JP4795203B2

JP4795203B2 - アンスラサイクリン系抗癌剤の感受性判定方法及びそのシステム

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Publication number: JP4795203B2
Application number: JP2006307276A
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Inventors: 周原田; 智一吉田
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Filing date: 2006-11-13
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Description

本発明は、抗癌剤の感受性判定方法及びそのシステムに関する。

癌の一般的な治療法の１つに化学療法があり、各種の抗癌剤投与が行われている。しかしながら癌の種類や患者個々人の差により有効な抗癌剤は異なり、また、抗がん剤は治療域と有害域がオーバーラップする場合が多い。従って、効果的でない抗癌剤を投与した場合は、癌の再発可能性が高まるばかりか、抗癌剤の副作用により患者の体力が低下し、次に有効な別の抗癌剤を投与しても十分な効力を発揮できない恐れがある。このことから、安全性を確保しつつ有効性を得る為に、投与前に有効な抗癌剤を正確に特定する薬剤反応性を予測するシステムの開発が切望されている。

従来、癌に対する抗癌剤の感受性検査としては、患者から単離した癌細胞又は癌組織に様々な抗癌剤を接触させ、癌細胞の増殖抑制等を指標としてその癌細胞に有効と思われる抗癌剤を特定する方法が採用されてきた。しかしながら、このような試行錯誤的方法では、検査結果が十分に臨床治療効果に反映しないばかりか、抗癌剤試験に大量の癌細胞又は癌組織が必要となり、患者への負担が大きいという問題が有った。従って、より客観的かつ正確な抗癌剤の感受性判定方法の確立が求められている。

セリンスレオニンキナーゼであるＡｋｔは、多くの癌組織でその活性化が確認されており、癌化との深い関連が示唆されている。Ａｋｔの活性化にはリン酸化が必要であり、活性化されたＡｋｔは細胞死抑制に関与する分子のリン酸化を促進する。これにより、細胞のアポトーシスを抑制し、細胞の癌化を引き起こす。更に、一般的に活性化Ａｋｔが高発現している患者は、活性化Ａｋｔが低発現の患者に比べ、術後の経過が悪く予後不良を引き起こす可能性が高いことが報告されている（非特許文献１）。一般的に予後不良の癌は、抗癌剤による化学療法の奏功性が低く、その治療が困難であり、癌が再発するリスクが高い。

アンスラサイクリン系抗癌剤は、トポイソメラーゼＩＩのＤＮＡの再結合を阻害することで、アポトーシスを誘導する抗癌剤である。臨床上高く評価され、乳癌等の化学療法において汎用されている。しかしながら、他の抗癌剤と同様に、心毒性、白血球減少等の重大な副作用を引き起こす恐れがある。従って、アンスラサイクリン系抗癌剤の客観的且つ正確な感受性判定方法の確立は非常に重要である。

Ｃｉｃｅｎａｓｅｔａｌ．ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＶｏｌ．７Ｎｏ．３ｐ３９４−４０１（２００５）

本発明は、アンスラサイクリン系抗癌剤の感受性判定方法を提供することを目的とする。

斯かる実情に鑑み、本発明者らはアンスラサイクリン系抗癌剤の感受性判定方法を得るべく鋭意研究を行なった結果、以下のi）〜iii）を見出し、本発明を完成するに至った。
i）活性化Ａｋｔが高発現の癌細胞又は癌組織はアンスラサイクリン系抗癌剤に高感受性であり、逆に活性化Ａｋｔ低発現の癌細胞又は癌組織は低感受性であること。
ii）従来、活性化Ａｋｔ高発現の癌患者は、術後の経過が悪く癌が再発する等の予後不良が指摘されているが、アンスラサイクリン系抗癌剤を投与した場合は、活性化Ａｋｔ高発現の癌患者の奏功率が高く、逆に活性化Ａｋｔ低発現の癌患者の奏功率が低いこと。
iii）活性化Ａｋｔが高発現であり、且つＨＥＲ−２及び／又はＰＴＥＮも高発現の癌細胞又は癌組織は、よりアンスラサイクリン系抗癌剤の感受性が高く、逆に活性化Ａｋｔが低発現であり、且つＨＥＲ−２及び／又はＰＴＥＮも低発現の癌細胞又は癌組織は、よりアンスラサイクリン系抗癌剤の感受性が低いこと。

