MX2007013973A - Determinacion de la respuesta a la quimioterapia. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para determinar si una muestra biologica que contiene celulas cancerigenas de pulmon humanas es sensible a una combinacion de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidermico y un agente quimioterapeutico mediante la determinacion de la sobreexposicion de una proteina AKT fosforilada o una proteina MAPK fosforilada en la muestra biologica. La invencion tambien se refiere a metodos para obtener un agente candidato o seleccionar una composicion para inhibir la progresion de las celulas cancerigenas de pulmon en un paciente en el que se utiliza una proteina Akt fosforilada o una proteina MAPK fosforilada.

Description

DETERMINACIÓN DS LA RESPUESTA A LA QUIMIOTERAPIA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para determinar si una muestra biológica que contiene células cancerígenas de pulmón humanas es sensible a una combinación de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimioterapéutico mediante la determinación de la sobreexpresión de una proteína AKT fosforilada o una proteína MAPK fosforilada en la muestra biológica. La invención también se refiere a métodos para obtener un agente candidato o seleccionar una composición para inhibir la progresión de las células cancerígenas de pulmón en un paciente en el que se utiliza una proteína Akt fosforilada o una proteína MAPK fosforilada . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El EGFR, codificado por el gen erbBl , se ha visto implicado causalmente en tumores malignos de humanos . En concreto , se ha observado una expresión aumentada del EGFR en los canceres de mama, vej iga , pulmón, en la cabeza, en el cuello y estómago así como en glioblastomas . El Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR, por sus siglas en inglés ) , una glicoproteína de 170 kD, se compone de un dominio extracelular N-terminal , un dominio transmembrana hidrofóbico , y una región intracelular C-terminal que contiene el dominio cinasa . La dimerización inducida por el Ref . 185682 ligando de EGFR activa el dominio RTK intrínseco (un dominio de homología Src 1, SHl), resultando en la autofosforilación en seis residuos de tirosina específicos del EGFR en la cola no catalítica del dominio citoplasmático. Los efectos celulares de la activación del EGFR en una célula cancerígena incluyen la proliferación aumentada, la potenciación de la motilidad celular, de la adhesión, de la invasión, de la angiogénesis, y de la supervivencia celular incrementada mediante inhibición de la apoptosis. El EGFR activado induce la proliferación de células tumorales a través de la estimulación de la cascada de la cinasa proteica activada por mitógeno (MAPK, por sus siglas en inglés) . Tras la unión de ligando al EGFR, el factor de intercambio nucleótido de guanina SOS es captado por la membrana plasmática mediante la proteína adaptadora Grb2, que estimula el intercambio de GTP por GDP en la Ras de proteína G pequeña, activando posteriormente la cascada MAPK, formada por Raf, MEK, y ERK. Las ERK (pMAPK, pERKl/2) activadas a su vez fosforilan y activan factores de transcripción tales como ELK-1 o c-Myc, promoviendo el crecimiento celular. Las múltiples vías del factor de crecimiento contribuyen a la progresión y supervivencia de las células NSCLC a través de la activación de varias cinasas. El EGFR también aumenta la supervivencia de células cancerígenas mediante la señalización a través de la vía de fosfatidilinositol-3-cinasa (Pl3K)/Akt y la vía de STAT. La Akt también se estimula con otros factores de crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento de insulina I, el factor de crecimiento de fibroblasto básico y las interleucinas 3 y 6. Las' tres isoformas de Akt 1 a 3 se fosforilan (pAKT) de forma similar en residuos T308 del dominio de activación y S473 del dominio COOH-terminal . El Eriotinib (Tarceva®) es un potente inhibidor de tirosina cinasa (TKI) del receptor del factor de crecimiento epidérmico (HERÍ/EGFR) que proporciona una mejora de la supervivencia en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC, por sus siglas en inglés) que fracasó en la quimioterapia previa cuando se ha utilizado un único agente (WO 01/34574) . La eficacia de Tarceva® se estudió en varios ensayos. Su denominación química es N-{3-etinilfenil) -6, 7-bis {2-metoxietoxi ) quinazolin-4-amina . El ensayo TALENT fue un estudio de fase III controlado con placebo en pacientes con NSCLC de primera línea que recibieron gemcitabina y cisplatino (esta quimioradioterapia simultánea fue el estándar del cuidado no Estadounidense) en combinación con eriotinib (Tarceva®) a 150 mg/día o con placebo. La variable principal fue la duración de la supervivencia, con puntos finales secundarias de tiempo a progresión, tasa de respuesta; duración de respuesta; parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos, y calidad de vida. También se valoraron las tasas de expresión de HER1/EGFR y HER2. Se realizó un análisis de seguridad estándar. El resultado general del ensayo TALENT fue negativo. Para las puntos finales primario y secundario no se observó ningún beneficio demostrable al comparar el eriotinib (Tarceva™) más quimioterapia (gemcitabina y cisplatino) con la gemcitabina y el cisplatino solos (Gatzemeier, U. , y otros, Proc Am Soc Clin Oncol 23 (2004) 617 (Resumen 7010)). Se observaron resultados idénticos en el estudio TRIBUTE basado en EE.UU., con eriotinib más carboplatino y paclitaxel (Herbst, R.S., y otros, J Clin Oncol (2004) ASCO Annual Meeting Proceedings. Post-Meeting Edition 22 (Sup. 15 de Julio) (Resumen 7011) ) . Un estudio de fase III aleatorizado y controlado por placebo del erlotimib como único agente como tratamiento de segunda o tercera línea para cáncer de pulmón de célµlas no pequeñas (NSCLC) (BR.21J NCIC/OSIP) encontró una mejora estadísticamente importante de la supervivencia al comparar el eriotinib (6.7 meses) con el placebo (4.7 meses). Varios estudios están relacionados con la investigación de los biomarcadores de cáncer de pulmón de células no pequeñas y su relación con determinadas sustancias inhibidoras de los EGFR. Han, y otros, Int J Cáncer 113 (2005) 109-115 investigan sobre 65 pacientes con monotratamiento con Gefitinib (Iressa™, EGFR TKI) . Analizan el papel de las moléculas en dirección 3 ' del EGFR como marcadores predictivos de respuesta para gefitinib en cánceres de pulmón de células no pequeñas resistentes a la quimioterapia. Cappuzzo, F. y otros, JNCI 96 (2004) 1133-1141 investigan sobre 106 pacientes con monoterapia de Gefitinib (Iressa; EGFR TKI) . Investigan la fosforilación de Akt y la eficacia del gefitinib en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas avanzado y descubren que los pacientes con tumores P-Akt-positivos que recibieron gefitinib se beneficiaron más del tratamiento que los pacientes con tumores P-Akt-negativos . Vincent, S. y otros, Br J Cáncer 90 (2004) 1047-1052 investigaron sobre 111 pacientes con NSCLC. Descubren que la pERK está activada en el cáncer de pulmón de células no pequeñas y está asociada a tumores avanzados. Han, S. W. y otros, J Clin Oncol 23 (2005) 2493-2501 investigan sobre 90 pacientes con monoterapia de Gefitinib (EGFR TKl) . Analizan el impacto predictivo y de pronóstico de la Mutación del 'Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas tratados con gefitinib. Mukohara, T. y otros, Lung Cáncer 41 (2003) 123-130 investigan sobre 60 pacientes, 20 pacientes por fase que o bien recibieron quimioterapia con neoadyuvante o radiación. La expresión del EGFR está relacionada con la expresión de pERK y pAkt . El tamaño de la muestra es demasiado bajo, como mencionan los propios autores. Raben, D y otros, Int J Radiation oncology Biol. Phys 59 (2004) 27-38 investigan tratamientos dirigidos para cáncer de pulmón de células no pequeñas. Ono, M. y otros, Mol Cáncer Ther 3 (2004) 465-472 ensayan con 9 líneas celulares de NSCLC y trataron con gefitinib. Hirsch, F.R. y otros, Curr Opin Oncol 17 (2005) 118-122 analizan el estado de fosforilación de Akt y de la MAPK como marcadores potenciales para la resistencia del gefitinib. Meert, y otros, Clinical Cáncer Research 9 (2003) 2316-2326 investigan líneas celulares de NSCLC con relación a la actividad inhibidora del EGFR. Ni los niveles de expresión de EGFR ni los de Her2 tienen relación con la sensibilidad a inhibidores de los EGFR. Brognard, J. y otros, Cell Death and Differentiation 9 (2002) 893-904 analizaron 19 líneas celulares de NSCLC, 17 de las cuales mostraron fosforilación de Erkl/2 y actividad constitutiva. David, O. y otros, Clinical cáncer research 10 (2004) 6865-6871 describen que la sobreexpresión de la pAkt es un factor de pronóstico independiente de las NSCLC . Kakiuchi , S . y otros , Human Molecular Genetics 13 (2004) 3029-3043 investigan un microensayo de ADNc de genoma amplio de 33 pacientes con NSCLC. Todos recibieron gefitinib dentro de un patrón monoterapéutico. No se encontraron pruebas que relacionasen los niveles de expresión de Akt/pAkt, el estado del gen EGFR o la tinción del pEGFR y la respuesta al gefitinib. Kim, R.H. y otros, Cáncer Cell 7 (2005) 263-273 revelaron que la expresión de DJ-1, un oncogen, es equivalente al nivel de la pAkt. Balsara, B.R. y otros, Carcinogenesis 25 (2004) 2053-2059 investigan sobre 110 pacientes con NSCLC con la expresión de TMA pAkt. No existen diferencias significativas en la supervivencia entre la presencia y ausencia de la pAkt. Hira i, Y. y otros, Cáncer letters 214 (2004) 157-164 investigan la relación entre el receptor de factor de crecimiento epidérmico, la pAkt y el factor lalpha inducido por hipoxia en los cánceres de pulmón de células no pequeñas . Lee, S.H. y otros, APMIS 110 (2002) 587-592 analizan 43 metástasis LN de pacientes con NSCLC. La activación de Akt en NSCLC desempeña un papel en el desarrollo de tumores más que en su progresión. Engelman, J.A. