treonina, metionina, o leucina, de manera preferente lisina (descrito en WO2006033386 (Kirin) ) y/o en donde la región bisagra comprende una secuencia Cys-Pro-Pro-Cys .
En una modalidad adicional, el anticuerpo antiTF tipo IgG4 estabilizado es un anticuerpo tipo IgG4 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende una región constante de IgG4 humana que tiene un residuo seleccionado del grupo que consiste de: Lys, Ala, Thr, Met y Leu en la posición que corresponde a 409 y/o un residuo seleccionado del grupo que consiste de: Ala, Val, Gly, lie y Leu en la posición que corresponde a 405, y en donde este anticuerpo comprende opcionalmente una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones adicionales, pero no comprende una secuencia Cys-Pro-Pro-Cys en la región bisagra. De manera preferente, este anticuerpo comprende un residuo Lys o Ala en la posición que corresponde a 409 o la región CH3 del anticuerpo se ha reemplazado por la región CH3 de IgGl humana, de IgG2 humana o de IgG3 humana.
En aún una modalidad adicional, el anticuerpo antiTF tipo IgG4 , estabilizado, es un anticuerpo tipo IgG4 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende una región constante de IgG4 humana que tiene residuos seleccionados del grupo que consiste de: Lys, Ala, Thr, Met y Leu en la posición que corresponde a 409 y/o un residuo seleccionado del grupo que consiste de: Ala, Val, Gly, lie y Leu en la posición que corresponde a 405, y en donde el anticuerpo comprende opcionalmente una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones adicionales y en donde el anticuerpo comprende una secuencia Cys-Pro-Pro-Cys en la región bisagra. De manera preferente, el anticuerpo comprende un residuo Lys o Ala en la posición que corresponde a 409 o la región CH3 del anticuerpo se ha reemplazado por la región CH3 de IgGl humana, o de IgG2 humana o de IgG3 humana.
En una modalidad adicional, el anticuerpo antiTF es un anticuerpo no del tipo IgG4, por ejemplo IgGl, IgG2 o lgG3 que se ha mutado tal que. se ha reducido o aún eliminado la capacidad para mediar las funciones efectoras, tal como ADCC, estas mutaciones se han descrito por ejemplo en Dall'Acqua WF et al., J Immunol. 177 (2 ): 1129-1138 (2006) y Hezareh M, J Virol. ;75 (24) :12161-12168 (2001) .
Conjugados La presente invención proporciona un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF.
En un aspecto, los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención comprenden un anticuerpo antiTF como se describe en la presente conjugado a auristatinas o análogos y derivados peptídicos de auristatinas (US5635483; US5780588) . Se ha mostrado que las auristatinas interfieren con la dinámica de los microtúbulos, con la hidrólisis de GTP y con la división nuclear y celular (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584) y tienen actividad anticáncer (US5663149) y antifúngica (Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42:2961-2965. La porción de fármaco de auristatina se puede unir al anticuerpo mediante un ligador, a través del N-terminal (amino) o el C-terminal (carboxi) de la porción de fármaco, peptídica.
Las modalidades de auristatina de ejemplo incluyen las porciones de DE y DF de fármaco de monometil-auristatina enlazadas al N-terminal, descritas en Senter et al., Prooeedings of the American Associa ion for Cáncer Research. Volumen 45, resumen número 623, presentado el 28 de Marzo del 2004 y descrito en US 2005/0238649) .
Una modalidad de auristatina de ejemplo es MMAE (monometil-auristatina E) , en donde la línea ondeada indica la unión covalente al ligador (L) de un conjugado de fármaco y anticuerpo: Otra modalidad de auristatina de ejemplo es MMAF (monometil-auristatina F) , en donde la línea ondeada indica la unión covalente a un ligador (L) de un conjugado de fármaco y anticuerpo (US2005/0238649) : El conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la invención comprende una unidad ligadora entre la unidad de fármaco citostático o citotóxico y la unidad de anticuerpo. En algunas modalidades, el ligador se puede escindir bajo condiciones intracelulares, de tal que la escisión del ligador libere la unidad de fármaco del anticuerpo en el ambiente intracelular . En aun otra modalidad, la unidad ligadora no se puede escindir y el fármaco por ejemplo se libera por la degradación del anticuerpo. En algunas modalidades, el ligador se puede escindir por un agente escindible que está presente en el ambiente intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma ó endosoma o caveola) . El ligador puede ser, por ejemplo, un ligador de peptidilo que se escinde por una enzima intracelular de peptidasa o proteasa, incluyendo pero no limitado a, una proteasa lisosomal o endosomal. En algunas modalidades, el ligador de peptidilo es de al menos dos aminoácidos de largo o al menos tres aminoácidos de largo. Los agentes de escisión pueden incluir catepsinas B y D y plasmina, todas las cuales se conoce que hidrolizan derivados de fármaco de dipéptido que dan por resultado la liberación del fármaco activo dentro de las células objetivo o diana (ver, por ejemplo Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). En una modalidad específica, el ligador de peptidilo escindible por una proteasa intracelular es un ligador de Val-Cit (valina-citrulina) o un ligador de Phe-Lys (fenilalanina-lisina) (ver por ejemplo US6214345, que describe la síntesis de doxorrubicina con el ligador Val-Cit y diferentes ejemplos de los ligadores Phe-Lys) . Los ejemplos de las estructuras de un ligador Val-Cit y Phe-Lys incluyen, pero no se limitan a MC-vc-PAB descrito más adelante, MC-vc-GABA, MC-Phe-Iys-PAB o MC-Phe-Lys-GABA, en donde CM es una abreviación para maleimido-caproílo, ve es una abreviación para Val-Cit, PAB es una abreviación para p-aminobencilcarbaraato y GABA es una abreviación para y-aminobutírico . Una ventaja de usar liberación proteolítica intracelular del agente terapéutico es que el agente se atenúa típicamente cuando se conjuga, y son típicamente altas las estabilidades en suero de los conjugados.
En aun otra modalidad, la unidad ligadora no se puede escindir y el fármaco se libera por degradación del anticuerpo (ver US 2005/0238649) . Típicamente, este ligador no es sustancialmente sensible al ambiente extracelular. Como se usa en la presente, "no sustancialmente sensible al ambiente extracelular" en el contexto de un ligador significa que no más de 20 %, típicamente no más de aproximadamente 15 %, más típicamente no más de aproximadamente 10 %, y aun más típicamente no más de aproximadamente 5 %, no más de aproximadamente 3 %, o no más de aproximadamente 1 % de los ligadores, en una muestra del compuesto de conjugado de fármaco y anticuerpo, se escinden cuando el compuesto conjugado de fármaco y anticuerpo está presente en un ambiente extracelular (por ejemplo, plasma) . Si un ligador no es sustancialmente sensible al ambiente extracelular se puede determinar por ejemplo al incubar el compuesto de conjugado de fármaco y anticuerpo con plasma durante un período predeterminado de tiempo (por ejemplo, 2, 4, 8, 16 o 24 horas) y luego cuantificar la cantidad de fármaco libre presente en el plasma.
Las modalidades adicionales de ejemplo comprenden MMAE o MMAF y varios componentes ligadores que tienen las siguientes estructuras (en donde Ab significa anticuerpo y p, que representa la carga de fármaco (o número promedio de fármacos citostáticos o citotóxicos por molécula de anticuerpo), es de 1 a aproximadamente 8, por ejemplo, p puede ser de 4-6, tal como de 3-5, o p puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) .
Los ejemplos donde se combina un ligador escindible con una auristatina incluyen C-vc-PAB-MMAF (también designado como vcMMAF) y MC-vc-PAB-MMAF (también designado como vcMMAE) , en donde CM es una abreviación para maleimido- caproílo, ve es una abreviación para el ligador basado en Val-Cit (valina-citrulina) , y PAB es una abreviación para p- aminobencilcarbamato : Ab-MC-vc-PAB-MMAE (vcMMAE) Otros ejemplos incluyen auristatinas combinadas con un ligador no escindible, tal como mcMMAF (me (MC es el mismo que me en este contexto) es una abreviación de maleimido-caproil) : Ab-MC-MMAF (mcMMAF) La carga de fármaco citostáticos o citotóxicos se representa por p y es el número promedio de porciones de fármacos citostático por anticuerpo en una molécula (también designado como la relación de fármaco a anticuerpo, DAR) . La carga de fármaco citostático o citotóxico puede variar de 1 a 20 porciones de fármacos por anticuerpo y puede presentarse con aminoácidos con grupos funcionales tal como, pero no limitado a, grupos amino o sulfhidrilo, como en lisina o cisteína.
Dependiendo de la manera de conjugación, p se puede limitar por el número de sitios de unión en el anticuerpo, por ejemplo, donde la unión es un grupo sulfhidrilo, como en la presente invención. En general, el anticuerpo no contienen muchos grupos sulfhidrilo (grupos tiol de cisteína libres y reactivos) que se pueden enlazar a una porción de fármaco puesto que muchos residuos tiol de cisteína en anticuerpos existen como puentes de disulfuro. Por lo tanto, en ciertas modalidades, un anticuerpo se puede reducir con agente reductor tal como ditiotreitol (DTT) o tricarboniletilfosfina (TCEP) , bajo condiciones de reducción parcial o completa, para generar residuos reactivos de sulfhidrilo. En ciertas modalidades, la carga de fármaco para un ADC de la invención varía desde 1 a aproximadamente 8, por ejemplo, p puede ser de 4-6, tal como de 3-5, o p puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8, puesto que un máximo de 8 residuos de sulfhidrilo llega a estar disponible después de la reducción (parcial) del anticuerpo (hay 8 cisteínas comprendidas en la unión de disulfuro inter-cadenas) .
En una modalidad, la porción de ligador de fármaco es vcMMAE. La porción de ligador de fármaco vcMMAE y los métodos de conjugación se describen en WO2004010957 , US7659241, US7829531, US7851437 y USll/833,028 (Seattle Genetics, Inc.), (que se incorporan en la presente como referencia) , y la porción de ligador de fármaco vcMMAE se une a los anticuerpos antiTF en las cisteínas usando un método similar a aquellos descritos en la presente.
En una modalidad, la porción de ligador de fármaco es mcMMAF. La porción de ligador de fármaco mcMMAF y los métodos de conjugación se describen en US7498298, US11/833, 954, y WO2005081711 (Seattle Genetics, Inc.), (que se incorporan en la presente como referencia) , y la porción de ligador de fármaco mcMMAF se une a los anticuerpos antiTF en las cisteínas usando un método similar a aquellos descritos en la presente.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF es HuMab-TF- 011-vcMMAE .
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF es HuMab-TF-098-vcMMAE .
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF es HuMab-TF- 111-vcMMAE .
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF es HuMab-TF-114-vcMMAE .
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF es HuMab-TF- 011-mcMMAF.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF es HuMab-TF- 098 -mcMMAF.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF es HuMab-TF-111-mcMMAF.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF es HuMab-TF-11 -mcMMAF.
En una modalidad alternativa, el anticuerpo antiTF se conjuga a una porción terapéutica, tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, una citocina, un inmunosupresor, o un radioisótopo. Estos conjugados se refieren en la presente como "inmunoconjugados" . Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se refieren como "inmunotoxinas" .
Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial a (por ejemplo, aniquile) células. Los agentes terapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados de la presente invención incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracina-diona, maitansina o un análogo o derivado del mismo, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidro-testosterona, glucocorticoides , procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puroraicina; caliqueamicina o análogos o derivados de estos; antimetabolitos (tal como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5 -fluorouracilo, decarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, gemcitabina, cladribina) , agentes de alquilación (tal como, mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) , lomustina (CCNU) , ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC) , procarbazina, mitomicina C, cisplatina y otros derivados de platino, tal como carboplatino, así como duocarmicina A, duocarmicina SA, CC-1065 (alias raquelmicina) , o análogos o derivados de CC-1065), dolastatina, pirrólo [2 , 1-c] [1 , 4] -benzodiazepinas (PDB) o análogos de estos, antibióticos (tal como dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) , doxorrubicina, idarrubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC) ) , agentes antimitóticos (por ejemplo, inhibidores de tubulina) , tal como toxina de difteria y moléculas relacionadas (tal como cadena de difteria A y fragmentos activos de esto y moléculas híbridas) ; toxina de ricino (tal como ricino A o un toxina de cadena de ricino A desglicosilada) , toxina de cólera, una toxina tipo Shiga (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV) , toxina LT, toxina C3 , toxina Shiga, toxina tosferina, toxina de tétanos, inhibidor de proteasa de Bowman-Birk de soja, exotoxina de Pseudomonas, alorina, saporina, modecina, gelanina, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, y toxinas de enomicina. Otras moléculas conjugadas adecuadas incluyen péptidos antimicrobianos/líticos tal como CLIP, Magainina 2, melitina, Cecropina, y P18; ribonucleasa (RNasa) , DNasa I, enterotoxina A estafilocócica, proteína antiviral de hierba carmesí, toxina de dif erina, y endotoxina de Pseudomonas. Ver, por ejemplo, Pastan et al., Cell £7, 641(1986) y Goldenberg, Calif. A Cáncer Journal for Clinicians 44, 43(1994). Los agentes terapéuticos que se pueden administrar en combinación con conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención como se describe en otra parte de la presente, tal como, por ejemplo, citocinas o quimiocinas anticáncer, también son candidatos para las porciones terapéuticos útiles para conjugación a un anticuerpo descrito en la presente invención.
En otra modalidad alternativa, un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF descrito en la presente invención comprende una molécula asociada a ácido nucleico conjugado o a ácido nucleico. En esta modalidad, el ácido nucleico conjugado es una ribonucleasa citotóxica, un ácido nucleico antisentido, una molécula de ARN inhibitoria (por ejemplo, una molécula de ARNsi) o un ácido nucleico inmunoestimulador (por ejemplo, un molécula de ADN que contiene un motivo CpG inmunoestimuladora) . En otra modalidad alternativa, un anticuerpo antiTF de la invención se conjuga a un aptámero o a una ribozima en lugar de a una auristatina o un análogo o derivado peptídico funcional de esto.
En otra modalidad alternativa, se proporcionan conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF que comprenden uno o más aminoácidos radiomarcados . Se puede usar un anticuerpo antiTF radiomarcado tanto para propósitos de diagnóstico como terapéuticos (es otra característica posible la conjugación a moléculas radiomarcadas) . Los ejemplos no limitantes de marcas para polipéptidos incluyen 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, y 1251, 1311, y 186Re. Los métodos para preparar aminoácidos radiomarcados y derivados peptídicos relacionados se conocen en la técnica (ver, por ejemplo Junghans et al., in Cáncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2- edición, Chafner y Longo, eds . , Lippincott Raven (1996)) y US 4,681,581, US 4,735,210, US 5,101,827, US 5,102,990 (US RE35,500), US 5,648,471 y US 5,697,902. Por ejemplo, se puede conjugar un radioisótopo por un método de cloramina T.
En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un radioisótopo o a un quelato que contiene un radioisótopo. Por ejemplo, el anticuerpo se puede conjugar a un ligador de quelador, por ejemplo, DOTA, DTPA o tiuxetan, que permite que el anticuerpo se vuelva complejo con un radioisótopo. El anticuerpo también o de manera alternativa puede comprender o se conjuga a uno o más aminoácidos radiomarcados u otra molécula radiomarcada . Se puede usar un anticuerpo antiTF radiomarcado tanto para propósitos de diagnóstico como terapéuticos. Los ejemplos no limitantes de radioisótopos incluyen 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 125I, luIn( 131I, 18SRe, 213Bs, 225Ac y 227Th.
Los anticuerpos antiTF también se pueden modificar químicamente por conjugación covalente a un polímero, por ejemplo, para incrementar su vida media en circulación. Los polímeros y métodos de ejemplo para unirlos a péptidos, se ilustran en, por ejemplo, US 4,766,106, US 4,179,337, US 4,495,285 and US 4,609,546. Los polímeros adicionales incluyen polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, un PEG con un peso molecular de entre aproximadamente 1,000 y aproximadamente 40,000, tal como entre aproximadamente 2,000 y aproximadamente 20,000). Este se puede usar por ejemplo si el anticuerpo antiTF es un fragmento .
Se puede emplear cualquier método conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo antiTF descrito en la presente invención a las moléculas conjugados, tal como aquellas descritas anteriormente, incluyendo los métodos descritos por Hunter et al., Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth. 4_0, 219 (1981) y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 3_0, 407(1982). Estos anticuerpos se pueden producir al conjugar químicamente la otra porción del lado N-terminal o lado C-terminal del anticuerpo antiTF o fragmento del mismo (por ejemplo, cadena H o L de anticuerpo antiTF) (ver, por ejemplo, Antibody Engineering Handbook, editado por Osamu Kanemitsu, publicado por Chijin Shokan (1994)). Estos derivados de anticuerpo conjugados también se pueden generar por conjugación en residuos o azúcares internos, donde sea apropiado .
Los agentes se pueden acoplar ya sea directamente o indirectamente a un anticuerpo antiTF descrito en la presente invención. Un ejemplo de acoplamiento indirecto de un segundo agente es acoplamiento mediante una porción separadora a residuos de cisteína o lisina en el anticuerpo. En una modalidad, se conjuga un anticuerpo antiTF, mediante un separador o ligador, a una molécula de profármaco que se puede activar in vivo a un fármaco terapéutico. Después de la administración, los separadores o ligadores se escinden por enzimas asociadas a células tumorales u otras condiciones específicas del tumor, por lo que se forma el fármaco activo. Los ejemplos de estas tecnologías de pro-fármaco y ligadores se describen en WO02083180, WO2004043493 , WO2007018431 , WO2007089149, O2009017394 y WO201062171 por Syntarga BV, et al. (todo incorporado en la presente como referencia) . La tecnología adecuada de anticuerpo-profármaco los análogos de duocarmicina también se pueden encontrar en la patente de los Estados Unidos No. 6,989,452 (Medarex) (incorporado en la presente como referencia) .