すなわち、本発明は、
（１）癌細胞又は癌組織中の活性化Ａｋｔを検出する工程と、前記検出の結果からアンスラサイクリン系抗癌剤の感受性を判定する工程と、を有する抗癌剤の感受性判定方法；
（２）前記癌細胞又は癌組織が、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、脳腫瘍、乳癌、前立腺癌、皮膚癌又は白血病細胞の癌細胞又は癌組織である、（１）に記載の抗癌剤の感受性判定方法；
（３）前記癌細胞又は癌組織が、乳癌の癌細胞又は癌組織である、（１）又は（２）に記載の抗癌剤の感受性判定方法；
（４）アンスラサイクリン系抗癌剤がダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、オキザウノマイシン又はイダルビシンである、（１）〜（３）のいずれか１に記載の抗癌剤の感受性判定方法；
（５）アンスラサイクリン系抗癌剤がドキソルビシン又はエピルビシンである、（１）〜（４）のいずれか１に記載の抗癌剤の感受性判定方法；
（６）癌細胞又は癌組織中のヒト上皮成長因子受容体２型の発現を検出する工程をさらに有する、（１）〜（５）のいずれか１に記載の抗癌剤の感受性判定方法；
（７）癌細胞又は癌組織中のＰＴＥＮの発現を検出する工程をさらに有する、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗癌剤の感受性判定方法；
（８）癌細胞又は癌組織中の活性化Ａｋｔの検出結果を入力する工程と、前記入力された検出結果と閾値とを比較する工程と、前記比較の結果に基づいてアンスラサイクリン系抗癌剤の感受性の判定を行う工程と、前記判定の結果を出力する工程と、を有する抗癌剤の感受性判定システム；
（９）前記癌細胞又は癌組織が、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、脳腫瘍、乳癌、前立腺癌、皮膚癌又は白血病細胞の癌細胞又は癌組織である、（８）に記載の抗癌剤の感受性判定システム；
（１０）前記癌細胞又は癌組織が、乳癌の癌細胞又は癌組織である、（８）又は（９）に記載の抗癌剤の感受性判定システム；
（１１）癌細胞又は癌組織中のヒト上皮成長因子受容体２型の発現の検出結果を入力する工程をさらに有する、（８）〜（１０）のいずれか１に記載の抗癌剤の感受性判定方法；
（１２）癌細胞又は癌組織中のＰＴＥＮの発現の検出結果を入力する工程をさらに有する、（８）〜（１１）のいずれか１に記載の抗癌剤の感受性判定方法；
を提供するものである。

本発明によれば、患者に大きな負担をかけることの無い、客観的で正確なアンスラサイクリン系抗癌剤の感受性判定方法及びそのシステムを提供することができる。

また、本発明によれば、個々の癌患者に対するアンスラサイクリン系抗癌剤の奏功率が判断できるため、有効なアンスラサイクリン系抗癌剤の投与が可能となるばかりで無く、不要なアンスラサイクリン系抗癌剤の投与を回避し、患者の副作用による負担を低減することができる。

本発明における癌細胞又は癌組織は、特に限定されるものではないが、例えば、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、脳腫瘍、乳癌、前立腺癌、皮膚癌および白血病細胞等の癌細胞又は癌組織が挙げられ、特に乳癌の癌細胞又は癌組織が好ましい。また、臨床的には癌患者から採取した癌細胞又は癌組織を使用すれば良く、特に限定されるものではないが、例えば、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、脳腫瘍、乳癌、前立腺癌、皮膚癌および白血病細胞等の癌患者から採取した癌細胞又は癌組織が挙げられ、特に乳癌の患者から採取した癌細胞又は癌組織が好ましい。

