JP2004229547A - アシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の課題は、アシル化ホモセリンラクトンの生物活性を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【解決手段】式Ｉ：
【化１】
〔式中、Ｒは、炭素数４〜３０の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基である〕
で表されるアシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養し、該細胞におけるＡｋｔ活性の阻害又はＡｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害を検出することにより、アシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする方法。
【選択図】 なし
【解決手段】式Ｉ：
【化１】
〔式中、Ｒは、炭素数４〜３０の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基である〕
で表されるアシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養し、該細胞におけるＡｋｔ活性の阻害又はＡｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害を検出することにより、アシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする方法。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物における病原因子の発現及びバイオフィルムの生成などの生物活性を阻害する物質をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
自然界において、微生物は様々な環境下で生存しなければならない。貧栄養、低・高温、ｐＨの変化はもちろんのこと、生体内においては貪食細胞又は抗菌性液性因子（補体、抗体、リゾチーム等）が存在する環境での生存を余儀なくされる。このような状況下で、細菌は自らの存在環境の変化を敏感に感知する機構を獲得してきた。そのような機構の１つとして、微生物は特異的な情報伝達物質を介して環境における自らの濃度を感知し、その濃度に応じて自らの様々な生物活性を巧妙に制御していることが明らかとなっている。このような細胞間の情報伝達機構は、クオラムセンシング（Ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ）システムと称される。
【０００３】
クオラムセンシングシステムは、基本的にＩ−遺伝子、Ｒ−遺伝子及び標的遺伝子の３つの遺伝子が担っており、Ｉ−遺伝子はオートインデューサー（ＡＩ）合成酵素をコードし、Ｒ−遺伝子は転写活性化因子をコードしている（非特許文献１参照）。ＡＩ合成酵素により、オートインデューサー、すなわちアシル化ホモセリンラクトンと称される一群の物質が合成される。アシル化ホモセリンラクトンは細菌の外膜を自由に通過できる分子であり、環境中の細菌濃度が低い場合には希釈され生物活性を示さないが、細菌の増殖が進み環境中での菌密度が高まるに従って菌内外のアシル化ホモセリンラクトン濃度も高まり一定の閾値に達すると、アシル化ホモセリンラクトンとＲ−遺伝子産物（転写活性化因子）の結合が加速する。この複合体が標的遺伝子の転写制御領域に結合し、標的遺伝子の発現を促進することにより様々な生物活性物質が発現される。
【０００４】
これまでに、ビブリオ属細菌、緑膿菌、セラチア、エンテロバクターなど臨床上重要な細菌において、アシル化ホモセリンラクトンが上記のクオラムセンシングシステムを介して病原因子の発現を促しているという事実が報告されている。さらには、アシル化ホモセリンラクトンが微生物によるバイオフィルムの生成
に関与していることも明らかとなっている（特許文献１参照）。
【０００５】
バイオフィルムは水のある環境、特に産業設備の導管材料の内側壁面や家庭の配管システムの内側壁面、医療用移植片上の界面に生じ、又は慢性感染症の病巣として生じ、かつ存続する生物の膜である。バイオフィルムは、その定住微生物の分泌した基質ポリマーから構成される有機質のゲル状構造とそれに埋め込まれた微生物とから成っている。バイオフィルムの形成は、配管システムの流れを制限したり又は完全に遮断する場合があり、また、埋め込まれた細菌による腐食作用により材料の寿命を低下させる場合もある。パイブ及び導管表面からのバイオフィルムの調節及び除去は、従来、塩素又は強いアルカリ溶液などの腐食性化学薬品、又は機械的手段を通じて行なわれてきた。このような処置は一般には配管システムと環境の双方にとって苛酷である。微生物の抗菌剤への耐性は、バイオフィルム基質ポリマーの持つ防御特性が大きな原因となっている。医療では、バイオフィルムが関与していると考えられる場合の治療には高用量の抗生物質の利用が必要とされてきた。これは、細胞外の基質ポリマーによりバイオフィルム細菌の防御性が高くなっていることが原因の１つであると考えられている。従って、医療、環境及び産業分野においてバイオフィルム形成を制御する必要ある。
【０００６】
以上に述べたように、病原因子の発現及びバイオフィルムの生成は重大な問題となっており、微生物におけるこれらの生物活性に関与するアシル化ホモセリンラクトンを阻害する物質をスクリーニングする方法が望まれていた。アシル化ホモセリンラクトンは微生物における様々な活性を制御していることから、微生物の生存等を指標としてアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングすることも考えられる。しかし、微生物自体がアシル化ホモセリンラクトンを産生しているためバイアスが生じ、スクリーニング方法として好ましくない。従って、アシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングするためのより有効な方法が望まれていた。
【０００７】
一方、アシル化ホモセリンラクトン分子が動物細胞に与える影響については、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンがヒト肺胞上皮細胞におけるＩＬ−８産生を刺激すること（非特許文献２参照）、本物質がマウスマクロファージ培養系においてＴＮＦ−α及びＩＬ−１２の産生を促進すること（非特許文献３参照）が報告されているに過ぎず、いずれの報告も炎症・免疫応答に関する報告であり、アシル化ホモセリンラクトンが動物細胞におけるＡｋｔの活性化を阻害すること、さらにはアシル化ホモセリンラクトンが動物細胞のアポトーシスを誘導することについては全く知られていなかった。
【０００８】
【特許文献１】
特表２００２−５１４０９２
【非特許文献１】
Ｍａｒｖｉｎ Ｗｈｉｔｅｌｏｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９６， １３９０４−１３９０９，（１９９６）
【非特許文献２】
Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ． Ｐｈｉｐｐｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６７， ３６６−３７４， （２００１）
【非特許文献３】
Ｇａｒｙ Ｔｅｌｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ６６， ３６−４２， （１９９８）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、アシル化ホモセリンラクトンの生物活性を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、下記の式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトンが、動物細胞におけるＡｋｔの活性を阻害し、それによって動物細胞におけるアポトーシスを誘導することを見出した。そして、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養して該細胞におけるＡｋｔ活性の阻害又はＡｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害を検出することにより上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）式Ｉ：
【化３】
〔式中、Ｒは、炭素数４〜３０の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基である〕
で表されるアシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養し、該細胞におけるＡｋｔ活性の阻害又はＡｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害を検出することにより、アシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする方法。
（２）アポトーシスを検出することによって、Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害を検出する（１）に記載の方法。
（３）（１）又は（２）に記載のスクリーニング方法により同定されたアシル化ホモセリンラクトン阻害物質。
（４）（１）又は（２）に記載のスクリーニング方法により同定されたアシル化ホモセリンラクトン阻害剤。
（５）（１）又は（２）に記載のスクリーニング方法に使用するための、以下の要素を含むキット。
ａ）式Ｉ：
【化４】
〔式中、Ｒは上記と同義である〕
で表されるアシル化ホモセリンラクトン、
ｂ）動物細胞、及び
ｃ）Ａｋｔ活性測定手段
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において、アシル化ホモセリンラクトンとは、式Ｉ：
【化５】
で表される化合物を意味する。
【００１３】
式Ｉにおける、Ｒは、炭素数４〜３０、好ましくは８〜２０、より好ましくは１０〜１４の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基であり、置換基としては、ヒドロキシル基、オキソ基、メチル基等が挙げられる。非置換の飽和脂肪族アシル基、及び３位にオキソ基を有する飽和脂肪族アシル基が好ましい。また、直鎖状であることが好ましい。
【００１４】
Ｒの具体例としては、特に限定されないが、例えば、ブチリル基、３−オキソブチリル基、３−ヒドロキシブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、３−オキソバレリル基、イソバレリル基、３−オキソイソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、３−オキソヘキサノイル基、ヘプタノイル基、３−オキソヘプタノイル基、オクタノイル基、３−オキソオクタノイル基、ノナノイル基、３−オキソノナノイル基、デカノイル基、３−オキソデカノイル基、ウンデカノイル基、３−オキソウンデカノイル基、ラウロイル基、３−オキソドデカノイル基、トリデカノイル基、３−オキソトリデカノイル基、テトラデカノイル基、３−オキソテトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、３−オキソペンタデカノイル基、パルミトイル基、３−オキソパルミトイル基、ヘプタデカノイル基、３−オキソヘプタデカノイル基、ステアロイル基、３−オキソステアロイル基、ノナデカノイル基、３−オキソノナデカノイル基、イコサノイル基、３−オキソイコサノイル基、トリアコンタノイル基、３−オキソトリアコンタノイル基、ミリストイル基、３−オキソミリストイル基及びピルボイル基等が挙げられる。
【００１５】
式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトンの具体例としては、特に限定されないが、例えば、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソブチリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−ヒドロキシブチリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−イソブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−バレリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソバレリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−イソバレリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソイソバレリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ピバロイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘプタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘプタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−オクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソオクタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ノナノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソノナノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−デカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ウンデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソウンデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−トリデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソトリデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−テトラデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソテトラデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ペンタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソペンタデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−パルミトイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソパルミトイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘプタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘプタデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ステアロイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソステアロイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ノナデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソノナデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−イコサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソイコサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−トリアコンタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソトリアコンタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ミリストイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソミリストイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン及びＮ−ピルボイル−Ｌ−ホモセリンラクトン等が挙げられる。