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2004) 3788-3793 analizan la mediación de erbB-3 sobre la actividad de la fosfoinositido 3-cinasa en las líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas sensibles a gefitinib. David, O., J Cell Mol Med 5 (2001) 430-433 describe el papel de la Akt y el PTEN como nuevos marcadores de diagnostico en el cáncer de pulmón. Mantha, A. y otros, Clin. Cáncer Res. 11 (2005) 2398-2407 investigan la dirección de la vía del mevalonato que inhibe el funcionamiento del receptor del factor de crecimiento epidérmico. Los marcadores de pronóstico asociados con el cáncer positivo en EGFR se investigan en WO 2004/046386. Los marcadores de expresión génica para la respuesta a sustancias inhibidoras de los EGFR se describen en US 2004/0157255. Los biomarcadores y métodos para determinar la sensibilidad a moduladores del receptor de crecimiento epidérmico se describen en WO 2004/063709. La WO 01/00245 describe los anti-cuerpos anti-Erb B2 humanizados y los métodos para tratar el cáncer con anticuerpos anti-Erb B2 , tales como los anti-cuerpos anti-Erb B2 humanizados BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIOH Todavía existe la necesidad de proporcionar métodos para la determinación de la sensibilidad al tratamiento con inhibidores de los EGFR, en concreto para tratamientos combinados de un inhibidor de los EGFR con un agente quimioterapéutico . Por lo tanto, en una modalidad de la invención, se proporciona un método para determinar si una muestra biológica que contiene células cancerígenas de pulmón humanas es sensible a una combinación de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimioterapéutico, consistiendo el método en la determinación de la sobreexpresión de una proteína AKT fosforilada o una proteína MAPK fosforilada en la muestra biológica, donde la sobreexpresión de la proteína AKT fosforilada o la proteína MAPK fo^sforilada indica que la muestra biológica que contiene células cancerígenas de pulmón humanas es sensible a una combinación de un inhibidor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimioterapéutico. En otra modalidad de la invención, se utiliza un anticuerpo que se une a la proteína AKT fosforilada o un anticuerpo que se une a la proteína MAPK para determinar si una muestra biológica que contiene células cancerígenas humanas, es sensible a una combinación de un inhibidor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimioterapéutico . En otra modalidad de la invención, se proporciona un método para seleccionar una fórmula para inhibir la progresión del cáncer de pulmón en un paciente, dicho método formado por los siguientes pasos: a) exponer por separado alícuotas de una muestra biológica que contiene células cancerígenas de pulmón humanas sensibles a una combinación de un inhibidor del EGFR y un agente quimioterapéutico del paciente en presencia de varias composiciones de prueba; b) comparar el nivel de expresión de una proteína Akt fosforilada y/o una proteína MAPK fosforilada en las alícuotas de la muestra biológica puesta en contacto con las composiciones de prueba y el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en una alícuota de la muestra biológica no puesta en contacto con las composiciones de prueba, c) seleccionar una de las composiciones de prueba que altera el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada y/o la proteína MAPK fosforilada en la alícuota que contiene la composición de prueba, relativa a la alícuota que no está en contacto con la composición de prueba donde la existencia de una diferencia de al menos un 10% entre el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica puesta en contacto con la composición de prueba y el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica no puesta en contacto con la composición de prueba es una indicación para la selección de la composición de prueba . Aún en otra modalidad de la invención, se proporciona un método para obtener un agente candidato, consistiendo dicho método en: (a) poner en contacto una alícuota de una muestra biológica que contiene células de cáncer de pulmón sensibles a un inhibidor del EGFR y a un agente quimioterapéutico con el agente candidato, (b) determinar el nivel de expresión de una proteína Akt fosforilada o una proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica puesta en contacto con el agente candidato y determinar el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en una alícuota de la muestra biológica no puesta en contacto con el agente candidato, (c) observar el efecto del agente candidato mediante comparación del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica puesta en contacto con el agente candidato y el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica no puesta en contacto con el agente can-didato, (d) obtener dicho agente a partir de dicho efecto observado, donde la existencia de al menos un 10% de diferencia entre el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica puesta en contacto con el agente candidato y el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica no puesta en contacto con el agente indica un efecto del agente candidato. En otra modalidad de la invención, se proporcionan un agente candidato obtenido a partir del método según la invención y una preparación farmacéutica que contiene un agente según la invención. Aún en otra modalidad de la invención un agente de acuerdo con la invención se utiliza para la preparación de una fórmula para inhibir la progresión del cáncer de pulmón. En aun otra modalidad de la invención, se proporciona un método para producir un fármaco que contiene los pasos del método de la invención y (i) sintetizar el agente candidato identificado en el paso (c) o un análogo o derivado del mismo en una cantidad suficiente para proporcionar dicho fármaco en una cantidad terapéutica parte efectiva a un participante o (ii) combinar el agente candidato identificado en el paso (c) o un análogo o derivado del mismo con un excipiente farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad de la invención se utiliza una proteína Akt, una proteína MAPK, una proteína Akt fosforilada, una proteína MAPK fosforilada, un anticuerpo unido selectivamente a una proteína Akt fosforilada o una proteína MAPK fosforilada para obtener un agente candidato o para seleccionar una fórmula para inhibir la progresión del cáncer de pulmón. En aun otra modalidad de la invención, se proporciona un kit que contiene un anticuerpo contra la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada. El término "muestra biológica" pretende significar generalmente cualquier muestra biológica obtenida a partir de un individuo, fluido corporal, línea celular, cultivo celular, u otra fuente. Son ejemplos de fluidos corporales: linfa, suero, plasma, orina, semen, líquido sinovial y el líquido raquídeo. De acuerdo con la invención, la muestra biológica contiene células de cáncer de pulmón y células que no son de cáncer de pulmón (otras células) . En ese campo se conocen los métodos para obtener biopsias tisulares y fluidos corporales de mamíferos. El término "nivel de expresión" se refiere en general a la cantidad de un producto aminoacídico o proteína en la muestra, preferiblemente la cantidad de un producto aminoacídico fosforilado o una proteína fosforilada en la muestra de acuerdo con la invención. El término "expresión" se refiere al proceso mediante el cual la información codificada genéticamente se transforma en las estructuras presentes y operativas en la célula incluyendo su fosforilación según la invención. Tal y como se utiliza aquí, el término "genes expresados" incluye aquellos que se transcriben a ARNm y luego se traducen a proteína y se modifican tras la traducción, por ejemplo siendo fosforilados. Para completar la definición, el término también incluye los genes expresados que se transcriben a ARN pero no se traducen en proteínas (por ejemplo, AR? de transferencia y ribosomales) . Los términos "sobreexpresión" e "infraexpresión" se refieren a una desviación hacia arriba o hacia abajo, respectivamente, de los niveles de expresión al compararlos con los niveles de expresión basal en una muestra utilizada como control. "Sobreexpresión" también significa, por lo tanto, "expresión aumentada" e "infraexpresión" significa "expresión disminuida". El término "anticuerpo" aquí se utiliza en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos muítiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo, mientras que exhiban la actividad biológica deseada. El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que abarcan la población son idénticos a excepción de la posible aparición de mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores . Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste a las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen distintos anticuerpos dirigidos contra distintos determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante sobre el antígeno. Además de por • su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque se pueden sintetizar sin contaminación por parte dé otros anticuerpos. El adjetivo "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo al ser obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe ser interpretado como la producción necesaria del anticuerpo por cualquier método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales utilizados de acuerdo con la presente invención pueden producirse mediante el método de hibridoma que fue descrito por primera vez pos Kohler, y otros, Nature 256 (1975) 495, o se puede producir mediante métodos de DNA recombinante (véase, por ejemplo, la patente Estadounidense No. 4,816,567). Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una parte de un anticuerpo intacto. Un anticuerpo "que une" un antígeno de interés de acuerdo con la invención, es decir, la MAPK fosforilada la proteína pAkt fosforilada, es uno capaz de unirse a ese antígeno con suficiente afinidad tal que el anticuerpo sea útil en la detección de la presencia del antígeno. El anticuerpo según la invención es uno que se une a la proteína MAPK fósforilada o a la proteína pAkt fosforilada, se unirá preferentemente a la MAPK fosforilada o la proteína pAkt fosforilada en contraposición a la MAPK no fosforilada o la proteíná pAkt no fosforilada o que no reacciona de forma cruzada: significativamente con la proteína MAPK no fosforilada o la proteína pAkt no fosforilada. En tales modalidades, la proporción de unión del anticuerpo a las proteínas no fosforiladas será inferior al 10% como se determina mediante análisis de separación celular por citometría de flujo (FACS, por sus siglas en inglés) o radioinmunoprecipitación (RÍA, por sus siglas en inglés) . En otras palabras, se unirá específicamente a las MAPK fosforiladas o a la proteína pAkt fosforilada y no se unirá específicamente o no se unirá en absoluto a la MAPK no fosforilada ni a la proteína pAkt no fosforilada. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como el tiotepa y la ciclosfosfamida (CYTOXAN™) ; sulfonatos de alquilo tales como el busulfano, el improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturodopa y urodopa; etileniminas y metilmelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas nitrogenadas tales como cloramb cilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliceamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelo icina, las mitomicinas, el ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, pofiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos del ácido fólico tales como denopterina, el metotrexato, pteropterina, el trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como amino-glutetimida, mitotano, trilostano; recargador del ácido tales como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; acido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofa ina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenameto; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2, 2', 2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; los taxanos, es decir, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; clo-rambucilo; gemcitabino; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; los análogos de platina tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etoposido (VP-16) ; ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; ácido retinoico; las esperamicinas; capecitabina; y las sales farmacéuticamente aceptables, los ácidos o los derivados de cualquiera de los mencionados. En esta definición también se incluyen los agentes1 anti-hormonales que actúan para inhibir o regular la acción hormonal sobre tumores tales como los antiestrógenos que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles, inhibidores de la aromatasa, el 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, la onapristona, y toremifeno (Fareston) ; y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales farmacéuticamente aceptables, los ácidos o los derivados de cualquiera de los mencionados. El "agente quimioterapéutico" en si puede ser una combinación de compuestos químicos útiles en el tratamiento combinado del cáncer como se menciona antes, por ejemplo la combinación puede ser gemcitabina/cisplatino, pero también por ejemplo cisplatino/paclitaxel , cisplatino/docetaxel , cisplatino/vinorelbina, gemcitabiana/carboplatino, o carboplatino/docetaxel . El término "inhibidor del EGFR" se refiere a un agente de tratamiento que se une al EGFR y, opcionalmente, inhibe la activación del EGFR. Los ejemplos de tales agentes incluyen los anticuerpos y a las moléculas pequeñas que se unen a los EGFR. Los ejemplos de anticuerpos que se unen a los EGFR incluyen MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (véase patente Estadounidense 4,943,533, Mendelsohn y otros) y variaciones de los mismos, tales como 225 quimerizado (C225 o Cetuximab; ERBUTIX®) y 225 humano reformado (H225) (véase, WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); los anticuerpos que se unen a los EGFR mutantes tipo 11 (Patente Estadounidense 5,212,290); los anticuerpos humanizados y quiméricos que se unen a los EGFR como se describe en la Patente Estadounidense 5,891,996; y los anticuerpos humanos que se unen a los EGFR, tales como ABX-EGF (véase WO 98/50433, Abgenix) . El anticuerpo anti-EGFR puede conjugarse con un agente citotóxico, generando así un inmunoconjugado (véase, por ejemplo, PE 0 659 439 A2, Merck Patent GmbH). Los ejemplos de moléculas pequeñas que se unen a EGFR incluyen ZD1839 o Gefitinibo (IRESSA™; Astra Zeneca) , CP-358774 (Tarceva®; Genentech/OSI) y AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen) . Para esta aplicación se prefieren en concreto los inhibidores de la tirosina cinasa de los EGFR, en concreto los inhibidores de la tirosina cinasa de los EGFR de molécula pegueña como por ejemplo el Tarceva®. Una "molécula pequeña" puede ser por ejemplo un péptido o un peptidomimético con un peso molecular inferior a unos 10,000 gramos por mol, preferentemente inferior a unos 5,000 gramos por mol. Preferentemente una "molécula pequeña" es un compuesto, es decir, un compuesto orgánico o inorgánico, con un peso molecular inferior a unos 5.000 gramos por mol, preferentemente inferior a unos 1.000 gramos ¡por mol, más preferentemente inferior a los 500 gramos por mol y sales, esteres y otras formas farmacéuticas aceptables de dichos compuestos. Por lo tanto, en una modalidad preferida de la invención el inhibidor de los EGFR es un inhibidor de la tirosina cinasa de los EGFR que es un compuesto con un peso molecular inferior a unos 5.000 gramos por mol, preferentemente inferior a los 1.000 gramos por mol y sales, steres y otras formas farmacéuticamente aceptables de dicho compuesto. En otras palabras, el inhibidor de los EGFR es un compuesto que inhibe la actividad tirosina cinasa de los EGFR y que posee un peso molecular inferior a unos 5,000 gramos por mol, preferentemente inferior a unos 1,000 gramos por mol, más preferentemente inferior a los 500 gramos por mol y sales, esteres y otras formas farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos . La "gemcitabina" es el agente quimioterapéutico 2 ' , 2 ' -difluorodeoxicitidina (dFdC) , que es un análogo pirimidínico de la deoxicitidina en el que la porción de desoxirribosa contiene 2 átomos de flúor en la posición 2'. (véase Heinemann, y otros, Cáncer Res 48 (1988) 4024) . Está comercialmente disponible como Gemzar®, de Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, EE.UU. El "cisplatino" como se utiliza en esta aplicación es el agente quimioterapéutico cis-diaminodicloroplatino (véase, patente Estadounidense 5,562,925) disponible comercialmente como Platinol®, de Bristol-Myers Squibb Company, Nueva York, NY , EE.UU. El "cisplatino" es un complejo metálico pesado que contiene un átomo central de platina rodeado de dos átomos de cloruro y dos moléculas de amoníaco en la posición cis. De acuerdo con la invención, la expresión "una muestra biológica que contiene células humanas de cáncer de pulmón es sensible a una combinación de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimioterapéutico" pretende significar que la muestra biológica que contiene células humanas de cáncer de pulmón es sensible a un tratamiento con una combinación de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico y un agente qui ioterapéutico en contraste con un tratamiento con un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico solo. El término "sensible" también se considerara sinónimo a "reaccionar a" o "mostrar una reacción a", en concreto suponiendo dicha reacción un beneficio para un paciente con cáncer de pulmón. De esta manera se puede determinar si un paciente con cáncer de pulmón es sensible a un tratamiento consistente en una combinación de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimioterapéutico en contraste con un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico solo. Esto significa que el paciente se beneficiará de este tipo de tratamiento. Una proteína "MAPK" es un miembro de una familia de cinasa de proteína de serina/treonina citosólica altamente conservada conocidas como cinasa de proteína activadas con mitógeno (MAPK) o cinasas reguladas por señales extracelulares (ERK, por sus siglas en inglés) . Esta familia de proteínas contiene diversos subgrupos. Las ERK se activan y la tirosina o treonina se fosforilan como respuesta a una amplia variedad de señales extracelulares, incluyendo estrés osmótico, shock de calor, citocinas pro-inflamatorias, hormonas, y mitógenos. El término "proteína MAPK" como se utiliza en la invención se refiere preferiblemente a un miembro de la familia de las proteínas MAPK que consiste o está formado preferiblemente por MAPKl y MAPK3. Las secuencias aminoacídicas de la MAPKl (ERK2) son las SEC ID NO:. 