EA034675B1 - Конъюгат для индуцирования клеточной гибели, ингибирования роста и пролиферации раковых клеток, экспрессирующих тканевой фактор, и его применение - Google Patents

Конъюгат для индуцирования клеточной гибели, ингибирования роста и пролиферации раковых клеток, экспрессирующих тканевой фактор, и его применение Download PDF

Info

Publication number
EA034675B1
EA034675B1 EA201300016A EA201300016A EA034675B1 EA 034675 B1 EA034675 B1 EA 034675B1 EA 201300016 A EA201300016 A EA 201300016A EA 201300016 A EA201300016 A EA 201300016A EA 034675 B1 EA034675 B1 EA 034675B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
seq
cancer
amino acid
region
Prior art date
Application number
EA201300016A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201300016A1 (ru
Inventor
Давид Сатейн
Сандра Верплуген
Вим Блекер
Стен Лисбю
Ян ван де Винкел
Патрик ван Беркел
Пауль Паррен
Original Assignee
Генмаб А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Генмаб А/С filed Critical Генмаб А/С
Publication of EA201300016A1 publication Critical patent/EA201300016A1/ru
Publication of EA034675B1 publication Critical patent/EA034675B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение направлено на конъюгат для индуцирования клеточной гибели или ингибирования роста и/или пролиферации раковых клеток, включающий антитело, связывающееся с тканевым фактором, и ауристатин, конъюгированный с антителом через линкер, и применение предложенного конъюгата для лечения рака.

Description

Изобретение касается конъюгатов антитело-препарат (ADCs), причем антитела связываются с эпитопом на тканевом факторе. Такие ADCs, в частности, применимы при лечении раковых, воспалительных и сосудистых заболеваний.
Уровень техники
Тканевой фактор (TF), также называемый тромбопластином, фактором III или CD142, представляет собой белок, который присутствует в субэндотелиальной ткани, тромбоцитах и лейкоцитах и необходим для запуска образования тромбина из зимогена -протромбина. Образование тромбина в конечном счете приводит к свертыванию крови. Тканевой фактор способствует клеткам в запуске каскада свертывания крови, при этом он действует как рецептор с высоким сродством для фактора свертывания крови VII (FVII), сериновой протеазы. Образующийся комплекс обеспечивает каталитическое событие, которое отвечает за запуск протеазного каскада свертывания крови посредством специфического ограниченного протеолиза. В отличие от других кофакторов этого протеазного каскада, которые циркулируют в виде нефункциональных предшественников, этот фактор является сильным инициатором, который полностью функционален при экспрессировании на поверхности клеток.
Тканевой фактор является рецептором на поверхности клеток для сериновой протеазы - фактора VIIa (FVIIa). Связывание FVIIa с тканевым фактором запускает сигнальные процессы внутри клетки, причем такая сигнальная функция играет роль в ангиогенезе. В то время как ангиогенез является нормальным процессом при росте и развитии, а также при заживлении ран, он также является важным шагом при переходе опухолей из состояния покоя в злокачественное состояние: когда раковые клетки обретают способность вырабатывать белки, участвующие в ангиогенезе, так называемые ангиогенные факторы роста, эти белки выделяются из опухоли в окружающие ткани и стимулируют разрастание новых кровеносных сосудов из существующих здоровых кровеносных сосудов по направлению и внутри опухоли. Как только новые кровеносные сосуды проникают в опухоль, она может быстро увеличиться в размере и вторгаться в местные ткани и органы. Через новые кровеносные сосуды раковые клетки также могут проникать в кровоток и обосновываться в других органах, образуя новые опухоли (метастазы).
Кроме того, TF играет роль в воспалении. Предполагается, что роль TF опосредуется свертыванием крови (A.J. Chu: Tissue factor mediates inflammation in Archives of biochemistry and biophysics, 2005, vol. 440, No. 2, pp. 123-132). Соответственно, ингибирование TF, например, моноклональным антителом против TF, имеет значение в прерывании цикла свертывание крови-воспаление и способствует не только противовоспалительному действию, но и при сосудистых заболеваниях.
Экспрессия TF наблюдается при многих типах рака и связана с более агрессивным течением заболевания. Кроме того, TF человека также существует в виде растворимой альтернативной сплайс-формы asHTF. Недавно было обнаружено, что asHTF способствует росту опухолей (Hobbs et al, 2007 Thrombosis Res. 120(2) S13-S21).
Несмотря на то, что достигнут значительный прогресс, остается потребность в улучшенных способах лечения серьезных заболеваний, например, улучшенном лечении рака, воспалительных и сосудистых заболеваний на основе терапевтических антител.
Соответственно, целью настоящего изобретения является получение высокоспецифичных и эффективных конъюгатов антител против TF с препаратами, в частности, для применения при лечении рака.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение касается новых конъюгатов антител против TF с лекарственными препаратами, которые применимы для лечения рака, воспалительных и сосудистых заболеваний. Конъюгаты препарат-антитело против TF настоящего изобретения очень эффективно уничтожают клетки, экспрессирующие тканевой фактор (TF). Кроме того, конъюгаты препарат-антитело против TF обладают тем преимуществом, что они почти или совсем не ингибируют свертывание крови.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Совмещение последовательностей антител настоящего изобретения. SEQ ID NOs приведены в скобках справа от последовательности. Участки CDR1, CDR2 и CDR3 согласно Kabat обозначены следующим образом: последовательности, выделенные жирным курсивом, представляют участки CDR1; подчеркнутые последовательности представляют участки CDR2; последовательности, выделенные жирным шрифтом, представляют участки CDR3.
Фиг. 2. Последовательности IgG4 (SEQ ID NO: 81-82). SEQ ID NO: 81: аминокислотная последовательность области CH дикого типа IgG4 человека. Последовательности, выделенные курсивом, представляют участки CH1, подсвеченные последовательности представляют шарнирные участки, обычные последовательности представляют участки CH2 и подчеркнутые последовательности представляют участки CH3. SEQ ID NO: 82: аминокислотная последовательность безшарнирной области CH IgG4 человека
Фиг. 3. Связывание HuMabs против TF с внеклеточным доменом TF. Связывание определяли методом ELISA. Значения EC50 представляют средние из 3 экспериментов.
Фиг. 4. Связывание HuMabs против TF с мембраносвязанным TF на клетках MDA-MD-231. Связывание определяли методом FACS и антитела разделяли на три группы, представленные в а), b) и с), см. также WO 10/066803, где антитела разделяли на перекрестные группы.
Фиг. 5. Ингибирование связывания FVIIa антителами HuMabs против TF измеряли методом FACS.
- 1 034675
Данные представлены в виде средней интенсивности флуоресценции (MFI) для связывания FVIIa в присутствии возрастающих концентраций HuMabs против TF. MFI для 100 нМ FVIIa в отсутствие HuMabs против TF составила 149,942. Представлен один репрезентативный эксперимент.
Фиг. 6. Дозозависимая индукция гибели клеток конъюгированными с анти-каппа-ЕТА' антителами
HuMabs против TF.
Фиг. 7. Связывание HuMabs против TF и ADCs с рекомбинантным белком внеклеточного домена TF при определении методом ELISA. Представлен один репрезентативный эксперимент.
Фиг. 8. Дозозависимая индукция гибели клеток in vitro конъюгатами ADCs против TF. Представлен один репрезентативный эксперимент для каждой линии клеток: А431 (а), HPAF-II (b) и NCI-H441 (с). Данные представлены в виде процента выживания ± S.E.M. из двойных лунок с клетками, обработанными ADCs против TF.
Фиг. 9. Эффективность ADCs против TF in vitro при терапевтическом лечении ксенотрансплантатов А431 и HPAF-II у мышей SCID. Мышей с привитыми опухолями А431 (А) или HPAF-II (В) обрабатывали ADCs против TF. Данные представлены в виде среднего объема опухолей ± S.E.M. на группу (n = 7 мышей в группе).
Фиг. 10. Анализ ADCs и неконъюгированных IgG1 методом SDS-PAGE при тестировании на стабильность. Образцы анализировали методом SDS-PAGE в начале исследования (t=0) (a-d) или после хранения при 5°С и < -65°С в течение трех месяцев (е-h). (а, с) Дорожки 1, 9: маркеры молекулярного веса (MW), дорожка 2: внутренний контроль на IgG1, дорожка 3: HuMab-TF-098, дорожка 4: HuMab-TF-098vcMMAE, дорожка 5: HuMab-TF-098-mcMMAF, дорожка 6: HuMab-TF-011, дорожка 7: HuMab-TF-011vcMMAE, дорожка 8: HuMab-TF-mcMMAF. (b, d) Дорожки 1, 9, 10: маркеры MW, дорожка 2: внутренний контроль на IgG1, дорожка 3: HuMab-TF-111, дорожка 4: HuMab-TF-111-vcMMAE, дорожка 5: HuMab-TF-111-mcMMAF, дорожка 6: IgG1-b12, дорожка 7: IgG1-b12-vcMMAE, дорожка 8: IgG1-b12mcMMAF. (е, g) Дорожки 1, 11: маркеры MW, дорожка 2: внутренний контроль на IgG1, дорожка 3: HuMab-TF-098-vcMMAE через 3 месяца при < -65°С, дорожка 4: HuMab-TF-098-vcMMAE через 3 месяца при 5°С, дорожка 5: HuMab-TF-098-mcMMAF через 3 месяца при < -65°С, дорожка 6: HuMab-TF-098mcMMAF через 3 месяца при 5°С, дорожка 7: HuMab-TF-011-vcMMAE через 3 месяца при < -65°С, дорожка 8: HuMab-TF-011-vcMMAE через 3 месяца при 5°С, дорожка 9: HuMab-TF-011-mcMMAF через 3 месяца при < -65°С, дорожка 10: HuMab-TF-011-mcMMAF через 3 месяца при 5°С. (f, h) Дорожки 1, 11, 12: маркеры MW, дорожка 2: внутренний контроль на IgG1, дорожка 3: HuMab-TF-111-vcMMAE через 3 месяца при < -65°С, дорожка 4: HuMab-TF-111-vcMMAE через 3 месяца при 5°С, дорожка 5: HuMab-TF111-mcMMAF через 3 месяца при < -65°С, дорожка 6: HuMab-TF-111-mcMMAF через 3 месяца при 5°С, дорожка 7: IgG1-b12-vcMMAE через 3 месяца при < -65°С, дорожка 8: IgG1-b12-vcMMAE через 3 месяца при 5°С, дорожка 9: IgG1-b12-mcMMAF через 3 месяца при < -65°С, дорожка 10: IgG1-b12-mcMMAF через 3 месяца при 5°С. Для невосстановительных условий указаны размеры различных комбинаций тяжелой цепи (Н) - легкой цепи (L): 148 кД (HHLL), 125 кД (HHL), 99 кД (НН), 67 кД (HL), 51кД (Н) и 25 кД (L).
Фиг. 11. Высокоэффективная эксклюзионная хроматография (HP-SEC): профили HuMab-TF-098vcMMAE (a), HuMab-TF-098-mcMMAF (b), HuMab-TF-011-vcMMAE (с), HuMab-TF-011-mcMMAF (d), HuMab-TF-111-vcMMAE (e), HuMab-TF-111-mcMMAF (f), IgG1-b12-vcMMAE (g) и IgG1-b12-mcMMAF (h) в начале исследования и после хранения при < -65°С или 5°С в течение трех месяцев.
Фиг. 12. Анализ связывания ADCs и неконъюгированного IgG1 с TF-ECDHis для теста на стабильность. Образцы подвергали анализу на связывание в начале исследования (t=0) и после хранения при = 5°С и < -65°С в течение трех месяцев.
Фиг. 13. Зависимость доза-эффект ADCs против TF in vivo при терапевтической обработке ксенотрансплантатов HPAF-II у мышей SCID. Мышей с привитыми опухолями HPAF-II обрабатывали ADCs против TF с vcMMAE. Данные представлены в виде среднего объема опухолей ± S.E.M. на группу (n = 8 мышей в группе).
Раскрытие сущности изобретения
Определения
Термины тканевой фактор, TF, CD142, антиген тканевого фактора, антиген TF и антиген CD142 используются здесь взаимозаменяемо и, если не указано иначе, охватывают любые варианты, изоформы и видовые гомологи тканевого фактора человека, которые в природе экспрессируются клетками или экспрессированы на клетках, трансфецированных геном тканевого фактора. Тканевой фактор может представлять собой последовательность с номером доступа NP 001984 в Genbank, которая использовалась в примере 1.
Термин иммуноглобулин относится к классу структурно родственных гликопротеидов, состоящих из двух пар полипептидных цепей - одной пары легких (L) низкомолекулярных цепей и одной пары тяжелых (Н) цепей, причем все четыре цепи связаны между собой дисульфидными связями. Структура иммуноглобулинов хорошо изучена. Например, см. Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Вкратце, каждая тяжелая цепь обычно состоит из вариабельной области тяже- 2 034675 лой цепи (сокращенно Vh) и константной области тяжелой цепи (CH). Константная область тяжелой цепи обычно состоит из трех доменов: CH1, CH2, и CH3. Каждая легкая цепь обычно состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно Vl) и константой области легкой цепи (Cl). Константная область легкой цепи обычно состоит из одного домена CL. Области Vh и Vl дополнительно подразделяются на участки гипервариабельности (или гипервариабельные участки, которые могут быть гипервариабельными по последовательности и/или образовывать петли определенной структуры), которые также именуются определяющими комплементарность участками (CDRs), вперемежку с более консервативными участками, которые именуются каркасными участками (FRs). Каждый Vh и Vl обычно состоит из трех CDRs и четырех FRs, расположенных в следующем порядке от N-конца к С-концу: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (см. также Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)). Обычно нумерация аминокислотных остатков в этих участках осуществляется согласно методу, описанному в Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) (такие выражения, как нумерация остатков вариабельного домена по Кабату или согласно Кабату относятся к этой системе нумерации для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи). По этой системе нумерации фактическая линейная аминокислотная последовательность пептида может содержать меньше или больше аминокислот в соответствии с укорочением или вставками в участки FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать вставку одной аминокислоты (остатка 52а по Кабату) после остатка 52 в CDR2 Vh и вставку нескольких остатков (например, остатков 82a, 82b, 82с и т.д. согласно Кабату) после остатка 82 в FR тяжелой цепи. Нумерацию остатков по Кабату для данного антитела можно определить путем совмещения гомологичных участков последовательности антитела со стандартной последовательностью, пронумерованной по Кабату.
Термин антитело (Ab) в контексте настоящего изобретения относится к молекуле иммуноглобулина, фрагменту молекулы иммуноглобулина или производному того или другого, которые обладают способностью к специфическому связыванию с антигеном при обычных физиологических условиях с весьма значительным временем полужизни, как-то по меньшей мере 30 мин, по меньшей мере 45 мин, по меньшей мере 1 ч, по меньшей мере 2 ч, по меньшей мере 4 ч, по меньшей мере 8 ч, по меньшей мере 12 ч, примерно 24 ч или больше, 48 ч или больше, 3, 4, 5, 6, 7 или больше дней и т.д., или любым другим соответствующим функционально-определенным временем (как-то временем, достаточным для индукции, запуска, усиления и/или модуляции физиологического ответа, связанного со связыванием антитела с антигеном, и/или временем, достаточным для запуска антителом эффекторной активности). Вариабельные участки тяжелых и легких цепей молекулы иммуноглобулина содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные участки антител (Abs) могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (как-то эффекторные клетки) и компоненты системы комплемента типа C1q - первого компонента классического пути активации комплемента. Как указано выше, термин антитело, если не указано иначе или прямо не противоречит контексту, включает фрагменты антитела, сохраняющие способность к специфическому связыванию с антигеном. Было показано, что функция связывания с антигеном у антител может выполняться фрагме, включают (i) фрагменты Fab' или Fab -моновалентные фрагменты, состоящие из доменов Vl, Vh, Cl и Ch1, или моновалентные антитела, описанные в WO2007059782 (Genmab A/S); (ii) фрагменты F(ab')2 - бивалентные фрагменты, содержащие два Fab-фрагмента, соединенные дисульфидным мостиком в шарнирном участке; (iii) фрагменты Fd, состоящие в основном из доменов Vh и Ch1; (iv) фрагменты Fv, состоящие в основном из доменов Vl и Vh одного плеча антитела, (v) фрагменты dAb (Ward et al, Nature 341, 544-546 (1989)), которые состоят в основном из домена Vh и также именуются доменными антителами (Holt et al., Trends Biotechnol. 2003, 21(11):484-90); (vi) камелиды или нанотела (Revets et al., Expert Opin Biol Ther. 2005, 5(1): 111-24) и (vii) выделенные участки, определяющие комплементарность (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, Vl и Vh, кодируются отдельными генами, при помощи рекомбинантных методов они могут быть соединены синтетическим линкером, что позволяет получать их в виде единой белковой цепи, в которой участки Vl и Vh сливаются, образуя моновалентные молекулы (известные как одноцепочечные антитела или одноцепочечные Fv (scFv), например, см. Bird et al, Science 242, 423-26 (1988) и Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Такие одноцепочечные антитела охватываются термином антитело, если не указано иначе или из контекста не следует иное. Хотя такие фрагменты, как правило, входят в значение антитела, они все вместе и каждый по отдельности составляют уникальные особенности настоящего изобретения, проявляя различные биологические свойства и полезность. Эти и другие полезные фрагменты антител в контексте настоящего изобретения обсуждаются здесь в дальнейшем. Также следует иметь в виду, что термин антитело, если не указано иначе, также включает и поликлональные антитела, моноклональные антитела (mAbs), антителоподобные полипептиды, как-то химерные антитела и гуманизированные антитела, и фрагменты антител, сохраняющие способность к специфическому связыванию с антигеном (антигенсвязывающие фрагменты), полученными любыми известными методами, такими как энзиматическое расщепление, синтез пептидов и рекомбинантные методы. Полученные антитела могут относиться к любому изотипу.
В контексте настоящего изобретения термин ADC относится к конъюгатам антитело-препарат,
- 3 034675 которые в настоящем изобретении представляют собой антитела против TF, соединенные с другой молекулой, как описано в настоящей заявке.
Антитело против TF означает антитело, как описано выше, которое связывается специфически с антигеном - тканевым фактором или антигеном тканевого фактора.
Термин человеческое антитело в настоящем изобретении охватывает антитела с вариабельными и константыми областями, происходящими из гаметных последовательностей иммуноглобулина человека. Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не представленные в гаметных последовательностях иммуноглобулина человека (например, мутации, введенные методом случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или при соматических мутациях in vivo). Однако термин человеческое антитело в настоящем изобретении не должен включать антитела, у которых в каркасные последовательности человека были вставлены гаметные последовательности CDR, полученные из других видов млекопитающих, как-то мыши.
В предпочтительном воплощении антитела из конъюгата антитело-препарат или конъюгаты антитело-препарат по изобретению являются выделенными. Выделенное антитело или выделенный конъюгат антитело-препарат в настоящем изобретении означает такие антитела или конъюгаты антителопрепарат, которые практически свободны от других антител с другой антигенной специфичностью (например, выделенные антитела, которые специфически связываются с тканевым фактором, практически свободны от других антител, специфически связывающихся с другими антигенами, чем тканевой фактор). Выделенный конъюгат антитело-препарат в настоящем изобретении означает такой конъюгат антитело-препарат, который практически лишен свободного токсина, при этом свободный токсин означает такой токсин, который не конъюгирован с антителом. Термин практически свободен от в применении к токсину, в частности, может означать, что присутствует менее 5%, например, менее 4% или менее 3% или менее 2% или менее 1,5% или менее 1% или менее 0,5% не конъюгированного препарата при определении его так, как описано в примере 16. Выделенное антитело или выделенный конъюгат антитело-препарат, который специфически связывается с эпитопом, изоформой или вариантом тканевого фактора человека, тем не менее может обладать перекрестной реактивностью с другими родственными ему антигенами, например, из других видов (как-то с видовыми гомологами тканевого фактора). Кроме того, выделенное антитело или выделенный конъюгат антитело-препарат могут быть практически свободными от другого клеточного материала и/или химических веществ. В одном воплощении настоящего изобретения в четко определенной композиции комбинируются два или несколько выделенных моноклональных антител или конъюгатов антитело-препарат с различной антиген-связывающей специфичностью.
В настоящем изобретении термин конкурирует с или перекрестно конкурирует с в отношении двух или нескольких антител означает, что два или несколько антител конкурируют за связывание с TF, например, конкурируют за связывание с TF при измерении, как описано в Примере 12 WO 10/066803. Для некоторых пар антител конкуренция при измерении как в Примере 12 WO 10/066803 наблюдается только тогда, когда антитело фиксировано на чашке, а другое используется для конкуренции, но не наоборот. Термин конкурирует с в настоящем изобретении охватывает и такие комбинации антител.
Термины моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела в настоящем изобретении относятся к препаратам молекул антител, состоящих из одинаковых молекул. Моноклональное антитело или его композиция может представлять собой конъюгированные с лекарством антитела по настоящему изобретению. Композиция моноклонального антитела проявлент только одну специфичность связывания и сродство к определенному эпитопу. Соответственно, термин моноклональное антитело человека относится к антителам, проявляющим только одну специфичность связывания, у которых вариабельные и константные области происходят из гаметных последовательностей иммуноглобулина человека. Моноклональные антитела человека могут вырабатываться гибридомой, которая содержит В-клетки, полученные из трансгенного или трансхромосомного животного (кроме человека), както из трансгенной мыши, у которых геном содержит тяжелую трансгенную цепь человека и легкую трансгенную цепь, слитые в иммортализованных клетках.
В настоящем изобретении термины связывание или специфически связывается в контексте связывания антител с заданным антигеном обычно означают связывание со сродством, соответствующим 7 8 9 10 значению KD в 10- М или меньше, как-то 10- М или меньше, как-то 10- М или меньше, примерно 10 М или меньше или около 10-11 М или даже меньше, при определении, к примеру, методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе BIAcore 3000 с использованием антигена в качестве лиганда и антитела в качестве анализируемого вещества, которое связывается с данным антигеном со сродством, соответствующим значению KD, которое по меньшей мере в десять раз меньше, как-то по меньшей мере в 100 раз меньше, к примеру, по меньшей мере в 1000 раз меньше, как-то по меньшей мере в 10 000 раз меньше, к примеру, по меньшей мере в 100 000 раз меньше, чем его сродство при связывании с неспецифическим антигеном (например, BSA, казеином), а не заданным антигеном или близкородственным антигеном. То, насколько это сродство меньше, зависит от KD антитела таким образом, что если KD антитела очень низкое (то есть антитело обладает высокой специфичностью), то степень уменьшения сродства к антигену может быть меньше, чем сродство к неспецифическому антигену, по меньшей мере в 10 000 раз.
- 4 034675
Термин kd (sec-1) в настоящем изобретении относится к константе скорости диссоциации определенного взаимодействия антитело-антиген. Данная величина также обозначается как значение koff.
Термин ka (М-1 х sec-1) в настоящем изобретении относится к константе скорости ассоциации определенного взаимодействия антитело-антиген.
Термин KD (M) в настоящем изобретении относится к равновесной константе диссоциации определенного взаимодействия антитело-антиген.
Термин Ka (M-1) в настоящем изобретении относится к равновесной константе ассоциации определенного взаимодействия антитело-антиген и получается путем деления ka на kd.
В настоящем изобретении термин интернализация в применении к антителам против TF включает любые механизмы, посредством которых антитела интернализуются с клеточной поверхности в TFэкспрессирующие клетки. Интернализацию антител можно оценить косвенным или прямым методом, когда измеряется эффект интернализованного конъюгата или комплекса антитело-токсин (таким, например, как метод анти-каппа-ЕТА' из примера 15 или метод интернализации и гибели клеток из примера 18). В общем, прямой метод применяется для измерения интернализации конъюгатов антитело-препарат типа метода, описанного здесь в примере 18, тогда как косвенные методы могут применяться для измерения интернализации антител, которые затем преинкубируют с вторичным конъюгированным антителом, типа метода, описанного здесь в примере 15.
Настоящим изобретением также предусмотрены, в одном воплощении, антитела, содержащие функциональные варианты области VL, области VH либо одного или нескольких участков CDR антител из примеров. Функциональный вариант VL, VH ИЛИ CDR, используемый в контексте антител против TF, все еще позволяет антителам сохранять по крайней мере значительную часть (по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95% или больше) сродства/авидности и/или специфичности/избирательности исходного антитела, а в некоторых случаях такие антитела против TF могут иметь большее сродство, избирательность и/или специфичность, чем исходное антитело.
Такие функциональные варианты обычно сохраняют значительное сходство с исходным антителом по последовательности. Степень идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений между двумя последовательностями (т.е. % гомологии = # идентичных позиций/общее # позиций х 100), с учетом количества пробелов и длины каждого пробела, которые нужно ввести для оптимального совмещения двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение степени идентичности между двумя последовательностями может осуществляться с помощью математического алгоритма, как описано ниже в неограничивающих примерах.
Степень идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определить при помощи программы GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступного на http://www.gcg.com), используя матрицу NWSgapdna.CMP и веса пробелов 40, 50, 60, 70 или 80 и веса длины пробелов 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Степень идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями также можно определить с помощью алгоритма Е. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 1117 (1988)), который встроен в программу ALIGN (версия 2.0), используя таблицу весов остатков РАМ120, пеню за расширение пробела 12 и пеню за пробел 4. Кроме того, степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с помощью алгоритма Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)), который встроен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступного на http://www.gcg.com), используя матрицу Blossum 62 или матрицу РАМ250 веса пробелов в 40, 50, 60, 70 или 80 и веса длины пробелов в 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Последовательность вариантов CDR может отличаться от последовательности CDR исходного антитела главным образом консервативными заменами; например, по меньшей мере 35%, около 50% или больше, 60% или больше, 70% или больше, 75% или больше, 80% или больше, 85% или больше, 90% или больше, 95% или больше (например, 65-99%, как-то 96%, 97% или 98%) замен у варианта представлены консервативными заменами аминокислотных остатков.
Последовательность вариантов CDR может отличаться от последовательности CDR исходного антитела главным образом консервативными заменами; например, по меньшей мере 10, например, по меньшей мере 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замена у варианта представлены консервативными заменами аминокислотных остатков.
В контексте настоящего изобретения консервативные замены могут определяться заменами внутри классов аминокислот, представленных в одной или нескольких из следующих трех таблиц.
Классы аминокислотных остатков для консервативных замен
Кислые остатки Asp (D) и Glu (Е)
Основные остатки Lys (К), Arg (R) и His (Н)
Гидрофильные незаряженные остатки Ser (S), Thr (Т), Asn (N) и Gin (Q)
Алифатические незаряженные остатки Gly (G), Ala (A), Vai (V), Leu (L) и He (I)
Неполярные незаряженные остатки Cys (C), Met (M) и Pro (P)
Ароматические остатки Phe (F), Tyr (Y) и Trp (W)
- 5 034675
Альтернативные классы консервативных замен аминокислотных остатков
Альтернативная физическая и функциональная классификация аминокислотных остатков
Остатки, содержащие спиртовую группу S иТ
Алифатические остатки I, L, V и М
Циклоалкенильные остатки F, Н, W и Y
Гидрофобные остатки А, С, F, G, Η, I, L, М, R, Т, V, W и Y
Отрицательно заряженные остатки DhE
Полярные остатки С, D, Е, Н, К, N, Q, R, S и Т
Положительно заряженные остатки Н, KnR
Небольшие остатки А, С, D, G, N, Р, S, Т и V
Очень маленькие остатки A, Gn S
Остатки, участвующие в образовании сгибов А, С, D, Е, G, Н, К, N, Q, R, S, Р и Т
Гибкие остатки Q, Т, К, S, G, Р, D, Е и R
Более консервативная группировка замен включает: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланинтирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутамин.
Могут быть составлены и другие группы аминокислот по принципам, описанным, например, в Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2nd ed., 1993), W.H. Freeman and Company.
В одном воплощении настоящего изобретения у варианта CDR может также существенно сохраняться консервативность в смысле гидропатических /гидрофильных свойств и веса/размера частиц по сравнению с CDR антител из примеров (например, весовой класс, гидропатический показатель или то и другое в последовательностях сохраняются по меньшей мере на 50, на 60, на 70, на 75, на 80, на 85, на 90, на 95% или больше (например, на 65-99%). Например, консервативные замены остатков могут также или альтернативно основываться на замене сильно или слабо консервативных по весу групп остатков, известных в данной области.
Сохранность подобных остатков можно также или альтернативно измерить по показателю сходства, который определяется при помощи программы BLAST (например, BLAST 2.2.8, доступной через NCBI, используя стандартные настройки BLOSUM62, Open Gap=11 и Extended Gap=1). Подходящие варианты обычно проявляют сходство с исходным пептидом по меньшей мере на 45%, как-то по меньшей мере на 55, на 65, на 75, на 85, на 90, на 95% или больше (например, на 70-99%).
В настоящем изобретении изотип означает класс иммуноглобулинов (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM), который кодируется генами константной области тяжелой цепи.
Термин эпитоп означает белковую детерминанту, способную специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы отличаются тем, что связывание с первыми, но не с последними, теряется в присутствии денатурирующих растворителей. Эпитопы могут содержать аминокислотные остатки, непосредственно вовлеченные в связывание (также называемые иммунодоминантной компонентой эпитопа), и другие аминокислотные остатки, которые прямо не участвуют в связывании, как-то аминокислотные остатки, которые эффективно блокируются специфическим связывающим антиген пептидом (другими словами, эти аминокислотные остатки находятся внутри футпринта специфического антигенсвязывающего пептида).
В настоящем изобретении человеческие антитела происходят из определенной гаметной последовательности, если антитела получены из системы с помощью последовательностей иммуноглобулина человека, к примеру, при иммунизации трансгенных мышей, несущих гены иммуноглобулина человека, или при скрининге библиотеки генов иммуноглобулинов человека, причем выбранное антитело человека по аминокислотной последовательности по меньшей мере на 90%, например, по меньшей мере на 95%, на 96, на 97, на 98 или на 99% идентично аминокислотной последовательности, кодируемой гаметным геном иммуноглобулина. Как правило, за пределами CDR3 тяжелой цепи человеческие антитела, происходящие из определенной гаметной последовательности человека, должны проявлять не более 20 аминокислотных отличий, например, не более 10 аминокислотных отличий, например, не более 9, 8, 7, 6 или 5, к примеру, не более 4, 3, 2 или 1 аминокислотных отличий от аминокислотной последовательности, кодируемой гаметным геном иммуноглобулина.
В настоящем изобретении термин подавляет рост (например, в отношении клеток, как-то раковых клеток) означает любое измеримое уменьшение роста клеток при контакте с конъюгатом препаратантитело против TF по сравнению с ростом тех же клеток без контакта с конъюгатом, например, ингиби
- 6 034675 рование роста культуры клеток по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 99 или 100%. Такое уменьшение роста клеток может происходить по различным механизмам со стороны антитела против TF и лекарственного препарата, либо по отдельности, либо в комбинации, например, зависимого от антител опосредованного клетками фагоцитоза (ADCP), зависимой от антител опосредованной клетками цитотоксичности (ADCC), обусловленной комплементом цитотоксичности (CDC) и/или апоптоза либо остановки клеточного цикла на стадии G2/M и апоптоза, как это происходит при взаимодействии ауристатина с тубулином.