【００１６】
特に、Ｎ−（３−オキソデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソウンデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソトリデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン及びＮ−（３−オキソテトラデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンが好ましい。
【００１７】
本発明のアシル化ホモセリンラクトンは、例えば、脂肪族カルボン酸又はそのエステルと環状アミノ酸との間にアミド結合を形成させることによって合成することができる。また、アシル化ホモセリンラクトンは、例えば、Ｃｈｈａｂｒａ， Ｓ． Ｒ．， Ｐ． Ｓｔｅａｄ， Ｎ． Ｊ． Ｂａｉｎｔｏｎ， Ｇ． Ｐ． Ｃ． Ｓａｌｍｏｎｄ， Ｇ． Ｓ． Ａ． Ｂ． Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｐ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ａｎｄ Ｂ． Ｗ． Ｂｙｃｒｏｆｔ， Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．， ４６， ４４１−４５４， １９９３、Ｚｈａｎｇ， Ｌ．， Ｐ．Ｊ． Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ． Ｋｅｒｒ， ａｎｄ Ｍ． Ｅ． Ｔａｔｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２， ４４６−４４８， １９９３、ＳｃｈａｅｆｅｒＡ．Ｌ．， Ｂ． Ｌ． Ｈａｎｚｅｌｋａ， Ａ． Ｅｂｅｒｈａｒｄ， ａｎｄ Ｅ． Ｐ． Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７８， ２８９７−２９０１， １９９６、Ｇａｏ， Ｊ． Ｇ． ａｎｄ Ｅ． Ａ． Ｍｅｉｇｈｅｎ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７５， ３８５６−３８６２， １９９３などに記載された方法によって合成できる。
【００１８】
また、本発明のアシル化ホモセリンラクトンは微生物によって生合成されるため、微生物を培養した培養物から当技術分野において通常用いられる方法によって分離精製することもできる。
【００１９】
本発明は、アシル化ホモセリンラクトンが動物細胞におけるＡｋｔ活性を阻害するという知見に基づくものである。
【００２０】
従って、本発明の一実施形態では、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養し、該細胞におけるＡｋｔ活性の阻害を検出することによりアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする。すなわち、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養した場合に、被検物質なしで培養したときに見られたアシル化ホモセリンラクトンのＡｋｔ活性阻害効果が見られなくなれるかあるいは減少すれば、当該被検物質はアシル化ホモセリンラクトン阻害物質であると同定できる。
【００２１】
Ａｋｔ活性の検出は、当技術分野で通常用いられる方法を用いて実施することができ、例えば、抗−リン酸化Ａｋｔ抗体（例えば、Ｂａｕｍａｎｎ ＣＡ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４０７， ２０２−２０７， （２０００）、Ｈｏｌｌａｎｄ ＥＣ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， ２５， ５５−５７， （２０００）を参照されたい）、すなわち抗−活性化Ａｋｔ抗体を用いるウェスタンブロットにより検出することができる。この抗体は、抗原であるリン酸化Ａｋｔに対する反応性及び特異性が高いことから、これを用いることにより非常に効果的にリン酸化Ａｋｔを検出することができる。
【００２２】
Ａｋｔは、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシチド３−ＯＨキナーゼ）の下流で活性化され、生存シグナル伝達経路において重要な役割を担っている。細胞の生死は、アポトーシスシグナル伝達と生存シグナル伝達との拮抗によって制御されている。Ａｋｔはリン酸化されることにより活性型となり、活性型Ａｋｔが細胞におけるアポトーシスを阻害することが報告されている（特表２００２−５２８３９０参照）。
【００２３】
活性型Ａｋｔは、様々な基質を介して細胞の生存を促進することが知られている（実験医学 Ｖｏｌ １９、Ｎｏ．１３（増刊）、ｐ．１１６、２００１年、羊土社）。また、Ａｋｔによる生存促進メカニズムには、１）アポトーシス誘導にかかわる分子を直接リン酸化してアポトーシス誘導能を抑制する経路と、２）転写因子を直接又は間接のターゲットとして、アポトーシス促進分子又は抑制分子の転写を調節することにより生存促進に働く経路とがあることが明らかとなってきている。Ａｋｔは様々な基質を介してアポトーシスを阻害しているため、Ａｋｔ活性の阻害は、Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路を担うその他の分子にも影響を及ぼし、最終的に細胞のアポトーシスをもたらすこととなる。
【００２４】
従って、本発明の別の実施形態では、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養し、Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害を検出することにより、アシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングすることもできる。Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害は、この経路に関与する分子、その活性及び構造、又はその他の分子との結合等を検出することによって行いうる。Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路に関与する分子は、Ａｋｔ活性の阻害によって何らかの影響を受ける分子であれば特に制限されないが、例えば、ｃａｓｐａｓｅ、Ｂａｄ、Ｆｏｒｋｈｅａｄ ｔｒａｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、ＧＳＫ−３等が挙げられる。
【００２５】
ｃａｓｐａｓｅとは、アポトーシスの誘導、決定、実行に決定的な働きをする一群のシステインプロテアーゼファミリーである。ｃａｓｐａｓｅの不活性型前駆体が限定分解により活性化されることで、細胞内においてプロテアーゼのカスケードが形成され、アポトーシスのシグナル伝達が行われる。すなわち、ｃａｓｐａｓｅの活性化はアポトーシスをもたらす。従って、ｃａｓｐａｓｅの活性化は、Ａｋｔによる生存シグナル伝達経路の阻害を意味する。すなわち、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養した場合に、被検物質なしで培養したときに見られたアシル化ホモセリンラクトンのｃａｓｐａｓｅ活性化効果が見られなくなるかあるいは減少すれば、当該被検物質はアシル化ホモセリンラクトン阻害物質であると同定できる。
【００２６】
ｃａｓｐａｓｅのうちｃａｓｐａｓｅ−３は最も高い酵素活性をもち、ＤＮＡ断片化因子のほか、細胞を構築する様々なタンパク質を基質としてアポトーシスを実行する。ｃａｓｐａｓｅ−９は、アポトーシス誘導刺激により障害を受けたミトコンドリアからチトクロームｃが放出されＡｐａｆ−１・チトクロームｃ・ｐｒｏ ｃａｓｐａｓｅ−９の多量体化が促されることにより活性化される。ｃａｓｐａｓｅ−９がＡｋｔによって直接リン酸化され、その活性化が阻害されることも報告されている。ｃａｓｐａｓｅ活性は、当技術分野で通常用いられる方法によって測定でき、例えば、ウェスタンブロットにより測定することができる。
【００２７】
また、ＭＡＰキナーゼスーパーファミリーメンバーのうちＪＮＫ及びｐ３８は、アポトーシスを誘導する様々な物理化学的ストレスによって活性化されることが明らかとなっており、ＭＡＰキナーゼがアポトーシスに関与することが示唆されている。ＭＡＰキナーゼとは、細胞が細胞増殖因子などの外界刺激を受けたとき、トレオニン残基とチロシン残基の両アミノ酸残基のリン酸化によって活性化されるセリン−トレオニンキナーゼの一群であり、酵母から高等動物まで真核生物に普遍的に存在する。本酵素は、単量体の触媒サブユニットからなるタンパク質キナーゼ分子である。そのアミノ酸配列は進化的に高度に保存されており、細胞増殖及び分子を制御する細胞内シグナル伝達の中枢の一翼を担っている。本発明者らは、アシル化ホモセリンラクトンによってＭＡＰキナーゼの活性化、すなわちリン酸化が促進されることを見出した。従って、本発明の一実施形態では、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養し、該細胞におけるＭＡＰキナーゼの活性を測定することにより、アシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングすることもできる。本発明においては、ＭＡＰキナーゼスーパーファミリーのうち、ＥＲＫ、ｐ３８及びＪＮＫの活性を検出するのが好ましい。ＭＡＰキナーゼの活性は、例えば、Ａｋｔと同様に活性化ＭＡＰキナーゼ（リン酸化ＭＡＰキナーゼ）をウェスタンブロット等で測定することによって検出できる。すなわち、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養した場合に、被検物質なしで培養したときに見られたアシル化ホモセリンラクトンのＭＡＰキナーゼ活性化効果が見られなくなるかあるいは減少すれば、当該被検物質はアシル化ホモセリンラクトン阻害物質であると同定できる。
【００２８】
Ａｋｔ活性の阻害は、最終的にアポトーシスをもたらすことから、本発明において「Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害の検出」には、アポトーシスの検出も包含される。
【００２９】
本発明において、アポトーシスとは当技術分野で通常用いられる意味を有し、すなわち、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死を意味する。アポトーシスの形態は、細胞核の染色体凝集、ＤＮＡの断片化、細胞表層微絨毛の消失、クロマチンの凝縮を特徴とする。細胞は萎縮し、細胞の内容物が細胞外に放出されずにマクロファージなどの周囲の細胞にすみやかに取り込まれるので、炎症が引き起こされず、周囲の細胞に影響を与えない。一方、環境の悪化から引き起こされるネクローシス（壊死）は、細胞の内容物が放出される点でアポトーシスとは大きく異なる。
【００３０】
本発明において動物細胞におけるアポトーシスを検出する方法としては、当技術分野で通常用いられるものを使用することができ、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡ結合性蛍光色素アミノベンズイミド（ヘキスト３３３４２、３３５８２及び３３３２５８など）などによる染色後に蛍光顕微鏡でクロマチン凝縮を観察する方法、断片化したＤＮＡを遠心などにより抽出分離してアガロースゲル電気泳動及び比色法などによって定量する方法、断片化したＤＮＡを組織化学的に検出するＴＵＮＥＬ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｂｉｏｔｉｎ−ｄＵＴＰ Ｎｉｃｋ Ｅｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ）法、並びにＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色により細胞生存率を測定する方法などが挙げられる。
【００３１】
本発明において、アシル化ホモセリンラクトン阻害物質とは、アシル化ホモセリンラクトンの各種細胞、特に動物細胞及び微生物に対する作用を阻害する物質、該作用に対する拮抗物質、アシル化ホモセリンラクトンの分泌を阻害する物質及びアシル化ホモセリンラクトンを分解する物質のいずれをも意味する。アシル化ホモセリンラクトンの各種細胞に対する作用としては、特に限定されないが、例えば、Ａｋｔ活性を阻害する作用、アポトーシスを誘導する作用、細胞による病原因子の発現を誘導する作用及び微生物によるバイオフィルムの生成を誘導する作用などが含まれる。
【００３２】
本発明はまた、動物細胞を用いてアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングすることを特徴とする。細菌などの微生物を用いてアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする場合は、細菌自体がアシル化ホモセリンラクトンを産生するためバイアスがかかるが、動物細胞はアシル化ホモセリンラクトンを産生しないため、信頼性の高いスクリーニングを実施できる。本発明において用いることができる動物細胞は、特に限定されないが、例えば、哺乳動物、鳥類由来の細胞を使用することができ、哺乳動物、特にヒト由来の細胞を使用するのが好ましい。また、上皮組織、特に腸管粘膜上皮組織由来の細胞（例えば、ＣａＣｏ−２：ヒト大腸癌カルチノーマ細胞）、内皮細胞、特に血管内皮細胞（例えば、ＰＥＣ：ブタ胸部大動脈由来内皮細胞）及び線維芽細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３：マウス胎児由来線維芽細胞）を使用するのが好ましい。また、パイエル板をはじめとする腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）を覆う腸管粘膜上皮層には、特殊に分化したＭ細胞と呼ばれる粘膜上皮細胞が点在し、食餌性抗原や腸内細菌などを積極的に取り込んで免疫組織に提供することにより、腸管局所及び全身の免疫応答調節に重要な役割を果たしている。従って、腸上皮は微生物産生物質との接触が想定される場であり、腸管粘膜上皮組織由来細胞を用いてアシル化ホモセリンラクトンの直接的作用を検討することは、実際の動物生体内で起こりうる現象として捉えることができる。また、動物細胞のなかでも癌細胞を用いるのが好ましい。
【００３３】
本発明のスクリーニング方法では、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、動物細胞を被検物質とともに培養することにより、アシル化ホモセリンラクトンによる刺激を行う。刺激のための培養時間は、アシル化ホモセリンラクトンの濃度、使用する検出方法及び動物細胞の種類に依存するが、通常、２分〜７２時間程度である。
【００３４】
Ａｋｔ活性を測定することによってスクリーニングを行う実施形態では、アシル化ホモセリンラクトンの存在下で動物細胞を培養すると、Ａｋｔ活性は、培養開始から数時間減少するが、その後基底レベルまで戻ることが示されている（実施例１（３）参照）。従って、本発明のスクリーニング方法においては、予め対照として被検物質の不在下でアシル化ホモセリンラクトンとともに動物細胞を培養し、活性型Ａｋｔが減少を示す培養時間を測定し、続いて、該時間の範囲内で、被検物質の存在下アシル化ホモセリンラクトンとともに動物細胞を培養することが好ましい。この場合の培養時間もアシル化ホモセリンラクトンの濃度及び使用する動物細胞の種類に依存するが、通常、２分〜２時間時間程度である。