En una modalidad, el anticuerpo antiTF de la presente invención se une a un ligador de quelador, por ejemplo, tiuxetano, que permite que el anticuerpo se conjugue a un radioisótopo.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un vector de expresión que codifica para un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, si el anticuerpo antiTF de la presente invención se conjuga a un porción terapéutica diferente que una auristatina o un análogo o derivado peptídico funcional del mismo. Estos vectores de expresión se pueden usar en una modalidad para expresar el anticuerpo antiTF de la presente invención, que entonces se puede conjugar de manera subsiguiente a una porción como se describe en la presente.
En una modalidad, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO:l-4, 5-8, 33-36, 37-40, 41-44, 45-48, 73-76 y 77-80.
En otra modalidad particular, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una o más de las secuencias de aminoácidos VH seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1, 5, 37 y 33.
En una modalidad particular, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una o más de las secuencias de aminoácidos de CDR3 de VH seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO 4, 8, 40 y 36.
En otra modalidad particular, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una o más de las secuencias de aminoácidos VL seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 41, 45, 77 y 73.
En otra modalidad, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una o más de las secuencias de aminoácidos de CDR3 de VL seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 44, 48, 80 y 76.
En una modalidad particular, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para variantes de una o más de las secuencias de aminoácidos anteriores, estas variantes que tienen a lo mucho 25 modificaciones de aminoácido, tal como 20, tal como a lo mucho 15, 14, 13, 12 o 11 modificaciones de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácido, tal como supresiones o inserciones, de manera preferente sustituciones, tal como sustituciones conservadoras o al menos 80 % de identidad a cualquiera de estas secuencias, tal como al menos 85 % de identidad o 90 % de identidad o 95 % de identidad, tal como 96 % de identidad o 97 % de identidad o 98 % identidad o 99 % de identidad a cualquiera de las secuencias de aminoácidos, mencionadas anteriormente .
En una modalidad adicional, el vector de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica para la región constante de una cadena ligera, una cadena pesada o tanto una cadena ligera como pesada de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo humano.
Estos vectores de expresión se pueden usar para producción recombinante de anticuerpos de la invención.
Un vector de expresión en el contexto de la presente invención puede ser cualquier vector adecuado, incluyendo vectores de ácido nucleico, cromosómicos , no cromosómicos , y sintéticos (una secuencia de ácido nucleico que comprende un conjunto adecuado de elementos de control de expresión) . Los ejemplos de estos vectores incluyen derivados de SV40, plásmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, y el vectores de ácido nucleico viral (ARN o ADN) . En una modalidad, un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo antiTF está comprendido en un vector de ARN o ADN desnudo, incluyendo, por ejemplo, un elemento de expresión lineal (como se describe por ejemplo, Sykes y Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), un vector de ácido nucleico compactado (como se describe por ejemplo, en US 6,077,835 y/o WO 00/70087), un vector de plásmido tal como pBR322, pUC 19/18, o pUC 118/119, un vector de ácido nucleico de tamaño mínimo de "mosquito" (como se describe por ejemplo en Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)), o como una construcción de vector de nucleico precipitado, tal como una construcción precipitada con CaP04 (como se describe por ejemplo en WO 00/46147, Benvenisty y Reshef, PNAS EUA 8J3, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725(1978), y Coraro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603(1981)). Estos vectores de ácido nucleico y el uso de los mismos es bien conocido en la técnica (ver, por ejemplo, US 5,589,466 y US 5,973,972).
En una modalidad, el vector es adecuado para la expresión del anticuerpo antiTF en una célula bacteriana. Los ejemplos de estos vectores incluyen vectores de expresión tal como BlueScript (Stratagene) , vectores pIN (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264 , 5503-5509 (1989), vectores pET (Novagen, Madison I) y similares.
Un vector de expresión también o de manera alternativa puede ser un vector adecuado para la expresión en un sistema de levadura. Se puede emplear cualquier vector adecuado para la expresión en un sistema de levadura. Los vectores adecuados incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden promotores constitutivos o inducibles tal como factor alfa, alcohol-oxidasa y PGH (revisado en: F. Ausubel et al, ed Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley- Interscience Nueva York (1987.), y Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)).
Un ácido nucleico y/o vector también puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de secreción/localización, que puede seleccionar como objetivo un polipéptido, tal como una cadena naciente de polipéptido, hacia el espacio periplasmático o un medio de cultivo celular. Estas secuencias se conocen la técnica, e incluyen péptidos de señal o guía de secreción, secuencias de selección de objetivo de organelos (por ejemplo, secuencias de localización nuclear, señales de retención de ER, secuencias de tránsito mitocondrial, secuencias de tránsito de cloroplasto) , secuencias de localización de membrana/ancla (por ejemplo, secuencias de transferencia de detención, secuencias de ancla de GPI) , y similares .
En un vector de expresión de la invención, los ácidos nucleicos que codifican para el anticuerpo antiTF pueden comprender o estar asociados con cualquier promotor, intensificador, y otros elementos facilitadores de expresión, adecuados. Los ejemplos de estos elementos incluyen promotores de fuerte de expresión (por ejemplo, promotor/intensificador IE de CMV de humano, así como promotores RSV, SV40, S.L3-3, MMTV, y VIH LTR) , secuencias de terminación poli (A) efectivas, un origen de replicación para el producto de plásmido en E. coli, un gen de resistencia a antibióticos como marcador seleccionable, y/o un sitio de clonación conveniente (por ejemplo, un poliligador) . Los ácidos nucleicos también puede comprender un promotor inducible como lo opuesto a un promotor constitutivo tal como CMV IE (el experto en la técnica reconocerá que estos términos son realmente descriptores de un grado de expresión génica bajo ciertas condiciones) .
En una modalidad, el vector de expresión que codifica para el anticuerpo antiTF se puede colocar en y/o distribuir a la célula hospedadora o animal hospedadora mediante un vector viral .
En un aspecto aun adicional, la invención se refiere a una célula hospedadora eucariótica o procariótica recombinante, tal como un transíectoma, que produce un anticuerpo antiTF de la invención como se define en la presente, o una molécula biespecífica de la invención como se define en la presente. Los ejemplos de células hospedadoras incluyen levadura, células bacterianas y mamíferas, tal como células CHO o HEK. Por ejemplo, en una modalidad, la presente invención proporciona una célula que comprende un ácido nucleico integrado de manera estable en el genoma celular que comprende una secuencia que codifica para la expresión de un anticuerpo antiTF de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula que comprende un ácido nucleico no integrado, tal como un plásmido, cósmido, fagómido, o elemento de expresión lineal, que comprende una secuencia que codifica para la expresión de un anticuerpo antiTF de la invención.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un hibridoma que produce un anticuerpo de la invención como se define en la presente. En un aspecto aun adicional, la invención se refiere a un animal no humano transgénico que comprende ácidos nucleicos que codifican para una cadena pesada humana y una cadena ligera humana, en donde el animal o planta produce un anticuerpo de la invención. Se ha descrito anteriormente la generación de estos hibridomas y animales transgénicos .
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para producir un anticuerpo antiTF de la invención, el método que comprende los pasos de a) cultivar un hibridoma o una célula hospedadora de la invención como se describe anteriormente en la presente, y b) purificar el anticuerpo de la invención del medio de cultivo y opcionalmente c) transformar el anticuerpo antiTF en un ADC.
Composición Farmacéutica Al purificar los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF, se pueden formular en composiciones farmacéuticas usando excipientes o portadores farmacéuticos bien conocidos.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables así como cualquier otro adyuvante y excipiente conocido, de acuerdo con técnicas convencionales tal como aquellas descritas Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19- Edición, Gennaro, Ed. , Mack Publishing Co . , Easton, PA, 1995.
Los portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables así como otros adyuvantes y excipientes conocidos, deben ser adecuados para el conjugado de fármaco y anticuerpo de la presente invención y el modo elegido de administración. La adecuabilidad de los portadores y otros componentes de las composiciones farmacéuticas se determina en base a la carencia de impacto negativo significante en las propiedades biológicas deseadas del compuesto elegido o la composición farmacéutica de la presente invención (por ejemplo, menos que un impacto sustancial (10 % o menos de inhibición relativa, 5 % o menos de inhibición relativa, etcétera) ) en la unión a antígeno .
Una composición farmacéutica de la presente invención también puede incluir diluyentes, agentes relleno, sales, amortiguadores, detergentes (por ejemplo, un detergente no iónico, tal como Tween-20 o Tween-80) , estabilizadores (por ejemplo, azúcares o aminoácidos libres de proteína), conservadores, fijadores de tejido, solubilizadores, y/u otros materiales adecuados para la inclusión en una composición farmacéutica.
Las células de cáncer que sobreexpresan TF pueden ser objetivos o dianas particularmente buenas para los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la invención, puesto que se pueden unir más anticuerpos por célula. De esta manera, en una modalidad, un paciente con cáncer que se va a tratar con un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la invención es un paciente, por ejemplo, un paciente con cáncer pancreático, cáncer pulmonar o cáncer colorrectal quien se ha diagnosticado que tiene una o más mutaciones en K-ras y/o una o más mutaciones en p53 en sus células tumorales. La expresión de TF está bajo el control de dos eventos transformantes principales que activan el progreso de la enfermedad (activación del oncogén K-ras e inactivación del supresor tumoral p53) , de una manera dependiente de la proteína-cinasa dependiente de MEK/mitógeno ( APK) y fosfatidilinositol-3 ' -quinasa (PI3K) (Yu et al. (2005) Blood 105 : 1734) .
Los niveles reales de dosis del conjugado de fármaco y anticuerpo en la composición farmacéutica de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad del conjugado de fármaco y anticuerpo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición, y modo de administración, sin que sea tóxica al paciente. El nivel seleccionado de dosis dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleada, o la amida de la misma, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se emplea, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, género, peso, condición, salud general e historia médica anterior del paciente que se trata, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
La composición farmacéutica se puede administrar por cualquier ruta y modo adecuado . Las rutas adecuadas para administrar un conjugado de fármaco y anticuerpo de la presente invención son bien conocidas en la técnica y se pueden seleccionar por los expertos en la técnica.
En una modalidad, la composición farmacéutica de la presente invención se administra de manera parenteral.
Las frases "administración parenteral" y "administrado de manera parenteral" como se usa en la presente, significa los modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, usualmente por inyección, e incluyen infusión e inyección epidérmica, intravenosa, intramuscular, intraarterial , intratecal, intracapsular, intraorbital , intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, intratendinosa, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracraneal, intratorácica, epidural e intraesternal .
En una modalidad, la composición farmacéutica se administra por infusión o inyección intravenosa o subcutánea.
Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera y todos los solventes adecuados, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes de isotonicidad, antioxidantes y agentes de retraso de absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles con el conjugado de fármaco y anticuerpo de la presente invención.
Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos, adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen agua, solución salina, solución salina amortiguada fosfato, etanol, dextrosa, polioles (tal como glicerol, propilenglicol , polietilenglicol , y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tal como aceite de oliva, aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón y aceite de ajonjolí, soluciones coloidales de carboximetil-celulosa, goma de tragacanto y esteres orgánicos inyectables, tal como oleato de etilo, y/o varios amortiguadores. Otros portadores son bien conocidos en las técnicas farmacéuticas.
Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto con respecto a los medios o agentes convencionales que son incompatibles con el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención.
La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de materiales de revestimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño requerido de partícula en el caso de dispersiones, y por el uso de agentes tensioactivos .
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también puede comprender antioxidantes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, (1) antioxidantes solubles en agua, tal como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tal como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, propil-galato, alfa-tocoferol , y similares; y (3) agentes queladores metálicos, tal como ácido cítrico, ácido etilendiamina-tetraacético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden comprender agentes de isotonicidad, tal como azúcares, polialcoholes , tal como manitol, sorbitol, glicerol o cloruro de sodio en las composiciones.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener uno o más adyuvantes apropiados para la ruta elegida de administración, tal como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes dispersantes, conservadores o amortiguadores, que pueden mejorar la vida en anaquel o la efectividad de la composición farmacéutica. El conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención se puede preparar con portadores que protegerán al compuesto contra la liberación rápida, tal como formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicós y sistemas de distribución microencapsulados. Estos portadores pueden incluir gelatina, monoestearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, polímeros biocompatibles, biodegradables tal como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico solo o con una cera, u otros materiales bien conocidos en la técnica. Los métodos para la preparación de estas formulaciones se conocen en general por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención pueden formular para asegurar la distribución apropiada in vivo. Los portadores f rmacéuticamente aceptables para administración parenteral incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Excepto con respecto a cualquier medio o agente convencional que sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. En las composiciones también se pueden incorporar compuestos activos complementarios.
Las composiciones farmacéuticas para inyección deben de ser típicamente estériles y estables bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, micro-emulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada a alta concentración de fármaco. El portador puede ser un solvente acuoso o no acuso o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol , y similares) , y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tal como aceite de oliva, y ásteres orgánicos inyectables, tal como oleato de etilo. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño requerido de partícula en el caso de dispersión y por el uso de agentes tensioactivos . En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como glicerol, manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar al incluir en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo sales de monoestearato y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar al incorporar el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes, por ejemplo similar a anteriormente, como se requiera, seguido por microfiltración por esterilización. En general, las dispersiones se preparan al incorporár el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básica y los otros ingredientes requeridos por ejemplo aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los ejemplos de métodos de preparación son secado al vacío y secado por congelación ( liofilización) que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada estéril del mismo .
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar al incorporar el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por microfiltración por esterilización. En general, se preparan dispersiones al incorporar el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básica y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los ejemplos de métodos de preparación son secado al vacío y secado por congelación (liofilización) que produce un polvo del conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada estéril del mismo.
La composición farmacéutica de la presente invención puede contener un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención o una combinación de conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención.
Como se describe anteriormente, en otro aspecto, la invención se refiere al conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la invención como se define en la presente, para el uso como un medicamento.
Los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la invención se pueden usar para varios propósitos. En particular, los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la invención se pueden usar para el tratamiento de varias formas de cáncer. En un aspecto, los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la invención se usan para el tratamiento de varios tipos de cánceres sólidos tal como: tumores del sistema nervioso central, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón (tal como, cáncer de pulmón de células no pequeñas) , cáncer de mama (tal como cáncer de mama triples negativos) , cáncer esofágico, cáncer de estómago, cáncer de hígado y biliar, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer de riñon, cáncer de próstata, cáncer de endometrial, cáncer ovárico, melanoma maligno, sarcoma (tejido blando, por ejemplo hueso y músculo), tumores de origen primario desconocido (por ejemplo, primarios desconocidos) , leucemia, cáncer de médula ósea (tal como, mieloma múltiple) leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crónica y linfoma no de Hodgkin, leucemia mieloide aguda (AML, por sus siglas en inglés) , cáncer de piel, glioma, cáncer de cerebro, útero, y recto.
Adicionaltnente la inflamación autoinmunitaria, tal como miopatías o esclerosis múltiple se puede seleccionar como objetivo con los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención.
Con la presente invención también se pueden seleccionar como objetivo los trastornos hemostáticos relacionados a cáncer.
Las enfermedades adicionales con inflamación, tal como miopatías, artritis reumatoide, osteoartritis , espondilitis anquilosante, gota, espondilartropatrias, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, artropatía psoriática, espondilitis enterapatrica, artropatía juvenil, artropatía reactiva, artritis infecciosa o post-infecciosa, artritis tuberculosa, artritis viral, artritis fúngica, artritis sifilítica, glomerulonefritis , enfermedad renal de etapa terminal, lupus eritematoso sistémico, mb. Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad inflamatoria de intestino, fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) , asma, asma alérgica, bronquitis, bronquiolitis aguda, bronquiolitis crónica, fibrosis pulmonar idiop tica, o esclerosis múltiple se pueden seleccionar como objetivo con los anticuerpos antiTF de la presente invención.
También, las enfermedades vasculares tal como restenosis vascular, enfermedad vascular miocárdica, enfermedad vascular cerebral, degeneración macular y retinopatía, incluyendo pero no limitado a AMD húmeda se pueden tratar con los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF.
Los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención también pueden ser útiles para el tratamiento de pacientes con riesgo cardiovascular, tal como aterosclerosis , hipertensión, diabetes, dislipidemia y síndrome coronario agudo, incluyendo pero no limitado a, infarto agudo al miocardio, ataque.
Los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención también pueden ser útiles para inhibición de trombosis, tal como DVT, embolia renal, embolia pulmonar, trombosis arterial, o para tratar trombosis que presenta después de cirugía arterial, injertos de derivación vascular periférica o injertos de derivación de arteria coronaria, derivaciones arterio-venosas , remoción de una implementación, tal como un endoprotesis o catéter.
Los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención también pueden ser útiles para inhibición de lesión por reperfusión isquémica renal.
Los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención también pueden ser útiles para el tratamiento de hiperlipoproteineimia o hiperparatiroidismo .
Los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención también pueden ser útiles para el tratamiento de vasculitis, vasculitis positiva ANCA o enfermedad de Behcet.
Los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención también puede ser útiles para bloquear falla respiratoria inducida por trauma, tal como síndrome de esfuerzo resriptorio agudo o lesión pulmonar aguda.
Los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención también pueden ser útiles para bloquear disfunción de órganos inducida por infección, tal como falla renal, síndrome y esfuerzo respiratorio agudo, o lesión pulmonar aguda.
Los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención también pueden ser útiles para tratar varios trastornos tromboembólicos tal como aquellos que surgen de angioplastia, infarto al miocardio, angina inestable y estenosis de arteria coronaria.
Los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención también pueden ser útiles en un escenario profiláctico para tratar complicaciones mediadas por TF a infecciones sistémicas, tal como sepsis o pneumonía.
Los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención también pueden ser útiles como tratamiento profiláctico de pacientes con vasos ateroscleróticos en riesgo de trombosis.
Los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención también pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedad de injerto versus hospedadora.
Los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención también pueden ser útiles para incrementar injerto de células beta en el trasplante de islotes, para impedir vasculopatía de aloinjerto cardíaco (CAV, por sus siglas en inglés) y para impedir rechazo agudo de injerto.
