CN103102319B - 三聚氰胺半抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种三聚氰胺半抗原及其制备方法和应用。本发明所提供的三聚氰胺半抗原合成方法：将三聚氰酸二酰胺与琥珀酸酐混合，加入吡啶在室温下搅拌12-24h，除去溶剂后在乙醇-水中重结晶得三聚氰酸胺的半琥珀酸酯，即为三聚氰胺半抗原。实验结果表明，本发明合成的三聚氰胺半抗原的方法简单，所得到的三聚氰胺半抗原产率和纯度都较高，利用本发明合成的三聚氰胺半抗原制备得到的抗原对实验动物进行免疫，得到特异性好，灵敏度高的单克隆抗体，用该抗体建立的酶联免疫试剂盒使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、可同时检测大批量的样本，适于动物源性食品中三聚氰胺残留的现场监控和大量样本的筛查。

Description

三聚氰胺半抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种三聚氰胺半抗原及其制备方法和应用。

背景技术

三聚氰胺学名1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺，是一种重要的氮杂环有机化工原料，是尿素的后加工品。主要用途是与醛缩合，生成三聚氰胺-甲醛树脂，生产塑料，部分亚洲国家也用来制造化肥。由于三聚氰胺含氮量为66.6％，是蛋白质平均含量的4.16倍，牛奶的151倍，奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1g三聚氰胺，就能提高0.4％蛋白质。食品工业历来通用的蛋白质测试方法为凯氏定氮法，通过测定总氮来估算蛋白质含量。这种方法只能知道氮的总量，不能识别氮的来源和氮源的种类，正是由于食品和饲料工业蛋白质含量测定方法存在缺陷，给不法商人留下制造伪劣食品的机会，他们将三聚氰胺作为食品添加剂，以冒充食品中的蛋白质，因此三聚氰胺也被叫做“蛋白精”。2008年9月，中国爆发的三鹿婴幼儿问题奶粉事件，导致食用受污染奶粉的婴幼儿患肾结石病症，其原因是奶粉中含有三聚氰胺。国家质检总局紧急在全国开展婴幼儿奶粉三聚氰胺含量专项检查，对其余109家乳品企业进行了排查，共检验了这些企业的491批次产品。检查结果显示，有22家婴幼儿奶粉生产企业的69批次产品检出了含量不同的三聚氰胺。此次爆发的事件涉及面之广，危害之大，给人们日常生活造成了巨大的负面影响。我国***等五部门联合发布公告，规定了我国婴儿配方食品中三聚氰胺限量值为1mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg。

目前用来检测三聚氰胺的最常用方法是仪器法，包括气相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法、超高相液相色谱-电喷雾串联质谱法、反相高效液相色谱法、高效液相色谱-四级杆质谱联用法等。仪器法检测成本高，仪器价格昂贵，前处理方法繁琐，检测时间长，并且需要专业技术人员才可操作仪器，不适合现场监控和大量样品的筛查。与之相比，酶联免疫方法具有高精确度和灵敏度、检测成本低、较低的操作技术要求、短暂的检测时间、较大的检测样本量等特点，能够更好地满足我国畜禽养殖户、屠宰场、食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种三聚氰胺半抗原及其制备方法

本发明提供的三聚氰胺半抗原的化合物，分子结构式为式I所示：

本发明所提供的三聚氰胺半抗原的化合物的制备方法包括如下步骤：将三聚氰酸二酰胺与琥珀酸酐混合，加入吡啶在室温下搅拌12-24h，除去溶剂后在乙醇-水中重结晶得三聚氰酸胺的半琥珀酸酯，即为式I所示的化合物；三聚氰酸二酰胺与琥珀酸酐的投料摩尔比为1∶(1-3)，优选为1∶2。

本发明所提供的三聚氰胺抗原的化合物，分子结构式为式II所示：

本发明所提供的三聚氰胺抗原的化合物制备方法包括如下步骤：

取三聚氰胺半抗原溶解于的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到溶液I；将碳化二亚胺(EDC)用用水充分溶解后，加入溶液I中，室温下搅拌12-24h，得到溶液II，时间优选为24h；取偶联的载体蛋白使之充分溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中，并将溶液II滴加到蛋白溶液中，并与室温下搅拌12-24h，得到溶液III，时间优选为24h；用PBS溶液于4℃透析，得到三聚氰胺抗原，分装，并低温保存备用。