本発明において活性化Ａｋｔとは、リン酸化されたＡｋｔ、特にスレオニン３０８基及びセリン４７３基の２つのアミノ酸がリン酸化されたＡｋｔを示す。

本発明においてアンスラサイクリン系抗癌剤としては、抗癌作用を有するアンスラサイクリン系化合物であれば特に限定されないが、臨床的に用いられているアンスラサイクリン系抗生物質及びその誘導体等が好ましく、具体的には、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、オキザウノマイシン及びイダルビシン等が挙げられ、特にドキソルビシン及びエピルビシンが好ましい。

本発明において活性化Ａｋｔを検出する方法としては、活性化Ａｋｔの発現の有無や強弱を確認できれば、特に限定されるものではないが、例えば、公知のタンパク質の検出方法が挙げられ、具体的にはＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、２次元電気泳動法、プロテインチップによる解析法、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、免疫蛍光法、ウエスタンブロッティング法、ドットブロッティング法及び免疫沈降法等が挙げられる。

本発明においてＨＥＲ−２及びＰＴＥＮの発現を検出する方法としては、ＨＥＲ−２及びＰＴＥＮの発現の有無や強弱を確認できれば、特に限定されるものではないが、例えば、上述のタンパク質の検出方法の他に、公知のｍ−ＲＮＡの検出方法を使用することができる。公知のｍ−ＲＮＡの検出方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロッティング法、ＮＡＳＢＡ法及びＤＮＡチップによる方法等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。

ここで、活性化Ａｋｔ、ＨＥＲ−２及びＰＴＥＮの発現の検出において、その発現の有無や強弱を確認する場合、目視等により直接的に確認しても良いが、発現量を測定し数値等で確認することもできる。

活性化Ａｋｔ、ＨＥＲ−２及びＰＴＥＮの発現の検出において、その発現量を測定方法する場合は、公知のタンパク質又はｍ−ＲＮＡ等の発現量の測定方法を用いればよく、特に限定されるものではないが、例えば、ウエスタンブロッティング法を用いた場合、ウエスタンブロッティングの結果をイメージスキャナに取り込み、活性化Ａｋｔ、ＨＥＲ−２及びＰＴＥＮのタンパク質に係るそれぞれのバンドのシグナル強度を解析することで、発現量を測定することが可能で、それら測定用機器も一般に市販されている。

本発明において閾値とは、判定対象である癌細胞又は癌組織のアンスラサイクリン系抗癌剤に対する感受性を判断する際の、当該癌細胞又は癌組織中の活性化Ａｋｔ、ＨＥＲ−２及びＰＴＥＮの発現の有無や強弱の判断基準を示し、具体例としては、コントロールとなる細胞又は組織中の活性化Ａｋｔ等の発現量、ハウスキーピング遺伝子やタンパクの発現量及びカットオフ値等が挙げられるが、特にこれ等に限定されるものではない。

本発明において、アンスラサイクリン系抗癌剤の感受性を判定する工程は、活性化Ａｋｔの検出結果から、その有無や強弱が判定可能であれば、特に制限されるものではないが、活性化Ａｋｔの発現量を測定し、その発現量からアンスラサイクリン系抗癌剤の感受性を判定するほうが客観性の観点から好ましい。

また、本発明におけるアンスラサイクリン系抗癌剤の感受性を判定する工程は、活性化Ａｋｔの発現の有無や強弱のみで行うことも可能だが、ＨＥＲ−２及び／又はＰＴＥＮの発現の検出結果を判定の工程に加えるほうが、正確性の観点からより好ましい。これらＨＥＲ−２及びＰＴＥＮの発現も、活性化Ａｋｔの検出と同様に、その発現量を測定することでアンスラサイクリン系抗癌剤の感受性を判定するほうが、客観性の観点から好ましい。