De manera similar, la invención se refiere a un método para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de una célula tumoral que expresa TF, que comprende la administración, a un individuo en necesidad del mismo, de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la invención. En una modalidad, la célula tumoral está comprendida en cáncer, tal como cáncer de próstata, cáncer de pulmón (tal como, cáncer de pulmón en células no pequeñas) , cáncer de mama (tal como, cáncer de mama triple negativo) , cáncer colorrectal (tal como cáncer colorrectal metastático) , cáncer pancreático, cáncer endometrial, cáncer ová ico, melanoma cutáneo, leucemia, cáncer de médula ósea (tal como, mieloma múltiple) , leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crónica y leucemia no de Hodgkin, cáncer de piel, cáncer de próstata, glioma, cáncer del cerebro, ríñones, útero, vejiga, leucemia mieloide aguda (LMA) y recto.
Tambén, la invención se refiere al uso de conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF que se unen a TF humano para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, tal como una de las indicaciones específicas de cáncer mencionadas anteriormente.
En una modalidad, la selección de pacientes que se van a tratar con un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF se basa en el nivel de TF en su orina y/o sangre. En una modalidad particular, el paciente que se va a tratar tiene un nivel relativamente alto de TF en orina y/o sangre. Por ejemplo, el paciente que se va a tratar puede tener un nivel de TF en orina de más de 20 ng/ml, tal como más de 40 ng/ml, por ejemplo, más de 100 mg/ml, tal como más de 200 ng/ml. De manera alternativa, o además, el nivel de TF en suero de los pacientes puede ser más de 100 pg/ml, tal como más de 200 pg/ml. Esto se puede determinar, por ejemplo usando un ELISA. Los métodos para hacer esto incluyen pero no se limitan a aquellos descritos más adelante con relación a usos de diagnóstico .
Sin embargo, también está dentro del alcance de la presente invención tratar pacientes con el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención que tiene un menor nivel de TF en la orina y/o sangre.
En una modalidad, la selección de los pacientes que se van a tratar con los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención se puede basar en el nivel de expresión de TF. El nivel de expresión de TF se puede evaluar al exponer a los pacientes a un anticuerpo antiTF radiomarcado y luego medir el nivel de radiactividad en los pacientes. El anticuerpo antiTF radiomarcado puede ser un anticuerpo antiTF descrito en la presente invención, es decir, un anticuerpo de los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF descritos en la presente, o puede ser otro anticuerpo antiTF. Los ejemplos de radiomarcas pueden ser cualquiera de las descritas anteriormente con relación a la radiomarcación de anticuerpos. Los métodos para hacer esto incluyen, pero no se limitan a aquellos descritos más adelante con relación a usos de diagnóstico.
En una modalidad adicional de los métodos de tratamiento de la presente invención, la eficacia del tratamiento que se monitoriza durante la terapia, por ejemplo, en puntos predefinidos de tiempo. En una modalidad, se puede monitorizar la eficiencia al medir el nivel de TF en orina o sangre, por ejemplo, por ELISA. Los métodos para hacer esto incluyen, pero no se limitan a aquellos descritos más adelante con relación a usos de diagnóstico. En otra modalidad, la eficacia se puede determinar por visualización del área de enfermedad, por ejemplo, al realizar una o más exploraciones por PET-CT, por ejemplo usando un anticuerpo antiTF marcado, tal como un anticuerpo antiTF marcado descrito en la presente invención. Adicionalmente, los anticuerpos antiTF marcados, tal como los anticuerpos antiTF marcados 011, 098, 114 y 111 descritos en la presente, se pueden usar para detectar tumores productores de TF, por ejemplo, usando una exploración por PET-CT.
Los regímenes de dosis en los métodos anteriores de tratamiento y usos se ajustan para proporcionar la respuesta terapéutica óptima, deseada. Por ejemplo, se puede administrar una dosis individual, se pueden administrar con el paso del tiempo varias dosis divididas o las dosis se pueden reducir o incrementar proporcionalmente como se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Las composiciones parenterales se pueden formular en la forma de dosis unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosis. La forma de dosis unitaria como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que se van ha tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. Las especificaciones de las formas de dosis unitarias de la presente invención se dictan por, y son directamente dependientes de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se va ha lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de combinación de este compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.
Las dosis eficientes y los regímenes de dosis para los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF dependen de la enfermedad o condición que se va ha tratar y se pueden determinar por las personas expertas en la técnica. Un intervalo no limitante de ejemplo para una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención es aproximadamente 0.1-100 mg/kg, tal como aproximadamente 0.1-50 mg/kg, por ejemplo aproximadamente 0.1-20 mg/kg, tal como aproximadamente 0.1-10 mg/kg, tal como aproximadamente 0.5-5 mg/kg, por ejemplo aproximadamente 5 mg/kg, tal como aproximadamente 4 mg/kg, o aproximadamente 3 mg/kg, o aproximadamente 2 mg/kg, o aproximadamente 1 mg/kg, o aproximadamente 0.5 mg/kg, o aproximadamente 0.3 mg/kg. Un intervalo no limitante de ejemplo para una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención es aproximadamente 0.02-30 mg/kg, tal como aproximadamente 0.1-20 mg/kg, o aproximadamente 0.5-10 mg/kg, o aproximadamente 0.5-5 mg/kg, por ejemplo aproximadamente 1-2 mg/kg, en particular de los anticuerpos 011, 098, 114 o 111 como se describe en la presente.
Un facultativo que tiene habilidad en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el facultativo puede empezar dosis del conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF empleado en la composición farmacéutica a niveles menores que los requeridos a fin de lograr el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composición de la presente invención será aquella cantidad del compuesto que sea la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. Esta dosis efectiva dependerá en general de los factores descritos anteriormente. La administración puede ser por ejemplo intravenosa, intramuscular, intraperitoneal , o subcutánea, y por ejemplo se administra próxima al sitio del objetivo. Si se desea, la dosis diaria efectiva de una composición farmacéutica se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis administradas de manera separada a intervalos apropiados a todo lo largo del día, opcionalmente , en formas de dosis unitarias. En tanto que es posible que un conjugado de fármaco y anticuerpo anfciTF de la presente invención se administre solo, se prefiera administrar el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF como una composición farmacéutica como se describe anteriormente.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF se puede administrar por infusión en una dosis semanal de 10 a 1500 mg/m2, tal como de 30 a 1500 mg/m2, o tal como de 50 a 1000 mg/m2, o tal como de 10 a 500 mg/m2, o tal como de 100 a 300 mg/m2. Esta administración se puede repetir, por e emplo, de 1 a 8 veces, tal como de 3 a 5 veces. La administración se puede realizar por infusión continua durante un período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas .
En una modalidad, los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF se pueden administrar por infusión cada tercera semana en una dosis de 30 a 1500 mg/m2, tal como de 50 a 1000 mg/m2 o de 100 a 300 mg/m2. Esta administración se puede repetir, por ejemplo, de 1 a 8 veces, tal como de 3 a 5 veces. La administración se puede realizar por infusión continua durante un período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas .
En una modalidad, los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF se pueden administrar por infusión continua lenta durante un período prolongado, tal como más de 24 horas, a fin de reducir los efectos secundarios tóxicos.
En una modalidad los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF se pueden administrar a una dosis semanal de 50 mg a 2000 mg, tal como por ejemplo 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg o 2000 mg, durante hasta 16 veces, tal como de 4 a 10 veces, tal como de 4 a 6 veces. La administración se puede realizar por infusión continua durante un período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Este régimen se puede repetir una o más veces como sea necesario, por ejemplo, después de 6 meses o 12 meses. La dosis se puede determinar o ajustar al medir la cantidad de conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención en la sangre en la administración, por ejemplo al tomar una muestra biológica y al usar anticuerpos antiidiotípicos que tienen como objetivo la región de unión a antígeno de los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF se puede administrar por terapia de mantenimiento, tal como, por ejemplo, una vez a la semana durante un período de 6 meses o más .
En una modalidad, los conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF se pueden administrar por un régimen que incluye una infusión de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención seguido por una infusión de un anticuerpo antiTF de la presente invención, tal como el anticuerpo 011, 098, 114 o 111 descritos en la presente que contienen un radioisótopo. El régimen se puede repetir, por ejemplo, 7 a 9 días más tarde.
Como ejemplos no limitantes, el tratamiento de acuerdo a la presente invención se puede proporcionar como una dosis semanal, bisemanal, trisemanal o mensual de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención en una cantidad de aproximadamente 0.1-100 mg/kg, tal como 0.3-3 mg/kg, por ejemplo 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg, por día, en al menos uno del día 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40, o de manera alternativa, al menos una de la semana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o en algunos casos la semana 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 después del inicio del tratamiento, o cualquier combinación de estos, usando dosis individuales o divididas cada 24, 12, 8, 6, 4, o 2 horas, o cualquier combinación de esto.
Una "cantidad efectiva" para terapia tumoral también se puede medir por su capacidad para estabilizar el progreso de la enfermedad. La capacidad de un compuestos para inhibir cáncer se puede evaluar en un sistema de modelo animal predictivo de la eficiencia en tumores humanos. De manera alternativa, esta propiedad de una composición se puede evaluar al examinar la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento celular o para inducir apoptosis por ensayos in vivo conocidos por el practicante experto. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, y de otro modo mejorar los síntomas en un sujeto. Un experto en la técnica será capaz de determinar estas cantidades en base a factores tal como el tamaño del sujeto, la severidad de los síntomas del sujeto, y la composición particular o la ruta de administración seleccionada.
Un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF también se puede administrar de manera profiláctica a fin de reducir el riesgo de desarrollar cáncer, de retrasar el comienzo de la ocurrencia de un evento en el progreso de cáncer, y/o reducir el riesgo de recurrencia cuando un cáncer está en remisión. Esto puede ser especialmente útil en pacientes en donde es difícil localizar un tumor que se conoce que está presente debido a otros factores biológicos.
El conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF también se puede administrar en terapia de combinación, es decir, combinado con otros agentes terapéuticos pertinentes para la enfermedad o condición que se va ha tratar. Por consiguiente, en una modalidad, el medicamento de conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF es para combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, tal como un agente citotóxico, quimioterapéutico o antiangiogénico .
Esta administración combinada puede ser simultánea, separada o secuencial. Para administración simultánea, los agentes se pueden administrar como una composición o como composiciones separadas, como sea apropiado. La presente invención también proporciona de este modo métodos para tratar un trastorno que comprende células que expresan TF como se describe anteriormente, métodos que comprenden la administración de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención combinado con uno o más agentes terapéuticos adicionales como se describe más adelante.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar un trastorno que comprende células que expresan TF en un sujeto, el método que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención y al menos un agente quimioterapéutico a un sujeto en necesidad de esto.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir cáncer, el método que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención y al menos un agente quimioterapéutico a un sujeto en necesidad de esto.
En una modalidad, la presente invención proporciona el uso de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica que se va ha administrar con al menos un agente quimioterapéutico para tratar cáncer.
En una modalidad, este agente quimioterapéutico se puede seleccionar de un antimetabolito, tal como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, gemcitabina, cladribina y agentes similares.
En una modalidad, este agente quimioterapéutico se puede seleccionar de un agente de alquilación, tal como mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) , lomustina (CCNU) , ciclofosfamida, busülfano, dibromomannitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC) , procarbazina, mitomicina C, cisplatina y otros derivados de platino, tal como carboplatina, y agentes similares.
En una modalidad, este agente quimioterapéutico se puede seleccionar de un agente antimitótico, tal como taxanos, por ejemplo docetaxel, y paclitaxel, y alcaloides de vinca per vinca, por ejemplo vindesina, vincristina, vinblastina, y vinorelbina.
En una modalidad, este agente quimioterapéutico se puede seleccionar de un inhibidor de topoisomerasa, tal como topotecano o irinotecano.
En una modalidad, este agente quimioterapéutico se puede seleccionar de un fármaco citostático, tal como etoposido y teniposido.
En una modalidad, este agente quimioterapéutico se puede seleccionar de un inhibidor de factor de crecimiento, tal como un inhibidor de ErbBl (EGFR) (tal como Iressa, erbitux (cetuximab) , tarceva y agentes similares) , un inhibidor de ErbB2 (Her2/neu) (tal como herceptin y agentes similares) y agentes similares.
En una modalidad, este agente quimioterapéutico se puede seleccionar de un inhibidor de tirosina-cinasa, tal como imatinib (Glivec, Gleevec STI571) , lapatinib, PTK787/ZK222584 y agentes similares.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar un trastorno que comprende células que expresan TF en un sujeto, método que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención y al menos un inhibidor de angiogénesis , neovascularización, y/u otra vascularización a un sujeto en necesidad de esto.
Los ejemplos de estos inhibidores de angiogénesis son inhibidores de urocinasa, inhibidores de metaloproteasa de matriz (tal como marimastat, neovastat, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 y agentes similares) , inhibidores de la proliferación y migración de células endoteliales (tal como TNP-470, escualamina, 2-metoxiestradiol , combretastatinas , endostatina, angiostatina, penicilamina, SCH66336 (Schering-Plough Corp, Madison, NJ) , R115777 (Janssen Pharmaceutica, Inc, Titusville, NJ) y agentes similares) , antagonistas de factores de crecimiento angiogénicos (tal como ZD6474, SU6668, anticuerpos contra agentes angiogénicos y/o sus receptores (tal como VEGF, bFGF, y angiopoyetina-1) , talidomida, análogos de talidomida (tal como CC-5013) , Sugen 5416, SU5402, ribozima antiangiogénica (tal como angiozima) , interferon OÍ (tal como interferon a2a) , suramina y agentes similares) , inhibidores de cinasa VEGF-R y otros inhibidores de tirosina-cinasa antiangiogénicos (tal como SU011248) , inhibidores de la señalización de integrina/supervivencia específicos del endotelio (tal como vitaxina y agentes similares) , antagonistas/queladores de cobre (tal como tetratiomolibdato, captopril y agentes similares) , carboxiamido-triazol (CAI) , ABT-627, CM101, interleucina-12 (IL-12) , IM862, PNU145156E así como moléculas de nucleótidos que inhiben la angiogénesis (tal como antisentido-VEGF-ADNc , ADNc que codifica para angiostatina, ADNc que codifica para p53 y ADNc que codifica para receptor-2 de VEGF deficiente) y agentes similares.
Otros ejemplos de estos inhibidores de angiogénesis, neovascularización, y/u otra vascularización son derivados de parina antiangiogénicos y moléculas relacionadas (por ejemplo, heparinasa III) , temozolomida, NK4 , factor inhibidor de migración de macrófagos (MIF) , inhibidores de ciclooxigenasa-2 , inhibidores de factor 1 inducible por hipoxia, isoflavonas de soja antiangiogénicas, oltipraz, fumagilina y análogos de la misma, análogos de somatostatina, polisulfato de pentosan, tecogalan sódico, dalteparin, tumstatina, trombospondin, NM-3, combrestatina, canstatina, avastatina, anticuerpos contra otros objetivos pertinentes (tal como mAb antialf -v/beta-3 integrina y antiquininoestatina) y agentes similares.
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención para tratar los trastornos como se describe anteriormente puede ser un inmunógeno anticáncer, tal como antígeno de cáncer/antígeno asociado a tumor (por ejemplo, molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM/TACSTDl) , mucina 1 (MUC1) , antígeno carcinoembriónico (CEA) , glicoproteína 72 asociada a tumor (TAG-72), gplOO, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7 , vacunas virales asociadas a cáncer (por ejemplo, vacunas de papilomavirus humano) , proteínas de choque térmico derivadas de tumor, y agentes similares. Un número de otros antígenos de cáncer adecuados/antígenos asociados a tumor descritos en otra parte de la presente y moléculas similares conocidas en la técnica también se pueden usar de manera alternativa en esta modalidad. Los péptidos inmunogénicos anticáncer también incluyen "vacunas" antiidiotípicas tal como anticuerpos antiidiotípicos BEC2 , Mitumomab, CeaVac y anticuerpos antiidiotípicos relacionados, anticuerpo antiidiotípico a anticuerpo MG7, y otros anticuerpos antiidiotípicos anticáncer, (ver por ejemplo Birebent et al., Vaccine. 21(15), 1601-12 (2003), Li et al., Chin Med J (Engl) . 114(9), 962-6 (2001), Schmitt et al., Hybridoma. 13(5), 389-96 (1994), Maloney et al., Hybridoma. 4(3), 191-209 (1985), Raychardhuri et al., J Immunol . 137(5), 1743-9 (1986), Pohl et al., Int J Cáncer. 50(6), 958-67 (1992), Bohlén et al., Cytokines Mol Ther. 2 (4) , 231-8 (1996) and aruyama, J Immunol Methods. 264(1-2), 121-33 (2002)). Estos A antiidiotípicos se pueden conjugar adicionalraente a un portador, que puede ser un portador de molécula sintética (típicamente inerte), una proteína (por ejemplo hemocianina de lappa (KLH) (ver, por ejemplo Ochi et al., Eur J Immunol. 17(11), 1645-8 (1987)), o una célula (por ejemplo una célula sanguínea roja, ver, por ejemplo Wi et al., J Immunol Methods. 122(2), 227-34 (1989)) .
En una modalidad de la presente invención, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF se combina con un fármaco de inmuno-oncología tal como Yervoy (ipilimumab) que actúa potencialmente al inducir inmunidad de células T contra el cáncer. La citoreducción con el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF en combinación con un fármaco inmunoestimulador puede proporcionar beneficio clínico significativo a los pacientes.
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención para tratar los trastornos como se describe anteriormente puede ser una citocina anticáncer, quimiocina, o combinación de esto. Los ejemplos de citocinas y factores de crecimiento, adecuados, incluyen IFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNOÍ (por ejemplo, INFa2b) , ?? , GM-CSF, CD40L, ligando Flt3, factor de células madre, ancestim, y TNF . Las quimiocinas adecuadas pueden incluir quimiocinas negativas a Glu-Leu-Arg (ELR) tal como IP-10, MCP-3, MIG, y SDF-IOÍ de las familias de quimiocinas humanas CXC y C-C. Las citocinas adecuadas incluyen derivados de citocina, variantes de citocina, fragmentos de citocina, y proteínas de fusión de citocina. Estos y otros métodos o usos que comprenden ácidos nucleicos que codifican para péptidos que se presentan de forma natural, en la presente se pueden realizar de manera alternativa o adicionalmente por "activación génica" y técnicas de favorecimiento de expresión de gen de recombinación homologa, tal como se describe en US 5,968,502, US 6,063,630 y US 6,187,305 y EP 0505500.
