BRPI0609096A2 - determinação de responsivos à quimioterapia - Google Patents

Abstract

DETERMINAçãO DE RESPONSIVOS à QUIMIOTERAPIA. A presente invenção refere-se a um processo para determinar se uma amostra biológica compreendendo células humanas de câncer de pulmão é sensível a uma combinação de um inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico e de um agente quimioterápico pela determinação da superexpressão de uma proteína AKT fosforilada e/ou uma proteína MAPK fosforilada, presente na amostra biológica. A invenção refere-se também a processos para produção de um possível agente ou para seleção de uma composição que iniba a progressão de câncer pulmonar em um paciente, em que uma proteína AKT fosforilada e/ou proteína MAPK fosforilada é utilizada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DETERMI-NAÇÃO DE RESPONSIVOS À QUIMIOTERAPIA".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um processo para determinar se uma amostra biológica compreendendo células humanas de câncer de pul-mão é sensível a uma combinação de um inibidor do receptor do fator decrescimento epidérmico e de um agente quimioterápico pela determinaçãoda superexpressão de uma proteína AKT fosforilada e/ou uma proteínaMAPK fosforilada, presente na amostra biológica. A invenção refere-se tam-bém a processos para produção de um possível agente ou para seleção deuma composição que iniba a progressão de câncer pulmonar em um pacien-te, em que uma proteína AKT fosforilada e/ou proteína MAPK fosforilada éutilizada.

Antecedente da Invenção O EGFR, codificado pelo gene erbB1, foi implicado na causali-

dade de malignidade humana. Particularmente, foi observado que a expres-são do EGFR está aumentada em câncer de mama, bexiga, cabeça, pesco-ço e estômago, bem como em glioblastomas. O Receptor do Fator de Cres-cimento Epidérmico (EGFR), uma glicoproteína com 170 kD, é composta por um domínio extracelular com N-terminal, um domínio transmembrana hidro-fóbico e uma região intracelular com C-terminal contendo o domínio quinase.A dimerização induzida por ligante do EGFR ativa o domínio intrínseco RTK(um domínio Src de homologia 1, SH1), resultando na autofosforilação emseis resíduos de tirosina, específicos do EGFR, na cauda não catalítica do domínio citoplásmico.

Os efeitos celulares da ativação de EGFR, em uma célula can-cerosa, incluem aumento de proliferação, promoção de mobilidade celular,adesão, invasão, angiogênese e melhora de sobrevida celular por inibiçãode apoptose. O EGFR ativado induz a proliferação celular do tumor através da estimulação da cascata da proteína quinase ativada por mitógenos(MAPK). Na ligação do ligante com o EGFR, o fator de troca de nucleotídeode guanina SOS é recrutado da membrana plasmática por meio da proteínaadaptadora Grb2, a qual estimula a troca de GTP por GDP na pequena pro-teína Ras do tipo G, ativando subseqüentemente a cascada da MAPK, com-posta por Raf, MEK e ERK. As ERKs ativadas (pMAPK, Perk1/2), por seuturno, induzem a fosforilação e ativam fatores de transcrição como ELK-1 ou c-Myc, promovendo o crescimento celular.

Múltiplos caminhos dos fatores de crescimento contribuem paraa progressão e sobrevivência das células NSCLC através da ativação demúltiplas quinases. O EGFR aumenta a sobrevivência das células cancerí-genas também pela sinalização através da via fosfatidilinositol-3-quinase

(PI3K)/Akt e via STAT. A Akt é estimulada também por outros fatores decrescimento, incluindo o fator de crescimento semelhante à insulina-1, o fa-tor de crescimento de fibroblasto básico, e interleucinas 3 e 6. As três iso-formas da Akt 1 -3 são todas fosforiladas (pAKT) em um modo semelhante—nos resíduos T308, no domínio da ativação, e S473, no domínio de COOH-

terminal.

Erlotinibe (Tarceva®, um potente inibidor da tirosina quinase(TKI) do receptor do fator de crescimento epidérmico (HER1/EGFR) benefi-cia a sobrevida em pacientes com câncer de pulmão de células não peque-nas (NSCLC), que não obtiveram êxito anterior quando este foi utilizado co-

mo agente isolado (WO 01/34574)). A eficácia do Tarceva® foi estudada emdiversos estudos. A sua denominação química é N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)quinazolin-4-amina.

O estudo TALENT foi um estudo de fase III placebo controladoem pacientes de primeira linha com NSCLC, que receberam gemcitabina e

cisplatina (esta radioquimioterapia concomitante era o padrão de tratamentofora dos Estados Unidos) em combinação com erlotinibe (Tarceva® na dosede 150 mg/dia ou com placebo). O endpoint (objetivo final) primário foi dura-ção de sobrevida, com endpoints secundários de tempo para progressão,taxa de resposta, duração de resposta, parâmetros farmacocinéticos e far- macodinâmicos e qualidade de vida. As taxas de expressão de HER1/EGFRe de HER2 foram avaliadas também. Foi efetuada uma análise padrão desegurança. O desfecho global do estudo TALENT foi negativo. Não houvebenefício demonstrável, em relação aos endpoints primário e os secundá-rios, para erlotinibe (Tarceva® mais quimioterapia (gemcitabina e cisplatina),em comparação ao uso isolado da gemcitabina e cisplatina (Gatzemeier, U.,et ai, Proc Am Soe Clin Oncol 23 (2004) 617 (Abstract 7010))). Resultados idênticos foram observados no estudo TRIBUTE, sediado nos Estados Uni-dos, com erlotinibe associada a carboplatina e paclitaxel (Herbst, R.S. et aiJ Clin Oncol (2004) ASCO Annual Meeting Proceedings. Post-Meeting Editi-on; 22 (July 15 Suppl.) (Abstract 7011)). Um estudo de fase III randomizadoe placebo controlado com o uso isolado do agente erlotinibe, como terapia

de segunda ou de terceira linha para câncer de pulmão de células não pe-quenas (NSCLC) (BR.21; NCIC/OSIP) constatou uma melhora estatistica-mente significativa em sobrevida com erlotinibe (6,7 meses), comparada aplacebo (4,7 meses).

Diversos estudos estão relacionados com a investigação de bi- omarcadores em câncer de pulmão de células não pequenas e sua relaçãocom certos fármacos inibidores do EGFR. Han et ai, Int J Câncer 113 (2005)109-115 investigam 65 pacientes em monoterapia com Gefitinibe (Iressa®,EGFR TIK). Eles analisam moléculas em posição posterior ao EGFR, comomarcadores predicativos de resposta para gefitinibe em câncer de pulmão de células não pequenas resistente à quimioterapia. Cappuzzo, F. et ai, JNCI96 (2004) 1133 - 1141 investigam 106 pacientes em monoterapia com Gefi-tinibe (Iressa; EGFR TKI). Eles investigam a fosforilação por Akt e a eficáciade gefitinibe em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenasem estágio avançado e constatam que pacientes com tumores P-Akt- positivo, os quais receberam gefitinibe, se beneficiaram mais da terapia doque pacientes com tumores P-Akt-negativo. Vicent, S. et ai, Br J Câncer 90(2004) 1047 - 1052 investigam 111 pacientes com NSCLC. Eles constatamque pERK está ativado em câncer de pulmão de células não pequenas eassociado a tumores em estágio avançado. Han, S.W. et ai, J Clin Oncol 23 (2005) 2493 - 2501 investigam 90 pacientes em monoterapia com Gefitinibe(EGFR TKI). Eles analisam o impacto predicativo e prognóstico da Mutaçãode Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico em pacientes com câncerde pulmão de Células Não Pequenas, tratados com gefitinibe. Mukohara, T.et ai, Lung Câncer 41 (2003) 123- 130 investigam 60 pacientes, 20 pacien-tes por estágio, que se submeteram à quimioterapia neoadjuvante ou irradi-ação. A expressão do EGFR está correlacionada com a expressão de pERK e pAkt. O tamanho da amostra é muito pequeno, conforme mencionado pe-los próprios autores. Raben, D. et aí., Int J Radiation Oncology Biol. Phys 59(2004) 27 - 38 investigam terapias voltadas para câncer de pulmão de célu-las não pequenas. Ono, M et ai, Mol Câncer Ther 3 (2004) 465 - 472 anali-sam 9 linhagens de células do NSCLC, tratadas com gefitinibe. Hirsch, F.R. et ai, Curr Opin Oncol 17 (2005) 118 - 122 revêem o status de fosforilaçãoda Akt e MAPK, como possível marcador para resistência a gefitinibe. Meertet ai, Clinicai Câncer Research 9 (2003) 2316 - 2326 investigam linhagensde células do NSCLC em termos de atividade do inibidor do EGFR. Nem osníveis de expressão do EGFR nem do Her2 estão correlacionados com a sensibilidade a inibidores do EGFR. Brognard, J. et ai, Cell Death and Diffe-rentiation 9 (2002) 893 - 904 analisaram 19 linhagens de células do NSCLCem que 17 exibiram fosforilação de Erk1/2 e atividade constitutiva. David, O.et ai, Clinicai Câncer Research 10 (2004) 6865 - 6871 expõem que a super-expressão de pAkt é um fator prognóstico independente em NSCLC. Kakiu- chi, S. et ai, Human Molecular Genetics 13 (2004) 3029 - 3043 investigamum microarranjo amplo de cDNA genômico de 33 pacientes com NSCLC.Todos receberam gefitinibe em um esquema de monoterapia. Não foramconstatadas evidências para correlação entre o nível de expressão deAkt/pAkt, status do gene de EGFR ou coloração de pEGRF e resposta a ge- fitinibe. Kim, R.H. et ai, Câncer Cell 7 (2005) 263 - 273 expuseram que aexpressão de DJ-1, um oncogene, é equivalente ao nível de pAkt. Balsara,B.R. et ai, Carcinogenesis 25 (2004) 2053 - 2059 investigam 110 pacientescom NSCLC com expressão de pAkt de TMA. Não há diferença expressivaem sobrevida entre negatividade e positividade de pAkt. Hirami, Y. ei ai, Câncer Letters 214 (2004) 157 - 164 investigam a relação do receptor defator de crescimento epidérmico, pAkt e fator 1 alfa, induzível por hipóxia, emcânceres de pulmão de células não pequenas. Lee, S.H. et ai, APMIS 110(2002) 587 - 592 analisam 43 metástasés de LN em pacientes com NSCLC.A ativação de Akt, no NSCLC, atua no desenvolvimento do tumor, mais doque em sua progressão. Engelman, J.A. et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA102 (2004) 3788 - 3793 analisam se a atividade da fosfoinositídeo 3-quinase é mediada por erb—3 em linhagens de células do câncer de pulmão de célu-las não pequenas sensíveis ao gefitinibe. David, O., J Cell Mol Med5 (2001)430 - 433 discute o papel de Akt e PTEN como novos marcadores diagnósti-cos em câncer de pulmão. Mantha, A. et ai, Clin Câncer Res. 11 (2005)2398 - 2407 investigam a definição de alvo da via do mevalonato que inibe a

função do receptor do fator de crescimento epidérmico.

Marcadores prognósticos associados com EGFR, positivos paracâncer, são investigados em WO 2004/046386. Marcadores de expressãogenética para resposta a fármacos inibidores de EGFR são expostos por US2004/0157255. Biomarcadores e processos para determinação de sensibili-

dade aos moduladores do receptor do fator de crescimento epidérmico sãoexpostos em WO 2004/063709. WO 01/00245 descreve anticorpos anti-ErbB2 humanizados e processos para o tratamento de câncer com anticor-pos anti-ErbB2, como anticorpos anti-erbB2 humanizados.Sumário da Invenção

Há ainda necessidade para que processos para a determinação

da sensibilidade à terapia com inibidor do EGFR sejam providos, particular-mente para terapias que combinam um inibidor do EGFR e um agente qui-mioterápico.

Por conseguinte, em uma concretização da invenção, é provido um processo de determinação se uma amostra biológica compreendendocélulas humanas de câncer de pulmão é sensível a uma combinação de uminibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico e um agente quimio-terápico, o processo compreendendo a determinação da superexpressão deuma proteína AKT fosforilada e/ou uma proteína MAPK fosforilada na amos-tra biológica, em que a superexpressão da proteína AKT fosforilada e/ou aproteína MAPK fosforilada é um indicativo de que a amostra biológica com-preendendo células humanas de câncer de pulmão é sensível a uma combi-nação de um inibidor do fator de crescimento epidérmico e de um agentequimioterápico.