1) y MAPK3 (ERKl) (SEC ID NO:. 2). Estas secuencias aminoacídicas están codificadas por las secuencias de ARNm, es decir, las secuencias de ADNc SEC ID NO:.: 3 y 4 para la MAPKl y SEC ID NO: . 5 para la MAPK 3. Los sitios de fosforilación primarios en la MAPKl son Thrl85 y Tyrl85 y la fosforilación primaria en MAPK3 está en Thr202 y Tyr204. Estos sitios de fosforilación también se reconocen mediante el anticuerpo utilizado en la presente invención, es decir, preferiblemente el suero del anticuerpo policlonal contra las formas fosforiladas de la MAPKl y la MAPK3. El término proteína "Akt" se refiere a una proteína de la subfamilia Akt/PKB de las serina/treonina cinasa de proteína reguladas por segundos mensajeros que consta de tres miembros llamados Aktl/PKBalfa, Akt2/PKBbeta (Staal, S.P., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84 (1987) 5034-5037) Y Akt3/PKBgamma (Nakatani, K. y otros, Biochem. Biophys. Res. Corom. 257 (1999) 906-910; patente Estadounidense 6,881,555) respectivamente. Las isoformas son homologas y se activan mediante fosforilación como respuesta a señales de la fosfatidilinositol 3 ' -OH cinasa (PI3K) . La vía de las Pl3K/Akt/PKB parece desempeñar un papel importante en la regulación de la supervivencia celular/muerte celular (Du-dek, H. et al., Science 275 (1997) 661-665) también en la tumorigénesis. El término "proteína Akt" como se utiliza en esta invención preferiblemente se refiere a un miembro de la familia de proteínas Akt que contiene o preferiblemente consiste en Aktl, Akt2 Y Akt3. La fosforilación de la Aktl/PKBa se da en dos sitios Thr308 y en Ser473 (Meier, R., y otros, J. Biol. Chern. 272 (1997) 30491-30497). Hay sitios de fosforilación equivalentes en Akt2/PKBbeta (Thr309 and Ser474) y Akt3 /PKBgamma (Thr305 and Ser472). El término "proteína Akt fosforilada" se refiere a una proteína "Akt" fosforilada, preferiblemente fosforilada en los sitios anteriormente descritos. El término "Proteína MAPK" tal y como se utiliza en la invención se refiere preferiblemente a un miembro de la familia de proteínas MAPK que contiene o preferiblemente consiste en MAPKl y MAPK3. La Akt también se conoce como 1 RAC-alfa cinasa de proteína de serina/treonina (EC 2.7.1.37) (RAC-PK-alfa) , cinasa de proteína B (PKB) (C-AKT) Y^ la secuencia aminoacídica de la Akt 1 es SEC ID NO:.: 6. La AKT2 también se conoce como RAC-beta cinasa de proteína de serina/treonina humana (EC 2.7.1.37) (RAC-PK-beta) , . cinasa de proteína Akt-2 o cinasa de proteína B, beta (PKB beta) y la secuencia aminoacídica de la Akt 2 es SEC ID NO:.: 7. La AKT3 también se conoce como la RAC- gamma cinasa de proteína serina/treonina humana (EC 2.7.1.37) (RAC-PK-gama) , la cinasa de proteína Akt-3 o cinasa de proteína B, la gamma (PKB gamma) (STK-2) y la secuencia aminoacídica de la Akt 3 es SEC ID NO: . : 8. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 Curvas de Kaplan-Meier para el análisis de tiempo de la muerte (OS) entre todos los pacientes aleatoriamente asignados para el tratamiento con Erlotinib/Gencitabina/Cisplatino (A) o Placebo/Gemcitabina/Cisplatino (los círculos indican los tiempos de observación censurados antes de que ocurra el evento) . Figura 2 Curvas de Kaplan-Meier para el análisis de tiempo de la muerte (OS) entre todos los pacientes con datos de biomarcador, aleatoriamente asignados para el tratamiento con Erlotinib/Gencitabina/Cisplatino (A) o Placebo/Gemcitabina/Cisplatino (los círculos indican los tiempos de observación censurados, cuando la observación se terminó antes de que ocurra el evento) . Figura 3 Curvas de Kaplan-Meier para el análisis de tiempo de la muerte (OS) entre todos los pacientes con datos de biomarcador, aleatoriamente asignados para el tratamiento con Erlotinib/Gencitabina/Cisplatino (A) o Placebo/Gemcitabina/Cisplatino (los círculos indican los tiempos de observación censurados, cuando la observación se terminó antes de que ocurra el evento) . Figura 4 Curvas de Kaplan-Meier para el análisis de tiempo de progresión/muerte (PFS) entre todos los pacientes con datos de biomarcador, aleatoriamente asignados para el tratamiento con Erlotinib/Gemcitabina/Cisplatino (A) o Placebo/Gemcitabina/Cisplatino (los círculos indican los tiempos de observación censurados, cuando la observación se terminó antes de que ocurra el evento) .

Figura 5 Curvas de Kaplan-Meier para el análisis de tiempo de la muerte (OS) entre todos los pacientes con datos de biomarcador, tratados con Placebo/Gemcitabina/Cisplatino comparando pacientes con pMAPK Puntuación H = 100 (los círculos indican los tiempos de observación censurados, cuando la observación se terminó antes de que ocurriera el evento) . Figura 6 Curvas de Kaplan-Meier para el análisis de tiempo de muerte (OS) entre todos los pacientes con datos de biomarcador con pMAPK Puntuación H = 100 comparando tratamiento con Erlotinib/Gemcitabina/Cisplatino (A) con Placebo/Gemcitabina/-Cisplatino (los círculos indican los tiempos de observación censurados, cuando la observación se terminó antes de que ocurriera el evento) . Figura 7 Curvas de Kaplan-Meier para el análisis de tiempo de muerte (OS) entre todos los pacientes con datos de biomarcador con pMAPK Puntuación H = 100 y pMAPK Puntuación H = 100 comparando tratamiento con Erlotinib/Gemcitabina/Cisplatino (LA, HA) con tratamiento con Placebo/Gemcitabina/Cisplatino (H) , respectivamente (los círculos indican los tiempos de observación censurados, cuando la observación se terminó antes de que ocurriera el evento) . Figura 8 Curvas de Kaplan-Meier para el análisis de tiempo de progresión/muerte (PFS) entre todos los pacientes con datos de biomarcador, tratados con pMAPK Puntuación H < 100 y pMAPK Puntuación H = 100 comparando tratamiento con Erlotinib/Ge citabina/-Cisplatino (LA, HA) con tratamiento con Placebo/Gemcitabina/Cisplatino (H) , respectivamente (los círculos indican los tiempos de observación censurados, cuando la observación se terminó antes de que ocurriera el evento) . Fisura 9 Curvas de Kaplan-Meier para el análisis de tiempo de muerte (OS) entre todos los pacientes con biomarcador tratados con Placebo/Gemcitabina/Cisplatino comparando pAKTl Puntuación H < 300 (L) y pAKTl Puntuación H = 300 (H) (los círculos indican los tiempos de observación censurados, cuando la observación se terminó antes de que ocurriera el evento) . Figura 10 Curvas Kaplan-Meier para el análisis de tiempo de muerte (OS) entre todos los pacientes biomarcados tratados con Erlotinib/Gemcitabina/Cisplatino comparando pAKTl Puntuación H <300 (L) con pAKTl Puntuación H = 300 (H) (los círculos indican los tiempos de observación censurados, cuando la observación se terminó antes de que ocurriera el evento) . Figura 11 Curvas de Kaplan-Meier para el análisis de tiempo de muerte (OS) entre todos los pacientes con biomarcador con pAKTl Puntuación H < 300 (L) y pAKTl Puntuación H = 300 (H) comparando Erlotinib/Gemcitabina/Cisplatino (LA, HA) con tratamiento con Placebo/Gemcitabina/Cisplatino (H) , respectivamente (los círculos indican los tiempos de observación censurados, cuando la observación se terminó antes de que ocurriera el evento) . ú DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las técnicas convencionales de biología molecular y la química de ácidos nucleicos, que son comprendidas por los expertos en la técnica, se explican en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook, J., y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Gait, M.J., (ed) . , Oli-gonucleotide Synthesis - A Practical Approach, IRL Press, 1984; Hames, B.D., y Higgins, S.J., (eds.), Nucleic Acid Hybridization-A Practical Approach, 1985; y una serie de ellos Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., los cuales están todos incluidos aquí como referencia. Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones aquí mencionadas, tanto anterior como posteriormente, se incorporan aquí como referencia. En una modalidad de la invención, se proporciona un método para determinar si una muestra biológica que contiene células humanas de cáncer de pulmón es sensible a una combinación de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimioterapéutico, consistiendo el método en determinar la sobreexpresión de una proteína Akt fosforilada o una proteína MAPK fosforilada en la muestra biológica donde la sobreexpresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada indica que la muestra biológica que contiene células humanas de cáncer de pulmón es sensible a una combinación de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimioterapéutico. Preferentemente, en el método de acuerdo con la invenci n, la sobreexpresión de la Proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la muestra biológica se determina mediante: a) determinación del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la muestra biológica, b) determinación del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en una muestra biológica que contiene células humanas de cáncer de pulmón que no son sensibles a la combinación de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimioterapéutico, c) determinación de la diferencia del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada determinado en los pasos a) y b) determinando así la sobreexpresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada. Preferentemente, la diferencia entre los niveles de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada determinados en los pasos a) y b) será de al menos de un 10%. Más preferentemente, la diferencia entre los niveles de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en los pasos a) y b) será como mínimo de un 25%. En otra modalidad, la diferencia de los niveles de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en a) y b) será de al menos un 50%, un 75%, un 100%, un 125%, un 150%, un 175%, un 200%, un 300%, un 400%, un 500% o un 1,000%. La diferencia del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o proteína MAPK fosforilada determinados en los pasos a) y b) puede ser de hasta un 10,000 0 un 50,000%. La diferencia del nivel de expresión de la Proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada determinados en los pasos a) y b) se encuentra preferentemente entre el 10% y el 10,000%, más preferentemente entre el 25% y el 10,000% entre el 50% y el 10,000%, entre el 100% y el 10,000%, aún más preferiblemente entre el 25% y el 5,000% entre el 50% y el 5,000%, entre el 100% y el 5,000%. En una modalidad preferida de la invención, la muestra biológica es un tumor pulmonar primario o una metástasis (regional o distal) que puede obtenerse por ejemplo mediante biopsia pulmonar o a partir de otros órganos mediante biopsia. Una metástasis también puede ser una metástasis distal, por ejemplo, de hígado o de ganglio linfático. Cabe señalar que ese tipo de metástasis distales también contienen células cancerígenas pulmonares dado que las metástasis se originan en el pulmón. En otra modalidad preferida el cáncer no es cáncer de pulmón como el cáncer de páncreas. Sin embargo, también son factibles otros canceres con tumores sólidos tales como el de ovario, el colorectal, el de cabeza y el de cuello, el carcinoma de células renales, el glioma y los cánceres gastrointestinales, en concreto el cáncer de estómago. En otra modalidad preferida de la invención el inhibidor de los EGFR es un inhibidor de la tirosina cinasa de los EGFR, en concreto una molécula pequeña inhibidora de la tirosina cinasa de los EGFR, como por ejemplo el Tarceva® Debido a esto, y en otras palabras, en una modalidad particularmente preferida de la invención el inhibidor de los EGFR es el eriotinib o la N- (3-etinilfenil) -6, 7-bis (2-metoxietoxi ) quinazolin-4-amina . En otra modalidad preferida de la invención, el agente quimioterapéutico es la gemcitabina y/o el cis-platino. En otra modalidad preferida de la invención, la sobreexpresión de la proteína Akt fosforilada o de la proteína MAPK fosforilada se determina utilizando un reactivo que se une específicamente a la proteína fosforilada y preferentemente de forma no especifica o de ninguna forma a la proteína no fosforilada. Preferentemente un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo se une específicamente a la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada y preferentemente de forma no específica o de ninguna forma a la proteína Akt no fosforilada o a la proteína MAPK no fosforilada. En aún otra modalidad preferida de la invención, la proteína Akt fosforilada se fosforila en una posición aminoacídica correspondiente a la posición aminoacídica 473 de la proteína Aktl o la proteína MAPK en las posiciones aminoacídicas correspondientes a las posiciones aminoacídicas 202 y 204 de la MAPKl. Preferentemente, la secuencia aminoacídica de la proteína MAPK es la secuencia aminoacídica SEC ID NO: 1 ó 2 y la secuencia aminoacídica de la proteína Akt es la secuencia aminoacídica SEC ID NO: 6, 7 u 8. Existen muchos tipos diferentes de inmunoensayos que pueden utilizarse en el método de la presente invención, por ejemplo el inmunoensayo enzimático sobre fase sólida (ELISA, por sus siglas en inglés) , ensayo absorbente de inmunofluorescencia (FIA, por sus siglas en inglés) , ensayo inmunoabsorbente de unión química (CLIA, por sus siglas en inglés) , radioinmunoensayo (RÍA, por sus siglas en inglés) , e inmunotransferencia. Para obtener una descripción de los diferentes inmunoensayos que se pueden utilizar, véase Lottspeich y Zorbas (eds.), Bioanalytik, la. edición 1998, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlín, Alemania. Por lo tanto, en otra modalidad preferida de la invención, el nivel de expresión se determina utilizando un método seleccionado a partir del grupo que consiste en proteómica, citometría de flujo, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica y ensayo inmunosorbente ligado a enzima. En una modalidad preferida de la invención, la sobreexpresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada se determina mediante: a) tinción inmunohistoquímica de la muestra biológica; b) asignación de un grade seleccionado a partir de los números 1, 2, 3 y 4 para el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada sometidas a inspección visual de la tinción celular en la muestra biológica donde se asigna el grade máximo detectable para el nivel de expresión; c) determinación del porcentaje de células con el grado máximo detectable en la muestra biológica teñida de forma inmunohistoquímica; d) multiplicación del grado asignado con el porcentaje de células con el grado máximo detectable en la muestra biológica teñida de forma inmunohistoquímica y con el número 100; y e) determinación de la sobreexpresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la muestra biológica cuando el resultado de la multiplicación del paso d) es superior a 100. En otra modalidad de la invención, se proporciona un método para determinar si un paciente con cáncer de pulmón se beneficia de una combinación de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimioterapéutico, consistiendo el método en determinar la sobreexpresión de una proteína Akt fosforilada una proteína MAPK fosforilada en una muestra del paciente donde la sobreexpresión de la proteína Akt fosforilada o de la proteína MAPK fosforilada es una indicación de que el paciente se beneficia de una combinación de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimioterapéutico. Todas las modalidades descritas anteriormente igualmente se aplican a esta modalidad. Preferentemente, en el método según la invención la sobreexpresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la muestra del paciente se determinan mediante: a) determinación del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la muestra del paciente; b) determinación del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en una muestra de un paciente con cáncer de pulmón que no se beneficia de una combinación de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimiot'erapéutico ; c) determinación de la diferencia del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada determinados en los pasos a) y b) determinando así la sobreexpresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada. El término "beneficiarse" significa que el paciente no obtiene beneficio de un tratamiento de combinación de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimioterapéutico en contraste con el tratamiento con el inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico solo. En otra modalidad preferida de la invención, se utiliza un anticuerpo que se une a la proteína Akt fosforilada o un anticuerpo que se une a la proteína MAPK fosforilada para determinar si una muestra biológica que contiene células de cáncer de pulmón humanas es sensible a una combinación de un inhibidor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimioterapéutico. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona un método para seleccionar una fórmula para inhibir la progresión del cáncer de pulmón en un paciente, consistiendo el método en: a) exponer por separado alícuotas de una muestra biológica que contiene células de cáncer de pulmón que son sensibles a una combinación de un inhibidor de los EGFR y un agente quimioterapéutico del paciente en presencia de diversas composiciones de prueba; b) comparar el nivel de expresión de una proteína Akt fpsforilada o una proteína MAPK fosforilada en las alícuotas de la muestra biológica puestas en contacto con las f6rmulas de prueba y el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en una alícuota de la muestra biológica no puesta en contacto con las composiciones de prueba; c) seleccionar una de las composiciones de prueba que altera el nivel de expresión de los genes marcadores en la alícuota que contiene dicha composición de prueba, relacionada con la alícuota no puesta en contacto con composición de prueba de forma que la existencia de una diferencia de al menos un 10% entre el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica puesta en contacto con la composición de prueba y el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica no puesta en contacto con la composición de prueba es indicativo para la selección de la composición de prueba. Preferentemente, la diferencia del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada del paso c) es de al menos un 25%. Más preferentemente, la diferencia del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en el paso c) es de al menos un 50%. En otra modalidad, la diferencia del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en el paso c) es de al menos un 75% un 100%, un 150%, un 175%, un 200%, un 300%, un 400%, un 500% o un 1,000%. La diferencia del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada determinados en el paso c) puede ser de hasta un 10,000 o un 50,000%. La diferencia del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada determinados en el paso c) preferentemente se encuentra comprendida entre el 10% y el 10.000%, más preferiblemente entre el 25% y el 10,000% entre el 50% y el 10,000%, entre el 100% y el 10,000%, aún más preferentemente entre el 25% y el 5.000%, entre el 50% y el 5.000%, entre el 100% y el 5,000%. En aún otra modalidad de la invención se proporciona un método para la obtención de un agente candidato, consistiendo dicho método en: a) poner en contacto una alícuota de la muestra biológica que contiene células de cáncer de pulmón sensibles a un inhibidor de los EGFR y un agente quimioterapéutico con el agente candidato; b) determinar el nivel de expresión de una proteína Akt fosforilada o una proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica puesta en contacto con el agente candidato y determinar el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en una alícuota de la muestra biológica no puesta en contacto con el agente candidato; c) observar el efecto del agente candidato mediante comparación del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica puesta en contacto con el agente candidato y el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica no puesta en contacto con el agente candidato, (d) obtener dicho agente a partir de dicho efecto observado, donde al menos un 10% de diferencia entre el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica puesta en contacto con el agente candidato y el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica no puesta en contacto con el agente candidato es una indicación de un efecto por parte del agente candidato. Preferentemente, la diferencia del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada del paso d) es de al menos un 25%. Más preferentemente, la diferencia del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en el paso d) es de al menos un 50 %. En otra modalidad, la diferencia del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada del paso d) es de la menos un 75% un 100% un 125%, un 150%, un 175%, un 200%, un 300%, un 400%, un 500% o un 1,000%. La diferencia del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada determinados en el paso d) puede ser de hasta un 10,000 0 un 50,000%. La diferencia del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada determinados en el paso d) se encuentra preferiblemente entre el 10% y el 10,000% más preferiblemente entre el 25% y el 10,000%, entre el 50% y el 10,000%, entre el 100% y el 10,000%, aún más preferiblemente entre el 25% Y el 5,000%, entre el 50% y el 5,000%, entre el 100% y el 5,000%. En una modalidad preferida dicho agente candidato es un agente inhibidor candidato o un agente potenciador candidato. En otra modalidad de la invención se proporciona un agente candidato obtenido a partir del método descrito según la invención. En aún otra modalidad se proporciona una preparación farmacéutica que contiene un agente según la invención. En aún otra modalidad se utiliza un agente según la invención para preparar una fórmula para la inhibición de la progresión del cáncer de pulmón. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona un método para producir un fármaco que contiene los pasos del método de la invención y (i) sintetizar el agente candidato identificado en el paso (c) o un análogo o derivado del mismo en una cantidad suficiente para proporcionar dicho fármaco en una dosis de tratamiento efectiva a un sujeto, o (ii) combinar el fármaco candidato identificado en el paso (c) o un análogo o derivado del mismo con un portador farmacéuticamente aceptable. En aún otra modalidad una proteína Akt, una proteína MAPK, una proteína Akt fosforilada, una proteína MAPK fosforilada, un anticuerpo unido selectivamente a una proteína Akt fosforilada o a una proteína MAPK fosforilada se utiliza para obtener un agente candidato o para seleccionar una fórmula para inhibir la progresión del cáncer de pulmón en un paciente. En otra modalidad de la invención, se contempla una asociación que contiene un anticuerpo contra la MAPK fosforilada o la proteína Akt fosforilada. Este tipo de asociaciones conocidas en el campo también contienen utensilios de plástico que pueden utilizarse durante el procedimiento de ampliación como por ejemplo placas microtituladas en los formatos de 96 ó 384 cavidades o simplemente tubos de ensayo normales, como por ejemplo los producidos por Eppendorf, Hamburgo, Alemania y todos los demás reactivos para llevar a cabo el método según la invención, preferentemente un inmunoensayo, como por ejemplo el ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) , el ensayo inmunosorbente de fluorescencia (FIA) , el ensayo inmunosorbente de unión química (CLIA) , el radioinmunoensayo (RÍA) , y la inmunotransferencia. Para obtener una descripción de los inmunoensayos y reactivos que se pueden utilizar, véase, Lottspeich y Zorbas (eds.), Bioanalytik, l6. edición 1998, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlín, Alemania. Los siguientes ejemplos, referencias, listados de secuencia y esquemas se proporcionan para facilitar la comprensión de la presente invención, cuyo verdadero ámbito de acción se presenta en las reivindicaciones anexas. Se entiende que las modificaciones pueden realizarse en los procedimientos posteriormente descritos sin alejarse del espíritu de la invención.

Ejemplo 1 Análisis de biomarcadores en muestras de tejido tumoral El objetivo de los análisis exploratorios de biomarcádores tumorales para el estudio clínico fue la identificación de dichos marcadores o combinaciones de marcadores que predicen mejor el resultado positivo o negativo del tratamiento con Tarceva®. Dado que los resultados clínicos no permitieron generar hipótesis sobre cómo seleccionar las poblaciones de pacientes que obtienen más beneficio del tratamiento con Tarceva®, se enfatizó especialmente sobre la identificación de marcadores que discriminan entre pacien-tes (subgrupos) que se benefician especialmente de la combinación con Tarceva® en comparación con el grupo control de sólo quimioterapia. También se investigó la identificación de marcadores que discriminan entre pacientes (subgrupo) que presentan un efecto perjudicial provocado por la combinación específica con Tarceva® en comparación con el grupo control de sólo quimioterapia . El objetivo de este estudio fue el de analizar biomarcadores específicos de tumores relacionados con las vías de, señalización del EGFR, por ejemplo EGFR, HER2 , pAKT y pMAPK. Los datos de biomarcadores se relacionaron con los datos clínicos (análisis generales y específicos del tratamiento) . Métodos y Materiales; Muestras clínicas; Los análisis de biomarcadores se realizaron en un sub-conjunto de muestra de 141 pacientes, del cual se habían recibido bloques tisulares incrustados en parafina y fijados en formalina (FFPE, por sus siglas en inglés) provenientes del diagnóstico inicial .

Anticuerpos para el análisis IHC: Protocolo IHC para pMAPKs 1. Cortar secciones de los bloques de matriz de parafina de unas 3 a 4 µm de grosor. 2. Montar secciones sobre portaobjetos de cristal y dejarlas secar durante toda la noche. 3. Desparafinar los portaobjetos en xileno seguido de series decrecientes de etanol: - xileno toda la noche - xileno 2 x 10 minutos - Etanol abs. 2 x 10 min.