【００３５】
ｃａｓｐａｓｅ活性を測定することによってスクリーニングを行う実施形態においても、アシル化ホモセリンラクトンの存在下で動物細胞を培養すると、ｃａｓｐａｓｅ活性は培養開始から数時間増加するが、その後基底レベルまで戻ることが示されている（実施例５参照）。従って、この場合も同様に、予め対照として被検物質の不在下でアシル化ホモセリンラクトンとともに動物細胞を培養し、活性型ｃａｓｐａｓｅが減少を示す培養時間を測定することが好ましい。この場合の培養時間もアシル化ホモセリンラクトンの濃度及び使用する動物細胞の種類に依存するが、通常、１〜８時間程度である。
【００３６】
アシル化ホモセリンラクトンによるＭＡＰキナーゼの活性化においても同様に、アシル化ホモセリンラクトンの存在下で培養を行うと、ＭＡＰキナーゼは一度活性化された後で時間の経過とともに基底レベルに戻る。この場合の培養時間もアシル化ホモセリンラクトンの濃度及び使用する動物細胞の種類に依存するが、通常、２分〜６時間程度である。
【００３７】
アポトーシスを検出することによってスクリーニングを行う場合の培養時間は、通常、６〜７２時間程度である。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法において、共存させるアシル化ホモセリンラクトンの濃度は、通常、１〜５００μＭ、好ましくは２０〜２００μＭ、より好ましくは３０〜１００μＭである。
【００３９】
より具体的には、ヒト由来腸管粘膜上皮細胞を用い、Ａｋｔ活性を指標にしてアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする場合は、１０μＭ以上、好ましくは３０〜２００μＭのアシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を２分〜２時間、好ましくは２〜６０分程度培養するのが好ましいと考えられる。そして、この培養時間の範囲内で本来見られるはずのＡｋｔ活性阻害がみられなかったときあるいはその活性阻害が減少したときは、その被検物質はアシル化ホモセリンラクトン阻害物質であると同定できる。
【００４０】
ヒト由来腸管粘膜上皮細胞を用い、ＥＲＫ活性を指標にしてアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする場合は、１０μＭ以上、好ましくは３０〜２００μＭのアシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を２〜３０分、好ましくは５〜１５分程度培養するのが好ましいと考えられる。ヒト由来腸管粘膜上皮細胞を用い、ｐ３８活性を指標にしてアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする場合は、１０μＭ以上、好ましくは３０〜２００μＭのアシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を５分〜６時間、好ましくは５〜６０分程度培養するのが好ましいと考えられる。
【００４１】
本発明のスクリーニング方法においては、動物細胞の培養において通常用いられる培地を使用することができ、特に制限されない。例えば、ＤＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地等があげられる。その他の培養条件も、動物細胞の培養において通常用いられる条件を使用することができる。
【００４２】
本発明では、上記時間にわたって動物細胞を培養した後、例えば培養細胞を急冷することによって反応を停止する。その後、上記のような方法により動物細胞におけるＡｋｔ活性、ｃａｓｐａｓｅ活性及びアポトーシス等を検出する。反応をすぐに停止するために、溶媒を除去してもよい。
【００４３】
本発明によってスクリーニングされる被検物質が含まれうる試料としては、特に限定されないが、動物（カビ、放射菌等の微生物を含む）及び植物の抽出物、並びに人工合成物が挙げられる。
【００４４】
本発明はまた、上記のようなスクリーニング方法によって同定されたアシル化ホモセリンラクトン阻害物質に関する。このような物質としては、特に限定されず、天然物及び合成物の双方が含まれる。本発明のアシル化ホモセリンラクトン阻害物質は、単独で、又は従来の抗菌剤とともに抗菌剤として使用することができる。本発明のアシル化ホモセリンラクトン阻害物質は、バイオフィルムの生成を阻害できることから、薬剤耐性を獲得した細菌に対しても、抗菌作用を増強できる点において有利である。本発明のアシル化ホモセリンラクトン阻害物質とともに用いることができる公知の抗菌剤としては、特に限定されないが、例えば、ペニシリン（ペナム）系抗生物質、セファロスポリン（セフェム）系抗生物質、オキサセフェム系抗生物質、ペネム系抗生物質、カルバペネム系抗生物質、モノバクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、クロラムフェニコール系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、グリコペプチド系抗生物質、ホスホマイシン系抗生物質、リンコマイシン系抗生物質、サルファ剤、パラアミノサリチル酸製剤、イソニコチン酸ヒドラジド製剤及びキノロン系合成抗菌剤などを挙げることができる。
【００４５】
本発明の方法によってスクリーニングされたアシル化ホモセリンラクトン阻害剤は、バイオフィルム阻害剤、並びにフィルター及びパイプにおける目詰まり防止剤として使用できる。また、本発明のアシル化ホモセリンラクトン阻害剤は、微生物における病原因子の発現を阻害することから、感染症治療剤として使用することもできる。
【００４６】
本発明はまた、上記のようなスクリーニング方法に用いるためのキットに関する。該キットは、例えば、式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトン、動物細胞及び該動物細胞におけるＡｋｔ活性測定手段を含む。Ａｋｔ活性測定手段とは、例えば、抗−リン酸化Ａｋｔ抗体と該抗体に対する標識２次抗体などである。標識２次抗体としては、当技術分野で通常用いられるもの、例えば、ＨＲＰ標識抗−ウサギＩｇＧ抗体、ＨＲＰ標識抗−マウスＩｇＧ抗体などを使用できる。
【００４７】
【実施例】
以下の実施例において実験材料は、特に他に記載がない限り、以下に記載のものを使用した。
【００４８】
細胞培養に用いたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）はＳＩＧＭＡ社から購入した。Ｎ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）の溶媒として用いたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は和光純薬工業株式会社のものを使用した。キナーゼ阻害剤であるＰＤ９８０５９、ＳＢ２０３５８０はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社から購入した。タンパク質の定量には、ＰＩＥＲＣＥ社のＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを使用した。抗体については以下の会社のものを使用した。抗−リン酸化−ｐ４４／４２ ＭＡＰキナーゼ抗体、抗−リン酸化−ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ抗体、抗−リン酸化−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ 抗体、抗−リン酸化−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３） 抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−３ 抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９（Ｄ３３０）抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰ（Ｄ２１４）抗体、ＨＲＰ標識抗−ウサギＩｇＧ抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社。ｃ−Ｍｙｃマウスモノクローナル抗体、ＨＲＰ標識抗−マウスＩｇＧ抗体はＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社。抗−α−チューブリン抗体（Ａｂ−１）はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社。
【００４９】
実施例１ Ａｋｔ 活性のウェスタンブロットによる解析
（１）ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性の変化
ヒト大腸癌カルチノーマ細胞株ＣａＣｏ−２はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入し、１０％ ＦＣＳ、１％ ＮＥＡＡ、１％ Ｐ／Ｓ（１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％ ＣＯ２存在下で培養した。
【００５０】
６ｃｍ ディッシュ（ＮＵＮＣ社）を用いて、１ ディッシュ当たりＣａＣｏ−２細胞を６×１０５個まき、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）（−）で２回洗浄後、１％ ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。その後、終濃度１００μＭでホモセリンラクトン塩酸塩、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンをそれぞれ添加し、１０分間反応させた。なお、精製されたアシル化ホモセリンラクトンは、目的とする終濃度の４００倍になるようＤＭＳＯに溶解し、フィルター滅菌（φ０．２２μｍ）を行ったものを使用した。対照として終濃度０．２５ ％のＤＭＳＯを使用した。また、内部標準としてα−チューブリンを用いた。
【００５１】
反応後、冷ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、−８０℃で凍結させた。氷上で細胞を融解し、溶解バッファー（５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％ グリセリン、１０ ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１００ ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン）を２００μｌ加え、スクレーパーで細胞を剥ぎ取った。これを氷上で２０分間静置し、その後１４０００ ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を回収した。回収したタンパク質の濃度を測定し、５０μｇ相当をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後ＰＶＤＦメンブレンにブロットした。リン酸化ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、Ａｋｔを測定する場合は、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含む５％ スキムミルク／Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水でブロッキングを行い、１次抗体にそれぞれ、抗−リン酸化−ｐ４４／４２ ＭＡＰキナーゼ抗体、抗−リン酸化−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ抗体、抗−リン酸化−ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体、抗−リン酸化−Ａｋｔ （Ｓｅｒ４３７） 抗体を、２次抗体にはＨＲＰ標識抗−ウサギＩｇＧ抗体を用いた。内部標準として使用したα−チューブリンは、ブロッキングを５％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＴＢＳ−Ｔで行い、１次抗体は抗−α−チューブリン（Ａｂ−１）、２次抗体にはＨＲＰ標識抗−マウスＩｇＧ抗体を用いた。バンドの検出にはＲｅｎａｉｓｓａｎｃｅＴＭ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ２５５８６１ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ（ＮＥＮ社）又は、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｌｕｍｉｎｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を使用した。結果を図１に示す。なお以下で言及する図中において、３−ｏｘｏ−Ｃ１２−ＨＳＬとは、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを意味する。
【００５２】
ＭＡＰキナーゼ活性に関しては、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを添加した場合のみ、ＥＲＫ、ｐ３８、ＪＮＫの活性化が促進された。一方、ＣａＣｏ−２細胞においてＡｋｔは通常リン酸化（活性化）された状態にあるが、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンによりＡｋｔのリン酸化レベルが著しく低下した。
【００５３】
以上から、アシル化ホモセリンラクトンがＥＲＫ、ｐ３８、ＪＮＫの活性化を促進し、一方、Ａｋｔの活性化を阻害することが明らかとなった。
【００５４】
（２）ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン濃度依存的なＭＡＰキナーゼ及びＡｋｔ活性の変化
細胞培養後、終濃度０μＭ（０．２５％ ＤＭＳＯ）、１μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソ−ドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンをそれぞれ添加して、１０分間反応させること以外は、（１）と同様にして、ＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性をウェスタンブロットにより解析した（図２）。
【００５５】
図２のバンドの強度をＬＡＳ−１０００により定量、数値化した結果をそれぞれ図３、図４に示す。１０μＭ以上の濃度でＥＲＫ、ｐ３８のリン酸化レベルが有意に増大した。１０μＭ、３０μＭ、１００μＭでは、それぞれＥＲＫ活性が１．５、７．７、９．８倍に、ｐ３８活性が３．２、４．４、５．４倍になった。ＪＮＫ活性については濃度依存的な有意差が認められなかった。Ａｋｔの活性阻害についても同様に１０μＭから起こり、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭではそれぞれ無刺激時の７９％、３１％、１４％にまで活性が低下した。
【００５６】
以上から、ＣａＣｏ−２細胞では、アシル化ホモセリンラクトン１０μＭ以上で、Ａｋｔの活性が有意に阻害されることがわかる。また、アシル化ホモセリンラクトン１０μＭ以上でＥＲＫ、ｐ３８及びＪＮＫが活性化されることがわかる。
【００５７】
（３）ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性の経時変化