Термин стабилизированное антитело IgG4 относится к таким антителам IgG4, которые подвергались модификации для уменьшения полуобмена молекул (см. WO 2008/145142 (Genmab A/S) или van der Neut Kolfschoten M. et al. (2007) Science 14; 317(5844) и приведенные в них ссылки.
В настоящем изобретении термин эффекторные клетки относится к иммунным клеткам, участвующим в эффекторной фазе иммунного ответа, в отличие от когнитивной и активационной фазы иммунного ответа. Типичными иммунными клетками являются клетки миелоидного или лимфоидного происхождения, например, лимфоциты (как-то В-клетки и Т-клетки, включая цитолитические Т-клетки (CTL)), клетки-киллеры, нормальные клетки-киллеры, макрофаги, моноциты, эозинофилы, полиморфноядерные клетки, как-то нейтрофилы, гранулоциты, тучные клетки и базофилы. Некоторые эффекторные клетки экспрессируют Fc-рецепторы (FcRs) и выполняют специфические иммунные функции. В некоторых воплощениях эффекторные клетки способны индуцировать ADCC, как-то нормальные клеткикиллеры, способные индуцировать ADCC. Например, моноциты, макрофаги, которые экспрессируют FcRs, участвуют в специфическом уничтожении клеток мишени и презентируют антигены другим компонентам иммунной системы или связываются с клетками, презентирующими антигены. В некоторых воплощениях эффекторные клетки могут подвергать фагоцитозу антигены мишени или клетки мишени. Экспрессия определенных FcR на эффекторных клетках может регулироваться такими гуморальными факторами, как цитокины. Например, экспрессия FcyRI, как оказалось, подвергается повышающей регуляции интерфероном-γ (IFN-γ) и/или колониестимулирующим фактором гранулоцитов (G-CSF). Такое повышение экспрессии усиливает цитотоксическую активность несущих FcyRI клеток против клеток мишени. Эффекторные клетки могут подвергать фагоцитозу или лизису антигены мишени или клетки мишени.
Термин вектор в настоящем изобретении обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она была соединена. Одним из типов вектора является плазмида, которая означает кольцевую двунитчатую петлю ДНК, с которой можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, причем в вирусный геном можно вставить дополнительные сегменты ДНК. Определенные вектора способны к автономной репликации в клетках хозяина, в которые они введены (например, бактериальные вектора, содержащие бактериальное начало репликации, и эписомные вектора млекопитающих). Другие вектора (как-то неэписомные вектора млекопитающих) могут встраиваться в геном клеток хозяина при введении в них и будут реплицироваться вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые вектора способны управлять экспрессией генов, с которыми они операбельно связаны. Такие вектора именуются здесь рекомбинантными экспрессирующими векторами (или просто экспрессионными векторами). В общем, экспрессирующие вектора, используемые в методах рекомбинантной ДНК, часто применяются в виде плазмид. В настоящей заявке термины плазмида и вектор можно использовать взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее распространенной формой вектора. Однако настоящее изобретение охватывает и другие формы экспрессирующих векторов, такие как вирусные вектора (как-то дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и адено-ассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.
В настоящем изобретении термин рекомбинантные клетки хозяина (или просто клетки хозяина) обозначает клетки, в которые был введен экспрессирующий вектор. Следует иметь в виду, что такие термины обозначают не только конкретные рассматриваемые клетки, но также и потомство таких клеток. Поскольку в последующих поколениях могут произойти определенные модификации вследствие мутаций или влияния окружающей среды, такое потомство может на деле и не быть идентичным родительским клеткам, но все-таки включается в рамки термина клетки хозяина в настоящем изобретении. Рекомбинантными клетками хозяина являются, к примеру, трансфектомы, такие как клетки СНО, клетки HEK293, клетки NS/0 и лимфоцитические клетки.
Термин трансфектома в настоящем изобретении охватывает рекомбинантные эукариотические клетки хозяина, экспрессирующие антитела, как-то клетки СНО, клетки NS/0, клетки HEK293, клетки растений или грибов, включая клетки дрожжей.
Термин трансгенное животное (кроме человека) относится к животным, у которых геном содержит один или несколько трансгенов или трансхромосом тяжелых и/или легких цепей человека (встроенных или не встроенных в природную геномную ДНК животного) и которые способны экспрессировать полностью человеческие антитела. Например, трансгенная мышь может содержать трансген легкой цепи человека и либо трансген тяжелой цепи человека, либо трансхромосому тяжелой цепи человека, так что
- 7 034675 такая мышь вырабатывает человеческие антитела против TF при иммунизации антигеном TF и/или клетками, экспрессирующими TF. Трансген тяжелой цепи человека может быть встроен в хромосомную ДНК мыши, как в случает с трансгенными мышами, к примеру, мышами HuMAb, как-то мышами HCo17, HCo17, HCo120 или HCo12, или же трансген тяжелой цепи человека может существовать вне хромосом, как в случае трансхромосомных мышей KM, описанных в WO02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши (собирательно именуемые здесь трансгенными мышами) способны вырабатывать множественные изотипы моноклональных антител человека к данному антигену (как-то IgG, IgA, IgM, IgD и/или IgE), подвергаясь рекомбинации V-D-J и переключению изотипа. Трансгенные животные также могут применяться для получения антител против определенного антигена путем введения генов, кодирующих такие специфичные антитела, к примеру, путем операбельного соединения генов с геном, который экспрессируется в молоке животного.
Обработка означает введение эффективного количества терапевтически активного соединения настоящего изобретения с целью ослабления, облегчения, задержки или устранения (излечения) симптомов или заболеваний.
Эффективное количество или терапевтически эффективное количество означает такое количество, которое в необходимых дозах и в течение нужного времени эффективно для получения требуемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество конъюгата препарат-антитело против TF может варьировать в зависимости от таких факторов, как заболевание, возраст, пол и вес индивида, и способности конъюгата вызывать требуемый ответ у индивида. Терапевтически эффективным количеством также является такое количество, при котором любые токсические или вредные эффекты антитела или части антитела перевешиваются терапевтически полезными эффектами.
Антиидиотипическое (Id) антитело есть такое антитело, которое распознает уникальные детерминанты, обычно связанные с антиген-связывающим сайтом антитела.
Другие аспекты и воплощения настоящего изобретения
Изобретением предусмотрены конъюгаты антител против TF с лекарственными препаратами (конъюгаты препарат-антитело против TF).
В одном аспекте изобретения предусмотрены конъюгаты препарат-антитело против TF, содержащие антитело, которое связывается с тканевым фактором и включает:
(i) область VH, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 6, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 7, и участок CDR3 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 8, и область VL, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 46, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 47, и участок CDR3 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 48; или (ii) область VH, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 34, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 35, и участок CDR3 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 36, и область VL, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 74, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 75, и участок CDR3 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 76; или (iii) область VH, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 38, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 39, и участок CDR3 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 40, и область VL, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 78, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 79, и участок CDR3 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 80; или (iv) область VH, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и участок CDR3 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и область VL, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 42, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 43, и участок CDR3 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 44; или (v) вариант любого из данных антител, причем данный вариант предпочтительно содержит не более 1, 2 или 3 модификаций аминокислот, более предпочтительно замен аминокислот, как-то консервативных замен аминокислот в данных последовательностях;
при этом антитело конъюгировано с ауристатином или его функциональным пептидным аналогом или производным через линкер.
В одном воплощении антитело включает:
(i) область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45; или (ii) область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; или
- 8 034675 (iii) область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; или (iv) область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41.
В одном воплощении антитело является полноразмерным антителом.
В одном воплощении антитело является полностью человеческим моноклональным антителом типа
IgG1, как-то IgG1,K. В другом воплощении антитело является полностью человеческим моноклональным стабилизированным антителом типа IgG4.
В одном воплощении ауристатин представлен монометилауристатином Е (ММАЕ):
где волнистой линией обозначен сайт прикрепления для линкера.
В одном воплощении ауристатин представлен монометилауристатином F (MMAF):
где волнистой линией обозначен сайт прикрепления для линкера.
В одном воплощении линкер прикрепляется к сульфгидрильным остаткам антитела против TF, полученным при (частичном) восстановлении антитела против TF.
В одном воплощении линкер-ауристатин представлен MC-vc-PAB-MMAF (также обозначается как vcMMAF) или MC-vc-PAB-MMAE (также обозначается как vcMMAE):
Ab-MC-vc-PAB-MMAF (vcMMAF)
Ab-MC-vc-PAB-MMAE (vcMMAE) где p означает число от 1 до 8, например, p может быть 3-5, S означает сульфгидрильный остаток антитела против TF, a Ab означает антитело против TF. В одном воплощении линкер-ауристатин представлен vcMMAE.
В одном воплощении линкер-конъюгат представлен mcMMAF (где сокращение mc/МС означает малеимидокапроил):
Ab-MC-MMAF (mcMMAF) где p означает число от 1 до 8, например, p может быть 3-5, S означает сульфгидрильный остаток антитела против TF, a Ab означает антитело против TF.
В одном воплощении антитело блокирует связывание FVIIa с тканевым фактором при определении, например, как описано в примере 14.
В одном воплощении антитело ингибирует связывание FVIIa с тканевым фактором, предпочтительно с максимальным значением IC50 между 0,01-3,0 мкг/мл либо 0,1-2,0 мкг/мл либо 0,2-1,2 мкг/мл при определении так, как описано в примере 14.
В одном воплощении антитело конкурирует за связывание с тканевым фактором:
с антителом, содержащим область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 33, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 73; или с антителом, содержащим область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 1, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 41; или с антителом, содержащим область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 5, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 45; или с антителом, содержащим область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 9, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 49; или с антителом, содержащим область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 13, и область
- 9 034675
VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 53; или с антителом, содержащим область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 17, и область
VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 57; или с антителом, содержащим область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 21, и область
VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 61; или с антителом, содержащим область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 25, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 65; или с антителом, содержащим область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 29, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 69; или с антителом, содержащим область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 37, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 77.
В одном воплощении антитело включает:
a) область VH, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 34, 35 и 36, и область VL, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 74, 75 и 76; или
b) область VH, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 2, 3 и 4, и область VL, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 42, 43 и 44; или
c) область VH, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 6, 7 и 8, и область VL, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 46, 47 и 48; или
d) область VH, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 10, 11 и 12, и область VL, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 50, 51 и 52; или
e) область VH, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 14, 15 и 16, и область VL, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 54, 55 и 56; или
f) область VH, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 18, 19 и 20, и область VL, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 58, 59 и 60; или
g) область VH, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 22, 23 и 24, и область VL, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 62, 63 и 64; или
h) область VH, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 26, 27 и 28, и область VL, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 66, 67 и 68; или
i) область VH, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 30, 31 и 32, и область VL, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 70, 71 и 72; или
j) область VH, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 38, 39 и 40, и область VL, содержащую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO: 78, 79 и 80; или
k) вариант любого из данных антител, причем этот вариант предпочтительно содержит не более 1, 2 или 3 модификаций аминокислот, более предпочтительно замен аминокислот, как-то консервативных замен аминокислот в данных последовательностях.
В одном воплощении антитело включает область VH, которая:
a) по меньшей мере на 80%, как-то по меньшей мере на 90, на 95 или на 98, или 100% идентична последовательности области VH, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 33, 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 37 и 29; или
b) содержит не более 20, как-то 15 или 10 или 5, 4, 3, 2 или 1 модификаций аминокислот, более предпочтительно замен аминокислот, как-то консервативных замен аминокислот по сравнению с последовательностью области VH, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 33, 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 37 и 29.
В одном воплощении антитело включает область VL, которая:
a) по меньшей мере на 80%, как-то по меньшей мере на 90, на 95 или на 98, или 100% идентична последовательности области VL, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 73, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 77 и 69; или
b) содержит не более 20, как-то 15 или 10 или 5, 4, 3, 2 или 1 модификаций аминокислот, более предпочтительно замен аминокислот, как-то консервативных замен аминокислот по сравнению с последовательностью области VL, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 73, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 77 и 69.
В одном воплощении антитело включает:
a) область VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 33, и область VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 73; или
b) область VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1, и область VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 41; или
c) область VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 5, и область VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 45; или
d) область VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 9, и область VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 49; или
e) область VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, и область VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 53; или
- 10 034675
f) область VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 17, и область VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 57; или
g) область VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 21, и область VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 61; или
h) область VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 25, и область VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 65; или
i) область VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 29, и область VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 69; или
j) область VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 37, и область VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 77.
В одном воплощении антитело связывается со внеклеточным доменом тканевого фактора с кажущимся сродством (EC5o) в 3,0 нМ или меньше, как-то 0,50 нМ или меньше, например, 0,35 нМ или меньше, как-то 0,20 нМ или меньше, например, 0,1 нМ или меньше при определении так, как описано в методе из Примера 12.
В одном воплощении антитело связывается с клетками млекопитающих, экспрессирующими тканевой фактор, как-то клетками А431, трансфецированными конструкцией, кодирующей тканевой фактор, предпочтительно с кажущимся сродством (ЕС50) в 10 нМ или меньше, например, 8 нМ или меньше, както 5 нМ или меньше, например, 2 нМ или меньше, как-то 1 нМ или меньше, например, 0,5 нМ или меньше, как-то 0,3 нМ или меньше при определении так, как описано в методе из Примера 13.
В другом или альтернативном аспекте антитело конъюгировано с терапевтической молекулой, выбранной из группы, состоящей из таксола; цитохалазина В; грамицидина D; бромида этидия; эметина; митомицина; этопозида; тенопозида; винкристина; винбластина; колхицина; доксорубицина; даунорубицина; дигидроксиантрациндиона; ингибиторов тубулина типа майтансина или их аналогов или производных; митоксантрона; митрамицина; актиномицина D; 1-дегидротестостерона; глюкокортикоидов; прокаина; тетракаина; лидокаина; пропранолола; пуромицина; калихеамицина или его аналогов или производных; антиметаболитов типа метотрексата, 6-меркаптопурина, 6-тиогуанина, цитарабина, флударабина, 5-фторурацила, декарбазина, гидроксимочевины, аспарагиназы, гемцитабина или кладрибина; алкилирующих реагентов типа мехлоретамина, тиоэпа, хлорамбуцила, мелфалана, кармустина (BSNU), ломустина (CCNU), циклофосфамида, бусульфана, дибромманнитола, стрептозотоцина, дакарбазина (DTIC), прокарбазина, митомицина С, цисплатина, карбоплатина, дуокармицина А, дуокармицина SA, рахелмицина (СС-1065) либо их аналогов или производных; пирроло[2,1-с][1,4]-бензодиазепинов (PDBs) или их аналогов; таких антибиотиков, как дактиномицин, блеомицин, даунорубицин, доксорубицин, идарубицин, митрамицин, митомицин, митоксантрон, пликамицин, антрамицин (АМС)); дифтерийного токсина и родственных ему молекул типа цепи А дифтерийного токсина и её активных фрагментов и гибридных молекул, токсинов рицина типа рицина А или дегликозилированной цепи А рицина, холерного токсина, Shiga-подобных токсинов типа токсина SLT I, SLT II, SLT IIV, LT, токсина С3, токсина Shiga, коклюшного токсина, столбнячного токсина, ингибитора протеаз из сои Bowman-Birk, эндотоксина Pseudomonas, алорина, сапорина, модекцина, геланина, цепи А абрина, цепи А модекцина, альфа-сарцина, белков Aleurites fordii, белков диантина, таких белков Phytolacca americana, как PAPI, PAPII и PAP S, ингибитора из Momordica charantia, курцина, кротина, ингибитора из Sapaonaria officinalis, токсинов гелонина, митогеллина, рестриктоцина, феномицина и еномицина; рибонуклеазы (РНКазы); ДНКазы I; стафилококкового энтеротоксина А; противовирусного белка фитолакки; дифтерийного токсина; и эндотоксина Pseudomonas. В другом альтернативном воплощении антитело конъюгировано с цитотоксической молекулой, выбранной из группы, состоящей из доластатина, майтансина, калихеамицина, дуокармицина, рахелмицина (СС-1065) или их аналогов, производных или пролекарственных форм.
В другом альтернативном воплощении антитело конъюгировано с цитокином, выбранным из группы, состоящей из IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa, IFN3, IFNy, GM-CSF, CD40L, лигандов Flt3, фактора стволовых клеток, анцестима и TNFa.
В другом альтернативном воплощении антитело конъюгировано с радиоизотопом.
В одном воплощении антитело способно индуцировать цитотоксичность при интернализации антител, конъюгированных с токсином, на клетках А431, BxPC3 или MDA-MB-23, как описано в примере 15.
В одном воплощении антитело индуцирует цитотоксичность при интернализации, как описано в примере 15, со значением EC50 между 9х 10-5 и 4х 10-4 мкг/мл на клетках А431.
В одном воплощении препарат конъюгата антитело-препарат дает менее 2%, как-то менее 1,5% или менее 1% или менее 0,5% неконъюгированного лекарственного препарата при определении так, как описано в примере 16.
В одном воплощении препарат конъюгата антитело-препарат дает менее 10%, как-то менее 8% или менее 7% или менее 7% или менее 5,5% агрегатов при определении так, как описано в примере 16.
В одном воплощении препарат конъюгата антитело-препарат дает менее 1%, как-то менее 0,5% или менее 0,25% или менее 0,2% эндотоксинов при определении так, как описано в примере 16.
- 11 034675
В одном воплощении препарат конъюгата антитело-препарат дает концентрацию конъюгата в пределах 1-100 мг/мл, как-то 2-50 мг/мл, или 5-25 мг/мл, или 5-15 мг/мл, или 7,5-15 мг/мл, или 8-12 мг/мл или 9-11 мг/мл при определении так, как описано в примере 16.
В одном воплощении конъюгат антитело-препарат связывается с внеклеточным доменом тканевого фактора с кажущимся сродством (EC50) в 600 нг/мл или меньше, как-то 550 нг/мл или меньше или 500 нг/мл или меньше, например, со значением EC50 в пределах 200-600 нг/мл, как-то в пределах 300-600 нг/мл, или 350-550 нг/мл, или 400-500 нг/мл при определении так, как описано в примере 17.
В одном воплощении конъюгат антитело-препарат индуцирует цитотоксичность при интернализации, как описано в примере 18, со значением EC50 между 1 и 100 нг/мл на клетках А431.
В одном воплощении конъюгат антитело-препарат индуцирует цитотоксичность при интернализации, как описано в примере 18, со значением EC50 между 0,5 и 20 нг/мл на клетках HPAF-II.
В одном воплощении конъюгат антитело-препарат индуцирует цитотоксичность при интернализации, как описано в примере 18, со значением EC50 между 0,5 и 500 нг/мл, например, между 0,5 и 20 нг/мл на клетках NCI-H441.
В одном воплощении конъюгат антитело-препарат индуцирует цитотоксичность при интернализации, как описано в Примере 18, например, в раковых клетках, экспрес-сирующих более чем 200000 молекул тканевого фактора на клетку, как-то 200000-1000000 молекул тканевого фактора на клетку, например, 200000-500000 молекул тканевого фактора на клетку. Значение EC50 в одном воплощении может составлять от 0,1 до 100 нг/мл.
В одном воплощении конъюгат антитело-препарат индуцирует цитотоксичность при интернализации, как описано в примере 18, например, в раковых клетках, экспрес-сирующих более чем 20000 молекул тканевого фактора на клетку, например, 20000-200000 молекул тканевого фактора на клетку. Значение EC50 в одном воплощении может составлять от 0,5 до 500 нг/мл, как-то от 0,5 до 20 нг/мл.
В одном воплощении конъюгат антитело-препарат ингибирует рост опухолей, как описано в примере 19.
В одном воплощении конъюгат антитело-препарат ингибирует рост опухолей в клеточной линии, экспрессирующей более 1000 молекул тканевого фактора на клетку, как-то более 10000 молекул тканевого фактора на клетку, например, более 100000 молекул тканевого фактора на клетку, или же в пределах 1000-20000 молекул тканевого фактора на клетку или 20000-200000 молекул тканевого фактора на клетку или 200000-500000 молекул тканевого фактора на клетку или 200000-1000000 молекул тканевого фактора на клетку при определении роста опухолей так, как описано в примере 19.
В одном воплощении конъюгат антитело-препарат стабилен при -65°С по меньшей мере в течение трех месяцев, при этом стабильность означает, что по меньшей мере 95% конъюгата антитело-препарат находится в виде мономерных молекул при определении так, как описано в примере 20.
В одном воплощении конъюгат антитело-препарат стабилен при 5°С по меньшей мере в течение трех месяцев, при этом стабильность означает, что по меньшей мере 95% конъюгата антитело-препарат находится в виде мономерных молекул при определении так, как описано в примере 20.
В другом аспекте изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат антитело-препарат, приведенный в любом из вышеперечисленных воплощений. В одном воплощении фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.
В другом аспекте изобретения предусмотрен конъюгат антитело-препарат, приведенный в любом из вышеперечисленных воплощений, для применения в качестве медикамента.
В другом аспекте изобретения предусмотрен конъюгат антитело-препарат, приведенный в любом из вышеперечисленных воплощений, для применения при лечении заболеваний.
В другом аспекте изобретения предусмотрен конъюгат антитело-препарат, приведенный в любом из вышеперечисленных воплощений, для применения при лечении воспаления.
В другом аспекте изобретения предусмотрен конъюгат антитело-препарат, приведенный в любом из вышеперечисленных воплощений, для применения при лечении рака.
В одном воплощении рак выбирается из группы, состоящей из опухолей центральной нервной системы, рака головы и шеи, рака легких, такого как NSCLC, рака молочной железы, особенно втройне отрицательного рака молочной железы, рака пищевода, рака желудка, раки печени и желчных протоков, рака поджелудочной железы, колоректального рака, рака мочевого пузыря, рака почек, рака предстательной железы, рака эндометрия, рака яичников, злокачественной меланомы, саркомы, опухолей неизвестного первичного происхождения, рака костного мозга, острой лимфобластной лейкемии, хронической лимфобластной лейкемии и неходжкинской лимфомы, рака кожи, глиомы, рака головного мозга, рака матки, острой миелоидной лейкемии и рака прямой кишки.
В одном воплощении рак представлен раком поджелудочной железы.
В одном воплощении рак представлен колоректальным раком.
В одном воплощении рак представлен раком яичников.
В одном воплощении рак представлен раком молочной железы.
В одном воплощении рак представлен раком предстательной железы.
В одном воплощении рак представлен раком мочевого пузыря.
- 12 034675
В одном воплощении рак представлен раком, чувствительным к обработке ингибиторами тубулина.
В другом аспекте изобретения предусмотрен конъюгат антитело-препарат из любого из вышеприведенных воплощений, при этом медикамент предназначается для лечения рака в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, как-то химиотерапевтическими средствами.
В другом аспекте изобретения предусмотрено применение конъюгата антитело-препарат из любого из вышеприведенных воплощений для изготовления медикамента для лечения рака. В одном воплощении рак может быть выбран из числа раковых заболеваний, описанных выше.
В другом воплощении изобретения предусмотрен способ индуцирования клеточной гибели или ингибирования роста и/или пролиферации раковых клеток, экспрессирующих тканевой фактор, который включает введение нуждающемуся в этом лицу эффективного количества конъюгата антитело-препарат из любого из вышеприведенных воплощений.
В другом аспекте изобретения предусмотрен способ лечения любого из вышеперечисленных раковых заболеваний путем введения нуждающемуся в этом индивиду эффективного количества конъюгата антитело-препарат из любого из вышеприведенных воплощений. В одном воплощении конъюгат антитело-препарат вводится в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, как-то химиотерапев-тическими средствами.
Антитела
Настоящее изобретение касается конъюгатов препарат-антитело против TF, то есть содержащих и антитело, и лекарственный препарат, которые, в частности, могут быть конъюгированы друг с другом через линкер.
Антитела могут быть получены хорошо известными рекомбинантными методами с использованием хорошо известных систем экспрессирующих векторов и клеток хозяина. В одном воплощении антитела получают в клетках СНО с помощью экспрессирующей системы векторов GS, как изложено в De la Cruz Edmunds et al, 2006, Molecular Biotechnology 34: 179-190; EP216846, US5981216, WO 87/04462, EP323997, US5591639, US5658759, EP338841, US5879936 и US5891693.
После выделения и очистки антител из клеточной среды хорошо известными методами их конъюгируют с ауристатином через линкер, как изложено более подробно ниже.
Моноклональные антитела настоящего изобретения могут быть получены, например, гибридомным методом, впервые описанным Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), или же методами рекомбинантной ДНК. Моноклональные антитела также можно выделить из фаговых библиотек антител при помощи методов, описанных, к примеру, в Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991); и Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). Моноклональные антитела могут быть получены из любого подходящего источника. Так, к примеру, моноклональные антитела могут быть получены из гибридом, полученных из В-клеток селезенки мышей, иммунизированных нужным антигеном, к примеру, в виде клеток, экспрессирующих антиген на поверхности, или нуклеиновой кислоты, кодирующей нужный антиген. Моноклональные антитела также могут быть получены из гибридом, происходящих из экспрессирующих антитела клеток иммунизированных людей или таких млекопитающих, как крысы, собаки, приматы и др.
В одном воплощении антитела изобретения представляют собой человеческие антитела. Человеческие моноклональные антитела против тканевого фактора могут быть получены с использованием трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части иммунной системы человека, а не мыши. Такие трансгенные или трансхромосомные мыши включают мышей, которые именуются здесь как мыши HuMAb и мыши KM, соответственно, и собирательно называются трансгенными мышами.
Мыши HuMAb содержат минилокус генов иммуноглобулина человека, который кодирует не прошедшие перегруппировку последовательности тяжелой (μ и γ) и легкой цепи к иммуноглобулина человека, вместе с направленными мутациями, инактиви-рующими эндогенные локусы цепей μ и к (Lonberg N. et al, Nature 368, 856-859 (1994)). Соответственно, мыши проявляют пониженную экспрессию IgM или к мыши и в ответ на иммунизацию введенные трансгены тяжелой и легкой цепи человека подвергаются переключению классов и соматическим мутациям, образуя моноклональные антитела IgG,K человека с высоким сродством (Lonberg N. et al. (1994), supra; reviewed in Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994); Lonberg N. and Huszar D., Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995); и Harding F. and Lonberg N. Ann. N.Y. Acad. Sci. 764, 536-546 (1995)). Получение мышей HuMAb подробно описано в Taylor L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992); Chen J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993); Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994); Taylor L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994); Fishwild D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). См. также US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 и WO 01/09187.
Мыши HCo17 содержат разрыв JKD в эндогенных генах легкой цепи (каппа) (как описано в Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), разрыв CMD в эндогенных генах тяжелой цепи (как описано в примере 1 из WO 01/14424), трансген KCo5 легкой каппа-цепи человека (как описано в Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), и трансген HCo17 тяжелой цепи человека (как описано в US 5,770,429).
- 13 034675
Мыши HCo12 содержат разрыв JKD в эндогенных генах легкой цепи (каппа) (как описано в Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), разрыв CMD в эндогенных генах тяжелой цепи (как описано в примере из WO 01/14424), трансген KCo5 легкой каппа-цепи человека (как описано в Fishwild et al, Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)) и трансген HCo12 тяжелой цепи человека (как описано в примере 2 из WO
01/14424).
Трансгенная линия мышей HCo17 (см. также US 2010/0077497) была создана путем совместного введения вставки рНС2 в 80 т.о. (Taylor et al. (1994) Int. Immunol. 6: 579-591), вставки pVX6 в 25 т.о. и искусственного хромосомного фрагмента дрожжей в 460 т.о. из хромосомы yIgH24. Эта линия была названа (HCo17) 25950. Затем линию (HCo17) 25950 скрещивали с мышами, содержащими мутацию CMD (как описано в примере 1 из РСТ Publication WO 01109187), мутацию JKD (Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820) и трансген (KC05) 9272 (Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851). Полученные мыши экспрессируют трансгены тяжелой и легкой каппа-цепи иммуноглобулина человека на фоне гомозиготности по разрывам эндогенных локусов тяжелой и легкой каппа-цепи мыши.
Трансгенная линия мышей HCo120 является результатом совместного введения трасгена рНС2 тяжелой цепи из минилокуса 30, содержащей гаметную вариабельную область (Vh) минихромосомы YAC yIgH10 и конструкции с минилокусом pVx6 (описанной в WO09097006). Затем линию (HCo120) скрещивали с мышами, содержащими мутацию CMD (описанную в примере 1 из РСТ Publication WO 01/09187), мутацию JKD (Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 811-820) и трансген (KC05) 9272 (Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851). Полученные мыши экспрессируют 10 трансгенов тяжелой и легкой каппа-цепи иммуноглобулина человека на фоне гомозиготности по разрывам локусов эндогенной тяжелой и легкой каппа-цепи мыши.
Для получения мышей HuMab с благотворными эффектами линии Balb/c мышей HuMab скрещивали с мышами KC05 [MlK] (Balb), полученными при обратном скрещивании линии KC05 (как описано в Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851) с мышами Balb/c дикого типа для получения мышей, описанных в WO 09097006. При этом скрещивании были получены гибриды Balb/c для линий HCo12, HCo17 и HCo120.
Линия мышей KM содержит гомозиготный разрыв эндогенного гена легкой каппа-цепи мыши, как описано в Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993), и гомозиготный разрыв эндогенного гена тяжелой цепи мыши, как описано в примере 1 из WO 01/09187. Эта линия мышей несет трансген KCo5 легкой каппа-цепи человека, как описано в Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996), а также несет трансхромосому тяжелой цепи человека, состоящую из фрагмента hCF (SC20) хромосомы 14, как описано в WO 02/43478.
Спленоциты их этих трансгенных мышей можно использовать для получения гибридом, секретирующих моноклональные антитела человека, в соответствии с хорошо известными методами. Моноклональные или поликлональные антитела человека по настоящему изобретению или антитела настоящего изобретения, происходящие из других видов, также можно получить трансгенно посредством получения других млекопитающих или растений, трансгенных по нужным последовательностям тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, и продукции в них антител в извлекаемой форме. При получении в трансгенных млекопитающих антитела можно получать и выделять из молока коз, коров или других млекопитающих. Например, см. US 5,827,690, US 5,756,687, US 5,750,172 и US 5,741,957.
Кроме того, человеческие антитела по настоящему изобретению или антитела настоящего изобретения из других видов могут быть получены дисплейными методами, включая, без ограничения, фаговый дисплей, ретровирусный дисплей, рибосомный дисплей и другие хорошо известные методы, а полученные молекулы могут быть подвергнуты дополнительному созреванию, как-то созреванию аффинности, поскольку такие способы хорошо известны в данной области (например, см. Hoogenboom et al, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (фаговый дисплей); Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (фаговый дисплей); Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (рибосомный дисплей); Parmley and Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (фаговый дисплей); Scott, TIBS 17, 241-245 (1992); Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990); Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993); Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992); Chiswell and McCafferty, TIBTECH 10, 80-84 (1992); и US 5,733,743). Если дисплейные технологии используются для получения антител, не являющихся человеческими, то такие антитела можно гуманизировать.
