MX2007012844A - Metodo in vitro para la deteccion simultanea e identificacion de antibioticos de diferentes clases y equipo diagnostico correspondiente. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un equipo diagnostico para el ensayo simultaneo de antibioticos de diferentes clases, que comprende: una mezcla de reaccion unica que contiene al menos un primer receptor marcado, especifico para el reconocimiento de ??-lactamos, un segundo receptor marcado , que especificamente y competitivamente identifica una tetraciclina y un fragmento de acido nucleico biotinilado, un anticuerpo antisulfamida y un analogo de sulfamida marcado; y un sistema de recuperacion en la forma de un soporte solido que comprende una membrana de nitrocelulosa sobre el cual se fijan tres zonas de prueba separadas, respectivamente un antibiotico con un nucleo de ??-lactamo, una avidina y un anticuerpo capaz de identificar de manera especifica el anticuerpo antisulfamida, de manera que la intensidad de marcado detectada sobre el sistema de recuperacion en las tres zonas de prueba resulta independientemente a partir de un reconocimiento competitivo de cada antibiotico por su receptor marcado.

Description

MÉTODO IN VITRQ PARA LA DETECCIÓN SIMULTANEA E IDENTIFICACIÓN DE ANTIBIÓTICOS DE DIFERENTES CLASES Y EQUIPO DIAGNOSTICO CORRESPONDIENTE ANTECEDENTES DE LA DNVENCiON La presente invención se refiere un método para producir una colección de diversas moléculas para reconocimiento biológico que son específicamente capaces de detectar varios analitos distintos con alta sensibilidad para reaccionar de manera simultánea en una mezcla de reacción única y para determinar la clase de analitos a los cuales cada uno de los compuestos detectados pertenece, con la condición de que el principio del reconocimiento específico de una clase dada de analitos no pueda interferir con el ppncipio de reconocimiento específico de otra clase de anali icos. La invención también se refiere al equipo diagnóstico especialmente diseñado para implementar el método.

TÉCNICA ANTECEDENTE Un principio fundamental que gobierna las buenas prácticas de monitoreo y de control de la cadena de alimentos requiere lleyar a cabo análisis de control tan arriba como sea posible a partir de la prod ucícíón con el objeto de ser capaz de identificar y aislar tan rápidamente como sea posible y los productos alimenticios que se sospecha que están contaminados. Como una regla general, cuando se llevan a cabo pruebas, frecuentemente denominadas pruebas "de análisis", una muesCra que fue detectada como positiva durante un primer análisis de monitoreo solamente se asume de hecho que es realmente positiva y tendrá que ser sometida a una segunda prueba denominada prueba "de confirmación". Por otra parte, si una prueba1 de análisis inicial produce un resultado negativo, esto es suficiente y no se necesitan análisis adicionales para confirmar de nuevo el resultado(1). La primera consecuencia de esta regla es que el primer método de análisis debe ser capaz de manejar la detección de un número máximo de compuestos. Las pruebas de detección o de análisis deben ser preferiblemente y lógicamente "pruebas de múltiples analitos". Una segunda consecuencia de esta regla es que es importante conocer la clase a la cual pertenece el compuesto descubierto en una muestra positiva durante la prueba de análisis de manera que sea capaz qe cambiar directamente hacia el método de confirmación el cual normalmente es muy específico puesto que se recomienda que el compuesto referido sea aislado e identificado. Una tercera consecuencia de esta regla es que una prueba de análisis, no puede dar resultados de tipo "falso negativo" puesto que éstos eludirán entonces el análisis en esta etapa preliminar y no serán confirmados posteriormente.

Actualmente se conocen varios métodos para la detección de antibióticos: las pruebas microbiológicas que miden el poder nhibidor de una muestra sobre el crecimiento de una cepa bacteriana. Este tipo de prueba requiere un periodo de incubación relativamente largo (entre 3 y 6 horas) antes de obtener el resultado. En general, estas pruebas (Delvotest® SP, prueba BRT, Copan™, Eclipse™, Valió™) pueden reconocer simultáneamente varias clases de antibióticos puesto que las cepas bacterianas utilizadas frecuentemente son sensibles a varios compuestos de diferentes clases. Sin embargo, este tipo de prueba no permite identificar la clase precisa a la cual pertenece el compuesto antibióticos evaluado; - las pruebas de funcionamiento in vitro, en el caso de la detección de pequeñas moléculas, de conformidad con el principio de la competencia entre el compuesto buscado que está presente en una muestra y un competidor marcado que fue deliberadamente introducido dentro de la muestra para un sitio de reconocimiento único que puede ser ya sea un receptor o un antibiótico. En una formulación del tipo ELISA (por sus siglas en inglés de Ensayo Inmuno Sorbente Asociado a Enzima) o RÍA (por sus siglas en ingles de Radio Inmuno Ensayo )/RRA (por sus siglas en inglés de Ensayo de Radió Receptor), el tiempo requerido para un análisis es del orden de 2 a 6 horas. Algunos de estos métodos, en particular los métodos de laboratorio de RRA, permiten la detección simultánea de varios compuestos de diferentes clases. Sin embargo, en este caso, el método no permite identificar la clase a la cual pertenece el compuesto que produjo el resultado positivo; - los métodos fisicoquímicos más complejos de permi|ten aislar e identificar el compuesto buscado han sido hasta hace poco ppric ¡pálmente métodos en donde un sistema de separación cromatográfica se combina con un sistema de detección de espectrometría de masas (GC/MS o LC/MS). Estos métodos requieren adaptar procedimientos particulares para cada compuesto distinto a ser identificado. Algunas veces un compuesto único o algunos de los compuestos de una misma clase se puedan analizar simultáneamente, algunas veces todos los compuestos de una rr|?sma clase se pueden detectar pero esto nunca es posible con compuestos do diferentes clases. De hecho, el principio de la separación croma tográf licea es característico de las propiedades fisicoquímicos de un compuesto jjado, estas propiedades frecuentemente son diferentes de una clase a otra. E :r? el caso en donde el operador no conoce el tipo de compuesto a ser identificado , éste debe considerar tantos métodos como clases de compuestos existan En años recientes, se han desarrollado métodos mucho más rápidos. Estos métodos, denominados "PRUEBAS RÁPIDAS", se utilizan para llevar á cabo los análisis de evaluación rápida en un gran número de muestras. En general, estos métodos utilizan el reconocimiento de los compuestos buscados en relación con una molécula biológica de donformidad con el principio de competencia. Para hacer en análisis rápido y fácil, estos tipos db pruebas funcionan con dispositivos membranales con flujo lateral la especie animal, del germen contra el que se lucha, de la práctica veterinaria, de la legislación en vigor, de los medios disponibles o incluso de la región geográfica. En el caso de algunos tratamientos específicos, se utiliza una mezcla de medicación. Como una regla general, el practicante utiliza productos antibióticos seleccionados de entre todos los compuestos comercíalmente disponibles que son los efectivos según su evaluación. Las clases principales de agentes antibacteríanos y antibióticos utilizados son: penicilinas y cefalosporinas, tetraciclinas, sulfamídas, aminoglicósídos y aminociclitoles, macrólídos, cloramfenicoles u otros péptidos, ¡onóforos, nitrofuranos, quinolonas, carbadox, etcétera. Todas estas clases abarcan un amplio intervalo de compuestos químicamente diferentes. Se piensa que el uso algunas veces intensivo de antibióticos en la medicina veterinaria y en la producción agrícola puede haber ocasionado el surgimiento de cepas bacterianas que se han vuelto resistentes a los antibióticos. Con el objeto de preservar la salud humana y de legislar este campo, muchos países (Unión Europea, EUA, Canadá, etcétera) han establecido límites máximos autorizados para los residuos (MRL; - por sus siglas en inglés de nivel máximo de residuo) de antibióticos en los productos alimenticios*2'. En cierto grado estos MRLs establecen los límites entre una muestra positiva en la muestra negativa, por ejemplo entre una muestra rechazada y una muestra aceptada. En paralelo, la Decisión de la Comisión del 12 de agosto de 2002 estableció los límites mínimos requeridos para desempeño (MRPLs) aplicables a los métodos analíticos a ser utilizados para examinar las muestras y definieron los criterios comunes para la ¡nterpreta?ón de los resultados*3'. Se entiende que las únicas técnicas de análisis para las cuales se puede demostrar, con base en pruebas verificables, que son validadas y tienen una relación de error conforme al estándar de menos de % para el nivel considerado, se pueden utilizar para los propósitos de selección conformé a la Directiva (Directíve) 96/23/EC. En 1995, un promedio de uno por ciento de todas lajs muestras analizadas para su contenido de antibiótico tuvo un nivel mayor que el MRL y dieron un resultado positivo. Cuando estos resultados posítíyos fueron confirmados, los productos más frecuentemente implicados fueron penicilinas y tetr aciclinas(4).