- Etanol 96% 2 x 5 min. - Etanol 80% 1 x 5 min. - Etanol 70% 2 x 5 min. Regulador de pH de PBS 10 min. (cambiar el regulador de pH una o dos veces) 4. Remoción del antígeno/pretratamiento de las muestras Olla a presión 5 minutos a 120°C en lx regulador de pH de citrato pH 6 (Biocyc GmbH, número de orden 400300692) . Lavar en regulador de pH TBS/PBS (1:10) durante 5 minutos 5. Bloqueo de la peroxidasa Incubación de los portaobjetos en H202 al 3% durante 10 minutos. - Lavar 2 x 5 minutos en regulador de pH TBS/PBS. 6. Incubación del anticuerpo Introducir los portaobjetos en suero normal (1.5%) diluido en regulador de pH Tris o en otra solución bloqueadora . Colocar sobre los portaobjetos el anticuerpo primario (Zymed Rabbit anti fosfo-ERKl+2 , num. cat 36-8800) diluido a 1:150 e incubarlo en una cámara húmeda a 30°C durante 2 horas . - Lavar 2 x 5 minutos en regulador de pH TBS/PBS. - Añadir Envision Polymer HRP (Dako) sobre los portaobjetos e incubar en cámara húmeda a 30°C durante 30 minutos . - Lavar 2 x 5 minutos en regulador de pH TBS/PBS. 7. Detección - Lavar los portaobjetos con regulador de pH Tris 0.05 M pH 7.6 durante 20 minutos - Cubrirlos durante 5 minutos con cromógeno DAB (DAB líquido Dako num. de código K3467) e incubar durante 5 a 10 minutos. - Lavar los portaobjetos con agua desmineralizada durante 5 minutos para la reacción de color. - Contrateñir con hematoxilina (Harris Hamatoxylin HTX 31000, Medite GmbH) - Aclarar con agua - Diferenciar en HCL-Etanol - "azul" durante 5 min en agua - Series de etanol ascendentes - xileno - cubrir Protocolo IHC para pAKTs Mismo protocolo que para pMAPK, excepto: Comparar 4.: Pretratamiento de muestras en regulador de pH de citrato pH 9 (Dako num. de código 82367) Comparar 6.: Dilución 1:450 (comparar 6.) del anticuerpo-primario (abcam AKT fosfo 8473) Presentación de datos HCs Un patólogo evaluó todas las inmunotinciones. La intensidad de tinción nuclear (pAKT, pMAPK) se estimó por inspección visual en una escala de cuatro pasos (0, 1, 2, 3). Además de la intensidad de tinción nuclear, también se observo el porcentaje de células positivas y las posibles causas de fallos del análisis (es decir, falta de células tumorales en el mancha tisular o falta de mancha tisular en el portaobjetos de TMA) . Análisis estadístico explorador El objetivo del análisis estadístico de los datos del biómarcador era explorar el potencial de predicción de beneficios o toxicidades clínicas, de cada marcador por separado o de combinaciones adecuadas de los mismos. De acuerdo con la experiencia, muchos biomarcadores muestran una distribución estadística sesgada entre pacientes y en el paciente. A menudo existen unos antecedentes bioquímicos para este sesgo, el proceso de variación presenta una estructura multiplicativa. Las distribuciones sesgadas repres ntan un problema cuando es necesario utilizar aproximaciones estadísticas lineales (por ejemplo, regresión) . Cuando se utilizan como co-variables finales en modelos estadísticos el sesgo también puede ocultar los resultados. Por lo tanto, es necesario encontrar transformaciones apropiadas que transformen estas mediciones en distribuciones con una forma Gaussiana aproximada. En el área de los biomarcadores las elecciones características son transformaciones de la forma log(x+c) . Estas transformaciones no cambian el orden de los valores de tal modo que los análisis no paramétricos basados en grados o en puntos de corte se mantienen invaribles finales tras la transformación. Estas transformaciones también son un prerrequisito cuando se utilizan aproximaciones multivariables lineales como, por ejemplo, Análisis Discriminante y Análisis de Componentes Principales. La estadística y las interdependencias fundamentales de los diferentes marcadores se investigaron de forma descriptiva. Se realizaron análisis metodológicos que comparaban diferentes aproximaciones de medición, por ejemplo para IRC, teniendo en cuenta la fiabilidad y la validez. El beneficio obtenido del Tarceva® se define mediante los parámetros clínicos de tiempo de supervivencia (Tiempo hasta la muerte, TTD) , de tiempo PFS (tiempo hasta la progresión, TTP/D) , de respuesta objetiva, de mejor respuesta (CR/PR/SD/PD) . Los valores-p obtenidos a partir de estos análisis no deben interpretarse en un sentido confirmativo; no deben verse como una herramienta descriptiva especial para guiar la exploración hasta una regla eficiente de predicción de candidatos . Los marcadores se evaluaron sobre un nivel univariable referente a su potencial de predicción (por ejemplo búsqueda de los puntos de corte) de los puntos finales clínicos . Se emplearon otras técnicas multivariables (por ej emplo Análisis de Discriminación Lineal , Regresión Logística Múltiple , Análisis de Componentes Principal mediante rotación, Análisis de conglomerados , metodología CART) para estudiar las combinaciones de marcadores . Se investigaron las correlaciones de biomarcadores y de respuesta con covariables f inales clínicas . Las agrupaciones de candidatos obtenidas a partir de los biomarcadores se comprobaron con puntos finales de tieppo a suceso (curvas de Kaplan-Meier, modelo de riesgos proporcionales de Cox, prueba logrank) . Resultados , Análisis del subcanjunto de la Muestra de Bffl, en ccn araci?n can la totalidad de la población del estudio El subconjunto de pacientes con muestras para el análisis se comparó con la totalidad de la población del estudio contemplando las características básales de los pacientes y los parámetros clínicos observables . El resumen se muestra en la siguiente tabla.

Resultadoss El subconjunto de pacientes can datos de biomarcadores no es representativo de la población del estudio B016411. Existen diferencias entre las tasas de peligrosidad para TTD y TTP entre la población principal y el subgrupo con biomarcadores . Los pacientes tratados con Tarceva® del subgrupo con biomarcadores presentan un pronóstico peor en comparación con la población clínica principal . Diversas covariables finales básales indican que el subgrupo con biomarcadores y, en concreto los pacientes relacionados con el Tarceva® dentro de este subgrupo, representaron una mezcla de casos más mórbida en comparación con la población principal del estudio. Los gráficos KM (Figuras 1 a 4) también deberían tenerse en cuenta. Resultados del análisis iHe de la pM&PKs ° Los datos IHC de la pMAPK mostraron una dispersión suficiente para ser elegidos en la modalidad de más análisis estadísticos.

Para determinar la correlación entre la expresión de la pMAPK y los datos clínicos, se establecieron los valores de los puntos de corte mediante análisis estadístico descriptivo: Se determinó el patrón H Franklin mediante la combinación de la intensidad de tinción y el porcentaje de células tumorales teñidas (pMAPKjhsco = (pMAPK_Tinción_Nuclear + 1 * FMAEK_Nuclear_Pos_Células; grado: 0-400) . La tinción "positiva" de la pMAPK se definió por patrones H -/> 100, en los demás casos la tinción fue "negativa" . • Los gráficos Kaplan-Meier se muestran en las Figuras de la 5 a la 8. pMAPK B-Seoro (Cutpoint 100) -- - COX Model sin covariabl Estimación Error Tasa do 95% límitos de con¬ Variable dß parámetro estándar Chi -Cuadrado Pr > ChiSq riesgo fianza de tasa do rioogo Tiempo hasta la progresión/muerte trtgr solo 0,27747 0,21560 1,6562 0,1981 1,320 0,865 2,014 trtgr 0,12352 0,22058 0,3136 0,5755 1,131 0,734 1,743 pMAPK (=100) 0,90942 0,23706 14,7164 0,0001 2,483 1,560 3,951 trtgr p APK<100 0,49122 0,30087 2,6656 0,1025 1,634 0,906 2,947 trtqr pMAPK=100 "-0,25703 0,30706 0,7007 0,4026 0,773 0,424 1,412 Tiempo hasta la muerte trtgr solo 0,15228 0,27818 0,2997 0,5841 1,164 0,675 2,009 trtgr -0,02494 0,28668 0,0076 0,9307 0,975 0,556 1,711 pMAPK (=100) 0,73352 0,29272 6,2797 0,0122 2,082 1,173 3,696 trtgr pMAPK<100 0,98292 0,45017 4,7674 0,0290 2,672 1,106 6,457 trtgr ¿ APK=100 -0,70524 0,36205 3,7943 0,0514 0,494 0,243 1,004 Resultadoss • En pacientes tratados con quimioterapia/placebo la expresión "positiva" de la pMAPK está asociada al peor pronóstico (TTD: HR 4,882, p=0,0001), mientras que la expresión "negativa" de la pAKT parece estar asociada a una supervivencia mayor. • Tendencia: Los pacientes con la "pMAPK positiva" podrían beneficiarse de la combinación quimioterapia/ Tarceva® (HR 0,500, p: 0,0516) ( ) Resultados del análisis IHC de la pA • Los datos IHC de la pAKT mostraron una dispersión suficiente para ser elegidos en la modalidad de más análisis estadísticos. Para determinar la correlación entre la expresión de la pAKT y los datos clínicos, se establecieron los valores de los puntos de corte mediante análisis estadístico descriptivo: Se determinó el patrón H Franklin mediante la combinación de la intensidad de tinción nuclear y el porcentaje de células tumorales teñidas (pAKT_hsco = (pAKT_Tinción_Nuclear + 1) * pAKT_Nuclear_Pos_Células ; grado: 0-400) .; La tinción "positiva" de la pAKT se definió por patrones H =/> 300, en los demás casos la tinción fue "negativa" . - Los gráficos Kaplan-Meier se muestran en las figuras de la 9 a la 11 . Correlación de los datos IHC y clínicos p?KTl B -Scoro (Cutpoint 300) - - COX Modal sin covariablos Estimación Error Tasa do 95% limitoo do con- Varlable do parámetro estándar Chi -Cuadrado ir > ChiSq riesgo flanso do tasa do rioogo Tiompo hasta la progrosidn/mußrte trtgr eolo 0,23796 0,20820 1,3064 0,2530 1,269 0,844 1,908 trtgr 0,19809 0,20973 0,8921 0,3449 1,219 0,808 1,839 pAKTl (=300) 0,66669 0,23379 8,1320 0,0043 1,948 1,232 3,080 trtgr pAKTl<300 0,12333 0,37441 0,1085 0,7419 1,131 0,543 2,356 trtgr pAKTl=300 0,23300 0,25463 0,8373 0,3602 1,262 0,766 2,079 Tiempo hasta la muerto trtgr sólo 0,14794 0,27012 0,3000 0,5839 1,159 0,683 1,969 trtgr 0,10118 0,27209 0,1383 0,7100 1,106 0,649 1,886 pAKTl (=300) 0,39280 0,29959 1,7191 0,1898 1,481 0,823 2,664 trtgr pAKTl«300 0,69986 0,50449 1,9244 0, 1654 2,013 0,749 5,412 trtgr pAKTl=300 -0,14277 0,32063 0,1983 0,6561 0,867 0,462 1,625 Resultados : ° En los pacientes tratados con quimioterapia/placebo la expresión "positiva" de la pAKT está asociada al peor pronóstico (TTD HR 2 , 258 , p=0 , 0573 ) , mientras que la expresión "negativa" de la pAKT parece estar asociada a una supervivencia mayor .