Антитела изобретения может быть любого изотипа. Как правило, выбор изотипа определяется требуемыми эффекторными функциями, такими как индукция ADCC. Типичными изотипами являются IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Можно использовать любые константные области легкой цепи человека - каппа или лямбда. При желании можно переключить класс антител против TF настоящего изобретения известными методами. Например, антитело настоящего изобретения, которое изначально было IgM, можно переключено на антитело класса IgG настоящего изобретения. Кроме того, можно использовать методы переключения класса для преобразования одного подкласса IgG на другой, к примеру, из IgG1 на IgG2. Таким образом, эффекторная функция антител настоящего изобретения может быть изменена переключением изотипа, например, на антитела IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM для различного терапевтического применения. В одном воплощении антитела настоящего изобретения представлены
- 14 034675 антителами IgG1, к примеру, IgG1,K.
В одном воплощении антитела изобретения являются антителами полной длины, предпочтительно антителами IgG1, в частности антителами IgG1,K. Термин антитело полной длины служит для обозначения того, что оно является естественным, целым антителом, т.е. не фрагментом или другим типом антител, у которых различные цепи антител подверглись перестройке человеком для получения новых антител (например, см. Sidhu SS, Nature Biotechnology, 25, 5, 537-538 (2007), где раскрыты антитела полной длины на дисплее). В другом воплощении антитела изобретения являются фрагментами антител или одноцепочечными антителами.
Фрагменты антител можно получить, например, путем фрагментации стандартными методами, а фрагменты подвергнуть скринингу на пригодность таким же образом, как описано здесь для целых антител. Например, фрагменты F(ab')2 можно получить при обработке антител пепсином. Полученные фрагменты F(ab')2 можно подвернуть восстановлению дисульфидных мостиков для получения Fab'фрагментов. Fab-фрагменты можно получить обработкой антител IgG папаином; Fab'-фрагменты можно получить при расщеплении антител IgG пепсином. F(ab')-фрагменты также можно получить путем связывания Fab', как описано ниже, через тиоэфирную связь или дисульфидную связь. Fab'-фрагменты представляют собой фрагменты антител, полученные при разрезании дисульфидной связи в шарнирном участке F(ab')2. Fab'-фрагменты можно получить при обработке F(ab')2-фрагмента восстанавливающим реагентом, как-то дитиотреитолом. Фрагменты антител также можно получить при экспрессировании нуклеиновых кислот, кодирующих такие фрагменты, в рекомбинантных клетках (например, см. Evans et al, J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995)). Например, химерный ген, кодирующий часть F(ab')2-фрагмента, может включать последовательности ДНК, кодирующие домен CH1 и шарнирный участок Н-цепи, за которой следует стоп-кодон трансляции, получая при этом укороченный фрагмент молекулы антитела.
Антитела настоящего изобретения дополнительно раскрыты и охарактеризованы в WO 2010/066803 (Genmab A/S).
В одном воплощении антитело против TF является стабилизированным антителом IgG4. Примерами подходящих стабилизированных антител IgG4 являются антитела, у которых аргинин в положении 409 константной области тяжелой цепи IgG4 человека, который приведен в указателе EU как в Kabat et al., замещен лизином, треонином, метионином или лейцином, предпочтительно лизином (описано в WO 2006033386 (Kirin)) и/или у которых шарнирный участок содержит последовательность Cys-Pro-Pro-Cys.
В другом воплощении стабилизированное антитело IgG4 против TF представляет собой антитело IgG4, содержащее тяжелую и легкую цепь, причем данная тяжелая цепь содержит константную область IgG4 человека с остатком, выбранным из группы, состоящей из Lys, Ala, Thr, Met и Leu в положении, соответствующем 409, и/или остатком, выбранным из группы, состоящей из Ala, Val, Gly, Ile и Leu в положении, соответствующем 405, при этом данное антитело необязательно содержит одну или несколько дополнительных замен, делеций и/или вставок, но не содержит последовательности Cys-Pro-Pro-Cys в шарнирном участке. Предпочтительно данное антитело содержит остаток Lys или Ala в положении, соответствующем 409, либо участок СН3 антитела заменен участком СН3 IgG1 человека, IgG2 человека или IgG3 человека.
В следующем воплощении стабилизированное антитело IgG4 против TF представляет собой антитело IgG4, содержащее тяжелую и легкую цепь, причем данная тяжелая цепь содержит константную область IgG4 человека с остатком, выбранным из группы, состоящей из Lys, Ala, Thr, Met и Leu в положении, соответствующем 409, и/или остатком, выбранным из группы, состоящей из Ala, Val, Gly, Ile и Leu в положении, соответствующем 405, при этом данное антитело необязательно содержит одну или несколько дополнительных замен, делеций и/или вставок и при этом данное антитело содержит последовательность Cys-Pro-Pro-Cys в шарнирном участке. Предпочтительно данное антитело содержит остаток Lys или Ala в положении, соответствующем 409, либо участок СН3 антитела заменен участком СН3 IgG1 человека, IgG2 человека или IgG3 человека.
В другом воплощении антитело против TF не является антителом типа IgG4, a, например, IgG1, IgG2 или IgG3, и было подвергнуто мутации с тем, чтобы уменьшить или даже устранить способность к выполнению эффекторных функций, таких как ADCC. Такие мутации описаны, например, в Dall'Acqua WF et al, J Immunol. 177(2): 1129-1138 (2006); и Hezareh M, J Virol. 75(24): 12161-12168 (2001).
Конъюгаты
Настоящим изобретением предусмотрены конъюгаты антител против TF с лекарственными препаратами (конъюгаты препарат-антитело против TF).
В одном аспекте конъюгаты препарат-антитело против TF настоящего изобретения включают антитела против TF, раскрытые в настоящем изобретении, конъюгированные с ауристатинами или пептидными аналогами и производными ауристатинов (US5635483; US5780588). Было показано, что ауристатины влияют на динамику микротрубочек, гидролиз GTP и деление ядер и клеток (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584) и обладают противораковой (US5663149) и противогрибковой активностью (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42:2961-2965. Молекула препарата ауристатина может присоединяться к антителу через линкер, через N-конец или С-конец пеп- 15 034675 тидной молекулы препарата.
Типичные воплощения ауристатинов включают присоединяемые по N-концам молекулы препаратов монометилауристатина DE и DF, раскрытые в Senter et al., Proceedings of the American Association for
Cancer Research. Volume 45, abstract number 623, presented March 28, 2004, и описанные в US
2005/0238649).
Типичным воплощением ауристатина является ММАЕ (монометилауристатин Е), где волнистой линией обозначено ковалентное присоединение конъюгата антитело-препарат к линкеру (L):
Другим типичным воплощением ауристатина является MMAF (монометилауристатин F), где волнистой линией обозначено ковалентное присоединение конъюгата антитело-препарат к линкеру (L) (US2005/0238649):
Конъюгаты препарат-антитело против TF по изобретению содержат звено линкера между звеном цитостатического или цитотоксического препарата и звеном антитела. В некоторых воплощениях линкер расщепляется при внутриклеточных условиях, так что при отщеплении линкера лекарственный препарат отделяется от антитела во внутриклеточном пространстве. В другом воплощении звено линкера не расщепляется, а препарат высвобождается, к примеру, при деградации антитела. В некоторых воплощениях линкер расщепляется расщепляющим агентом, присутствующим во внутриклеточной среде (например, внутри лизосом или эндосом или кавеол). Линкером может быть, например, пептидный линкер, который расщепляется внутриклеточным ферментом пептидазой или протеазой, включая, без ограничения, лизосомные или эндосомные протеазы. В некоторых воплощениях длина пептидного линкера составляет по меньшей мере две аминокислоты или три аминокислоты. Расщепляющие агенты могут включать катепсины В и D и плазмин, в отношении которых известно, что все они гидролизируют дипептидные производные лекарств, приводя к высвобождению активного препарата внутри клеток мишени (например, см. Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). В определенном воплощении пептидным линкером, который расщепляется внутриклеточной протеазой, является линкер Val-Cit (валинцитруллин) или Phe-Lys (фенилаланин-лизин) (например, см. US6214345, в котором описан синтез доксорубицина с линкером Val-Cit и другие примеры линкеров Phe-Lys). Примеры структур с линкером ValCit или Phe-Lys включают, без ограничения, MC-vc-PAB, описанный ниже, MC-vc-GABA, MC-Phe-LysPAB или MC-Phe-Lys-GABA, где МС означает малеимидокапроил, vc означает Val-Cit, РАВ - nаминобензилкарбамат и GABA - γ-аминомасляная кислота. Преимущество внутриклеточного протеолитического высвобождения терапевтического средства состоит в том, что это средство, как правило, ослаблено при конъюгировании, а стабильность конъюгатов в сыворотке, как правило, высока.
В следующем воплощении звено линкера не расщепляется, а препарат высвобождается при деградации антитела (см. US 2005/0238649). Как правило, такой линкер практически не чувствителен к внеклеточному окружению. В настоящем изобретении практически не чувствителен к внеклеточному окружению в отношении линкера означает, что не более 20%, обычно не более 15%, более обычно не более 10% и еще более обычно не более 5%, не более 3% или не более 1% линкера в образце соединения конъюгата антитело-препарат расщепляется тогда, когда конъюгат антитело-препарат находится во внеклеточном окружении (например, плазме). Будет ли линкер практически нечувствительным к внеклеточному окружению, можно определить, к примеру, путем инкубации соединения конъюгата антителопрепарат с плазмой в течение определенного времени (напр. 2, 4, 8, 16 или 24 часов), а затем измерения количества свободного препарата, присутствующего в плазме.
Другие типичные воплощения, содержащие ММАЕ или MMAF и различные линкерные компоненты, имеют следующие структуры (где Ab означает антитело, а p, которое означает нагруженность препаратом (или среднее количество цитостатических или цитотоксических молекул на молекулу антитела), составляет от 1 до 8, например, p может составлять 4-6, как-то 3-5, или же p может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8).
Примеры, когда расщепляемый линкер соединен с ауристатином, включают MC-vc-PAB-MMAF (также обозначается как vcMMAF) и MC-vc-PAB-MMAF (также обозначается как vcMMAE), где МС означает малеимидокапроил, vc - линкер Val-Cit (валин-цитруллин), а РАВ - n-аминобензилкарбамат:
- 16 034675
Ab-MC-vc-PAB-MMAF (vcMMAF)
Ab-MC-vc-PAB-MMAE (vcMMAE)
Другие примеры включают ауристатины, соединенные с нерасщепляемым линкером, такие как mcMMAF (mc означает малеимидокапроил, причем МС означает то же самое, что и mc):
Ab-MC-MMAF (mcMMAF)
Нагруженность цитостатическим или цитотоксическим препаратом представлена p, которое означает среднее число молекул цитостатического препарата на антитело в молекуле (также обозначается как соотношение лекарства к антителу, DAR). Нагруженность цитостатическим или цитотоксическим препаратом может составлять от 1 до 20 молекул препарата на антитело и может приходиться на аминокислоты с полезными функциональными группами, такими, без ограничения, как амино- или сульфгидрильные группы, как в лизине или цистеине.
В зависимости от способа конъюгации, p может быть ограничено числом сайтов прикрепления на антителе, например, при прикреплении через сульфгидрильные группы, как в настоящем изобретении. Обычно антитела содержат немного сульфгидрильных групп (свободных и реактивных тиоловых групп цистеина), по которым могут присоединяться молекулы препарата, так как большинство тиоловых групп цистеина находится в виде дисульфидных мостиков. Поэтому в некоторых воплощениях антитело может быть подвергнуто восстановлению с помощью таких восстановителей, как дитиотреитол (DTT) или трикарбонилэтилфосфин (ТСЕР), в частично или полностью восстановительных условиях, для получения реактивных сульфгидрильных групп. В некоторых воплощениях нагруженность препаратом у ADC изобретения составляет от 1 до 8, например, p может составлять 4-6, как-то 3-5, или же p может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, так как после (частичного) восстановления антитела становятся доступными максимум 8 сульфгидрильных остатков (именно 8 цистеинов задействовано в образовании межцепочечных дисульфидных связей).
В одном воплощении молекула линкера для препарата представлена vcMMAE. Молекула линкера vcMMAE для препарата и способы конъюгации изложены в WO 2004010957, US7659241, US7829531, US7851437 и US 11/833,028 (Seattle Genetics, Inc.), (которые включены сюда в виде ссылки), причем молекула линкера vcMMAE связывается с антителами против TF по цистеинам при помощи способа, близ кого приведенному там.
В одном воплощении молекула линкера для препарата представлена mcMMAE. Молекула линкера mcMMAE для препарата и способы конъюгации изложены в US7498298, US 11/833,954 и WO 2005081711 (Seattle Genetics, Inc.) (которые включены сюда в виде ссылки), причем молекула линкера mcMMAE связывается с антителами против TF по цистеинам при помощи способа, близкого приведенному там.
В одном воплощении конъюгат антитела против TF с препаратом
vcMMAE.
В одном воплощении конъюгат антитела против TF с препаратом
vcMMAE.
В одном воплощении конъюгат антитела против TF с препаратом
vcMMAE.
В одном воплощении конъюгат антитела против TF с препаратом
vcMMAE.
В одном воплощении конъюгат антитела против TF с препаратом
mcMMAF.
В одном воплощении конъюгат антитела против TF с препаратом
mcMMAF.
В одном воплощении конъюгат антитела против TF с препаратом
mcMMAF.
представлен представлен представлен представлен представлен представлен представлен
HuMab-TF-011·
HuMab-TF-098·
HuMab-TF-111·
HuMab-TF-114·
HuMab-TF-011·
HuMab-TF-098
HuMab-TF-111
- 17 034675
В одном воплощении конъюгат антитела против TF с препаратом представлен HuMab-TF-114mcMMAF.
В альтернативном воплощении антитело против TF конъюгировано с терапевтической молекулой, такой как цитотоксин, химиотерапевтический препарат, цитокин, иммуносупрессор или радиоизотоп. Такие конъюгаты именуются здесь иммуно-конъюгатами. Иммуноконъюгаты, которые включают один или несколько цитотоксинов, именуются иммунотоксинами.
Цитотоксином или цитотоксическим средством является любое вещество, которое губительно (например, уничтожает) для клеток. Подходящими терапевтическими средствами для получения иммуноконъюгатов настоящего изобретения являются таксол, цитохалазин В, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, майтанзин или его аналоги или производные, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин; калихеамицин или его аналоги или производные; антиметаболиты (как-то метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, флударабин, 5-фторурацил, декарбазин, гидроксимочевина, аспарагиназа, гемцитабин, кладрибин), алкилирующие реагенты (как-то мехлоретамин, тиоэпа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU), ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнитол, стрептозотоцин, дакарбазин (DTIC), прокарбазин, митомицин С, цисплатин и другие производные платины, как-то карбоплатин; а также дуокармицин А, дуокармицин SA, СС-1065 (иначе рахелмицин) или аналоги или производные СС-1065), доластатин, пирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепины (PDBs) или их аналоги, антибиотики (такие как дактиномицин (бывший актиномицин), блеомицин, даунорубицин (бывший дауномицин), доксорубицин, идарубицин, митрамицин, митомицин, митоксантрон, пликамицин, антрамицин (АМС)), антимитотические агенты (например, ингибиторы тубулина), как-то дифтерийный токсин и родственные ему молекулы (как-то цепь А дифтерийного токсина, её активные фрагменты и гибридные молекулы); токсины рицина (как-то рицин А или дегликозилированная цепь А рицина), холерный токсин, а Shiga-подобный токсин (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), токсин LT, токсин C3, Shiga-токсин, коклюшный токсин, столбнячный токсин, соевый ингибитор протеаз Bowman-Birk, экзотоксин Pseudomonas. алорин, сапорин, модекцин, геланин, цепь А абрина, цепь А модекцина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolacca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор из Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор из Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, токсины феномицин и еномицин. Другими подходящими для конъюгирования молекулами являются противомикробные/литические пептиды типа CLIP, магайнина 2, меллитина, цекропина и Р18; рибонуклеаза (РНКаза), ДНКаза I, стафилококковый энтеротоксин А, противовирусный белок фитолакка, дифтерийный токсин и эндотоксин Pseudomonas. Например, см. Pastan et al, Cell 47, 641 (1986); и Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for CLinicians 44, 43 (1994). Терапевтические средства, которые могут вводиться в комбинации с конъюгатами препарат-антитело против TF настоящего изобретения, как описано здесь, такие, например, как противораковые цитокины или хемокины, также являются кандидатами для терапевтических молекул, пригодных для конъюгации с антителами, раскрытыми в настоящем изобретении.
В другом альтернативном воплощении конъюгаты препарат-антитело против TF, раскрытые в настоящем изобретении, включают конъюгированную нуклеиновую кислоту или связанную с нуклеиновой кислотой молекулу. В одном таком воплощении конъюгированная нуклеиновая кислота представлена цитотоксической рибонуклеазой, антисмысловой нуклеиновой кислотой, молекулой ингибиторной РНК (например, молекулой siRNA) или иммуностимулирующей нуклеиновой кислотой (например, иммуностимулирующей молекулой ДНК, содержащей мотив CpG). В другом альтернативном воплощении антитело против TF по изобретению конъюгировано с аптамером или рибозимом вместо ауристатина или его функционального пептидного аналога или производного.
В другом альтернативном воплощении предусмотрены конъюгаты препарат-антитело против TF, содержащие одну или несколько меченых радиоизотопами аминокислот. Меченые радиоизотопами антитела против TF могут применяться для диагностических и для терапевтических целей (конъюгация с радиоактивно мечеными молекулами является другой возможной особенностью). Неограничивающие примеры меток для полипептидов включают 3Н, 14С, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 125I, 131I и 186Re. Способы получения меченых радиоизотопами аминокислот и связанных с ними пептидных производных известны (например, см. Junghans et al, in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2nd edition, Chafher and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) и US 4,681,581, US 4,735,210, US 5,101,827, US 5,102,990 (US RE35,500), US 5,648,471 и US 5,697,902. Например, радиоизотоп может быть конъюгирован с помощью хлорамина Т.
В одном воплощении антитело конъюгировано с радиоизотопом или с хелатом, содержащим радиоизотоп. Например, антитело может быть конъюгировано с хелатным линкером, например, DOTA, DTPA или тиуксетаном, что позволяет образование комплекса антитела с радиоизотопом. Антитело может также или альтернативно содержать или быть конъюгированным с одной или несколькими радиоактивно мечеными аминокислотами или другими радиомеченными молекулами. Радиоактивно меченое антитело против TF может применяться для диагностических и для терапевтических целей. Неограничивающие примеры радиоизотопов включают 3Н, 14С, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 125I, 111In, 131I, 186Re, 213Bs, 225Ac и 227Th.
- 18 034675
Антитела против TF также могут быть химически модифицированы ковалентной конъюгацией с полимером, например, для увеличения времени полужизни в кровотоке. Типичные полимеры и способы присоединения их к пептидам представлены, к примеру, в US 4,766,106, US 4,179,337, US 4,495,285 и US 4,609,546. Дополнительные полимеры включают полиоксиэтилированные полиоли и полиэтиленгликоль (PEG) (например, PEG с молекулярным весом от 1000 до 40000, как-то от 2000 до 20000). Их можно использовать, к примеру, если антитело против TF является фрагментом.
Для конъюгирования антител против TF, раскрытых в настоящем изобретении, с конъюгируемыми молекулами типа тех, что описаны выше, можно использовать любые известные способы, включая способы, описанные в Hunter et al, Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); и Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982). Такие антитела могут быть получены путем химической конъюгации другой молекулы с N-концевой или С-концевой стороной антитела против TF или его фрагмента (например, цепи Н или L антитела против TF) (например, см. Antibody Engineering Handbook, edited by Osamu Kanemitsu, published by Chijin Shokan (1994)). Такие конъюгированные производные антител также могут быть получены при конъюгации по внутренним остаткам или сахарам, если нужно.
Вещества можно конъюгировать непосредственно или косвенно с антителами против TF, раскрытыми в настоящем изобретении. Одним из примеров непрямого конъюгирования второго агента является конъюгация через молекулу спейсера с остатками цистеина или лизина в антителе. В одном воплощеним антитело против TF конъюгируют, через спейсер или линкер, с молекулой пролекарства, которая может быть активироваться in vivo до терапевтического препарата. Спейсеры или линкеры после введения расщепляются связанными с раковыми клетками ферментами или другими специфическими для опухоли условиями, при которых образуется активный препарат. Примеры таких пролекарственных технологий и линкеров описаны в WO 02083180, WO 2004043493, WO 2007018431, WO 2007089149, WO 2009017394 и WO 201062171 от Syntarga BV et al. (все они включены сюда в виде ссылки). Подходящие технологии антитела-пролекарства и аналоги дуокармицина также приведены в U.S. Patent No. 6,989,452 (Medarex) (включенном сюда в виде ссылки).
В одном воплощении антитело против TF настоящего изобретения присоединяется к хелаторному линкеру, например, тиуксетану, что позволяет конъюгировать антитело с радиоизотопом.
В следующем аспекте изобретение касается экспрессирующих векторов, кодирующих антитела изобретения. Например, если антитело против TF настоящего изобретения конъюгируют с другой терапевтической молекулой, чем ауристатин или его функциональный пептидный аналог или производное. Такие экспрессирующие вектора в одном воплощении могут применяться для экспрессии антител против TF настоящего изобретения, которые затем можно конъюгировать с молекулой, как описано здесь.
В одном воплощении экспрессирующий вектор изобретения содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую одну или несколько аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1-4, 5-8, 33-36, 37-40, 41-44, 45-48, 73-76 и 77-80.
В другом воплощении экспрессирующий вектор изобретения содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую одну или несколько аминокислотных последовательностей VH, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1, 5, 37 и 33.
В одном предпочтительном воплощении экспрессирующий вектор изобретения содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую одну или несколько аминокислотных последовательностей CDR3 VH, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO 4, 8, 40 и 36.
В другом предпочтительном воплощении экспрессирующий вектор изобретения содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую одну или несколько аминокислотных последовательностей VL, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 41, 45, 77 и 73.
В другом воплощении экспрессирующий вектор изобретения содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую одну или несколько аминокислотных последовательностей CDR3 VL, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 44, 48, 80 и 76.
В предпочтительном воплощении экспрессирующий вектор изобретения содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую варианты одной или нескольких из вышеприведенных аминокислотных последовательностей, причем данные варианты содержат не более 25 модификаций аминокислот, как-то 20, например, не более 15, 14, 13, 12 или 11 модификаций аминокислот, как-то 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 модификацию аминокислот, как-то делеций или вставок, предпочтительно замен типа консервативных замен, или же они по меньшей мере на 80% идентичны любой из данных последовательностей, например, по меньшей мере на 85%, или на 90%, или на 95% идентичны, как-то на 96%, или на 97%, или на 98%, или на 99% идентичны любой из вышеприведенных аминокислотных последовательностей.
В следующем воплощении экспрессирующий вектор дополнительно содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую константную область легкой цепи, тяжелой цепи или же легкой и тяжелой цепи антитела, например, человеческого антитела.
Такие экспрессирующие вектора могут применяться для рекомбинантного получения антител изобретения.
Экспрессирующим вектором в контексте настоящего изобретения может быть любой подходящий
- 19 034675 вектор, включая хромосомные, нехромосомные вектора и вектора из синтетических нуклеиновых кислот (последовательностей нуклеиновой кислоты, содержащих подходящий набор контролирующих экспрессию элементов). Примеры таких векторов включают производные SV40, бактериальные плазмиды, фаговые ДНК, бакуловирусы, плазмиды дрожжей, вектора, полученные комбинацией плазмид и фаговой ДНК, и вектора из вирусных нуклеиновых кислот (РНК или ДНК). В одном воплощении кодирующая антитело против TF нуклеиновая кислота содержится в голом векторе из ДНК или РНК, включая, к примеру, линейные экспрессирующие элементы (как описано, к примеру, в Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), сжатые вектора из нуклеиновой кислоты (как описано, к примеру, в US 6,077, 835 и/или WO 00/70087), плазмидные вектора типа pBR322, pUC 19/18 или pUC 118/119, вектора из нуклеиновой кислоты минимального размера midge (как описано, к примеру, в Schakowski et al, Mol Ther 3, 793-800 (2001)), или в виде осажденной векторной конструкции из нуклеиновой кислоты, например, осажденной СаРО4 конструкции (как описано, к примеру, в WO 00/46147; Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986); Wigler et al., Cell 14, 725 (1978); и Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)). Такие вектора из нуклеиновой кислоты и их применение хорошо известны (например, см. US 5,589,466 и US 5,973,972).
В одном воплощении вектор подходит для экспрессии антител против TF в бактериальных клетках. Примеры таких векторов включают такие экспрессирующие вектора, как BlueScript (Stratagene), вектора pIN (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), вектора рЕТ (Novagen, Madison WI) и др.).
Экспрессирующим вектором также или альтернативно может быть вектор, подходящий для экспрессии в дрожжевой системе. Можно использовать любой вектор, подходящий для экспрессии в дрожжевой системе. Подходящими векторами являются, к примеру, вектора, содержащие конститутивные или индуцибельные промоторы, как-то альфа-фактора, алкогольоксидазы и PGH (см. обзоры в F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience, New York (1987); и Grant et al., Methods in Enzymol. 153, 516-544 (1987)).
Нуклеиновая кислота и/или вектор также может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность секреции/локализации, которая может направить полипептид, както возникающую полипептидную цепь, в периплаз-матическое пространство или в среду клеточной культуры. Такие последовательности известны и включают лидера секреции или сигнальные пептиды, последовательности, направляющие в органеллы (например, последовательности ядерной локализации, сигналы удержания в ER, последовательности транспорта в митохондрии, последовательности транспорта в хлоропласты), последовательности мембранной локализации/ якорные последовательности (например, последовательности остановки переноса, якорные последовательности GPI) и др.
В экспрессирующем векторе изобретения нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело против TF, могут содержать или быть связаны с любым подходящим промотором, энхансером и другими способствующими экспрессии элементами. Примеры таких элементов включают сильные промоторы экспрессии (например, промотор/энхансер IE вируса CMV человека, а также промоторы RSV, SV40, SL3-3, MMTV и LTR вируса HIV), эффективные последовательности терминации поли(А), начало репликации для получения плазмид в Е. coli, гены устойчивости к антибиотикам в качестве селектируемых маркеров и/или удобные сайты клонирования (например, полилинкеры). Нуклеиновые кислоты также могут содержать индуцибельный промотор в отличие от конститутивного промотора типа IE CMV (специалистам должно быть извенстно, что такие термины фактически служат для описания степени экспрессии генов при определенных условиях).
В одном воплощении экспрессирующий вектор, кодирующий антитело против TF, может быть расположен и/или доставлен в клетки хозяина или организм животного при помощи вирусного вектора.
В следующем аспекте изобретение касается рекомбинантных эукариотических или прокариотических клеток хозяина типа трансфектомы, которые вырабатывают приведенные здесь антитела против TF по изобретению или биспецифичные молекулы по изобретению. Примеры клеток хозяина включают дрожжевые, бактериальные клетки и клетки млекопитающих, как-то клетки СНО или HEK. Например, в одном воплощении настоящего изобретения предусмотрены клетки, содержащие нуклеиновую кислоту, стабильно встроенную в клеточный геном и содержащую последовательность, которая кодирует экспрессию антитела против TF настоящего изобретения. В другом воплощении настоящего изобретения предусмотрены клетки, содержащие не встроенную нуклеиновую кислоту типа плазмиды, космиды, фагемиды или линейного экспрессирующего элемента, которая содержит последовательность, кодирующую экспрессию антитела против TF по изобретению.
В другом аспекте изобретение касается гибридомы, вырабатывающей приведенные здесь антитела изобретения. В следующем аспекте изобретение касается трансгенных животных, содержащих нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь человека, причем животные или растения вырабатывают антитела по изобретению.
Получение таких гибридом и трансгенных животных было описано выше.
В другом аспекте изобретение касается способа получения антител против TF по изобретению, который включает стадии:
a) культивирования гибридомы или клеток хозяина по изобретению, как описано выше, и
- 20 034675
b) очистки антител изобретения из культуральной среды, и необязательно
c) трансформации антител против TF в ADC.
Фармацевтические композиции
После очистки конъюгатов препарат-антитело против TF они могут быть заключены в фармацевтические композиции с помощью хорошо известных фармацевтических носителей или наполнителей.
Фармацевтические композиции могут быть составлены с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, а также с любыми другими известными вспомогательными веществами и наполнителями в соответствии со стандартными методами типа тех, что изложены в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995.
Фармацевтически приемлемые носители или наполнители, а также любые другие известные вспомогательные вещества и разбавители должны подходить для конъюгатов антитело-препарат настоящего изобретения и выбранного способа введения. Пригодность для носителей и других компонентов фармацевтической композиции определяется на основании отсутствия значительного отрицательного воздействия на требуемые биологические свойства выбранного соединения или фармацевтической композиции настоящего изобретения (например, не столь значительного воздействия (относительного ингибирования на 10% или меньше, относительного ингибирования на 5% или меньше и т.д.)) или на связывание антигена.
Фармацевтическая композиция настоящего изобретения также может включать разбавители, заполнители, соли, буфера, детергенты (например, неионные детергенты типа Tween-20 или Tween-80), стабилизаторы (например, сахара или свободные от белка аминокислоты), консерванты, фиксаторы тканей, солюбилизирующие вещества и/или другие материалы, подходящие для включения в фармацевтическую композицию.
Особенно хорошей мишенью для конъюгатов препарат-антитело против TF по изобретению могут быть раковые клетки, суперэкспрессирующие TF, так как может связываться больше антител на клетку. Так, в одном воплощении больные раком, подлежащие лечению конъюгатом препарат-антитело против TF по изобретению, представлены больными, например, раком поджелудочной железы, раком легких или колоректальным раком, у которых в опухолевых клетках установлено наличие одной или нескольких мутаций в K-ras и/или одной или нескольких мутаций в р53. Экспрессия TF находится под контролем двух крупнейших трансформирующих событий, вызывающих прогрессирование заболевания (активации онкогена K-ras и инактивации супрессора опухолей р53) зависимым от MEK/митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) и фосфатидилинозитол-3'-киназы (PI3K) образом (Yu et al. (2005) Blood 105:1734).
Фактический уровень дозы конъюгата антитело-препарат в фармацевтических композициях настоящего изобретения может варьироваться с тем, чтобы получить количество конъюгата антителопрепарат, эффективное для достижения требуемого терапевтического ответа для определенного пациента, композиции и способа применения, но не быть токсичным для пациента. Выбранный уровень дозы зависит от ряда фармакокинетических факторов, включая активность используемой конкретной композиции настоящего изобретения, способа применения, времени введения, скорости выведения используемого конкретного соединения, продолжительности лечения, других лекарственных препаратов и/или материалов, используемых в комбинации с данной композицией, возраста, пола, веса, заболевания, общего состояния здоровья и предыдущей медицинской истории пациента, подлежащего лечению, и других подобных факторов, хорошо известных в области медицины.
Фармацевтическая композиция может вводиться любым подходящим способом. Подходящие способы введения конъюгатов антитело-препарат настоящего изобретения хорошо известны и могут быть выбраны рядовым специалистом.
В одном воплощении фармацевтическая композиция настоящего изобретения вводится парентерально.
Выражения парентеральное введение и вводится парентерально в настоящем изобретении означают другие способы введения, чем энтеральное и топическое, обычно посредством инъекции, и включают эпидермальное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интратекальное, интракапсулярное, внутриглазничное, внутри-сердечное, внутрикожное, внутрибрюшинное, внутрисухожильное, транстрахеальное, подкожное, субкутикулярное, внутрисуставное, субкапсулярное, субарахноидальное, интраспинальное, внутричерепное, внутригрудное, эпидуральное и интрастернальное введение и вливание.