Em outra concretização da invenção, um anticorpo que se liga àproteína AKT fosforilada ou um anticorpo que se liga à proteína MAPK fosfo- rilada é utilizado para determinar se uma amostra compreendendo célulashumanas de câncer de pulmão é sensível a uma combinação de um inibidordo fator de crescimento epidérmico e de um agente quimioterápico.

Em outra concretização da invenção, é provido um processo pa-ra seleção de uma combinação que iniba a progressão do câncer de pulmão em um paciente, o processo compreendendo:

a) a exposição separada de alíquotas de uma amostra biológica,a qual compreende células de câncer de pulmão sensíveis a uma combina-ção de um inibidor do EGFR e de um agente quimioterápico do paciente, napresença de uma diversidade de composições para testes; b) a comparação do nível de expressão de uma proteína MAPK

fosforilada nas alíquotas da amostra biológica posta em contato com ascomposições para teste e o nível de expressão da proteína AKT fosforiladae/ou da proteína MAPK fosforilada em uma alíquota da amostra biológicaque não foi posta em contato com as composições para teste, c) a seleção de uma das composições para teste que altere o

nível de expressão da proteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fos-forilada na alíquota contendo aquela composição para teste, em relação àalíquota que não foi posta em contato com a composição para teste, em queuma diferença de pelo menos 10% entre o nível de expressão da proteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada na alíquota da amostrabiológica, posta em contato com a composição para teste, e o nível de ex-pressão da proteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada naalíquota da amostra biológica que não foi posta em contato com a composi-ção para teste é um indicativo para a seleção da composição para teste. Em ainda uma outra concretização da invenção, é provido um

processo para produção de um possível agente, o referido processo com-preendendo:a) o contato de uma alíquota de uma amostra biológica contendocélulas de câncer de pulmão, as quais são sensíveis a um inibidor do EGFRe a um agente quimioterápico com o possível agente,

(b) a determinação do nível de expressão de uma proteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada na alíquota da amostra bioló-gica posta em contato com o possível agente e a determinação do nível deexpressão da proteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforiladaem uma alíquota da amostra biológica que não foi posta em contato com opossível agente,(c) a observação do efeito do possível agente pela comparação

do nível de expressão da proteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPKfosforilada na alíquota da amostra biológica posta em contato com o possívelagente e o nível de expressão da proteína AKT fosforilada e/ou da proteínaMAPK fosforilada na alíquota da amostra biológica que não foi posta em contato com o possível agente,

(d) a produção do referido agente, a partir do referido efeito ob-servado, em que uma diferença de pelo menos 10% entre o nível de expres-são da proteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada na alí-quota da amostra biológica posta em contato com o possível agente e o ní-vel de expressão da proteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fosfori-lada na alíquota da amostra biológica que não foi posta em contato com opossível agente é indicativo de um efeito do possível agente.

Em outra concretização da invenção, um possível agente, pro-duzido pelo processo de acordo com a invenção, é fornecido e um prepara- do farmacêutico compreendendo um agente de acordo com a invenção.

Em ainda uma outra concretização da invenção, um agente deacordo com a invenção é utilizado para o preparo de uma composição vi-sando a inibição de progressão de câncer de pulmão.

Em mais uma outra concretização da invenção, um processo de produção de um fármaco, compreendendo as etapas do processo da inven-ção e

(i) a síntese do possível agente identificado na etapa (c), ou deum análogo ou derivado do mesmo, em uma quantidade suficiente para for-necer o referido fármaco em uma quantidade terapeuticamente efetiva paraum sujeito; e/ou

(ii) a combinação do possível fármaco com o possível agente identificado na etapa (c), ou um análogo ou derivado do mesmo, com umveículo farmaceuticamente aceitável.

Em outra concretização da invenção, uma proteína Akt, uma pro-teína MAPK, uma proteína AKT fosforilada, uma proteína MAPK fosforilada,um anticorpo que se liga seletivamente a uma proteína AKT fosforilada ou uma proteína MAPK fosforilada é utilizado para produzir um possível agenteou para selecionar uma composição visando à inibição da progressão decâncer de pulmão em um paciente.

Em ainda outra concretização da invenção, é provido um kitcompreendendo.um anticorpo contra proteína MAPK fosforilada e/ou fosfori- lada por Akt.

O termo "amostra biológica" significará geralmente qualquer a-mostra biológica obtida de um indivíduo, líquido corporal, linhagem celular,cultura de tecido ou de outra fonte. Líquidos corporais incluem, por exemplo,linfa, soro, plasma, urina, sêmen, líquido sinovial e líquido çefalorraquidiano. De acordo com a invenção, a amostra biológica compreende células de cân-cer de pulmão e células não cancerosas de pulmão (outras células). Proces-sos para se obter biópsias de tecidos e líquidos corporais, de mamíferos,são bem-conhecidos na técnica.

O termo "nível de expressão" ou "nível expresso" refere-se ge- ralmente à quantidade de um produto de aminoacido ou proteína na amos-tra, preferencialmente um produto de aminoacido fosforilado ou de proteínafosforilada na amostra, de acordo com a invenção. "Expressão" refere-se aoprocesso pelo qual uma informação de código genético é convertida nas es-truturas presentes e em funcionamento na célula, incluindo sua fosforilação, de acordo com a invenção. Conforme aqui utilizado, "genes expressos" in-cluem aqueles que são transcritos em mRNA e, em seguida, traduzidos emproteína e após a tradução, modificados, por exemplo, fosforilados. Apenaspara ser mais completo, este termo incluirá também os genes expressos queforem transcritos em RNA, porém não traduzidos em uma proteína (por e-xemplo, RNA de transferência ou ribossomal). Os termos "superexpressão"e "subexpressão" referem-se a um desvio para cima ou para baixo, respecti- vãmente, em níveis de expressão quando comparados ao nível de expres-são basal em uma amostra utilizada como controle. "Superexpressão" étambém, por conseguinte, "expressão aumentada" e "subexpressão", "ex-pressão diminuída".

O termo "anticorpo" é utilizado aqui no sentido mais amplo e a-

brange especificamente anticorpos monoclonais íntegros, anticorpos policlo-nais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos),formados por pelo menos dois anticorpos íntegros e fragmentos de anticor-po, desde que eles exibam a atividade biológica desejada.- O termo "anticorpo monoclonal", conforme utilizado no presente,

refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substanci-almente homogêneos, ou seja, os anticorpos individualizados que compre-.... endem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações que ocor-ram naturalmente que poderão estar presentes em quantidades mínimas.Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra

um único sítio antigênico. Ademais, ao contrário de preparados de anticor-pos policlonais, que incluem anticorpos diferentes direcionados contra de-terminantes (epítopos) diferentes, cada anticorpo monoclonal é dirigido con-tra um único determinante no antígeno. Além de sua especificidade, os anti-corpos monoclonais são vantajosos no sentido de que podem ser sintetiza-

dos sem contaminação por outros anticorpos. O modificador "monoclonal"indica o caráter do anticorpo!como o obtido de uma população substancial-mente homogênea de anticorpos, não devendo ser interpretado como exi-gindo ser produzido por qualquer processo particular. Por exemplo, os anti-corpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção

podem ser obtidos pelo processo de cultivo de células de hibridoma, descritoinicialmente por Kohler, G. et ai, Nature 256 (1975) 495, ou poderão ser ob-tidos por processos com DNA recombinante (consultar, por exemplo, a pa-tente U.S. No. 4 816 567). "Fragmentos de anticorpo" compreendem umaparte de um anticorpo íntegro.

Um anticorpo "que se liga" a um antígeno de interesse, de acor-do com a invenção, ou seja, a proteína MAPK fosforilada e/ou a fosforilada por pAKT, é aquele que for capaz de se ligar àquele antígeno com afinidadesuficiente de forma que o anticorpo possa ser utilizado para detectar a pre-sença do antígeno. O anticorpo de acordo com a invenção é aquele que seliga à proteína MAPK fosforilada ou fosforilada por pAkt, sendo geralmentepreferível, aquele que se liga à proteína MAPK fosforilada ou fosforilada por pAkt, em oposição à proteína não fosforilada por MAPK a não fosforilada porpAkt, e que não tenha uma reação cruzada significante com proteína nãofosforilada por MAPK ou a não fosforilada por pAkt. Nestas concretizações, aextensão da ligação do anticorpo com as proteínas não fosforiladas será in-ferior a 10%, conforme determinado por análise de seleção de células ativa- das por fluorescência (FACS) ou por radioimunoprecipitação (RIA).Em ou-tras palavras, ele se ligará especificamente à proteína MAPK fosforilada ou afosforilada por pAkt e não se ligará especificamente ou de forma alguma àproteína não fosforilada por MAPK ou a não fosforilada por pAkt.

Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tra- tamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentesalquilantes, como tiotepa e ciclofosfamida (CITOXAN®); alquilsulfonatos,como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas como benzodopa, carbo-quona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas, incluindotrietileno tiofosforamida e trimetilmelamina; mostardas nitrogenadas como clorambucil, clornafazina, cliclofosfamida, estramustina, ifosfamida, meclore-tamina, cloridrato de oxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, pred-nimustina, trofosfamida, uracil mostarda; nitrosuréias como carmustina, clo-rozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos comoaclacinomicinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactino- micina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomici-nas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina,doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomici-nas, ácido micofenólico, nogalamicina, òlivomicinas, peplomicina, tubercidi-na, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabólicos como metotrexate e 5-fluoruracil (5-FU); análogos do ácido fólico como denopterina, metotrexate,pteropterina, trimetrexate; análogos de purina como fludarabina, 6-mercapto- purina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina como ancitabina, azaci-tidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enoci-tabina, floxuridina, 5-FU; androgênios como calusterona, propionato de dro-mostanolona, epitiostanol., mepitiostano, testolactona; anti-adrenocorticaiscomo aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo aldofosfamida; ácido aminolevulínico;amsacrina; bestrabucil, bisantreno; edatraxato, defofamina; demecolcina,diaziquona; elformitina; acetato de eliptínio; etoglucida; nitrato de gálio; hi-droxiuréia; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; ni-tracrina; pentostanina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidra-zida; procarbazina; PSK®; razoxana; sizofirana; espirogermânio; ácido tenu-azônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarba-zina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabi-nosídeo ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por exemplo, paclitaxel(TAXOL®, Bristol-Mayers Squibb Oncololy, Princeton, N.J.) e docetaxel (TA- XOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucil; gemcitabi-na; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexate, análogos de platina comocisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposide (VP-16); ifofasmida;mitomicina C, mitoxantrona; vincristina, vinorelbina; navelbina; novantrona;teniposide; daunomicina; aminopterina; xeloda, ibandronato; CPT-11; inibidorda topoisomerase RFS 2000; difluormetilornitina (DMFO); ácido retinóico;esperamicinas; capecitabina e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamenteaceitáveis de qualquer um dos precedentes. Também incluídos nesta defini-ção são os agentes anti-hormonais cuja ação regula ou inibe a ação hormo-nal sobre tumores, como anti-estrógenos incluindo, por exemplo, tamoxifen, raloxifeno, aromatases que inibem 4(5)imidazóis, 4-hidroxitamoxifen, trioxi-feno, keoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston); e anti-androgênios como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolide e goserelin;e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer umdos precedentes. O próprio "agente quimioterápico" pode ser uma combina-ção de compostos químicos úteis no tratamento de câncer, combinação con-forme mencionada acima, ou seja, a combinação pode ser de gemcitabi-na/cisplatina, porém também, por exemplo, cisplatina/paclitaxel, cisplati-na/docetaxel, cisplatina/vinorelbina/gemcitabina/carboplatina ou carboplati-na/docetaxel.