Estado de la técnica Se describe un sistema para reconocer moléculas de tetraciclina en la Solicitud de Patente del Solicitante WO-A-03/048770 titulada "Method for performing in vitro diagnosis using gene regulatíon mechar isms and correspónding díagnostic kit (método para llevar a cabo el diagnóslico ¡n vitro ufilizando mecanismos de regulación del gen y equipo c iagnóstico correspondiente)". Este método no permite detectar ningún otro elemento más que tetrácíclinas. En una formulación preferida, los reactivos comprenden un receptor tetR, aislada partir del mecanismo de control genético c e E. Coli, para la resistencia a las tetraciclínas, un anticuerpo capaz de reconocer el receptor y una preparación de proteína A conjugada con partículas de oro coloidal!. Además, el sistema de cooperación es un fragmento específico y bíotinilado de ADN que se puede fijar a una molécula de avidina ?nida a una membrana de nítrocelulosa. Es durante la incubación en la presencia de la muestra que el receptor y el fragmento de ADN interactúan sola ente en la ausencia de tetracíclina. En este caso, el fragmento de ADN forma un complejo con el receptor y aparece una señal generada por partíc las de oro unidas al receptor. De otra manera, el receptor que ya ha reconocido una molécula de tetraciclína ya no es capaz de unirse al fragmento de ADN y como uh resultado no aparece ninguna señal. Un sistema para reconocer los ß-lactamos se des?ribe en la patente ' WO-A- 99/67416 titulada "Method for determining antibiotics wíth ß-lactame core in a biologícal liquid (método para determinar antibióticos con un núcleo de ß-lactamo en un líquido biológico)". De conformidad con este método, no es posible detectar ningún otro elemento diferente! a los ß-lactamos. En una formulación prefepda, los inventores describen por una parte uni receptor aislado de Bacillus licheniformis, purificado y químicamente unido a moléculas de biotina, al cual se asocia una preparación del anticuerpo anti-biotina conjugada con partículas de oro coloidal, y por otrei parte un conjugado formado de una cefalosporina asociado a una inmunogbbulina de humano y fijado a una membrana de nitrocelulosa. En el caso en donde la muestra no comprende ß-lactamo, el receptor se une al antibiótico fijo y se detecta una señal generada por las partículas de oro unidas al receptor de biotina por medio de un anticuerpo anti-biotina unido al oro. De otra manera, si el receptor se inhibe durante la incubación previa con la muestra a ser evaluada, ya no es capaz de unirse con el antibiótico fijo, y como ?n resultado no aparece ninguna señal. También se conoce un sistema de reconocimiento rápido de sulfamida como se descpbe por R. Verheijen et al.(5) y titulado "Development of a one-step strip test for the detection of sulfadimídine residuesj (desarrollo de una prueba de tira en un paso para la detección de residuos de sulfadimidina)". Este sistema utiliza un principio similar a aquel de la detección antepormente mencionada de ß-lactamos. Por una parte, un anticuerpo específico a las sulfadímidínas se conjugó con partículas de oro coloidal y es una sulfadimídina que se conjugó con ovalbúmina y se fijó a una membrana de nitrocelulosa. Si la muestra comprende cualesquiera sulfadímidinas reconocidas por el anticuerpo, ésta forma un complejo que es incapaz de encontrar subsecuentemente el compuesto fijado y como un resultado no será capaz de unirse a éste. Manera, en la ausencia de sulfadimídina en la muestra, el anticuerpo conjugado será capaz de reconocer la sulfadimídina fijada y aparecerá una señal coloreada. Este artículo lo indican especificidad de esta prueba. Todos los métodos rápidos y procedimientos con flujo lateral conocidos hasta la fecha solamente se aplican a la detección de una clase única de compuestos y hasta la fecha no existe ningún método para detectar en una: operación única todos los compuestos que pertenecen a a menos dos diferentes clases de antibióticos. Las razones principales para ésto son la incompatibilidad técnica para juntar de manera independi nte y sin interferencia todos los agentes requeridos para la detección de cada una de las clases en un procedimiento único. La segunda dificultad yace en la forma en que; se logra la identificación de la clase a la cual pertenece e compuesto detectado. Para resumir, los sistemas rápidos conocidos para la detección de moléculas pequeñas (PM < 2,000) funcionan de conformidad con el principio de competencia que requiere el uso de dos elementos particulares los cuales son, por una parte, una molécula que puede reconocer específicamente el compuesto a ser detectado, esta molécula generalmente es un receptor bacteriano o un inmunoglobulina (anticuerpo) y por otra parte, un competidor para el sitio de reconocimiento. Dependiendo del método elegido, uno de los elementos se fija un soporte y otro elemento está marcado. En algunos casos (formato 1 , véase a continuación), es la molécula de reconocimiento la que está marcada y un análogo del analito el que se encuentra fijo; en otros casos (formato 2, véase a continuación), es un análogo del analito el que está marcado y es la molécula de reconocimiento la que está unida a una fracción ¡nsoluble. La originalidad del sistema de detección de tetraciclíha yace en el hecho de que el receptor comprende dos sitios de reconocimiento independientes y como un resultado, el competidor no es un e nálogo del analíto buscado sino un fragmento de ADN capaz de unirse al segundo sitio de reconocimiento del mismo receptor. En todos los métodos denominados "PRUEBA RÁPIDA", la evaluación se realiza mediante la comparación de la intensidad de la señal obtenidla en la zona "de prueba", por ejemplo, en el punto en donde se fija el elemento de recuperación del receptor activo, con la intensidad di. otra señal que se obtiene en la zona "control", por ejemplo en el punto en donde se recuperan otros reactivos (o el exceso de reactivos). En general, cuando la intensidad en la zona "de prueba" está más marcada que en la zofa "control", el resultado es negativo para el elemento buscado. En todos los casos en relación con la medición de las moléculas de ß-lactamo, la molécula de reconocimiento se obtiene a partir de la preparación de Bacillus y en cada caso, esta molécula se marca (después de la purificación. Para lograr este marcado, la superficie se debe someter a una modificación química. Por ejemplo, ésta puede estar químicamente unida a una enzima, como es el caso con el receptor de Bacillus Stearothermophillus unido a1 peroxidasa (EP-A-0 593 112 y US-A-5,434,053 de Giest Brocades) o a una biotina, como es el caso con el