В одном воплощении фармацевтическая композиция вводится посредством внутривенного или подкожного введения или вливания.
Фармацевтически приемлемые носители включают всевозможные подходящие растворители, диспергирующие среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, средства поддержания изотоничности, антиоксиданты, замедляющие всасывание средства и др., которые физиологически совместимы с конъюгатами антитело-препарат настоящего изобретения.
Примерами подходящих водных и неводных носителей, которые можно использовать в фармацевтических композициях настоящего изобретения, являются вода, физраствор, фосфатно-солевой буфер, этанол, декстроза, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и др.) и подхо- 21 034675 дящие их смеси, растительные масла, как-то оливковое масло, кукурузное масло, арахисовое масло, хлопковое масло и кунжутное масло, коллоидные растворы карбоксиметилцеллюлозы, трагакантовая камедь и органические эфиры для инъекций типа этилолеата и/или различные буфера. Другие носители хорошо известны в области фармацевтики.
Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления ex temporo стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Применение таких сред и веществ для фармацевтически активных субстанций хорошо известно. За исключением случаев, когда какая-то обычная среда или вещество несовместимы с конъюгатом препаратантитело против TF настоящего изобретения, предусмотрено их применение в фармацевтических композициях настоящего изобретения.
Надлежащая текучесть может поддерживаться, к примеру, за счет покрывающих материалов, таких как лецитин, поддерживанием требуемого размера частиц в случае дисперсий и использованием поверхностно-активных веществ.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения также могут содержать фармацевтически приемлемые антиоксиданты, например, (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеин гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и др.; (2) жирорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутиловый гидроксианизол (ВНА), бутиловый гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и др.; и (3) хелаторы металлов, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), сорбитол, винная кислота, фосфорная кислота и др.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения также могут содержать средства поддержания изотоничности, такие как сахара, полиспирты, как-то маннитол, сорбитол, глицерин или хлористый натрий в композициях.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения также могут содержать одно или несколько вспомогательных веществ, подходящих для выбранного способа применения, таких как консерванты, увлажняющие вещества, эмульгирующие вещества, диспергирующие вещества, консерванты или буфера, которые могут увеличить срок годности или эффективность фармацевтической композиции. Конъюгаты препарат-антитело против TF настоящего изобретения могут быть приготовлены с носителями, которые будут предохранять от быстрого высвобождения соединения, например, составы с контролируемым высвобождением, включая импланты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Такие носители могут включать желатин, глицерилмоностеарат, глицерилдистеарат, биоразложимые биосовместимые полимеры типа этиленвинилацетата, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, поли-ортоэфиры и полимеры молочной кислоты сами по себе или вместе с воском или другими материалами, хорошо известными в данной области. Способы получения таких составов хорошо известны специалистам. Например, см. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
В одном воплощении конъюгаты препарат-антитело против TF настоящего изобретения могут быть заключены в лекарственную форму, обеспечивающую надлежащее распределение in vivo. Фармацевтически приемлемые носители для парентерального введения включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления ex temporo стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Применение таких сред и веществ для фармацевтически активных субстанций известно в данной области. За исключением случаев, когда какая-то обычная среда или вещество несовместимы с активным соединением, предусматривается их применение в фармацевтических композициях настоящего изобретения. В композиции также могут входить дополнительные активные соединения.
Фармацевтические композиции для инъекций, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях изготовления и хранения. Композиции могут быть составлены в виде раствора, микроэмульсии, липосом или других упорядоченных структур, подходящий для высоких концентраций препарата. Носителем может быть водный или неводный растворитель или диспергирующая среда, содержащая, к примеру, воду, этанол, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и подходящие их смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические эфиры для инъекций, например, этилолеат. Надлежащая текучесть может поддерживаться, к примеру, с помощью таких покрытий, как лецитин, поддержанием требуемого размера частиц в случае дисперсий и применением поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительно следует включать в композицию изотонические вещества, к примеру, сахара, полиспирты, как-то глицерин, маннитол, сорбитол или хлористый натрий. Пролонгированное всасывание композиций для инъекций может обеспечиваться включением в композицию вещества, замедляющего всасывание, к примеру, соли моностеарата и желатина.
Стерильные растворы для инъекций могут быть получены введением конъюгата препарат-антитело против TF в требуемом количестве в подходящий растворитель с одним или несколькими ингредиентами, например, перечисленными выше, как положено, с последующей стерилизацией микрофильтрованием. Обычно дисперсии получают путем введения конъюгата препарат-антитело против TF в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие нужные ингредиенты, например, из пе- 22 034675 речисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций примерами методов получения являются вакуумная сушка и замораживание-высушивание (лиофилизации), дающие порошок активного вещества плюс дополнительных нужных ингредиентов из предварительно стерилизованного фильтрованием раствора.
Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может содержать один конъюгат препаратантитело против TF настоящего изобретения или несколько конъюгатов препарат-антитело против TF настоящего изобретения.
Как описано выше, в другом аспекте, изобретение касается приведенных здесь конъюгатов препарат-антитело против TF по изобретению для применения в качестве лекарств.
Конъюгаты препарат-антитело против TF по изобретению могут применяться для различных целей. В частности, конъюгаты препарат-антитело против TF по изобретению могут применяться для лечения различных форм рака. В одном аспекте конъюгаты препарат-антитело против TF по изобретению применяются для лечения различных твердых форм рака, как-то опухолей центральной нервной системы, рака головы и шеи, рака легких (например, немелкоклеточного рака легких), рака молочной железы (например, втройне отрицательного рака молочной железы), рака пищевода, рака желудка, рака печени и желчевыводящих протоков, рака поджелудочной железы, колоректального рака, рака мочевого пузыря, рака почек, рака предстательной железы, рака эндометрия, рака яичников, злокачественной меланомы, саркомы (мягких тканей, например, костей и мышц), опухолей неизвестного первичного происхождения (т.е. неизвестных первичных), лейкемии, рака костного мозга (как-то множественной миеломы), острой лимфобластной лейкемии, хронической лимфобластной лейкемии и неходжкинской лимфомы, острой миелоидной лейкемии (AML), рака кожи, глиомы, рака головного мозга, матки и прямой кишки.
Кроме того, с помощью конъюгатов препарат-антитело против TF настоящего изобретения можно лечить аутоиммунное воспаление, как-то миопатии или рассеянный склероз.
Также по настоящему изобретению можно лечить связанные с раком нарушения гемостаза.
Далее, с помощью антител против TF настоящего изобретения можно лечить такие воспалительные заболевания, как миопатии, ревматоидный артрит, остеоартрит, анкилозирующий спондилит, подагра, спондилоартропатия, болезнь Бехтерева, синдром Рейтера, псориатическая артропатия, энтеропатический спондилит, ювенильная артропатия, реактивная артропатия, инфекционный или постинфекционный артрит, туберкулезный артрит, вирусный артрит, грибковый артрит, сифилитический артрит, гломерулонефрит, терминальная стадия почечной недостаточности, системная красная волчанка, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительная болезнь кишечника, кистозный фиброз, хроническая обструктивная болезнь легких (COPD), астма, аллергическая астма, бронхит, острый бронхиолит, хронический бронхиолит, идиопатический фиброз легких или рассеянный склероз.
Также с помощью конъюгатов препарат-антитело против TF можно лечить сосудистые заболевания, такие как рестеноз сосудов, сосудистые заболевания миокарда, сосудистые заболевания головного мозга, ретинопатия и дегенерация желтого пятна, включая, без ограничения, мокнущую AMD.
Конъюгаты препарат-антитело против TF настоящего изобретения могут быть полезными при лечении пациентов с риском сердечно-сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз, гипертония, диабет, дислипидемия и острый коронарный синдром, включая, без ограничения, острый инфаркт миокарда, инсульт.
Конъюгаты препарат-антитело против TF настоящего изобретения также могут быть полезными для подавления тромбозова, как-то DVT, почечной эмболии, легочной эмболии, артериального тромбоза, или для лечения тромбозов, возникающих после хирургических операций на артериях, шунтирования периферических сосудов или аортокоронарного шунтирования, артериовенозного шунтирования, удале ния имплантов, таких как стенты или катетеры.
Конъюгаты препарат-антитело против TF настоящего изобретения также могут быть полезными для подавления ишемического реперфузионного повреждения почек.
Конъюгаты препарат-антитело против TF настоящего изобретения также могут быть полезными для лечения гиперлипопротеинемии или гиперпаратиреоза.
Конъюгаты препарат-антитело против TF настоящего изобретения также могут быть полезными для лечения васкулита, ANCA-положительного васкулита или болезни Бехчета.
Конъюгаты препарат-антитело против TF настоящего изобретения также могут быть полезными для блокирования травматической дыхательной недостаточности, как-то острого респираторного дист ресс-синдрома или острого повреждения легких.
Конъюгаты препарат-антитело против TF настоящего изобретения также могут быть полезными для блокирования вызванных инфекцией дисфункций органов, как-то почечной недостаточности, остро го респираторного дистресс-синдрома или острого повреждения легких.
Конъюгаты препарат-антитело против TF настоящего изобретения также могут быть полезными для лечения различных тромбоэмболических заболеваний, например, возникающих при ангиопластике, инфаркте миокарда, нестабильной стенокардии и стенозе коронарных артерий.
Конъюгаты препарат-антитело против TF настоящего изобретения также могут быть полезными при профилактическом лечении опосредованных TF осложнений таких системных инфекций, как сепсис
- 23 034675 или пневмония.
Конъюгаты препарат-антитело против TF настоящего изобретения также могут быть полезными при профилактическом лечении пациентов с атеросклеротическими сосудами, подверженных риску тромбоза.
Конъюгаты препарат-антитело против TF настоящего изобретения также могут быть полезными для лечения реакции трансплантат против хозяина.
Конъюгаты препарат-антитело против TF настоящего изобретения также могут быть полезными для усиления приживления β-клеток при трансплантации островков, для предотвращения васкулопатии сердечных аллотрансплантатов (CAV) и для предотвращения острого отторжения трансплантатов.
Кроме того, изобретение касается способа подавления роста и/или пролиферации опухолевых клеток, экспрессирующих TF, который включает введение нуждающемуся в этом индивиду конъюгата препарат-антитело против TF по изобретению. В одном воплощении такие опухолевые клетки связаны с раком, таким как рак предстательной железы, рак легких (например, немелкоклеточный рак легких), рак молочной железы (например, втройне отрицательный рак молочной железы), колоректальный рак (например, метастатический колоректальный рак), рак поджелудочной железы, рак эндометрия, рак яичников, кожная меланома, лейкемия, рак костного мозга (например, множественная миелома), острая лимфобластная лейкемия, хроническая лимфобластная лейкемия и неходжкинская лимфома, рак кожи, рак простаты, глиома, рак головного мозга, почек, матки, мочевого пузыря, острой миелоидной лейкемии (AML) и рак прямой кишки.
Изобретение также касается применения конъюгатов препарат-антитело против TF, связывающихся с TF человека, для изготовления лекарств для лечения рака, как-то одного из конкретных раковых заболеваний, приведенных выше.
В одном воплощении отбор пациентов для лечения конъюгатами препарат-антитело против TF основывается на уровне TF в моче и/или крови. В предпочтительном воплощении лечению подлежат пациенты с относительно высоким уровнем TF в моче и/или крови. Например, лечению подлежат пациенты, у которых уровень TF в моче составляет более 20 нг/мл, как-то более 40 нг/мл, например, более 100 нг/мл, как-то более 200 нг/мл. При этом уровень TF в сыворотке пациентов может составлять более 100 пг/мл, как-то более 200 пг/мл. Его можно определить, например, методом ELISA. Методы для этого включают, без ограничения, описанные ниже в связи с диагностическим применением.
Тем не менее, в рамки настоящего изобретения также входит лечение конъюгатами препаратантитело против TF настоящего изобретения и пациентов с более низким уровнем TF в моче и/или крови.
В одном воплощении отбор пациентов, подлежащих лечению конъюгатами препарат-антитело против TF настоящего изобретения, может основываться на уровне экспрессии TF. Уровень экспрессии TF можно оценить путем обработки пациентов радиоактивно меченым антителом против TF с последующим измерением уровня радиоактивности у пациентов. Радиоактивно меченое антитело против TF может быть представлено антителом против TF, описанным в настоящем изобретении, т.е. антителом из описанных здесь конъюгатов препарат-антитело против TF, или другим антителом против TF. Примерами радиоактивных меток могут быть любые из тех, что описаны выше в связи с радиоактивным мечением антител. Методы для этого включают, без ограничения, описанные ниже в связи с диагностическим применением.
В другом воплощении способов лечения по настоящему изобретению во время терапии отслеживается эффективность лечения, например, в заданные моменты времени. В одном воплощении эффективность можно отслеживать по измерению уровня TF в моче или крови, к примеру, методом ELISA. Методы для этого включают, без ограничения, описанные ниже в связи с диагностическим применением. В другом воплощении эффективность может определяться путем визуализации пораженного участка, например, по одному или нескольким снимкам методом РЕТ-СТ, к примеру, с помощью меченого антитела против TF, как-то меченого антитела против TF, описанного в настоящем изобретении. Кроме того, меченые антитела против TF, как-то раскрытые здесь меченые антитела 011, 098, 114 и 111 против TF можно использовать для выявления TF-продуцирующих опухолей, например, методом РЕТ-СТ.
Схемы дозировки в вышеприведенных способах лечения и применения подбираются так, чтобы обеспечить оптимальный требуемый терапевтический ответ. Например, можно вводить однократную дозу, можно вводить несколько дробных доз по времени или же можно пропорционально уменьшать или увеличивать дозу, исходя из конкретной терапевтической ситуации. Парентеральные композиции можно составлять в виде дозовых форм для легкости введения и однородности дозировки. Дозовая форма в настоящем изобретении относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве стандартной дозировки для подлежащих лечению субъектов; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное на получение требуемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для дозовых форм настоящего изобретения определяется и напрямую зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и требуемого конкретного терапевтического эффекта, и (b) ограничений, существующих в области составления рецептур такого активного соединения для лечения чувствительности у индивидов.
Эффективные дозировки и схемы дозировки для конъюгатов препарат-антитело против TF зависят
- 24 034675 от подлежащего лечению заболевания и может быть установлены специалистами. Типичный, без ограничения, диапазон для терапевтически эффективного количества соединения настоящего изобретения составляет 0,1-100 мг/кг, как-то 0,1-50 мг/кг, например, 0,1-20 мг/кг, как-то 0,1-10 мг/кг, как-то 0,5-5 мг/кг, например, 5 мг/кг, как-то 4 мг/кг или 3 мг/кг или 2 мг/кг или 1 мг/кг или 0,5 мг/кг или 0,3 мг/кг. Типичный, без ограничения, диапазон для терапевтически эффективного количества конъюгата препарат-антитело против TF настоящего изобретения составляет 0,02-30 мг/кг, как-то 0,1-20 мг/кг или 0,5-10 мг/кг или 0,5-5 мг/кг, например, 1-2 мг/кг, в частности, для приведенных здесь антител 011, 098, 114 или 111.
Врач с рядовой квалификацией в данной области может легко установить и прописать эффективное количество требуемой фармацевтической композиции. Например, врач может начать с дозы конъюгата препарат-антитело против TF, используемого в фармацевтической композиции, на меньшем уровне, чем это требуется для получения терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозу, пока не будет достигнут требуемый эффект. В общем, подходящая суточная доза композиции настоящего изобретения должна быть такой, чтобы количество соединения составляло самую низкую дозу, достаточную для получения терапевтического эффекта. Такая эффективная доза будет в целом зависеть от факторов, описанных выше. Введение может осуществляться, например, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно или подкожно, например, проксимально к местонахождению мишени. Если нужно, эффективная суточная доза фармацевтической композиции может вводиться в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более дробных доз, вводимых по отдельности через соответствующие промежутки в течение суток, необязательно в виде дозовых форм. Хотя конъюгаты препарат-антитело против TF настоящего изобретения можно вводить и сами по себе, однако предпочтительно конъюгаты препарат-антитело против TF вводятся в виде фармацевтической композиции, как описано выше.
В одном воплощении конъюгаты препарат-антитело против TF можно вводить вливанием в еженедельной дозе от 10 до 1500 мг/м2, как-то от 30 до 1500 мг/м2, или от 50 до 1000 мг/м2, или от 10 до 500 мг/м2, или от 100 до 300 мг/м2. Такое введение можно повторять, например, от 1 до 8 раз, как-то от 3 до 5 раз. Введение может осуществляться путем непрерывного вливания на протяжении от 2 до 24 ч, как-то от 2 до 12 ч.
В одном воплощении конъюгаты препарат-антитело против TF вводятся путем вливания каждую третью неделю в дозе от 30 до 1500 мг/м2, как-то от 50 до 1000 мг/м2 или от 100 до 300 мг/м2. Такое введение можно повторять, например, от 1 до 8 раз, как-то от 3 до 5 раз. Введение может осуществляться путем непрерывного вливания на протяжении от 2 до 24 ч, как-то от 2 до 12 ч.
В одном воплощении конъюгаты препарат-антитело против TF вводятся путем медленного непрерывного вливания на протяжении длительного времени, как-то более 24 ч, для снижения токсических побочных эффектов.
В одном воплощении конъюгаты препарат-антитело против TF можно вводить в еженедельной дозе от 50 мг до 2000 мг, как-то, к примеру 50, 100, 200, 300, 500, 700, 1000, 1500 или 2000 мг, вплоть до 16 раз, как-то от 4 до 10 раз, как-то от 4 до 6 раз. Введение может осуществляться путем непрерывного вливания на протяжении от 2 до 24 ч, как-то от 2 до 12 ч. Такая схема может повторяться один или несколько раз по необходимости, например, через 6 месяцев или 12 месяцев. Дозировка может определяться или подбираться путем измерения количества конъюгата препарат-антитело против TF настоящего изобретения в крови после введения, например, отбирая биологические образцы и используя антиидиотипические антитела, мишенью которых является антиген-связывающий участок конъюгатов препарат-антитело против TF настоящего изобретения.
В одном воплощении конъюгаты препарат-антитело против TF вводятся в качестве поддерживающей терапии, к примеру, раз в неделю на протяжении 6 месяцев или больше.
В одном воплощении конъюгаты препарат-антитело против TF вводятся по схеме, включающей одно вливание конъюгата препарат-антитело против TF настоящего изобретения с последующим вливанием антитела против TF настоящего изобретения, как-то раскрытого здесь антитела 011, 098, 114 или 111, содержащего радиоактивный изотоп. Такая схема может быть повторена, например, через 7-9 дней.
В качестве неограничивающего примера лечение по настоящему изобретению может проводиться при введении конъюгата препарат-антитело против TF настоящего изобретения раз в неделю, раз в 2 недели, раз в 3 недели или раз в месяц в количестве 0,1-100 мг/мг, как-то 0,3-3 мг/мг, например, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/мг в день, по меньшей мере в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 день или же по меньшей мере в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 неделю или в некоторых случаях 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 неделю после начала лечения или же в любой комбинации, используя однократные или дробные дозы через каждые 24, 12, 8, 6, 4 или 2 ч или же в любой комбинации.
Эффективное количество для противоопухолевой терапии также можно измерить по его способности стабилизировать течение болезни. Способность соединения к подавлению рака можно оценить на модельной системе у животных, прогнозирующей эффективность на опухолях человека. С другой сторо
- 25 034675 ны, это свойство композиции можно оценить, исследуя способность соединения ингибировать клеточный рост или индуцировать апоптоз методами in vitro, известными практикующим специалистам. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшать размеры опухоли либо иным образом ослаблять симптомы у субъекта. Рядовой специалист сможет определить такие количества, исходя из таких факторов, как размер субъекта, тяжесть симптомов у субъекта и конкретная композиция или выбранный способ введения.
Конъюгаты препарат-антитело против TF можно вводить профилактически для уменьшения риска развития рака, замедления начала возникновения события при прогрессировании рака и/или снижения риска рецидива при ремиссии рака. Это может быть особенно полезно тем пациентам, у которых трудно локализовать опухоль, наличие которой известно по другим биологическим факторам.
Конъюгаты препарат-антитело против TF также можно вводить при комбинированной терапии, т.е. в сочетании с другими терапевтическими средствами, уместными для подлежащего лечению заболевания. Соответственно, в одном воплощении лечебный конъюгат препарат-антитело против TF предназначен для комбинирования с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, как-то цитотоксическими, химиотерапевтическими или антиангиогенными средствами.
Такое комбинированное введение может быть одновременным, раздельным или последовательным. При одновременном введении средства вводятся в виде одной композиции или в виде отдельных композиций, как получится. Таким образом, настоящим изобретением также предусмотрены способы лечения заболеваний с участием клеток, экспрессирующих TF, как описано выше, которые включают введение конъюгата препарат-антитело против TF настоящего изобретения в сочетании с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, как описано ниже.
В одном воплощении настоящим изобретением предусмотрен способ лечения заболеваний с участием клеток, экспрессирующих TF у субъекта, который включает введение терапевтически эффективного количества конъюгата препарат-антитело против TF настоящего изобретения и по меньшей мере одного химиотерапевтического средства нуждающемуся в этом субъекту.
В одном воплощении настоящим изобретением предусмотрен способ лечения или предотвращения рака, который включает введение терапевтически эффективного количества конъюгата препаратантитело против TF настоящего изобретения и по меньшей мере одного химиотерапевтического средства нуждающемуся в этом субъекту.
В одном воплощении настоящим изобретением предусмотрено применение конъюгата препаратантитело против TF настоящего изобретения для изготовления фармацевтической композиции, предназначенной для введения по меньшей мере с одним химиотерапевтическим средством для лечения рака.
В одном воплощении такое химиотерапевтическое средство может быть выбрано из антиметаболитов, таких как метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, флударабин, 5-фторурацил, декарбазин, гидроксимочевина, аспарагиназа, гемцитабин, кладрибин и аналогичных средств.
В одном воплощении такое химиотерапевтическое средство может быть выбрано из алкилирующих средств, таких как мехлорэтамин, тиоэпа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU), ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнитол, стрептозотоцин, дакарбазин (DTIC), прокарбазин, митомицин С, цисплатин и другие производные платины типа карбоплатина и аналогичных средств.
В одном воплощении такое химиотерапевтическое средство может быть выбрано из антимитотических средств типа таксанов, например, доцетакселя, паклитакселя, и алкалоидов барвинка, к примеру, виндесина, винкристина, винбластина и винорелбина.
В одном воплощении такое химиотерапевтическое средство может быть выбрано из ингибиторов топоизомеразы, таких как топотекан или иринотекан.
В одном воплощении такое химиотерапевтическое средство может быть выбрано из цитостатических препаратов, таких как этопозид и тенипозид.
В одном воплощении такое химиотерапевтическое средство может быть выбрано из ингибиторов факторов роста, как-то ингибиторов ErbB 1 (EGFR) (таких как иресса, эрбитукс (цетуксимаб), тарцева и аналогичные средства), ингибиторов ErbB2 (Her2/neu) (таких как герцептин и другие подобные средства) и аналогичных средств.
В одном воплощении такое химиотерапевтическое средство может быть выбрано из ингибиторов тирозинкиназы, таких как иматиниб (Glivec, Gleevec STI571), лапатиниб, PTK787/ZK222584 и аналогичные средства.
В одном воплощении настоящим изобретением предусмотрен способ лечения заболеваний с участием клеток, экспрессирующих TF у субъекта, который включает введение терапевтически эффективного количества конъюгата препарат-антитело против TF настоящего изобретения и по меньшей мере одного ингибитора ангиогенеза, неоваскуляризациии и/или иной васкуляризации нуждающемуся в этом субъекту.
Примерами таких игибиторов ангиогенеза являются ингибиторы урокиназы, ингибиторы матриксных металлопротеаз (как-то маримастат, неовастат, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 и аналогичные средства), ингибиторы миграции и пролиферации эндотелиальных клеток (как-то TNP-470, скваламин, 2метоксиэстрадиол, комбрета-статины, эндостатин, ангиостатин, пеницилламин, SCH66336 (Schering
- 26 034675
Plough Corp., Madison, NJ), R115777 (Janssen Pharmaceutica Inc, Titusville, NJ) и аналогичные средства), антагонисты ангиогенных факторов роста (как-то ZD6474, SU6668, антитела против ангиогенных агентов и/или их рецепторов (типа VEGF, bFGF и ангиопоэтина-1), талидомид, аналоги талидомида (как-то СС-5013), Sugen 5416, SU5402, антиангиогенные рибозимы (например, ангиозим), интерферон-а (например, интерферон-а2а), сурамин и аналогичные средства), ингибиторы киназы VEGF-R и ингибиторы других антиангиогенных тирозинкиназ (например, SU011248), ингибиторы эндотелиального интегрина/сигнального пути выживания (как-то витаксин и аналогичные средства), антагонисты/хелаторы меди (как-то тетратиомолибдат, каптоприл и аналогичные средства), карбоксиамидо-триазол (CAI), АВТ-627, СМ101, интерлейкин-12 (IL-12), IM862, PNU145156E, а также нуклеотидные молекулы, ингибирующие ангиогенез (как-то антисмысловая ДНК VEGF, кДНК, кодирующая ангиостатин, кДНК, кодирующая р53, и кДНК, кодирующая дефектный рецептор-2 VEGF) и аналогичные средства.
Другими примерами таких ингибиторов ангиогенеза, неоваскуляризации и/или иной васкуляризации являются антиангиогенные производные гепарина и родственные им молекулы (например, гепариназа III), темозоломид, NK4, фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (MIF), ингибиторы циклооксигеназы-2, ингибиторы индуцируемого гипоксией фактора 1, антиангиогенные изофлавоны сои, олтипраз, фумагиллин и его аналоги, аналоги соматостатина, пентозанполисульфат, текогалан натрия, дальтепарин, тумстатин, тромбоспондин, NM-3, комбрестатин, канстатин, авастатин, антитела против других соответствующих мишеней (такие как mAbs против a-v/β-β интегрина и против кининостатина) и аналогичные средства.
В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации с конъюгатом препарат-антитело против TF настоящего изобретения для лечения вышеописанных заболеваний может представлять собой противораковый иммуноген, как-то раковый антиген/опухолевый антиген (например, молекула адгезии эпителиальных клеток (EpCAM/TACSTD1), муцин 1 (MUC1), карциноэмбриональный антиген (СЕА), опухолевый гликопротеин 72 (TAG-72), g100, мелан-А, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7, связанные с раком вирусные вакцины (например, вакцины от папилломавируса человека), опухолевые белки теплового шока и аналогичные средства. Ряд других подходящих раковых антигенов/опухолевых антигенов, описанных здесь, и аналогичные молекулы, известные в данной области, тоже могут применяться в таком воплощении. Противораковые иммуногенные пептиды также включают антиидиотипические вакцины, как-то антиидиотипические антитела к BEC2, митомумаб, CeaVac и родственные им антиидиотипические антитела, антиидиотипическое антитело к антителу MG7 и другие противораковые антиидиотипические антитела (например, см. Birebent et al, Vaccine 21(15), 1601-12 (2003); Li et al., Chin Med J (Engl) 114(9), 962-6 (2001); Schmitt et al., Hybridoma 13(5), 389-96 (1994); Maloney et al., Hybridoma 4(3), 191-209 (1985); Raychardhuri et al., J Immunol. 137(5), 1743-9 (1986); Pohl et al., Int J Cancer 50(6), 958-67 (1992); Bohlen et al., Cytokines Mol Ther. 2(4), 231-8 (1996); и Maruyama, J Immunol Methods 264(12), 121-33 (2002)). Такие антиидиотипические Abs необязательно могут быть конъюгированы с носителем, которым может быть синтетическая (как правило, интертная) молекула носителя, белок (к примеру, гемоцианин моллюска блюдечко (KLH) (например, см. Ochi et al., Eur J Immunol. 17(11), 1645-8 (1987)) или клетки (к примеру, эритроциты - например, см. Wi et al., J Immunol Methods 122(2), 227-34 (1989)).
В одном воплощении изобретения конъюгат препарат-антитело против TF комбинируется с иммуноонкологическим препаратом типа Yervoy (ипилимумаб), который потенциально действует, индуцируя Т -клеточный иммунитет против рака. Циторедукция с помощью конъюгата препарат-антитело против TF в комбинации с иммуностимулирующим препаратом может принести значительную клиническую пользу пациентам.
В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации с конъюгатом препарат-антитело против TF настоящего изобретения для лечения вышеописанных заболеваний может представлять собой противораковый цитокин, хемокин или их комбинации. Примеры подходящих цитокинов и факторов роста включают IFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa (например, INFa2b), IFN3, GM-CSF, CD40L, лиганд Flt3, фактор стволовых клеток, анцестим и TNFa. Подходящими хемокинами могут быть Glu-Leu-Arg (ELR)отрицательные хемокины, такие как IP-10, МСР-3, MIG и SDF-1a из семейств CXC и C-C хемокинов человека. Подходящие цитокины включают производные цитокинов, варианты цитокинов, фрагменты цитокинов и слитые белки цитокинов. Эти и другие способы или применения с использованием нуклеиновых кислот, кодирующих пептиды естественного происхождения, могут дополнительно или альтернативно выполняться методами активации генов и повышающей регуляции генов путем гомологичной рекомбинации типа тех, что описаны в US 5,968,502, US 6,063,630, US 6,187,305 и ЕР 0505500.
В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации с конъюгатом препарат-антитело против TF настоящего изобретения для лечения вышеописанных заболеваний может представлять собой регулятор контроля клеточного цикла /апоптоза (или регулирующий агент). Регуляторы контроля клеточного цикла/апоптоза может включать молекулы, которые воздействуют на и модулируют регуляторы контроля клеточного цикла/апоптоза, такие как (i) cdc-25 (например, NSC 663284), (ii) циклин-зависимые киназы, которые суперстимулируют клеточный цикл (как-то флавопиридолы
- 27 034675 (L868275, HMR1275), 7-гидроксистауроспорин (UCN-01, KW-2401) и росковитин (R-росковитин,
CYC202)), и (iii) модуляторы теломеразы (как-то BIBR1532, SOT-095, GRN163 и композиции, описанные, к примеру, в US 6,440,735 и US 6,713,055). Неограничивающие примеры молекул, влияющих на апопотозные пути, включают родственный TNF индуцирующий апоптоз лиганд (TRAIL)/апоптозный лиганд-2 (Apo-2L), антитела, активирующие рецепторы TRAIL, IFNs и антисмысловые Bcl-2.
В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации с конъюгатом препарат-антитело против TF настоящего изобретения для лечения вышеописанных заболеваний может представлять собой гормональное регуляторное средство типа средств, используемых для антиандрогенной и антиэстрогенной терапии. Примерами таких гормональных регуляторных средств являются тамоксифен, идоксифен, фулвестрант, дролоксифен, торемифен, ралоксифен, диэтилстильбестрол, этинилэстрадиол/эстинил, антиандрогены (такие как флутаминд/эулексин), прогестины (такие как гидроксипрогестерон капроат, медроксипрогестерон/провера, мегестрол ацепат/ мегас), адренокортикостероиды (такие как гидрокортизон, преднизон), рилизинг-гормон лютеинизирующего гормона (и его аналоги и другие агонисты LHRH, такие как бусерелин и госерелин), ингибиторы ароматазы (такие как анастразол/аримидекс, аминоглютетимид/ цитраден, экземестан), ингибиторы гормонов (такие как октреотид/сандостатин) и аналогичные средства.