活性化Ａｋｔ、ＨＥＲ−２及びＰＴＥＮの発現量を測定し判定する方法としては、それらの発現の有無や強弱を基準となる閾値と、絶対的又は相対的に比較し、活性化Ａｋｔ、ＨＥＲ−２及びＰＴＥＮの発現の有無や強弱を判定できるものであれば、特に限定されるものではないが、具体的方法としては、以下のi)〜iv)の方法が挙げられる。
i)判定対象である癌細胞又は癌組織の試料に係るタンパク質又は核酸の発現量と、コントロール試料のタンパク質又は核酸の発現量を測定し、それぞれの測定結果を比較及び補正することで発現の有無や強弱を判定する方法。
ii)判定対象である癌細胞又は癌組織の試料とコントロール試料のタンパク含有量等を予め揃えておき、発現量の測定結果を直接比較することで、発現の有無や強弱を判定する方法。
iii)内部標準として、予め適切なハウスキーピング遺伝子のｍ−ＲＮＡやハウスキーピングタンパク（例えばβアクチン、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素等）を定め、該内部標準の発現量と活性化Ａｋｔ、ＨＥＲ−２及びＰＴＥＮのタンパク質又はｍ−ＲＮＡの発現量の測定し、それぞれの測定結果を相対的に比較することで発現の有無や強弱を判定する方法。
iv)予め、アンスラサイクリン系抗癌剤に対する感受性が異なる複数の癌細胞又は癌組織の活性化Ａｋｔ、ＨＥＲ−２及びＰＴＥＮの発現量を測定し、その集積された測定結果からカットオフ値を導き出し、当該カットオフ値を基準として発現量を判定する方法等が挙げられる。

本発明における、抗癌剤の感受性判定システムは、コンピュータにおいて実行されることが好ましい。以下、本発明の抗癌剤の感受性判定方法を実施するための一実施形態であるコンピュータシステム（図１）及び判定フロー（図２）について説明する。

図１に示すシステム１００は、コンピュータ本体１１０、必要データをコンピュータ本体１１０に入力する入力デバイス１３０、及び入出力データ等を表示するディスプレイ１２０を備え、さらに必要に応じて外部記録媒体１４０が含まれ得る。ここで、本実施形態のプログラム１４０ａは、外部記録媒体１４０に記録されていてもよいし、コンピュータ本体１１０に備え付けのメモリ１１０ｂ〜１１０ｄに保存されていてもよい。コンピュータ本体１１０内において、ＣＰＵ１１０ａ、メモリ１１０ｂ〜１１０ｄ、入出力インターフェイス１１０ｆ、画像出力インターフェイス１１０ｈ、読出装置１１０ｅは、それぞれバス１１０ｉにて、データの送受信可能なように接続されている。

図２は、上記抗癌剤の感受性判定方法によるアンスラサイクリン系抗癌剤の感受性の判定を実行するためのプログラムの動作を示すフローチャートであり、このプログラムはメモリ１１０ｄに格納されている。まず、入力デバイス１３０により、検体である癌細胞又は癌組織中の活性化Ａｋｔの発現量が入力されると、ＣＰＵ１１０aが入出力インターフェイス１１０ｆを介して、ＲＡＭ１１０ｃに記憶させる（ステップＳ１）。

ＣＰＵ１１０aは、予めプログラムのデータとしてメモリ１１０ｄに記憶されていた閾値を呼び出して、これらの閾値と活性化Ａｋｔの発現量との比較を実行する（ステップＳ２）。

次に、ＣＰＵ１１０aは、比較結果に基づいてアンスラサイクリン系抗癌剤の感受性の判定を行う（ステップＳ３）。ＣＰＵ１１０aは、活性化Ａｋｔの発現量が閾値以上である場合には、アンスラサイクリン系抗癌剤の感受性「高」と判定する。活性化Ａｋｔの発現量が閾値以下である場合には、アンスラサイクリン系抗癌剤の感受性「低」と判定する。

そして、ＣＰＵ１１０aは、上記の判定結果を、ＲＡＭ１１０ｃに格納するとともに画像出力インターフェイス１１０ｈを介してディスプレイ１２０に出力する（ステップＳ４）。

なお、本実施形態においては、活性化Ａｋｔの発現量を、入力デバイス１３０を用いて入力したが、これに限定されるものではなく、例えば、操作者による入力ではなく、活性化Ａｋｔの発現量が測定装置２００から入出力インターフェイス１１０ｆを介して自動的に取得されるようにしてもよい。

本発明の抗癌剤の感受性判定方法によれば、患者へのアンスラサイクリン系抗癌剤の投与による奏功性について診断することができる。具体的には、患者から採取した癌細胞又は癌組織中の活性化Ａｋｔを検出及び判定し、活性化Ａｋｔの発現が高ければアンスラサイクリン系抗癌剤の投与による奏功性が高い患者であり、逆に活性化Ａｋｔの発現が低ければアンスラサイクリン系抗癌剤の投与による奏功性が低い患者であるとの診断が可能である。