O termo "inibidor do EGFR" refere-se a um agente terapêuticoque se liga ao EGFR e, opcionalmente inibe a ativação do EGFR. Exemplos destes agentes incluem antibióticos e moléculas pequenas que se ligam aoEGFR. Exemplos de antibióticos que se ligam ao EGFR incluem Mab 579(ATCC CRL HB 8506), Mab 455 (ATCC CRL Hb 8507), Mab 225 (ATCCCRL 8508), Mab 528 (ATCC CRL 8509) (consultar US 4 943 533, Mendel-sohn et ai.) e variantes dos mesmos, como 225 quimerizado (C225 ou Cetu-ximab; ERBUTIX®) e 255 remodelado humano (H225) (consultar WO96/40210, Imclone Systems Inc.); anticorpos que se ligam ao EGFR mutantedo tipo 11 (US 5 212 290); anticorpos humanizados e quiméricos que se li-gam ao EGFR, conforme descrito em US 5 891 996; e anticorpos humanosque se ligam ao EGFR, como o ABX-EGF (consultar WO 98/50433, Abge- nix). O anticorpo anti-EGFR pode ser conjugado a um agente citotóxico ge-rando, dessa forma, um imunoconjugado (consultar, por exemplo, EO 0 659439 A2, Merck Patent GmbH). Exemplos de moléculas pequenas que se li-gam ao EGFR incluem ZD1839 ou Gefitinibe (IRESSA®, Astra Zeneca), CP-358774 (Tarceva®, Genentech/OSI) e AG1478, AG1571 (SU 5271, Sugen). Particularmente preferido neste pedido são os inibidores da tirosina quinasedo EGFR, particularmente inibidores de moléculas pequenas da tirosina qui-nase do EGFR como, por exemplo, Tarceva®. Uma "molécula pequena" po-de ser, por exemplo, um peptídeo ou um peptideomimétiço com peso mole-cular inferior aproximadamente a 10.000 gramas por mol, preferencialmente inferior aproximadamente a 5.000 gramas por mol. Preferencialmente, uma"molécula pequena" é um composto, ou seja, um composto orgânico ou i-norgânico com peso molecular inferior aproximadamente a 5.000 gramas pormol, preferencialmente, inferior aproximadamente a 1.000 gramas por mol emais preferencialmente inferior a 500 gramas por mol, e sais, ésteres e ou-tras formas farmaceuticamente aceitáveis destes compostos. Por conseguin-te, em uma concretização preferida da invenção, o inibidor do EGFR é um inibidor da tirosina quinase do EGFR em que este é um composto com pesomolecular inferior aproximadamente a 5.000 gramas por mol, preferencial-mente, inferior aproximadamente a 1.000 gramas por mol e mais preferenci-almente inferior a 500 gramas por mol, e sais, ésteres e outras formas far-maceuticamente aceitáveis deste composto. Ou seja, o inibidor do EGFR é

um composto que inibe a atividade da tirosina quinase do EGFR e que pos-sui peso molecular inferior a 5.000 gramas por mol, preferencialmente, infe-rior aproximadamente a 1.000 gramas por mol e mais preferencialmente in-- ferior a 500 gramas por mol, e sais, ésteres e outras formas farmaceutica-mente aceitáveis deste composto.

"Gemcitabina" é o agente quimioterápico 2',2'-difluordeoxicitidina

(dFdC), um análogo da pirimidina do deoxicitidina em que a porção desoxir-ribose contém dois átomos de flúor na posição 2' (consultar Heinemann, V.et ai, Câncer Res 48 (1988) 4024). Ele está à disposição no mercado comoGemzar®, da Eli Lilly and Company, Indianápolis, Indiana, EUA.

"Cisplatina", conforme utilizada por todo este pedido de patente,

é o agente quimioterápico cisdiaminodicloroplatina (consultar US 5 562 925),à disposição no mercado sob a forma de Platinol, da Bristol-Myers SquibbCompany, Nova York, NY, EUA. "Cisplatina" é um complexo de metal pesa-do contendo um átomo central de platina cercado por dois átomos de cloreto

e duas moléculas de amônia na posição eis.

De acordo com a invenção, a expressão que "uma amostra bio-lógica compreendendo células humanas de câncer de pulmão é sensível auma combinação de um inibidor do receptor de fator de crescimento epidér-mico e um agente quimioterápico" significará que a amostra compreendendo

células humanas de câncer de pulmão é sensível a um tratamento com umacombinação de um inibidor do fator de crescimento epidérmico e um agentequimioterápico ao contrário de um tratamento com um inibidor do fator decrescimento epidérmico isolado. "Sensível" pode ser também entendido co-mo "reagindo a" ou "exibindo uma reação a", particularmente uma reaçãoque traga benefício a um paciente com câncer de pulmão. Com isso, podeser determinado se um paciente com câncer de pulmão é sensível a um tra- tamento com uma combinação de um inibidor do fator de crescimento epi-dérmico e um agente quimioterápico ao contrário de um tratamento com uminibidor do fator de crescimento epidérmico isolado. Isso significa que o pa-ciente se beneficiará deste tratamento.

Uma proteína "MAPK" faz parte de uma família de proteína qui- nase com nível de serina/treonina citosólica altamente preservada, conheci-da como proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs) ou quinasesextracelulares reguladas por sinal (ERKs). Esta família de proteínas possuidiversos subgrupos. As ERKs são ativas e as suas tirosinas ou treoninas,fosforiladas, em resposta a uma ampla diversidade de sinais, incluindo so- brecarga osmótica, choque térmico, citoquinas pró-inflamatórias, hormôniose mitógenos. O termo "proteína MAPK", conforme utilizado nesta invenção,refere-se preferencialmente a um membro da família das proteínas MAPKque compreenda ou, preferencialmente, seja constituída por MAPK1 eMAPK3. As seqüências de aminoácidos de MAPK1 (ERK2) são SEQ ID NO: 1 e de MAPK3 (ERK1), SEQ ID NO: 2. Estas seqüências de aminoácidossão codificadas pelas seqüências de mRNA, isto é, cDNA, SEQ ID NO: 3 e4, para MAPK1, e SEQ ID NO: 5 para MAPK3. Os sítios primários de fosfori-lação, na MAPK1, são Tr182 e Tir185 e a fosforilação primária, na MAPK3,ocorre Tr202 e Tir204. Estes sítios de fosforilação são reconhecidos também pelo anticorpo utilizado na presente invenção, ou seja, preferencialmente, osoro de anticorpo policlonal contra as formas fosforiladas de MAPK1 eMAPK3.

O termo proteína "Akt" refere-se a uma proteína da subfamíliaAkt/PK de proteínas quinases serina/treonina, reguladas segundo mensagei- ro, a qual possuí três membros denominados Akt1/PKBalfa, Akt2/PKB beta(Stall, S.P., Proc Natl. Acad. Sei USA 84 (1987) 5034-5037) eAkt3/PKBgama (Nakatani, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 257(1999) 906-910; US 6 881 555), respectivamente. As isoformas são homólo-gas e ativadas por fosforilação em resposta à sinalização da fosfatotidiIinosi-tol 3'-OH quinase (PI3K). A via PI3K/Akt/PKB aparenta ser muito importantepara a regulação de sobrevida/morte celular (Dudek, H. et ai, Science (1997) 661-665), além de na tumorigênese. O termo "proteína Akt", confor-me utilizado nesta invenção, refere-se preferencialmente a um membro dafamília das proteínas Akt que compreende ou é preferencialmente constituí-do por Akt1, Akt2 e Akt3. A fosforilação de Akt1/PKBoc ocorre em dois sítiosda 308Tr e em 473Ser (Meier, R. et ai, J. Biol. Chem. 272 (1997) 30491- 30497). Sítios equivalentes de fosforilação ocorrem na Akt2/PKBbeta (309Tr eem 474Ser) e Akt3/PKBgama (305Tr e em 472Ser). O termo proteína "Akt fosfo-rilada" refere-se a uma proteína "Akt" fosforilada, preferencialmente fosfori-. lada nos sítios descritos acima. O termo "proteína MAPK", conforme utilizadonesta invenção, refere-se preferencialmente a um membro da família de pro-teínas MAPK que compreende ou é preferencialmente constituído porMAPK1 e MAPK3. Akt1 é também conhecida como proteína quinase seri-na/treonina RAC alfa humana (EC 2.7.1.37) (RAC-PK-alfa), proteína quinaseB (PKB) (C-AKT) e a seqüência de aminoácidos da Akt1 é SEQ ID NO: 6. AATK2 é também conhecida como proteína quinase serina/treonina RAC betahumana (EC 2.7.1.37) (RAC-PK-beta), proteína quinase Akt-2 ou proteínaquinase B, beta (PKB beta) e a seqüência de aminoácidos da Akt2 é SEQ IDNO: 7. A ATK3 é também conhecida como proteína quinase serina/treoninaRAC gama humana (EC 2.7.1.37) (RAC-PK-gama), proteína quinase Akt-3ou proteína quinase B, gama (PKB gama) e a seqüência de aminoácidos da Akt3 é SEQ ID NO: 8.

Descrição Detalhada da Invenção

Técnicas convencionais de biologia molecular e de química deácido nucléico, as quais fazem parte da capacidade da técnica, são explica-das na literatura. Consultar, por exemplo, Sambrook, J. era/., Molecular Clo-ning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold S-pring Harbor, New York, 1898; Gait, M.J. (ed.), Oligonucleotide Synthesis - APractical Approach, IRL Press, 1984; Hames, B.D. e Higgins, S.J. (eds.), Nu-cleic Acid Hybridisation - A Practical Approach, IRL Press, 1985; e uma sé-rie, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., todos os quais aqui in-corporados por referência. Todas as patentes, os pedidos de patentes e pu-blicações aqui mencionados, acima e abaixo, são aqui incorporados por re- ferência.

Em uma concretização da invenção, um processo é provido dedeterminação se uma amostra compreendendo células humanas de câncerde pulmão é sensível a uma combinação de um inibidor do receptor de fatorde crescimento epidérmico e um agente quimioterápico, o processo compre-

endendo a determinação da superexpressão de uma proteína AKT fosforila-da e/ou uma proteína MAPK fosforilada na amostra biológica, pelo qual asuperexpressão da proteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fosfori-lada é indicativo de que a amostra biológica compreendendo células huma-nas de câncer de pulmão é sensível a uma combinação de um inibidor do

receptor de fator de crescimento epidérmico e um agente quimioterápico.

No processo de acordo com a invenção, a superexpressão daproteína AKT fosforilada e/ou proteína MAPK fosforilada, na amostra biológi-ca, é preferencialmente determinada por

a) a determinação do nível de expressão de proteína AKT fosfo- rilada e/ou de proteína MAPK fosforilada na amostra biológica,

b) a determinação do nível de expressão de proteína AKT fosfo-rilada e/ou de proteína MAPK fosforilada na amostra biológica compreen-dendo células humanas de câncer de pulmão que não sejam sensíveis auma combinação de um inibidor do receptor de fator de crescimento epidér-

mico e um agente quimioterápico,

c) a determinação da diferença do nível de expressão da proteí-na AKT fosforilada e/ou de proteína MAPK fosforilada determinado na etapaa) e d), e pelo mesmo, a determinação da superexpressão da de proteínaAKT fosforilada e/ou de proteína MAPK fosforilada.

A diferença do nível de expressão da proteína AKT fosforilada

e/ou da proteína MAPK fosforilada, determinado na etapa (a) e (b) é, prefe-rencialmente, de pelo menos 10%. Mais preferencialmente, a diferença donível de expressão da proteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fos-forilada, determinado na etapa (a) e (b), é de pelo menos 25%. Em outraconcretização, a diferença do nível de expressão da proteína AKT fosforiladae/ou da proteína MAPK fosforilada, determinado na etapa (a) e (b) é de pelo menos 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 300%, 400%, 500% ou1.000%. A diferença do nível de expressão da proteína AKT fosforilada e/ouda proteína MAPK fosforilada, determinado na etapa (a) e (b), pode ser deaté 10.000 ou 50.000%. A diferença do nível de expressão da proteína AKTfosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada, determinado na etapa (a) e (b), é preferencialmente, de 10% a 10.000%, mais preferencialmente, de25% a 10.000%, 50% a 10.000%, 100% a 10.000%, ainda mais preferenci-almente, de 25% a 5.000%, 50% a 5.000% e 100% a 5.000%.

Em uma concretização de preferência da invenção, a amostrabiológica é um tumor primário de pulmão ou uma metástase (regional ou dis- tante), a qual pode ser obtida, por exemplo, por biópsia pulmonar ou de ou-tros órgãos por meio de biópsia. Uma metástase pode também ser uma me-tástase distante, por exemplo, do fígado ou de linfonodo. Cabe observar queesta metástase distante pode conter também células do câncer de pulmão,uma vez que as metástases têm origem no pulmão. Em outra concretização preferida da invenção, o câncer de pul-

mão é de um tipo diferente de câncer de pulmão, como por exemplo, câncerde pâncreas. No entanto, outros cânceres com tumores sólidos são tambémpossíveis, como de ovário, colorretal, de cabeça e pescoço, carcinoma decélula renal, glioma e cânceres gastrintestinais, particularmente, câncer deestômago.

