CN105424924A - 一种抗生素检测试纸条及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种抗生素检测试纸条，包括底板，所述底板上依次粘贴有样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，所述反应膜上设有包被有β-内酰胺抗原的检测线B、包被有四环素抗原的检测线T、包被有磺胺类抗原的检测线S和包被有羊抗鼠IgG的质控线C，所述结合垫上包被有β-内酰胺特异性抗体-胶体金标记物、磺胺类特异性抗体-胶体金标记物和四环素特异性抗体-胶体金标记物。本发明还公布了该试纸条的制备方法及在牛奶抗生素检测的应用。本发明的试纸条检测快速；携带方便；灵敏度高；操作简便；便于储存；保质期长；可工业化生产；生产成本低；能够实现一次对β-内酰胺类抗生素、四环素类抗生素和磺胺类抗生素的检测。

Description

一种抗生素检测试纸条及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及免疫学检测领域，具体涉及β-内酰胺类、四环素类和磺胺类抗生素检测试纸条及其制备方法、应用。

背景技术

奶牛在养殖过程中易患疾病，由于抗生素药效好、价格低廉，奶农在奶牛患病时大量使用，尤其是β-内酰胺类，四环素类和黄胺类抗生素被大量使用，导致原料乳中抗生素残留现象普遍，长期摄入含抗生素的食品，可造成药物积累，当达到一定浓度后，就会对人体的健康带来一系列负面影响，如产生过敏反应、破坏胃肠道菌群平衡和增强细菌耐药性等。更为重要的是，抗生素被过量食入健康人肠道，会破坏健康人的正常菌群环境，导致人体免疫力的降低，从而危害消费者的身体健康。欧盟、美国等多个国家都制定了牛奶、肌肉和肾脏等动物源性食品中该类药物的最高残留限量(MRL)，我国农业部235号文件公告对其MRL也做了严格规定，该类药物在牛奶中的MRL为4～100μg/L，在肌肉、肝脏和肾脏中的MRL为50～1000μg/kg。但极少量的产品能够达到该标准。

目前，常用的检测方法中微生物受阻检测方法***低，但是灵敏度低、耗时长、耐药菌的存在容易导致误检；仪器检测方法精确度高，但其存在检测成本高，检测设备复杂，对检测人员的要求较高，检测耗时长等缺点，目前常用的免疫学分析法前处理过程较为复杂，不能实现样品的大规模检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的β-内酰胺类、四环素类和磺胺类抗生素检测耗时长、成本高的缺陷，提供一种灵敏度高，方便快捷的β-内酰胺类、四环素类和磺胺类抗生素检测试纸条及其制备方法、应用。

本发明的技术方案是这样实现的：一种抗生素检测试纸条，包括底板，所述底板上依次粘贴有样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，所述反应膜上设有包被有β-内酰胺抗原的检测线B、包被有四环素抗原的检测线T、包被有磺胺类抗原的检测线S和包被有羊抗鼠IgG的质控线C，所述结合垫上包被有β-内酰胺特异性抗体-胶体金标记物、磺胺类特异性抗体-胶体金标记物和四环素特异性抗体-胶体金标记物。

进一步地，所述反应膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有检测线S、检测线T、检测线B和质控线C。