receptor de Bacillus lichenífopnis unido a una biotina (WO-A-99/67416 y US-A-6, 524,804 de U.C.B. S.A.) o incluso con el receptor de Bacillus Stearothermophillus directamente conjugado con oro coloídali (US-A-6,475,805 de Charm Inc.). Con la excepción del método Tetrasensor™, en los otros casos conocidos hasta la fecha es necesario modificar químicamente la molécula de reconocimiento para obtener un complejo coloreado. Como un resultado, es necesapo purificarla y modificar algunos de sus sustituyentes de superficie con el riesgo de m|odificar una propiedad importante de funcionalidad o de estabilidad. Por lo tanto, en los otros casos conocidos hastia la fecha, generalmente es imposible trabajar ya sea con extractos no purificados o con receptores que podrían no estar químicamente modificados. Además, el tipo de marcado utilizado en la medición de la "tetraciclina" no es compatible con la medición de los ß-lactamos puesto que ocasiona que sea una ¡nmunoglobulina la que se fija a la zona "control" en todos los casos reportados. En el caso del documento WO-99/67416, también es una inmunoglobulina la que actúa como la proteína de anclaje con el objeto de fijar el competidor a la zona "de prueba". El uso de la proteína A como en la medición de las tetraciclinas, podría ocasionar de manera inevitable un mareadlo no específico en una o ambas líneas de captura requeridas para la detección de los ß-lactamos. En otro método, en donde es necesario recurrir al uso de la combinación de avidína-biotina con el objeto de facilitar la fijación al soporte o el marcado, la combinación de avidina-biotína solamente se puede utilizar en un método dado para un reconocimiento específico particular. Do hecho, si una avidina forma un punto de anclaje, será posible para todas las; moléculas bíotiniladas unirse ellas mismas en ese lugar. En tal caso, no es posible considerar una prueba para la detección común de los ß-lactamos y de las tetraciclínas que podría basarse por ejemplo en la combinación ne los dos principios de medición descritos en el documento WO-A-99/67416 y en el documento WO-A-03/048770. De hecho, en el primer caso, el receptor está biotíníládo y luego se marca por medio de anti-biotína-oro y en el segundo caso, la avidina se fija para recuperar un fragmento bíotinílado de ADN. La combinación de estos dos principios podría llevar entonces a un conflicto adicional entre los dos sistemas independientes utilizando las combinaciones de avidína-biotina. En una combinación de los dos sistemas existentes, el receptor biotinilado del sistema de ß-lactamo se podría unir _? la avidina requerida para la recuperación del ADN del sistema tetraciclína y como un resultado podría ocasionar un mercado no específico independientemente del nivel de tetraciclína en la muestra. Además, la presencia de antibi tina-oro en la fase móvil podría interferir con el ADN biotinilado previniendo que éste encuentre a la avidina requerida para su captura, que podría llevpr incluso a otro conflicto. En un tercer método, la combinación de dos s stemas de reconocimiento independientes podría requerir un sistema bastante complejo para le r e interpretar el resultado en donde cada uno de los marcadores tiene que se ?t evaluado por su intensidad de relativa con respecto a una referencia interna. Por lo tanto podrían existir dos bandas "de prueba" ("beta" y "tetra") y dos bandas "control". Este concepto hace que el análisis no sea simple ni práctico. En el contexto de la combinación de las dos pruebas, podría ser mejor valuar la intensidad de cada prueba mediante comparación entre sí. En dicho procedimiento, la zona "de prueba" para el analito no. 1 podría volverse la zona "de control" para el analito no. 2 y viceversa. En el caso en donde las dos clases de analitos referidos estaban presentes al m smo tiempo en una misma muestra, este método podría no producir ninguna señal o casi ninguna señal. Esto raramente es el caso pero sí se presenta, se recomienda la adición de una referencia única en la forma de una línea control única que permite evaluar más fácilmente la intensidad relativa de ambas señales prueba' con el objeto de evitar dificultades de interpretación en el caso de contaminación doble por ß-lactamos y tetraciclinas. Obviamente, esta línea de control única se podría volver necesaria en el caso en donde más de dos pruebas se combinan en un método único. En un cuarto método, los materiales elegidos de manera expresa y preferiblemente para formar el dispositivo en varilla del equipo diagnóstico debe ser compatible para el análisis simultáneo de las dos clases de analitos. De hecho, en una modalidad preferida descrita en WO 99'67416, se recomienda el uso de la membrana "Leukosorb®" pero no es compatible con el método que recomiendan los inventores para la prueba de tetraciclina y podría no ser adecuada para la medición de múltiples analitos. De Inecho, muy raramente, en una formulación en donde ambos receptores están marcados por sus anticuerpos respectivos, es imposible obtener un punto límite limpio mediante la adición de ß-lactamos cuando los reactivos a canzan la membrana Leukosorb® antes de que alcancen el punto de captura. Esta membrana, cuya eficiencia se demostró para la purificación de la leche y para el uso en el flujo lateral, es la causa de la señales específicas de reconocimiento cuando el marcado se logra por medio de anticuerpos y de la proteína A conjugada con oro coloidal. En un quinto método, es importante la elección de loa receptores implicados en el reconocimiento de todos los compuestos de cada una de las clases. Esta elección no solamente se determina por el desempeño del reconocimiento de los compuestos sino también por los criterios de estabilidad, estructura, reactividad del antígeno, composición de aminoácidos, etc. Como una conclusión, basándose en los métodos conocidos, es imposible a priori poner juntos en un método único al menos dos métodos independientes, por ejemplo para el reconocimiento por los receptores a los ß-lactamos y tetraciclinas, sin considerar modificaciones principales que permiten combinan los elementos requeridos a la vez que se asegura que el sistemai para reconocimiento del compuesto no interfiera con el sistema para reconocimiento de otro compuesto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIQl? La presente invención se pretende para proveer un método diagnóstico novedoso que permite detectar simultáneamente una combinación (teóricamente ¡limitada) de compuestos que pueden pertenecer a menos a dos clases distintas de analitos y para identificar la clase a la cua pertenece un compuesto efectivamente detectado.