更に、ＨＥＲ−２及びＰＴＥＮの発現の検出及び判定を、活性化Ａｋｔの検出及び判定と組み合わせることにより、より正確なアンスラサイクリン系抗癌剤の投与による奏功性について診断することができる。例えば、活性化Ａｋｔの発現が高く、且つＨＥＲ−２及び／又はＰＴＥＮの発現が高ければアンスラサイクリン系抗癌剤の投与による奏功性がより高い患者であるとの診断が可能である。逆に、活性化Ａｋｔの発現が低く、且つＨＥＲ−２及び／又はＰＴＥＮの発現が低ければアンスラサイクリン系抗癌剤の投与による奏功性がより低い患者であるとの診断が可能である。

この診断により、患者への効果的なアンスラサイクリン系抗癌剤の投与が可能となる。更に、奏功性が低いと診断された患者に対しては、アンスラサイクリン系抗癌剤以外の抗癌剤を投与することで、非効率的な治療を回避し、患者の副作用による負担を低減することが可能となる。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜ヒト乳癌細胞又は癌組織の調製＞
ヒト乳癌細胞である、ＭＣＦ−７、Ｔ４７−Ｄ、ＳＫ−Ｂ−３、ＳＫ−Ｂｒ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より購入した。また、癌組織３８検体（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３８）は、浸潤性乳癌で乳癌ステージ分類においてステージＩ〜ＩＩＩｂに分類される乳癌患者３８名から摘出したものである。尚、当該乳癌患者３８名は癌組織の摘出後にアンスラサイクリン系抗癌剤を主に投与する化学療法を受けている。各ヒト乳癌細胞又は癌組織は、１０％ＦＣＳ（コモンウェルス・ラボラトリーズ社）、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸（ギブコ社）、２ｍＭＬ−グルタミン（シグマ・ケミカル社）、１００μg／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ社）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ギブコ社）、および０．２８μg／ｍｌのフンギゾン（スクイブ・ファーマスーティカルズ社）を含有するイーグル変法最少必須培地（ギブコ社）（以下、単に培地という）で、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿雰囲気中で増殖した。

＜細胞増殖試験＞
３．０×１０^３個のヒト乳癌細胞又は癌組織を96ウェルプレートの培地に撒き、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿雰囲気中で一日培養した。その後、薬剤未添加の培地、又は１μＭドキソルビシンを含む培地に交換し、０、２４、４８、及び７２時間後の細胞増殖を、Ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｓｓａｙｋｉｔ（ケミコン社）又はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙａｓｓａｙ（プロメガ社）を用い、その使用方法に準じて測定した。その結果を図３〜図１１に示す。

ＭＣＦ−７（図３）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図６及び図１１）は、ドキソルビシンの投与０時間目から投与７２時間目に渡り、細胞増殖はコントロールに比べ抑制されている。しかしながら、生細胞は０時間目から殆ど変化がないか増加しており、ドキソルビシンによるアポトーシスの誘導が極めて低いことが明らかに示されている。

Ｔ４７−Ｄ（図４）、ＳＫ−Ｂｒ−３（図５及び図１０）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（図７及び図９）及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３（図８）は、ドキソルビシン投与群では生細胞は０時間目から、時間の経過と共に徐々に減少していることからアポトーシスが誘導されたことが分かる。ここで、ＳＫ−Ｂｒ−３（図５及び図１０）及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３（図８）は、ドキソルビシンの投与によりアポトーシスの誘導が極めて高く、７２時間後には殆ど生細胞が残っていない。それに対し、Ｔ４７−Ｄ（図４）及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８（図７及び図９）では、アポトーシスが誘導されてはいるが、ＳＫ−Ｂｒ−３（図５及び図１０）及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３（図８）よりもその効果が低いことが分かる。