細胞培養後、終濃度３０μＭ及び１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを添加し、それぞれアシル化ホモセリンラクトンによる刺激時間を０、５、１０、３０、６０分の短いタイムコース（図５）、０、１０分、６０分、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間の長いタイムコース（図６）で行った他は、（１）と同様にして、ウェスタンブロットによりＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性を測定した。３０μＭ刺激ではＥＲＫ、ｐ３８活性はともに１０分をピークに上昇したが、ＥＲＫ活性が３０分で基底レベルに戻ったのに対し、ｐ３８は４時間までその活性が持続した。３０μＭ刺激時のＡｋｔの活性阻害は５分をピークに６０分まで持続し、２時間で基底レベルに戻った。１００μＭ刺激ではＥＲＫ活性化が２段階で起こった。すなわち、１段階目は５分をピークにして２時間で基底レベルに戻り、２段階目は４時間から活性が上昇しはじめ、８時間をピークにして１０時間で基底レベルに戻るというものであった。この２段階目のＥＲＫ活性化はＤＮＡ損傷後のものと考えられる。一方、１００μＭ刺激時のｐ３８活性化は、５分をピークにしてその活性が８時間まで持続し、Ａｋｔ活性阻害は５分をピークにして６時間まで持続した。
【００５８】
実施例２ Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ 染色による生存率の評価
３．５ｃｍ ディッシュ（ＮＵＮＣ社）に、ＣａＣｏ−２細胞を２×１０５ 個まき、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１％ ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。各種薬剤 ［終濃度１〜１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを添加し、１２時間培養した。対照として０．２５％ ＤＭＳＯを使用した。その後、上清及びトリプシン−ＥＤＴＡ（ＴＥ）でディッシュから剥がした細胞を、室温、８００ ｒｐｍで５分間遠心後、上清を取り除き、２００μｌのＤＭＥＭにて希釈した。うち５０μｌをエッペンチューブにとり、等量のＴｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色液を加え、細胞数を血球計測盤にて測定した。このとき、測定対象とする死細胞数と生細胞数の合計を２００個以上とした。
【００５９】
Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン濃度依存的に生存率の有意な低下が認められた。１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンにより、生存率がそれぞれ９０％、５５％、５１％にまで低下した（図７）。この３０μＭ以上の濃度において有意に生存率を低下させるという結果は、ウェスタンブロット解析においてＭＡＰキナーゼ活性増加及びＡｋｔ活性阻害が３０μＭ前後で顕著に見られたこととも一致する。また対照及び０．２５％ ＤＭＳＯ添加時の生存率はともに９４％であり、１μＭ Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激時の生存率が９４ ％であることからＤＭＳＯの生存率への影響は無視できるものと考えられる。
【００６０】
実施例３ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２ 染色によるクロマチン凝縮の観察とアポトーシスの判定
実施例２で観察されたＣａＣｏ−２の細胞死がアポトーシス又はネクローシスであるかを判定すべく、クロマチン染色の蛍光色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて形態学的に評価した。
【００６１】
８ウェル培養スライド（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ ｃｅｌｌ ｗａｒｅ ｂｉｏｃｏａｔ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ）に、ＣａＣｏ−２細胞を２×１０４個まき、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１％ ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。３−オキソ−ドデカノイルホモセリンラクトンを各濃度（１〜１００μＭ）にて添加し１２時間培養後、細胞を４％ パラホルムアルデヒド−３％ スクロース／ＰＢＳにて固定し、蛍光色素ヘキスト３３３４２を用いてクロマチン染色を行い、蛍光顕微鏡下で観察した。倍率４００倍にて５視野をランダムに選び、アポトーシス細胞と正常細胞を計数、アポトーシス細胞の割合を算出し、これをｎ＝１として３回以上試行した。
【００６２】
Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン１０μＭ以上の濃度で、クロマチン凝縮を起こしたアポトーシス細胞が観察された。しかし０．２５％ ＤＭＳＯ、１μＭ Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンでは正常細胞のみが観察された（図８）。クロマチン凝縮が観察されたアポトーシス細胞の計数によりアポトーシスの定量を行った結果を図９に示す。全細胞数に対するアポトーシス細胞の割合は、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンでそれぞれ１５％、３９％、５０％であった。この値は生存低下率とも一致する。したがって、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンによるＣａＣｏ−２の細胞死はアポトーシスによるものと判定された。
【００６３】
実施例４ ＤＮＡ 断片化によるアポトーシスの評価
実施例２で観察されたＣａＣｏ−２の細胞死がアポトーシス又はネクローシスであるかを判定するための別法として、ＤＮＡの断片化を評価した。
【００６４】
ＣａＣｏ−２細胞を５×１０６個／１５ ｃｍ ディッシュ（ＮＵＮＣ社）にまき、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１％ ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養し、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを１μＭ〜１００μＭの各濃度で添加後１２時間培養した。その後、上清及びＴＥでディッシュから剥がした細胞を、室温、８００ ｒｐｍで５分間遠心し、上清を取り除いた。細胞を３００ μｌのＰＢＳ（−）で懸濁し再度４℃、２５００ ｒｐｍで５分間遠心して上清を取り除いた。細胞を細胞溶解バッファー ［１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．４）、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ ８．０）、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００］ ３００μｌを加えて細胞溶解させ、氷上に１０分置いてＤＮＡ断片を抽出した。これを４℃、１４０００ｒｐｍで、１０分間遠心し、上清にＲＮａｓｅ Ａを加え、３７℃で１時間温置した。さらにプロテイナーゼＫを加え、５０℃で３０分間温置した。ＤＮＡ断片抽出液をエタノール沈澱によって濃縮し、２％アガロースゲルで電気泳動を行った。ゲルをエチジウムブロミドで染色後、ＵＶトランスイルミネーター下でＤＮＡ断片化を検出した。
【００６５】
それぞれ０μＭ、１μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン存在下で１２時間培養したＣａＣｏ−２細胞において、ＤＮＡラダーを検出したところ、３０μＭ以上の濃度にてラダーが確認された（図１０）。
【００６６】
この結果からも、ＣａＣｏ−２細胞においては、アシル化ホモセリンラクトン３０μＭ以上の濃度でスクリーニングを行うのが好ましいと考えられる。
【００６７】
実施例５ ｃａｓｐａｓｅ 活性の測定
ｃａｓｐａｓｅ（ｃａｓｐａｓｅ−３、ｃａｓｐａｓｅ−９）、ＰＡＲＰ（ｐｏｌｙ−ＡＤＰ ｒｉｂｏｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の活性を、ウェスタンブロット解析により抗−活性型（Ｃｌａｖｅｄ型）ｃａｓｐａｓｅ抗体すなわち、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−３抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９抗体（Ｄ３３０）、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰ 抗体 （Ｄ２１４）をそれぞれ用いて、実施例１と同様に測定した。
【００６８】
培養したＣａＣｏ−２細胞に、終濃度３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンをそれぞれ添加し、経時的に０時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間培養後のｃａｓｐａｓｅ−３、ｃａｓｐａｓｅ−９、ＰＡＲＰ活性をウェスタンブロットにより解析した。結果を図１１に示す。３０μＭでは活性型ｃａｓｐａｓｅ−３は刺激１時間後から検出され、その活性が４時間まで持続したのに対し、１００μＭでは活性が刺激６時間後をピークにして１０時間まで持続した。各メンブレンをリプローブしてＣｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９、Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰを検出した。ｃａｓｐａｓｅ−９活性は３０μＭ刺激では１、２、４時間で活性が強く、微弱な活性が８時間まで持続したのに対し、１００μＭ刺激では強い活性が８時間まで持続した。Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰに関してもＣｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９と同様の挙動を示した。
【００６９】
次に、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンとの３時間の反応を、０、１、１０、３０、１００μＭの各濃度にて行い、ｃａｓｐａｓｅ、ＰＡＲＰ活性を測定した。図１２に示すように、３０μＭ、１００μＭの濃度においてのみＣｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ、Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰが検出された。この結果はウェスタンブロット解析によるＭＡＰキナーゼ活性化、Ａｋｔ活性阻害、生存率低下やアポトーシス細胞出現が３０μＭ以上で顕著に起こったこととも一致した。
【００７０】
実施例６ ＣａＣｏ−２ 細胞における Ｎ−（３− オキソドデカノイル ）−Ｌ− ホモセリンラクトン依存的なアポトーシスに対する各種キナーゼ阻害剤（ ＰＤ９８０５９ 、 ＳＢ２０３５８０ ）の効果
ＣａＣｏ−２細胞を３．５ｃｍ ディッシュ当たり２×１０５個まいて１０％血清存在下で１２時間培養後、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、無血清培地にて２４時間同調培養を行った。各種阻害剤（５０μＭ ＰＤ９８０５９、２０μＭ ＳＢ２０３５８０）又はＤＭＳＯによる前処理を３０分間行い、３０μＭ Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン又はＤＭＳＯを添加して１２時間培養後、Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色により生存率を測定した。結果を図１３に示す。
【００７１】
Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン（３０μＭ）により生存率が９６％から４９％にまで低下した。ＥＲＫ経路の阻害剤であるＰＤ９８０５９（ＭＥＫ阻害剤）の前処理では、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを単独で添加した場合の生存率とほぼ同じ値を示し、ＰＤ９８０５９の前処理による生存率への影響は認められなかった。一方、ｐ３８活性阻害剤であるＳＢ２０３５８０の前処理で、生存率がさらに３５％にまで減少した。
【００７２】
以上の結果より、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン依存的な生存率の低下には、ＥＲＫ、ｐ３８のいずれの経路も関与しないといえる。またｐ３８に関してはむしろ、アポトーシスを誘導するＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンという負の因子に対抗するシグナルとして働くことが示唆された。
【００７３】
【発明の効果】
本発明のスクリーニング方法によって、アシル化ホモセリンラクトンが各種細胞に与える作用を阻害する物質、及び微生物によるバイオフィルムの生成を阻害する物質をスクリーニングすることができる。また、同定されたアシル化ホモセリンラクトン阻害物質を従来の抗菌剤と同時に使えば、バイオフィルムの生成を阻害することにより抗菌剤の効果を数倍〜数十倍高められるため、薬剤耐性を有する細菌に対する抗菌効果を高めることができる。さらにそれによって、難治性感染症をも効果的に治療することができる。また、アシル化ホモセリンラクトン阻害剤により微生物による病原因子の発現をも阻害することができるため、強力な治療効果が期待できる。一方、工業用途においても、本発明の方法によってスクリーニングされたアシル化ホモセリンラクトン阻害剤によって、フィルターパイプの目詰まりを防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣａＣｏ−２細胞におけるＤＭＳＯ、ホモセリンラクトン塩酸塩及びＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性の変化を表す図である。
【図２】ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン濃度依存的なＭＡＰキナーゼ及びＡｋｔ活性の変化を表す図である。
【図３】図２のＭＡＰキナーゼのバンドの強度をＬＡＳ−１０００により定量、数値化した結果を表す図である。
【図４】図２のＡｋｔのバンド強度をＬＡＳ−１０００により定量、数値化した結果を表す図である。
【図５】ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性の経時変化を表す図である。
【図６】ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性の経時変化を表す図である。
【図７】アシル化ホモセリンラクトン存在下における細胞生存率をＴｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色によって評価した結果である。
【図８】アシル化ホモセリンラクトン存在下における細胞のアポトーシスをＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色によるクロマチン凝縮で判定した結果である。
【図９】クロマチン凝縮が観察されたアポトーシス細胞の計数によりアポトーシスの定量を行った結果である。
【図１０】ＣａＣｏ−２の細胞死がアポトーシス又はネクローシスであるかを判定するために、ＤＮＡの断片化を評価した結果である。
【図１１】アシル化ホモセリンラクトン存在下におけるｃａｓｐａｓｅ活性の培養時間依存性を、ウェスタンブロットによって測定した結果である。