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención para tratar los trastornos como se describe anteriormente puede ser un regulador de apoptosis/control del ciclo celular (o "agente regulador") . Un regulador de apoptosis/control de ciclo celular puede incluir moléculas que tengan como objetivo y modulen los reguladores de apoptosis/control de ciclo celular tal como (i) cdc-25 (tal como NSC 663284) , (ii) cinasas dependientes de ciclina que sobre-estimulan el ciclo celular (tal como flavopiridol (L868275, HMR1275) , 7-hidroxie-staurosporina (UCN-01, KW-2401) , y roscovitina (R-roscovitina, CYC202)), y (iii) moduladores de telomerasa (tal como BIBR1532, SOT-095, GRN163 y composiciones descritas por ejemplo en US 6,440,735 y US 6,713,055). Los ejemplos no limitantes de moléculas que interfieren con las rutas apoptóticas incluyen ligando inductor de apoptosis relacionado a TNF (TRAIL) /ligando de apoptosis-2 (Apo-2L) , anticuerpos que activan los receptores TRAIL, lFNs,D y Bcl-2 antisentido .
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención para tratar los trastornos como se describe anteriormente puede ser un agente regulador hormonal, tal como agentes útiles para terapia antiandrógenos y antiestrógenos . Los ejemplos de estos agentes reguladores hormonales son tamoxifeno, idoxifeno, fulvestrant, droloxifeno, toremifeno, raloxifeno, dietilestilbestrol, etinil-estradiol/estinilo, un antiandrógeno (tal como flutaminda/eulexina) , una progestina (tal como caproato de hidroxiprogesterona, medroxiprogesterona/provera, acepato de megestrol/megace) , un adrenocorticosteroide (tal como hidrocortisona, prednisona) , hormona liberadora de hormona luteinizante (y análogos de la misma y otros agonistas de LHRH tal como buserelina y goserelina) , un inhibidor de aromatasa (tal como anastrazol/arimidex, aminoglutetimida/citraden, exemestano) , un inhibidor hormonal (tal como octreotido/sandostatina) y agentes similares.
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención para tratar los trastornos como se describe anteriormente puede ser un agente antianérgico (por ejemplo compuestos de molécula pequeña, proteínas, glicoproteínas , o anticuerpos que rompen la tolerancia a tumor y antígenos de cáncer) . Los ejemplos de estos compuestos o moléculas que bloquean la actividad de CTLA-4, tal como MDX- 010/Yervoy (ipilimumab) (Phan et al., PNAS USA 100 , 8372 (2003)), que actúan potencialmente al inducir inmunidad de células T contra el cáncer. La citoreducción con el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF en combinación con un fármaco inmunoestimulador puede proporcionar beneficio clínico significativo a los pacientes.
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención para tratar los trastornos como se describe anteriormente puede ser un vector o ácido nucleico que contiene un gen supresor de tumor tal como un adenovirus deficiente en replicación que codifica para p53/SCH58500 tipo silvestre, recombinante , humano, etc.; ácidos nucleicos antisentido dirigidos a oncogenes, genes mutados o desregulados; o ARNsi dirigido a genes mutados o desregulados. Los ejemplos de objetivos de supresor tumoral incluyen por ejemplo BRCA1 , RB1, BRCA2 , DPC4 (Smad4) , MSH2 , MLH1 , y PCC.
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención para tratar los trastornos como se describe anteriormente puede ser un ácido nucleico anticáncer, tal como genasense (augmerosen/G3l39) , LY900003 (ISIS 3521), ISIS 2503, OGX-011 (ISIS 112989), LE-AON/LEraf-AON (oligonucléotido antisentido c-raf encapsulado en liposoma/ISIS-5132) , MG98, y otros ácidos nucleicos antisentido que tienen como objetivo PKC , clusterina, IGFBP, proteína-cinasa A, ciclina DI, o Bcl-2h.
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención para tratar los trastornos como se describe anteriormente puede ser una molécula de ARN inhibitoria anticáncer (ver por ejemplo Lin et al., Curr Cáncer Drug Targets . 1(3), 241-7 (2001)', Erratum in: Curr Cáncer Drug Targets . 3_(3), 237 (2003), Lima et al., Cáncer Gene Ther. 11(5), 309-16 (2004), Grzmil et al., Int J Oncol. 4(1), 97-105 (2004), Collis et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys. 57(2 Suppl) , S144 (2003), Yang et al., Oncogene. 22(36), 5694-701 (2003) y Zhang et al., Biochem Biophys Res Commun. 303(4), 1169-78 (2003)).
Las composiciones y métodos de administración en combinación de la presente invención también incluyen la administración de vacunas de ácido nucleico, tal como vacunas de ADN desnudo que codifican para antígenos de cáncer/antígenos asociados a tumor (ver por ejemplo US 5,589,466, US 5,593,972, US 5,703,057, US 5,879,687, US 6,235,523, y US 6,387,888). En una modalidad, el método de administración en combinación y/o la composición de combinación comprenden una composición de vacuna autóloga. En una modalidad, la composición de combinación y/o el método de administración de combinación comprende una vacuna de células enteras o célula que expresa citocina (por ejemplo un fibroblasto que expresa IL-2 recombinante, célula dendrítica que expresa citocina recombinante, y similares) (ver, por ejemplo Kowalczyk et al., Acta Biochim Pol. 50(3), 613-24 (2003), Reilly et al., Methods Mol Med. 69, 233-57 (2002) y Tirapu et al., Curr Gene Ther. 2(1), 79-89 (2002). Otro ejemplo de este planteamiento de células autólogas que puede ser útil en los métodos de combinación de la presente invención es el método de Inmunoterapia Personalizada MyVaxMR (previamente referido como GTOP-99) (Genitope Corporation -Redwood City, CA, EUA) .
En una modalidad, la presente invención proporciona composiciones de combinación y métodos de administración de combinación en donde un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención se combina o se co-administra con un virus, proteínas virales, y similares. Los virus deficientes en replicación, que en general son capaces de una o solo unas pocas rondas de replicación in vivo, y que se dirigen como objetivo a células tumorales, pueden ser por ejemplo componentes útiles de estas composiciones y métodos. Estos agentes virales pueden comprender o estar asociados con ácidos nucleicos que codifican para inmunoestimulantes , tal como GM-CSF y/o IL-2. Los virus tanto naturalmente oncolíticos como oncolíticos recombinantes (por ejemplo virus de HSV-1, reovirus, adenovirus deficiente en replicación y sensible a replicación, etc.) pueden ser componentes útiles de estos métodos y composiciones. Por consiguiente, en una modalidad, la presente invención proporciona composiciones de combinación y métodos de administración de combinación en donde se combina o co-administra a un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF con un virus oncolítico. Los ejemplos de estos virus incluyen adenovirus oncolíticos y virus de herpes, y pueden ser o no virus modificados (ver por ejemplo Shan et al., J Neurooncol. 65(3), 203-26 (2003), Stiles et al., Surgery. 134(2), 357-64 (2003), Sunarmura et al., Páncreas. 28(3), 326-9 (2004), Teshigahara et al., J Surg Oncol. 85(1), 42-7 (2004), Varghese et al., Cáncer Gene Ther. 9(12), 967-78 (2002), ildner et al., C ncer Res. 59(2), 410-3 (1999), Yamanaka, Int J Oncol. 24(4), 919-23 (2004) y Zwiebel et al., Semin Oncol. 28(4), 336-43 (2001).
Las composiciones de combinación y los métodos de administración de combinación de la presente invención también pueden comprender métodos de inmunoterapia de "células enteras" y "adoptivos" . Por ejemplo, estos métodos pueden comprender la infusión o re- infusión de células del sistema inmunitario (por ejemplo linfocitos de infiltración a tumor (TIL) , tal como células T CD4+ y/o CD8+ (por ejemplo células T expandidas con antígenos específicos de tumor y/o me oras genéticas) , células B que expresan anticuerpo u otras células productoras/presentadoras de anticuerpo, células dendríticas (DC) (por ejemplo, células dendríticas recombinantes que expresan anticitocinas, células dendríticas cultivas con un agente de expansión de DC tal como GM-CSF y/o Flt3-L, y/o células dendríticas cargadas con antígeno asociado a tumor) , células NK antitumor, las llamadas células híbridas, o combinaciones de estas. Los lisados celulares también pueden ser útiles en los métodos y composiciones. Las "vacunas" celulares en ensayos clínicos que pueden ser útiles en estos aspectos incluyen CanvaxinMR, APC-8015 (Dendreon) , HSPPC-96 (Antigenics) , y lisados celulares MelacineMR. Los antígenos vertidos de células de cáncer y mezclas de los mismos (ver por ejemplo Bystryn et al., Clinical Cáncer Research Vol . 7, 1882-1887, Julio 2001), opcionalmente mezclados con adyuvantes tal como alumbre, también pueden ser componentes en estos métodos y composiciones de combinación.
En una modalidad, un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención se puede distribuir a un paciente en combinación con aplicación de un método de vacunación interna. La vacunación interna se requiere a la muerte inducida de tumor o células de cáncer, tal como muerte celular inducida por fármaco o inducida por radiación de las células tumorales, en un paciente, que conduce típicamente a respuesta de una respuesta inmunitaria dirigida hacia (i) las células tumorales como una totalidad o (ii) partes de las células tumorales que incluyen (a) proteínas segregadas, glicoproteínas u otros productos, (b) proteínas o glicoproteínas asociadas a membrana u otros componentes asociados con o insertados en membranas, y/o (c) proteínas intracelulares u otros componentes intracelulares . Una respuesta inmunitaria inducida por vacunación interna puede ser humoral (es decir, mediada por anticuerpo-complemento) o mediada por células (por ejemplo, el desarrollo y/o incremento de linfocitos T citotóxicos endógenos que reconocen las células tumorales internamente aniquiladas o partes de las mismas) . Además de radioterapia, los ejemplos no limitantes de fármacos y agentes que se pueden usar para inducir esta muerte de células tumorales y vacunación interna son agentes quimioterapéuticos convencionales, inhibidores del ciclo celular, fármacos antiangiogénicos , anticuerpos monoclonales , agentes inductores de apoptosis, e inhibidores de transducción de señal .
Los ejemplos de otros agentes anticáncer, que pueden ser pertinentes como agentes terapéuticos para el uso en combinación con un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención para tratar los trastornos como se describe anteriormente son agentes inductores de diferenciación, análogos de ácido retinoico (tal como ácido trans-retinoico total, ácido 13-cis-retinoico y agentes similares) , análogos de vitamina D (tal como seocalcitol y agentes similares) , inhibidores de ErbB3 , ErbB4, IGF-IR, receptor de insulina, PDGFRa, PDGFRbeta, Flk2 , Flt4, FGFR1 , FGFR2 , FGFR3 , FGFR , TRKA, TRKC, c-met, Ron, Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 y agentes similares.
Los ejemplos de otros agentes anticáncer, que pueden ser pertinentes como agentes terapéuticos para el uso en combinación con el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención para tratar los trastornos como se describe anteriormente son catepsina B, moduladores de la actividad de catepsina D deshidrogenasa, glutationa-S-transferasa (tal como glutacilcisteína sintetasa y lactato-deshidrogenasa) , y agentes similares.
Los ejemplos de otros agentes anticáncer, que pueden ser pertinentes como agentes terapéuticos para el uso en combinación con un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención para tratar los trastornos como se describe anteriormente son estramustina y epirubicina .
Los ejemplos de otros agentes anticáncer, que pueden ser pertinentes como agentes terapéuticos para el uso en combinación con un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención para tratar los trastornos como se describe anteriormente son un inhibidor de HSP90 tal como 17-alil-amino-geld-anamicina, anticuerpos dirigidos contra un antígeno tumoral tal como PSA, CA125, KSA, etc., integrinas tal como integrina ß?, inhibidores de VCAM y agentes similares.
Los ejemplos de otros agentes anticáncer, que pueden ser pertinentes como agentes terapéuticos para el uso en combinación con un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención para tratar los trastornos como se describe anteriormente son inhibidores de calcineurina (tal como valspodar, PSC 833 y otros inhibidores de MDR-1 o p-glicoproteína) , inhibidores de TOR (tal como sirolimus, everolimus y rapamciina) , e inhibidores de mecanismos "autodireccionales a linfocitos" (tal como FTY720) , y agentes que afectan la señalización celular tal como inhibidores de molécula de adhesión (por ejemplo antiLFA, etc . ) .
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la invención es para el uso en combinación con uno o más anticuerpos terapéuticos diferentes, tal como bevacizumab (AvastinMR) , zalutumumab, cetuximab (ErbituxMR) , panitumumab (VectibixMR) , ofatumumab (ArzerraMR) , zanolimumab, daratumumab (HuMax-CD38) , ranibizumab (LucentisMR) , daclizumab (ZenapaxMR) , basiliximab (SimulectR) , infliximab (RemicadeMR) , adalimumab (HumiraMR) , natalizumab (TysabriMR) , omalizumab (XolairMR) , efalizumab (RaptivaMR) , nimotuzumab, rituximab (RituxanMR/MabTheraMR) y/o trastuzumab (HerceptinM) . Otros anticuerpos terapéuticos que se pueden usar en combinación con el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención son aquellos descritos en WO98/40408 (anticuerpos que pueden unirse a TF humano nativo) , WO04/094475 (anticuerpos capaces de unirse a factor de tejido humano, que no inhiben la coagulación sanguínea mediada por el factor en comparación a un control de plasma normal) , WO03/093422 (anticuerpos que se unen con mayor afinidad al complejo TF:VIIa que a TF solo), WO03/037361 (agonista o antagonista de TF para tratamiento relacionado a apoptosis) o WO 2010/066803 (anticuerpos monoclonales humanos contra factor de tejido) .
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF se puede administrar en unión con la distribución de uno o más agentes que promueven el acceso del conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF o composición de combinación al interior de un tumor. Estos métodos se pueden realizar por ejemplo en asociación con la distribución de una relaxina, que es capaz de relajar un tumor (ver por ejemplo US 6,719,977). En una modalidad, un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención se puede unir a un péptido penetrador de célula (CPP) . Los péptidos penetradores de célula y péptidos relacionados (tal como anticuerpos penetradores de célula, manejados por ingeniería) se describen por ejemplo en Zhao et al., J Immunol Methods. 254(1-2), 137-45 (2001), Hong et al., Cáncer Res. 60(23) , 6551-6 (2000). Lindgren et al., Bioche J. 377 (Pt 1), 69-76 (2004), Buerger et al., J Cáncer Res Clin Oncol . 129(12), 669-75 (2003), Pooga et al., FASEB J. 12(1), 67-77 (1998) y Tseng et al., Mol Pharmacol . 62(4), 864-72 (2002).
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar un trastorno que comprende células que expresan TF en un sujeto, método que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención y al menos un agente antiinflamatorio a un sujeto en necesidad de lo mismo.
En una modalidad este agente antiinflamatorio se puede seleccionar de aspirina y otros salicilatos, inhibidores de Cox-2 (tal como rofecoxib y celecoxib) , NSAID (tal como ibuprofeno, fenoprofeno, naproxeno, sulindac, diclofenaco, piroxicam, cetoprofeno, diflunisal, nabumetona, etodolaco, oxaprozin, e indometacina) , anticuerpos antiIL6R, anticuerpos antiIL8 (por ejemplo anticuerpos descrito en la WO2004058797 , por ejemplo 10F8) , anticuerpos antiIL15 (por ejemplo anticuerpos descritos en WO03017935 y WO2004076620) , anticuerpos antiIL15R, anticuerpos antiCD4 (por ejemplo zanolimumab) , anticuerpos antiCDlla (por ejemplo, efalizumab) , anticuerpos antialfa-4/beta- 1 integrina (VLA4) (por ejemplo natalizumab) , CTLA4-Ig para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, prednisolona, prednisona, fármacos antireumáticos modificadores de enfermedad (DMARD) tal como metotrexato, hidroxiquiloroquina, sulfasalazina, inhibidores de la síntesis de pirimidina (tal como leflunomida) , agentes bloqueadores del receptor de IL-1 (tal como anakinra) , agentes bloqueadores de TNF-OÍ (tal como etanercept, infliximab, y adalimumab) y agentes similares.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar un trastorno que comprende células que expresan TF en un sujeto, método que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención y al menos un agente inmunosupresor y/o inmunomodulador a un sujeto en necesidad del mismo.
En una modalidad, este agente inmunosupresor y/o inraunomodulador se puede seleccionar de ciclosporina, azatioprina, ácido micofenólico, micofenolat-mofetil , corticosteroides tal como prednisona, metotrexato, sales de oro, sulfasalazina, antimalarios, brequinar, leflunomida, mizoribina, 15-desoxiespergualina, 6-mercaptopurina, ciclofosf mida, rapamicina, tacrolimus (FK-506) , 0KT3 , globulina antitimocito, timopentina, timosina-a y agentes similares .
En una modalidad, este agente inmunosupresor y/o inmunomodulador se puede seleccionar de anticuerpos inmunosupresores , tal como anticuerpos que se unen a p75 de receptor IL-2, anticuerpos contra CD25 (por ejemplo aquellos descritos en WO2004045512 , tal como AB1, AB7 , AB11, y AB12) , o anticuerpos que se unen a por ejemplo MHC, CD2, CD3 , CD4 , CD7, CD28, B7, CD40, CD45, IFNyR, TNFaR o TNFR (consisten de dos subunidades: CD120a y CD120b) , IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-8R, IL-10R, CDlla, o CD58, o anticuerpos que se unen a sus ligandos.