＜ウエスタンブロッティング法による、ヒト乳癌細胞又は癌組織中の活性化Ａｋｔ、ＨＥＲ−２及びＰＴＥＮの発現の検出＞
１．０×１０^６個の各ヒト乳癌細胞又は癌組織を６０ｍｍ培養皿の培地に撒き、１日培養した。培養液及び培養皿に付着したヒト乳癌細胞又は癌組織をセルスクレイパーで回収し、１９０× ｇ、４℃で５分間遠心し、培養液を除去した。次に、残った細胞塊を液体窒素中で凍結させ、−８０℃で一晩保存した。細胞溶解液（０．１％ＮＰ−４０、５０ｍＭＴｉｓ−ＣｌｐＨ７．５、５ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＮａＦ、１ｍＭＮａ３ＶＯ４、０．２％プロテアーゼ阻害剤カクテル(シグマ社)）１００μｌを保存した凍結細胞塊に加えピペッティングにより懸濁し、１０分間氷上で静置した。懸濁液を１２０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離を行い、上清を試料として新しいマイクロチューブに移し、その一部を使用してローリー法によりタンパク量を測定した。

試料に６×ＳＤＳサンプルバッファーを添加し、１００℃で５分間加熱することで、試料中のタンパク質を変性した。１２０００×ｇ、４℃、２０秒間遠心分離を行い、上清を新しいマイクロチューブに移した。タンパク量が２０ｍｇ／ウエルとなるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のゲル(第一化学)に試料を添加し、電気泳動を２時間、２０ｍＡの条件下で行った。Mini Trans-Blot cell (BioRad社) を用いてタンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のゲルからImmobilon FL membrane （以下、単にメンブレンという）(Millipore社)に、１００Ｖ、２時間、４℃の条件下でトランスファーした。次に、メンブレンを４％のＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ＰＨ７．６）、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）で３０分間常温下においてインキュベートした後、下記の希釈した一次抗体を有する１％のＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔバッファーでメンブレンを４℃で一晩、インキュベートした。
Phospho-Akt (Ser473)(587F11) Mouse mAb(Cell Signaling Technologies社), 1/1000
Akt Antibody(Cell Signaling Technologies社), 1/1000
PARP Antibody (Cell Signaling Technologies社), 1/1000
Anti-Glyceramldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase Rabbit Polyclonal Antibody (GAPDH) (TREVIGEN社), 1/1000
Anti-PTEN (A2B1) antibody (Santa Cruz Biotechnology社), 1/200
Anti-PI3-kinase p85a (Z-8) (Santa Cruz Biotechnology社), 1/200
Anti-HER2 antibody (Upstate社), 1/1000
一晩インキュベートしたメンブレンを、常温で５分間、３回ＴＢＳ−Ｔバッファー中でインキュベートすることで洗浄した。洗浄後、下記の希釈した二次抗体を有する１％のＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔバッファーでメンブレンを常温で１時間インキュベートし、二次抗体と反応した。
Polyclonal rabbit anti-mouse polyclonal immunoglobulins/HRP (Dako社), 1/2000
Polyclonal swine anti-rabbit polyclonal immunoglobulins/HRP (Dako社), 1/2000
二次抗体と反応後、再度ＴＢＳ−Ｔバッファーで三回メンブレンを洗浄し、ＥＣＬＰｌｕｓ (Amersham社)で処理した。その結果を図１２及び図１３に示す。

図１２から明らかなように、ドキソルビシンによるアポトーシスの誘導が極めて低かった、ＭＣＦ−７（図３）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図６及び図１１）では、リン酸化されたＡｋｔ、即ち活性化Ａｋｔの発現が極めて低いことが分かる。逆に、ドキソルビシンによりアポトーシスが誘導されたＴ４７−Ｄ（図４）、ＳＫ−Ｂｒ−３（図５及び図１０）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（図７及び図９）及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３（図８）では、活性化Ａｋｔの発現がバンドとして明確に検出できる。

ここで、ドキソルビシンによるアポトーシス誘導の効果が低いＴ４７−Ｄ（図４）及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８（図７及び図９）は、活性化Ａｋｔの発現は確認可能であるが、アポトーシス誘導の効果が高いＳＫ−Ｂｒ−３（図５及び図１０）及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３（図８）よりもＨＥＲ−２の発現が、明らかに低いことが分かる。また、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（図７及び図９）は、ＰＴＥＮの発現量も低いことも確認できる。