В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации с конъюгатом препарат-антитело против TF настоящего изобретения для лечения вышеописанных заболеваний может представлять собой антианергическое средство (например, соединения небольших молекул, белки, гликопротеины или антитела, нарушающие толерантность к опухолям и раковым антигенам). Примерами таких соединений являются молекулы, блокирующие активность CTLA-4, как-то MDX-010/Yervoy (ипилимумаб) (Phan et al, PNAS USA 100, 8372 (2003)), который потенциально действуют, индуцируя Тклеточный иммунитет против рака. Циторедукция с помощью конъюгата препарат-антитело против TF в комбинации с иммуностимулирующим препаратом может принести значительную клиническую пользу пациентам.
В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации с конъюгатом препарат-антитело против TF настоящего изобретения для лечения вышеописанных заболеваний может представлять собой нуклеиновую кислоту, содержащую ген супрессора опухолей, или вектор типа дефектного по репликации аденовируса, кодирующего рекомбинантный p53/SCH58500 дикого типа человека, и др.; антисмысловую нуклеиновую кислоту, направленную на онкоген, мутированный или дерегули-рованный ген; или siRNA, направленную на мутированный или дерегулированный ген. Примеры мишеней для супрессора опухолей включают, к примеру, BRCA1, RB1, BRCA2, DPC4 (Smad4), MSH2, MLH1 и DCC.
В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации с конъюгатом препарат-антитело против TF настоящего изобретения для лечения вышеописанных заболеваний может представлять собой противораковую нуклеиновую кислоту, как-то генасенс (augmerosen/G3139), LY900003 (ISIS 3521), ISIS 2503, OGX-011 (ISIS 112989), LE-AON/LEraf-AON (инкапсулированный в липосомах антисмысовлой олигонуклеотид к c-raf/ISIS-5132), MG98 и другие антисмысловые нуклеиновые кислоты, направленные на PKCa, кластерин, IGFBPs, протеинкиназу А, циклин D1 или Bcl-2h.
В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации с конъюгатом препарат-антитело против TF настоящего изобретения для лечения выше описанных заболеваний может представлять собой противораковую ингибиторную молекулу РНК (например, см. Lin et al, Curr Cancer Drug Targets 1(3), 241-7 (2001), Erratum in: Curr Cancer Drug Targets 3(3), 237 (2003); Lima et al., Cancer Gene Ther. 11(5), 309-16 (2004); Grzmil et al., Int J Oncol. 4(1), 97-105 (2004); Collis et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys. 57(2 Suppl), S144 (2003); Yang et al., Oncogene 22(36), 5694-701 (2003); и Zhang et al., Biochem Biophys Res Commun. 303(4), 1169-78 (2003)).
Композиции и комбинированные способы введения по настоящему изобретению также включают введение вакцин из нуклеиновых кислот типа вакцин из голой ДНК, кодирующей такие раковые антигены/опухолевые антигены (например, см. US 5,589,466, US 5,593,972, US 5,703,057, US 5,879,687, US 6,235,523 и US 6,387,888). В одном воплощении комбинированный способ введения и/или комбинированная композиция включает композицию аутологичной вакцины. В одном воплощении комбинированный способ введения и/или комбинированная композиция включает вакцину из целых клеток или клеток, экспрессирующих цитокин (например, экспрессирующих рекомбинантный IL-2 фибробластов, экспрессирующих цитокины дендритных клеток и т.п.) (например, см. Kowalczyk et al., Acta Biochim Pol. 50(3), 613-24 (2003); Reilly et al., Methods Mol Med. 69, 233-57 (2002); и Tirapu et al., Curr Gene Ther. 2(1), 79-89 (2002)). Другим примером такого подхода с аутологичными клетками, который может быть полезным в комбинированных способах настоящего изобретения, является метод индивидуализированной иммунотерапии MyVax® (раньше назывался GTOP-99) (Genitope Corporation - Redwood City, CA, США).
В одном воплощении настоящим изобретением предусмотрены комбинированные композиции и комбинированные способы введения, в которых конъюгаты препарат-антитело против TF по настоящему изобретению комбинируются или вводятся совместно с вирусом, вирусными белками и т.п. Полезными
- 28 034675 компонентами таких композиций и способов могут быть, к примеру, дефектные по репликации вирусы, которые обычно способны только на один или всего лишь несколько циклов репликации in vivo и направлены на опухолевые клетки. Такие вирусные агенты могут содержать или быть связанными с нуклеиновыми кислотами, кодирующими такие иммуностимуляторы, как GM-CSF и/или IL-2. Полезными компонентами таких способов и композиций могут быть как природные онколитические, так и рекомбинантные онколитические вирусы (например, вирусы HSV-1, реовирусы, дефектные по репликации и чувствительные к репликации аденовирусы и др.). Соответственно, в одном воплощении настоящего изобретения предусмотрены комбинированные композиции и способы введения, в которых конъюгаты препарат-антитело против TF комбинируются или вводятся совместно с онколитическим вирусом. Примеры таких вирусов включают онколитические аденовирусы и герпесвирусы, которые могут быть или не быть модифицированными вирусами (например, см. Shah et al, J Neurooncol. 65(3), 203-26 (2003); Stiles et al, Surgery 134(2), 357-64 (2003); Sunarmura et al., Pancreas 28(3), 326-9 (2004); Teshigahara et al., J Surg Oncol. 85(1), 42-7 (2004); Varghese et al., Cancer Gene Ther. 9(12), 967-78 (2002); Wildner et al., Cancer Res. 59(2), 410-3 (1999); Yamanaka, Int J Oncol. 24(4), 919-23 (2004); и Zwiebel et al., Semin Oncol. 28(4), 336-43 (2001).
Комбинированные композиции и комбинированные способы введения настоящего изобретения также могут включать методы цельноклеточной и адоптивной иммунотерапии. Например, такие способы могут включать инфузию или повторное вливание клеток иммунной системы (к примеру, инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TILs), как-то Т-клеток CD4+ и/или CD8+ (например, Т-клеток, подвергшихся экспансии под действием опухолевых антигенов и/или генетических усилителей), экспрессирующих антитела В-клеток или других клеток, продуцирующих/презентирующих антитела, дендритных клеток (DCs) (например, рекомбинантных дендритных клеток, экспрессирующих антитела к цитокинам, дендритных клеток, подвергавшихся культивированию с вызывающим их экспансию агентом типа GMCSF и/или Flt3-L, и/или связанных с опухолями нагруженных антигеном дендритных клеток), противоопухолевых клеток NK, так называемых гибридных клеток или их комбинаций. В таких способах и композициях могут быть полезными и клеточные лизаты. Клеточные вакцины в клинических испытаниях, которые могут быть полезными в таких аспектах, включают клеточные лизаты Canvaxin, APC-8015 (Dendreon), HSPPC-96 (Antigenics) и Melacine®. Антигены, выделяющиеся из раковых клеток, и их смеси (например, см. Bystryn et al., Clinical Cancer Research Vol. 7, 1882-1887, July 2001), необязательно в смеси с такими адъювантами, как квасцы, тоже могут быть компонентами в таких способах и комбинированных композициях.
В одном воплощении конъюгаты препарат-антитело против TF по настоящему изобретению можно вводить пациентам в сочетании с применением способа внутренней вакцинации. Внутренняя вакцинация означает индуцированную гибель опухолевых или раковых клеток, как-то индуцированную лекарствами или индуцированную радиацией гибель опухолевых клеток у пациента, которая, как правило, вызывает иммунный ответ, направленный на (i) опухолевые клетки в целом или (ii) части опухолевых клеток, включая (а) секретируемые белки, гликопротеины или другие продукты, (b) мембрано-связанные белки или гликопротеины или другие компонентны, связанные или встроенные в мембраны, и/или (с) внутриклеточные белки или другие внутриклеточные компоненты.
Иммунный ответ, индуцированный внутренней вакцинацией, может быть гуморальным (т.е. опосредованным антителами-комплементом) или опосредованным клетками (например, развитием и/или возрастанием числа эндогенных цитотоксических Т-лимфоцитов, распознающих погибшие внутри опухолевые клетки или их части). Наряду с лучевой терапией, неограничивающими примерами лекарств и агентов, которые можно использовать для индуцирования такой гибели опухолевых клеток и внутренней вакцинации, являются стандартные химиотерапевтические средства, ингибиторы клеточного цикла, антиангиогенные препараты, моноклональные антитела, индуцирующие апоптоз вещества и ингибиторы передачи сигналов.
Примерами других противораковых средств, которые могут быть адекватными в качестве терапевтических средств для применения в комбинации с конъюгатами препарат-антитело против TF по настоящему изобретению для лечения вышеописанных заболеваний, являются средства, индуцирующие дифференцировку, аналоги ретиноевой кислоты (такие как полностью транс-ретиноевая кислота, 13-цисретиноевая кислота и аналогичные вещества), аналоги витамина D (такие как сеокальцитол и аналогичные вещества), ингибиторы ErbB3, ErbB4, IGF-IR, инсулиновых рецепторов, PDGFRa, PDGFR3, Flk2, Flt4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, TRKA, TRKC, c-met, Ron, Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 и аналогичные средства.
Примерами других противораковых средств, которые могут быть адекватными в качестве терапевтических средств для применения в комбинации с конъюгатами препарат-антитело против TF по настоящему изобретению для лечения вышеописанных заболеваний, являются катепсин В, модуляторы активности дегидрогеназы катепсина D, глутатион^-трансферазы (такие как глутацилцистеинсинтетаза и лактатдегидрогеназа) и аналогичные средства.
Примерами других противораковых средств, которые могут быть адекватными в качестве терапев- 29 034675 тических средств для применения в комбинации с конъюгатами препарат-антитело против TF по настоящему изобретению для лечения вышеописанных заболеваний, являются эстрамустин и эпирубицин.
Примерами других противораковых средств, которые могут быть адекватными в качестве терапевтических средств для применения в комбинации с конъюгатами препарат-антитело против TF по настоящему изобретению для лечения вышеописанных заболеваний, являются ингибиторы HSP90 типа 17аллиламиногелд-анамицина, антитела против таких опухолевых антигенов, как PSA, CA125, KSA и др., интегрины типа интегрина β1, ингибиторы VCAM и аналогичные средства.
Примерами других противораковых средств, которые могут быть адекватными в качестве терапевтических средств для применения в комбинации с конъюгатами препарат-антитело против TF по настоящему изобретению для лечения вышеописанных заболеваний, являются ингибиторы кальцинейрина (такие как вальсподар, PSC 833 и другие ингибиторы MDR-1 или β-гликопротеина), ингибиторы TOR (такие как сиролимус, эверолимус и рапамицин) и ингибиторы механизмов самонаведения лимфоцитов (такие как FTY720), а также средства, воздействующие на клеточную сигнализацию, такие как ингибиторы молекул адгезии (например, антитела против LFA и др.).
В одном воплощении конъюгаты препарат-антитело против TF по изобретению предназначаются для применения с одним или несколькими другими терапевтическими антителами, такими как бевацизумаб (Avastin®), залутумумаб, цетуксимаб (Erbitux®), панитумумаб (Vectibix™), офатумумаб (Arzerra®), занолимумаб, даратумумаб (HuMax-CD38), ранибизумаб (Lucentis®), даклизумаб (Zenapax®), базиликсимаб (Simulect®), инфликсимаб (Remicade®), адалимумаб (Humira®), натализумаб (Tysabri®), омализумаб (Xolair®), эфализумаб (Raptiva®), нимотузумаб, ритуксимаб (Rituxan®/MabThera®) и/или трастузумаб (Herceptin®). Другие терапевтические антитела, которые могут применяться в комбинации с конъюгатами препарат-антитело против TF настоящего изобретения, приведены в WO 98/40408 (антитела, связывающиеся с нативным TF человека), WO 04/094475 (антитела, способные связываться с тканевым фактором человека, которые не ингибируют опосредованное фактором свертывание крови по сравнению с контролем -нормальной плазмой), WO 03/093422 (антитела, связывающиеся с большим сродством с комплексом TF:VIIa чем с самим TF), WO 03/037361 (агонисты или антагонисты TF для лечения, связанного с апоптозом) или WO 2010/066803 (моноклональные антитела человека против тканевого фактора).
В одном воплощении конъюгаты препарат-антитело против TF можно вводить вместе с введением одного или нескольких агентов, содействующих доступу конъюгата препарат-антитело против TF или комбинированной композиции внутрь опухоли. Такие способы могут выполняться, к примеру, в связи с введением релаксина, который способен расслабить опухоль (например, см. US 6,719,977). В одном воплощении конъюгат препарат-антитело против TF может быть связан с проникающим в клетки пептидом (СРР). Проникающие в клетки пептиды и родственные им пептиды (как-то искусственные проникающие в клетки антитела) описаны, к примеру, в Zhao et al, J Immunol Methods 254(1-2), 137-45 (2001); Hong et al., Cancer Res. 60(23), 6551-6 (2000); Lindgren et al., Biochem J. 377(Pt 1), 69-76 (2004); Buerger et al., J Cancer Res CLin Oncol. 129(12), 669-75 (2003); Pooga et al., FASEB J. 12(1), 67-77 (1998); и Tseng et al., Mol Pharmacol. 62(4), 864-72 (2002).
В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ лечения заболеваний с участием клеток, экспрессирующих TF у субъекта, который включает введение терапевтически эффективного количества конъюгата препарат-антитело против TF настоящего изобретения и по меньшей мере одного противовоспалительного средства нуждающемуся в этом субъекту.
В одном воплощении такое противовоспалительное средство может быть выбрано из аспирина и других салицилатов, ингибиторов Сох-2 (таких как рофекоксиб и целекоксиб), NSAIDs (таких как ибупрофен, фенопрофен, напроксен, сулиндак, диклофенак, пироксикам, кетопрофен, дифлунисал, набуметон, этодолак, оксапрозин и индометацин), антител против IL6R, антител против IL8 (например, антител, описанных в WO 2004058797, например, 10F8), антител против IL15 (например, антител, описанных в WO 03017935 и WO 2004076620), антител против IL15R, антител против CD4 (например, занолимумаб), ан- антител против CD11a (например, эфализумаб), антител против а4/в1-интегрина (VLA4) (например, натализумаб), CTLA4-Ig для лечения воспалительных заболеваний, преднизолона, преднизона, модифицирующих заболевание противоревматических препаратов (DMARD) типа метотрексата, гидроксихлорохина, сульфасалазина, ингибиторов синтеза пиримидинов (таких как лефлуномид), блокаторов рецептора IL-1 (таких как анакинра), блокаторов TNF-α (таких как этанерсепт, инфликсимаб и адалимумаб) и аналогичных средств.
В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ лечения заболеваний с участием клеток, экспрессирующих TF у субъекта, который включает введение терапевтически эффективного количества конъюгата препарат-антитело против TF настоящего изобретения и по меньшей мере одного иммуносупрессорного и/или иммуномодулирующего средства нуждающемуся в этом субъекту.
В одном воплощении такое иммуносупрессорное и/или иммуномодулирующее средство может быть выбрано из циклоспорина, азатиоприна, микофеноловой кислоты, микофенолата мофетила, кортикостероидов типа преднизона, метотрексата, солей золота, сульфасалазина, противомалярийных препа- 30 034675 ратов, бреквинара, лефлуномида, мизорибина, 15-дезоксиспергуалина, 6-меркаптопурина, циклофосфамида, роапамицина, такролимуса (FK-506), OKT3, глобулина против тимоцитов, тимопентина, тимозинаα и аналогичных средств.
В одном воплощении такое иммуносупрессорное и/или иммуномодулирующее средство может быть выбрано из иммуносупрессорных антител, как-то антител, связывающихся с р75 рецептора IL-2, антител против CD25 (например, описанных в WO 2004045512 типа АВ1, АВ7, АВ11 и АВ 12), или антител, связывающихся, к примеру, с MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, В7, CD40, CD45, IFNyR, TNFaR или TNFR (состоит из двух субъединиц: CD120a и CD120b), IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-8R, IL-10R, CD11a или CD58, либо антител, связывающихся с их лигандами.
В одном воплощении такое иммуносупрессорное и/или иммуномодулирующее средство может быть выбрано из растворимых молекул IL-15R, IL-10R, В7 (В7-1, В7-2, их вариантов и фрагментов), ICOS и ОХ40, ингибиторов отрицательного регулятора Т-клеток (как-то антител против CTLA4) и аналогичных средств.
В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ лечения заболеваний с участием клеток, экспрессирующих TF у субъекта, который включает введение терапевтически эффективного количества конъюгата препарат-антитело против TF по настоящему изобретению и антитела против C3b(i) нуждающемуся в этом субъекту.
В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации с конъюгатом препарат-антитело против TF для лечения вышеописанных заболеваний может быть выбрано из ингибиторов деацетилаз гистонов (к примеру, фенилбутирата) и/или агентов репарации ДНК (к примеру, ферментов репарации ДНК и аналогичных композиций типа димерицина).
В одном воплощении конъюгатом препарат-антитело против TF для применения в комбинированной терапии с одним или несколькими вышеприведенными средствами является HuMab-TF-011vcMMAE.
В одном воплощении конъюгатом препарат-антитело против TF для применения в комбинированной терапии с одним или несколькими вышеприведенными средствами является HuMab-TF-098vcMMAE.
В одном воплощении конъюгатом препарат-антитело против TF для применения в комбинированной терапии с одним или несколькими вышеприведенными средствами является HuMab-TF-111vcMMAE.
В одном воплощении конъюгатом препарат-антитело против TF для применения в комбинированной терапии с одним или несколькими вышеприведенными средствами является HuMab-TF-114vcMMAE.
В одном воплощении конъюгатом препарат-антитело против TF для применения в комбинированной терапии с одним или несколькими вышеприведенными средствами является HuMab-TF-011mcMMAF.
В одном воплощении конъюгатом препарат-антитело против TF для применения в комбинированной терапии с одним или несколькими вышеприведенными средствами является HuMab-TF-098mcMMAF.
В одном воплощении конъюгатом препарат-антитело против TF для применения в комбинированной терапии с одним или несколькими вышеприведенными средствами является HuMab-TF-111-mcMMAF.
В одном воплощении конъюгатом препарат-антитело против TF для применения в комбинированной терапии с одним или несколькими вышеприведенными средствами является HuMab-TF-114mcMMAF.
Способы настоящего изобретения для лечения вышеописанных заболеваний, включающие введение терапевтически эффективного количества конъюгата препарат-антитело против TF по настоящему изобретению, также могут включать противораковую фотодинамическую терапию (к примеру, противораковую лазерную терапию - которая необязательно может осуществляться с помощью фотосенсибилизирующего средства, например, см. Zhang et al, J Control Release 93(2), 141-50 (2003)), противораковую звуковолновую и ударноволновую терапию (например, см. Kambe et al., Hum Cell 10(1), 87-94 (1997)) и/или противораковую нутрицевтическую терапию (например, см. Roudebush et al., Vet CLin North Am Small Anim Pract. 34(1), 249-69, viii (2004); и Rafi, Nutrition 20(1), 78-82 (2004). Кроме того, конъюгаты препарат-антитело против TF могут применяться для получения фармацевтических композиций для лечения заболеваний, как описано выше, которые должны применяться с противораковой фотодинамической терапией (например, противораковой лазерной терапией - которая необязательно может осуществляться с помощью фотосенсибилизирующего средства, противораковой звуковолновой и ударноволновой терапией и/или противораковой нутрицевтической терапией.
В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ лечения заболеваний с участием клеток, экспрессирующих TF у субъекта, который включает введение терапевтически эффективного количества конъюгата препарат-антитело против TF, как-то конъюгата препарат-антитело против TF на- 31 034675 стоящего изобретения, и проведение радиотерапии нуждающемуся в этом субъекту.
В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ лечения заболеваний с участием клеток, экспрессирующих TF у субъекта, который включает введение терапевтически эффективного количества конъюгата препарат-антитело против настоящего изобретения и проведение радиотерапии нуждающемуся в этом субъекту.
В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрено применение конъюгатов препаратантитело против TF настоящего изобретения для получения фармацевтической композиции для лечения рака, которая должна применяться в комбинации с радиотерапией.
Радиотерапия может включать облучение или введение пациенту радиоактивных фармпрепаратов. Источник излучения может быть либо внешним или внутренним для подлежащего лечению пациента (облучение, к примеру, может быть в виде наружной лучевой терапии (EBRT) или брахитерапии (ВТ)). Радиоактивные элементы, которые можно использовать при выполнении таких способов, включают, например, радий, цезий-137, иридий-192, америций-241, золото-198, кобальт-57, медь-67, технеций-99, йод123, йод-131 и индий-111.
В следующем воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ лечения или предотвращения рака, который включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата препарат-антитело против TF настоящего изобретения в сочетании с хирургией.
Как описано выше, фармацевтическая композиция настоящего изобретения может вводиться при комбинированной терапии, т.е. в сочетании с одним или несколькими средствами, адекватными для подлежащего лечению заболевания, либо в виде отдельных фармацевтических композиций, либо вместе с соединением настоящего изобретения, составленным вместе с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, как описано выше. Такая комбинированная терапия может потребовать меньшие дозы соединения настоящего изобретения и/или вводимых вместе с ним средств, что позволяет избежать токсичности или осложнений, связанных с различными монотерапиями.
В дополнение к вышесказанному другие адекватные комбинированные терапии включают следующее:
для лечения рака поджелудочной железы: конъюгат препарат-антитело против TF по настоящему изобретению в комбинации с антиметаболитом типа 5-фторурацила и/или гемцитабина, возможно в комбинации с одним или несколькими соединениями, выбранными из 90Y-hPAM4, ARC-100, ARQ-197, AZD-6244, метилбардоксолона, циксутумумаба (IMC-А12), фолитиксорина кальция, GVAX, ипилимумаба, KRX-0601, мербарона, MGCD-0103, MORAb-009, PX-12, Rh-Apo2L, TLN-4601, трабедерсена, волоциксимаба (М200), WX-671, пеметрекседа, рубитекана, иксабепилона, ОСХ-0191Vion, 216586-46-8, лапатиниба, матузумаба, иматиниба, сорафиниба, трастузумаба, эксаберилона, эрлотиниба, авастина и цетуксимаба;
для лечения колоректального рака: конъюгат препарат-антитело против TF по настоящему изобретению в комбинации с одним или несколькими соединениями, выбранными из гемцитабина, бевацизумаба, FOLFOX, FOLFIRI, XELOX, IFL, оксалиплатина, иринотекана, 5-FU/LV, капецитабина, UFT, средств, направленных на EGFR, как-то цетуксимаба, панитумумаба, нимотузумаба, залутумумаба; ингибиторов VEGF или ингибиторов тирозинкиназ типа сунитиниба;
для лечения рака молочной железы: конъюгат препарат-антитело против TF по настоящему изобретению в комбинации с одним или несколькими соединениями, выбранными из антиметаболитов, антрациклинов, таксанов, алкилирующих агентов, антигормональных эпотилонов (фемар, тамоксифен и др.), ингибиторов ErbB2 (Her2/neu) (типа герцептина и аналогичных средств), CAF/FAC (циклофосфамид, доксорубицин, 5FU), АС (цикло, доксо), CMF (цикло, метотрексат, 5FU), доцетаксель + капецитабин, GT (паклитаксель, гемцитабин), FEC (цикло, эпи, 5FU) в комбинации с герцептином: паклитаксель ± карбоплатин, винорелбин, доксетаксель, СТ в комбинации с лапатинибом; капецитабин;
для лечения рака мочевого пузыря: конъюгат препарат-антитело против TF по настоящему изобретению в комбинации с одним или несколькими соединениями, выбранными из антиметаболитов (гемцитабин, алимта, метотрексат), аналогов платины (цисплатин, карбоплатин), ингибиторов EGFR (типа цетуксимаб или залутумумаб), ингибиторов VEGF (типа авастина), доксорубицина, ингибиторов тирозинкиназ типа гефитиниба, трастузумаба, антимитотических средств типа таксанов, к примеру, паклитакселя, и алкалоидов барвинка, к примеру, винбластина;
для лечения рака предстательной железы: конъюгат препарат-антитело против TF по настоящему изобретению в комбинации с одним или несколькими соединениями, выбранными из: гормональной/антигормональной терапии, как-то антиандрогенами, агонистами рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона (LHRH) и такими химиотера-певтическими препаратами, как таксаны, митоксантрон, эстрамустин, 5-FU, винбластин, иксабепилон;
для лечения рака яичников: конъюгат препарат-антитело против TF по настоящему изобретению в комбинации с одним или несколькими соединениями, выбранными из антимитотических средств типа таксанов и алкалоидов барвинка, каеликс, топотекан.
Диагностическое применение
Антитела против TF по изобретению могут применяться и для диагностических целей. Описанные
- 32 034675 здесь антитела против TF в одном воплощении могут быть конъюгированы с детектирующим агентом или меткой вместо лекарственного препарата, что делает их пригодными для диагностики. В одном воплощении диагностическое применение антител против TF или конъюгата антител против TF с детектирующим агентом может применяться в комбинации с одним или несколькими способами настоящего изобретения, в частности, с фармацевтическим применением конъюгатов препарат-антитело против TF настоящего изобретения. Антитела против TF, конъюги-рованные с детектирующим агентом, позволяют в некоторых случаях непосредственно детектировать связывание антител против TF с TF, а примеры детектирующих агентов или меток приведены в дальнейшем, причем упоминание антител против TF в дальнейшем также может включать, где это уместно, антитела против TF, конъюги-рованные с детектирующим агентом или меткой. Термин диагностическое применение также включает измерение уровня TF, например, в плазме, моче, или уровня экспрессии TF в биоптатах в связи с отбором пациентов для лечения или с определением эффективности лечения, как описано выше, а также применение, например, радиоактивно меченых антител против TF, например, для отбора пациентов для лечения, как описано выше. Таким образом, в следующем аспекте изобретение касается диагностической композиции, содержащей антитела против TF, как определено здесь, причем диагностическая композиция в предпочтительном воплощении может применяться в комбинации с конъюгатом препарат-антитело против TF настоящего изобретения.
В одном воплощении антитела против TF настоящего изобретения могут применяться in vivo или in vitro для диагностики заболеваний, в патогенезе которых активную роль играют клетки, экспрессирующие TF, путем измерения уровня TF или уровня содержащих TF клеток на поверхности мембран. Это может осуществляться, к примеру, приведением в контакт тестируемого образца, необязательно вместе с контрольным образцом, с антителом против TF при условиях, способствующих образованию комплекса между антителом против TF и TF. Затем детектируется образование комплекса (например, методом ELISA). При использовании контрольного образца вместе с тестируемым образцом комплекс детектируется в обоих образцах, и любые статистически значимые отличия в образовании комплексов между образцами свидетельствуют о наличии TF в тестируемом образце.
Итак, в следующем аспекте антитела против TF настоящего изобретения также могут применяться в способе выявления наличия антигена TF или экспрессирующих TF клеток в образце, который включает:
контактирование образца с антителом против TF по изобретению или биспецифической молекулой по изобретению в условиях, способствующих образованию комплекса между антителом и TF; и анализ образовавшегося комплекса.
В одном воплощении способ выполняется in vitro.
В частности, антитела против TF настоящего изобретения также могут применяться в способах идентификации и диагностики инвазивных клеток и тканей и других клеток, являющихся мишенью для антител против TF настоящего изобретения, и мониторинга хода терапевтического лечения, состояния после лечения, риска развития рака, прогрессирования рака и др.
В одном из примеров такого диагностического определения антитела против TF настоящего изобретения могут применяться в способе диагностики уровня инвазивных клеток в ткани. Такой способ включает образование иммунокомплекса между антителами против TF и потенциальными TFсодержащими тканями и детектирование образования иммунокомплекса, причем образование иммунокомплекса коррелирует с наличием инвазивных клеток в ткани. Контакт может осуществляться in vivo, с использованием меченых выделенных антител и стандартных методов визуализации, или же in vitro на образцах ткани.
Антитела против TF настоящего изобретения также могут применяться для выявления TFсодержащих пептидов и фрагментов пептидов в любых подходящих биологических образцах любым подходящим способом. Примеры стандартных иммунологических методов, предусмотренных настоящим изобретением, включают, без ограничения, методы ELISA, RIA, FACS, методы плазмонного резонанса, хроматографические методы, иммуногистохимию тканей, методы Western-блот и/или иммунопреципитации с использованием антител против TF. Антитела против TF настоящего изобретения также могут применяться для выявления TF и фрагментов TF у человека. Подходящие метки для антител против TF и/или вторичных антител, используемых в таких методах, включают, без ограничения, различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества и радиоактивные вещества. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, βгалактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных веществ включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин-изотиоцианат, родамин, дихлор-триазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; примеры подходящих люминесцентных веществ включают люминол; и 125 131 35 3 примеры подходящих радиоактивных веществ включают I, I, S и Н.
Антитела против TF также могут применяться для проведения анализов в биологических образцах методом конкурентного иммуноанализа с использованием стандартов пептида TF, помеченных детектируемым веществом, и немеченых антител против TF. При таком анализе биологический образец, мече- 33 034675 ный стандартный пептид TF и антитела против TF смешивают и определяют количество меченого стандарта TF, связавшегося с немеченым антителом против TF. Количество пептида TF в биологическом образце обратно пропорционально количеству меченого стандарта TF, связавшегося с антителом против
TF.
Антитела против TF особенно полезны при визуализации опухолей in vivo. Визуализации опухолей in vivo, ассоциированных с TF, может осуществляться любым подходящим методом. Например, можно использовать мечение 99Tc или мечение другим изотопом, дающим гамма-излучение, чтобы пометить антитела против TF в опухолях или вторично пометить (например, меткой FITC) комплексы антитело против TF:TF из опухолей и визуализировать при помощи гамма-сцинтилляционной камеры (например, установки Elscint Apex 409ECT), как правило, с использованием низкоэнергетического коллиматора с высоким разрешением или низкоэнергетического универсального коллиматора. Затем можно определить радиоактивность в окрашенных тканях в качестве показателя содержания TF-ассоциированных пептидов в опухоли. Изображения, полученные с применением таких методов, можно использовать для оценки биораспределения TF у пациента, млекопитающего или ткани, к примеру, при использования TF или фрагментов TF в качестве биомаркера на наличие инвазивных раковых клеток. Варианты такого метода могут включать применение магнитно-резонансной томографии (MRI) для улучшения изображений по сравнению с методами гамма-камеры. Подобные методы и принципы иммуносцинтиграфии описаны, например, в Srivastava (ed.) Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy (Plenum Press, 1988); Chase, Medical Applications of Radioisotopes, in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Gennaro et al. (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990); и Brown, Clinical Use of Monoclonal Antibodies, in Biotechnology And Pharmacy 227-49, Pezzuto et al. (eds.) (Chapman & Hall, 1993). Такие снимки можно использовать и для адресной доставки других противораковых средств, примеры которых описаны здесь (например, апоптозных агентов, токсинов или композиций для химиотерапии CHOP). Кроме того, такие снимки могут также или альтернативно служить основанием для хирургических методов удаления опухолей. Кроме того, такие методы визуализации in vivo могут способствовать идентификации и локализации опухолей в ситуации, когда у пациента установлена опухоль (по присутствию других биомаркеров, метастазов и т.д.), но её невозможно идентифицировать обычными аналитическими методами. Все эти способы являются предметом настоящего изобретения, и такие способы, в частности, могут применяться в сочетании с лечением пациента с помощью конъюгатов препарат-антитело против TF настоящего изобретения.