Em outra concretização de preferência da invenção, o inibidor doEGFR é um inibidor de tirosina quinase de EGFR, particularmente, inibidoresde moléculas pequenas de tirosina quinase de EGFR como por exemplo,Tarceva®. Portanto, em outras palavras, em uma concretização particular- mente preferida da invenção, o inibidor do EGFR é erlotinibe ou N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-(metoxietoxi)quinazolin-4-amina.

Em ainda outra concretização preferida da invenção, o agentequimioterápico é gemcitabina e/ou cisplatina.

Em ainda outra concretização da invenção, a superexpressão daproteína AKT fosforilada ou da proteína MAPK fosforilada é determinada uti-lizando um reagente que se liga especificamente à proteína fosforilada e, de preferência, que não se ligue especificamente ou de forma alguma à proteí-na não fosforilada. Preferencialmente, um anticorpo, ou um derivado de anti-corpo, ou um fragmento de anticorpo, que se ligue especificamente à proteí-na AKT fosforilada ou a proteína MAPK fosforilada e, de preferência, quenão se ligue especificamente ou de forma alguma à proteína AKT não fosfo- rilada ou a proteína MAPK não fosforilada.

Em ainda uma outra concretização preferida da invenção, a pro-teína AKT fosforilada é fosforilada em uma posição de aminoácido que cor-responda à posição 473 da proteína Akt1 ou a proteína MAPK é fosforiladaem posições de aminoácidos que correspondam às posições de aminoáci- dos 202 e 204 da MAPK1. Preferencialmente, a seqüência de aminoácidosda proteína MAPK é a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 ou 2, e aseqüência de aminoácidos da proteína AKT é a seqüência de aminoácidosSEQ ID NO: 6, 7 ou 8.

Há muitos tipos diferentes de imunoensaios que poderão ser utilizados no processo da invenção, por exemplo, imunoensaio enzimáticode absorção direta (ELISA), imunoensaio por absorção fluorescente (FIA),imunoensaio por absorção química direta (CLIA), radioimuno ensaio (RIA) eimunnoblotting. Portanto, em ainda uma outra concretização preferida dainvenção, o nível de expressão é determinado utilizando um processo sele- cionadó do grupo composto por análise proteômica, por citometria de fluxo,imunocitoquímica, imunohistoquímica e imunoensaio enzimático por absor-ção direta.

Em uma concretização preferida da invenção, a superexpressãode proteína AKT fosforilada e/ou de proteína MAPK fosforilada é determina- da por

a) coloração imunohistoquímica da amostra biológica.

b) atribuição de um grau, selecionado entre os números 1, 2, 3 e4, para o nível de expressão da proteína AKT fosforilada e/ou da proteínaMAPK fosforilada na inspeção visual da coloração das células na amostrabiológica, pela qual é atribuído o grau mais alto detectável para o nível deexpressão

c) a determinação do percentual de células com o grau mais alto

detectável na amostra biológica corada imunohistoquimicamente.

d) a multiplicação do grau atribuído ao percentual de células como grau mais alto detectável, na amostra biológica corada imunohistoquimi-camente, e o número 100, e

e) a determinação de superexpressão de proteína AKT fosforila-

da e/ou de proteína MAPK fosforilada na amostra biológica quando o resul-tado da multiplicação na etapa d) for acima de 100.

Em outra concretização da invenção, é provido um processo dedeterminação se pacientes com câncer de pulmão se beneficiam de uma combinação de um inibidor do receptor de fator de crescimento epidérmico eum agente quimioterápico, o processo compreendendo a determinação dasuperexpressão de uma proteína AKT fosforilada e/ou de uma proteínaMAPK fosforilada em uma amostra do paciente, pelo qual a superexpressãoda proteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada é indicativade que o paciente se beneficia de uma combinação de um inibidor do recep-tor de fator de crescimento epidérmico e de um agente quimioterápico. To-das as outras concretizações preferidas descritas acima, aplicam-se igual-mente a esta concretização. Preferencialmente, o processo de acordo com ainvenção, a superexpressão de proteína AKT fosforilada e/ou de proteína MAPK fosforilada, na amostra do paciente, é determinada por

a) a determinação do nível de expressão de proteína AKT fosfo-rilada e/ou de proteína MAPK fosforilada na amostra do paciente,

b) a determinação do nível de expressão de proteína AKT fosfo-rilada e/ou de proteína MAPK fosforilada em uma amostra de um paciente com câncer de pulmão que não se beneficia de uma combinação de um ini-bidor do receptor de fator de crescimento epidérmico e um agente quimiote-rápico,c) a determinação da diferença do nível de expressão de proteí-na AKT fosforilada e/ou de proteína MAPK fosforilada, determinado na etapa(a) e (b), e por esta, a determinação da superexpressão do nível de expres-são de proteína AKT fosforilada e/ou de proteína MAPK fosforilada. O termo "benefício" significa que o paciente não se beneficia de um tratamento comcombinação de um inibidor do receptor de fator de crescimento epidérmico eum agente quimioterápico ao contrário de um tratamento com um inibidor doreceptor de fator de crescimento epidérmico isolado.

Em uma outra concretização preferida da invenção, um anticor- po que se liga à proteína AKT fosforilada ou um anticorpo que se liga à pro-teína MAPK fosforilada é utilizado para determinar se uma amostra biológicacompreendendo células humanas de câncer de pulmão é sensível a umacombinação de um inibidor do receptor de fator de crescimento epidérmico eum agente quimioterápico. Em ainda outra concretização da invenção, é provido um pro-

cesso de seleção de uma combinação que iniba a progressão de câncer depulmão em um paciente, o processo compreendendo:

a) a exposição separada de alíquotas de uma amostra biológicacompreendendo células de câncer de pulmão sensíveis a uma combinação

de um inibidor do EGFR e de um agente quimioterápico do paciente, na pre-sença de uma diversidade de composições para testes;

b) a comparação do nível de expressão de uma proteína Akt fos-forilada e/ou de uma proteína MAPK fosforilada nas alíquotas da amostrabiológica posta em contato com as composições para teste e o nível de ex-

pressão da proteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada emuma alíquota da amostra biológica que não foi posta em contato com ascomposições para teste,

c) a seleção de uma das composições para teste que altere onível de expressão da proteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fos-

forilada na alíquota contendo aquela composição para teste, em relação àalíquota que não foi posta em contato com a composição para teste, em queuma diferença de pelo menos 10% entre o nível de expressão da proteínaAKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada na alíquota da amostrabiológica, posta em contato com a composição para teste, e o nível de ex-pressão da proteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada naalíquota da amostra biológica que não foi posta em contato com a composi- ção para teste é um indicativo para a seleção da composição para teste.

Preferencialmente, a diferença do nível de expressão da proteí-na AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada na etapa (c) é de pelomenos 25%. Mais preferencialmente, a diferença do nível de expressão daproteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada na etapa (c) é depelo menos 50%. Em outra concretização, a diferença do nível de expressãoda proteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada na etapa (c) éde pelo menos 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 300%, 400%, 500%ou 1.000%. A diferença do nível de expressão da proteína AKT fosforiladae/ou da proteína MAPK fosforilada na etapa (c) pode ser de até 10.000 ou50.000%. A diferença do nível de expressão da proteína AKT fosforiladae/ou da proteína MAPK fosforilada na etapa (c) é preferencialmente entre10% a 10.000%, mais preferencialmente, de 25% a 10.000%, 50% a10.000%, 100% a 10.000%, ainda mais preferencialmente de 25% a10.000%, 50% a 10.000% e 100% a 10.000% e até ainda mais preferencial- mente, 25% a 5.000%, 50% a 5.000% e 100% a 5.000%.

Em ainda outra concretização da invenção, é provido um pro-cesso para produção de um possível agente, o referido processo compreen-dendo:

a) o contato de uma alíquota de uma amostra biológica contendo células de câncer de pulmão, as quais são sensíveis a um inibidor do EGFRe a um agente quimioterápico com o possível agente,

(b) a determinação do nível de expressão de uma proteína Aktfosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada na alíquota da amostra bioló-gica posta em contato com o possível agente e a determinação do nível deexpressão da proteína Akt fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada emuma alíquota da amostra biológica que não foi posta em contato com o pos-sível agente,(c) a observação do efeito do possível agente pela comparaçãodo nível de expressão da proteína Akt fosforilada e/ou da proteína MAPKfosforilada na alíquota da amostra biológica posta em contato com o possívelagente e o nível de expressão da proteína Akt fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada na alíquota da amostra biológica que não foi posta emcontato com o possível agente,

(d) a produção do referido agente, a partir do referido efeito ob-servado, em que uma diferença de pelo menos 10% entre o nível de expres-são da proteína Akt fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada na alíquo-ta da amostra biológica posta em contato com o possível agente e o nível deexpressão da proteína Akt fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada naalíquota da amostra biológica que não foi posta em contato com o possívelagente é indicativo de um efeito do possível agente.

Preferencialmente, a diferença do nível de expressão da proteí- na AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada na etapa (d) é de pelomenos 25%. Mais preferencialmente, a diferença do nível de expressão daproteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada na etapa (d) é depelo menos 50%. Em outra concretização, a diferença do nível de expressãoda proteína AKT fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada na etapa (d) éde pelo menos 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 300%, 400%, 500%ou 1.000%. A diferença do nível de expressão da proteína AKT fosforiladae/ou da proteína MAPK fosforilada na etapa (d) pode ser de até 10.000 ou50.000%. A diferença do nível de expressão da proteína AKT fosforiladae/ou da proteína MAPK fosforilada na etapa (d) é preferencialmente entre10% a 10.000%, mais preferencialmente, de 25% a 10.000%, 50% a10.000%, 100% a 10.000%, ainda mais preferencialmente de 25% a10.000%, 50% a 10.000% e 100% a 10.000% e até ainda mais preferencial-mente, 25% a 5.000%, 50% a 5.000% e 100% a 5.000%.

Em uma concretização preferida, o referido possível agente é um possível agente inibidor ou possível agente promotor.

Em outra concretização da invenção, é provido um possível a-gente produzido pelo processo de acordo com a invenção.Em ainda outra concretização, é provido um preparado farma-cêutico compreendendo um agente de acordo com a invenção.

Em ainda uma outra concretização, um agente de acordo com ainvenção é utilizado para o preparo de uma composição para a inibição de progressão de câncer de pulmão.

Em outra ainda concretização da invenção, é provido um pro-cesso de produção de um fármaco compreendendo as etapas do processoda invenção e

(i) a síntese do possível agente identificado na etapa (c), ou de um análogo ou derivado do mesmo, em uma quantidade suficiente para for-necer o referido fármaco em uma quantidade terapeuticamente efetiva paraum sujeito; e/ou

(ii) a combinação do possível fármaco com o possível agenteidentificado na etapa (c), ou um análogo ou derivado do mesmo, com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em ainda outra concretização, uma proteína Akt, uma proteínaMAPK, uma proteína Akt fosforilada, uma proteína MAPK fosforilada, umanticorpo que se ligue seletivamente a uma proteína Akt fosforilada ou auma proteína MAPK fosforilada é utilizado para a produção de um possível agente ou para a seleção de uma composição que iniba a progressão decâncer de pulmão em um paciente.

Em outra concretização da invenção, é contemplado um kitcompreendendo um anticorpo contra proteína MAPK fosforilada e/ou Aktfosforilada. Estes kits, conhecidos na técnica, compreendem ainda acessó- rios de plástico que podem ser utilizados durante o procedimento de amplifi-cação como, por exemplo, placas de microtitulaçao no formato com 96 ou384 poços ou, apenas, tubos comuns de reação fabricados, por exemplo,por Eppendorf, Hamburgo, Alemanha, e todos os outros reagentes para exe-cução do processo de acordo com a invenção, preferencialmente, um imu- noensaio, por exemplo, imunoensaio enzimático de absorção direta (ELISA),imunoensaio por absorção fluorescente (FIA), imunoensaio por absorçãoquímica direta (CLIA), radioimuno ensaio (RIA) e imunnoblotting. Para umarevisão dos diferentes imunoensaios que podem ser utilizados, consultar:Lottspeich e Zorbas (eds.), Bioanalytik, 1st edition, Spektrum AkademischerVerlag, Heildelberg, Berlin, Alemanha.