【図１２】ｃａｓｐａｓｅ活性のアシル化ホモセリンラクトン濃度依存性を、ウェスタンブロットによって測定した結果である。
【図１３】ＣａＣｏ−２細胞におけるアシル化ホモセリンラクトン依存的なアポトーシスに対する各種キナーゼ阻害剤（ＰＤ９８０５９、ＳＢ２０３５８０）の効果を表す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物における病原因子の発現及びバイオフィルムの生成などの生物活性を阻害する物質をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
自然界において、微生物は様々な環境下で生存しなければならない。貧栄養、低・高温、ｐＨの変化はもちろんのこと、生体内においては貪食細胞又は抗菌性液性因子（補体、抗体、リゾチーム等）が存在する環境での生存を余儀なくされる。このような状況下で、細菌は自らの存在環境の変化を敏感に感知する機構を獲得してきた。そのような機構の１つとして、微生物は特異的な情報伝達物質を介して環境における自らの濃度を感知し、その濃度に応じて自らの様々な生物活性を巧妙に制御していることが明らかとなっている。このような細胞間の情報伝達機構は、クオラムセンシング（Ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ）システムと称される。
【０００３】
クオラムセンシングシステムは、基本的にＩ−遺伝子、Ｒ−遺伝子及び標的遺伝子の３つの遺伝子が担っており、Ｉ−遺伝子はオートインデューサー（ＡＩ）合成酵素をコードし、Ｒ−遺伝子は転写活性化因子をコードしている（非特許文献１参照）。ＡＩ合成酵素により、オートインデューサー、すなわちアシル化ホモセリンラクトンと称される一群の物質が合成される。アシル化ホモセリンラクトンは細菌の外膜を自由に通過できる分子であり、環境中の細菌濃度が低い場合には希釈され生物活性を示さないが、細菌の増殖が進み環境中での菌密度が高まるに従って菌内外のアシル化ホモセリンラクトン濃度も高まり一定の閾値に達すると、アシル化ホモセリンラクトンとＲ−遺伝子産物（転写活性化因子）の結合が加速する。この複合体が標的遺伝子の転写制御領域に結合し、標的遺伝子の発現を促進することにより様々な生物活性物質が発現される。
【０００４】
これまでに、ビブリオ属細菌、緑膿菌、セラチア、エンテロバクターなど臨床上重要な細菌において、アシル化ホモセリンラクトンが上記のクオラムセンシングシステムを介して病原因子の発現を促しているという事実が報告されている。さらには、アシル化ホモセリンラクトンが微生物によるバイオフィルムの生成
に関与していることも明らかとなっている（特許文献１参照）。
【０００５】
バイオフィルムは水のある環境、特に産業設備の導管材料の内側壁面や家庭の配管システムの内側壁面、医療用移植片上の界面に生じ、又は慢性感染症の病巣として生じ、かつ存続する生物の膜である。バイオフィルムは、その定住微生物の分泌した基質ポリマーから構成される有機質のゲル状構造とそれに埋め込まれた微生物とから成っている。バイオフィルムの形成は、配管システムの流れを制限したり又は完全に遮断する場合があり、また、埋め込まれた細菌による腐食作用により材料の寿命を低下させる場合もある。パイブ及び導管表面からのバイオフィルムの調節及び除去は、従来、塩素又は強いアルカリ溶液などの腐食性化学薬品、又は機械的手段を通じて行なわれてきた。このような処置は一般には配管システムと環境の双方にとって苛酷である。微生物の抗菌剤への耐性は、バイオフィルム基質ポリマーの持つ防御特性が大きな原因となっている。医療では、バイオフィルムが関与していると考えられる場合の治療には高用量の抗生物質の利用が必要とされてきた。これは、細胞外の基質ポリマーによりバイオフィルム細菌の防御性が高くなっていることが原因の１つであると考えられている。従って、医療、環境及び産業分野においてバイオフィルム形成を制御する必要ある。
【０００６】
以上に述べたように、病原因子の発現及びバイオフィルムの生成は重大な問題となっており、微生物におけるこれらの生物活性に関与するアシル化ホモセリンラクトンを阻害する物質をスクリーニングする方法が望まれていた。アシル化ホモセリンラクトンは微生物における様々な活性を制御していることから、微生物の生存等を指標としてアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングすることも考えられる。しかし、微生物自体がアシル化ホモセリンラクトンを産生しているためバイアスが生じ、スクリーニング方法として好ましくない。従って、アシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングするためのより有効な方法が望まれていた。
【０００７】
一方、アシル化ホモセリンラクトン分子が動物細胞に与える影響については、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンがヒト肺胞上皮細胞におけるＩＬ−８産生を刺激すること（非特許文献２参照）、本物質がマウスマクロファージ培養系においてＴＮＦ−α及びＩＬ−１２の産生を促進すること（非特許文献３参照）が報告されているに過ぎず、いずれの報告も炎症・免疫応答に関する報告であり、アシル化ホモセリンラクトンが動物細胞におけるＡｋｔの活性化を阻害すること、さらにはアシル化ホモセリンラクトンが動物細胞のアポトーシスを誘導することについては全く知られていなかった。
【０００８】
【特許文献１】
特表２００２−５１４０９２
【非特許文献１】
Ｍａｒｖｉｎ Ｗｈｉｔｅｌｏｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９６， １３９０４−１３９０９，（１９９６）
【非特許文献２】
Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ． Ｐｈｉｐｐｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６７， ３６６−３７４， （２００１）
【非特許文献３】
Ｇａｒｙ Ｔｅｌｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ６６， ３６−４２， （１９９８）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、アシル化ホモセリンラクトンの生物活性を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、下記の式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトンが、動物細胞におけるＡｋｔの活性を阻害し、それによって動物細胞におけるアポトーシスを誘導することを見出した。そして、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養して該細胞におけるＡｋｔ活性の阻害又はＡｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害を検出することにより上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）式Ｉ：
【化３】
で表されるアシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養し、該細胞におけるＡｋｔ活性の阻害又はＡｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害を検出することにより、アシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする方法。
（２）アポトーシスを検出することによって、Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害を検出する（１）に記載の方法。
（３）（１）又は（２）に記載のスクリーニング方法により同定されたアシル化ホモセリンラクトン阻害物質。
（４）（１）又は（２）に記載のスクリーニング方法により同定されたアシル化ホモセリンラクトン阻害剤。
（５）（１）又は（２）に記載のスクリーニング方法に使用するための、以下の要素を含むキット。
ａ）式Ｉ：
【化４】
で表されるアシル化ホモセリンラクトン、
ｂ）動物細胞、及び
ｃ）Ａｋｔ活性測定手段
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において、アシル化ホモセリンラクトンとは、式Ｉ：
【化５】
【００１３】
式Ｉにおける、Ｒは、炭素数４〜３０、好ましくは８〜２０、より好ましくは１０〜１４の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基であり、置換基としては、ヒドロキシル基、オキソ基、メチル基等が挙げられる。非置換の飽和脂肪族アシル基、及び３位にオキソ基を有する飽和脂肪族アシル基が好ましい。また、直鎖状であることが好ましい。
【００１４】
Ｒの具体例としては、特に限定されないが、例えば、ブチリル基、３−オキソブチリル基、３−ヒドロキシブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、３−オキソバレリル基、イソバレリル基、３−オキソイソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、３−オキソヘキサノイル基、ヘプタノイル基、３−オキソヘプタノイル基、オクタノイル基、３−オキソオクタノイル基、ノナノイル基、３−オキソノナノイル基、デカノイル基、３−オキソデカノイル基、ウンデカノイル基、３−オキソウンデカノイル基、ラウロイル基、３−オキソドデカノイル基、トリデカノイル基、３−オキソトリデカノイル基、テトラデカノイル基、３−オキソテトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、３−オキソペンタデカノイル基、パルミトイル基、３−オキソパルミトイル基、ヘプタデカノイル基、３−オキソヘプタデカノイル基、ステアロイル基、３−オキソステアロイル基、ノナデカノイル基、３−オキソノナデカノイル基、イコサノイル基、３−オキソイコサノイル基、トリアコンタノイル基、３−オキソトリアコンタノイル基、ミリストイル基、３−オキソミリストイル基及びピルボイル基等が挙げられる。
【００１５】
式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトンの具体例としては、特に限定されないが、例えば、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソブチリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−ヒドロキシブチリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−イソブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−バレリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソバレリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−イソバレリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソイソバレリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ピバロイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘプタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘプタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−オクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソオクタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ノナノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソノナノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−デカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ウンデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソウンデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−トリデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソトリデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−テトラデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソテトラデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ペンタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソペンタデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−パルミトイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソパルミトイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘプタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘプタデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ステアロイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソステアロイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ノナデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソノナデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−イコサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソイコサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−トリアコンタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソトリアコンタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ミリストイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソミリストイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン及びＮ−ピルボイル−Ｌ−ホモセリンラクトン等が挙げられる。
【００１６】
特に、Ｎ−（３−オキソデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソウンデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソトリデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン及びＮ−（３−オキソテトラデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンが好ましい。
【００１７】