进一步地，所述底板为PVC底板。

进一步地，所述反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

进一步地，所述β-内酰胺抗原、四环素抗原和磺胺类抗原分别为β-内酰胺类抗生素-载体蛋白、四环素类抗生素-载体蛋白和磺胺类抗原抗生素-载体蛋白。

进一步地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白的一种。

改进地，所述样品垫上还设有MAX标记线。

更进一步地，所述样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫依次搭接粘贴到所述底板上。

一种制备试纸条的方法，包括以下步骤：

1)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；

2)制备含有β-内酰胺特异性抗体-胶体金标记物、四环素特异性抗体-胶体金标记物和磺胺类特异性抗体-胶体金标记物这3种胶体金标抗体的混合物；

3)结合垫的包被：将步骤2)制备的3种胶体金标抗体混合物包被到所述结合垫上，包被后干燥；

4)反应膜的包被：将羊抗鼠IgG、β-内酰胺抗原，四环素抗原和磺胺类抗原包被到反应膜上，分别制得质控线C、检测线B、检测线T和检测线S，包被后干燥；

5)试纸条的组装：在所述底板上依次粘贴样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫。

抗生素检测试纸条在牛奶抗生素检测中的应用。

本发明的一种抗生素检测试纸条，在反应膜上设有包被有β-内酰胺抗原的检测线B、包被有四环素抗原的检测线T、包被有磺胺类抗原的检测线S和包被有羊抗鼠IgG的质控线C，以及在结合垫上包被有β-内酰胺特异性抗体-胶体金标记物、磺胺类特异性抗体-胶体金标记物和四环素特异性抗体-胶体金标记物的能够实现一次对β-内酰胺类抗生素、四环素类抗生素和磺胺类抗生素的检测，由于在结合垫上直接包被这3类抗生素的特异性抗体-胶体金标记物，所述不需要另外设包被有胶体金标抗体提的微管，直接将待测样品滴加或将试纸条***到样品中进行检测即可。

本发明的试纸条具有以下有益效果：本发明的试纸条检测快速，仅需要5-10min；携带方便；灵敏度高；操作简便，不需要对样品进行处理，也不需要单独准备特异性抗体-胶体金标记物，直接将样品滴加或将试纸条***样品即可一次对3类抗生素进行检测；便于储存、保质期长；可工业化生产；生产成本低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的抗生素检测试纸条的结构示意图；

图2为抗生素检测试纸条的结果判断示意图。

图中，1-底板；2-样品垫；3-结合垫；4-反应膜；5-吸水垫。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例，仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：试纸条的制备

1.1胶体金颗粒的制备

取0.01％HAuCl₄水溶液100mL置于烧杯内；加入2mL1％柠檬酸三钠水溶液，用恒温电磁搅拌器加热煮沸15min左右，直至溶液呈红色；室温冷却后加入0.5mL0.2mol/LK₂CO₃混匀。此法制备的胶体金颗粒直径为15nm，且大小均一。将制备好的胶体金颗粒置于4℃冰箱保存备用。

1.2特异性抗体-胶体金标记物的制备

取30mL胶体金溶液加于50mL离心管中，用0.1MK₂CO₃或0.1MHCl调节pH至7.0-7.5，用铝箔纸包住离心管，轻轻振荡；边振荡边逐滴加入1mL含100ugβ-内酰胺特异性抗体溶液，继续振荡20min；边振荡边逐滴加入1mL含100ug四环素特异性抗体溶液，继续振荡20min；边振荡边逐滴加入1mL含100ug磺胺类特异性抗体，继续振荡20min；逐滴加入2mL1％BSA溶液以饱和游离的胶体金，然后于4℃，10000rpm，离心45min。离心后取出离心管，轻轻将上清液吸掉一部分后，用移液枪将管底沉淀的混合有3种胶体金标抗体的混合物吸至2mL的离心管中，4℃保存备用。

其中，β-内酰胺特异性抗体-胶体金标记物中的β-内酰胺特异性抗体是用β-内酰胺抗原作为免疫原制备获得，β-内酰胺特异性抗体可为β-内酰胺单克隆抗体或β-内酰胺多克隆抗体；磺胺类特异性抗体-胶体金标记物中的磺胺类特异性抗体是用磺胺类抗原作为免疫原制备获得，磺胺类特异性抗体可为磺胺类单克隆抗体或磺胺类多克隆抗体；四环素特异性抗体-胶体金标记物中的四环素特异性抗体是用四环素抗原作为免疫原制备获得，四环素特异性抗体可为四环素单克隆抗体或四环素类多克隆抗体；其中，β-内酰胺抗原，四环素抗原和磺胺类抗原分别为β-内酰胺类抗生素-载体蛋白、四环素类抗生素-载体蛋白和磺胺类抗生素-载体蛋白的偶联物，载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白。其中，单克隆抗体的使用进一步增加了检测结果的可靠性。

1.3结合垫的包被

将1.2制备的3种胶体金标抗体的混合物用抗体稀释液(20mMPB，200mMNaCl，1％BSA，0.1％TritonX-100，2％蔗糖，0.01％Proclin300)进行5倍稀释后均匀喷涂在结合垫3上，37℃真空干燥，即得包被有胶体金标抗体的结合垫3。