Os exemplos, referências, listagem de seqüência e figuras sãofornecidos para auxiliar o entendimento da presente invenção, o verdadeiroda qual descrito nas reivindicações anexadas. Entende-se que modificaçõespodem ser efetuadas nos procedimentos descritos, sem se afastar do espíri-to da invenção.Descrição das FigurasFiguras 1 - Curvas de Kaplan-Meier para análise de tempo para

óbito (OS) entre todos os pacientes designados aleatoriamente para o trata-mento com Elotinibe/Gemcitabina/Cisplatina (A) ou Placebo/Gemcitabina/Cisplatina (os círculos indicam tempos de observação censurados, quando aobservação foi finalizada antes de o evento ter ocorrido). Figura 2 - Curvas de Kaplan-Meier para análise de tempo para

óbito (OS) entre todos os pacientes com dados de biomarcador, designadosaleatoriamente para tratamento com Elotinibe/Gemcitabina/Cisplatina (A) ouPlacebo/Gemcitabina/Cisplatina (os círculos indicam tempos de observaçãocensurados, quando a observação foi finalizada antes de o evento ter ocorri-do)

Figura 3 - Curvas de Kaplan-Meier para análise de tempo paraprogressão/óbito (PFS) entre todos os pacientes designados aleatoriamentepara tratamento com Elotinibe/Gemcitabina/Cisplatina (A) ou Placebo/ Gem-citabina/Cisplatina (os círculos indicam tempos de observação censurados, quando a observação foi finalizada antes de o evento ter ocorrido).

Figura 4 - Curvas de Kaplan-Meier para análise de tempo paraprogressão/óbito (PFS) entre todos os pacientes com dados de biomarcado-res, designados aleatoriamente para tratamento com Elotinibe/Gemcitabina/Cisplatina (A) ou Placebo/Gemcitabina/Cisplatina (os círculos indicam tem- pos de observação censurados, quando a observação foi finalizada antes deo evento ter ocorrido).

Figura 5 - Curvas de Kaplan-Meier para análise de tempo paraóbito (OS) entre todos os pacientes de biomarcadores tratados com Place-bo/Gemcitabina/Cisplatina, comparando pacientes com Escore-H de pMARK> 100 (H) com pacientes com Escore-H de pMARK < 100 (os círculos indi-cam tempos de observação censurados, quando a observação foi finalizada antes de o evento ter ocorrido)

Figura 6 - Curvas de Kaplan-Meier para análise de tempo paraóbito (OS) entre pacientes de biomarcadores com Escore-H de pMARK <100, comparando o tratamento com Elotinibe/Gemcitabina/Cisplatina (A)com Placebo/Gemcitabina/Cisplatina (os círculos indicam tempos de obser- vação censurados, quando a observação foi finalizada antes de o evento terocorrido).

Figura 7 - Curvas de Kaplan-Meier para análise de tempo para. óbito (OS) entre todos os pacientes de biomarcadores com Escore-H depMARK < 100 e Escore-H de pMARK > 100, comparando tratamento com Erlotinibe/Gemcitabina/Cisplatina (LA, HA) com Placebo/Gemcitabina/ Cis-platina (H), respectivamente (os círculos indicam tempos de observaçãocensurados, quando a observação foi finalizada antes de o evento ter ocorri-do).

Figura 8 - Curvas de Kaplan-Meier para análise de tempo para progressão/óbito (PFS) entre todos os pacientes de biomarcadores com Es-core-H de pMARK < 100 e Escore-H de pMARK > 100, comparando trata-mento com Erlotinibe/Gemcitabina/Cisplatina (LA, HA) com Placebo/ Gemci-tabina/Cisplatina (H), respectivamente (os círculos indicam tempos de ob-servação censurados, quando a observação foi finalizada antes de o evento ter ocorrido).

Figura 9 - Curvas de Kaplan-Meier para análise de tempo paraóbito (OS) entre todos os pacientes de biomarcadores, tratados com Place-bo/Gemcitabina/Cisplatina, comparando Escore-H de pAKT1 < 300 (L) e Es-core-H de Paktl > 300 (H) (os círculos indicam tempos de observação cen- surados, quando a observação foi finalizada antes de o evento ter ocorrido).

Figura 10 - Curvas de Kaplan-Meier para análise de tempo paraóbito (OS) entre todos os pacientes de biomarcadores, tratados com Erlotini-be/Gemcitabina/Cisplatina, comparando Escore-H de pAKT1 < 300 (L) e Es-core-H de Paktl > 300 (H) (os círculos indicam tempos de observação cen-surados, quando a observação foi finalizada antes de o evento ter ocorrido).

Figura 11 - Curvas de Kapían-Meier para análise de tempo para óbito (OS) entre todos os pacientes de biomarcadores com Escore-H depAKT1 < 300 e Escore-H de Paktl > 300 (H), comparando tratamento comErlotinibe/Gemcitabina/Cisplatina (LA, HA) com Placebo/Gemcitabina/ Cis-platina (H), respectivamente (os círculos indicam tempos de observaçãocensurados, quando a observação foi finalizada antes de o evento ter ocorri- do).

Exemplo 1

Análise de biomarcador em amostras de tecido do tumor

O objetivo das análises investigativas de biomarcador tumoral,para o estudoxlínico, foi o de identificar aqueles marcadores, ou combina-ções de marcadores, que predizem desfecho clínico, de melhor para positivoou negativo, do tratamento com Tarceva®. Uma vez que os resultados doestudo não permitiram que fossem geradas hipóteses sobre como selecionarpopulações de pacientes que se beneficiam mais do tratamento com Tarce-va®, foi dada ênfase especial à identificação de marcadores que descrimi-

nam pacientes (subgrupos) que se beneficiam especificamente da combina-ção com Tarceva® em relação ao braço de controle de quimioterapia isola-da.

O propósito deste estudo foi analisar biomarcadores específicosdo tumor, relacionados com a via de sinalização do EGFR, por exemplo, EGFR, HER2, pAKT e pMAPK.

Os dados de biomarcadores foram correlacionados com os da-dos clínicos (análise global e da terapia específica).Material e métodos:

Amostras clínicas: As análises de biomarcadores foram realizadas em um subcon-

junto de amostras de 141 pacientes, para as quais cortes de tecido foramembebidos em parafina, e fixados por formalina (FFPE), assim que o diag-nóstico inicial foi recebido.

Anticorpos para testes de IHC (imunohistoquímica):

<table>table see original document page 28</column></row><table>

Protocolo para pMARK da ICH:

1. Cortar seções com 3-4 cm de espessura dos cortes em Ar- ranjos de Parafina.

2. Colocar as seções em lâminas de vidro e deixar secar duran-te a noite.

3. Retirar a parafina das lâminas com xileno, seguido por sériedecrescente de etanol:- xileno durante a noite

- xileno por 2 x 10 minutos

- Etanol abs. 2 x10 minutos

- Etanol a 96% 2x10 minutos

- Etanol a 80% 1x5 minutos - Etanol a 70% 2x5 minutos

- Tampão PBS 10 minutos (trocar o tampão uma ou duas ve-zes)

4. Extração de antígeno/pré-tratamento da amostra

Colocar em panela de pressão por 5 minutos a 120°C em 1 x tampão citrato pH 6 (Biocyc GmbH, número de ordem 400300692). Lavar emtampão TBS/PBS (1:10) por 5 minutos.

5. Bloqueio com peroxidase

- As lâminas são incubadas em H202a 3% por 10 minutos.

- Lavar 2x5 minutos em tampão TBS/BPS.6. Incubação de anticorpos

- Colocar as lâminas em soro normal (1,5%), diluído em Tam-pão Tris ou em outra solução de bloqueio.

- Colocar o anticorpo primário (Anti-fosfo-ERK1+2 de coelho da Zymed, ne de cat. 36-8800), diluído em 1:150 nas lâminas e incubar a mes-ma em câmara úmida a 30°C por 2 horas.

- Lavar 2x5 minutos em tampão TBS/PBS.

- Colocar o Polímero Envision HRP (Dako) nas lâminas e incu-bar em câmara úmida a 30°C por 30 minutos.- Lavar 2x5 minutos em tampão TBS/PBS.

7. Detecção:

- Lavar as lâminas com tampão Tris a 0,05 M pH 7,6 por 20 mi-nutos

- Cobrir as lâminas por 5 minutos com Cromógeno DAB (DAB líquido da Dako, código nQ K3467) e incubar por 5-10 minutos.

- Lavar as lâminas com água desmineralizada por 5 minutos pa-ra interromper a reação de coloração.

- Fazer a contracoloração com hematoxilina (Harris HámatoxylinHTX 31000, Medite GmbH)

- Lavar com água

- Diferenciar com HCL-Etanol-"azul" por 5 minutos em água

- Série crescente de etanol

- xileno

- cobrir

Protocolo de IHC para pAKT:

Protocolo conforme para pMARK, exceto

- Comparar 4.: Pré-tratamento da amostra em tampão citrato pH6 (Dako, código n9 S2367)

- Comparar 6.: Anticorpo primário (abcam AKT fosfo S473), dilu-

ído em 1:450 (comparar 6.).Relatório de dados de IHC:

Um patologista avaliou todas as colorações imunológicas. A in-tensidade da coloração nuclear (pAKT, pMAPK) foi estimada por inspeçãovisual em uma escala de quatro etapas (0, 1, 2, 3). Além da intensidade da coloração nuclear, foram registrados o percentual de células positivas e omotivo para falha da análise (isto é, ausência de células tumorais na manchade tecido ou ausência de mancha de tecido na lâmina do TMA).Análises estatísticas investigativas:

As análises estatísticas dos dados de biomarcadores objetivaram a investigação do potencial para predizer benefício clínico e/ou toxicidades,para cada biomarcador separadamente e/ou por combinações adequadas.

De acordo com a experiência, muitos biomarcadores exibiramuma distribuição estatística distorcida entre pacientes e no paciente. Fre-qüentemente, há também algum fundamento bioquímico para essa distor- ção, no sentido que o processo de variação possui uma estrutura multiplica-tiva. Distribuições distorcidas apresentam problemas quando abordagensestatísticas lineares (por exemplo, regressão) deverão ser utilizadas. Quan-do utilizada como covariantes, em modelos estatísticos, a distorção podetambém obscurecer os resultados. Por conseguinte, transformações ade- quadas precisam ser encontradas que transformem estas determinações emdistribuições com um formato aproximado de Gaussian. Escolhas típicas naárea de biomarcadores são transformações do tipo log(x+c). Estas transfor-mações não alteram a ordem dos valores, de forma que análises não para-métricas baseadas em classificações ou limites de corte permanecem inalte- radas pela transformação. Estas transformações são também um pré-requisito quando abordagens lineares multivariadas como, por exemplo,Análise e Análise dos Componentes Principais devem ser utilizadas.

A estatística básica e interdependências dos diferentes marca-dores foram descritivamente investigadas. As análises metodológicas com- parando diferentes abordagens para medições, por exemplo, de IHÇ, foramrealizadas em relação à confiabilidade e validade. O benefício em relação aTarceva® é definido pelos endpoints clínicos de tempo de sobrevida (ouTempo para Óbito ,TPO), Tempo de PFS (Tempo para progressão, TPP/O),resposta objetiva, melhor resposta (RC/RP, SD, PD).

Os valores p emergentes destas análises não deverão ser inter-pretados em um sentido de confirmação; eles deverão ser considerados co-mo uma ferramenta descritiva especial visando orientar a investigação emdireção a uma regra eficiente de predição de candidato (por exemplo, buscapor limites de corte) dos endpoints clínicos. Técnicas adicionais com multiva-riantes (por exemplo, Análise Linear Discriminante, Regressão Logística Múl-tipla, Análise de Componente Principal com Rotação, Análise de Agrupa-

mentos, metodologia CART) foram empregadas para combinações de bio-marcadores do estudo. As correlações de biomarcador e resposta com cova-riantes clínicas foram investigadas. Os grupos de candidatos, derivados debiomarcadores, foram averiguados com variáveis de tempo para evento (cur-vas de Kaplan-Meier, modelo de risco proporciona! de Cox, teste de logrank),

Resultados:

Análise do subconjunto de amostra de TMA em comparação àpopulação global do estudo

O subconjunto de pacientes com amostras para análise dè bio-marcadores foi comparado à população global do estudo, em relação às ca- racterísticas basais dos pacientes e parâmetros de desfecho clínico. O su-mário é apresentado na tabela abaixo.