En particular, la invención se pretende para demostrar la compatibilidad técnica y práctica de la combinación en un método único de al menos dos mecanismos de detección sin interferencia entre el fun?ona miento de uno de ellos y el funcionamiento del otro mecanismo. Un objetivo adicional de la invención es demostrar lá viabilidad técnica de la medición de los múltiples analitos que se puede lograr de manera rápida, por ejemplo en menos de 30 minutos y en una etapa de análisis única por medio de una muestra única. Un objetivo adicional de la invención es proveer un niétodo y un equipo diagnóstico in vitro para la detección simultánea y medfción de al menos dos clases de analitos.

Elementos principales característicos de la invención Un primer objetivo de la presente invención, de conformidad con las reivindicaciones respectivas 1 , 3, 4 y 10, se refiere a un equipo d. ¡agnóstico para la detección o cuantificación simultánea y específica de al ijnenos dos analitos que pertenecen a diferentes clases de antibióticos, es decir al menos dos clases a partir de los ß-lactamos, tetracíclinas y sulfamidas, caracterizado porque comprende generalmente, por ejemplo: - por una parte, una mezcla reactiva única, preferiblertíente en la forma de una solución o un liofilizado, que comprende al pjienos dos moléculas biológicas diferentes, cada una capaz de reconocer, respectivamente, de manera simultánea y específica, un analito determinado presente en una muestra que puede comprender analitos que pertenecen a dichas clases diferentes de analitos; - y por otra parte, un sistema de recuperación en la forma de un soporte sólido único al cual están unidos, en distintas posiciones espaciales conocidas, los ligandos respectivos que son capaces de recuperar de manera específica, selectiva y exclusiva cada una de dichas moléculas biológicas comprendidas en dicha mezcla reactiva de manera que identifica, por la posición de la recuperación sobre dicho soporte, el tipo de clase al cual pertenece cada uno de los analitos presentes en la muestra Dependiendo del caso, ya sea que elemento de recuderación fijo sea un competidor análogo a la sustancia buscada y el receptor fn solución esté marcado o ya sea que el competidor análogo en solución esté marcado y el elemento de recuperación fijo sea el receptor. Los sistemas mezclados también pueden coexistir de conformidad con la invención. Las modalidades preferidas de la invención se desceben en las reivindicaciones secundarias 2, 5 y 9 y 11 -12. Un segundo objetivo de la invención, como en la reij indicación 13, se refiere a un método para ¡mplementar un equipo diagnóstico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por las siguientes etapas: la mezcla reactiva anteriormente mencionada se! puso en contacto, con una muestra a ser identificada con el objeto de obtener una solución que se deja incubar a temperatura entre 30°C y 50°C por 3 a 15 minutos; - una varilla que contiene el sistema de recuperación anteriormente mencionado se sumerge en la solución obtenida y se deja incubar: por 3 a 15 minutos; - el resultado en la varilla se interpretó ya sea visualnpente por el ojo desnudo o por medio de un lector óptico para varilla. En las modalidades preferidas de la presente intención, se recomienda evitar por una parte la purificación y por otra parte la modificación química! del receptor por ejemplo mediante el uso de anticuerpos anti-receptor que están marcados ya sea directamente con oro coloidal o preferiblemente con proteína A unida al oro coloidal. Por otra parte, en el concepto de la detección múltiple, la proteína A marcada con oro coloidal podría actuar como un marcador genérico para todos los anticuerpos introducidos dfntro de la solución. Con el objeto de preservar la máxima funcionalidad de los receptores y anticuerpos utilizados en la presente invención, un principio adoptado es que no se presenta ningún marcado mediante modificación química: Como un resultado, la presente invención utiliza receptores bacterianos en su estado más natural posible. Estos receptores están marcados por medio de anticuerpos que serán identificados ellos mismos por un conjugado de proteína A con oro coloidal. Por lo tanto, en dicho caso, es exclusivamente la proteína de marcado la que será unida al oro y no las moléculas sensibles para el reconocimiento de los analitos referidos. En este método, se preservan así todos los grupos funcionales de las ¡moléculas sensibles de reconocimiento. Esta ventaja se explota hasta su máximo cuando el objetivo es explotar la actividad de los receptores cuyos mecanismos de reconocimiento dependen de ciertas cadenas laterales tales como los residuos de lisina, por ejemplo. Por lo tanto es muy impártante que, cuando; se presenta una modificación química, en la mayoría de los casos reportados, la modificación incluya residuos NH3+ de las cadenas laterales de lisina. Como una conclusión, la unión química a las usinas puede pcasionar el deterioro de las usinas del sitio activo y por lo tanto se hace a la preparación parcialmente inactiva. El marcado por medio de los anticuerpos tiene la flexibilidad del marcado no fijo. De hecho, el marcado químico implica una unión covalente irreversible mientras que la unión de los anticuerpos es irreve rsible y se somete! a un equilibrio que puede ser modificada dependiendo de las fuerzas que actúan sobre ésta. Otra ventaja es que es capaz de ajustar la etapa de marcado un segundo paso. De hecho, en una segunda formulación de la presenté invención, es después de la fase de reconocimiento del analito por el receptor, cuando el analito libre de la muestra o el analito fijo para la recuperación, que el anticuerpo reconoce al receptor. Por varias razones de costos o de estabilidad, pero también para una perfecta integración dentro de una prueba de múltiples analítos, la La presente invención ofrece la ventaja adicional de proponer la formulalción de una prueba de múltiples analitos confiable y económica. De hecho, no es necesario purificar los receptores ni las preparaciones de anticuerpo y además, los receptores no se modifican químicam te, lo cual podría prevenir su total reactividad y estabilidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra esquemáticamente un ejemplo del posicionamiento de los elementos de recuperación de conformipad con la invención sobre un soporte sólido de nitrocelulosa en el caso de a medición simultánea de solamente dos antibióticos, también se provee una zfona control fija. La figura 2 muestra esquemáticamente un ejemplo del posicionamiento de los elementos de recuperación de conformipad con la invención sobre un soporte sólido de nitrocelulosa en el caso de a medición simultánea de tetracíclinas, ß-lactamos y sulfamidas, también se provee una zona control fija.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Comentario preliminar Como se mencionó en el estado de la técnica, una prueba de competencia considerada de conformidad con la presente invención puede estar en particular en dos formatos diferentes. En el primer caso (formato 1), los receptores se conjugan con partículas de oro coloidal y los bompuestos competidores, análogos de la sustancia buscada, actúan como el amentos de recuperación a ser fijados al punto de captura específico. En el segundo caso (formato 2), los compuestos competidores, análogos de la sustancia buscada, se conjugan con las partículas del oro coloidal y los receptores actúan como elementos de recuperación a ser fijados al punto de captura específico. En ciertos casos de detección de múltiples analitos, también es posible un sistema mezclado (formatos 1 y 2 presentes).