En una modalidad, este agente inmunosupresor y/o inmunomodulador se puede seleccionar de moléculas solubles de IL-15R, IL-10R, B7 (B7-1, B7-2, variantes de los mismos, y fragmentos de los mismos), ICOS, y 0X40, un inhibidor de un regulador de células T negativo (tal como un anticuerpo contra CTLA4) y agentes similares.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar un trastorno que comprende células que expresan TF en un sujeto, método que comprende la administración en una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención y un anticuerpo antiC3b(i) a un sujeto en necesidad de lo mismo.
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF para tratar los trastornos como se describe anteriormente se puede seleccionar de inhibidores de histona-desacetilasa (por ejemplo fenilbutirato) y/o agentes de reparación de ADN (por ejemplo enzimas de reparación de ADN y composiciones relacionadas tal como dimericina) .
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF para el uso en terapia de combinación con cualquiera de los agentes mencionados anteriormente es HuMab-TF-011-vcMMAE.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF para el uso en terapia de combinación con cualquiera de los agentes mencionados anteriormente es Hu ab-TF-098-vcMMAE .
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF para el uso en terapia de combinación con cualquiera de los agentes mencionados anteriormente es HuMab-TF-lll-vcMMAE.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF para el uso en terapia de combinación con cualquiera de los agentes mencionados anteriormente es Hu ab-TF-114-vcMMAE.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF para el uso en terapia de combinación con cualquiera de los agentes mencionados anteriormente es HuMab-TF-011-mcMMAF.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF para el uso en terapia de combinación con cualquiera de los agentes mencionados anteriormente es Hu ab-TF-098 -mcMMAF .
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF para el uso en terapia de combinación con cualquiera de los agentes mencionados anteriormente es HuMab-TF-lll-mcMMAF.
En una modalidad, el conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF para el uso en terapia de combinación con cualquiera de los agentes mencionados anteriormente es HuMab-TF-114 -mcMMAF .
Los métodos de la presente invención para tratar un trastorno como se describe anteriormente que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención también pueden comprender terapia fotodinámica dirigida anticáncer (por ejemplo terapia láser anticáncer, que se puede practicar opcionalmente con el uso de un agente fotosensibilizador, ver, por ejemplo Zhang et al., J Control Reléase. 3(2), 141-50 (2003)), terapias de onda de choches y onda sónica anticáncer (ver por ejemplo Kambe et al., Hum Cell. 10(1), 87-94 (1997)), y/o terapia nutracéutica anticáncer (ver por ejemplo Roudebush et al., Vet Clin North Am Small Anim Pract. 34 (1), 249-69, viii (2004) and Rafi, Nutrition. 2 (1), 78-82 (2004). Igualmente, un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF se puede usar para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un trastorno como se describe anteriormente que se va ha administrar con terapia fotodinámica dirigida anticáncer (por ejemplo terapia láser anticáncer que se puede practicar opcionalmente con el uso de agente fotosensibilizador, terapias de onda de choque y onda sónica anticáncer y/o terapia nutracéutica anticáncer.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar un trastorno que comprende células que expresan TF en un sujeto, método que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF, tal como conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención, y radioterapia a un sujeto en necesidad de esto.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir cáncer, método que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención, y radioterapia a un sujeto en necesidad de esto.
En una modalidad, la presente invención proporciona el uso de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF, de la presente invención, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar cáncer que se va ha a administrar en combinación con radioterapia.
La radioterapia puede comprender radiación o administración de radiofarmacéuticos a un paciente. La fuente de radiación puede ser ya sea externa o interna al paciente que se trate (tratamiento de radiación puede estar por ejemplo en la forma de terapia de radicación de haz externo (EBRT, por sus siglas en inglés) o braquiterapia (BT) ) . Los elementos radiactivos que se pueden usar en la práctica de estos métodos incluyen, por ejemplo, radio, cesio-137, iridio-192, americio-241, oro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnecio-99, yoduro -123, yoduro-131, e indio-111.
En una modalidad adicional, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir cáncer, el método que comprende la administración a un sujeto en necesidad del mismo y una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención, en combinación con cirugía.
Como se describe anteriormente, una composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar en terapia de combinación, es decir, combinar con uno o más agentes pertinentes para la enfermedad o condición que se va a tratar ya sea como composiciones farmacéuticas separadas o con un compuesto de la presente invención co- formulado con un o más agente terapéuticos adicionales como se describe anteriormente. Estas terapias de combinación pueden requerir menores dosis del compuesto de la presente invención y/o los agentes co-administrados , evitando de este modo las posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las varias monoterapias .
Además de lo anterior, otras terapias pertinentes de combinación incluyen lo siguiente: - Para el tratamiento de cáncer pancreático, un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención en combinación con un antimetabolito, tal como 5-fluorouracilo y/o gemcitabina, posiblemente en combinación con uno o más compuestos seleccionados de: 90Y-hPAM , ARC-100, ARQ-197, AZD-6244, bardoxolona-metil, cixutumumab, (IMC-A12) , folitixorin cálcico, GVAX, ipilimumab, KRX-0601, merbarona, MGCD-0103, MORAb-009, PX-12, Rh-Apo2L, TLN-4601, trabedersen, volociximab (M200) , WX-671, pemetrexed, rubitecano, ixabepilono, OCX- 0191Vion, 216586-46-8, lapatinib, matuzumab, imatinib, sorafinib, trastuzumab, exabepilone, erlotinib, avastin y cetuximab.
Para el tratamiento de cáncer colorectal un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención en combinación con uno o más compuestos seleccionados de: gemcitabina, bevacizumab, FOLFOX, FOLFIRI, XELOX, IFL, oxaliplatin, irinotecan, 5-FU/LV, Capecitabina, UFT, agentes que seleccionan como objetivo EGFR, tal como cetuximab, panitumumab, nimotuzumab, zalutumumab; inhibidores de VEGF, o inhibidores de tirosina-cinasa tal como sunitinib.
- Para el tratamiento de cáncer de mama, un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención en combinación con uno o más compuestos seleccionados de: antimetabolitos, antraciclinas , taxanos, agentes de alquilación, epotilonas antihormonales (femar, tamoxifen etc) , inhibidores de ErbB2 (Her2/neu) (tal como herceptin y agentes similares) , CAF/FAC (ciclofosfamida, doxorubicina, 5FU) AC (ciclo, doxo) , CMF (ciclo, metotrexatoe, 5FU) , Docetaxel + capecitabina, GT (paclitaxel, gemcitabina) FEC (ciclo, epi, 5FU) en combinación con herceptina: Paclitaxel +/- carboplatina, Vinorelbine, Docetaxel, CT en combinación con lapatinib; Capecitabina.
- Para el tratamiento de vejiga, un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención en combinación con uno o más compuestos seleccionados de: antimetabolitos (gemcitabina, alimta, metotrexato) , análogos de platino (cisplatina, carboplatina) , inhibidores de EGFr (tal como cetuximab o zalutumumab) , inhibidores de VEGF (tal como Avastina) doxorubicina, inhibidores de tirosina-cinasa tal como gefitinib, trastuzumab, agente antimitótico, tal como taxanos, por ejemplo paclitaxel, y alcaloides de vinca per vinca, por ejemplo vinblastina.
- Para el tratamiento de cáncer de próstata, un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención en combinación con uno o más compuestos seleccionados de: terapias hormonales/antihormonales; tal como antiandrógenos, agonistas de hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH, por sus siglas en inglés) , y quimioterapéuticos tal como taxanos, mitoxantrona, estramustina, 5FU, vinblastina, ixabepilona.
Para el tratamiento de cáncer ovárico, un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de acuerdo a la presente invención en combinación con uno o más compuestos seleccionados de: un agente antimitótico, tal como taxanos, y alcaloides de vinca per vinca, caelyx, topotecan.
Usos de Diagnóstico Los anticuerpos antiTF de la invención también se pueden usar para propósitos de diagnóstico. Los anticuerpos antiTF descritos en la presente se pueden conjugar en una modalidad a un agente de detección o marca en lugar de un fármaco, haciéndolos de este modo adecuados para propósitos de diagnóstico. En una modalidad, el uso de diagnóstico de un anticuerpo antiTF o un anticuerpo antiTF conjugado a un agente de detección se puede usar en combinación con uno de los otros métodos de la presente invención, en particular un uso farmacéutico del conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención. El anticuerpo antiTF conjugado a un agente de detección puede permitir en algunos casos una detección directa de la unión del anticuerpo antiTF al TF, los ejemplos del "agente de detección" o "marca" se dan en lo siguiente y la referencia a "anticuerpo antiTF" en lo siguiente pueden ser pertinentes también incluyen la referencia a "anticuerpo antiTF conjugado a un agente o marca de detección" . El término "usos de diagnóstico" incluye también medir el nivel de TF en por ejemplo plasma, orina o los niveles de expresión de TF en biopsias con relación a la selección de pacientes para tratamiento o a la medición de la eficiencia en un tratamiento como se describe anteriormente, y el uso de por ejemplo anticuerpos antiTF radiomarcados por ejemplo para seleccionar pacientes para tratamiento como se describe anteriormente. De esta manera, en un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición de diagnóstico que comprende un anticuerpo antiTF como se define en la presente, en donde la composición de diagnóstico se puede usar en una modalidad particular en combinación con un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención .
En una modalidad, los anticuerpos antiTF de la presente invención se pueden usar ín vivo o in vitro para diagnosticar enfermedades en donde las células que expresan TF juegan un papel activo en la patogénesis, al detectar niveles de TF, o niveles de células que contienen TF en su superficie de membrana. Esto se puede lograr, por ejemplo, al poner en contacto una muestra que se va ha probar, opcionalmente junto con una muestra de control, con el anticuerpo antiTF bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo antiTF y TF. Entonces se detecta la formación del complejo (por ejemplo, usando un ELISA) . Cuando se usa una muestra de control junto con la muestra de prueba, se detecta el complejo en ambas muestras y cualquier diferencia estadísticamente significativa en la formación de complejos entre las muestras es indicativa de la presencia de TF en la muestra de prueba.
De esta manera, en un aspecto adicional, los anticuerpos antiTF de la presente invención también se pueden usar en un método para detectar la presencia de antígeno de TF, o una célula que expresa TF, en una muestra que comprende : - poner en contacto la muestra con un anticuerpos antiTF de la invención o una molécula biespecífica de la invención, bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y TF y - analizar si se ha formado un complejo.
En una modalidad, el método se realiza in vitro. De manera más específica, los anticuerpos antiTF de la presente invención también se pueden usar en métodos para la identificación de, y diagnosis de células y tejidos invasores, y otras células seleccionadas como objetivo por anticuerpos antiTF de la presente invención, y para el monitoreo del proceso de tratamientos terapéuticos, estado después de tratamiento, riesgo de desarrollar cáncer, progreso de cáncer, y similares.
En un ejemplo de este ensayo de diagnóstico, los anticuerpos antiTF de la presente invención se pueden usar en un método para diagnosticar el nivel de células invasoras en un tejido. Este método comprende formar un inmunocomplejo entre un anticuerpo antiTF y potenciales tejidos que contienen TF, y detectar la formación del inmunocomplejo, en donde la formación del inmunocomplejo correlaciona con la presencia de células invasoras en el tejido. La puesta en contacto se puede realizar in vivo, usando anticuerpos aislados, marcados y técnicas normales de información de imágenes, o se puede realizar in vitro en muestras de tejido.
Los anticuerpos antiTF de la presente invención también se pueden usar para detectar péptidos que contienen TF y fragmentos peptídicos en cualquier muestra biológica adecuada por cualquier técnica adecuada. Los ejemplos de inmunoensayos convencionales proporcionados por la presente invención incluyen, sin limitación, un ELISA, un RIA, ensayos de FACS, ensayos de resonancia de plasmón, ensayos cromatográficos , inmunohistoquímica de tejido, transferencia Western, y/o inmunoprecipitación usando un anticuerpo antiTF. Los anticuerpos antiTF de la presente invención se pueden usar para detectar TF y fragmentos de TF de humanos. Las marcas adecuadas para el anticuerpo antiTF y/o anticuerpos secundarios usados en estas técnicas incluyen, sin limitación, varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alalina, ß-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos adecuados de grupos protésicos incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbelliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina . Un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de material reactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S, y 3H.
También se pueden usar anticuerpos antiTF para valorar una muestra biológica por un inmunoensayo de competición utilizando marcas de péptido de TF marcadas con una sustancia detectable y un anticuerpo antiTF no marcado. En este ensayo, la muestra biológica, las normas de péptido de TF marcadas y los anticuerpos antiTF se combinan y se determina la cantidad de norma de TF marcada unida al anticuerpo antiTF no marcado. La cantidad de péptido de TF en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de marca de TF marcada unida al anticuerpo antiTF.
Los anticuerpos antiTF son particularmente útiles en la formación in vivo de imágenes de tumores. La formación in vivo de imágenes de tumores asociados con TF se puede realizar por cualquier técnica adecuada. Por ejemplo, se puede usar marcación con 99Tc o marcación con otro isótopo emisor de rayos gamma para marcar anticuerpos antiTF en tumores o complejos secundarios marcados (por ejemplo, marcados con FITC) de anticuerpo antiTF:TF de los tumores y formar en imagen con una cámara de escintilación gamma (por ejemplo, un dispositivo Elscint Apex 409ECT) , típicamente usando un colimador de alta resolución y baja energía o un colimador de todo propósito de baja energía. Entonces los tej idos teñidos se pueden valorar para conteo de radioactividad como un indicador de la cantidad de péptidos asociados a TF en el tumor. Las imágenes obtenidas por el uso de esta técnica se pueden usar para valorar la biodistribución de TF en un paciente, mamífero, o tejido, por ejemplo en el contexto de usar TF o fragmentos de TF como un biomarcador para la presencia de células de cáncer invasivas. Las variaciones en esta técnica pueden incluir el uso de formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) para mejorar la formación de imágenes con respecto a las técnicas con cámaras gamma. Los principios y métodos de inmunoescintigrafía, similares, se describen en, por ejemplo Srivastava (ed. ) , Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy (Plenum Press 1988) , Chase, "Medical Applications of Radioisotopes , " en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Gennaro et al., (eds.), p . 624-652 (Mack Publishing Co. , 1990), y Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," en Biotechnology And Pharmacy 227-49, Pezzuto et al., (eds.) (Chapman y Hall 1993). Estas imágenes también se pueden usar para distribución dirigida de otros agentes anticáncer, los ejemplos de los cuales se describen en la presente (por ejemplo, agentes apoptóticos, toxinas, o composiciones de quimioterapia de CHOP) . Además, estas imágenes pueden servir también o de manera alternativa como la base de técnicas quirúrgicas para remover tumores. Adicionalmente, estas técnicas de formación in vivo de imágenes pueden permitir la identificación y localización de un tumor en una situación donde se identifica un paciente como que tiene un tumor (debido a la presencia de otros biomarcadores , metástasis, etc.), pero el tumor no se puede identificar por técnicas analíticas tradicionales. Todos estos métodos son características de la presente invención y estos métodos se pueden usar en particular en combinación con el tratamiento de un paciente con un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención.
Los métodos de formación in vivo de imágenes y otros métodos de diagnóstico proporcionados por la presente invención son particularmente útiles en la detección de micrometástasis en un paciente humano (por ejemplo, un paciente no previamente diagnosticado con cáncer o un paciente en un período de recuperación/remisión de un cáncer) . Se ha demostrado que las células de cáncer de carcinoma, que pueden constituir hasta 90% de todas las células de cáncer, a manera de ejemplo, se tiñen muy bien con composiciones de anticuerpo antiTF. La detección con anticuerpos antiTF monoclonales , descritos en la presente, puede ser indicativa de la presencia de carcinomas que son agresivos/invasivos y también o de manera alternativa proporcionan una indicación de la factibilidad de usar anticuerpo antiTF monoclonal relacionado contra estas micrometástasis .
En una modalidad, los anticuerpos antiTF de la presente invención se pueden usar en un método de formación in vivo de imágenes en donde se conjuga un anticuerpo antiTF de la presente invención a un radioagente opaco promotor de detección, el anticuerpo conjugado se administra a un hospedador, tal como por inyección en la corriente sanguínea, y se valora la presencia y ubicación del anticuerpo marcado en el hospedador. A través de esta técnica y de cualquier otro método de diagnóstico proporcionado en la presente, los anticuerpos antiTF de la presente invención se pueden usar en un método para examinar la presencia de células relacionadas a enfermedad en un paciente humano o en una muestra biológica tomada de un paciente humano.
Para formación de imágenes de diagnóstico, los radioisótopos se pueden unir a un anticuerpo antiTF ya sea de forma directa, o indirectamente al usar un grupo funcional intermedio. Los grupos funcionales intermedios útiles incluyen queladores tal como ácido etilenodiaminetetraacético y ácido dietilenotriaminepentaacético (ver por ejemplo US 5, 057, 313) .
Además de los radioisótopos y radio-agentes opacos, los métodos de diagnóstico se pueden realizar usando anticuerpos antiTF que se conjugan a tintes (tal como con el complejo de biotina-estreptavidina) , agentes de contraste, compuestos fluorescentes o moléculas y agentes mej oradores (por ejemplo iones paramagnéticos) para formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 6,331,175, que describe técnicas de MRI y la preparación de anticuerpos conjugados a un agente mejorador de MRI) . Estos agentes de diagnóstico/detección se pueden seleccionar de agentes para el uso en formación de imágenes por resonancia magnética, y compuestos fluorescentes. A fin de cargar un anticuerpo antiTF con metales radioactivos o iones paramagnéticos, puede ser necesario hacerlos reaccionar con un agente que tenga una extremidad larga a la cual se unan una multiplicidad de grupos queladores para la unión de los iones. Esta extremidad puede ser un polímero tal como una polilisina, polisacárido, u otra cadena derivatizada o derivatizable que tiene grupos colgantes a los cuales se pueden unir grupos queladores tal como por ejemplo, porfirinas, poliaminas, éteres corona, bistiosemicarbazonas, polioximas, y grupos similares conocidos por ser útiles para este propósito. Los quelatos se pueden acoplar a anticuerpos antiTF usando químicas normales.