<table>table see original document page 31</column></row><table><table>table see original document page 32</column></row><table> Achados:

O subconjunto de pacientes, com dados de biomarcadores, nãoé representativo para a população do estudo B016411. Há diferenças emrazões de risco para TPO e TPP entre a população principal e o subgrupo dè biomarcadores. Os pacientes tratados com Tarceva® do subgrupo de bio-marcadores apresentam um pior prognóstico em comparação com a popula-ção clínica principal. Diversas covariantes basais indicam que o subgrupo debiomarcadores -e, dentro deste subgrupo, particularmente, pacientes trata-dos com Tarceva®, representou uma mistura de caso mais mórbida compa- rada ao da população do estudo principal. Gráficos de KM (Figuras 1 a 4)também devem ser levados em conta.Resultados da análise IHC de pMAPK:

• Os dados IHC de pMAPK exibiram distribuição irregular suficiente pa-ra se qualificarem para análise estatística posterior.

Em relação da determinação da correlação entre expressão de

pMAPK e desfecho clínico, os valores de limites de corte foram esta-belecidos por análise estatística descritiva: O escore-H de Franklinfoi determinado pela combinação de intensidade de coloração e per-centual de células tumorais coradas (pMAPKJisco = (pMAPK_Nuclear_Coloração + 1) * pMAPK_Nuclear_Pos_Células; in-

tervalo: 0-400). Coloração pAKT "positiva" foi definida por escores-Hde =/> 300, as outras colorações foram "negativas".

• Gráficos de Kaplan-Meier são apresentados nas Figuras 5 a 8.Escore-H de pMAPK (Corte 100) — Modelo de Cox sem covariantes <table>table see original document page 33</column></row><table>Achados:

• Para pacientes tratados com quimioterapia/placebo, a expressão depMAPK "positiva" é associada com prognóstico pior (TPO: RR 4,882,p = 0,0001), enquanto que expressão pMAPK "negativa" parece serassociada com sobrevida mais longa.

• Tendência: pacientes "pMARK positivo" poderiam se beneficiar dacombinação quimioterapia/Terceva® (RR 0,500, p: 0,0516) (----)

Resultados da análise IHC de pAKT:

• os dados IHC de pAKT exibiram distribuição irregular suficiente parase qualificarem para análise estatística posterior.

Em relação da determinação da correlação entre expressão de pAKTe desfecho clínico, os valores de limites de corte foram estabelecidospor análise estatística descritiva: O escore-H de Franklin foi determi-nado pela combinação de intensidade de coloração e percentual décélulas tumorais coradas (pAKT_hsco = (pAKT_Nuclear_Coloração +1) * pAKT_Nuclear_Pos_Células; intervalo: 0-400). Coloração pMARK"positiva" foi definida por escores-H de =/> 300, as outras coloraçõesforam "negativas".

• Gráficos de Kaplan-Meier são apresentados nas Figuras 9 a 11.Escore-H de pAKT (Corte 300) — Modelo de Cox sem covariantes<table>table see original document page 35</column></row><table>Achados:

• Para pacientes tratados com quimioterapia/placebo, a expressão depAKT "positiva" é associada com prognóstico pior (TPO: RR 2,258, p=0,0573), enquanto que expressão pAKT "negativa" parece ser associ-ada com sobrevida mais longa.

• Uma diferença semelhante não foi encontrada para pacientes tratadoscom combinação quimioterapia/Terceva®.Listagem de Seqüência

<11Q> Hoffmann-La. Roçhê ÁG

<12Q> DETERMINAÇÃO DE RESPONSIVOS À QUIMIOTERAPIA

<130> 2312B

<150> ££05010244*1

<151> 2005-05-11

<15Q> £FÜ5011Q?0.9

<151> 2005-05-23

<I60> 8

<n0> Patentm vsrslon 3.2

<210> 1

<211> 360

<212> PRT

<213> Homo sãpíens

<400> 1

Mst Ala- Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Glu Me-t Vai Arg Gly1 5 10* 15 '

Gln vai Phe Asp Vai Gly Pro Arg Tyr Thx Asn Leu Ser Tyr lie Gly20 25 30

Glu Gly Ala Tyr Gly Met Vai Cys Ser Alã Tyr Asp Asa Vai Aên Lys35 40 AS

Vai Arg Vai Ala lie Lys Lys lie Ser Pro Phe Glu His Gln Tk Tyr50 55 60

Cys Gln Arg fhr Leu Arg Glu lie Lys lie Leu Leu Arg Phe Arg Hi$S5 70 75 80

Glu Asn lie lie Gly lie Asn Asp lie lie Arg Ala Pro Thr lie Glw85 90 95

Gln Met Lys Asp Vai Tyr lie Vai Gln Asp Leu M&t Gla Thr Asp Lbu100 105 110

"Tyr Lys Leu Leu Lvs Thr Gln His Leu Ser Açn Asp His Ilè Cys fyx115 ~ 120 125

Phe Leu Tyr Gln lie Leu Arg Gly Leu Lys Tyr lie HLã Ser Ala >.sn130 135 " MOVai Leu His Aig Asp Leu hys PtO Sêr ,A*n Lea Le« fceu Asa Thr Thr145 150 155 160

Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Vai Ala Asp Pro165 170 175

Asp His Asp His Thr Gly Phe Leu Tbr Glu Tyr Vai Ais Thr Arg Ttp180 185 190

Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Ser Lys Gly Tyr Tbr Lys Ser195 200 205

Ile Asp Ile Trp Ser Vai Gly Cys Ile Leu Ala Glu Met Leu. Ser Asn210 215 220

Arg Pro Ile Phe Pro Gly Lvs His Tyr Leu Asp Gln Leu Asn His Ile225 230 235 2<J0

Leu Gly Ile Leu Gly Ser Pxo Sex Gln Glu Asp Leu Asn Cys Ile IleZÚ 250 255

Asn Leu lys Ala Arg Asn Tyr Leu Leu Sex Leu Pro His Lys Asn Lys260 265 270

Vai Pxo Trp Asn Arg Leu Phe Pxo Asn Ala Asp Sex l>ys Al* l,eu Aso275 280 285

Leu Leu Asp Lys Met Leu Thr Phe Asn Pxo His Ly$ Arg Ile Glu Vai290 295 300

Glu Gln. Ala Leu Ala His. Pro Tyr Leu Glu Gln Tyr Tyr Asp.Pro Ser305 310 315 320

Asp Glu Pro Ile Ala Glu Ala Pxo Phe Lys Phe Asp Met Glu Leu Asp325 330 335

Asp Leu Pro Lys Glu Lys Leu Lys Glu Leu Ile Phe Glu Glu Thr Ala340 345 350

Arg phe Gln pro Gly fyr Arg Se355 360

<210> 2<211> 37»<212> PRT<213> Homo $*pien$

<40Q> 2

Mèfc Ma Ala Ala Ala Ala Gln Gly Gly Gly Gly Gly Glu Pro Arg Arg1 5 10 1S

Thr Glu Gly Vai Gly Pro Gly vai Pro Gly Glu Vai Gly mt vai Lys20 25 30

Gly Gln Pro Fhe Asp Vai Gly Pro Arg Tyr Thr Gln Leu Gln Tyr 11$35 40 45

Gly Cia Gly Ala Tyr Gly Met Vai Ser Ser Ala Tyr Asp His Vai Arg50 55 60

Lys Thr Arg Vai Ala lie Lys Lys lie Ser Pro Phe Glu His Gln Thr

65 1® . 75 ■ 60

Tyr Cys Gln Arq Thr Leu Arg Glu He Gln Ile Leu Leu hxq Fhe Arg

— -— es — — : 90 -95-

His Glu Asn Vai Ile Gly Ile Arg Asp Ile Leu Arg Ais Ser Thr Leu100 105 UD

Glu Ala Met Arg Asp Vai Tyr He Vai Gln Asp Leu Met Glu Thr Asp115 120 125

Leu Tyr Lys; Leu Leu Lys Ser Gln Gln Leu Ser A$ft Aâp His He Cys130 135 1*0 '

Tyr £b.e Leu Tyr Gln. Ile Leu Arç Gly Leu Lys Tyr lie. His Ser Ala145- 150 L5S 160

Asn Vai Leu His Arç Asp Leu Lys ?ra Ser Asn Leu Leu Ile P*Sn Tht165 170 . 115

Thr Cys Asp Leu Lys lie Cys Asp Phe Gly Leu Ale-, Arg Ile Ala Asp

1B0 135 190

Pro GXü His Asp Bis thr Gly Phe Le« Thr Glu Tyr Vai Ala Thr Arg195 2G0 205

Trp Tyr Arg Ais Pro Glu Ile Met Leu Asn. Ser Lys Gly Tyr Thr Lys210 215 220

Ser He Asp He Trp Ser Vai Gly Cys He Leu Ala Glu Met Leu Ser225 230 235 240

Asn Arg Pro He Phe Pro Giy Lys His Tyr Leu Asp Gln Leu Asn Kis245 250 255

He Leu Gly lie Leu Gly Ser Pro Ser Gln Glo Asp Leu Asn Cys He2 60 265 210

He h-m Met Lys Ala Arg Asn Tyr Leu Gln Ser Leu Pro Ser Lys thr275 2B0 28S

Lys Vai Ala Trp Ala Lya Leu Phe Pro Lys ser Asp Ser Lys Ala Leu290 295 300

Asp leu leu Asp Arg Met Leu Thr Phe Asn Pro Asn Lys Arg He Thr305 310 315 320

Vai Glu Glu Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Glu Gln Tyr Tyr Asp Pro325 330 335

Thr Asp Glu Pro Vai Ala Glu Glu Pro Phe Thr Phe Ala Met Glu Leu340 345 350

Asp Asp Leu Pro Lys Glu Arg Leu Lys Glu Leu He Phe Gln Glu Thr355 360 365

Ala Arg Phe Gln Pro Gly Vai Leu Glu Ale Pro370 3?5

<210> 3

<211> 2334

<212> om.

<213> Komo sapiens

<400> 3

gcccctccct ccgccegccc gccggeçcge. ccgteagtct ggcaggcãgg caçgeaatcg 60

i

gtccçagtgg ctgteggcte ttcagctcic ccgctcggcg tcttccttcc. tcoteccggt 120

csocgtcgçc ggctgcacog gcggcggcgc agtccctgcg ggaggggcçõ caagaçctga 180

gçggcggccg ccgaçcgtcg âgctcágcgc ggcggaggcg gcggcggccc ççcaçccaac• ■ 240

atggeggçgg cggcçgcggc ggçcgcgggç çcggagatgg tccgcçggca gçtçfctcgac 300gtggggccgc gctacaccaa cctGtcgtac âtcggcgagg gçgcctacgg catggtgtgc 360

tctgcttatg ataatgtcaa caaagttcga gtagctatca açaaaatcag cccctttgag 420

caccagacct actgccagag aaccctgagg gagataaaaa tcttactgcg cttcagacat 4B0

gag&acatca ttggaatcaa tgacattat& cgagcaccae ccatcgagca aatgaaagat 540

gtatatatag tacaggacct catggaaecc. gatctttaca agctcttgaa gacacaacac eoo

ctcagcaatg ôccatátctg ctâttttctc taccagatcc tcagagggtt aaaatatatc 660

çattcagcta acgttctgca ccgtgacete aagccttcca acctgctgct caacaccacc 720

tçtgatctca agatctgtga ctttggectg gcccgtgttg cagatccaga ccatgatcac 780

acagggttce tgaeagaata tgtggccaca cgttggtaça gçgctccaga aattatgttg 840

aattccaagg gctacaccaa gtccattgat atttggtctg taggctgcat tctggcagaa 900

■atgctticta ãcaggcccat ctttccaggg âagçattate ttgaccagct gaaacâCâtt 960

ttgggtattc ttggatcccc atcacaagaa gacctgaatt gta.taataaa tttaaaagct 1020

aggaactatt igctttetct aataâçgtgc eatggaacag gcf.gttccca 1080

aatgctgact ccáaaçctct çgacttâttg gacaaaatgt tgâCãttcaa cccacacaâg_. 1140

aggattgaag tagaacaggç tctggcccac ccatatctgg agcagtatta cgacccgagt 1200

gacgagccca tcgccgaagc ac.Cãttcaag ttcgacatgg àãttggâtgâ. cttgcctaag 1260

gaaaagctca aagaactaat ttttgaagag actgctagat tccagccagg atacagatct 1320

taaatttgtc aggaçàacdg ctcagaggac tggâcgtgct ■cãgacatcgg tgttctt-ctt 1380

Gccagttctt gacccctggt cctgtctcca gcccgtcttç gcttatccac tttgactcct 1440

ttgagcegtt tggaggggcg gtttctggta gttg^ggctt ttatgcttte aaagaatttc 1500

ttcagtccag agaattcctc ctggcagccc tgtgtgtgtc acccattggt gacctgcgce 1560

agtátgtact tôâgtgCêeç ttaetgctta cfcgttgetEt .sgteaetaat tgctttctgg 1620

tttgaaagat gcagtggttc ctccctctcc tgaatccxtt tctacatgat gccctçctçc 1680

ecatgcagcc gcaccagaga gagattcttc cccaattggc tctagtcact ggcatetcac 1740

tttatçatag ggaagçetac tacctagggc actttaagtc agtgacagcc cettatttçc 1800

ãcttcacctt ttgaccatõa ctctttcccc agagcaggag cttgtggaaa tacçttggct 1860

gatgttgeag ec"ü:cagcaa gtgcttGcgt etccggaatc cttggggagc acttçtccac 1920

gtcttttctc atatca.tggfc agtcac.taaç atatata&çg tatgtgctat tggcccagct 1980

tttagaaaat gcagtcattt ttètaaataa aaaqgaagta Ctgcãcc£âç Câgtçtcâ.et 2040

ctgtagttãc tgtggfccact tgtaccatat agaggtçtaa câcttgteaé gaagcgttat 2100gtgcagtact taatgtttgt aaçacttaca aaaaaagatt taaagtggca gcttcactcg 2160