更に、図１３は、アンスラサイクリン系抗癌剤を主に治療に使用した乳癌患者の癌細胞又は癌組織３８検体のウエスタンブロッティング法の結果を示す。図中、無病生存期間(年)は、患者が癌を再発すること無く、術後に経過した年数を示している。また、再発の＋及び−は再発の有無を示しており、＋は再発した患者を、−は再発していない患者を示す。例えば、Ｎｏ．１は術後５．０２年経過したが癌の再発が無い患者を表し、Ｎｏ．９は術後４．６０年経過後に癌が再発した患者を表す。癌が再発した８検体（Ｎｏ．９、Ｎｏ．１４、Ｎｏ．２３、Ｎｏ．２６、Ｎｏ．２９、Ｎｏ．３１、Ｎｏ．３５及びＮｏ．３７）では、Ｎｏ．３５を除き、明らかに全ての検体の活性化Ａｋｔの発現が低い。また、活性化Ａｋｔの発現が有るが癌が再発したＮｏ．３５では、ＨＥＲ−２及びＰＴＥＮ、特にＰＴＥＮの発現量が極めて低いことが確認された。

＜活性化Ａｋｔの発現量の測定＞
上述のウエスタンブロッティング法により得られた各ヒト乳癌細胞又は癌組織の、リン酸化及び非リン酸化両方のＡｋｔのバンドに係るシグナルカウントを、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒＦＸ (BioRad社) を用いてそれぞれの分子量のバンドを定量した。Ａｋｔ活性は、リン酸化Ａｋｔのシグナルカウントの、リン酸化及び非リン酸化のＡｋｔのシグナルカウントに対する割合で示した。その測定結果を図１４及び図１５に示す。

図１４から明らかなように、ＭＣＦ−７、Ｔ４７−Ｄ、ＳＫ−Ｂ−３、ＳＫ−Ｂｒ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８のヒト乳癌細胞又は癌組織のうち、ドキソルビシンによるアポトーシス誘導の効果が低いＴ４７−Ｄ及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８は、活性化Ａｋｔの発現量が極めて低いことが分かる。

図１５は、アンスラサイクリン系抗癌剤を主に治療に使用した乳癌患者の癌細胞又は癌組織３８検体を、癌の再発群及び非再発群に分け、それぞれの活性化Ａｋｔの発現量を示したものである。図１５から明らかなように、非再発群には活性化Ａｋｔが高発現の乳癌患者が多く、逆に再発群には活性化Ａｋｔが低発現の乳癌患者が多い。

以上の実施例から明らかなように、アンスラサイクリン系抗癌剤は、従来予後不良を引き起こす可能性が高いとされている、活性化Ａｋｔが高発現の癌細胞又は癌組織に対し治療効果が高く、逆に活性化Ａｋｔが低発現の癌細胞又は癌組織に対し治療効果が低い。更に、活性化Ａｋｔが高発現であり、更にＨＥＲ−２及び／又はＰＴＥＮの発現が高い癌細胞又は癌組織に対し、アンスラサイクリン系抗癌剤は特に有効であることが示された。

このことから、個々の癌患者の癌細胞又は癌組織における活性化Ａｋｔを検出することにより、アンスラサイクリン系抗癌剤の奏功率の高低が判断できるため、効率的な抗癌剤の選択、特にアンスラサイクリン系抗癌剤の選択の適否をより正確に行うことができる。これにより、患者に対する非効率的な治療を回避し、副作用による弊害をより軽減することが可能となり、患者のＱＯＬを交渉することが可能となる。