其中，载体蛋白可为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白。

上述三聚氰胺半抗原或三聚氰胺抗原化合物在制备三聚氰胺抗体中的应用也属于本发明的保护范围。

由上述化合物式II免疫动物得到的抗体也属于本发明的保护范围。所述抗体为单克隆抗体。

上述任一所述化合物和(或)抗体在检测三聚氰胺中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明以三聚氰酸二酰胺为合成的起始物质，与琥珀酸酐反应，从而获得与载体蛋白直接偶联的活性基团-COOH，获得的三聚氰胺半抗原三聚氰酸二酰胺的半琥珀酸酯再与载体蛋白偶联制备人工抗原。用此方法合成的三聚氰胺半抗原制备得到的抗原免疫动物后能够产生针对三聚氰胺的抗体亲和力高，特异性强，以往采用三聚氰胺原药作为合成的起始物质，与琥珀酸酐反应，得到的三聚氰胺半抗原制备得到的抗原免疫动物后能够产生针对三聚氰胺的抗体的亲和力和特异性比本发明采用的半抗原合成方法得到的半抗原制备的抗体低。本发明制备方法半抗原产率和纯度都较高，方法简单可行，成本较低，适于动物源性食品中三聚氰胺残留的现场监控和大量样本的筛查。

附图说明

图1：三聚氰胺半抗原合成图。

图2：三聚氰胺核磁共振氢谱图。

图3：三聚氰胺ELISA标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例一：三聚氰胺半抗原的合成与鉴定

一、三聚氰胺半抗原合成

取0.64g三聚氰酸二酰胺和1.0g琥珀酸酐，加入10ml吡啶，室温下搅拌12-24h，除去溶剂后在乙醇-水中重结晶得到白色粉末状晶体，为三聚氰酸胺的半琥珀酸酯，即为三聚氰胺半抗原，分子结构如下，合成路线如图1所示：

二、三聚氰胺半抗原的鉴定

取上述式I化合物经核磁共振氢谱进行结构分析，如图2所示，发现图谱中12ppm(mg/L)附近的峰为羧酸上的H，2.7ppm(mg/L)左右的峰为半琥珀酸酐上的两个亚甲基，说明三聚氰胺半抗原合成成功。

实施例二、三聚氰胺抗原的制备

一、免疫原的合成

取30mg三聚氰胺半抗原，溶解于1.5mlDMF中得到溶液I，再取20mg的EDC用0.2m水充分溶解后加入到溶液I中，室温搅拌24h，即可得到溶液II；称取BSA50mg，使之充分溶解在8.3mlpH为7.2的PBS中，将溶液II逐滴缓慢滴加到上述BSA溶液中，于室温下搅拌24h得到溶液III；用0.02mol/LPBS在4℃下透析3天，以除去未反应的小分子物质。将得到的免疫原分装，于-20℃保存备用。

二、包被原的合成

取30mg三聚氰胺半抗原，溶解于1.5mlDMF中得到溶液I，再取20mg的EDC用0.2ml水充分溶解后加入到溶液I中，室温搅拌24h，即得溶液II；称取OVA40mg，使之充分溶解在5.3mlpH为7.2的PBS中，将溶液II逐滴缓慢滴加到上述OVA溶液中，并于室温下搅拌24h得到溶液III；用0.02mol/L的PBS在4℃下透析3天，以除去未反应的小分子物质；将得到的包被原分装，于-20℃保存备用。

三、三聚氰胺抗原的鉴定

将载体蛋白、三聚氰胺半抗原、三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/LpH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200～800nm范围内扫描，得到载体蛋白、三聚氰胺半抗原、三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线，并计算其结合比。结果发现，三者出现不同的吸收曲线，表明三聚氰胺半抗原与载体蛋白偶联成功，半三聚氰胺抗原与牛血清白蛋白的结合比为16-21∶1，半抗原与卵清白蛋白的结合比为18-22∶1。分子结构式为式II所示：

实施例三、三聚氰胺单克隆抗体

一、三聚氰胺单克隆抗体制备

动物免疫：三聚氰胺半抗原与载体蛋白偶联物免疫8-10周龄Balb/c小鼠。

细胞融合与克隆化：取免疫后的鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂聚乙二醇(PEG)4000的作用下融合，筛选获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