本発明のアシル化ホモセリンラクトンは、例えば、脂肪族カルボン酸又はそのエステルと環状アミノ酸との間にアミド結合を形成させることによって合成することができる。また、アシル化ホモセリンラクトンは、例えば、Ｃｈｈａｂｒａ， Ｓ． Ｒ．， Ｐ． Ｓｔｅａｄ， Ｎ． Ｊ． Ｂａｉｎｔｏｎ， Ｇ． Ｐ． Ｃ． Ｓａｌｍｏｎｄ， Ｇ． Ｓ． Ａ． Ｂ． Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｐ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ａｎｄ Ｂ． Ｗ． Ｂｙｃｒｏｆｔ， Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．， ４６， ４４１−４５４， １９９３、Ｚｈａｎｇ， Ｌ．， Ｐ．Ｊ． Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ． Ｋｅｒｒ， ａｎｄ Ｍ． Ｅ． Ｔａｔｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２， ４４６−４４８， １９９３、ＳｃｈａｅｆｅｒＡ．Ｌ．， Ｂ． Ｌ． Ｈａｎｚｅｌｋａ， Ａ． Ｅｂｅｒｈａｒｄ， ａｎｄ Ｅ． Ｐ． Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７８， ２８９７−２９０１， １９９６、Ｇａｏ， Ｊ． Ｇ． ａｎｄ Ｅ． Ａ． Ｍｅｉｇｈｅｎ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７５， ３８５６−３８６２， １９９３などに記載された方法によって合成できる。
【００１８】
また、本発明のアシル化ホモセリンラクトンは微生物によって生合成されるため、微生物を培養した培養物から当技術分野において通常用いられる方法によって分離精製することもできる。
【００１９】
本発明は、アシル化ホモセリンラクトンが動物細胞におけるＡｋｔ活性を阻害するという知見に基づくものである。
【００２０】
従って、本発明の一実施形態では、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養し、該細胞におけるＡｋｔ活性の阻害を検出することによりアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする。すなわち、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養した場合に、被検物質なしで培養したときに見られたアシル化ホモセリンラクトンのＡｋｔ活性阻害効果が見られなくなれるかあるいは減少すれば、当該被検物質はアシル化ホモセリンラクトン阻害物質であると同定できる。
【００２１】
Ａｋｔ活性の検出は、当技術分野で通常用いられる方法を用いて実施することができ、例えば、抗−リン酸化Ａｋｔ抗体（例えば、Ｂａｕｍａｎｎ ＣＡ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４０７， ２０２−２０７， （２０００）、Ｈｏｌｌａｎｄ ＥＣ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， ２５， ５５−５７， （２０００）を参照されたい）、すなわち抗−活性化Ａｋｔ抗体を用いるウェスタンブロットにより検出することができる。この抗体は、抗原であるリン酸化Ａｋｔに対する反応性及び特異性が高いことから、これを用いることにより非常に効果的にリン酸化Ａｋｔを検出することができる。
【００２２】
Ａｋｔは、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシチド３−ＯＨキナーゼ）の下流で活性化され、生存シグナル伝達経路において重要な役割を担っている。細胞の生死は、アポトーシスシグナル伝達と生存シグナル伝達との拮抗によって制御されている。Ａｋｔはリン酸化されることにより活性型となり、活性型Ａｋｔが細胞におけるアポトーシスを阻害することが報告されている（特表２００２−５２８３９０参照）。
【００２３】
活性型Ａｋｔは、様々な基質を介して細胞の生存を促進することが知られている（実験医学 Ｖｏｌ １９、Ｎｏ．１３（増刊）、ｐ．１１６、２００１年、羊土社）。また、Ａｋｔによる生存促進メカニズムには、１）アポトーシス誘導にかかわる分子を直接リン酸化してアポトーシス誘導能を抑制する経路と、２）転写因子を直接又は間接のターゲットとして、アポトーシス促進分子又は抑制分子の転写を調節することにより生存促進に働く経路とがあることが明らかとなってきている。Ａｋｔは様々な基質を介してアポトーシスを阻害しているため、Ａｋｔ活性の阻害は、Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路を担うその他の分子にも影響を及ぼし、最終的に細胞のアポトーシスをもたらすこととなる。
【００２４】
従って、本発明の別の実施形態では、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養し、Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害を検出することにより、アシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングすることもできる。Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害は、この経路に関与する分子、その活性及び構造、又はその他の分子との結合等を検出することによって行いうる。Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路に関与する分子は、Ａｋｔ活性の阻害によって何らかの影響を受ける分子であれば特に制限されないが、例えば、ｃａｓｐａｓｅ、Ｂａｄ、Ｆｏｒｋｈｅａｄ ｔｒａｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、ＧＳＫ−３等が挙げられる。
【００２５】
ｃａｓｐａｓｅとは、アポトーシスの誘導、決定、実行に決定的な働きをする一群のシステインプロテアーゼファミリーである。ｃａｓｐａｓｅの不活性型前駆体が限定分解により活性化されることで、細胞内においてプロテアーゼのカスケードが形成され、アポトーシスのシグナル伝達が行われる。すなわち、ｃａｓｐａｓｅの活性化はアポトーシスをもたらす。従って、ｃａｓｐａｓｅの活性化は、Ａｋｔによる生存シグナル伝達経路の阻害を意味する。すなわち、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養した場合に、被検物質なしで培養したときに見られたアシル化ホモセリンラクトンのｃａｓｐａｓｅ活性化効果が見られなくなるかあるいは減少すれば、当該被検物質はアシル化ホモセリンラクトン阻害物質であると同定できる。
【００２６】
ｃａｓｐａｓｅのうちｃａｓｐａｓｅ−３は最も高い酵素活性をもち、ＤＮＡ断片化因子のほか、細胞を構築する様々なタンパク質を基質としてアポトーシスを実行する。ｃａｓｐａｓｅ−９は、アポトーシス誘導刺激により障害を受けたミトコンドリアからチトクロームｃが放出されＡｐａｆ−１・チトクロームｃ・ｐｒｏ ｃａｓｐａｓｅ−９の多量体化が促されることにより活性化される。ｃａｓｐａｓｅ−９がＡｋｔによって直接リン酸化され、その活性化が阻害されることも報告されている。ｃａｓｐａｓｅ活性は、当技術分野で通常用いられる方法によって測定でき、例えば、ウェスタンブロットにより測定することができる。
【００２７】
また、ＭＡＰキナーゼスーパーファミリーメンバーのうちＪＮＫ及びｐ３８は、アポトーシスを誘導する様々な物理化学的ストレスによって活性化されることが明らかとなっており、ＭＡＰキナーゼがアポトーシスに関与することが示唆されている。ＭＡＰキナーゼとは、細胞が細胞増殖因子などの外界刺激を受けたとき、トレオニン残基とチロシン残基の両アミノ酸残基のリン酸化によって活性化されるセリン−トレオニンキナーゼの一群であり、酵母から高等動物まで真核生物に普遍的に存在する。本酵素は、単量体の触媒サブユニットからなるタンパク質キナーゼ分子である。そのアミノ酸配列は進化的に高度に保存されており、細胞増殖及び分子を制御する細胞内シグナル伝達の中枢の一翼を担っている。本発明者らは、アシル化ホモセリンラクトンによってＭＡＰキナーゼの活性化、すなわちリン酸化が促進されることを見出した。従って、本発明の一実施形態では、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養し、該細胞におけるＭＡＰキナーゼの活性を測定することにより、アシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングすることもできる。本発明においては、ＭＡＰキナーゼスーパーファミリーのうち、ＥＲＫ、ｐ３８及びＪＮＫの活性を検出するのが好ましい。ＭＡＰキナーゼの活性は、例えば、Ａｋｔと同様に活性化ＭＡＰキナーゼ（リン酸化ＭＡＰキナーゼ）をウェスタンブロット等で測定することによって検出できる。すなわち、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養した場合に、被検物質なしで培養したときに見られたアシル化ホモセリンラクトンのＭＡＰキナーゼ活性化効果が見られなくなるかあるいは減少すれば、当該被検物質はアシル化ホモセリンラクトン阻害物質であると同定できる。
【００２８】
Ａｋｔ活性の阻害は、最終的にアポトーシスをもたらすことから、本発明において「Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害の検出」には、アポトーシスの検出も包含される。
【００２９】
本発明において、アポトーシスとは当技術分野で通常用いられる意味を有し、すなわち、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死を意味する。アポトーシスの形態は、細胞核の染色体凝集、ＤＮＡの断片化、細胞表層微絨毛の消失、クロマチンの凝縮を特徴とする。細胞は萎縮し、細胞の内容物が細胞外に放出されずにマクロファージなどの周囲の細胞にすみやかに取り込まれるので、炎症が引き起こされず、周囲の細胞に影響を与えない。一方、環境の悪化から引き起こされるネクローシス（壊死）は、細胞の内容物が放出される点でアポトーシスとは大きく異なる。
【００３０】
本発明において動物細胞におけるアポトーシスを検出する方法としては、当技術分野で通常用いられるものを使用することができ、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡ結合性蛍光色素アミノベンズイミド（ヘキスト３３３４２、３３５８２及び３３３２５８など）などによる染色後に蛍光顕微鏡でクロマチン凝縮を観察する方法、断片化したＤＮＡを遠心などにより抽出分離してアガロースゲル電気泳動及び比色法などによって定量する方法、断片化したＤＮＡを組織化学的に検出するＴＵＮＥＬ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｂｉｏｔｉｎ−ｄＵＴＰ Ｎｉｃｋ Ｅｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ）法、並びにＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色により細胞生存率を測定する方法などが挙げられる。
【００３１】
本発明において、アシル化ホモセリンラクトン阻害物質とは、アシル化ホモセリンラクトンの各種細胞、特に動物細胞及び微生物に対する作用を阻害する物質、該作用に対する拮抗物質、アシル化ホモセリンラクトンの分泌を阻害する物質及びアシル化ホモセリンラクトンを分解する物質のいずれをも意味する。アシル化ホモセリンラクトンの各種細胞に対する作用としては、特に限定されないが、例えば、Ａｋｔ活性を阻害する作用、アポトーシスを誘導する作用、細胞による病原因子の発現を誘導する作用及び微生物によるバイオフィルムの生成を誘導する作用などが含まれる。
【００３２】
本発明はまた、動物細胞を用いてアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングすることを特徴とする。細菌などの微生物を用いてアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする場合は、細菌自体がアシル化ホモセリンラクトンを産生するためバイアスがかかるが、動物細胞はアシル化ホモセリンラクトンを産生しないため、信頼性の高いスクリーニングを実施できる。本発明において用いることができる動物細胞は、特に限定されないが、例えば、哺乳動物、鳥類由来の細胞を使用することができ、哺乳動物、特にヒト由来の細胞を使用するのが好ましい。また、上皮組織、特に腸管粘膜上皮組織由来の細胞（例えば、ＣａＣｏ−２：ヒト大腸癌カルチノーマ細胞）、内皮細胞、特に血管内皮細胞（例えば、ＰＥＣ：ブタ胸部大動脈由来内皮細胞）及び線維芽細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３：マウス胎児由来線維芽細胞）を使用するのが好ましい。また、パイエル板をはじめとする腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）を覆う腸管粘膜上皮層には、特殊に分化したＭ細胞と呼ばれる粘膜上皮細胞が点在し、食餌性抗原や腸内細菌などを積極的に取り込んで免疫組織に提供することにより、腸管局所及び全身の免疫応答調節に重要な役割を果たしている。従って、腸上皮は微生物産生物質との接触が想定される場であり、腸管粘膜上皮組織由来細胞を用いてアシル化ホモセリンラクトンの直接的作用を検討することは、実際の動物生体内で起こりうる現象として捉えることができる。また、動物細胞のなかでも癌細胞を用いるのが好ましい。
【００３３】
本発明のスクリーニング方法では、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、動物細胞を被検物質とともに培養することにより、アシル化ホモセリンラクトンによる刺激を行う。刺激のための培養時間は、アシル化ホモセリンラクトンの濃度、使用する検出方法及び動物細胞の種類に依存するが、通常、２分〜７２時間程度である。
【００３４】
Ａｋｔ活性を測定することによってスクリーニングを行う実施形態では、アシル化ホモセリンラクトンの存在下で動物細胞を培養すると、Ａｋｔ活性は、培養開始から数時間減少するが、その後基底レベルまで戻ることが示されている（実施例１（３）参照）。従って、本発明のスクリーニング方法においては、予め対照として被検物質の不在下でアシル化ホモセリンラクトンとともに動物細胞を培養し、活性型Ａｋｔが減少を示す培養時間を測定し、続いて、該時間の範囲内で、被検物質の存在下アシル化ホモセリンラクトンとともに動物細胞を培養することが好ましい。この場合の培養時間もアシル化ホモセリンラクトンの濃度及び使用する動物細胞の種類に依存するが、通常、２分〜２時間時間程度である。
【００３５】
ｃａｓｐａｓｅ活性を測定することによってスクリーニングを行う実施形態においても、アシル化ホモセリンラクトンの存在下で動物細胞を培養すると、ｃａｓｐａｓｅ活性は培養開始から数時間増加するが、その後基底レベルまで戻ることが示されている（実施例５参照）。従って、この場合も同様に、予め対照として被検物質の不在下でアシル化ホモセリンラクトンとともに動物細胞を培養し、活性型ｃａｓｐａｓｅが減少を示す培養時間を測定することが好ましい。この場合の培養時間もアシル化ホモセリンラクトンの濃度及び使用する動物細胞の種類に依存するが、通常、１〜８時間程度である。
【００３６】
アシル化ホモセリンラクトンによるＭＡＰキナーゼの活性化においても同様に、アシル化ホモセリンラクトンの存在下で培養を行うと、ＭＡＰキナーゼは一度活性化された後で時間の経過とともに基底レベルに戻る。この場合の培養時間もアシル化ホモセリンラクトンの濃度及び使用する動物細胞の種類に依存するが、通常、２分〜６時間程度である。
【００３７】
アポトーシスを検出することによってスクリーニングを行う場合の培養時間は、通常、６〜７２時間程度である。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法において、共存させるアシル化ホモセリンラクトンの濃度は、通常、１〜５００μＭ、好ましくは２０〜２００μＭ、より好ましくは３０〜１００μＭである。