抗癌剤の感受性判定システムのコンピュータシステムによる一実施形態を示す。抗癌剤の感受性判定システムのコンピュータシステムにおける判定フローを示す。ＭＣＦ−７のドキソルビシン添加の有無における細胞増殖試験の結果を示す。Ｔ４７−Ｄのドキソルビシン添加の有無における細胞増殖試験の結果を示す。ＳＫ−Ｂｒ−３のドキソルビシン添加の有無における細胞増殖試験の結果を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のドキソルビシン添加の有無における細胞増殖試験の結果を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８のドキソルビシン添加の有無における細胞増殖試験の結果を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３のドキソルビシン添加の有無における細胞増殖試験の結果を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８のドキソルビシン添加の有無における細胞増殖試験の結果を示す。ＳＫ−Ｂｒ−３のドキソルビシン添加の有無における細胞増殖試験の結果を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のドキソルビシン添加の有無における細胞増殖試験の結果を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫ−Ｂ−３、Ｔ４７−Ｄ及びＭＣＦ−７のウエスタンブロッティング法による、活性化Ａｋｔ、ＨＥＲ−２及びＰＴＥＮの発現の確認。アンスラサイクリン系抗癌剤を主に治療に使用した乳癌患者の癌細胞又は癌組織３８検体のウエスタンブロッティング法による、活性化Ａｋｔ、ＨＥＲ−２及びＰＴＥＮの発現の確認。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫ−Ｂ−３、Ｔ４７−Ｄ及びＭＣＦ−７のリン酸化Ａｋｔのシグナルカウントの分析結果。アンスラサイクリン系抗癌剤を主に治療に使用した乳癌患者の癌細胞又は癌組織３８検体の、非再発及び再発群における、リン酸化Ａｋｔのシグナルカウントの分析結果。

符号の説明

１００：システム１１０：コンピュータ本体１１０ａ：ＣＰＵ１１０ｂ：ＲＯＭ１１０ｃ：ＲＡＭ１１０ｄ：メモリ１１０ｅ：読出装置１１０ｆ：入出力インターフェイス１１０ｈ：画像出力インターフェイス１１０ｉ：バス１２０：ディスプレイ１３０：入力デバイス１４０：外部記録媒体１４０ａ：プログラム２００：測定装置

Claims

癌細胞又は癌組織中の活性化Ａｋｔを検出する工程と、前記検出の結果からアンスラサイクリン系抗癌剤の感受性を判定する工程と、を有する抗癌剤の感受性判定方法。
前記判定工程において、検出された活性化Ａｋｔが高発現である場合、アンスラサイクリン系抗癌剤の感受性が高いと判定する、請求項１に記載の抗癌剤の感受性判定方法。
前記癌細胞又は癌組織が、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、脳腫瘍、乳癌、前立腺癌、皮膚癌又は白血病細胞の癌細胞又は癌組織である、請求項１又は２に記載の抗癌剤の感受性判定方法。
前記癌細胞又は癌組織が、乳癌の癌細胞又は癌組織である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗癌剤の感受性判定方法。
アンスラサイクリン系抗癌剤がダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、オキザウノマイシン又はイダルビシンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗癌剤の感受性判定方法。
アンスラサイクリン系抗癌剤がドキソルビシン又はエピルビシンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗癌剤の感受性判定方法。
癌細胞又は癌組織中のヒト上皮成長因子受容体２型の発現を検出する工程をさらに有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗癌剤の感受性判定方法。
癌細胞又は癌組織中のＰＴＥＮの発現を検出する工程をさらに有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗癌剤の感受性判定方法。
癌細胞又は癌組織中の活性化Ａｋｔの発現の検出結果を入力する工程と、前記入力された検出結果と閾値とを比較する工程と、前記比較の結果に基づいてアンスラサイクリン系抗癌剤の感受性の判定を行う工程と、前記判定の結果を出力する工程と、を有する抗癌剤の感受性判定システム。
前記癌細胞又は癌組織が、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、脳腫瘍、乳癌、前立腺癌、皮膚癌又は白血病細胞の癌細胞又は癌組織である、請求項９に記載の抗癌剤の感受性判定システム。
前記癌細胞又は癌組織が、乳癌の癌細胞又は癌組織である、請求項９又は１０に記載の抗癌剤の感受性判定システム。
癌細胞又は癌組織中のヒト上皮成長因子受容体２型の発現の検出結果を入力する工程をさらに有する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の抗癌剤の感受性判定システム。
癌細胞又は癌組織中のＰＴＥＮの発現の検出結果を入力する工程をさらに有する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の抗癌剤の感受性判定システム。