Визуализация in vivo и другие способы диагностики, предусмотренные настоящим изобретением, особенно полезны при выявлении микрометастазов у больных людей (например, тех, у кого ранее не был диагностирован рак или в период выздоровления/ ремиссии от рака). Было показано, что раковые клетки карциномы, которые могут составлять до 90% всех раковых клеток, к примеру, очень хорошо окрашиваются с помощью композиций антител против TF. Обнаружение с помощью описанных здесь моноклональных антител против TF может свидетельствовать о наличии аггрессивной/ инвазивной карциномы или же указывать на целесообразность использования против таких микрометастазов родственных моноклональных антител против TF.
В одном воплощении антитела против TF настоящего изобретения могут применяться в способе визуализации in vivo, в котором антитело против TF настоящего изобретения конъюгируют со способствующим детектированию рентгеноконтрастным веществом, конъюгированное антитело вводят в организм путем инъекции в кровоток и определяют присутствие и локализацию меченого антитела в организме. По этой методике и другим способам диагностики, предусмотренным здесь, антитела против TF настоящего изобретения могут применяться в способе скрининга на наличие связанных с болезнью клеток у больного человека или в биологическом образце, взятом у больного.
Для диагностической визуализации радиоизотопы могут быть связаны с антителом против TF как непосредственно, так и косвенно через промежуточную функциональную группу. Полезными промежуточными функциональными группами являются хелаторы, как-то этилендиаминтетрауксусная кислота и диэтилентриаминпентауксусная кислота (например, см. US 5,057,313).
Наряду с радиоизотопами и рентгеноконтрастными веществами, способы диагностики могут выполняться с помощью антител против TF, конъюгированных с красителями (например, с комплексом биотин-стрепавидин), контрастными веществами, флуоресцентными соединениями или молекулами и усиливающими агентами (например, парамагнитными ионами) для магнитно-резонансной томографии (MRI) (например, см. US Pat. No. 6,331,175, в котором описаны методы MRI и получение антител, конъюгированных с усиливающим агентом для MRI). Такие диагностические/детектирующие вещества могут быть выбраны из веществ, используемых для магнитно-резонансной томографии, и флуоресцентных соединений. Для того чтобы нагрузить антитела против TF радиоактивными металлами или парамагнитными ионами, может потребоваться подвергнуть их реакции с реагентом, имеющим длинный хвост, к которому прикрепляется множество хелатирующих групп для связывания ионов. Таким хвостом может быть полимер, например, полилизин, полисахарид или другая функционализированная цепь с подвешенными группами, с которыми могут связываться хелатирующие группы, например, порфирины, полиамины, краун-эфиры, бистиосемикарбазоны, полиоксимы и аналогичные группы, применимые для этой це- 34 034675 ли. Хелаты могут быть конъюгированы с антителами против TF стандартными химическими методами.
Итак, настоящим изобретением предусмотрены диагностические конъюгаты антител против TF, в которых антитело против TF конъюгировано с контрастным веществом (как-то для магнитнорезонансной томографии, компьютерной томографии или с усилителем контрастности ультразвука) или радионуклидом, который может быть представлен, к примеру, гамма-, бета-, альфа-излучающим или излучающим электроны Оже или позитроны изотопом.
В следующем аспекте изобретение касается набора для выявления присутствия антигена TF или экспрессирующих TF клеток в образце, который содержит:
антитело против TF по изобретению или биспецифическую молекулу изобретения; и инструкции по применению набора, причем набор предпочтительно также содержит антитело против TF, конъюгированное с детектирующим веществом или контрастным веществом по настоящему изобретению.
В одном воплощении антитела против TF настоящего изобретения также могут применяться в наборе для диагностики рака, включающем контейнер, содержащий антитело против TF и один или несколько реагентов для детектирования связывания антител против TF с пептидом TF. Такой набор, в частности, может дополнительно включать конъюгат препарат-антитело против TF настоящего изобретения. Реагенты могут включать, к примеру, флуоресцентные метки, ферментные метки или другие детектируемые метки. Реагенты могут включать и вторичные или третичные антитела или реагенты для ферментативных реакций, причем ферментативные реакции дают продукт, который можно визуализировать. В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен диагностический набор, содержащий одно или несколько антител против TF настоящего изобретения в меченом или немеченом виде в подходящем контейнере, реагенты для инкубации при непрямом определении и субстраты или функционализирующие реагенты для детектирования при таком определении, в зависимости от природы метки. Также могут входить контрольные реагенты и инструкции по применению.
Диагностические наборы также могут поставляться для применения с антителом против TF, как-то конъюгированным/меченым антителом против TF, для выявления клеточной активности или детектирования наличия пептидов TF в образце ткани или организме. В таких диагностических наборах, а также наборах для терапевтического применения, тоже описанных здесь, антитела против TF обычно предоставляются в лиофилизированном виде в контейнере, либо сами по себе, либо в сочетании с другими антителами, специфичными для клеток мишени или пептида. Как правило, сюда же входит и фармацевтически приемлемый носитель (например, инертный разбавитель) и/или его компоненты, такие как трисбуфер, фосфатный или карбонатный буфер, стабилизаторы, консерванты, биоциды, инертные белки, напр. сывороточный альбумин и др. (обычно в отдельном контейнере для смешивания) и дополнительные реагенты (также обычно в отдельном контейнере). В некоторые наборы также входит вторичное антитело, способное связываться с антителом против TF, которое, как правило, находится в отдельном контейнере. Второе антитело обычно конъюгировано с меткой и составлено таким же образом, как и антитело против TF настоящего изобретения. При помощи способов, описанных выше и далее здесь, антитела против TF могут применяться для определения подмножеств раковых/опухолевых клеток и характеристики таких клеток и родственных им тканей/новообразований.
Детектирование in situ может осуществляться путем взятия гистологических образцов у пациентов и применения комбинации меченых антител против TF (антител против TF, конъюгированных с детектирующим агентом) настоящего изобретения к таким образцам. Антитела против TF настоящего изобретения могут применяться путем нанесения или наложения меченых антител против TF настоящего изобретения на биологический образец. По такой методике можно определить не только наличие TF или фрагментов TF, но также и распределение таких пептидов в исследуемой ткани (например, при оценке распространения раковых клеток). При применении настоящего изобретения рядовые специалисты в данной области должны хорошо понимать, что для осуществления такого детектирования in situ можно модифицировать любые из широкого спектра гистологических методов (как-то методики окрашивания).
Далее настоящее изобретение раскрывается на следующих примерах, которые не следует воспринимать как дополнительные ограничения.
Примеры
Пример 1. Экспрессирующие конструкции для тканевого фактора (TF).
Создавали полностью оптимизированные по кодонам конструкции для экспрессии TF или его внеклеточных доменов в клетках HEK, NS0 или СНО. Белки, кодируемые этими конструкциями, идентичны TF с кодом доступа NP_001984 в Genbank. Конструкции содержали подходящие рестрикционные сайты для клонирования и оптимальную последовательность Козака (Kozak, 1987). Конструкции клонировали в экспрессирующем векторе рЕЕ13.4 для млекопитающих (Lonza Biologics) (Bebbington, Renner et al, 1992), получая pEE13.4TF. Для амплификации из синтетической конструкции части, кодирующей внеклеточный домен (ECD) (аминокислоты 1-251) TF, использовали метод ПЦР, добавляя С-концевой His-тег, содержащий 6 остатков His (TFECDHis). Конструкцию клонировали в рЕЕ13.4 и полностью секвенировали для подтверждения правильности конструкции.
Пример 2. Кратковременная экспрессия в клетках HEK-293F.
- 35 034675
Клетки Freestyle 293-F (субклон HEK-293, адаптированный для культивирования в суспензии в химически определенной среде Freestyle (HEK-293F)) получали от Invitrogen и трансфецировали подходящей плазмидной ДНК с помощью 293 фектина (Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя.
При экспрессии антител экспрессировали совместно подходящие вектора тяжелой цепи и легкой цепи, как описано в примере 10.
Пример 3. Полустабильная экспрессия в клетках NS0.
pEE13.4TF стабильно трансфецировали в клетки NS0 и отбирали стабильные клоны на рост в отсутствии глутамина и в присутствии 7,5 мкМ метилсульфоксимина (MSX). Пул клонов выращивали в суспензионной культуре, поддерживая давление отбора. Пулы тестировали на экспрессию TF методом FACS и выделяли их для дальнейшего использования.
Пример 4. Стабильная экспрессия в клетках СНО.
pEE13.4TF стабильно трансфецировани в клетки CHO-K1SV (Lonza Biologies) и отбирали стабильные клоны на рост в отсутствие глутамина и в присутствии 50 мкМ MSX. Отбирали единичные клоны, подвергали их экспансии и тестировали на экспрессию TF методом FACS, как описано ниже. Отбирали клоны с высоким уровнем экспрессии отбирали и выделяли их для дальнейшего использования.
Пример 5. Очистка TF с His-тегом.
TFECDhis экспрессировали в клетках HEK-293F. His-тег в TFECDHis способствует очистке методом аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом. При этом хелатор фиксирован на хроматографической смоле и заряжен катионами Со2+. Содержащий TFECDHis супернатант инкубировали со смолой в режиме batch (т.е. в растворе). Белок с His-тегом прочно связывается с шариками смолы, тогда как другие белки, находящиеся в супернатанте культуры, связываются не прочно. После инкубации шарики извлекают из супернатанта и набивают в колонку. Колонку промывают для удаления слабо связанных белков. Прочно связанные белки TFECDHis затем элюируют буфером, содержащим имидазол, который конкурирует со связыванием His с Со2+. Элюент удаляют из белка заменой буфера на обессоливающей колонке.
Пример 6. Процедура иммунизации трансгенных мышей.
Антитела 042, 092-А09, 098 и 101 получали при следующих иммунизациях: трех мышей HCo120 (2 самца и 1 самка, линия GG2713), трех мышей HCo17 (2 самца и 1 самка, линия GG2714), трех мышей HCo12-BALB/c (3 самца, линия GG2811), трех мышей HCo17 (3 самца, линия GG2201) и трех мышей HCo12 (3 самца, линия GG2198) (Medarex, San Jose, CA, США); см. ссылки в приведенном выше абзаце о мышах HuMab) иммунизировали через каждые две недели поочередно 5х106 полустабильно трансфецированных клеток NS0-TF или 20 мкг белка TFECDHis. В общей сложности проводили 8 иммунизации, 4 внутрибрюшинно (IP) и 4 подкожно (SC) в основание хвоста. Первую иммунизацию клетками проводили в полном адъюванте Фрейнда (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, США). При всех других иммунизациях клетки вводили IP в PBS, a TFECDHis вводили SC, используя неполный адъювант Фрейнда (IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, США). Когда титры в сыворотке стали достаточными (положительным считали разведение сыворотки 1:50 или ниже при антиген-специфическом скрининге методом, описанным в примере 7, по меньшей мере 2 раза подряд за две недели), мышам дополнительно дважды вводили внутривенно (IV) 10 мкг белка TFECDHis в 100 мкл PBS за 4 и 3 дня до слияния.
Антитела 109, 111 и 114 получали при следующих иммунизациях: трех мышей HCo120 (3 самки), трех мышей HCo17 (3 самки), трех мышей HCo12-BALB/c (3 самки), трех мышей HCo17 (3 самца) и трех мышей HCo12 (3 самки) иммунизировали через каждые две недели 5х106 полустабильно трансфецированных клеток NS0-TF. Первую иммунизацию клетками проводили в CFA, при всех остальных (7) иммунизациях клетки вводили IP в PBS. Когда титры в сыворотке стали достаточными (как определено выше), мышам дополнительно дважды вводили IV 1х106 полустабильно трансфецированных клеток NS0TF в 100 мкл PBS за 4 и 3 дня до слияния.
Антитела 011, 017-D12 и 025 получали при следующих иммунизациях: трех мышей HCo120 (3 самца), трех мышей HCo17 (2 самца и 1 самка), трех мышей HCo12-BALB/c (3 самки), трех мышей HCo17 (3 самца) и трех HCo12 мышей (2 самца и 1 самка) иммуни-зированли через каждые две недели 20 мкг белка TFECDHis. Первую иммунизацию (внутрибрюшинно) белком проводили в CFA, при всех остальных (7) иммунизациях белок вводили поочередно подкожно и внутрибрюшинно в IFA. Когда титры сыворотки стали достаточными (как определено выше), мышам дополнительно дважды вводили внутривенно (IV) 10 мкг белка TFECDHis в 100 мкл PBS за 4 и 3 дня до слияния.
Пример 7. Гомогенный антиген-специфический метод скрининга.
Присутствие антител против TF в сыворотке иммунизированных мышей или HuMab (моноклональных антител человека) в супернатантах культур гибридомы или трансфектомы определяли гомогенным антиген-специфическим методом скрининга (четыре квадранта) по технологии флуорометрического анализа в микрообъеме (FMAT; Applied Biosystems, Foster City, CA, США).
Для этого применяли комбинацию из 3 клеточных методов и одного на основе шариков. В клеточных методах определяли связывание с клетками TH1015-TF (клетки HEK-293F, временно экспрессирующие TF; получали как описано выше) и А431 (которые экспрессируют TF на клеточной поверхно- 36 034675 сти), а также клетками HEK293 дикого типа (не экспрессируют TF, отрицательный контроль). В методе на основе шариков определяли связывание с биотинилированным TF, посаженным на шарики со стрептавидином (SB1015-TF).
Образцы добавляли к клеткам/шарикам, чтобы происходило связывание с TF. После этого детектировали связывание HuMab с помощью флуоресцентного конъюгата (козий IgG-Cy5 против человека; Jackson ImmunoResearch). В качестве положительного контроля использовали мышиное антитело против TF человека (ERL; соединенное с Alexa-647 на Genmab), а в качестве отрицательного контроля - объединенную сыворотку мышей HuMAb и мышиное антитело с chrompure-Alexa647. Образцы сканировали на установке Applied Biosystems 8200 Cellular Detection System (8200 CDS) и считывали показания в виде 'отсчетх флуоресценция'.
Пример 8. Получение гибридом для HuMab.
Мышей HuMab при появлении достаточного антиген-специфического титра (определяли как и выше) подвергали эвтаназии и извлекали селезенку и лимфатические узлы, окружающие брюшную аорту и полую вену. Слияние спленоцитов и клеток лимфатических узлов с клетками миеломы мыши проводили методом электрослияния на установке CEEF 50 Electrofusion System (Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, США), в основном следуя инструкциям производителя. Отбор и культивирование полученных гибридом HuMab проводили по стандартным методикам (например, как описано в Coligan J.E., Bierer B.E., Margulies D.H., Shevach E.M. and Strober W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006).
Пример 9. Масс-спектрометрия очищенных антител.
Небольшие порции содержащих антитела супернатантов по 0,8 мл из 6-луночной стадии или Hyperflask очищали на колонках PhyTip, содержащих смолу с белком G (PhyNexus Inc., San Jose, США), на установке Sciclone ALH 3000 (Caliper Lifesciences, Hopkinton, США). Колонки PhyTtip использовали согласно инструкциям производителя, но буфера заменяли на: связывающий буфер PBS (B.Braun, Medical B.V., Oss, Нидерланды) и элюирующий буфер 0,1М глицин-HCl рН 2,7 (Fluka Riedel-de Haen, Buchs, Германия). После очистки образцы нейтрализировали 2М трис-HCl рН9,0 (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Нидерланды). А в некоторых случаях подвергали очистке большие объемы супернатантов культур методом аффинной колоночной хроматографии с белком А.
После очистки образцы наносили на 384-луночный планшет (Waters, квадратные лунки на 100 мкл, № 186002631). Образцы подвергали дегликозилированию в течение ночи при 37°С с помощью Nгликозидазы F (Roche, кат. № 11365177001). Добавляли (1 мкл на лунку) DTT (15 мг/мл) и инкубировали 1 ч при 37°С. Образцы (5 или 6 мкл) обессоливали на Acquity UPLC™ (Waters, Milford, США) с колонкой BEH300 С18, 1,7мкм, 2,1x50 мм при 60°С. В качестве элюентов А и В использовали воду MQ и ацетонитрил класса LC-MS (Biosolve, кат. № 01204101, Valkenswaard, Нидерланды), соответственно, в обоих случаях с 0,1% муравьиной кислотой (Fluka, кат. № 56302, Buchs, Германия). Времяпролетные массспектры при ионизации электрораспылением регистрировали online на масс-спектрометре micrOTOF™ (Bruker, Bremen, Германия), работающем в режиме положительных ионов. Перед анализом проводили калибровку в интервале 900-3000 m/z с помощью настроечной смеси ES (Agilent Technologies, Santa Clara, США). Масс-спектры подвергали деконволюции с помощью программы DataAnalysis™ v. 3.4 (Bruker), используя алгоритм поиска Maximal Entropy для молекулярных весов в районе от 5 до 80 кДа.
После деконволюции полученные массы тяжелой и легкой цепи для всех образцов сопоставляли с целью поиска дубликатов антител. При сравнении тяжелых цепей учитывали возможное присутствие вариантов С-концевого лизина. В результате получили список уникальных антител, где уникальность определяется как уникальная комбинация тяжелых и легких цепей. В том случае, когда обнаруживались дубликаты антител, использовали результаты других тестов, чтобы решить, какой материал лучше всего использовать для продолжения экспериментов.
При анализе методом MS молекулярных весов тяжелой и легкой цепей 118 TF-специфичных гибридом получили 70 уникальных антител (уникальных комбинаций тяжелой цепи и легкой цепи). Их характеризировали по целому ряду функциональных анализов, идентифицируя наших ведущих кандидатов TF-специфичные антитела.
Пример 10. Анализ последовательности вариабельных доменов HuMab против TF и клонирование их в экспрессирущих векторах.
Выделяли тотальную РНК HuMabs против TF из 5x106 гибридомных клеток и получали 5'-RACEкомплементарную ДНК (кДНК) из 100 нг тотальной РНК с помощью набора SMART RACE cDNA Amplification kit (Clontech) согласно инструкциям производителя. Амплифицировали кодирующие участки VH (вариабельной области тяжелой цепи) и VL (вариабельной области легкой цепи) методом ПЦР и клонировали в вектор pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen) с помощью набора для клонирования Zero Blunt PCR (Invitrogen). Для каждого HuMab секвенировали 16 клонов VL И 8 клонов VH. Последовательности представлены в Перечне последовательностей и на фиг. 1.
В табл. 1А и табл. 1В (ниже) приведены сведения о последовательностях антител и наиболее гомологичных гаметных последовательностях.
- 37 034675
Таблица 1 А. Гомология тяжелых цепей
АЬ Ген V и его аллель Идентичность no V-области, % Ген J и его аллель Ген D и его аллель Длина CDRIMGT
098 IGHV1-69*04 95,49% (275/288 нт) IGHJ3*02 IGHD2-21*02 [8,8,11]
011 IGHV3-23*01 96,53% (278/288 нт) IGHJ4*02 IGHD 1-26*01 [8,8,11]
017 IGHV3-23*01 98,26% (283/288 нт) IGHJ2*01 IGHD2-15*01 [8,8,13]
092 IGHV3-23*01 97,92% (282/288 нт) IGHJ4*02 IGHD7-27*01 [8,8,11]
101 IGHV3-23*01 95,83% (276/288 нт) IGHJ4*02 IGHD7-27*01 [8,8,11]
025 IGHV3-30-3*01 97,57% (281/288 нт) IGHJ4*02 IGHD7-27*01 [8,8,13]
109 IGHV3-30-3*01 96,18% (277/288 нт) IGHJ4*02 IGHD7-27*01 [8,8,13]
114 IGHV3-33*01, IGHV3-33*03 94,44% (272/288 нт) IGHJ6*02 IGHD3-10*01 [8,8,12]
111 IGHV3-30-3*01 97,57% (281/288 нт) IGHJ4*02 IGHD3-10*01 [8,8,13]
042 IGHV3-23*01 98,26% (283/288 нт) IGHJ4*02 IGHDl-l*01 [8.8.11]
Таблица 1В. Гомология легких цепей
Ab Ген V и его аллель Идентичность no V-области, % (нт) Ген J и его аллель Длина CDR-IMGT
011 IGKV1D-16*O1 98,57% (275/279 нт) IGKJ2*01 [6.3.9]
092 IGKV1D-16*O1 99,28% (277/279 нт) IGKJ2*01 [6.3.10]
098 IGKV1D-16*O1 100,00% (279/279 нт) IGKJ2*01 [6.3.9]
101 IGKV1D-16*O1 100,00% (279/279 нт) IGKJ2*01 [6.3.10]
025 IGKV3-ll*01 100,00% (279/279 нт) IGKJ4*01 [6.3.9]
109 IGKV3-ll*01 99,64% (278/279 нт) IGKJ4*01 [6.3.9]
017 IGKV3-20*01 99,29% (280/282 нт) IGKJl*01 [7.3.9]
114 IGKV3-20*01 99,65% (281/282 нт) IGKJ4*01 [7.3.8]
111 IGKV3-ll*01 100,00% (279/279 нт) IGKJ4*01 [6.3.9]
042 IGKV3-20*01 99,29% (280/282 нт) IGKJl*01 [7.3.9]
Ссылки на перечень последовательностей (последовательности на фиг. 1) На фиг. 1 клон 017-D12 именуется 017, а клон 092-А09 именуется 092.
Область Vh Область Vh
SEQ ID No 1 VH 114 SEQ ID No 21 VH 101
SEQ ID No 2 VH 114, CDR1 SEQ ID No 22 VH 101, CDR1
SEQ ID No 3 VH 114, CDR2 SEQ ID No 23 VH 101, CDR2
SEQ ID No 4 VH 114, CDR3 SEQ ID No 24 VH 101, CDR3
SEQ ID No 5 VH011 SEQ ID No 25 VH 025
SEQ ID No 6 VH011, CDR1 SEQ ID No 26 VH 025, CDR1
SEQ ID No 7 VH011, CDR2 SEQ ID No 27 VH 025, CDR2
SEQ ID No 8 VH011, CDR3 SEQ ID No 28 VH 025, CDR3
SEQ ID No 9 VH017-D12 SEQ ID No 29 VH 109
SEQ ID No 10 VH017-D12, CDR1 SEQ ID No 30 VH 109, CDR1
SEQ ID No 11 VH017-D12, CDR2 SEQ ID No 31 VH 109, CDR2
SEQ ID No 12 VH017-D12, CDR3 SEQ ID No 32 VH 109, CDR3
SEQ ID No 13 VH 042 SEQ ID No 33 VH 098
SEQ ID No 14 VH 042, CDR1 SEQ ID No 34 VH 098, CDR1
SEQ ID No 15 VH 042, CDR2 SEQ ID No 35 VH 098, CDR2
SEQ ID No 16 VH 042, CDR3 SEQ ID No 36 VH 098, CDR3
SEQ ID No 17 VH 092-A09 SEQ ID No 37 VH 111
SEQ ID No 18 VH 092-A09, CDR1 SEQ ID No 38 VH 111, CDR1
SEQ ID No 19 VH 092-A09, CDR2 SEQ ID No 39 VH 111, CDR2
SEQ ID No 20 VH 092-A09, CDR3 SEQ ID No 40 VH 111, CDR3
Область Vl Область Vl
SEQ ID No 41 VL 114 SEQ ID No 61 VL 101
SEQ ID No 42 VL 114, CDR1 SEQ ID No 62 VL 101, CDR1
SEQ ID No 43 VL 114, CDR2 SEQ ID No 63 VL 101, CDR2
SEQ ID No 44 VL 114, CDR3 SEQ ID No 64 VL 101, CDR3
SEQ ID No 45 VL011 SEQ ID No 65 VL 025
SEQ ID No 46 VL011, CDR1 SEQ ID No 66 VL 025, CDR1
SEQ ID No 47 VL011, CDR2 SEQ ID No 67 VL 025, CDR2
SEQ ID No 48 VL011, CDR3 SEQ ID No 68 VL 025, CDR3
SEQ ID No 49 VL 017-D12 SEQ ID No 69 VL 109
SEQ ID No 50 VL 017-D12, CDR1 SEQ ID No 70 VL 109, CDR1
SEQ ID No 51 VL 017-D12, CDR2 SEQ ID No 71 VL 109, CDR2
SEQ ID No 52 VL 017-D12, CDR3 SEQ ID No 72 VL 109, CDR3
SEQ ID No 53 VL 042 SEQ ID No 73 VL 098
SEQ ID No 54 VL 042, CDR1 SEQ ID No 74 VL 098, CDR1
SEQ ID No 55 VL 042, CDR2 SEQ ID No 75 VL 098, CDR2
SEQ ID No 56 VL 042, CDR3 SEQ ID No 76 VL 098, CDR3
SEQ ID No 57 VL 092-A09 SEQ ID No 77 VL 111
SEQ ID No 58 VL 092-A09, CDR1 SEQ ID No 78 VL 111, CDR1
SEQ ID No 59 VL 092-A09, CDR2 SEQ ID No 79 VL 111, CDR2
SEQ ID No 60 VL 092-A09, CDR3 SEQ ID No 80 VL 111, CDR3
- 38 034675
HuMab 092-A09 против TF представляет собой полноразмерное, полностью человеческое моноклональное антитело типа IgG1,K, содержащее последовательность VH по SEQ ID No: 17 и последовательность VL по SEQ ID No: 57.
HuMab 101 против TF представляет собой полноразмерное, полностью человеческое моноклональное антитело типа IgG1,K, содержащее последовательность VH по SEQ ID No: 21 и последовательность VL по SEQ ID No: 61.
HuMab 025 против TF представляет собой полноразмерное, полностью человеческое моноклональное антитело типа IgG1,K, содержащее последовательность VH по SEQ ID No: 25 и последовательность VL по SEQ ID No: 65.
HuMab 109 против TF представляет собой полноразмерное, полностью человеческое моноклональное антитело типа IgG1,K, содержащее последовательность VH по SEQ ID No: 29 и последовательность VL по SEQ ID No: 69.
HuMab 017-D12 против TF представляет собой полноразмерное, полностью человеческое моноклональное антитело типа IgG1,K, содержащее последовательность VH по SEQ ID No: 9 и последовательность VL по SEQ ID No: 49.
HuMab 114 против TF представляет собой полноразмерное, полностью человеческое моноклональное антитело типа IgG1,K, содержащее последовательность VH по SEQ ID No: 1 и последовательность VL по SEQ ID No: 41.
HuMab 042 против TF представляет собой полноразмерное, полностью человеческое моноклональное антитело типа IgG1,K, содержащее последовательность VH по SEQ ID No: 13 и последовательность VL по SEQ ID No: 53.
HuMab 011 против TF представляет собой полноразмерное, полностью человеческое моноклональное антитело типа IgG1,K, содержащее последовательность VH по SEQ ID No: 5 и последовательность VL по SEQ ID No: 45.
HuMab 098 против TF представляет собой полноразмерное, полностью человеческое моноклональное антитело типа IgG1,K, содержащее последовательность VH по SEQ ID No: 33 и последовательность VL по SEQ ID No: 73.
HuMab 111 против TF представляет собой полноразмерное, полностью человеческое моноклональное антитело типа IgG1,K, содержащее последовательность VH по SEQ ID No: 37 и последовательность VL по SEQ ID No: 77.
Пример 11. Очистка антител.
Супернатанты из культур фильтровали через накладные фильтры на 0,2 мкм и наносили на колонки с 5 мл белка A (rProtein A FF, Amersham Bioscience) и элюировали 0,1 М лимонной кислотой-NaOH, рН 3. Элюат немедленно нейтрализировали 2М трис-HCl, рН 9 и диализировали в течение ночи до 12,6 мМ NaH2PO4, 140 мМ NaCl, рН 7,4 (B.Braun). После диализа образцы стерилизовали фильтрованием через накладные фильтры на 0,2 мкм. Чистоту определяли методом SDS-PAGE, а концентрацию измеряли по нефелометрии и поглощению при 280 нм. Очищенные антитела разделяли на порции и хранили при 80°С. После оттаивания порции очищенных антител хранили при 4°С. Молекулярную массу тяжелых и легких цепей антител, экспрессируемых гибридомами, определяли методом масс-спектрометрии, как описано в примере 9.
Пример 12. Связывание HuMabs против TF с внеклеточным доменом TF методом ELISA.
Специфичность полученных HuMabs против TF определяли методом ELISA. Планшеты для ELISA (Microlon; Greiner Bio-One) в течение ночи при +4°С покрывали 0,5 мкг/мл TFECDHis в PBS, рН 7,4. Покрытые планшеты сливали и блокировали 1 час при комнатной температуре 2% об. куриной сывороткой (Gibco, Paisley, Scotland) в PBS и промывали PBS, содержащим 0,05% Tween 20 (PBST). После этого делали серийные разведения HuMabs в PBSTC (PBS с добавлением 2% об. куриной сыворотки и 0,05% об. Tween-20) и инкубировали их 1 ч при комнатной температуре со встряхиванием (300 об/мин). Связавшиеся HuMabs детектировали с помощью конъюгированных с HRP козьих антител против IgG человека (Jackson ImmunoResearch), разведенных 1:5,000 в PBSTC, которые инкубировали 1 час при комнатной температуре со встряхиванием (300 об/мин). Далее реакцию проявляли с помощью ABTS (Roche Diagnostics) при комнатной температуре в темноте, останавливали через 15-30 минут добавлением 2% масс. щавелевой кислоты, а затем измеряли поглощение при 405 нм. В качестве отрицательного контроля использовали HuMab-KLH (моноклональное антитело человека против KLH (гемоцианина моллюска блюдечко). В качестве положительного контроля использовали мышиное антитело против TF человека (ERL) (в виде меченого HRP конъюгата против IgG мыши). Кривые связывания анализировали методом нелинейной регрессии (сигмоидные кривые доза-эффект с переменным наклоном) с помощью программы GraphPad Prism V4.03.
Как видно из фиг. 3, все антитела против TF связывались с TFECDHis. Значения ЕС50 для HuMabs представляют средние из 3 экспериментов и колеблются от 0,13 до 0,17 нМ (табл. 2 ниже).
- 39 034675
Таблица 2
HuMab к TF ЕС50 (нМ)
И 0,16
017-D12 0,25
42 0,23
092-А09 0,18
101 0,28
98 0,13
114 0,17
25 0,34
109 0,27
Пример 13. Связывание HuMabs против TF с мембраносвязанным TF Связывание HuMabs против TF с мембраносвязанным TF определяли методом FACS, используя трансфецированные TF клетки СНО или экспрессирующие TF клетки раковых линий MDA-MB-231, (трансфецированные люциферазой) А431 и Bx-PC3.