EJEMPLO 1 ie Ucñón siipmultáinea de tetraciclñipas y ß°lla(gte?pfi)@s p©r ireselptoirds ®S|p® 5is@§ (fopnraato 1 para amba d®-®(5sS ?p?®§) El método utiliza una mezcla reactiva que comprJBnde tanto receptores respectivos de ß-lactamos y tetraciclinas así como sus reactivos y un elemento de recuperación al cual se fijan los lígandos específicas de estos receptores en puntos precisos y distintos.

Preparación de la mezcla reactiva Para la detección de los ß-lactamos, la mezc a reactiva comprende el receptor específico para el reconocimiento de los ß-l.ictamos, su anticuerpo específico y una preparación de proteína A conjugada con oro coloidal. Para la detección de las tetraciclinas, la mezcla reactiva comprende el receptor de las tetraciclinas, su anticuerpo específico, un fragmento específico de ADN conjugado con biotína y una preparación de proteína A conjugada con oro coloidal El receptor de ß-lactamo se obtiene mediante el métojdo descrito por Golemi-Kotra et al.(6). El receptor no purificado se filtró sobre una membrana Millex HV (Millipore, Inc., EUA) antes de ser almacenados 4°C en la presencia de glicerol al 50% v/v. El receptor de tetraciclina se obtuvo mediante el método descrito en la Solicitud de Patente WO-A-03/048770. Ambas preparaciones de anticuerpos se obtuvieron mediante el método descrito en Kachab et al.(7) Estas preparaciones de anficuerpo se obtuvieron medíante la inyección de una preparación de receptor purificado hasta la homogeneidad de la proteína de conformidad con Golemi-Kotra et al.(6) para el receptor de ß-lactamo y de conformidad con la solicitud WO-A-03/048770 para el receptor de tetraciclina. Ambas preparaciones de anticuerpo preferiblemente se utilizan de manera no purificada, lo cual significa que es suero no purificado el que se añade directamente la mezcla reactiva. De conformidad con una segunda modalidad preferida, los anticuerpos específicos de tipo policlonal o monoclonal se codifican mediante métodos conocidos al experto en la técnica y luego se unen directamente o indirectamente a partículas de oro coloidal de conformidad con e método de Frens(é). El fragmento de ADN se obtuvo en Eurogentec SA, Bélgica de conformidad con la secuencia y preparación descrita en la solicitud de patente WO-A-03/048770. En este caso preciso, el fragmento de ADN no se fija a un punto de captura sobre una membrana de nitrocelulosa sino que se incorpora de mañera directa dentro de la mezcla de reacción. Este fragmento será recuperado in testo por medio de su extremo biotinílado sobre la avidína fijada a un punto de captura (véase a continuación). Todos los reactivos requeridos se introdujeron áin ninguna modificación química o sustitución de manera que conservaron todas las propiedades de reactividad y estabilidad. Estas moléculas pueden estar purificadas o no purificadas, lo cual en un beneficio económico eviqente. En el ejemplo preciso, la mezcla reactiva comprende: - 5 partes del receptor ß-lactamo (RSA) a una concejntración de 360 nM!; 5 partes del receptor de tetraciclina (TetR) a una cojncentración de 4.2 µM; - 1 parte de suero anti-RSA diluido 4x en un regulador de pH de NaPi 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7.8; - 1 parte de suero anti-TetR diluido 4x en un regulador de pH de NaPi 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7.8; Las zonas de captura "beta" y "tetra" se pueden posícionar de manera sucesiva una después de la otra o viceversa sin ninguna preferencia particular siempre y cuando se dispongan en ubicaciones espacialmente distintas pero conocidas. Es de hecho esta posición distinta la que permitirá que el tipo de antibiótico presente en la solución de análisis sea identificado. Si ambos sistemas de captura estuvieran posicionados en el mismo punto, su medición podría no ser afectada pero no se podría determinar de manera posible ¡qué tipo de compuesto está realmente presente.

Preparación de ß-lactoglobulina coniugada con ampie lina La ß-lactoglobulína se eligió debido a que es una pr eína de la leche que comprende muchos residuos de lisína (10%) y la estructura tridimensional indica que la mayoría de las usinas tienen sus extremos NH2 mirando hacia la parte exterior de la proteína (Pubmed, estructura, I GXA). Se incubaron 100 mg de ß-lactoglobulina y 15 mg de 2- ¡minotiolano en un regulador de pH de NaPi 100 mM, pH 8.5 en un volumen reactivo! de 4 ml por 60 minutos a 25°C. La mezcla se depositó entonces sobre una columna PD10 (Amersham Bíosciences, RU) previamente equilibrada en PBS pH 7, EDTA 5 mM y se eluyó en este mismo regulador ce pH. Las fraccionies de proteína se agruparon mediante métodos bien conocidos. Además, se incubaron 2 ml de DMSO que comprendía 100 mg de SICC con 2 ml de una solución de 50 mg/ml de ampicílina sódica en un regulador de pH de NaPi 25 mM, pH 8, por 60 minutos a 25°C antes de ser incubada en la presencia de 50 mg de una solución de proteína pfr 4 horas a 4°C. Finalmente, la solución se dializó dos veces por 6 horas con 100 volúmenes de un regulador de pH de NaPi 25 mM, pH 7.5.