De esta manera, la presente invención proporciona conjugados de anticuerpo antiTF de diagnóstico, en donde el anticuerpo antiTF se conjuga a un agente de contraste (tal como para formación de imágenes por resonancia magnética, tomografía computarizada, o agente de contrastes - mejorador de ultrasonido) o un radionúclido que puede ser por ejemplo, un isótopo emisor de rayos gamma- , beta- , alfa- , electrones Auger opositores .
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un equipo o kit para detectar la presencia de antígeno de TF, o una célula que expresa TF, en una muestra que comprende un anticuerpo antiTF de la invención o una molécula bioespecífica de la invención; y - instrucciones para el uso del equipo, en donde el equipo también contiene en particular un anticuerpo antiTF con jugado a un agente de dirección o agente de contraste de la presente invención.
En una modalidad, los anticuerpos antiTF de la presente invención también se pueden usar en un equipo para diagnosis de cáncer que comprende un recipiente que comprende un anticuerpo antiTF, y uno o más reactivos para detectar la unión del anticuerpo antiTF a un péptido de TF. Este equipo puede comprender además en particular un conjugado de fármaco y anticuerpo antiTF de la presente invención. Los reactivos pueden incluir por ejemplo, marcas fluorescentes, marcas enzimáticas, u otras marcas detectables . Los reactivos también pueden incluir anticuerpos secundarios o terciarios o reactivos para reacciones enzimáticas, en donde las reacciones enzimáticas producen un producto que se puede visualizar. En una modalidad, la presente invención proporciona un equipo de diagnóstico que comprende uno o más anticuerpos antiTF, de la presente invención en forma marcadas o no marcada en recipientes adecuados, reactivos para las incubaciones para un ensayo indirecto, y substratos o agentes derivatizadores para la detección en este ensayo, dependiendo de la naturaleza de la marca. También se pueden incluir reactivos de control e instrucciones para el uso.
También se pueden suministrar equipos de diagnóstico para el uso con un anticuerpo antiTF, tal como un anticuerpo antiTF conjugado/marcado, para la detección de una actividad celular o para detectar la presencia de péptidos de TF en una muestra de tejido u hospedador. En estos equipos de diagnóstico, así como en equipos para usos terapéuticos descritos en otra parte de la presente, un anticuerpo antiTF se puede proporcionar típicamente en una forma liofilizada en un recipiente, ya sea solo o en unión con anticuerpos adicionales específicos para un péptido o célula objetivo o diana. Típicamente, un portador farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, un diluyente inerte) y/o componentes del mismo, tal como un amortiguador Tris, de fosfato, o de carbonate, estabilizadores, conservadores, biocidas, proteínas inertes, por ejemplo biocidas, proteínas inertes, por ejemplo, albúmina sérica, o similares, también se incluyen (típicamente en un recipiente separado para mezclado) y reactivos adicionales (también típicamente en recipientes separados) . En ciertos equipos, un anticuerpo secundario capaz de unirse al anticuerpo antiTF, que está típicamente presente en un recipiente separado, también se incluye. El segundo anticuerpo se conjuga típicamente a una marca y se formula de una manera similar al anticuerpo antiTF de la presente invención. Usando los métodos descritos anteriormente y en otra parte de la presente, se pueden usar los anticuerpos antiTF para definir subconjuntos de células de cáncer/tumor y caracterizar estas células y tejidas/crecimientos relacionados.
Se puede lograr la detección in situ al remover un espécimen histológico de un paciente, y al proporcionar la combinación de anticuerpos antiTF marcador (anticuerpo antiTF conjugado a un agente de detección), de la presente invención a este espécimen. El anticuerpo antiTF de la presente invención se puede proporcionar al aplicar o al traslapar el anticuerpo antiTF marcado de la presente invención a una muestra biológica. A través del uso de este procedimiento, es posible determinar no solo la presencia de TF o de fragmentos de TF sino también la distribución de estos péptidos en el tejido examinado (por ejemplo, en el contexto de valorar la propagación de células de cáncer) . Usando la presente invención, aquellos expertos en la técnica percibieron fácilmente que cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tal como procedimientos de tinción) se pueden modificar a fin de lograr esta detección in situ.
La presente invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos que no se deben considerar como adicionalmente como limitantes.
Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de expresión para factor de tejido (TF) Se generaron construcciones completamente optimizadas por codón para la expresión de TF o sus dominios extracelulares en células HEK, NSO o CHO. Las proteínas codificadas por estas construcciones son idénticas al acceso en Genbank NP_001984 para TF. Las construcciones contuvieron sitios adecuados de restricción para clonación y una secuencia Kozak óptima (Kozak, 1987) . Las construcciones se clonaron en un vector de expresión de mamífero pEE13.4 (Lonza Biologics) (Bebbington, Renner et al. 1992), obteniendo pEE13.4TF. se usó PCR para amplificar la parte, que codifica para el domiminio extracelular (ECD, por sus siglas en inglés) (aminoácidos 1-251) de TF, de la construcción sintética, adicionando una marca His tag C-terminal que contiene 6 residuos His (TFECDHis) . La construcción se clonó en pEE13.4 y se secuenció completamente para confirmar la corrección de la construcción.
Ejemplo 2 Expresión transiente en células HEK-293F Se obtuvieron células 293 -F FreestyleMR (un subclon HEK-293 adaptado al crecimiento en suspensión y medio Freestyle químicamente definido, (HEK-293F) ) de Invitrogen y se transíectaron con el ADN de plásmido apropiado, usando 293fectin (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. En el caso de la expresión de anticuerpo, los vectores apropiados de cadena pesada y de cadena ligera, como se describe en el Ejemplo 10, se co-expresaron.
Ejemplo 3 Expresión semi-estable en células NSO Se transfectó de manera estable pEE13.4TF en células NSO y se seleccionaron clones estables en crecimiento en la ausencia de glutamina y en la presencia de 7.5 µ? de metilsulfoximina (MSX) . Se cultivó una combinación de clones en cultivo de suspensión en tanto que se mantiene presión de selección. Las combinaciones se probaron para la expresión de TF por análisis por FACS y se aseguraron para uso futuro.
Ejemplo 4 Expresión estable en células CHO Se transfectó de manera estable pEE13.4TF en células CHO-K1SV (Lonza Biologics) y se seleccionaron clones estables en crecimiento en la ausencia de glutamina y en la presencia de MSX 50 µ?. Los clones individuales se recolectaron y expandieron y probaron para la expresión de TF por análisis por FACS como se describe más adelante. Se eligieron clones de alta expresión y se aseguraron para uso adicional.
Ejemplo 5 Purificación de TF marcado con His Se expresó TFECDhis en células I HEK-293F. la marca his en TFECDHis permite la purificación con cromatografía por afinidad de metales inmovilizados. En este proceso, un quelador fijado en la resina cromatográfica se cargó con cationes Co2+. El sobrenadante que contiene TFECDHis se incuba con la resina en modo por lotes (es decir, en solución) . La proteína marcada con His se une fuertemente a las cuentes de resina, en tanto que otras proteínas presentes en el sobrenadante de cultivo no se unen de manera fuerte . Después de la incubación, las cuentas se recuperaron del sobrenadante y se envasaron en una columna. La columna se lavó a fin de remover las proteínas débilmente unidas. Las proteínas TFECDHis fuertemente unidas entonces se eluyen con un amortiguador que contiene imidazol, que compite con la unión de His a Co2+. El eluyente se remueve de la proteína por intercambio de amortiguador en una columna de desalación.
Ej emplo 6 Procedimiento de inmunización de ratones transgénicos Se derivaron los anticuerpos 042, 092-A09, 098 y 101 de las siguientes inmunizaciones: tres ratones HCo20 (2 machos y 1 hembra, variedad GG2713) , tres ratones HCol7 (2 machos y 1 hembra, variedad GG2 14) , tres ratones HCol2-BALB/c (3 machos, variedad GG2811) , tres ratones HCo7 (3 machos, variedad GG2201) y tres ratones HCol2 (3 machos, variedad GG2198) (Medarex, San José, CA, EUA; para referencias ver párrafo en HuMab anterior) se inmunizaron cada dos semanas alternando con 5xl06 células NSO-TF transfectadas semi-estables, o con 20 pg de proteína TFECDHis . Se realizaron ocho inmunizaciones en total, cuatro inmunizaciones intraperitoneales (IP) y cuatro subcutáneas (SC) en la base de la cola. La primera inmunización con células se hizo en adyuvante completo de Freund (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, EUA) . Para todas las otras inmunizaciones, las células se inyectaron IP en PBS y se inyectó SC TFECDHis usando adyuvante incompleto de Freund (IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, EUA) . Cuando se encontró que son suficientes los títulos de suero (dilución de suero de 1/50 o menor encontrado positivo en ensayo de examen específico de antígeno como se describe en el ejemplo 7 en al menos dos eventos de examen bisemanal secuencial) , los ratones se reforzaron adicionalmente dos veces de forma intravenosa (IV) con 10 µg de proteína TFECDHis en 100 L de PBS, 4 y 3 días antes de la fusión.
Los anticuerpos 109, 111 y 114 se derivaron de las siguientes inmunizaciones: tres ratones HCo20 (3 machos), tres ratones HCol7 (3 machos), tres ratones HCol2-BALB/c (3 machos) , tres ratones HCo7 (3 machos) y tres ratones HCol2 (3 hembras) se inmunizaron cada quincena con 5xlOe NSO-TF transfectadas , semi-estables. La primera inmunización con células se realizó en CFA, para todas las otras (7) inmunizaciones, se inyectaron IP células en PBS. Cuando se encontró que ls títulos son suficientes (como se define anteriormente) , los ratones se reforzaron adicionalmente dos veces IV con lxlO6 células NSO-TF transíectadas , transientemente semi-estables en 100 de PBS, 4 y 3 días antes de la fusión.
Los anticuerpos 011, 017-D12 y 025 mse derivaron de las siguientes inmuunizaciones : tres ratones HCo20 (3 machos) , tres ratones HCol7 (2 machos y 1 hembra) , tres ratones HCol2-BALB/c (3 hembras) , tres ratones HCo7 (3 machos) tres ratones HCol2 (2 machos y 1 hembra) se inmunizaron cada quince días 20 20 ug de proteína TFECDHis. La primera inmunización (intraperitoneal) con proteínas se hizo en CFA, para todas las otras (7) inmunizaciones, la proteínas se inyectó alternando de forma subcutánea e intraperitoneal en IFA. Cuando se encontró que son suficientes los títulos de suero (como se define anteriormente) , los ratones se reforzaron adicionalmente dos veces de forma intravenosa (IV) con 10 \iq de proteína TFECDHis en 100 µ? de PBS, 4 y 3 días antes de la fusión.
Ejemplo 7 Ensayo de examen específico de antígeno homogéneo La presencia de anticuerpos antiTF en sueros de ratones inmunizados o sobrenadante de cultivo de hibridoma o transfec oma de HuMab (anticuerpo monoclonal humano) se determinó por ensayos de examen específico de antígeno homogéneo (cuatro cuadrante) usando Tecnología de Ensayo de Microvolumen Fluorométrico (FMAT; Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) .
Para esto, se usó una combinación de tres ensayos basados en células y un ensayo basado en cuentas. En los ensayos basados en células, se determinó la unión a TH1015-TF (células HE -293F que expresan de forma transiente TF; producidas como se describe anteriormente) y A431 (que expresan TF en la superficie celular) así como células HEK293 tipo silvestre (no expresan TF, control negativo) . En el ensayo basado en cuentas, se determinó la unión a TF biotinilado acoplado en una cuenta de estreptavidina (SB1015-TF) .
Se adicionaron muestras a las células/cuentas para permitir la unión a TF. De manera subsiguiente, se detectó la unión de HuMab usando un conjugado fluorescente (IgG-Cy5 antiHumano de cabra; Jackson ImmunoResearch) . Se usó anticuerpo de ratón antiTF humano (ERL; acoplado a Alexa-647 en Genmab) como control positivo y como controles negativos se usaron suero mezclado de HuMAb-ratón y anticuerpo de ratón-crompuro-Alexa647. Las muestras se exploraron usando un Sistema de Detección Celular Applied Biosystems 8200 (8200 CDS) y se usó como lectura "cuentas x fluorescencia" .
Ejemplo 8 Generación de hibridoma HuMab Ratones HuMab con suficiente desarrollo de título específico de antígeno (como se define anteriormente) se sacrificaron por eutanasia y se recolectaron el bazo y los nodulos linfáticos que flanquean la aorta abdominal y la vena cava. La fusión de esolenocitos y células de nodulos linfáticos a una línea de células de mieloma de ratón se hizo por electrofusión usando un Sistema de Electrofusión CEEF 50 (Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, EUA) , esencialmente de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La selección y cultivo de los hibridomas HuMab resultantes se hizo en base a protocolos normales (por ejemplo como se describe en Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. y Strober, W., eds . Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc . , 2006) .
Ejemplo 9 Espectrometría de masas de anticuerpos purificados Se purificaron pequeñas alícuotas de 0.8 mi de sobrenadante que contiene anticuerpo de una etapa de 6 concavidades o Hyperflask usando columnas PhyTip que contienen resina de proteína G (PhyNexus Inc., San José, EUA) en una estación de trabajo Sciclone ALH 3000 (Caliper Lifesciences , Hopkinton, EUA). Las columnas PhyTtip se usaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante, pero se reemplazaron los amortiguadores por: Amortiguador de Unión PBS (B.Braun, Medical B.V., Oss, los países bajos) y Amortiguador de Elución Glicina-HCl 0.1M pH 2.7 (Fluka Riedel-de Haén, Buchs, Alemania) . Después de la purificación, las muestras se neutralizaron con Tris-HCl 2M pH 9.0 (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Los países bajos) . De manera alternativa, en algunos casos, se purificaron mayores volúmenes de sobre nadante de cultivo usando cromatografía en columna por afinidad de Proteína A.
Después de la purificación, las muestras se colocaron en una placa de 384 concavidades (Waters, placa de concavidad cuadrada de 100 ul, parte # 186002631) . Las muestras de desglicosilaron durante la noche a 37 °C con N-glicosidasa F (Roche cat no 11365177001. DTT (15 mg/ml) se adicionó (1 µ? / concavidad) y se incubó durante 1 hora a 37°C. Las muestras (5 o 6 ul) se desalaron en un Acquity UPLCMR (Waters, Milford, EUA) con una columna BEH300 C18, 1.7 m, 2.1x 50 mm a 60°C. Se usaron agua MQ y acetonitrilo grado LC-MS (Biosolve, cat no 01204101,Valkenswaard, Los países bajos) ambos con ácido fórmico al 0.1% (Fluka, cat no 56302, Buchs, Alemania) , como eluyentes A y B, respectivamente. Se registraron en línea los espectros de masa con ionización por electrorociado de tiempo de vuelo en un espectrómetro de masas micrOTOFMR (Bruker, Bremen, Alemania) que opera en el modo de ión positivo. Antes del análisis, se calibró una balanza de 900-3000 m/z con mezcla de ajuste ES (Agilent Technologies, Santa Clara, EUA) . Los espectros de masa se desconvulucionaron con software DataAnalysis v. 3.4 (Bruker) usando la búsqueda por algoritmo de Entropía máxima para pesos moleculares entre 5 y 80 kDa.
Después de la desconvolución, las masas resultantes de cadena pesada y ligera para todas las muestras se compararon a fin de encontrar anticuerpos duplicados. En la comparación de las cadenas pesadas, se tomó en cuenta la posible presencia de variantes de lisina C-terminales . Esto dio por resultado una lista de anticuerpos únicos, donde únicos se define como una combinación única de cadenas pesadas y ligeras . En el caso en que se encontraron anticuerpos duplicados, los resultados de otras pruebas se usaron para decidir cuál fue el mejor material para continuar con los experimentos.
El análisis por S de los pesos moleculares de cadenas pesadas y ligeras de 118 hibridomas específicos de TF produjo 70 anticuerpos únicos (combinación única de cadena pesada/cadena ligera) . Estos se caracterizaron en varios ensayos funcionales, identificando nuestros candidatos guía, anticuerpos específicos TF.
Ejemplo 10 Análisis de secuencia de los dominios variables de HuMab antiTF y clonación en vectores de expresión Se preparó ARN total de los HuMabs antiTF a partir de 5x10s células de hibridoma y se preparó 5 ' -RACE-ADN complementario (ADNc) a partir de 100 ng de ARN total, usando el equipo de amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech) , de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se amplificaron las regiones codificadoras de H (región variable de cadena pesada) y de VL (región variable de cadena ligera) mediante PCR y se clonaron en el vector pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen) usando el equipo de clonación por PCR Zero Blunt (Invitrogen) . Para cada HuMab, se secuenciaron 16 clones de VL y 8 clones de VH. Las secuencias se dan en el Listado de Secuencias y en la Figura 1 de la presente.
La Tabla 1A y la Tabla IB (posteriores) dan una vista general de la información de secuencias de anticuerpo y la mayoría de las secuencias de línea germinal homologa.
Tabla 1A Homologías de cadena pesada Tabla IB Homologías de cadena ligera Referencia al listado de secuencias: (secuencias en la Figura 11 En la Figura 1, el clon 017-D12 se refiere como "017" y similar el clon 092-A09 se refiere como "092".
El HuMab 092-A09 antiTF es un anticuerpo tipo IgGl,K monoclonal completamente humano de longitud completa que comprende la secuencia VH de SEQ ID No: 17 y la secuencia VL de SEQ ID No: 57.
El HuMab 101 antiTF es un anticuerpo tipo IgGl,K monoclonal completamente humano de longitud completa que comprende la secuencia VH de SEQ ID No: 21 y la secuencia VL de SEQ ID No: 61.
El HuMab 025 antiTF es un anticuerpo tipo IgGl,K monoclonal completamente humano de longitud completa que comprende la secuencia VH de SEQ ID No: 25 y la secuencia VL de SEQ ID No: 65.
El HuMab 109 antiTF es un anticuerpo tipo IgGl, monoclonal completamente humano de longitud completa que comprende la secuencia VH de SEQ ID No:29 y la secuencia VL de SEQ ID NO: 69.