Клетки ресуспендировали в PBS (2х10б клеток/мл), помещали в 96-луночные планшеты с Vобразным дном (50 мкл/лунку). К клеткам добавляли 50 мкл серийного разведения HuMab в буфере FACS (PBS с добавлением 0,1% BSA и 0,02% Na-азида) и инкубировали 30 минут на льду. После трехкратной отмывки буфером FACS добавляли 50 мкл конъюгированных с фикоэритрином (РЕ) козьих антител против IgGFc человека 81 (Jackson ImmunoResearch), разведенных 1:100 в буфере FACS. После 30 мин на льду (в темноте) клетки отмывали три раза и определяли специфическое связывание HuMabs методом проточной цитометрии на установке FACSCalibur (BD Biosciences). В качестве отрицательного контроля использовали HuMab-KLH. В качестве положительного контроля использовали мышиное антитело против TF с последующим конъюгированным с PE антителом против IgGFc мыши. Кривые связывания анализировали методом нелинейной регрессии (сигмоидные кривые доза-эффект с переменным наклоном) с помощью программы GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, США).
На фиг. 4 представлен пример кривых связывания TF-специфичных HuMabs с клетками MDA-MB231. В табл. 3 приведена сводка значений EC50 для связывания TF-специфичных HuMabs с трансфецированными TF клетками СНО (S1015-TF), клетками MDA-MB-231, A431 и Вх-PC3.
Таблица 3. Сводка значений EC50 и максимальной средней интенсивности флуоресценции (max MFI) при определении методом FACS для TF-специфичных HuMabs с различными типами клеток. Значения EC50 приводятся в нМ. Max MFI для клеток MDA-МВ-231, BxPC3 и А431 при 30 мкг/мл антител, для S1015-TF - при 7,5 мкг/мл антител.
Группа HuMab KTF MDA-MB-231 Вх-РСЗ A431 S1015-TF-012
ec50 Max MFI ec50 Max MFI EC50 Max MFI ec50 Max MFI
I 13 1,58 2451 1,86 1305 8,04 3622 1,07 5207
I 44 0,87 1881 1,88 1136 1,45 2646 2,13 5021
I 87-Lg6 8,28 1107 7,19 1030
II 11 0,47 2143 1,01 1280 0,20 2606 1,32 5654
II 017-D12 1,33 2401 1,61 1422 1,24 3296 1,21 5792
II 42 0,25 1518 2,45 1701
II 092-А09 0,53 2290 0,84 1262 0,83 3137 1,32 5409
II 101 0,85 2071 2,25 1220 3,16 2934 1,77 5859
п/ш 98 0,99 1956 1,38 1151 1,40 2755 0,96 5229
II/III 114 0,47 2438 0,80 1407 0,90 3433 1,72 6095
III 3 3,20 1798 4,98 1106 6,94 2530 2,06 4247
III 25 0,69 2254 0,88 1320 5,19 3170 0,73 5808
III 109 2,16 2052 4,04 1324 1,74 3124 0,92 5629
III 111 1,03 1774 1,83 1128 2,88 3043 0,55 5353
Пример 14. Ингибирование связывания FVIIa с TF.
Ингибирование связывания FVIIa с TF антителами HuMabs против TF измеряли на клетках MDAMB-231 методом FACS. Клетки MDA-MB-231 отмывали PBS, чтобы удалить сыворотку, и высеивали на 96-луночные планшеты (100 000 клеток на лунку). Клетки инкубировали с HuMabs против TF в DMEM/0,1% BSA в течение 15 мин с последующей инкубацией с 100 нМ FVIIa в DMEM/0,1% BSA при 4°С в течение 30 мин. Клетки отмывали PBS/0,1% BSA/0,02% азида натрия (буфер FACS) и инкубировали с 10 мкг/мл кроличьего антитела против FVIIa (Abcam [ab7053]). Клетки отмывали буфером FACS и инкубировали с разведенным 1:50 меченным РЕ козьим антителом против IgG кролика (Jackson [111116-144]). Клетки отмывали буфером FACS и измеряли среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) на FACSCanto II (Becton Dickinson).
Концентрацию антител, необходимую для 50%-го ингибирования (IC50), рассчитывали с помощью GraphPad Prism (нелинейный регрессионный анализ).
Из фиг. 5 и табл. 4 видно, что HuMab-TF-098 (IC50 = 1,2 мкг/мл), -114 (IC50 не поддается вычислению) и -011 (IC50 = 0,6 мкг/мл) эффективно подавляли связывание FVIIa с клетками MDA-MB-231, тогда как HuMab-TF-013, -044 и -111 не ингибировали (или ингибировали в гораздо меньшей степени) связывание FVIIa.
- 40 034675
Таблица 4. Сводка значений IC50 для ингибирования антителами HuMabs против TF связывания
FVIIa. Представлены значения IC50 (в мкг/мл) для ингибирования HuMabs против TF связывания 100 нМ
FVIIa с TF на клетках MDA-MB-231, полученные в одном репрезентативном эксперименте.
Антитело (HuMab-TF-) IC50
098 1,218
111 н/оа
013 н/оа
044 н/оа
114 н/оа
011 0,6472
а) не поддается вычислению.
Пример 15. Опосредованная антителами интернализация и гибель клеток, вызванная HuMabs против TF при анализе с помощью анти-каппа-ЕТА'.
Чтобы установить, пригодны ли HuMabs против TF для подхода типа конъюгата антитело-препарат, применяли обобщенный метод измерения гибели клеток in vitro с использованием направленного на каппа-цепи экзотоксина A Pseudomonas (анти-каппа-ЕТА'). В этом методе использовали высокоаффинный домен против легкой каппа-цепи человека, конъюгированный с укороченной формой экзотоксина A Pseudomonas. После интернализации конъюгат доменного антитела против каппа с ЕТА' подвергается протеолизу и восстановлению дисульфидных связей с отделением каталитического и связывающего домена. Каталитический домен переносится из системы Гольджи в эндо-плазматический ретикулум через удерживающий мотив KDEL, а затем перемещается в цитозоль, где он ингибирует синтез белка и индуцирует апоптоз (Kreitman RJ., BioDrugs 2009, 23(1): 1-13. Recombinant Immunotoxins Containing Truncated Bacterial Toxins for the Treatment of Hematologic Malignancies).
Опосредованную антителом интернализацию и вызванную токсином гибель клеток тестировали для различных HuMabs против TF. Тестировали три различные линии клеток со сравнимым уровнем экспрессии TF. Эти клетки также экспрессируют EGFR (на различном уровне), что позволяет использовать положительный контроль - антитело (2F8), которое связывается с EGFR и вызывает интернализацию EGFR. Количество молекул TF и EGFR, экспрессируемых на клеточных линиях, определяли с помощью набора Qifi (Dako, Glostrup, Дания); клетки А431: среднее число молекул TF на клетку примерно 500000, среднее число молекул EGFR примерно 500000; клетки BxPC3: среднее число молекул TF на клетку примерно 500000, среднее число молекул EGFR на клетку примерно 200000; клетки MDA-MB-231: среднее число молекул TF на клетку примерно 500000, среднее число молекул EGFR на клетку примерно 100000. Клетки высеивали при оптимальной концентрации (А431: 2500 клеток/лунку; BxPC3: 3000 клеток/лунку; MDA-MB-231: 5000 клеток/лунку) в среду для клеточных культур в 96-луночные планшеты для тканевых культур (Greiner Bio-one) и давали им прикрепиться. Для идентификации HuMabs против TF, способствующих интернализации и погибели клеток токсином, инкубировали анти-каппа-ЕТА' при фиксированной концентрации (0,5 мкг/мл [А431 и BxPC3]; 0,25 мкг/мл [MDA-MB-231]), не вызывающей неспецифической гибели клеток в отсутствие антител, в течение 30 мин с оттитрованным количеством HuMabs против TF перед добавлением к клеткам. Через 3 дня определяли содержание жизнеспособных клеток с помощью AlamarBlue (BioSource International, San Francisco, США) в соответствии с инструкциями производителя. Флуоресценцию регистрировали на считывающем устройстве EnVision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer, Turku, Финляндия) при стандартных настройках для AlamarBlue. В качестве положительного контроля включали антитело 2F8 с анти-каппа-ЕТА'. В качестве отрицательного контроля использовали контрольное антитело на изотип (IgG1-b12).
Из фиг. 6 и табл. 5 видно, что все преинкубированные с анти-каппа-ЕТА' HuMabs против TF, кроме одного (HuMab-TF-087), вызывали гибель клеток А431, BxPC3 и MDA-MB-231 дозозависимым образом. Преинкубированные с анти-каппа-ЕТА' HuMab-TF-098, -114 и -011 вызывали гибель более эффективно (EC50 между 9х10-5 и 4х10-4 мкг/мл на клетках А431), чем преинкубированные с анти-каппа-ЕТА' HuMabTF-013, -111 и -044 (ЕС50 между 2,0х10-2 и 9,8х10-2 мкг/мл на клетках А431). Преинкубированное с антикаппа-ЕТА' HuMab-TF-087 не вызывало гибели клеток.
Для каждой линии клеток представлен один репрезентативный эксперимент: А431 (а), BxPC3 (b) и MDA-MB-231 (с). Данные представлены в виде средней интенсивности флуоресценции (MFI) ± S.E.M. для трех лунок с клетками, обработанными HuMabs против TF, преинкубированными с анти-каппа-ЕТА'. Верхняя пунктирная линия представляет максимальный сигнал, полученный в отсутствие преинкубированных с анти-каппа-ЕТА' HuMabs против TF; нижняя пунктирная линия представляет максимальную гибель клеток, полученную со стауроспорином.
- 41 034675
Таблица 5. Сводка значений ЕС50 и степени гибели клеток, вызванной HuMabs против TF, проинкубированными с анти-каппа-ЕТА'
Антитело (HuMab-TF-) А431 ВхРСЗ MDA-MB-231
Гибель (%) ес50 (мкг/мл) Гибель (%) ес50 (мкг/мл) Гибель (%) ес50 (мкг/мл)
098 95 9.0/10' 99 1.3/10' 96 7,2 /10 4
111 92 3.4/10 2 98 1.5х 10 2 88 2,3 /10 2
013 80 2,0 /10 2 96 9,4 /10' 56 н/оа
044 66 9.8/10 2 96 1.5х 10 2 44 н/оа
087 3 н/оа 56 н/оа 8 н/оа
114 97 2,6 /10 4 99 7,3 /10 4 99 2,5 /10'
Oil 96 3.9/10 4 98 2,6 /10 4 88 3.0/10'
2F8 99 7.1/10 4 98 3,5 /10' 84 1.5x10'
В12 5 н/оа 22 н/оа 0 н/оа
а) не поддается вычислению
Приведены значения ЕС50 (в мкг/мл) и максимальной гибели указанных линий клеток, обработанных HuMabs против TF, преинкубированными с анти-каппа-ЕТА', полученные в одном репрезентативном эксперименте. Степень гибели клеток (% погибших клеток) рассчитывали следующим образом: (AIF Необработанные — HI ^обработанные конъюгированным HuMab)/ (МЕ1необработанные — МИобработанные стауроспорином) х100%.
Пример 16. Получение ADCs против TF.
HuMab-011, HuMab-098 и HuMab-111 и отрицательный контроль - IgG1-b12 временно продуцировали в клетках HEK-293F (HuMab-011, HuMab-111 и IgGl-b12) или получали в стабильной линии клеток СНО (HuMab-098). Антитела очищали методом хроматографии с белком А по стандартной методике, получая в конечном счете примерно 400 мг очищенного антитела. Далее антитела конъюгировали с vcMMAE и mcMMAF, соответственно. Примерно 200 мг HuMab-011, HuMab-098 или HuMab-111 конъюгировали с vcMMAE или с mcMMAF. Препарат-линкер vcMMAE или mcMMAF подвергали алкилированию с цистеинами восстановленных антител по методикам, описанным в литературе (Sun et al. (2005) Bioconjugate Chem. 16: 1282-1290; McDonagh et al. (2006) Protein Eng. Design Sel. 19: 299-307; Alley et al. (2008) Bioconjugate Chem. 19: 759-765). Реакцию останавливали добавлением избытка N-ацетилцистеина. Остаток неконъюги-рованного препарата удаляли при очистке, и конечные конъюгаты препаратантитело против TF переводили в PBS. После этого конъюгаты препарат-антитело против TF подвергали анализу на концентрацию (по поглощению при 280 нм), соотношение препарат-антитело ('DAR') методом обратнофазовой хроматографии (RP-HPLC) и гидрофобной хроматографии (HIC), содержание неконъюгированного препарата (методом обратнофазовой хроматографии), степень агрегации (методом эксклюзионной хроматографии, SEC-HPLC) и уровень эндотоксина (методом LAL). Результаты представлены ниже в табл. 6.
Таблица 6. Сводка различных характеристик конъюгатов антитело-препарат
Определение HuMab-TF-011 HuMab-TF-098 HuMab-TF-111 IgGl-bl2
vcMMAE mcMMAF vcMMAE mcMMAF vcMMAE mcMMAF vcMMAE mcMMAF
Концентрация (мг/мл) 10,69 9,86 9,28 10,96 9,83 10,4 5,49 8,74
DAR по RP- HPLC 3,9 3,9 3,9 4,0 4,3 4,1 3,6 3,9
DAR по HIC 3,9 4,1 3,7 3,9 4,1 4,2 3,4 3,9
Неконъюгированный препарат (%) <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5
Агрегаты по SEC-HPLC (%) 5,3 5,3 0,8 0,7 1,2 0,8 0,6 1,0
Эндотоксин 0,2 0,2 0,131 <0,05 0,07 0,07 0,05 <0,05
Пример 17. Связывание ADCs против TF с рекомбинантным внеклеточным доменом TF при определении методом ELISA.
Связывание ADCs против TF с TF измеряли методом ELISA (с фиксацией реком-бинантного внеклеточного домена TF) и сравнивали со связыванием неконъюгированных HuMabs против TF. Планшеты для ELISA (Greiner BioOne) в течение ночи при 4°С покрывали 1,25 мкг/мл (по 100 мкл на лунку) рекомбинантного TFECDHis в PBS (В. Braun Melsungen AG). Планшеты три раза отмывали PBS, содержащим 0,05% Tween-20 (PBST), блокировали PBST по 200 мкл/лунку при комнатной температуре в течение 1 ч со встряхиванием (300 об/мин), отмывали три раза PBST и сливали. После этого добавляли 100 мкл ADCs против TF или неконъюгированных HuMabs против TF в виде серийных разведений в PBST и инкубировали со встряхиванием при комнатной температуре в течение 90 мин. Планшеты раза отмывали три PBST и сливали. Связавшиеся ADCs против TF и неконъюгированные HuMabs детектировали добавлением конъюгированного с HRP мышиного антитела против IgG1 человека (100 мкл; 0,015 мкг/мл; San
- 42 034675 quin; # M1328) в буфере определения и инкубировали со встряхиванием при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты отмывали три раза PBST, сливали и инкубировали со 100 мкл раствора ABTS (50 мл буфера ABTS [Roche] и одна таблетка ABTS [50 мг; Roche]). После инкубации в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин реакцию останавливали добавлением 100 мкл щавелевой кислоты на лунку (2% об.; Riedel de Haen) в темноте на 10 мин. В планшетах измеряли OD при 405 нм на считывающем устройстве для ELISA (Biotek Instruments, EL808 Absorbance Microplate Reader).
В качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG1-b12 к постороннему антигену (как неконъюгированное, так и в формате ADC).
Кривые связывания анализировали методом нелинейной регрессии (сигмоидные кривые дозаэффект с переменным наклоном) с помощью программы GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, США).
На фиг. 7 представлены кривые связывания, свидетельствующие, что все HuMabs и ADCs против TF связывались в сходном диапазоне с внеклеточным доменом TF при анализе методом ELISA (значения EC50 от 370 до 470 нг/мл).
В табл. 7 представлены значения EC50 для связывания HuMabs и ADCs против TF с внеклеточным доменом TF. Значения EC50 приводятся в нг/мл.
Таблица 7. Сводка значений EC50 для связывания TF-специфичных HuMabs и ADCs с внеклеточным доменом TF при определении методом ELISA
HuMab-TF- ЕС50 (ELISA)
Неконъюгированное vcMMAE mcMMAF
011 373 469 431
098 422 426 401
111 377 464 416
Пример 18. Опосредованная антителами интернализация и гибель клеток, вызванная ADCs против TF, при анализе на клетках in vitro.
Для определения способности ADCs против TF индуцировать цитотоксичность проводили анализ на клетках in vitro.
Гибель клеток из трех клеточных линий тестировали для различных ADCs против TF. Клетки А431 получали из Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ: ACC 91), клетки HPAF-II и NCI-H441 получали из American Type Culture Collection (ATCC: CRL-1997 и НТВ-174). Клетки высеивали при оптимальной концентрации (А431: 2,5х103 клеток/лунку; HPAF-II HNCI-H441: 5х103 клеток/лунку) в среде для клеточных культур в 96-луночные планшеты для тканевых культур (Greiner Bioone) и давали им прикрепиться. Добавляли серийные разведения ADCs против TF и инкубировали при 37°С в течение 72 ч (А431 и HPAF-II) или 96 ч (NCI-H441). Содержание жизнеспособных клеток определяли с помощью AlamarBlue (BioSource International, San Francisco, США) в соответствии с инструкциями производителя. Флуоресценцию регистрировали на считывающем устройстве EnVision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer, Turku, Финляндия) при стандартных настройках для AlamarBlue. В качестве отрицательного контроля использовали ADCs с антителом IgG1-b12, связывающимся с посторонним антигеном. Для индукции максимальной гибели клеток использовали стауроспорин (Sigma, # S6942).
Обе линии клеток - А431 и HPAF-II экспрессируют более 200 000 молекул тканевого фактора на клетку и поэтому могут рассматриваться как экспрессирующие тканевой фактор на высоком уровне.
Клетки NCI-H441 экспрессируют примерно 80 000 молекул тканевого фактора на клетку и поэтому могут рассматриваться как экспрессирующие тканевой фактор на промежуточном уровне.
Из фиг. 8 и табл. 8 видно, что все ADCs против TF вызывали гибель клеток А431, HPAF-II и NCIH441 дозозависимым образом. HuMab-TF-098 и -011 вызывали гибель клеток слегка более эффективно (IC50 от 9 до 22 нг/мл на клетках А431, от 1 до 5 нг/мл на клетках HPAF-II и от 1 до 10 нг/мл на клетках NCI-H441), чем HuMab-TF-111 (IC50 от 46 до 83 нг/мл на клетках А431, от 4 до 15 нг/мл на клетках HPAF-II и 416 нг/мл на клетках NCI-H441). Для каждой линии клеток представлен один репрезентативный эксперимент: А431 (а) и HPAF-II (b). Данные приведены в процентах выживания ± S.E.M. в двойных лунках с клетками, обработанными ADCs против TF.
Таблица 8. Сводка значений IC50 и степени гибели клеток, вызванной ADCs против TF
ADC (HuMab-TF-) A431 HPAF-II NCI-H441
Г ибель (%) IC50 (нг/мл) Г ибель (%) 1С5о (нг/мл) Г ибель (%) 1С50 (нг/мл)
098-vcMMAE 92 9 71 1 60 10
098-mcMMAF 85 13 73 5 63 4
011-vcMMAE 93 10 71 3 60 10
011-mcMMAF 78 22 72 5 53 5
111-vcMMAE 90 46 73 4 51 416
111-mcMMAF 73 83 74 15 62 416
IgGl-bl2-vcMMAE н/оа 0 н/оа н/оа 0 н/оа
IgGl-bl 2-mcMMAF н/оа 0 н/оа н/оа 0 н/оа
а) не поддается вычислению.
- 43 034675
Приведены значения IC50 (в нг/мл) и максимальной гибели (при концентрации в 10 мкг/мл) указанных линий клеток, обработанных ADCs против TF, полученные в одном репрезентативном эксперименте. Степень гибели клеток (% погибших клеток) рассчитывали следующим образом:
(МНнеобработанные — МНобработанные ADC против Tf)/ (МНнеобработанные — МНобработанные стауроспорином) х100%.
Пример 19. Терапевтическое лечение привитых опухолей А431 и HPAF-II у мышей SCID с помощью ADCs против TF.
Эффективность ADCs против TF in vivo определяли на привитых подкожно (SC) опухоляхксенотрансплантатах А431 и HPAF-II у мышей SCID. Самкам мышей SCID в правый бок вводили SC 5х106 раковых клеток А431 (полученных из DSMZ) или 2х10б HPAF-II (полученных из АТСС) в 200 мкл PBS с последующими четырьмя инъекциями ADCs против TF или контролей (IgG1-b12; как в виде ADC, так и неконъюгированного), начиная с того момента, когда размер опухоли составил примерно 200-250 мм3 для ксенотрансплантатов А431: день 11, день 14, день 18 и день 21, либо примерно 100-150 мм3 для ксенотрансплантатов HPAF-II: день 13, 16, 20 и 23 (60 мкг/мышь в 100 мкл, внутрибрюшинно (IP)). Объем опухолей измеряли по меньшей мере два раза в неделю. Объемы опухоли (мм3) рассчитывали по измерениям кронциркулем (PLEXX) как: 0,52х(длина)х(ширина)2
Из фиг. 9 видно, что все ADCs против TF эффективно подавляли рост привитых подкожно (s.c.) опухолей А431 (а) и HPAF-II (b). Данные представлены в виде среднего размера опухолей ± S.E.M. на группу (n = 7 мышей на группу). На модели HPAF-II конъюгаты vcMMAE значительно более эффективно подавляли рост опухолей, чем конъюгаты mcMMAF.
Пример 20. Стабильность ведущего клона ADCs против TF и ADCs IgG1-b12.
Стабильность конъюгированных с ММАЕ и MMAF материалов тестировали при хранении в течение 10 дней, 1, 2 и 3 месяцев при < -65°С и 5°С. В этом примере представлены данные только по трем месяцам, поскольку аналогичные результаты были получены для всех промежуточных точек времени. Кроме того, стабильность материалов тестировали при повторных циклах замораживания-оттаивания.
Приготовленные партии ADC (четыре партии IgG, конъюгированных с двумя различными линкерами, табл. 6) подвергали глубокой заморозке. Для тестирования на стабильность их оттаивали и разбавляли до 1 мг/мл в PBS. Разбавленный материал делили на порции по 300 мкл в криопробирках, а пробирки ставили на хранение при температуре < -65°С или 5°С. Для замораживания-оттаивания по три флакона из каждой партии замораживали при < -65°С на всю ночь, а затем оставляли оттаиваться при комнатной температуре. Цикл замораживания-оттаивания повторяли еще два раза (в целом образцы подвергали замораживанию-оттаиванию по три раза). Все материалы анализировали в начале исследования (t=0) методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), высокоэффективной эксклюзионной хроматографии (HP-SEC) и на связывание с тканевым фактором (TFECDHis) методом ELISA. Такие же анализы проводили для образцов, хранившихся в течение трех месяцев (t=3 месяца) при < -65°С и 5°С и для замороженных-оттаявших образцов.
SDS-PAGE проводили в восстановительных и невосстановительных условиях в гелях 4-12% NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen, Breda, Нидерланды) по модифицированному методу Laemli (Laemli 1970 Nature 227(5259): 680-5), при этом пробы разгоняли при нейтральном рН. Гели SDS-PAGE окрашивали Coomassie и делали цифровые снимки на установке Optigo Imaging System (Isogen Life Science).
HP-SEC проводили на разделительном блоке Waters Alliance 2695 или 2795 (Waters, Etten-Leur, Нидерланды), подсоединенном к колонке TSK HP-SEC (G3000SWxl; Tosoh Bioscience, через Omnilabo, Breda, Нидерланды) и двухволновому детектору поглощения Waters 2487 (Waters). Пробы разгоняли при 1 мл/мин. Результаты обрабатывали с помощью программы Empower, версия 2, и выражали на пик в процентах от общей высоты пика.
Связывание с рекомбинантным белком внеклеточного домена TF анализировали методом ELISA, как описано выше в примере 17.
На фиг. 10 a-d представлен анализ методом SDS-PAGE неконъюгированных и конъюгированных ведущих клонов против TF и IgG1-b12 в начале испытания на стабильность (t=0). При невосстановительном SDS-PAGE (a,b) неконъюгированный IgG1 мигрировал в виде зоны интактного IgG примерно в 150 кД. Как и ожидалось, ADCs в значительной степени распадались на фрагменты IgG меньших размеров (125 i^=HHL, 99 i^=HH, 67 кД=ИЕ 51 кД=И и 25 кД=Р) вследствие денатурирующих условий SDSPAGE и нековалентной природы молекул ADC (разрушение дисульфидных связей) (фиг. 10 аф). При восстановительном SDS-PAGE (фиг. 10 c,d) проявлялись зоны неконъюгированной легкой цепи (L0) и легкой цепи с одним присоединенным (L1) препаратом (ММАЕ или MMAF). Наблюдалось частичное разрешение неконъюгированной тяжелой цепи (H0) и конъюгированных с ММАЕ форм (H1, H2 и H3). Конъюгированные с MMAF и неконъ-югированные формы тяжелой цепи разделялись плохо, но проявлялись как диффузная полоса в 50 кД.
Результаты SDS-PAGE для образцов после трех месяцев хранения при обеих температурах (< -65°С и 5°С) были сравнимы с данными при t=0, как видно из фиг. 10 e-f. Также не наблюдалось отличий для подвергнутых замораживанию-оттаиванию образцов по сравнению с исходным материалом при анализе
- 44 034675 методом SDS-PAGE (данные не приводятся).
На фиг. 11 представлено наложение профилей HP-SEC для различных партий ADC при t=0 и t=3 месяца при обеих температурах. В условиях нативного HP-SEC материал ADC (t=0) выходил как один пик мономерных молекул IgG с небольшим количеством димерных молекул IgG. Ile наблюдалось никаких изменений для конъюгированного с ММАЕ и MMAF HuMab-TF-098 (a, b) и HuMab-TF-011 (с, d) после трех месяцев хранения. Однако материал ADC HuMab-TF-111 (e, f) и IgG1-b12 (g, h) проявлял снижение выхода (высоты пика) через t=3 месяца. Т акое снижение выхода уже наблюдалось в образцах при t=10 дней и оставалось неизменным после длительного хранения вплоть до 3 месяцев.
Содержание мономерных молекул IgG (% мономеров) рассчитывали из профиля пиков HP-SEC, а данные приведены в табл. 9. Для сравнения приведен % мономеров у неконъюгированного материала. Данные показывают, что > 95% материала ADC состояло из интактных мономерных молекул IgG. Содержание мономеров оставалось неизменным после трех месяцев хранения при < -65°С и 5°С, свидетельствуя, что за это время не образовались агрегаты.
Анализ методом HP-SEC подвергнутых замораживанию/оттаиванию образцов показал, что выход пика IgG у всех образцов был близок к выходу при t=0 (данные не приводятся). Однако замораживаниеоттаивание материала HuMab-TF-ADC приводило к небольшому снижению % мономеров (1,5-3,6%), как видно из табл. 9. Это связано с образованием небольшого количества агрегатов (димерных молекул IgG, судя по данным HP-SEC; данные не приводятся).
Связывание неконъюгированных и конъюгированных HuMab-TF-098, -011 и -111 с рекомбинантным белком внеклеточного домена TF (TFECDHis) тестировали методом ELISA. После трех месяцев хранения при < -65°С и 5°С связывающая способность не изменилась по сравнению с таковой при t=0, как видно из фиг. 12. Близкие результаты были получены для подвергнутых замораживанию-оттаиванию образцов (данные не приводятся).
Эксперименты по стабильности показали, что материал ADC, при 1 мг/мл, был стабильным при < 65°С и при 5°С в течение по меньшей мере трех месяцев при определении методами SDS-PAGE, HP-SEC и по связыванию с TFECDHis. Повторное замораживание-оттаивание материала вызывало небольшое образование арегатов.
Таблица 9. Анализ образцов ADC методом HP-SEC. Данные представлены в виде процента мономерных молекул
T=0 t=3 месяца Замораживаниеоттаивание (3 отдельных флакона)
Линкер-токсин <-65°C 5°C 1 2 3
HuMab-TF-098 неконъюгированное >99 - - - - -
vcMMAE 98,3 97,6 98,3 96,8 96,1 96,2
mcMMAF 95,4 98,2 98,2 92,3 92,0 91,9
HuMab-TF-011 неконъюгированное 96,1 - - - - -
vcMMAE 96,3 95,2 95,6 93,4 93,0 92,9
mcMMAF 95,8 96,6 96,4 94,2 93,5 93,7
HuMab-TF-111 неконъюгированное >99 - - - - -
vcMMAE 98,3 98,3 98,4 96,5 94,6 95,9
mcMMAF 97,9 97,8 >99 95,5 95,1 94,8
IgGl-bl2 неконъюгированное >99 - - - - -
vcMMAE 98,2 96,2 97,3 98,3 98,2 98,3
mcMMAF 98,6 98,8 98,8 98,1 97,9 98,0
Пример 21. Доза-эффект ADCs против TF при терапевтическом лечении привитых опухолейксенотрансплантатов HPAF-II у мышей SCID.
Эффективность ADCs против TF in vivo далее анализировали при лечении привитых подкожно опухолей-ксенотрансплантатов HPAF-II у мышей SCID различными дозами ADCs против TF. Опухоликсенотрансплантаты HPAF-II прививали, как описано выше, а затем следовали четыре инъекции vcMMAE-ADCs против TF в двух различных дозах (6 и 20 мкг/мышь [добавляли IgG1-b12 до конечной дозы в 60 мкг IgG1 на мышь] в 100 мкл, IP) или контрольного неконъюгированного mAb (IgG1-b12; 60 мкг/мышь в 100 мкл, IP); начиная с того момента, когда размеры опухолей составляли примерно 100-150 мм3: день 10, 13, 17 и 21. Объем опухолей измеряли по меньшей мере два раза в неделю. Объемы опухолей (мм3) рассчитывали по измерениям кронциркулем (PLEXX) как: 0,52 х(длина)х (ширина)2.
Из фиг. 13 видно, что в дозе 20 мкг всех три конъюгата vcMMAE эффективно подавляли рост привитых подкожно опухолей HPAF-II. В дозе 6 мкг все три конъюгата vcMMAE лишь немного замедляли, но не подавляли рост опухоли.
Эквивалент ы
Специалистам в данной области должны быть известны или они сами смогут установить всего лишь путем простого экспериментирования многие эквиваленты описанных здесь конкретных воплощений изобретения. Такие эквиваленты должны быть охвачены прилагаемой формулой изобретения. В
- 45 034675 рамки изобретения также входят любые комбинации воплощений, изложенных в зависимых пунктах формулы.

Claims (29)

1. Конъюгат для индуцирования клеточной гибели или ингибирования роста и/или пролиферации раковых клеток, экспрессирующих тканевой фактор (TF), содержащий:
(i) антитело, которое связывается с тканевым фактором и включает область VH, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 6, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 7, и участок CDR3 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 8, и область VL, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 46, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 47, и участок CDR3 с аминокислотной после довательностью, приведенной в SEQ ID NO: 48, и (ii) ауристатин или его функциональный пептидный аналог или производное, конъюгированный с антителом через линкер.
2. Конъюгат для индуцирования клеточной гибели или ингибирования роста и/или пролиферации раковых клеток, экспрессирующих тканевой фактор, содержащий:
(i) антитело, которое связывается с тканевым фактором и включает область VH, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 34, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 35, и участок CDR3 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 36, и область VL, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 74, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 75, и участок CDR3 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 76, и (ii) ауристатин или его функциональный пептидный аналог или производное, конъюгированный с антителом через линкер.