Preparación de una solución de avidina neutralizada Se preparó una solución de 5 mg/ml de avidina de clara de nuevo, disponible por Pierce Inc., EUA en un regulador de pH de NaPi 50 mM, pH 7.5.

Preparación de una solución control de BSA-oro La presente invención recomienda el uso de una líne i control de intensidad constante y visible antes y después del desarrollo de la prueba. Esta línea preferiblemente es de un color similar al color desarrollado en las líneas "de prueba" y se sintetizó como sigue. A una preparación de 27 ml de oro coloidal de 40 nrln, obtenida por el método de Frens(8) y con una densidad óptica de DOiamdba ma. de 3, se le añadieron 3 ml de una solución de BSA (Sigma) al 10% en un regulador de pH de borato de 10 mM, pH 6.5. La mezcla se incubó por 60 minutos a 20°C antes de ser centrifugada por 45 minutos a 10,000 rpm en un rotor SS34 (Sorvalli). El residuo se recuperó entonces en un regulador de pH de NaPi 50 mM, NaCI 150 mM con el objeto de obtener una DO?amCiba de 45. La solución que será depositada sobre la membrana de nitrocelulosa se diluyó adicionalmente 15 veces en este mismo regulador de pH para obt ner una DO final de 3.

Técnica inmunocromatográfica La técnica inmunocromatográfica se conoce y se dejscribe en la literatura (Developing Immunochromatographic Test Strips: A Short Guide, Millipor , Lit. no. TB500 impreso en EUA 11/96, 96-204). En la presente invención, las preparaciones anteriormente obtenidas se depositaron en las posiciones precisas y distintas sobre una membrana de nitrocelulosa y preferiblemente de manera exitosa una detrás de la otra con refeirencia a la dirección de la migración del líquido. La membrana de nitrocelulosa se puso entonces en contacto en un extremo con una membrana, por ejemplo, de tipo 142 disponible por Ahlstrom, Inc., EUA o del tipo GFDVA disponible por Whatmán, RU pero no de tipo Leukosorb(R) disponible por Pall, RU y en el otro extremo por cualquier papel absorbente por ejemplo de tjpo 17CHR disponible por Whatman, RU.

Depositación de los elementos de recuperación sobren el soporte de nitrocelulosa Es el posicionamiento de los elementos de recuperación lo que permitirá identificar el tipo de contaminación encontrada en la muestra. Las soluciones se depositan por medio de un "dispensador" Biodot (RU) del tipo Quanti-3000 a una velocidad de flujo de 1 µL/cm.

EJEMPLO 2 iedición simultánea de las tetraciclinas, ß°llacte-ipp?@@ y §ylf< (foinppiato H a partcir d® fores etecciioipies)) En esta modalidad preferida, además de ambos receptores de tetraciclínas y ß-lactamos, este método incorpora un anticuerpo específico para el reconocimiento de las sulfadimetoxinas.

Preparación de la mezcla reactiva Además se añadió un anticuerpo anti-sulfadímet xina a la mezcla anteriormente mencionada de conformidad con la siguiente preparación: Preparación de una BSA conjugada con sulfadimeto ina La preparación se logró mediante el procedimiento descrito por Dixon-Holland y Katz(9). Se incubaron 100 mg de sulfadimetoxína y 200 mg de BSA sólubilízada en 25 ml de una mezcla, comprendiendo dos partes de un regulador de pH de fosfato de 50 mM, pH 7.2 y 1 parte de dioxano, en la presencia de 120 µL de glutaraldehído al 25% agitado por 3 horas a 25°C. La solucióh se dializó entonces por 6 días a 4°C en contra de 100 volúmenes de un regulador de pH de NaPí 50 mM, pH 7.2 con un cambio de regalador de pH cada 12 horas.

Depositaci?n de los elementos de recuperación sobre el soporte de nitrocelulosa En el caso de una detección de tres parámetros, las líneas de captura se ubicaron en localizacíones precisas y distintas sobre una membrana de nitrocelulosa y preferiblemente de manera exitosa u a después de la otra con referencia a la dirección de migración del íquido. De conformidad con una modalidad preferida, las zonas de captura para ß-lactamq, tetracíclina y sulfadimetoxína y la zona control se ubicaron en un primeroi segundo, tercer y finalmente cuarto nivel, respectivamente con referencia a la dirección de migración del líquido (figura 2). Una zona de control única sirve como una referencia para los tres marcadores. Una formulación diferente, similar al ejemplo precedente, podría ser la incorporación de dos zonas de control, por ejemplo una zona de tf;ontrol entre cada zona de prueba. Como una regla general, será evidente que, de conformidad con la presente invención, las líneas de prueba y las líneas de control no tiene necesariamente que ser ubicadas en el mismo orden en relación con la dirección de migración del líquido. Por lo tanto, el equipo funciona igualmente bien si el orden observado es "beta" - "tetra" o "tetra" - "beta", "beta" - "sulfa" o "sulfa" •- "beta" (véase el ejemplo a continuación), "beta" - "tetra "sulfa" o "sulfa" - "tetra" - "beta", etcétera.

Medición simultánea de los ß-lactamos, tetraciclinas y sulfadimetoxinas en una muestra de leche Se incubaron 200 µL de leche fría a 50°C en la presencia de 50 µl de los reactivos preparados y/o liofilizados como se mencionó anteriormente. Después de 3 minutos de incubación a 50°C, el elemento de recuperación anteriormente descrito se sumergió en la solución. La interpretación final se realizó después de 3 minutos de incubador! Por medio de un lector óptico de varilla disponible por Matest (Alemania). Los resultados de describen en el cuadro 3. El método permite considerar como positiva una muestra de leche con 4 ppb en ampi lina y/o 75 ppb en tetracíclina y 100 ppb en sulfadimetoxína. El cuadro 4 resume los límites de detección obten dos por el método de conformidad con la invención para los diversos compuestos de ß- lactamo, tetraciclina y sulfadimetoxina anteriormente mencionadosj. Como una regla general, si la relación de las intensidades de la señal prueba referida re nsidera EJEMPLO 3 1ed,ición simultánea de ß°Bae amo§ y suiiFaippiiidas (formato 1 para ß° y TOCTOS Preparación de la mezcla reactiva La mezcla reactiva comprende: - 5 partes del receptor ß-lactamo (RSA) a una concentración de 360 nM; - 10 partes de un anticuerpo monoclonal anti-RSA u|n¡do a oro coloidal :(DO = 10 a 520 nm); - 1 parte de un antí- sulfadimetoxina biotínilado y dílukpo en NaPí 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7.8; Me mbas detecciones) Preparación de la mezcla reactiva La mezcla reactiva comprende: - 5 partes del receptor de tetraciclina (TetR) a una concentración de 4.2 µM; - 1 parte de anticuerpo monoclonal anti-TetR de ratón diluido en un regulador de pH de NaPí 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7.8; - 1 parte anticuerpo antisulfamida de conejo diluido en este mismo regulador de pH; - 10 partes de una dilución de BSA-sulfadimetoxiná-oro de 40 nm; 1 parte de ácido nucleico biotínilado a una concentración de 50 µM; - 10 partes de un anticuerpo anti-bíotina-oro de 40 nm a DO = 10 a 520 nm; - 22 partes de regulador de pH Hepes 120 mM, phf 8, BSA al 2%, Dextrán al 1 %, sacarosa al 5%. Esta mezcla se prepara ya sea como se requiera o se liofiliza por 20 horas.