El HuMab 017-D12 antiTF es un anticuerpo tipo IgGl, monoclonal completamente humano de longitud completa que comprende la secuencia VH de SEQ ID No: 9 y la secuencia VL de SEQ ID No: 49.
El HuMab 114 antiTF es un anticuerpo tipo IgGl,K monoclonal completamente humano de longitud completa que comprende la secuencia VH de SEQ ID No:l y la secuencia VL de SEQ ID No: 41.
El HuMab 042 antiTF es un anticuerpo tipo IgGl, monoclonal completamente humano de longitud completa que comprende la secuencia VH de SEQ ID No: 13 y la secuencia VL de SEQ ID No: 53.
El HuMab 011 antiTF es un anticuerpo tipo IgGl,K monoclonal completamente humano de longitud completa que comprende la secuencia VH de SEQ ID No: 5 y la secuencia VL de SEQ ID No: 45.
El HuMab 098 antiTF es un anticuerpo tipo IgGl,K monoclonal completamente humano de longitud completa que comprende la secuencia VH de SEQ ID No: 33 y la secuencia VL de SEQ ID No : 73.
El HuMab 111 antiTF es un anticuerpo tipo IgGl, monoclonal completamente humano de longitud completa que comprende la secuencia VH de SEQ ID No:37 y la secuencia VL de SEQ ID No: 77.
Ejemplo 11 Purificación de anticuerpos Se filtró el sobrenadante de cultivo sobre filtros de extremo muerto de 0.2 µt? y se cargó en columnas de Proteína A de 5 mi (rProteína A FF, Amersham Bioscience) y se eluyó con ácido cítrico-NaOH 0.1 M, pH 3. El producto eluido se neutralizó inmediatamente con Tris-HCl 2M, pH 9 y se dializó durante la noche a NaH2P04 12.6 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4 (B. Braun) . Después de la diálisis, las muestras se filtraron estériles sobre filtros de extremo muerto de 0.2 µp?. La pureza se determinó por SDS-PAGE y se midió la concentración por nefelometría y absorbancia a 280nm. Los anticuerpos purificados se tomaron en alícuotas y se almacenaron a -80°C. Una vez descongeladas, las alícuotas de anticuerpos purificados se mantuvieron a 4°C. Se realizó la espectrometría de masa para identificar la masa molecular de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo expresadas por los hibridomas como se describe en el Ejemplo 9.
Ejemplo 12 Unión de HuMabs antiTF al dominio extracelular de TF en ELISA La especificidad de los HuMabs antiTF obtenidos se evaluó por ELISA. Se revistieron placas de ELISA (Microlon; Greiner Bio-One) durante la noche a +4°C con 0.5 µ%/ta?, de TFECDHis en PBS, pH 7.4. Las placas de ELISA revestidas se varía con y bloquearon durante una hora a temperatura ambiente con suero de pollo al 2% (v/v) (Gibco, Paisley, Escocia) en PBS y se lavaron con PBS que contiene Tween 20 al 0.05% (PBST) . De manera subsiguiente, los HuMabs, diluidos en serie en PBSTC (PBS complementado con 2% (v/v) de suero de pollo y 0.05% (v/v) de Tween-20) , se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente bajo condiciones de agitación (300 rpm) . Los HuMabs unidos se detectaron usando anticuerpos de cabra antilgG de humano, conjugados con HRP (Jackson ImmunoResearch) diluidos 1:5,000 en PBSTC, que se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente bajo condiciones de agitación (300 rpm) . La reacción se reveló adicionalmente con ABTS (Roche Diagnostics) a temperatura ambiente en la oscuridad, se detuvo después de 15-30 minutos al adicionar 2% (p/v) de ácido oxálico y luego se midió la absorbancia a 405 nm. Se usó HuMab-KLH (un anticuerpo monoclonal humano contra KLH (hemocianina de lapa)), como un control negativo. Se usó antiTF humano de ratón (ERL) como control positivo (IgG antiratón marcado con HRP como conjugado) . Se analizaron las curvas de unión usando regresión no lineal (dosis-respuesta sigmoidal con pendiente variable) usando el software GraphPad Prism V .03.
Como se puede ver en la Figura 3 , todos los anticuerpos antiTF se unieron a TFECDHis . Los valores de EC50 para los HuMab fueron la media de 3 experimentos y variaron entre 0.13 y 0.17 nM (Tabl 2 posterior).
Tabla 2: Ejemplo 13 Unión de HuMab antiTF a TF unido a membrana Mediante análisis por FACS se determinó la unión de HuMabs antiTF a TF unido a membrana, usando células CHO transfectadas con TF, o las líneas de células tumorales MDA-MB-231, que expresan TF, A431 y Bx-PC3 (transfectadas con luciferasa) .
Las células se resuspendieron en PBS (2 x 106 células/mL) , se pusieron en placas de fondo V de 96 concavidades (50 µL/concavidad) . Se adicionaron 50 pL de HuMab diluido en serie en amortiguador FACS (PBS complementado con 0.1% de BSA y 0.02% de Na-azida) a las células y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Después del lavado tres veces con amortiguador de FACS, se adicionaron 50 L de IgGFc antihumano de cabra conjugado con ficoeritrina (PE) (Jackson ImmunoResearch) , diluido 1:100 en amortiguador de FACS. Después de 30 minutos en hielo (en la oscuridad), las células se lavaron tres veces, y se detectó la unión específica de los HuMabs por citometría de flujp en un FACSCalibur (BD Bipsciences) . Se usó HuMab-KLH como un control negativo. Como control positivo se usó antiTF de ratón seguido por IgGFc antiratón conjugado a AP. Se analizaron las curvas de unión usando regresión no lineal (dosis-respuesta sigmoidal con pendiente variable) usando software GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA) .
Las Figuras 4A-4C muestran un ejempolo de curvas de unión de HuMabs específicos de TF a células MDA-MB-231. La Tabla 3 da una vista general de los valores de ECS0 de la unión de HuMabs específicos de TF a células CHO transíectadas con TF (S1015-TF) , células MDA-MB-231, A431 y Bx-PC3.
Tabla 3. - Vista general de los valores de EC50 e intensidad de fluorescencia media, máxima (MFI máxima) determinados por análisis por FACS de unión de HuMabs específicos de TF a diferentes tipos de células.
Los valores de EC50 están en n . MFI máxima para células MDA-MB-231, BxPC3 y A431 a 30 g/mL de anticuerpo, para S1015-TF a 7.5 yg/mL de anticuerpo.
Ejemplo 14 Inhibición de la unión de FVIIa a TF Mediante análisis por FACS se midió la inhibición de FVIIa a TF, en células MDA-MB-231, por HuMab antiTF. Se lavaron células MDA-MB-231 en PBS para remover el suero y se colocaron en placas con 96 concavidades (100,000 células por concavidad) . Las células se incubaron HuMab antiTF en DMEM/0.1% de BSA durante 15 min, seguido por incubación con FVIIa 100 nM en DMEM/0.1% de BSA a 4°C durante 30 min. Las células se lavaron con PBS/0.1% de BSA/0.02% de azida sódica (amortiguador de FACS) y se incubaron con 10 pg/ml de antiFVIIa de. conejo (Abcam [ab7053] ) ) . Las células se lavaron con amortiguador de FACS y se incubaron con IgG anticonejo de cabra marcada con PE-diluida 1:10 (Jackson [111-116-144]). Las células se lavaron con amortiguador de FACS y se midió la intensidad de fluorescencia media (MFI) en un FACSCanto II (Becton Dickinson) .
La concentración de anticuerpo necesaria para obtener 50% de inhibición (IC50) se calculó usando GraphPad Prism (análisis por regresión no lineal) .
La Figura 5 y la Tabla 4 muestran que HuMab-TF-098 (IC50: 1.2 g/mL) , -114 (IC50 no se puede determinar) y -011 (IC50: 0.6 g/ml) inhibieron de manera efectiva la unión de FVIIa a células MDA-MB-231, en tanto que HuMab-TF-013 , -044 y -111 no inhiben (o a un menor grado) la unión de FVIIa.
Tabla 4 - Vista general de valores de IC50 de HuMab antiTFF para inhibir la unión FVIIa a) no se puede calcular Los datos mostrados son valores de IC50 (en g/ml) de HuMab antiTF para inhibir la unión de FVIIa 100 nM a TF en células MDA-MB-231, medido en un experimento representativo.
Ejemplo 15 Internalización mediada por anticuerpos y aniquilación celular por HuMab antiTF en un ensayo antikappa-ETA' Para determinar si los HuMab antiTF son adecuados para un planteamiento de conjugado de anticuerpo- fármaco, se uso ensayo de aniquilación a base de células, in vitro, genérico que usa exotoxina A de pseudomonas kappa-dirigido (antikappa-ETA' ) . En este ensayo, se uso un dominio de cadena ligera a kappa antihumano de alta afinidad conjugado a una forma truncada de la exotoxina A de pseudomonas. En la internalización, el conjugo de dominio antikappa-ETA' -anticuerpo se somete a proteólisis y reducción de enlaces de disulfuro, separando el dominio catalítico y la unión. El dominio catalítico se transporta desde el sistema Golgi al retículo endoplásmico mediante el motivo de retención KDEL, y se transcoloca subsiguientemente al citosol donde inhibe la síntesis de proteína e induce a apoptosis (Kreitman RJ. BioDrugs. 2009; 23(1):1-13. Recombinant Immunotoxins Containing Truncated Bacterial Toxins for the Treatment of Hematologic Malignancies) .
Se probó la internalización mediada por anticuerpo y la aniquilación celular para diferentes HuMab antiTF. Las tres líneas diferentes de células, con niveles comparables de expresión de TF, se probaron. Estas células también expresaron EGFR (a diferentes niveles) , permitiendo el uso de un anticuerpo de control positivo (2F8) , que se une a EGFR y se conoce que induce internalización de EGFR. El número de moléculas de TF y de EGFR expresadas en las líneas de células se determinó por equipo Qifi (Dako, Glostrup, Dinamarca) ; células A431: moléculas TF promedio por célula aproximadamente 500,000, moléculas EGFR promedio por célula aproximadamente 500,000; BxPC3 : moléculas TF promedio por células aproximadamente 500,000, moléculas EGFR promedio por célula aproximadamente 200,000; MDA-MB-231 : moléculas TF promedio por célula aproximadamente 500,000, moléculas EGFR promedio por célula aproximadamente 100,000. Las células se sembraron a una concentración óptima (A431: 2,500 células/concavidad; BxPC3 : 3,000 células/concavidad; MDA-MB-231: 5,000 células/concavidad) en medio de cultivo celular en placas de cultivo de tejido de 96 concavidades (Greiner Bio-One) y se dejaron adherir. Para identificar los HuMab antiTF que permitan la internalización de y la aniquilación por la toxina, se incubó durante 30 min una concentración fija (0.5 pg/mL [A431 y BxPC3] ; 0,25 pg/ml, [MDA-MB-231]) de antikappa-ETA' , que no induce muerte celular no específica en la ausencia de anticuerpo, con una cantidad titulada de HuMab antiTF antes de la adición a las células. Después de tres días, se cuantificó la cantidad de células viables con AlamarBlue (BioSource International, San Francisco, EUA) , de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se monitorizó la fluorescencia usando el lector EnVision 2101 Multilabel (PerkinElmer, Turku, Finlandia) con ajustes normales de alamarBlue. Se incluyó 2F8 con el antikappa-ETA' como un control positivo. Como control negativo se uso un anticuerpo de control de isotipo (IgGl-bl2) .
Las Figuras 6A-6C y la Tabla 5 muestran que todos excepto uno (HuMab-TF-087) de los HUMab antiTF pre- incubados con antikappa-ETA' fueron capaces de aniquilar las células A431, BxPC3 y MDA-MB-231 de una manera dependiente de la dosis. Los HuMab-TF-098 , -114 y -011, pre-incubados con antikappa-ETA' indujeron aniquilación más eficiente (EC50 entre 9 y 4 x 10"5 x 10"4 µg/ml en células A431) que HuMab-TF-013, -111 y -044 pre-incubados con anti kappa-ETA' (EC5o entre 2.0 x 10~2 y 9.8 x 10~2 pg/ml en células A431) . El HuMab-TF-087 pre-incubado con antikappa-ETA' no induce aniquilación celular .
Se muestra un experimento representativo para cada línea celular: A431(a), BxPC3 (b) y MDA-MB-231 (c) . LOS datos mostrados son las intensidades de fluorescencia media (MFI) ± SEM de las concavidades por triplicado de células tratadas con HuMab antiTF pre-incubados con antikappa-ETA' . La línea punteada superior indica la señal máxima obtenida en la ausencia de HuMab antiTF pre-incubados con antikappa-ETA' ; la línea punteada inferior indica la aniquilación máxima obtenida con estaurosporina.
Tabla 5 - Vista general es valores de EC50 y porcentajes de aniquilación celular inducida por HuMab antiTF pre- incubados con antikappa-ETA' a) No puede calcular.
Los datos mostrados son los valores de CE50 (en g/mL) y porcentajes máximos de aniquilación de las líneas celulares indicadas tratadas con HuMab antiTF pre- incubados con antikappa-ETA' , medido en un experimento representativo. El porcentaje de aniquilación celular (% de aniquilación) se calculó como sigue: (MFIno tratado " MFItratado con HuMab conjugado) / (MFIno tratado ~ MFItratado con estauroporina) Ejemplo 16 Preparación de ADC antiTF Se produjeron HuMab-011, HuMab-098 y HuMab 111 y IgGl-bl2 de control negativo de forma transiente en células HEK-293F (HuMab-011, HuMab-111 y lgGl-bl2) usando una línea de células CHO estables (HuMab-098) . Los anticuerpos se purificaron por cromatografí de proteína A de acuerdo a procedimientos normales, produciendo finalmente aproximadamente 400 mg de anticuerpo purificado. Entonces, los anticuerpos se conjugaron con vcMMAE y mcMMAF, respectivamente. Se conjugaron aproximadamente 200 mg de HuMab-011, HuMab-098 o HuMab-111 a ya sea vcMMAE o mcMMAF. El f rmaco-ligador vcMMAE o mcMMAF se alquiló a las cisteínas de los anticuerpos reducidos de acuerdo a procedimientos descritos en la literatura (Sun et al. (2005) Bioconjugate Chem. 16: 1282-1290; McDonagh et al., (2006) Protein Eng. Design Sel. 19: 299-307; Alley et al., (2008) Bioconjugate Chem. 19: 759-765) . La reacción se extinguió por la adición de un exceso de N-acetilcisteína. Se removió cualquier fármaco no conjugado residual por purificación y los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF finales se formularon en PBS. Los conjugados de fármaco y anticuerpo antiTF se analizaron subsiguientemente para la concentración (por absorbancia a 280 nm) , la relación de fármaco a anticuerpo (la "DAR, por sus siglas en inglés") por cromatografía de fase inversa (RP-HPLC) y cromatografía de interacción hidrófoba (HIC, por sus siglas en inglés) , la cantidad de fármaco no conjugado (por cromatografía de fase inversa) , el por ciento de agregación (por cromatografía de exclusión de tamaño, SEC-HPLC) y los niveles de endotoxina (por LAL) . Los resultados se muestran más adelante en la Tabla Tabla 6 - Vista general de diferentes características de los conjugados de anticuerpo- fármaco Ejemplo 17 Unión de los ADC antiTF a dominio extracelular recombinante de TF, determinada por ELISA Se midió la unión de los ADC antiTF a TF por ELISA (dominio extracelular recombinante revestido de TF) y se comparó con la unión de HuMab antiTF no conjugados. Se revistieron placas de ELISA (Greiner BioOne) O/N a 4°C con 1.25 pg/ml, 100 mi por concavidad, TFECDHis recombinante en PBS (B. Braun Melsungen AG) . Las placas de ELISA se lavaron tres veces con PBS que contiene Tween-20 al 0.05% (PBST) , se bloquearon con 200 µL/concavidad de PBST a temperatura ambiente durante 1 h en tanto que se agita (300 rpm) , se lava tres veces con PBST y se vacía. Subsiguientemente, se adicionan 100 L de ADC antiTF o HuMab antiTF no conjugados en diluciones en serie en PBST y se incubó en tanto que se agita a temperatura ambiente durante 90 min. Las placas ELISA se lavaron tres veces con PBST y se vaciaron. Se detectaron los ADC antiTF unidos y los HuMAb no conjugados al adicionar IgGl antihumano de ratón conjugada a HRP (100 L; 0.015 pg/mL; Sanquin; # M1328) en amortiguador de ensayo e se incubó en tanto que se agita a temperatura ambiente durante 1 h. Las placas se lavaron tres veces con PBST, se vaciaron y se incubaron con 100 L de solución de ABTS (amortiguador ABTS 50 mi [Roche] y en una tableta ABTS [50 mg; Roche] ) . Después de la incubación en oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min, la reacción se detuvo por incubación con 100 L por concavidad de ácido oxálico (2% [p/v] ; Riedel de Haen) en la oscuridad, durante 10 min. Las placas se midieron a OD 405 nm en un lector ELISA (Biotek Instruments, EL808 Absorbance Microplate Reader) . Como un control negativose uso IgGl-bl2, como un anticuerpo que se une a un antígeno no relacionado, pero no conjugado así como en formato ADC) .
Se analizaron las curvas de unión por regresión no lineal (dosis-respuesta sigmoidal con pendiente variable) usando software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA) .
Las Figuras. 7A-7B muestran curvas de unión, que demuestran que todos los HuMab antiTF y los ADC se unen dentro de un intervalo similar al dominio extracelular de TF en un ELISA (valores de CE50 entre 370 y 470 ng/ml) .
La Tabla 7 muestra valores de EC50 de los HuMab antiTF y de los ADCs la unión al dominio extracelular de TF. Los valores de EC50 están en ng/ml.
Tabla 7 - Vista general de los valores de ECS0 para la unión de HuMab específicos de TF y ADC al dominio extracelular de TF, determinado por ELISA.