经筛选得到三聚氰胺的单克隆杂交瘤细胞株。三聚氰胺的单克隆杂交瘤细胞株可以无限量的产生三聚氰胺特异性抗体，该抗体特异性是针对三聚氰胺的，灵敏度达到0.05μg/L。

细胞冻存和复苏：将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

二、单克隆抗体效价的测定

用间接竞争ELISA法测定抗体的效价为1∶100000～170000。

间接竞争ELISA方法：用三聚氰胺半抗原-卵清白蛋白偶联物包被酶标板，加入三聚氰胺标准品工作液溶液、单克隆抗体工作液和酶标二抗，25℃反应30min，倒出孔内液体，用PBST洗涤液洗涤3～5次，用吸水纸拍干；加入底物显色液，25℃反应15min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。

三、单克隆抗体的特异性

抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该类抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越高。

本实验将三聚氰胺、三聚氰酸和三聚酸二酰胺3种药物做系列稀释，分别与单克隆抗体进行间接竞争ELISA，制作标准曲线，分析得到IC₅₀，然后按下式计算交叉反应率：

结果显示交叉反应率为：三聚氰胺100％，三聚氰酸＜1，三聚氰酸二酰胺＜1。本发明抗体对三聚氰胺有较强的特异性和亲和力。

实施例四、由三聚氰胺单克隆抗体制备的酶联免疫试剂盒

一、三聚氰胺酶联免疫试剂盒，包含下述各组分：

(1)包被有包被原的酶标板。

(2)酶标记抗抗体：辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗抗体。

(3)三聚氰胺单克隆抗体工作液。

(4)标准溶液：采用梯度稀释法配制标准品溶液，得到系列标准品6瓶，浓度分别为0.0μg/L、1.0μg/L、3.0μg/L、9.0μg/L、27.0μg/L、81.0μg/L，以及高浓度标准品10mg/L。

(5)底物显色液A液为过氧化脲溶液，底物显色液B液为四甲基联苯胺溶液。

(6)终止液为2mol/L的硫酸溶液。

(7)浓缩洗涤液为0.6％～1.0％吐温-20和0.01％～0.02％的叠氮化钠防腐剂的0.3～0.6mol/LpH7.4的PBS。

(8)浓缩复溶液为pH值为7.4，含有9％～12％卵清白蛋白、0.1～0.3mol/L的PBS。

本试剂盒的主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。

二、酶联免疫试剂盒检测实际样本的应用

1.样品的前处理

(1)牛奶样品前处理方法

取400μl鲜牛奶样品，加入800μl乙腈，涡动1min，取100μl上清液，再加入500μl的复溶工作液(用去离子水与浓缩复溶液按1∶1体积比进行混合)，涡动混匀。

(2)奶粉样品前处理方法

称取1.0±0.05g奶粉样品至10ml离心管中，加入2.5ml去离子水，涡动1min。移取400μl于2ml离心管中，加入400μl乙腈，再加入400μl甲醇，涡动1min，4000r/min，室温离心5min。取100μl上清液加入到500μl复溶工作液中，涡动混匀，取50μl用于分析。

(3)组织(猪肉、鸡肉、鱼、虾)样品前处理方法

称取1.0±0.02g组织样品至50ml离心管中，加入2ml丙酮，再加入2ml去离子水用振荡器振荡5min，4000r/min，室温下离心5min。取上清液100μl，再加入900μl复溶工作液，涡动混匀，取50μl用于分析。

(4)饲料样品前处理方法

称取1.0±0.05粉碎的饲料样品至50ml离心管中，分别加入5ml丙酮、4ml甲醇、0.5ml1M盐酸溶液和0.5ml去离子水用振荡器振荡5min。4000r/min，室温下离心10min，移取100μl上清液，加入900μl复溶工作液，涡动混匀，取50μl用于分析。

(5)鸡蛋样品前处理方法

称取1.0±0.05g鸡蛋样品至离心管中，分别加入4.5ml去离子水和0.5ml甲醇，用振荡器振荡5min。4000r/min，室温下离心10min，移取100μl上清液，加入300μl复溶工作液，涡动混匀，取50μl用于分析。