acatttggtg agagaagtac aaaggttgca gtgctgagct gtgggcggtt tctggggatg 2220

teccagggtg gaactccaca tgctgçtgca tatacgcect tgagctactt caaatgtggt 2280

ttatacctcg cagatacaag eatctttatg aatatacãat tctttttcct tetacagett 2340

agctecgtct tttcaaccac gascattta.a aacccçaect actagcaetg ttctgtcctc 2400

aagtactcaa atatttctga tactgctgag tcagactgtc agaáaaagct agcactaact 2460

cgtgtttgga gctctatcca tõttttactç atctctctaa gtatttgttc ctgccactgt 2520

gtactgtgga gttgactcgg tgttctgtcc caetgcgçtg ectcctcttg acttccccac 2580

tgctctctgt ggtgagaaat ttgccttgtt caataattac tgtaccctcg catgáctgtt 2640

acagCtttet gtgcôgagat gactgtccaa gtgccacatg cctaegattg aaatgaaaac 2700

tctattgtta cctctgagtt gtgttccacg gaaaatgcta tccagcagat catttaggaa 2760

aaataattct atttttagct tttcatttct. cagctçtcct tttttcttgt ttgatttttg 2820

aeagcaatgg agaatgggtt atataaagac tgcctgctaa tatgaacaga aatgcatttg 2880

taattcatga aaataaatgt acatcttcta aaâââãââââ âaaa 2934

<21Õ> 4 <2ll> 1514 <212> DNA <2I3> Homo sepiens

<400> 4 gcccctccct ccgcccgccc gccggcccgc ccgtcagtct ggcaggcagg caggcaatcg 60

gtccgagtgg ctgtcggctc ttcagctctc ccgctcggcç tcttcettcc tectcecgsgt 120

cagcgtcggc ggctgcaccg gcggcggcgc agtccctgcg ggaggggcga caa.gagctga 180

gcggcggccg ccgagcgtcg agctcagcgc ggcggagçcg gcçgçggçcc gçcageçaaç 24 0

atggcggcgg eggcggcgge gggcgcggqc ccggagatgg tccgcgggca ggtgttcgac 300

gtggggccgc gctacaccaa cctctcgtac atcggcgagg çcgcctacgg catggtgtçc 360

tctocfctatg ataatgtcaa caaagttcga gtagctâtcs açâaaatcag cçççtttgag 420

caceagaeçt açtgçeagag aaccctgagg gagataaaaa tcctaccgco cttcagacat 480

gagaacatca ttggaatcaa tgacattatt cgaçcaccae ccstcgagca aaigaaagat 5-40

gtatatataç tacaggacct catggaaaca gatctttaca açctcttçaa gacacaacac 600

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taaatttgtc aggtacctgg agtttaatac agtgagctct ageaagogag gegctgeett 1380

ttgtttctag aatattatgt tcctcaaggt ccattatttt gtattctttt ccaagctcct 144 0

tattggaagg tattttttta aatttagaat taaaaattat ttagaaaaaa aaaaaaaaaa 1500

aaaaaaaaaa aaaa 1514

<210> S <2ll> 1866. <2i2> DNA <213> Honro sapiens

<400> 5 egttcctcgg cgccgceggg gccccagagg gcagcggcag caacagcagc ageageagea so

gegggagtgg agátggóggc ggcggcggct eãggggggcg geeeGgtaga 120

aeçgaggggg tçggcççggg ggtcccgggg gaggtggaga tggtgaaggg gcagccgttc 180

gacgtgggcc cgcgctacac gcagttgca.g tacatcggcg agggcgcgta cggcatggtc 240

agctcggcct atgacc-aegt gcgcaagact cgcgtggcca tcaagaagat cagccccttc 300

gaacatcaga cctactgcca gcgcacgctc cgggagatcc agatcctgct gcgcttccgc 360

catgagaatg tcatcggcèt cegagacatt ctgcgggcgt çcaoectgga agcçatgaga 420

gatgtçtáca ttqtgcaçga ectgatggag actgacctgt acaaçttçct gaaaagccag «80

cagctgagca atgaceatat ctgctacttc ctctaccaga tcctgcgggg cctcaa.gtac . 54 0

atccsciceg ccaacgtgct ccaccgagat ctaaagcccfi: ccaacctgct eagçaacacc 600

acçtgcgêcc ttãaçatç.tg tgatttcgge ctggcccgga rtgccgatcc ^gagcatgac 660eaçacçggct tcctgacgga gtatgtggct acgcgctggt accgggcccc agagatcatg 720

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cccaagtcag actccaaaçc ccttgacctg ceggaccgge tgttaácctt taeccccaat 1020

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gaggccccct agcccagaca gacatctctg caccctgggg cctggacctg cctcctgcct 1260

gcccctctcc cgccagactg ttegaasatg gacaetgtge ecagcccgga eettggeage 1320

ccaggccggg gtggagcatg ggcctggcca cctctctcct ttgctgaggc ctccagcttc 1380

aggcaggcca aggccttctc ctecccaccç gcect.cceea. cggggcctcç ggagetcaçg 1440

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agtctctggc agttctggaa tggaagggtt ctggetgecc caacctgctg aagggcagag 1560

gtggagggtg gggggcgctg agtagggact cagggccatg cctgccccco tcatctcátt 1620

caaaccccac cctagtttcc ctgaaggaac attcettagt ctcaagggct agçatccctg 16B0

aggagccagg ccgggccgaa teccctccct gtcaaagctg tcacttcgcg tgccctcgct 1740

gcttctgtgt gtggtgagca gaagtggagc tggggggcgt ggagagcccg gcgcccctgc 1600

cacctccctg acccgtctaa tatataaata tagagatgtg tctatggctg aaaaéaaaaa 1660

aaaae? 1666

<2io> e

<211> 480<212> PRT<213> Horao sapiens

<400> 6

Met Ser Aso Vai Ala lie Vai Lys GIu Gly frp Leu Eis Lys Arg Gly

Glu Tyr lie Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys hsn Asp

29 25 30Gly Thr Fbe lis Gly Tyr Lys Glu Aro Pro Gln Asp Vai Asp Gln Arg35 40 $5

Glu Ala £ro L©ü Asn A&n Phe Ser Vai Ala Gln Cys Gln Leu Hei Lys.50 55 60

Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asa Thr Phe He lie Arg Cys Leu Gln Trp65 70 75 80

Thr Thr Vai Ile Glu Arg Thr Phe His Vel Glu. Thr Pro Glu Glu Arg85 90 35

Glu Glu Trp Thr Thr Ala lia Gln Thr Vai Ala Asp Gly Leu Lys Lys100 105 110

Gln Glu Glu Glu Glu Met Asp Phe Arg Ser Gly Ser Pro Ser Asp Asii115 120 125

Ser Gly Ais Glu Glu Ntet Glu Vai Ser Leu Ala Lys Pro Lys His Arg

130 135 140 • .

Vai Thr Ket Asn Glu Fhe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Tftr145 150 155 160

Phe Gly Lys Vai Ile Leu Vai Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr155 HO 175

Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Glu Vai Ile Vai Ala Lys A$p Glu Vai180 185 150

Ala His Thr Leu Thr Glu Asm Arg Vai Leu Gln hzn Ser Arg Ris Pro' 2SS 200 205

Fhe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr. Ser Phe. Gln Thr His Asp Arg Lei* Cys

210 215 220

Ph€P Vaa «et Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser225 * 2 30 235 24 0

Arg Glu Arg Vai Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu24 5 250 255

Ile Vai Ser Ala Leu Asp' Tyr Leu His Séx Glu Lys Asn Vai Vai Tyr260 265 2')0Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His He275 280 285

Lys He Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Oe Lys Asp Gly AlaZBO 295 300

Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Vai305 310 315 ■ 320

Leu Glu Asp Asn Asp l*yr Gly Arg Ala Vai Asp Trp Trp Gly Leu Gly325 " 330 335

Vai Vai Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln340 345 350

Asp His Glu Lys leu Phe Glu Leu lie Leu Met Êlu Glu He Arg Phe355 360 365

Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu. Leu37C 375 360

Lys Lys Asp ?ro Lys Gln Atg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp Ala Lys365 390 395 400

Glu He Met Gln His Arg Phe Phe Ala Gly lie Vai Trp Gln His Vai.

405 410 415

Tyr Glu lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gln Vai Thr Ser Glu«20 425 430

Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ale Gln Met He Thr435 440 445

He Thr Pro Pro Asp Gln Asp Asp Ser Met Glu Cys Vai Asp Ser Glu450 455 460

Arg Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Thr Ale.4 65 4 70 41S 480

<210> 7

<211> 481

<212> PR?

<213> Homô sâpièfis

<400> 7Met Asn Glu Vai Ser Vai He Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly1 5 10 15

Glu tyr lie Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Ser Asp20 25 30

Gly Ser Phe lie Gly Tyr Lys Glu Atq Pro Glg Alâ Pr£> Asp Gln Thr35 40 45

Leu Pro Pxo Leu Asn Asn Phe Ser Vai Ala Glu Cys Gln Leu Met Lys50 55 €0

Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe Vai lie Arg Cys Leu Gln Trp65 70 75- 80

Thr fhr Vai lie Glu Arg Thr Phe His Vai Asp Ser Pro Asp Glu Arg85 90 95

Glu Glu Trp Met Aro Ala lie Gln. Het Vai Ala Asn Ser Leu Lys Gln100 105 110

Arg Ala Pro Gly Glu Asp Pro Het Asp Tyr Lys Cys Gly Ser Pro Ser11S 120 125

Asp Ser Ser Thr Thr Glu Glu Met Glu Vai Ala Vai Ser Lys ALa Arg

130 135 ÍÀ0

Ala Lys Vai Thr Wet Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys1.45 150 155 " 160

Gly Thr Phe Gly Lys Vai lie Leu. Vai Arg Glu Lys Alã Thr Gly Arg165 170 . 175

Tyr Tyr Ala Met Lys lie Leu Arg Lys Glu Vai lie lie Ala Lys Asp180 185 190

Glu Vai Ala His Thr Vai Thr Glu Ser Arg Vai Leu Gln Asn Thr Arg195 200 205

fils Pzq Phe Leu Thr Ala Lesi Lys- Tyr Ala Phe Éln Thr His Asp Ãrg210 215 220

Leu Cys Phe Vai Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe- Fhe Bis22b 230 235 24 0Leu Ser Arg Glu Arg Vai the Thr Giu Glu Arg Ala Arg Phe Tyr Giy245 250 255

Ala Glu Ile Vai Ser Ala Leu Giu Tyr Leu 8is Ser Arg Asp Vfil Vai260 265 " 27Õ

Tyr Arg Asp Ile Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly JHis275 280 .28 5

Ile Lys Ile Thr Asp Phe Giy Leu Cys Lys Glu Giy lie Ser Asp Gly290 295 300

Ala Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu305 3.10 315 320

Vai Leti Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Vai Asp Trp Trp Gly Leu

325 330 *. " 335

Gly Vai Vai Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn340 345 350

Gin Asp Bis Glu Arg Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu. Ile Arg355 360 365

Phe Pro Arg Thr Leu Ser Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ala Gly Leu370 375 380