【００３９】
より具体的には、ヒト由来腸管粘膜上皮細胞を用い、Ａｋｔ活性を指標にしてアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする場合は、１０μＭ以上、好ましくは３０〜２００μＭのアシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を２分〜２時間、好ましくは２〜６０分程度培養するのが好ましいと考えられる。そして、この培養時間の範囲内で本来見られるはずのＡｋｔ活性阻害がみられなかったときあるいはその活性阻害が減少したときは、その被検物質はアシル化ホモセリンラクトン阻害物質であると同定できる。
【００４０】
ヒト由来腸管粘膜上皮細胞を用い、ＥＲＫ活性を指標にしてアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする場合は、１０μＭ以上、好ましくは３０〜２００μＭのアシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を２〜３０分、好ましくは５〜１５分程度培養するのが好ましいと考えられる。ヒト由来腸管粘膜上皮細胞を用い、ｐ３８活性を指標にしてアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする場合は、１０μＭ以上、好ましくは３０〜２００μＭのアシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を５分〜６時間、好ましくは５〜６０分程度培養するのが好ましいと考えられる。
【００４１】
本発明のスクリーニング方法においては、動物細胞の培養において通常用いられる培地を使用することができ、特に制限されない。例えば、ＤＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地等があげられる。その他の培養条件も、動物細胞の培養において通常用いられる条件を使用することができる。
【００４２】
本発明では、上記時間にわたって動物細胞を培養した後、例えば培養細胞を急冷することによって反応を停止する。その後、上記のような方法により動物細胞におけるＡｋｔ活性、ｃａｓｐａｓｅ活性及びアポトーシス等を検出する。反応をすぐに停止するために、溶媒を除去してもよい。
【００４３】
本発明によってスクリーニングされる被検物質が含まれうる試料としては、特に限定されないが、動物（カビ、放射菌等の微生物を含む）及び植物の抽出物、並びに人工合成物が挙げられる。
【００４４】
本発明はまた、上記のようなスクリーニング方法によって同定されたアシル化ホモセリンラクトン阻害物質に関する。このような物質としては、特に限定されず、天然物及び合成物の双方が含まれる。本発明のアシル化ホモセリンラクトン阻害物質は、単独で、又は従来の抗菌剤とともに抗菌剤として使用することができる。本発明のアシル化ホモセリンラクトン阻害物質は、バイオフィルムの生成を阻害できることから、薬剤耐性を獲得した細菌に対しても、抗菌作用を増強できる点において有利である。本発明のアシル化ホモセリンラクトン阻害物質とともに用いることができる公知の抗菌剤としては、特に限定されないが、例えば、ペニシリン（ペナム）系抗生物質、セファロスポリン（セフェム）系抗生物質、オキサセフェム系抗生物質、ペネム系抗生物質、カルバペネム系抗生物質、モノバクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、クロラムフェニコール系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、グリコペプチド系抗生物質、ホスホマイシン系抗生物質、リンコマイシン系抗生物質、サルファ剤、パラアミノサリチル酸製剤、イソニコチン酸ヒドラジド製剤及びキノロン系合成抗菌剤などを挙げることができる。
【００４５】
本発明の方法によってスクリーニングされたアシル化ホモセリンラクトン阻害剤は、バイオフィルム阻害剤、並びにフィルター及びパイプにおける目詰まり防止剤として使用できる。また、本発明のアシル化ホモセリンラクトン阻害剤は、微生物における病原因子の発現を阻害することから、感染症治療剤として使用することもできる。
【００４６】
本発明はまた、上記のようなスクリーニング方法に用いるためのキットに関する。該キットは、例えば、式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトン、動物細胞及び該動物細胞におけるＡｋｔ活性測定手段を含む。Ａｋｔ活性測定手段とは、例えば、抗−リン酸化Ａｋｔ抗体と該抗体に対する標識２次抗体などである。標識２次抗体としては、当技術分野で通常用いられるもの、例えば、ＨＲＰ標識抗−ウサギＩｇＧ抗体、ＨＲＰ標識抗−マウスＩｇＧ抗体などを使用できる。
【００４７】
【実施例】
以下の実施例において実験材料は、特に他に記載がない限り、以下に記載のものを使用した。
【００４８】
細胞培養に用いたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）はＳＩＧＭＡ社から購入した。Ｎ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）の溶媒として用いたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は和光純薬工業株式会社のものを使用した。キナーゼ阻害剤であるＰＤ９８０５９、ＳＢ２０３５８０はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社から購入した。タンパク質の定量には、ＰＩＥＲＣＥ社のＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを使用した。抗体については以下の会社のものを使用した。抗−リン酸化−ｐ４４／４２ ＭＡＰキナーゼ抗体、抗−リン酸化−ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ抗体、抗−リン酸化−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ 抗体、抗−リン酸化−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３） 抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−３ 抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９（Ｄ３３０）抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰ（Ｄ２１４）抗体、ＨＲＰ標識抗−ウサギＩｇＧ抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社。ｃ−Ｍｙｃマウスモノクローナル抗体、ＨＲＰ標識抗−マウスＩｇＧ抗体はＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社。抗−α−チューブリン抗体（Ａｂ−１）はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社。
【００４９】
実施例１ Ａｋｔ 活性のウェスタンブロットによる解析
（１）ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性の変化
ヒト大腸癌カルチノーマ細胞株ＣａＣｏ−２はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入し、１０％ ＦＣＳ、１％ ＮＥＡＡ、１％ Ｐ／Ｓ（１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％ ＣＯ２存在下で培養した。
【００５０】
６ｃｍ ディッシュ（ＮＵＮＣ社）を用いて、１ ディッシュ当たりＣａＣｏ−２細胞を６×１０５個まき、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）（−）で２回洗浄後、１％ ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。その後、終濃度１００μＭでホモセリンラクトン塩酸塩、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンをそれぞれ添加し、１０分間反応させた。なお、精製されたアシル化ホモセリンラクトンは、目的とする終濃度の４００倍になるようＤＭＳＯに溶解し、フィルター滅菌（φ０．２２μｍ）を行ったものを使用した。対照として終濃度０．２５ ％のＤＭＳＯを使用した。また、内部標準としてα−チューブリンを用いた。
【００５１】
反応後、冷ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、−８０℃で凍結させた。氷上で細胞を融解し、溶解バッファー（５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％ グリセリン、１０ ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１００ ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン）を２００μｌ加え、スクレーパーで細胞を剥ぎ取った。これを氷上で２０分間静置し、その後１４０００ ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を回収した。回収したタンパク質の濃度を測定し、５０μｇ相当をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後ＰＶＤＦメンブレンにブロットした。リン酸化ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、Ａｋｔを測定する場合は、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含む５％ スキムミルク／Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水でブロッキングを行い、１次抗体にそれぞれ、抗−リン酸化−ｐ４４／４２ ＭＡＰキナーゼ抗体、抗−リン酸化−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ抗体、抗−リン酸化−ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体、抗−リン酸化−Ａｋｔ （Ｓｅｒ４３７） 抗体を、２次抗体にはＨＲＰ標識抗−ウサギＩｇＧ抗体を用いた。内部標準として使用したα−チューブリンは、ブロッキングを５％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＴＢＳ−Ｔで行い、１次抗体は抗−α−チューブリン（Ａｂ−１）、２次抗体にはＨＲＰ標識抗−マウスＩｇＧ抗体を用いた。バンドの検出にはＲｅｎａｉｓｓａｎｃｅＴＭ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ２５５８６１ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ（ＮＥＮ社）又は、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｌｕｍｉｎｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を使用した。結果を図１に示す。なお以下で言及する図中において、３−ｏｘｏ−Ｃ１２−ＨＳＬとは、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを意味する。
【００５２】
ＭＡＰキナーゼ活性に関しては、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを添加した場合のみ、ＥＲＫ、ｐ３８、ＪＮＫの活性化が促進された。一方、ＣａＣｏ−２細胞においてＡｋｔは通常リン酸化（活性化）された状態にあるが、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンによりＡｋｔのリン酸化レベルが著しく低下した。
【００５３】
以上から、アシル化ホモセリンラクトンがＥＲＫ、ｐ３８、ＪＮＫの活性化を促進し、一方、Ａｋｔの活性化を阻害することが明らかとなった。
【００５４】
（２）ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン濃度依存的なＭＡＰキナーゼ及びＡｋｔ活性の変化
細胞培養後、終濃度０μＭ（０．２５％ ＤＭＳＯ）、１μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソ−ドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンをそれぞれ添加して、１０分間反応させること以外は、（１）と同様にして、ＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性をウェスタンブロットにより解析した（図２）。
【００５５】
図２のバンドの強度をＬＡＳ−１０００により定量、数値化した結果をそれぞれ図３、図４に示す。１０μＭ以上の濃度でＥＲＫ、ｐ３８のリン酸化レベルが有意に増大した。１０μＭ、３０μＭ、１００μＭでは、それぞれＥＲＫ活性が１．５、７．７、９．８倍に、ｐ３８活性が３．２、４．４、５．４倍になった。ＪＮＫ活性については濃度依存的な有意差が認められなかった。Ａｋｔの活性阻害についても同様に１０μＭから起こり、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭではそれぞれ無刺激時の７９％、３１％、１４％にまで活性が低下した。
【００５６】
以上から、ＣａＣｏ−２細胞では、アシル化ホモセリンラクトン１０μＭ以上で、Ａｋｔの活性が有意に阻害されることがわかる。また、アシル化ホモセリンラクトン１０μＭ以上でＥＲＫ、ｐ３８及びＪＮＫが活性化されることがわかる。
【００５７】
（３）ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性の経時変化
細胞培養後、終濃度３０μＭ及び１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを添加し、それぞれアシル化ホモセリンラクトンによる刺激時間を０、５、１０、３０、６０分の短いタイムコース（図５）、０、１０分、６０分、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間の長いタイムコース（図６）で行った他は、（１）と同様にして、ウェスタンブロットによりＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性を測定した。３０μＭ刺激ではＥＲＫ、ｐ３８活性はともに１０分をピークに上昇したが、ＥＲＫ活性が３０分で基底レベルに戻ったのに対し、ｐ３８は４時間までその活性が持続した。３０μＭ刺激時のＡｋｔの活性阻害は５分をピークに６０分まで持続し、２時間で基底レベルに戻った。１００μＭ刺激ではＥＲＫ活性化が２段階で起こった。すなわち、１段階目は５分をピークにして２時間で基底レベルに戻り、２段階目は４時間から活性が上昇しはじめ、８時間をピークにして１０時間で基底レベルに戻るというものであった。この２段階目のＥＲＫ活性化はＤＮＡ損傷後のものと考えられる。一方、１００μＭ刺激時のｐ３８活性化は、５分をピークにしてその活性が８時間まで持続し、Ａｋｔ活性阻害は５分をピークにして６時間まで持続した。
【００５８】
実施例２ Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ 染色による生存率の評価