2、用试剂盒进行检测

将所需试剂从冷藏环境中取出，不回温直接加样，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。加标准品/样本50μl到对应的微孔中。再加入酶标二抗50μl/孔，最后加入抗体工作液50μl/孔轻轻振荡摇匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液(用去离子水将20×浓缩洗涤液按1∶19体积比进行稀释)250μl/孔，充分洗涤4-5次，用吸水纸拍干。显色：加入底物液A液50μl/孔，再加底物液B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min。测定：加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测)，测定每孔OD值。

3、检测结果分析

标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100％，即得到百分吸光率。以标准品百分吸光率为纵坐标，以三聚氰胺标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图(如图3)。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中三聚氰胺实际浓度。

三、酶联免疫试剂盒技术参数的确定

1.试剂盒灵敏度测定

50％抑制浓度(即IC₅₀，指零标准品溶液的吸光度值的50％处所对应的药物浓度)常作为评价竞争酶联免疫试剂盒的灵敏度指标。利用三聚氰胺标准品溶液进行反应，根据实验结果绘制标准曲线，由图可知试剂盒三聚氰胺标准曲线在1.0～81.0μg/L之间。牛奶、奶粉、组织(猪肉、鸡肉、鱼、虾)、鸡蛋样品中三聚氰胺灵敏度为1μg/L。

2.试剂盒最低检测限

对20份空白样品进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光值的浓度，以20份样品的三聚氰胺测定值的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法在牛奶中检测限为18μg/L、奶粉中检测限为45μg/kg、组织(猪肉、鸡肉、鱼、虾)中检测限为50μg/kg、饲料中的检测限为100μg/kg、鸡蛋样品中检测限为20μg/kg。

3.试剂盒准确度和精密度

分别向空白牛奶样品中添加36μg/L和72μg/L浓度的三聚氰胺；空白奶粉样品中添加90μg/kg和180μg/kg浓度的三聚氰胺；空白组织样品中添加100μg/kg和200μg/kg浓度的三聚氰胺；空白饲料样品中添加100μg/kg和200μg/kg浓度的三聚氰胺；空白鸡蛋样品中添加40μg/kg和80μg/kg浓度的三聚氰胺；进行测定，取3个不同批次的试剂盒，并且每个批次抽取2个试剂盒进行检测，每种样本做6次平行，每个样本重复2次，结果得该方法对牛奶、奶粉、组织(猪肉、鸡肉、鱼、虾)、饲料、鸡蛋样品的回收率为均90±15％，批内变异系数＜15％，批间变异系数＜25％。

4.保存期实验

试剂盒保存条件为2-8℃，经过12个月测定，试剂盒的最大吸光度值、IC₅₀值、三聚氰胺添加实际测定值均在正常范围之内。同时做加速老化和冷冻试验，将试剂盒放在37℃、-20℃中6天，测定结果也表明试剂盒的各项指标正常。从以上结果得到三聚氰胺试剂盒可以在2-8℃保存12个月。

Claims (8)

1.一种化合物，其分子结构式为式I所示：

2.一种制备权利要求1中式Ⅰ所示的化合物的方法，包括如下步骤：将三聚氰酸二酰胺与琥珀酸酐混合，加入吡啶在室温下搅拌12-24h，除去溶剂后在乙醇-水中重结晶得三聚氰酸胺的半琥珀酸酯，即为式Ⅰ所示的化合物。

3.一种化合物，是由权利要求1所述的化合物与载体蛋白偶联得到的，其特征在于分子结构式为式Ⅱ所示：

4.如权利要求3所述的化合物，其特征是其制备方法包括如下步骤：

取三聚氰胺半抗原溶解于的N，N-二甲基甲酰胺中，得到溶液I；将碳化二亚胺用水充分溶解后，加入溶液I中，室温下搅拌12-24h，得到溶液II；取偶联的载体蛋白使之充分溶解在磷酸盐缓冲液中，并将溶液II滴加到蛋白溶液中，并与室温下搅拌12-24h，得到溶液III；用磷酸盐缓冲溶液于4℃透析，得到三聚氰胺抗原，分装，并低温保存备用。

5.如权利要求3所述的化合物，其特征在于所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白。

6.一种三聚氰胺单克隆抗体，是由权利要求3所述化合物免疫动物制备得到。

7.一种检测动物性食品中三聚氰胺残留的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于利用权利要求1所述半抗原制备得到。

8.一种检测动物性食品中三聚氰胺残留的检测方法，其特征在于利用权利要求7所述试剂盒进行检测。