Ejemplo 18 Internalización mediada por anticuerpo y aniquilación celular por ADC antiTF en un ensayo de aniquilación in vitro Para determinar la capacidad de los ADC antiTF para inducir citotoxicidad, se realizó un ensayo de aniquilación basado en células in vitro.
La aniquilación celular de tres líneas células se probó para diferentes ADC antiTF. Se obtuvieron células A431 de Deutsche Sammlung von Mikroorganimsmen und Zellkulturen GmbH (DSMZ: ACC 91), se obtuvieron células HPAF-II y NCI-H441 de la American Type Culture Collection (ATCC: CRL-1997 y HTB-174). Las células se sembraron a concentración óptima (A431: 2.5 X 103 células/concavidad; HPAF-II y NCI-H441: 5 x 103 células/concavidad) en medio de cultivo celular en placas de cultivo de tejido de 96 concavidades (Greiner Bio-One) y se dejaron adherir. Se adicionaron diluciones en serie de ADC antiTF y se incubaron a 37 °C durante 72 h (A431 y HPAF-II) o 96 h (NCI-H441) . La cantidad de células viables se cuantificó con AlamarBlue (BioSource International, San Francisco, EUA) , de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se monitorizó la fluorescencia usando el lector EnVision 2101 Multilabel 1 (PerkinElmer, Turku, Finlandia) con ajuste normales de alamarBlue. Se usaron ADC de IgGl-bl2 (un anticuerpo que se une a un antígeno no relacionado) como controles negativos. Se uso estaurosporina (Sigma, # S6942) para inducir aniquilación celular máxima.
Las líneas de células A431 y HPAF-II expresan ambas más de 200,000 moléculas de factor de tejido por célula y por lo tanto se pueden considerar como que expresan altos niveles de factor de te ido.
Las células NCI-H441 expresan aproximadamente 80,000 moléculas de factor de tejido por célula y por lo tanto se pueden considerar como que expresan niveles intermedios de factor de tejido.
Las Figuras 8A-8C y la Tabla 8 muestran que todos los ADC antiTF fueron capaces de aniquilar las células A431, HPAF-II y NCI-H441 de una manera dependiente de la dosis. Los HuMab-TF-098 y -011 indujeron ligeramente aniquilación más eficiente (IC50 entre 9 y 22 ng/mL en células A431, entre 1 y 5 ng/mL en células HPAF-II y entre 1 y 10 ng/mL en células NCI-H441) que HuMab-TF- 111 (ICS0 entre 46 y 83 ng/mL en células A431, entre 4 y 15 ng/mL en células HPAF-II y 416 ng/ml en células NCI-H441) . Un experimento representativo se muestra para cada línea celular: A431(8A) y HPAF-II(8B). Los datos mostrados son porcentajes de supervivencia ± S.E.M. de concavidades duplicadas de células tratadas con ADC antiTF. Tabla 8 - Vista general de valores de ICSo y porcentajes de aniquilación celular inducida por ADC antiTF a) No se puede calcular.
Los datos mostrados son valores de IC50 (en ng/ml) y porcentajes máximos de aniquilación (a una concentración de 10 mg/ml) de las líneas celulares indicadas tratadas con ADC antiTF, medido en un experimento representativo. El porcentaje de aniquilación celular ( de aniquilación) se calculó como sigue: (MFIno tratado " Maltratado COn ADC antiTF) / (MFIno tratado "~ MFItratado con eatauroporina) x 10Oí Ejemplo 19 Tratamiento terapéutico de xenoinjertos tumorales A431 y HPAF-II en ratones SCID con ADC antiTF La eficacia in vivo de los ADC antiTF se determinó en tumores de xenoinjertos A431 y HPAF-II establecidos subcutáneamente (SC) en ratones SCID. Se inyectaron 5 x 106 células tumorales A431 (obtenidas de DSMZ) o 2 x 106 células tumorales HPAF-II (obtenidas de ATCC) en 200 pL de PBS s.c. en el flanco derecho de ratones SCID hembras, seguido por cuatro inyecciones con ADC antiTF o controles (IgGl-bl2; ambos ADC y no conjugados) , iniciando cuando los tamaños de tumor fueron aproximadamente 200-250 mm3 para los xenoinjertos A431: día 11, día 14, día 18 y día 21 o aproximadamente 100-150 mm3 para xenoinjertos HPAF-II: días 13, 16, 20 y 23 (60 g/ratón en 100 L, intraperitonealmente (IP) ) . El volumen tumoral se determinó al menos dos veces por semana. Se calcularon los volúmenes tumorales (mm3) por mediciones de calibrador (Plexx) como: 0.52 x (longitud) x (ancho) 2.
Las Figuras 9A-9B muestran que todos los ADC antiTF fueron efectivos en inhibir el crecimiento tumoral de tumores A431(9A) y HPAF-II (9B) establecidos s.c.. Los datos mostrados son los volúmenes tumorales medios ± S.E.M. por grupo (n = 7 ratones por grupo) . En el modelo de HPAF-II, los conjugados vcMMAE fueron significativamente más eficientes en inhibir el crecimiento tumoral que los conjugados mcMMAF.
Ejemplo 20 Estabilidad de los ADC de clon guia antiTF y de los ADC de IgGl-bl2 Se probó la estabilidad de los materiales conjugados con MMAE y MMAF en almacenamiento durante 10 días, 1, 2 y 3 meses a < -65°C y 5°C. En este ejemplo se muestran solo los datos de tres meses, puesto que se obtuvieron resultados similares para todos los puntos de tiempo intermedios. Adicionalmente , la estabilidad de los materiales se probó en ciclos repetidos de congelación-descongelación. totes de ADC preparados (cuatro lotes de IgG cada uno conjugado con dos diferentes ligadores, Tabla 6 se congelaron de forma intensa. Para la prueba de estabilidad, los lotes se descongelaron y diluyeron a 1 mg/ml en PBS . El material diluido se tomó en alícuotas en porciones de 300 L en criofrascos y los frascos se colocaron a < -65°C o 5°C para almacenamiento a temperatura. Para la congelación-descongelación, tres frascos de cada lote se congelaron a < -65 °C, O/N, y luego se descongelaron sin ayuda a temperatura ambiente. El ciclo de congelación-descongelación se repitió otras dos veces (las muestras se congelaron-descongelaron tres veces en total) . Todos los materiales se analizaron al inicio del estudio (t = 0) por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) , cromatografía de exclusión de tamaño de alto desempeño (HP-SEC) y unión a factor de tejido (TFECDHis) en un ELISA de unión. Se realizaron los mismos análisis para las muestras almacenadas durante tres meses (t = 3 meses) a < -65 °C y 5°C y para las muestras congeladas-descongeladas .
Se realizó el SDS-PAG bajo condiciones reductoras y no reductoras en geles de Bis-Tris NuPAGE al 4-12% (Invitrogen, Breda, Los Países Bajos) usando un método modificado de Laemli (Laemli 1970 Nature 227 (5259) : 680-5) , donde las muestras se corren a pH neutral. Los geles de SDS-PAGE se tiñeron con Coomassie y se formaron digitalmente en imagen usando un sistema de formación de imágenes Optigo (Isogen Life Science) .
Se realizó la HP-SEC usando una unidad de separación Waters Alliance 2695 o 2795 (Waters, Etten-Leur, Los Países Bajos) conectada a una columna TSK HP-SEC (G3000SWxl; Tosoh Bioscience, via Omnilabo, Breda, Los Países Bajos) y un detector de absorbancia ? Waters 2487 (Waters) . Las muestras se corrieron a 1 ml/min. Los resultados se procesaron usando software Empower versión 2, y se expresaron por pico como porcentaje de altura total de pico.
La unión a proteína recombinante del dominio extracelular de TF se analizó por ELISA, como se describe supra en el ejemplo 17.
Las Figuras 10A-10D muestran los análisis por SDS-PAGE de los clones guía antiTF conjugados y conjugados e IgGl-bl2 al inicio del estudio de estabilidad (t = 0) . En SDS-PAGE no reductor (10A-10B) , La IgGl no conjugada migró como una banda intacta de IgG de aproximadamente 150 kDa. Como se espera, los ADC se disociaron en su mayor parte en fragmentos de IgG de menores tamaños (125 kDa = HHL, 99 kDa = HH, 67 kDa =HL, 51 kDa = H y 25 kDa=L) , debido a las condiciones de SDS-PAGE de desnaturalización y la naturaleza no covalente de las moléculas de ADC (enlaces de disulfuro interrumpidos) (figuras 10A, 10B) . El análisis por SDS-PAGE reducido (figuras 10C, 10D) mostró bandas de cadena ligera no conjugada (LO) y cadena ligera con un fármaco (MMAE o MMAF) unido (Ll) . Se observó resolución parcial para la cadena pesada no conjugada (HO) y las formas conjugadas a MMAE (Hl, H2 y H3) . Las formas de cadena pesada conjugadas y no conjugadas a MMAF no se pueden resolver bien sino que aparecieron como una banda difusa a 50 kDa.
Los resultados de SDS-PAGE para las muestras después de tres meses de almacenamiento a ambas temperaturas (< -65 °C y 5°C) fueron comparables a los datos de t = 0, como se muestran en las figuras 10E-10F. También para las muestras congeladas-descongeladas , no se observaron diferencias en comparación al material de inicio por el análisis de SDS-PAGE (datos no mostrados) .
Las Figuras 11A-11H muestra los revestimiento del perfil de HP-SEC para los lotes de ADC a t = 0 y t = 3 meses a ambas temperaturas. Bajo condiciones nativas de HP-SEC, el material de ADC (t = 0) eluyó como un pico de moléculas monoméricas de IgG con cantidades menores de moléculas de IgG diméricas. No se observaron cambios para MMAE y MMAF conjugado a MMAE- y MMAF (???,???) y HuMab-TF-098 y HuMab-TF098 (???,???) HuMab-TF-011 (11C,11D) en el almacenamiento a tres meses. Sin embargo, el material de ADC de HuMab-TF-111 (11E,11F) e IgGl-bl2 (11G,11H) mostró una disminución en la recuperación (altura pico) a t = 3 meses. Esta menor recuperación se observó ya en las muestras t = 10 días y permaneció constante después de almacenamiento prolongado hasta tres meses.
El porcentaje de moléculas IgG monoméricas (% de monómero) se calculó del perfil pico de HP-SEC y los datos se resumen en la Tabla 9. Para comparación, el % de monómerode material no conjugado se muestra. Los datos muestran que > 95% del material de ADC consistió de moléculas de IgG monoméricas intactas. El % de monómero permaneció sin cambio después de tres de meses de almacenamiento < -65°C y 5°C, indicado que no se formaron en el tiempo agregados.
El análisis de HP-SEC de las muestras congeladas/ descongeladas mostró que la recuperación pico de IgG de todas las muestras fue similar a las recuperaciones a t = 0 (datos no mostrados) . Sin embargo, la congelación-descongelación de material de HuMab-TF-ADC dio por resultado un % ligeramente menor de monómero (1.5-3.6%), como se muestra en la rabia 9. Esto fue debido a la formación de cantidades menores de agregados moléculas de IgG diméricas (como se juzga por HP-SEC, datos no mostrados) .
La unión de HuMab-TF- 098 , -011 y -111 conjugados y no conjugados a proteína recombinante de dominio extracelular de TF (TFECDHis) se probó por ELISA. Después de tres meses de almacenamiento a < -65°C y 5°C, la capacidad de unión no cambió en comparación con aquella a t = 0, como se muestra en la Figura 12. Se obtuvieron resultados similares para las muestras congeladas-descongeladas (datos no mostrados) .
Los experimentos de estabilidad mostraron que el material de ADC, a 1 mg/ml, fue estable a < -65°C y a 5°C durante al menos tres meses, como se determina por SDS-PAGE, HP-SEC y unión a TFECDHis. Se indujo formación menor de agregados por congelación-descongelación repetida del material .
Tabla 9: Análisis por HP-SEC de muestras de ADC.
Los datos mostrados son porcentajes de moléculas monoméricas Ejemplo 21 Dosis-respuesta de los ADC antiTF en tratamiento terapéutico de xenoinjertos tumorales HPAF-II en ratones SCID La eficacia in vivo de los ADC antiTF se analizó adicionalmente por tratamiento de tumores de xenoinjertos SC HPAF-II establecidos subcutáneamente en ratones SCID con diferentes dosis de ADC antiTF. Los xenoinjertos tumorales HPAF-II se establecieron como se describe supra, seguido por cuatro inyecciones con ADC vcMMAE antiTF en dos dosis diferentes (6 y 20 g/ratón [se adicionó IgGl-bl2 a una dosis final de 60 mg de IgGl por ratón] en 100 µL, IP) o mAb no conjugado de control (IgGl-bl2; 60 µg/ratón en 100 xl>, IP) , iniciando cuando los tamaños tumorales fueron aproximadamente 100-150 mm3 : días 10, 13, 17 y 21. Se determinó el volumen tumoral al menos dos veces por semana. Se calcularon los volúmenes tumorales (mm3) de mediciones con calibrador (PLEXX) como: 0.52 x (longitud) x (ancho) 2.
La Figura 13 muestra que las dosis de 20 g de los tres conjugados vcMMAE fueron efectivas en inhibir el crecimiento tumoral de tumores HPAF-II establecidos subcutáneamente. La dosis de 6 g de los tres conjugados vcMMAE fue capaz de retrasar ligeramente, pero no de inhibir el crecimiento tumoral.
Equivalentes Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando no más que experimentación de rutina, muchos equivalentes de las modalidades específicas de la invención descrita en la presente. Se propone que estos equivalentes se abarquen por las siguientes reivindicaciones. También se contempla que cualquier combinación de las modalidades descritas en las reivindicaciones dependientes estén dentro del alcance de la invención.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (26)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un conjugado de fármaco y anticuerpo que comprende un anticuerpo que se une a factor de tejido caracterizado porque comprende (i) una región VH que comprende una región CDRl que' tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 6, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 7, y una región CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8, y una región VL que comprende una región CDRl que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 46, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 47, y un región CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 48, (ii) una región VH que comprende una región CDRl que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 34, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 35, y una región CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 36, y una región VL que comprende una región CDRl que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 74, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 75, y un región CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 76, o (iii) una región VH que comprende una región CDRl que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 38, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 39, y una región CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 40, y una región VL que comprende una región CDRl que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 78, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 79, y un región CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 80, o (iv) una región VH que comprende una región CDRl que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 2, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 3, y una región CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 4, y una región VL que comprende una región CDRl que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 42, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 43, y un región CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 44, o (v) una variante de cualquiera de estos anticuerpos, en donde la variante tiene, de manera preferente a lo mucho 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácido, de manera más preferente sustituciones de aminoácido, tal como sustituciones conservadoras de aminoácido en estas secuencias, en donde el anticuerpo se ha conjugado a una auristatina o un análogo o derivado peptidico funcional de la misma mediante un ligador.
2. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende (i) una región VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una región VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, o (ii) una región VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y una región VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, o (iii) una región VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 y una región VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, o (iv) una región VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.
3. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.
4. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo tipo IgGl monoclonal completamente humano, tal como una IgGl,K.
5. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la auristatina es monometil-auristatina E (MMAE) : en donde la línea ondeada indica el sitio de unión para el ligador .
6. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la auristatina es monometil-auristatina F (MMAF) : en donde la línea ondeada indica el sitio de unión para el ligador.
7. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ligador se une a residuos de sulfhidrilo del anticuerpo antiTF obtenido por reducción (parcial) del anticuerpo antiTF.
8. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o 7, caracterizado porque el ligador-auristatina es vcMMAF o vcMMAE : Ab Ab-MC-ve-PAB-M AE (vcMMAE) en donde p denota un número de 1 a 8 , S representa un residuo de sulfhidrilo del anticuerpo antiTF, y Ab designa el anticuerpo antiTF.
9. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el ligador-auristatina es vcMMAE como de conformidad con la reivindicación 8.
10. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 6-7, caracterizado porque el ligador-conjugado es mcMMAF: Ab-MC-MMAF (mcMMAF) en donde p denota un número de 1 a 8, S representa un residuo de sulfhidrilo del anticuerpo antiTF, y Ab designa el anticuerpo antiTF.
11. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, y un portador farmacéuticamente aceptable.
12. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para usarse como un medicamento.
13. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para usarse en el tratamiento de cáncer.
14. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de tumores del sistema nervioso central, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, tal como NSCLC, cáncer de mama, específicamente cáncer de mama trinegativo, cáncer esofágico, cáncer gástrico o de estómago, cáncer de hígado y biliar, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer de riñon, cáncer de próstata, cáncer endometrial , cáncer ovárico, melanoma maligno, sarcoma, tumores de origen primario desconocido, cáncer de médula ósea, leucemia linfoblástica aguda, AML, leucemia linfoblástica crónica y linfoma no de Hodgkin, cáncer de piel, glioma, cáncer del cerebro, útero, y recto.
15. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 , para usarse en el tratamiento de cáncer pancreático.
16. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13, para usarse en el tratamiento del cáncer colorrectal .
17. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13, para usarse en el tratamiento de cáncer ovárico.
18. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13, para usarse en el tratamiento de cáncer de mama.
19. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13, para usarse en el tratamiento del cáncer de próstata.
20. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 , para usarse en el tratamiento de cáncer de vejiga.
21. El conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porgue el tratamiento es para el cáncer en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, tal como un agente quimioterapéutico .
22. Uso del conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
23. El uso de conformidad con la reivindicación 21, que comprende las características adicionales de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-20.
24. Un método para inducir muerte celular, o inhibir crecimiento y/o proliferación de una célula tumoral que expresa factor de tejido, caracterizado porque comprende la administración a un individuo en necesidad del mismo de una cantidad efectiva del conjugado de fármaco y anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
25. Un método de tratamiento de conformidad con cualquiera de las enfermedades de las reivindicaciones 14-20, caracterizado porque es por administración a un individuo en necesidad del mismo, de una cantidad efectiva del conjugado de fármaco y anticuerpo de cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 1-10.
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el conjugado de fármaco y anticuerpo se administra en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, tal como un agente quimioterapéutico.
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