3. Конъюгат для индуцирования клеточной гибели или ингибирования роста и/или пролиферации раковых клеток, экспрессирующих тканевой фактор, содержащий:
(i) антитело, которое связывается с тканевым фактором и включает область VH, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 38, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 39, и участок CDR3 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 40, и область VL, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 78, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 79, и участок CDR3 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 80, и (ii) ауристатин или его функциональный пептидный аналог или производное, конъюгированный с антителом через линкер.
4. Конъюгат для индуцирования клеточной гибели или ингибирования роста и/или пролиферации раковых клеток, экспрессирующих тканевой фактор, содержащий:
(i) антитело, которое связывается с тканевым фактором и включает область VH, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и участок CDR3 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и область VL, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 42, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 43, и участок CDR3 с аминокислотной после довательностью, приведенной в SEQ ID NO: 44, и (ii) ауристатин или его функциональный пептидный аналог или производное, конъюгированный с антителом через линкер.
5. Конъюгат по любому из пп.1-4, в котором антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45; или область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; или область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; или область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41.
6. Конъюгат по любому из пп.1-5, в котором антитело является полноразмерным антителом.
7. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, в котором антитело является полностью человеческим моноклональным антителом типа IgG1, предпочтительно IgG1,K.
8. Конъюгат по любому из пп.1-7, в котором ауристатин представлен монометилауристатином Е (ММАЕ):
- 46 034675
где волнистой линией обозначен сайт прикрепления для линкера.
9. Конъюгат по любому из пп.1-4, в котором ауристатин представлен монометилауристатином F (MMAF):
где волнистой линией обозначен сайт прикрепления для линкера.
10. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, в котором линкер прикрепляется к сульфгидрильным остаткам антитела против TF, полученным при (частичном) восстановлении антитела против TF.
11. Конъюгат по любому из пп.1-7, в котором линкер-ауристатин представлен vcMMAF или vcMMAE:
Ab-MC-vc-PAB-MMAF (vcMMAF)
Ab-MC-vc-PAB-MMAE (vcMMAE) где p означает число от 1 до 8, S означает сульфгидрильный остаток антитела против TF, a Ab означает антитело против TF.
12. Конъюгат по любому из пп.1-8 и 10-11, в котором линкер-ауристатин представлен vcMMAE:
Ab-MC-vc-PAB-MMAE (vcMMAE) где p означает число от 1 до 8, S означает сульфгидрильный остаток антитела против TF, a Ab означает антитело против TF.
13. Конъюгат по п.12, где p означает число от 3 до 5.
14. Конъюгат по п.1, в котором линкер-ауристатин представлен vcMMAE:
Ab-MC-vc-PAB-MMAE (vcMMAE) где p означает число от 3 до 5, S означает сульфгидрильный остаток антитела против TF, а Ab означает антитело против TF, которое включает (i) область VH, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 6, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 7, и участок CDR3 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 8, и область VL, содержащую участок CDR1 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 46, участок CDR2 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 47, и участок CDR3 с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 48.
15. Конъюгат по любому из пп. 1-7 или 9-11, в котором линкер-ауростатин представлен mcMMAF:
Ab-MC-MMAF (mcMMAF) где p означает число от 1 до 8, S означает сульфгидрильный остаток антитела против TF, а Ab означает антитело против TF.
- 47 034675
16. Фармацевтическая композиция для индуцирования клеточной гибели или ингибирования роста и/или пролиферации раковых клеток, экспрессирующих тканевой фактор, содержащая конъюгат по любому из пп.1-15 и фармацевтически приемлемый носитель.
17. Применение конъюгата по любому из пп.1-15 для лечения рака.
18. Применение по п.17, в котором рак выбирается из группы, состоящей из опухолей центральной нервной системы, рака головы и шеи, рака легких, такого как NSCLC, рака молочной железы, особенно втройне отрицательного рака молочной железы, рака пищевода, рака желудка, рака печени и желчных протоков, рака поджелудочной железы, колоректального рака, рака мочевого пузыря, рака почек, рака предстательной железы, рака эндометрия, рака яичников, злокачественной меланомы, саркомы, опухолей неизвестного первичного происхождения, рака костного мозга, острой лимфобластной лейкемии, острой миелоидной лейкемии (AML), хронической лимфобластной лейкемии и неходжкинской лимфомы, рака кожи, глиомы, рака головного мозга, рака матки и рака прямой кишки.
19. Применение по п.17 для лечения рака поджелудочной железы.
20. Применение по п.17 для лечения колоректального рака.
21. Применение по п.17 для лечения рака яичников.
22. Применение по п.17 для лечения рака молочной железы.
23. Применение по п.17 для лечения рака предстательной железы.
24. Применение по п.17 для лечения рака мочевого пузыря.
25. Применение комбинации конъюгата по любому из пп.1-13 с химиотерапевтическим средством для лечения рака.
26. Применение конъюгата по любому из пп.1-15 для изготовления медикамента для лечения рака.
27. Способ индуцирования клеточной гибели или ингибирования роста и/или пролиферации раковых клеток, экспрессирующих тканевой фактор, который включает введение нуждающемуся в этом индивиду эффективного количества конъюгата по любому из пп.1-15.
28. Способ лечения любого из заболеваний, определенных в любом из пп.17-24, который включает введение нуждающемуся в этом индивиду эффективного количества конъюгата по любому из пп.1-15.
29. Способ по п.28, который дополнительно включает введение одного или нескольких для лечения рака.
EA201300016A 2010-06-15 2011-06-15 Конъюгат для индуцирования клеточной гибели, ингибирования роста и пролиферации раковых клеток, экспрессирующих тканевой фактор, и его применение EA034675B1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35497010P 2010-06-15 2010-06-15
DKPA201000529 2010-06-15
US201161434776P 2011-01-20 2011-01-20
DKPA201100039 2011-01-20
PCT/EP2011/059917 WO2011157741A2 (en) 2010-06-15 2011-06-15 Human antibody drug conjugates against tissue factor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201300016A1 EA201300016A1 (ru) 2013-06-28
EA034675B1 true EA034675B1 (ru) 2020-03-05

Family

ID=44534293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201300016A EA034675B1 (ru) 2010-06-15 2011-06-15 Конъюгат для индуцирования клеточной гибели, ингибирования роста и пролиферации раковых клеток, экспрессирующих тканевой фактор, и его применение

Country Status (24)

Country Link
US (5) US9168314B2 (ru)
EP (2) EP2582728B1 (ru)
JP (1) JP6055404B2 (ru)
KR (1) KR101935058B1 (ru)
CN (3) CN106084053B (ru)
AU (1) AU2011267106B2 (ru)
BR (1) BR112012031727B1 (ru)
CA (1) CA2802782C (ru)
CY (1) CY1119616T1 (ru)
DK (1) DK2582728T3 (ru)
EA (1) EA034675B1 (ru)
ES (1) ES2647388T3 (ru)
HR (1) HRP20171789T1 (ru)
HU (1) HUE035599T2 (ru)
LT (1) LT2582728T (ru)
ME (1) ME02919B (ru)
MX (1) MX347893B (ru)
NO (1) NO2582728T3 (ru)
NZ (1) NZ604718A (ru)
PL (1) PL2582728T3 (ru)
PT (1) PT2582728T (ru)
RS (1) RS56599B1 (ru)
SI (1) SI2582728T1 (ru)
WO (1) WO2011157741A2 (ru)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1578397B1 (en) 2002-11-15 2012-12-26 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd25
UA109633C2 (uk) 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
NO2582728T3 (ru) 2010-06-15 2018-01-20
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
CN104736174B (zh) 2012-07-06 2019-06-14 根马布私人有限公司 具有三重突变的二聚体蛋白质
KR20160007478A (ko) 2013-01-10 2016-01-20 젠맵 비. 브이 인간 IgG1 Fc 영역 변이체 및 그의 용도
CN103342752B (zh) * 2013-05-16 2014-07-09 太原博奥特生物技术有限公司 一种抗人组织因子单链抗体及其制备方法
WO2015075201A1 (en) * 2013-11-21 2015-05-28 Genmab A/S Antibody-drug conjugate lyophilised formulation
JP5957637B2 (ja) * 2014-02-03 2016-07-27 国立研究開発法人国立がん研究センター 抗ＴｉｓｓｕｅＦａｃｔｏｒモノクローナル抗体
RU2016141267A (ru) * 2014-03-21 2018-04-24 Эббви Инк. Антитела против egfr и конъюгаты антитело-лекарственное средство
CN106170300A (zh) * 2014-04-08 2016-11-30 西雅图基因公司 Cd19‑抗体药物偶联物的优化给药
CA2929542A1 (en) * 2015-05-13 2016-11-13 Pfizer Inc. Treatment with anti-efna4 antibody-drug conjugates
BR112017027690A2 (pt) 2015-06-29 2018-10-09 Daiichi Sankyo Co Ltd “método para produção de uma composição de conjugado anticorpo-fármaco, e, composição de conjugado anticorpo-fármaco
CA2990837A1 (en) * 2015-07-22 2017-01-26 Iconic Therapeutics, Inc. Methods for treating disorders associated with angiogenesis and neovascularization
CN106467574B (zh) * 2015-08-20 2019-09-20 复旦大学 靶向于组织因子的抗体、其制备方法和用途
US20190030178A1 (en) 2015-09-11 2019-01-31 Genmab A/S Dosing regimens for anti-tf-antibody drug-conjugates
SG10202007520WA (en) 2016-03-02 2020-09-29 Eisai R&D Man Co Ltd Eribulin-based antibody-drug conjugates and methods of use
EP3430055B1 (en) * 2016-03-17 2020-10-28 Oslo Universitetssykehus HF Fusion proteins targeting tumour associated macrophages for treating cancer
KR20220004226A (ko) 2016-03-22 2022-01-11 바이오노믹스 리미티드 항-lgr5 단클론성 항체의 투여
CN106938051B (zh) * 2016-08-22 2019-10-11 复旦大学 靶向于组织因子的抗体-药物偶联物
US10676537B2 (en) 2016-08-22 2020-06-09 Fudan University Antibody targeted to tissue factor, preparation method therefor, and use thereof
BR112019008702A2 (pt) 2016-11-01 2019-07-16 Genmab B.V. polipeptídeo, método de diminuição de uma função fc efetora de um polipeptídeo, composição, método de tratamento, kit de partes, e, uso de um polipeptídeo ou composição.
AU2018211561B2 (en) * 2017-01-24 2020-04-30 Pfizer Inc. Calicheamicin derivatives and antibody drug conjugates thereof
BR112019015900A2 (pt) 2017-02-10 2020-04-07 Genmab B.V. polipeptídeo, métodos para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo, para aumentar a atividade de cdc de um polipeptídeo e de tratamento de um indivíduo tendo uma doença, composição, kit de partes, e, uso de um polipeptídeo ou uma composição
CN113512111B (zh) * 2017-03-10 2023-08-15 北京天广实生物技术股份有限公司 抗埃博拉病毒单克隆抗体、其制备方法及用途
CA3080137A1 (en) * 2017-11-02 2019-05-09 Genmab A/S Anti-tissue factor antibody-drug conjugates and their use in the treatment of cancer
CN111727075B (zh) * 2017-11-27 2024-04-05 普渡制药公司 靶向人组织因子的人源化抗体
CN111818943A (zh) * 2018-01-04 2020-10-23 伊科尼克治疗公司 抗组织因子抗体、抗体-药物缀合物及相关方法
JP2021510740A (ja) 2018-01-24 2021-04-30 ゲンマブ ビー．ブイ． ポリペプチド変種およびそれらの用途
CA3091217A1 (en) * 2018-03-07 2019-09-12 Genmab A/S Anti-tissue factor antibody-drug conjugates and their use in the treatment of cancer
KR20200135416A (ko) * 2018-03-21 2020-12-02 젠맵 에이/에스 백금-기반 작용제와 항-조직 인자 항체-약물 접합체의 조합을 사용하여 암을 치료하는 방법
BR112020022179A2 (pt) 2018-05-03 2021-02-02 Genmab B.V. primeiro anticorpo, anticorpo, composição, métodos para tratar um indivíduo tendo uma doença, para esgotar uma população de célula e para induzir a proliferação em uma população de célula, e, kit.
KR20210044183A (ko) * 2018-05-07 2021-04-22 젠맵 에이/에스 항-pd-1 항체 및 항-조직 인자 항체-약물 접합체의 조합을 사용하여 암을 치료하는 방법
EA202092136A1 (ru) 2018-05-07 2021-03-22 Генмаб А/С Способы лечения рака с помощью комбинации антитела к pd-1 и конъюгата антитела к тканевому фактору и лекарственного средства
BR112021001691A2 (pt) * 2018-08-16 2021-05-04 Genmab A/S método de tratamento de câncer de ovário, câncer peritoneal ou câncer de trompa de falópio, e, kit
JP2022513386A (ja) * 2018-10-30 2022-02-07 ゲンマブ エー／エス 抗ｖｅｇｆ抗体と抗組織因子抗体－薬物コンジュゲートとの組み合わせを用いてがんを治療する方法
AU2020299398A1 (en) * 2019-07-03 2022-02-24 Iconic Therapeutics Llc Anti-tissue factor antibody-drug conjugates and related methods
JP2023500701A (ja) 2019-11-06 2023-01-10 ジェンマブ ビー．ブイ． 抗体変種の組み合わせおよびその使用
TW202132343A (zh) 2019-11-07 2021-09-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 使用抗ｐｄ－１抗體與抗組織因子抗體－藥物共軛體之組合以治療癌症之方法
TW202131954A (zh) 2019-11-07 2021-09-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 利用鉑類劑與抗組織因子抗體－藥物共軛體之組合來治療癌症之方法
AU2020412805A1 (en) * 2019-12-26 2022-07-14 Hendrix College Methods and compositions for inhibition of dihydroorotate dehydrogenase in combination with an anti-CD38 therapeutic agent
US20230263902A1 (en) 2020-06-29 2023-08-24 Genmab A/S Anti-tissue factor antibody-drug conjugates and their use in the treatment of cancer
US20220089736A1 (en) * 2020-09-11 2022-03-24 Janssen Biotech, Inc. Immune targeting molecules and uses thereof
US11965024B2 (en) 2020-09-11 2024-04-23 Janssen Biotech, Inc. Methods and compositions for modulating beta chain mediated immunity
MX2023004941A (es) 2020-11-08 2023-07-12 Seagen Inc Conjugado de anticuerpo y fármaco para terapia de combinación con inhibidor de células inmunitarias.
CN113368232B (zh) * 2021-06-02 2022-08-26 上海交通大学 多特异性抗原结合蛋白及其应用
AU2022320438A1 (en) * 2021-07-29 2024-02-15 Toolgen Incorporated Hemocompatible mesenchymal stem cells, preparation method therefor and use thereof
TW202408583A (zh) 2022-05-06 2024-03-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 使用抗組織因子抗體－藥物共軛體以治療癌症之方法
WO2024083162A1 (en) * 2022-10-19 2024-04-25 Multitude Therapeutics Inc. Antibodies, antibody-drug conjugates, preparations and uses thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004094475A2 (en) * 2003-04-22 2004-11-04 Euro-Celtique S.A. Tissue factor antibodies and uses thereof
WO2005025623A2 (en) * 2003-07-28 2005-03-24 Emory University Ef-24-factor vii conjugates
WO2008137382A1 (en) * 2007-04-30 2008-11-13 Centocor, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions with enhanced effector function
WO2010066803A2 (en) * 2008-12-09 2010-06-17 Genmab A/S Human antibodies aganist tissue factor.

Family Cites Families (133)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US505731A (en) 1893-09-26 Ice oeeam feeezee
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
JP2532858B2 (ja) 1985-04-01 1996-09-11 セルテツク リミテツド 形質転換したミエロ―マ細胞系
US5981216A (en) 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
US5589173A (en) 1986-11-04 1996-12-31 Genentech, Inc. Method and therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction
US5437864A (en) 1987-03-31 1995-08-01 The Scripps Research Institute Method of inhibiting blood coagulation in extracorporeal circulation by inhibiting human tissue factor
US5223427A (en) * 1987-03-31 1993-06-29 The Scripps Research Institute Hybridomas producing monoclonal antibodies reactive with human tissue-factor glycoprotein heavy chain
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5879936A (en) 1988-04-18 1999-03-09 Aluguisse Holding A.G. Recombinant DNA methods, vectors and host cells
WO1989012463A1 (en) 1988-06-21 1989-12-28 Genentech, Inc. Method and therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5102990A (en) 1989-08-09 1992-04-07 Rhomed Incorporated Direct radiolabeling of antibodies and other proteins with technetium or rhenium
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
DE779362T1 (de) 1989-12-22 2001-04-05 Applied Research Systems DNS-Konstrukten zur Aktivierung und Veränderung der Expression von endogenen Genen
US5891693A (en) 1990-01-25 1999-04-06 Alusuisse Holdings A.G. Recombinant DNA methods vectors and host cells
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5506134A (en) 1990-10-22 1996-04-09 Corvas International, Inc. Hypridoma and monoclonal antibody which inhibits blood coagulation tissue factor/factor VIIa complex
JP3149960B2 (ja) 1991-01-24 2001-03-26 財団法人化学及血清療法研究所 ヒト組織因子を定量する方法
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
JPH06508880A (ja) 1991-07-08 1994-10-06 ユニバーシティ　オブ　マサチューセッツ　アット　アムハースト サーモトロピック液晶セグメント化ブロックコポリマー
US6063630A (en) 1991-11-05 2000-05-16 Transkaryotic Therapies, Inc. Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JPH05244988A (ja) 1992-03-04 1993-09-24 Green Cross Corp:The 抗組織因子モノクローナル抗体、及びこれによる免疫抑制剤
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
AU5093593A (en) 1992-08-28 1994-03-29 Scripps Research Institute, The Inhibition of tumor metastasis via neutralization of tissue factor function
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5879677A (en) 1992-12-09 1999-03-09 The Scripps Research Institute Method for inhibition of cerebral tissue factor mediated reperfusion damage
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
PT804070E (pt) 1993-03-09 2000-11-30 Genzyme Corp Isolamento de componentes de interesse a partir do leite.
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
US5879687A (en) 1994-04-22 1999-03-09 Corixa Corporation Methods for enhancement of protective immune responses
PT771216E (pt) 1994-07-11 2001-07-31 Scripps Research Inst Metodos e composicoes para a coagulacao especifica da vasculatura tumoral
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5703057A (en) 1995-04-07 1997-12-30 Board Of Regents The University Of Texas System Expression library immunization
PT833911E (pt) 1995-06-07 2004-09-30 Ortho Mcneil Pharm Inc Anticorpos anti-factor tecidular enxertados com cdr e metodos para a sua utilizacao
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
JPH09302000A (ja) 1996-05-16 1997-11-25 Chemo Sero Therapeut Res Inst 抗組織因子モノクローナル抗体及び当該モノクローナル抗体を用いた組織因子凝固活性の測定法
US6593291B1 (en) 1997-02-06 2003-07-15 Entremed, Inc. Compositions and methods of use of ligands that bind components of the blood coagulation/clotting pathway for the treatment of cancer and angiogenic-based disease
US7749498B2 (en) 1997-03-10 2010-07-06 Genentech, Inc. Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
US20040229282A1 (en) 1997-03-10 2004-11-18 Sunol Molecular Corporation Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
US5986065A (en) 1997-03-10 1999-11-16 Sunol Molecular Corporation Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
US6719977B1 (en) 1998-02-12 2004-04-13 The General Hospital Corporation Methods to potentiate cancer therapies
EP1068296B1 (en) 1998-03-31 2011-08-10 Geron Corporation Compositions for eliciting an immune response to a telomerase antigen
IL138801A0 (en) 1998-04-03 2001-10-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized antibody against human tissue factor and process for the preparation thereof
ATE369428T1 (de) 1998-09-04 2007-08-15 Sanofi Pasteur Ltd Behandlung von gebärmutterhalskrebs
US6387888B1 (en) 1998-09-30 2002-05-14 American Foundation For Biological Research, Inc. Immunotherapy of cancer through expression of truncated tumor or tumor-associated antigen
EP1150918B1 (en) 1999-02-03 2004-09-15 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Method of manufacturing therapeutic calcium phosphate particles
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
DE60037896D1 (de) 1999-07-29 2008-03-13 Medarex Inc Menschliche antikörper gegen her2/neu
EP1792991A1 (en) 1999-08-24 2007-06-06 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
JP2001213804A (ja) 2000-01-31 2001-08-07 Chugai Pharmaceut Co Ltd 抗組織因子抗体の複合体
AU2001250814B2 (en) 2000-03-16 2007-02-15 Genentech, Inc. Anti-tissue factor antibodies with enhanced anticoagulant potency
US6713055B2 (en) 2000-11-27 2004-03-30 Geron Corporation Glycosyltransferase vectors for treating cancer
US20040018194A1 (en) 2000-11-28 2004-01-29 Francisco Joseph A. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
US7041870B2 (en) 2000-11-30 2006-05-09 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
EP1374896A4 (en) 2001-03-26 2005-04-06 Koji Suzuki MEANS TO IMPROVE THE FLUID CHARACTERISTICS OF BLOOD
MXPA03011094A (es) 2001-05-31 2004-12-06 Medarex Inc Citotoxinas, profarmacos, ligadores, y estabilizadores utiles para ello.
US7247304B2 (en) 2001-08-23 2007-07-24 Genmab A/S Methods of treating using anti-IL-15 antibodies
SI1425389T1 (sl) 2001-08-23 2012-02-29 Genmab As Humana protitelesa, specifična za interlevkin 15 (IL-15)
DE60232733D1 (de) 2001-08-30 2009-08-06 Sinai School Medicine Alternativ gesplicter zirkulierender gewebefaktor
IL160998A0 (en) 2001-10-02 2004-08-31 Novo Nordisk As Human tissue factor antibodies
TWI338009B (en) 2001-10-29 2011-03-01 Genentech Inc Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
AU2002336920A1 (en) 2001-11-02 2003-05-12 Novo Nordisk Health Care Ag Use of tissue factor agonist or tissue factor antagonist for treatment of conditions related to apoptosis
WO2003070275A1 (en) 2002-02-22 2003-08-28 Prophy Med Ab Use of an inhibitor or antagonist against tissue factor
UA81114C2 (en) 2002-05-01 2007-12-10 Schering Ag Novel antibodies to tissue factor as anticoagulants
WO2004007557A2 (en) 2002-07-12 2004-01-22 Novo Nordisk A/S Tf antagonist
AU2003263964C1 (en) 2002-07-31 2010-08-19 Seagen Inc. Drug conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
WO2004039842A2 (en) 2002-10-31 2004-05-13 Novo Nordisk A/S Humanized tissue factor antibodies
WO2004041296A2 (en) 2002-11-06 2004-05-21 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical composition comprising a tissue factor antagonist and protein c polypeptides
WO2004041302A1 (en) 2002-11-06 2004-05-21 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical composition comprising a tissue factor antagonist and a blood glucose regulator
AU2003282624A1 (en) 2002-11-14 2004-06-03 Syntarga B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
EP1578397B1 (en) 2002-11-15 2012-12-26 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd25
US7282568B2 (en) 2002-12-16 2007-10-16 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies against interleukin 8 (IL-8)
EP1587549A2 (en) 2003-01-22 2005-10-26 Novo Nordisk A/S Radiolabelled tissue factor binding agent and the use thereof
US20060034846A1 (en) 2003-04-14 2006-02-16 Mirella Ezban Use of TF antagonists
CA2526080A1 (en) 2003-05-30 2005-01-06 Genentech, Inc. Polypeptides that bind an anti-tissue factor antibody and uses thereof
US7605235B2 (en) 2003-05-30 2009-10-20 Centocor, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
WO2004110363A2 (en) 2003-05-30 2004-12-23 Centocor, Inc. Method of inhibiting tumor growth with anti-tissue factor antibodies
JP5114055B2 (ja) 2003-06-19 2013-01-09 ジェネンテック， インク． 障害に関連する凝固の治療用組成物および方法
WO2005020927A2 (en) 2003-08-29 2005-03-10 Centocor, Inc. Method of promoting graft survival with anti-tissue factor antibodies
SI1725249T1 (sl) 2003-11-06 2014-04-30 Seattle Genetics, Inc. Spojine monometilvalina, sposobne konjugacije na ligande
JP4942487B2 (ja) 2003-12-10 2012-05-30 メダレックス インコーポレーティッド Ｉｐ−１０抗体およびその用途
JP2007523099A (ja) 2004-02-20 2007-08-16 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ 組み合わせ療法
WO2005118646A2 (en) 2004-04-26 2005-12-15 Centocor, Inc. Epitope directed selection of antibodies to murine tissue factor
EP2286844A3 (en) 2004-06-01 2012-08-22 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
ES2387312T3 (es) 2004-09-22 2012-09-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anticuerpos IgG4 humanos estabilizados
EP1676574A3 (en) 2004-12-30 2006-07-26 Johnson &amp; Johnson Vision Care, Inc. Methods for promoting survival of transplanted tissues and cells
CA2617907A1 (en) 2005-08-05 2007-02-15 Syntarga B.V. Triazole-containing releasable linkers and conjugates comprising the same
CA2626100A1 (en) 2005-10-21 2007-08-30 Genentech, Inc. Treatment for antiphospholipid-syndrome-related pregnancy complications
WO2007056352A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 The Scripps Research Institute Compositions and methods for controlling tissue factor signaling specificity
KR20080090406A (ko) 2005-11-28 2008-10-08 젠맵 에이/에스 재조합 １가 항체 및 그의 제조 방법
WO2007076091A2 (en) 2005-12-22 2007-07-05 Genentech, Inc. Treatment of viral infections using a tissue factor inhibitor
US8940784B2 (en) 2006-02-02 2015-01-27 Syntarga B.V. Water-soluble CC-1065 analogs and their conjugates
EP2061814B1 (en) * 2006-10-27 2012-06-06 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
CA2676766A1 (en) * 2007-02-09 2008-08-21 Genentech, Inc. Anti-robo4 antibodies and uses therefor
CA2688275A1 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Stable igg4 antibodies
US8680293B2 (en) 2007-08-01 2014-03-25 Syntarga B.V. Substituted CC-1065 analogs and their conjugates
JP5588866B2 (ja) 2007-08-10 2014-09-10 メダレックス エル．エル．シー． Ｈｃｏ３２およびｈｃｏ２７、ならびに関連実施例
HUE035798T2 (en) 2008-11-03 2018-05-28 Syntarga Bv CC-1065 analogues and conjugates
US20120027772A1 (en) * 2008-11-20 2012-02-02 Genentech, Inc. Therapeutic protein formulations
JP5172811B2 (ja) 2009-10-27 2013-03-27 株式会社ジェイエスピー 発泡性スチレン系樹脂粒子及び該樹脂粒子の製造方法、並びにスチレン系樹脂発泡粒子成形体
NO2582728T3 (ru) 2010-06-15 2018-01-20
JP5244988B1 (ja) 2012-02-20 2013-07-24 浜松ホトニクス株式会社 濃度測定装置および濃度測定方法
WO2015075201A1 (en) * 2013-11-21 2015-05-28 Genmab A/S Antibody-drug conjugate lyophilised formulation

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004094475A2 (en) * 2003-04-22 2004-11-04 Euro-Celtique S.A. Tissue factor antibodies and uses thereof
WO2005025623A2 (en) * 2003-07-28 2005-03-24 Emory University Ef-24-factor vii conjugates
WO2008137382A1 (en) * 2007-04-30 2008-11-13 Centocor, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions with enhanced effector function
WO2010066803A2 (en) * 2008-12-09 2010-06-17 Genmab A/S Human antibodies aganist tissue factor.

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAIYANG WANG, MARC BERGER, GREGG MASTERS, EARL ALBONE, QIFENG YANG, JOSEPHINE SHEEDY, YOLANDA KIRKSEY, LISA GRIMM, BO WANG, JUDITH: "Radiotherapy of Human Xenograft NSCLC Tumors in Nude Mice with a 90 Y-Labeled Anti-Tissue Factor Antibody", CANCER BIOTHERAPY & RADIOPHARMACEUTICALS, MARY ANN LIEBERT, INC., vol. 20, no. 3, 1 June 2005 (2005-06-01), pages 300 - 309, XP055007882, ISSN: 10849785, DOI: 10.1089/cbr.2005.20.300 *
JACKSON DOWDY, ET AL: "A Human Antibody-Drug Conjugate Targeting EphA2 Inhibits Tumor Growth In vivo", CANCER RESEARCH, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH., AACR ANNUAL MEETING 2018; APRIL 14-18, 2018; CHICAGO, IL, vol. 68, no. 22, 15 November 2008 (2008-11-15), AACR Annual Meeting 2018; April 14-18, 2018; Chicago, IL, pages 9367 - 9374, XP002563032, ISSN: 0008-5472, DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-08-1933 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130117751A (ko) 2013-10-28
NO2582728T3 (ru) 2018-01-20
NZ604718A (en) 2015-01-30
AU2011267106A1 (en) 2013-01-10
LT2582728T (lt) 2017-12-11
CN106084053A (zh) 2016-11-09
WO2011157741A2 (en) 2011-12-22
BR112012031727A2 (pt) 2016-10-11
ES2647388T3 (es) 2017-12-21
CY1119616T1 (el) 2018-04-04
EA201300016A1 (ru) 2013-06-28
CA2802782C (en) 2018-03-13
RS56599B1 (sr) 2018-02-28
EP2582728A2 (en) 2013-04-24
MX2012014552A (es) 2013-01-29
CN111012921A (zh) 2020-04-17
EP3281956A3 (en) 2018-04-18
BR112012031727B1 (pt) 2022-03-29
ME02919B (me) 2018-04-20
JP6055404B2 (ja) 2016-12-27
HRP20171789T1 (hr) 2017-12-29
MX347893B (es) 2017-05-18
US9492565B2 (en) 2016-11-15
DK2582728T3 (da) 2017-11-27
CN103119065B (zh) 2016-08-03
US20130101608A1 (en) 2013-04-25
US20210395384A1 (en) 2021-12-23
EP2582728B1 (en) 2017-08-23
US20170136130A1 (en) 2017-05-18
US9168314B2 (en) 2015-10-27
AU2011267106B2 (en) 2015-05-14
KR101935058B1 (ko) 2019-01-03
SI2582728T1 (en) 2018-01-31
CA2802782A1 (en) 2011-12-22
CN103119065A (zh) 2013-05-22
CN106084053B (zh) 2020-01-17
WO2011157741A3 (en) 2012-03-08
EP3281956A2 (en) 2018-02-14
US20160067349A1 (en) 2016-03-10
JP2013532148A (ja) 2013-08-15
PL2582728T3 (pl) 2018-01-31
US20190315880A1 (en) 2019-10-17
PT2582728T (pt) 2017-11-23
HUE035599T2 (en) 2018-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210395384A1 (en) Human antibody drug conjugates against tissue factor
US20220323582A1 (en) Human antibodies and antibody-drug conjugates against cd74
KR101998492B1 (ko) 조직 인자에 대한 인간 항체
AU2013203136A1 (en) Human antibody drug conjugates against tissue factor
NZ717560A (en) Human antibodies and antibody-drug conjugates against cd74
NZ717560B2 (en) Human antibodies and antibody-drug conjugates against cd74