３．５ｃｍ ディッシュ（ＮＵＮＣ社）に、ＣａＣｏ−２細胞を２×１０５ 個まき、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１％ ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。各種薬剤 ［終濃度１〜１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを添加し、１２時間培養した。対照として０．２５％ ＤＭＳＯを使用した。その後、上清及びトリプシン−ＥＤＴＡ（ＴＥ）でディッシュから剥がした細胞を、室温、８００ ｒｐｍで５分間遠心後、上清を取り除き、２００μｌのＤＭＥＭにて希釈した。うち５０μｌをエッペンチューブにとり、等量のＴｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色液を加え、細胞数を血球計測盤にて測定した。このとき、測定対象とする死細胞数と生細胞数の合計を２００個以上とした。
【００５９】
Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン濃度依存的に生存率の有意な低下が認められた。１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンにより、生存率がそれぞれ９０％、５５％、５１％にまで低下した（図７）。この３０μＭ以上の濃度において有意に生存率を低下させるという結果は、ウェスタンブロット解析においてＭＡＰキナーゼ活性増加及びＡｋｔ活性阻害が３０μＭ前後で顕著に見られたこととも一致する。また対照及び０．２５％ ＤＭＳＯ添加時の生存率はともに９４％であり、１μＭ Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激時の生存率が９４ ％であることからＤＭＳＯの生存率への影響は無視できるものと考えられる。
【００６０】
実施例３ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２ 染色によるクロマチン凝縮の観察とアポトーシスの判定
実施例２で観察されたＣａＣｏ−２の細胞死がアポトーシス又はネクローシスであるかを判定すべく、クロマチン染色の蛍光色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて形態学的に評価した。
【００６１】
８ウェル培養スライド（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ ｃｅｌｌ ｗａｒｅ ｂｉｏｃｏａｔ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ）に、ＣａＣｏ−２細胞を２×１０４個まき、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１％ ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。３−オキソ−ドデカノイルホモセリンラクトンを各濃度（１〜１００μＭ）にて添加し１２時間培養後、細胞を４％ パラホルムアルデヒド−３％ スクロース／ＰＢＳにて固定し、蛍光色素ヘキスト３３３４２を用いてクロマチン染色を行い、蛍光顕微鏡下で観察した。倍率４００倍にて５視野をランダムに選び、アポトーシス細胞と正常細胞を計数、アポトーシス細胞の割合を算出し、これをｎ＝１として３回以上試行した。
【００６２】
Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン１０μＭ以上の濃度で、クロマチン凝縮を起こしたアポトーシス細胞が観察された。しかし０．２５％ ＤＭＳＯ、１μＭ Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンでは正常細胞のみが観察された（図８）。クロマチン凝縮が観察されたアポトーシス細胞の計数によりアポトーシスの定量を行った結果を図９に示す。全細胞数に対するアポトーシス細胞の割合は、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンでそれぞれ１５％、３９％、５０％であった。この値は生存低下率とも一致する。したがって、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンによるＣａＣｏ−２の細胞死はアポトーシスによるものと判定された。
【００６３】
実施例４ ＤＮＡ 断片化によるアポトーシスの評価
実施例２で観察されたＣａＣｏ−２の細胞死がアポトーシス又はネクローシスであるかを判定するための別法として、ＤＮＡの断片化を評価した。
【００６４】
ＣａＣｏ−２細胞を５×１０６個／１５ ｃｍ ディッシュ（ＮＵＮＣ社）にまき、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１％ ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養し、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを１μＭ〜１００μＭの各濃度で添加後１２時間培養した。その後、上清及びＴＥでディッシュから剥がした細胞を、室温、８００ ｒｐｍで５分間遠心し、上清を取り除いた。細胞を３００ μｌのＰＢＳ（−）で懸濁し再度４℃、２５００ ｒｐｍで５分間遠心して上清を取り除いた。細胞を細胞溶解バッファー ［１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．４）、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ ８．０）、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００］ ３００μｌを加えて細胞溶解させ、氷上に１０分置いてＤＮＡ断片を抽出した。これを４℃、１４０００ｒｐｍで、１０分間遠心し、上清にＲＮａｓｅ Ａを加え、３７℃で１時間温置した。さらにプロテイナーゼＫを加え、５０℃で３０分間温置した。ＤＮＡ断片抽出液をエタノール沈澱によって濃縮し、２％アガロースゲルで電気泳動を行った。ゲルをエチジウムブロミドで染色後、ＵＶトランスイルミネーター下でＤＮＡ断片化を検出した。
【００６５】
それぞれ０μＭ、１μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン存在下で１２時間培養したＣａＣｏ−２細胞において、ＤＮＡラダーを検出したところ、３０μＭ以上の濃度にてラダーが確認された（図１０）。
【００６６】
この結果からも、ＣａＣｏ−２細胞においては、アシル化ホモセリンラクトン３０μＭ以上の濃度でスクリーニングを行うのが好ましいと考えられる。
【００６７】
実施例５ ｃａｓｐａｓｅ 活性の測定
ｃａｓｐａｓｅ（ｃａｓｐａｓｅ−３、ｃａｓｐａｓｅ−９）、ＰＡＲＰ（ｐｏｌｙ−ＡＤＰ ｒｉｂｏｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の活性を、ウェスタンブロット解析により抗−活性型（Ｃｌａｖｅｄ型）ｃａｓｐａｓｅ抗体すなわち、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−３抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９抗体（Ｄ３３０）、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰ 抗体 （Ｄ２１４）をそれぞれ用いて、実施例１と同様に測定した。
【００６８】
培養したＣａＣｏ−２細胞に、終濃度３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンをそれぞれ添加し、経時的に０時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間培養後のｃａｓｐａｓｅ−３、ｃａｓｐａｓｅ−９、ＰＡＲＰ活性をウェスタンブロットにより解析した。結果を図１１に示す。３０μＭでは活性型ｃａｓｐａｓｅ−３は刺激１時間後から検出され、その活性が４時間まで持続したのに対し、１００μＭでは活性が刺激６時間後をピークにして１０時間まで持続した。各メンブレンをリプローブしてＣｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９、Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰを検出した。ｃａｓｐａｓｅ−９活性は３０μＭ刺激では１、２、４時間で活性が強く、微弱な活性が８時間まで持続したのに対し、１００μＭ刺激では強い活性が８時間まで持続した。Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰに関してもＣｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９と同様の挙動を示した。
【００６９】
次に、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンとの３時間の反応を、０、１、１０、３０、１００μＭの各濃度にて行い、ｃａｓｐａｓｅ、ＰＡＲＰ活性を測定した。図１２に示すように、３０μＭ、１００μＭの濃度においてのみＣｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ、Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰが検出された。この結果はウェスタンブロット解析によるＭＡＰキナーゼ活性化、Ａｋｔ活性阻害、生存率低下やアポトーシス細胞出現が３０μＭ以上で顕著に起こったこととも一致した。
【００７０】
実施例６ ＣａＣｏ−２ 細胞における Ｎ−（３− オキソドデカノイル ）−Ｌ− ホモセリンラクトン依存的なアポトーシスに対する各種キナーゼ阻害剤（ ＰＤ９８０５９ 、 ＳＢ２０３５８０ ）の効果
ＣａＣｏ−２細胞を３．５ｃｍ ディッシュ当たり２×１０５個まいて１０％血清存在下で１２時間培養後、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、無血清培地にて２４時間同調培養を行った。各種阻害剤（５０μＭ ＰＤ９８０５９、２０μＭ ＳＢ２０３５８０）又はＤＭＳＯによる前処理を３０分間行い、３０μＭ Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン又はＤＭＳＯを添加して１２時間培養後、Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色により生存率を測定した。結果を図１３に示す。
【００７１】
Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン（３０μＭ）により生存率が９６％から４９％にまで低下した。ＥＲＫ経路の阻害剤であるＰＤ９８０５９（ＭＥＫ阻害剤）の前処理では、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを単独で添加した場合の生存率とほぼ同じ値を示し、ＰＤ９８０５９の前処理による生存率への影響は認められなかった。一方、ｐ３８活性阻害剤であるＳＢ２０３５８０の前処理で、生存率がさらに３５％にまで減少した。
【００７２】
以上の結果より、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン依存的な生存率の低下には、ＥＲＫ、ｐ３８のいずれの経路も関与しないといえる。またｐ３８に関してはむしろ、アポトーシスを誘導するＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンという負の因子に対抗するシグナルとして働くことが示唆された。
【００７３】
【発明の効果】
本発明のスクリーニング方法によって、アシル化ホモセリンラクトンが各種細胞に与える作用を阻害する物質、及び微生物によるバイオフィルムの生成を阻害する物質をスクリーニングすることができる。また、同定されたアシル化ホモセリンラクトン阻害物質を従来の抗菌剤と同時に使えば、バイオフィルムの生成を阻害することにより抗菌剤の効果を数倍〜数十倍高められるため、薬剤耐性を有する細菌に対する抗菌効果を高めることができる。さらにそれによって、難治性感染症をも効果的に治療することができる。また、アシル化ホモセリンラクトン阻害剤により微生物による病原因子の発現をも阻害することができるため、強力な治療効果が期待できる。一方、工業用途においても、本発明の方法によってスクリーニングされたアシル化ホモセリンラクトン阻害剤によって、フィルターパイプの目詰まりを防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣａＣｏ−２細胞におけるＤＭＳＯ、ホモセリンラクトン塩酸塩及びＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性の変化を表す図である。
【図２】ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン濃度依存的なＭＡＰキナーゼ及びＡｋｔ活性の変化を表す図である。
【図３】図２のＭＡＰキナーゼのバンドの強度をＬＡＳ−１０００により定量、数値化した結果を表す図である。
【図４】図２のＡｋｔのバンド強度をＬＡＳ−１０００により定量、数値化した結果を表す図である。
【図５】ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性の経時変化を表す図である。
【図６】ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性の経時変化を表す図である。
【図７】アシル化ホモセリンラクトン存在下における細胞生存率をＴｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色によって評価した結果である。
【図８】アシル化ホモセリンラクトン存在下における細胞のアポトーシスをＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色によるクロマチン凝縮で判定した結果である。
【図９】クロマチン凝縮が観察されたアポトーシス細胞の計数によりアポトーシスの定量を行った結果である。
【図１０】ＣａＣｏ−２の細胞死がアポトーシス又はネクローシスであるかを判定するために、ＤＮＡの断片化を評価した結果である。
【図１１】アシル化ホモセリンラクトン存在下におけるｃａｓｐａｓｅ活性の培養時間依存性を、ウェスタンブロットによって測定した結果である。
【図１２】ｃａｓｐａｓｅ活性のアシル化ホモセリンラクトン濃度依存性を、ウェスタンブロットによって測定した結果である。
【図１３】ＣａＣｏ−２細胞におけるアシル化ホモセリンラクトン依存的なアポトーシスに対する各種キナーゼ阻害剤（ＰＤ９８０５９、ＳＢ２０３５８０）の効果を表す図である。
Claims (5)
- 式Ｉ：
で表されるアシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養し、該細胞におけるＡｋｔ活性の阻害又はＡｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害を検出することにより、アシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする方法。 - アポトーシスを検出することによって、Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害を検出する請求項１に記載の方法。
- 請求項１又は２に記載のスクリーニング方法により同定されたアシル化ホモセリンラクトン阻害物質。
- 請求項１又は２に記載のスクリーニング方法により同定されたアシル化ホモセリンラクトン阻害剤。
- 請求項１又は２に記載のスクリーニング方法に使用するための、以下の要素を含むキット。
ａ）式Ｉ：
で表されるアシル化ホモセリンラクトン、
ｂ）動物細胞、及び
ｃ）Ａｋｔ活性測定手段
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2003
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