El sistema de recuperación El sistema de recuperación es similar a aquél del ejelmplo 1. Sin embargo, en el presente caso, es un anticuerpo anti-ratón el que forma el primer punto de captura en donde el anticuerpo monoclonal anti-TetR será recuperado y es un anticuerpo de pollo anti-conejo el que forma el segundo punto de captura en donde el anticuerpo antisulfamída será recuperado.

Medición simultánea de las tetraciclinas y sulfamidas en una muestra! de carne 30 ml de un regulador de pH de NaPi 50 mM, pH 8 se añadieron a 10 gramos de un músculo de cerdo y la mezcla se mezcló con un mezclador de tipo MiniMix (Interscience, F) por 2 minutos. La solución, recolecltada en un tubo Eppendorf, se centrifugó entonces por 1 minuto a 6,000 rpm para recuperar el sobrenadante a partir de ésta. Se incubaron 200 µL del sobrenadante por 15 minutos a 25°C en la presencia de 50 µL de los reactivos anteriormente preparados. Después de esta primera incubación, el elemento de recuperación anteriormente descrito se sumergió en la scHucíó n. La interpretación final se realizó después de una segunda incubación de 15 minutos. Los resultados se establecen en el cuadro 6.

CUADRO 8 Relaciones d® Das intensidades medidas (*) T: tetraciclina, S: sulfamida, C: control EJEMPLO 5 ledicipn simultánea de ß-Caeta?r¡p@s, tetracScG?rpas y s lffag (ffoippr-ato 1 para ß-fla ta os/fteftiraciiclliiipias y formato 2 para su ifai Preparación de la mezcla reactiva La mezcla reactiva comprende: - 5 partes del receptor ß-lactamo (RSA) a una concentración de 360 nM; - 1 parte del anticuerpo monoclonal anti-RSA diluido en un regulador de pH de NaPi 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7.8; - 5 partes del receptor de tetraciclina (TetR) a una concentración de 4.2 µM; - 1 parte de anticuerpo monoclonal anti-TetR de ratójn diluido en un regulador de pH de NaPi 50 mM, NaC1 150 mM, pH 7.8; - 1 parte de ácido nucleico biotinilado a una concentración de 50 µM; - 1 parte de anticuerpo policlonal antisulfamida de conejo diluido en un regulador de pH de NaPi 50 mM, NaC1 150 mM, pH 7.8; - 7 partes de una dilución de BSA-sulfadimetoxina-orq de 40 nm; - 13 partes de un anticuerpo anti-ratón unido a oro co oidal de 40 nm a DO = 10 a 520 nm; - 16 partes de regulador de pH Hepes 120 mM, phj 8, BSA al 2%, Dextrán al 1 %, sacarosa al 5%.

Esta mezcla se prepara ya sea como se requiera o se liofiliza por 20 horas. En un segundo método preferido, ambos anticuerpos monoclonales anti-RSA y anti-TetR se conjugaron directamente con partículas de oro coloidal.

El sistema de recuperación El sistema de recuperación es similar a aquél del ejemplo 1. Sin embargo, en el presente caso, es lactoglobulina-ampicilina la q je forma el primer ¡punto de captura en donde el receptor de RSA será rec j perado, es avidína en el segundo punto de captura en donde el recepto TetR será recuperado y es un anticuerpo de pollo anti-conejo el que forr+ia el tercer punto de captura en donde será recuperado el anticuerpo antisjjlfamida de conejo.

Medición simultánea de ß-lactamos, tetraciclinas y sulfamidas en una muestra de leche 200 µL de leche fría se incubaron por 15 minutos a 30°C en la presencia de 50 µL de los reactivos anteriormente preparados. Después de esta primera incubación, el elemento de recuperación anteriormente descrito se sumergió en la solución. La interpretación final se realizó después de una segunda incubación de 15 minutos. Los resultados se establecen en el cuadro 7.

Relaciones de Das intensidades medidas (*) B: ß-lactamo, T: tetracíclina, S: sulfamida, C: control Referencias (1 ) Directiva del Consejo (Directive 96/23/CE Du Conseil) 96/23/CE fechada el 29 de abril de 1996, sobre las med iilíones para monitorear ciertas sustancias y residuos de las mismas en animales vivos y productos animales y aboliendo las Directivas 85/358/CEE y 87/409/ CEE y las Decisiones 89/187/CEE y 91/664/CEE. (2) Regulación del Consejo (EEC) No 2377/90 (Re¡glement Du Conseíl) fechado el 26 de junio de 1990 estableciendo un procedimiento comunitario para la fijación de los límites máximos de residuos paira productos medicinales veterinarios en productos alimenticios de origen anima1! (3) Off. J. Eur. Comm. 2002, L221/8 - 2002/657/CE.

Claims (13)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un equipo diagnóstico para la medición simultánea de antibióticos de diferentes clases, al menos ß-lactamos y tetrac dinas, que compre,nde: - por una parte, una mezcla reactiva única que comprende al menos un primer receptor específico para el reconocimiento de ß-lfctamos, un segundo receptor para reconocer específicamente y de manera competitiva una tetraciclina y un fragmento biotinilado de ácido nucleico, ambos receptores preferiblemente estando marcados por partículas de oro coloidal, ya sea directamente o indirectamente por medio de un anticuerpo o de un anticuerpo en asociación con la proteína A; - y por otra parte, un sistema de recuperación en la forma de un soporte sólido que comprende una membrana de nitrocelulosa sobre la cual se unen al menos dos secciones conocidas y distintas, denominadas zonas prueba, un antibiótico con un núcleo de ß-lactamo y una avidina, respectivamente o viceversa; de tal manera que la intensidad de marcado detectada sobre el sistema de recuperación en ambas zonas de prueba resulta independientemente a partir del reconocimiento competitivo de cada antibiótico por su receptor marcado

2.- El equipo diagnóstico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el antibiótico con un núcleo de ß-lactamo y la avidina1 unida a la membrana de nítrocelulosa son una penicilina o una cefalosporina respectivamente, preferiblemente una ampicílina fijada a una ß-lactoglóbulina y una avidina de clara de huevo.