• No se encontró ninguna diferencia similar en el caso de pacientes tratados con la asociación de quimioterapia/Tarceva® . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. - Un método para determinar si una muestra biológica que contiene células cancerígenas de pulmón humanas es sensible a una combinación de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimioterapéutico, caracterizado porque consiste de: determinar la sobreexpresión de una proteína AKT fosforilada o una proteína MAPK fosforilada en la muestra biológica por la cual la sobreexpresión de la proteína AKT fosforilada b la proteína MAPK fosforilada es una indicación de que la muestra biológica que contiene células cancerígenas de pulmón humanas es sensible a una combinación de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimioterapéutico.
2. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque la sobreexpresión de la proteína AKT fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la muestra biológica se determina mediante a) la determinación del nivel de expresión de la proteína AKT fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la muestra biológica, b) la determinación del nivel de expresión de la proteína AKT fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en una muestra biológica que contiene células cancerígenas de pulmón humanas que no son sensibles a una combinación de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimioterapéutico, c) la determinación de la diferencia de nivel de expresión de la proteína AKT fosforilada o la proteína MAPK fosforilada determinados en los pasos a) y b) determinando así la sobreexpresión de la proteína AKT fosforilada o la proteína MAPK fosforilada.
3. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la diferencia del nivel de expresión de la proteína AKT fosforilada o la proteína MAPK fosforilada determinado en los pasos a) y b) es de al menos un 10%.
4. 4.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, caracterizado porque la diferencia del nivel de expresión de la proteína AKT fosforilada o la proteína MAPK fosforilada determinada en los pasos a) y b) es de al menos un 25%.
5. 5.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la muestra biológica es un tumor pulmonar primario o una metástasis.
6. 6. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el inhibidor del EGFR es eriotinib o N- (3-etinilfenil) -6, 7-bis (2-metoxietoxi) quinazolin-4-amina.
7. 7. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el agente quimioterapéutico es gemcitabina o cisplatino.
8. 8. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la sobreexpresión de la proteína Akt fosforilada o de la proteína MAPK fosforilada se determina utilizando un reactivo que se une específicamente a la proteína fosforilada.
9. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el anticuerpo, el derivado de anticuerpo, o el fragmento de anticuerpo se une específicamente a la proteína Akt fosforilada o a la proteína MAPK fosforilada.
10. 10.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la proteína Akt fosforilada se fosforila en una posición aminoacídica correspondiente a la posición aminoacídica 473 de la proteína Aktl o' la proteína MAPK se fosforila en las posiciones aminoacídicas correspondientes a las posiciones aminoacídicas 202 y 204 de la MAPKl.
11. 11.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la secuencia aminoacídica de la proteína MAPK es la secuencia aminoacídica SEC ID NO: 1 ó 2 y la secuencia aminoacídica de la proteína Akt es la secuencia aminoacídica SEC ID NO: 6, 7 u 8.
12. 12.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el nivel de expresión se determina mediante un método seleccionado a partir del grupo que consiste en proteómica, citometría de flujo, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica y análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas.
13. 13.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la sobreexpresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada se determina mediante a) la tinción inmunohistoquímica de la muestra biológica, b) la asignación de un grado, seleccionado a partir de los, números 1, 2, 3 y 4 de clasificación del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada, basándose en la inspección visual de la tinción de las células de la muestra biológica mediante la cual se asigna el grado superior detectable para el nivel de expresión, c) la determinación del porcentaje de células con el grado superior detectable de la muestra biológica teñida de forma inmunohistoquímica, d) la multiplicación del grado asignado con el porcentaje de células que presenten el grado superior detectable de la muestra biológica teñida de forma inmunohistoquímica y con el número 100 y e) la determinación de la sobreexpresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la muestra biológica cuando el resultado de la multiplicación del paso d) es superior a 100.
14. 14.- Uso de un anticuerpo que se une a la proteina Akt fosforilada o, de un anticuerpo que se une a la proteína MAPK fosforilada, para determinar si una muestra biológica que contiene células cancerígenas de pulmón humanas es sensible a una combinación de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico y un agente quimioterapéutico.
15. 15.- Un método para seleccionar una composición que inhiba la progresión del cáncer de pulmón en un paciente, el método ¡caracterizado porque consiste en: a) exponer por separado alícuotas de una muestra biológica que contiene células de cáncer de pulmón sensibles a una combinación de un inhibidor del EGFR y un agente quimioterapéutico del paciente en presencia de varias composiciones de prueba; b) comparar el nivel de expresión de una proteína Akt fosforilada o una proteína MAPK fosforilada en las alícuotas de la muestra biológica puestas en contacto con las composiciones de prueba y el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en una alícuota de la muestra biológica que no ha estado en contacto con las composiciones de prueba, c) seleccionar una de las composiciones de prueba que altere el nivel de expresión de los genes marcadores en la alícuota que contiene esa composición de prueba, con relación a la alícuota no puesta en contacto con la composición de prueba en la una diferencia de al menos un 10% entre el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada la proteína MAPK fosforilada de la alícuota de la muestra biológica puesta en contacto con la composición de prueba y el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o la proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica no puesta en contacto con la composición de prueba es indicativa para la selección de la composición de prueba.
16. 16.- Un método para derivar un agente candidato, caracterizado porque comprende: a) poner en contacto una alícuota de una muestra biológica que contiene células de cáncer de pulmón sensibles a un inhibidor del EGFR y a un agente quimioterapéutico con el agente candidato, b) determinar el nivel de expresión de una proteína Akt fosforilada o de una proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica puesta en contacto con el agente candidato y determinar el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o de la proteína MAPK fosforilada en una alícuota de la muestra biológica no puesta en contacto con el agente candidato, c) observar el efecto del agente candidato mediante comparación del nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o de la proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica puesta en contacto con el agente candidato y el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o de la proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica no puesta en contacto con el agente candidato, d) obtener el agente a partir de dicho efecto observado, caracterizado porque la existencia de al menos un 10% de diferencia entre el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o de la proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica puesta en contacto con el agente candidato y el nivel de expresión de la proteína Akt fosforilada o de la proteína MAPK fosforilada en la alícuota de la muestra biológica no puesta en contacto con el agente candidato es indicativa de un efecto del agente candidato.
17. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el agente candidato es un agente inhibidor candidato.
18. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el agente candidato es un agente estimulador candidato.
19. 19.- Un agente candidato caracterizado porque se deriva a partir del método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.
20. 20.- Una preparación farmacéutica caracterizada porque comprende un agente de conformidad con la reivindicación 19.
21. 21.- Uso de un agente de conformidad con la reivindicación 19 para la preparación de una composición para la inhibición de la progresión del cáncer de pulmón.
22. 22.- Un método para producir un fármaco caracterizado porque comprende los pasos del método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18; y i) la síntesis del agente candidato identificado en el paso (c) , o un análogo o derivado del mismo, en una cantidad suficiente para proporcionar el fármaco mencionado en una cantidad efectiva para el tratamiento de un sujeto; o ii) la combinación del fármaco candidato, el agente candidato identificado en el paso (c) o un análogo o derivado de los mismos con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
23. 23.- Uso de una proteína Akt, una proteína MAPK, una proteína Akt fosforilada, una proteína MAPK fosforilada y un anticuerpo que se una selectivamente a una proteína Akt fosforilada o a una proteína MAPK fosforilada para obtener un agente candidato para seleccionar una composición para inhibir la progresión de cáncer de pulmón en un paciente.
24. 24.- Un kit caracterizado porque comprende una proteína MAPK fosforilada o Akt fosforilada.