Leu Lys. Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Pro Ser Asp Ala365 390 395 400

Lys Glu Vai Met Glu His Arg Phe Phe Leu Ser Ile Asn Trp Gln Asp405 410 415

Vai Vai Gin Lys Lys Leu Leu Pro Pro Phe Lys Pro Gln Vai Thr Ser420 425 430

Glu Vai Asp fht htq Tyr Phe Mp Asp Glu Phe Thr Ala Gln S%z lie

335 4AQ 445

Thr Ile Thr Pro Pro Asp Arg Tyr Asp Ser Leu Gly Leu Leu Glu Leu450 455 46Asp Glr* htq Thr Hás Phe Pro Glrt Phe Ser Tyr Ser Ala Ser lie Axg365 470 475 480

Glu

<210> 8

<211> 4 79

<2i2> PRT

<213> Hôróo sápiens

<400> 8

Met Ser Asp Vai Thr lie vai Lys Glu Gly Trp Vai Gln Lys Arg Gly1 5 10 15

Glu Tyx lie Lys Asn Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Thr Asp20 25 30

Gly Ser Phe He Gly Tyr Lys Glu Lys Pro Gln Asp Vai Asp Leu PrG35 40 45

—Tyr Prc I*eu Asn-- -Aen Phe Ser- Vai Ais' lys--Cys Gln Leis-Met. Lys Thr50 55 60

Glu Arg Pro Lys Pro Asn Thr Phe lie lie Arg Cys Leu Gln Trp Thr65 70 75 80

Thr Vai lie Glu Arg Thr Phe Hi$ Vai Asp Thr Pro Glu Glu Arg GluB5 90 95

Gln Trp Thr Glu Ala lie Gln Ala Vâl Ala A$p Arg Leu Gln Arg Gln100 105 HO

Glií Gly Glu Arg Met Asn Cys Ser Fro Thr Ser Gin íl.e Asp A$n lie115 120 125

Gly Glu Glu Glu Met Asp Ala Ser Tíir Thr His His Lys Arg lys Thr130 135 14 0

Met Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe Gly14 5 150 155 160

lys Vai. Ile Leu Vai Arg Glu Lys Ala Ser Gly Lys Tyr Tyr Ala Met165 170 175LyS lie Leu Lys Lys Glu Vãl lie lie Ala Lys Asp Glu Vai Ala His180 1B5 190

Thr Leu Thr Glu Ser Arg Vai leu Lys Asn Thr Arg Ws Pro Phe L«u195 200 205

Thr Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr Lys Asp Arg Leu Cys Phe Vai210 215 220.

Met Glu Tyr Vai Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser Arg Glu225 230 235 240

Arg Vai Phe Ser Glu Asp Arg Thr Rrg Phe Tyr Gly Ala Glu lie Vai

245 250 255

Ser Ala Leu Asp fyr Leu His Ser Gly Lys lie Vai Tyr Arg Asp Leu260 265 270

Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His lie Lys lie Thr275 260 265

Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly lie Thr Asp Ais Ala Thr Ket Lys290 295 300

Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Vai Leu Glu Asp305 3.10 315 320

Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Vai Asp Trp Trp Gly Leu Gly Vai. Vai Mei325 330 335

Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Pha Tyr Asn.Gln Asp His Glu340 345 350 •

Lys Leu Phe Glu Leu lie Leu Met Glu Asp He Lys Phs Pro Arg Thr355 360 365

Leu Ser Ser Asp Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu Üe Lys Asp370 ' 375 380

Pro Asn Lys Arg Leu Gly Gly Gly Pro Asp Asp Ala Lys Glu íle Met385 ' '■ 390 395 400

Arg His Ser Phe Phe Ser Gly Vai Asn Trp Gin Asp Vai Tyr Asp Lys405 410 415Lys Leu Vai Pro Pro ?he Lys PíO Gln Vfel Thr Ser Gly Thr Asp Thr420 425 430

Arg Tyr Phe Asp Glu GiO Phe Thr Ala Gln Thr Ilê Thr Ile Thr Pro435 4 40 445

Pro Glu Lys Tyr Asp Glu Asp Gly Met Asp Cys Met Asp Asn Glu Arg450 i355 460

Arg Pro Ms Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Arg Glu.465 470 475

Claims (24)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para determinação se uma amostra biológica com-preendendo células humanas de câncer de pulmão é sensível a uma combi-nação de um inibidor do receptor de fator de crescimento epidérmico è umagente quimioterápico, o processo compreendendo determinação da super-expressão de uma proteína AKT fosforilada e/ou de uma proteína MAPK fos-forilada na amostra biológica pelo qual a superexpressão da proteína AKTfosforilada e/ou a proteína MAPK fosforilada é indicativo de que a amostrabiológica compreendendo células humanas de câncer de pulmão é sensívela uma combinação de um inibidor do receptor de fator de crescimento epi-dérmico e um agente quimioterápico.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1 em que a superex-pressão da proteína AKT fosforilada e/ou a proteína MAPK fosforilada, naamostra biológica, é determinada pora) determinação do nível de expressão de proteína AKT fosfori-lada e/ou de proteína MAPK fosforilada na amostra biológica,b) determinação do nível de expressão de proteína AKT fosfori-lada e/ou de proteína MAPK fosforilada na amostra biológica compreenden-do células humanas de câncer de pulmão que não sejam sensíveis a umacombinação de um inibidor do receptor de fator de crescimento epidérmico eum agente quimioterápico,c) determinação da diferença do nível de expressão da proteínaAKT fosforilada e/ou de proteína MAPK fosforilada determinado na etapa a)eb).

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, pelo qual a dife-rença do nível de expressão da proteína AKT fosforilada e/ou de proteínaMAPK fosforilada determinado na etapa a) e b) é de pelo menos 10%.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicação 2 ou3, pelo qual a diferença do nível de expressão da proteína AKT fosforiladae/ou de proteína MAPK fosforilada determinado na etapa a) e b) é de pelomenos 25%.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de·1 a 4, em que a amostra biológica é um tumor pulmonar primário ou umametástase.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de·1 a 5, em que o inibidor do EGFR é o erlotinibe ou N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2- metoxietoxi)quinazolin-4-amina.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de·1 a 6, em que o agente quimioterápico é gemcitabina ou cisplatina.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de1 a 7, em que a superexpressão da proteína AKT fosforilada e/ou de proteí-na MAPK fosforilada é determinada utilizando um reagente que se liga espe-cificamente à proteína fosforilada.

9. Processo da reivindicação 8, em que o anticorpo, o derivadodo anticorpo, ou o fragmento do anticorpo, se liga especificamente à proteí---------na AKT fosforilada e/ou de proteína MAPK fosforilada.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 9, em que a proteína AKT fosforilada é fosforilada em uma posição deaminoácido correspondente à posição de aminoácidos 473 da proteína Akt1ou a proteína MAPK fosforilada é fosforilada em posições de aminoácidocorrespondentes às posições de aminoácidos 202 e 204 da MAPK1.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 11, em que a seqüência de aminoácidos da proteína MAPK é a se-qüência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 ou 2 e a seqüência de aminoácidosda proteína AKT é a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 6, 7 ou 8.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 11, em que o nível de expressão é determinado utilizando um proces-so selecionado do grupo composto por análise proteômica, por citometria defluxo, imunocitoquímica, imunohistoquímica e imunoensaio enzimático porabsorção direta.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, em que a superexpressão da proteína AKT fosforilada e/ou deproteína MAPK fosforilada é determinada pora) coloração imunohistoquímica da amostra biológica,b) atribuição de um grau selecionado dos números 1, 2, 3 e 4para o nível de expressão da proteína AKT fosforilada e/ou de proteínaMAPK fosforilada na inspeção visual da coloração das células na amostrabiológica, pela qual é atribuído o grau mais alto detectável para o nível de expressão,c) determinação do percentual de células com o grau mais altodetectável na amostra biológica corada imunohistoquimicamente.d) a multiplicação do grau atribuído ao percentual de células como grau mais alto detectável, na amostra biológica corada imunohistoquimi- camente, e o número 100, ee) a determinação de superexpressão de proteína AKT fosforila-da e/ou de proteína MAPK fosforilada na amostra biológica quando o resul-tado da multiplicação na etapa d) for acima de 100.

14. Uso de um antibiótico que se liga à proteína AKT fosforilada ou de um antibiótico que se liga à proteína MAPK fosforilada para a determi-nação se uma amostra biológica compreendendo células humanas de cân-cer de pulmão é sensível a uma combinação de um inibidor do receptor defator de crescimento epidérmico e um agente quimioterápico.

15. Processo de seleção de uma composição que iniba a pro- gressão de câncer de pulmão em um paciente, o processo compreendendo:a) a exposição separada de alíquotas de uma amostra biológicacompreendendo células de câncer de pulmão sensíveis a uma combinaçãode um inibidor do EGFR e de um agente quimioterápico do paciente, na pre-sença de uma diversidade de composições para testes; b) a comparação do nível de expressão de uma proteína Akt fos-forilada e/ou de uma proteína MAPK fosforilada nas alíquotas da amostrabiológica postas em contato com as composições para teste e o nível de ex-pressão da proteína Akt fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada emuma alíquota da amostra biológica que não foi posta em contato com as composições para teste,c) a seleção de uma das composições para teste que altere onível de expressão da proteína Akt fosforilada e/ou da proteína MAPK fosfo-rilada na alíquota contendo aquela composição para teste, em relação à alí-quota que não foi posta em contato com a composição para teste, em queuma diferença de pelo menos 10% entre o nível de expressão da proteínaAkt fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada na alíquota da amostra biológica posta em contato com a composição para teste, e o nível de ex-pressão da proteína Akt fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada naalíquota da amostra biológica que não foi posta em contato com a composi-ção para teste é um indicativo para a seleção da composição para teste.

16. Processo de produção de um possível agente, o referido processo compreendendo:a) o contato de uma alíquota de uma amostra biológica contendocélulas de câncer de pulmão, as quais são sensíveis a um inibidor do EGFRe a um agente quimioterápico com o possível agente,(b)-a determinação do nível de expressão de uma proteína Akt fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada na alíquota da amostra bioló-gica posta em contato com o possível agente e a determinação do nível deexpressão da proteína Akt fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada emuma alíquota da amostra biológica que não foi posta em contato com ò pos-sível agente, (c) a observação do efeito do possível agente pela comparaçãodo nível de expressão da proteína Akt fosforilada e/ou da proteína MAPKfosforilada na alíquota da amostra biológica posta em contato com o possívelagente e o nível de expressão da proteína Akt fosforilada e/ou da proteínaMAPK fosforilada na alíquota da amostra biológica que não foi posta em contato com o possível agente,(d) a produção do referido agente, a partir do referido efeito ob-servado, em que uma diferença de pelo menos 10% entre o nível de expres-são da proteína Akt fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada na alíquo-ta da amostra biológica posta em contato com o possível agente e o nível de expressão da proteína Akt fosforilada e/ou da proteína MAPK fosforilada naalíquota da amostra biológica que não foi posta em contato com o possívelagente é indicativo de um efeito do possível agente.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16, em que o referi-do possível agente é um possível agente inibidor.

18. Processo de acordo com a reivindicação 16, em que o referi-do possível agente é um possível agente promotor.

19. Possível agente produzido pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações de 16 a 18.

20. Preparado farmacêutico compreendendo um agente comodefinido na reivindicação 19.

21. Uso de um agente como definido na reivindicação 19 para o preparo de uma composição para a inibição de progressão de câncer de pulmão.

22. Processo de produção de um fármaco compreendendo asetapas do processo como definido em qualquer uma das reivindicações de16 a 18; e (i) a síntese do possível agente identificado na etapa (c), ou deum análogo ou derivado do mesmo, em uma quantidade suficiente para for-necer o referido fármaco em uma quantidade terapeuticamente efetiva paraum sujeito; e/ou(ii) a combinação do possível fármaco com o possível agente identificado na etapa (c), ou um análogo ou derivado do mesmo, com umveículo farmaceuticamente aceitável.

23. Uso de uma proteína Akt, uma proteína MAPK, uma proteínaAkt fosforilada, uma proteína MAPK fosforilada, um anticorpo que se ligaseletivamente a uma proteína Akt fosforilada ou uma proteína MAPK fosfori- lada para produção de um possível agente ou para seleção de uma compo-sição que iniba a progressão de câncer de pulmão em um paciente.

24. Kit compreendendo um anticorpo contra proteína MAPK fos-forilada e/ou Akt fosforilada.