3.- Un equipo diagnóstico para la medición sim ultánea de antibióticos de diferentes clases, al menos ß-lactamos y sulfamídas, que comprende: - por una parte, una mezcla reactiva única que comprende al menos , un primer receptor específico para el reconocimiento de ß-lactamos, marcado directamente o indirectamente preferiblemente por partículas de oro coloidal, un anticuerpo antisulfamida biotinilado y un análogo de una sulfamida marcada ya sea directamente o indirectamente con oro coloidal; - y por otra parte, un sistema de recuperación en la forma de un soporte sólido que comprende una membrana de nitrocelulosa sobre la cual están ur idas en dos secciones conocidas y distintas, denominadas zonas de prueba, un antibiótico con un núcleo de ß-lactamo y una avidina, respectivamente o viceversa; de tal manera que la intensidad de marcado detectada en el sistema de recuperación en ambas zonas de prueba resulta independientemente a partir del reconocimiento competitivo de cada antibiótico.

4.- Un equipo diagnóstico para la medición simultánea de analitos que corresponden a antibióticos de diferentes clases, al menos tetraciclinas y sulfamidas, que comprende: - por una parte, una mezcla reactiva única que comprende al menos un receptor qup reconoce específicamente y competitivamente una tetraciclína y un fragmento bíotinílado de ácido nucleico, dicho receptor estando preferiblemente marcado por partículas de oro coloidal ya sea directamente o indirectamente por medio de un anticuerpo, así como un anticuerpo antisulfamida y un análogo de una sulfamida marcado ya sea directamente o indirectamente preferiblemente con oro coloidal; - y por otra parte, un sistema de recuperación en la forma de un soporté sólido que comprende una membrana de nitrocelulosa sobre la cual están unidas en dos secciones conocidas y distintas, denominadas zonas de prueba, un antibiótico específicamente dirigido ya sea al receptor de tetraciclina o al antibiótico específico del receptor de tetrac clina y un anticuerpo específicamente dirigido al anticuerpo aritísulfamida, respectivamente o viceversa.

5.- El equipo diagnóstico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque los anticuerpos antí-receptor específicos añadidos a la mezcla reactiva son anticuerpos monoclbnales o policlonales, químicamente modificados o no modificados o modificados mediante recombinación, purificados o no purificados, unidos o no unidos, directamente o indirectamente a partículas marcadas, preferiblemente partículas de oro coloidal.

6.- El equipo diagnóstico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque la membrana de nítrocelµlosa depositada sobre un soporte de varilla se encuentra en contacto en un primer extremo con una membrana y en un segundo extre mo con un papel absorbente y tiene ambas zonas de prueba distintas una después de la otra en la dirección de migración del líquido, una zona de fontrol que posiblemente separa las dos zonas de prueba. 7 '.- El equipo diagnóstico de conformidad con la reivípd ¡cacíón 6, caracterizado además porque la zona de control se obtiene per medio de cualquier preparación de proteína marcada preferiblemente por plartículas de oro col idal e incluso preferiblemente por medio de una albúmina de suero de bovino ¡o BSA unida a partículas de oro coloidal. 8.- Un equipo diagnóstico para la medición simultánea de ß-lactamos, tetraciclinas y sulfamidas de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde la mezcla reactiva también comprende un anticuerpo específico para él reconocimiento de sulfamidas y está marcado, preferiblemente directamente o indirectamente por partículas de oro coloidal, y en el que el sistema de recuperación también comprende una preparación de proteína conjugada con sulfamidas, fijada a la membrana de nitrocelulosa. 9.- El equipo diagnóstico para la medición simultánea de ß-lactamos, tetraciclinas y sulfamidas de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la membrana de nitrocelulosa depositada sobre un soporte tipo varilla se encuentra en contacto en un primer extremo con una membrana y en un segundo extremo con un papel absorbente y tiene tres zonas de prueba distintivas y una zona de control, sucesivamente dispuestas una después de la otra en la dirección de la migración del líquido, o dos zonas control¡ cada una alternativamente dispuesta entre dos zonas de prueba. 10.- Un equipo diagnóstico para la medición simultánea de analitos que corresponden a antibióticos de diferentes clases, cil menos ß-lactamós, tetraciclinas y sulfamidas, que comprende: - por una parte, una mezcla reactiva única que comprende al menos un primer receptor específico para el reconocimiento de ß-lactamos, un segundo receptor que reconoce de manera específica y competitiva una tetraciclina y un fragmento biotínilado de ácido nucleico, ambos receptores estando preferiblemente marcados por partículas de oro coloidal, ya sea directamente o indirectamente por medio de un anticuerpo o un anticuerpo en asociación con la proteína A, así como un anticuerpo antisulfamida y un análogo de una sulfamida libre marcada ya sea directamente o indirectamente con oro coloidal; - y por otra parte, un sistema de recuperación en la forma de un soporte sólido que comp rende una membrana de nitrocelulosa sobre la cual están unidas en tres posiciones conocidas y distintas un antibiótico con un núcleo de ß-lactamo, ura avidina y un anticuerpo dirigido contra el anticuerpo antisulfamida, respectivamente, de tal manera que la intensidad de marcado detectada en el sistema de recuperación en las tres zonas de prueba resulta independíentemejnte a partir del reconocimiento competitivo de cada antibiótico. 11.- El equipo diagnóstico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la muestra es esencialmente líquida y se obtiene a partir de leche, miel, carne, huevos o líquidos: biológicos. 12.- El equipo diagnóstico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque los receptores utilizados para la medición de los ß-lactamos o tetraciclinas son los receptores BlaR y TetR respectivamente aislados a partir de clases conocidas de microorganismos, preferiblemente partir de Staphylococcus aureus para BlaR y a partir del plásmído pSC101 de E. Colí 600 para TetR, respectivamente. 13.- Un método para implementar un equipo diagnóstico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, que tiene las siguientes etapas: - la mezcla reactiva anteriormente mencioneida se pone en contacto con una muestra a ser clasificada con el objeto de obtener una solución que se deja incubar a temperatura entre 30°C y 50°C por 3 a 15 minutos; - una varilla que contiene el sistema de recuperación anteriormente mencionado se sumerge en la solución obtenida y se deja incubaif por 3 a 15 minutos; - el resultado de la varilla se interpretó ya sea visualmentje por el ojo desnudo o por medio de un lector óptico de varilla.