1.4反应膜的包被

采用金标喷涂仪在反应膜4上分别平行喷涂羊抗鼠IgG、β-内酰胺抗原，四环素抗原和磺胺类抗原，分别制得羊抗鼠IgG质控线C、β-内酰胺抗原检测线B、四环素抗原检测线T和磺胺类抗原检测线S，喷涂后37℃真空干燥后备用，反应膜4上从样品垫2到吸水垫5方向依次包被有检测线S、检测线T、检测线B和质控线C。β-内酰胺抗原，四环素抗原和磺胺类抗原分别为β-内酰胺类抗生素-载体蛋白、四环素类抗生素-载体蛋白和磺胺类抗生素-载体蛋白的偶联物，其中载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白。该反应膜4可以为硝酸纤维素膜(NC膜)或醋酸纤维素膜。

1.5试纸条的组装

先将反应膜4粘贴到底板1上，该底板1为PVC底板，再将胶体金结合垫3和样品垫2逐一粘贴在底板1上，稍为用力压住反应膜4，然后把吸水垫5粘好，其中样品垫2、结合垫3、反应膜4和吸水垫5为依次搭接粘贴到底板1上，样品垫2上还可贴有MAX标记线，将组装好的试纸条用专用切条机切割成3.5mm宽的试纸条，最后将试纸条与干燥剂装入专用的塑料小桶，8条试纸每桶，密封包装。在2～8℃的环境中储存，有效期12个月，同时也可在室温下保存。

制备的试纸条如图1所示，包括底板1、样品垫2、结合垫3、吸水垫5和反应膜4，底板1上依次粘贴有样品垫2、结合垫3、反应膜4和吸水垫5，其中反应膜4上从样品垫2到吸水垫5方向依次设有检测线S、检测线T、检测线B和质控线C，分别包被有磺胺类抗原、四环素抗原、β-内酰胺抗原和羊抗鼠IgG；结合垫3上包被有β-内酰胺特异性抗体-胶体金标记物、磺胺类特异性抗体-胶体金标记物和四环素特异性抗体-胶体金标记物。样品垫2上还可以设有MAX标记线。其中，底板1可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；吸水垫5为吸水纸；反应膜4可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。其中β-内酰胺类抗原为β-内酰胺类抗生素-载体蛋白，四环素类抗原为四环素类抗生素-载体蛋白、磺胺类抗原为磺胺类抗原抗生素-载体蛋白。其中，载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白的一种。

实施例2：试纸条在牛奶检测抗生素中的应用

2.1加样

取生鲜牛奶200ug，直接滴在样品垫2上，或将试纸条的样品垫2***生鲜牛奶中，但不要超过样品垫上的MAX标记线。

2.2结果判断

加样后开始计时，一般应该在5～10min读取，其他时间判读结果无效，优选在孵育6min时读取结果。

2.2.1结果判断标准

如图2所示，

阴性(-)：样品中的抗生素浓度低于试纸条的最低检测浓度时，检测线B、T或S颜色较质控线C深或一样深，表明残留量不超标，判断为阴性，如图2所示，其中检测线B、T和S分别为β-内酰胺抗原检测线B、四环素抗原检测线T和磺胺类抗原检测线S。

阳性(+)：样品中的抗生素浓度高于或等于试纸条的最低检测浓度时，检测线B、T或S颜色较质控线C浅或不显色，表明残留量超标，判断为阳性(如图2所示)，其中检测线B、T或S分别为β-内酰胺抗原检测线B、四环素抗原检测线T和磺胺类抗原检测线S。

β-内酰胺类抗生素呈阳性：β-内酰胺抗原检测线B颜色较质控线C浅或不显色，表明残留量超标，且颜色越浅残留量越多；

四环素类抗生素呈阳性：四环素抗原检测线T颜色较质控线C浅或不显色，表明残留量超标，且颜色越浅残留量越多；

磺胺类抗生素呈阳性：磺胺类抗原检测线S颜色较质控线C浅或不显色，表明残留量超标，且颜色越浅残留量越多；

无效：质控线C未显色，则无论检测线B、检测线T和检测线S是否出现红色条带，试纸条均失效。

注：由于结合垫3上结合有β-内酰胺特异性抗体-胶体金标记物、磺胺类特异性抗体-胶体金标记物和四环素特异性抗体-胶体金标记物这3中抗体的胶体金标记物，在检测时可以一次对3类抗生素进行检测。

2.2.2试纸条的检测原理

将待检样品滴加到样品垫2或将试纸条的样品垫2***到样品中，样品在吸水垫5的作用下由样品垫2向吸水垫5方向扩散，经过包被有β-内酰胺特异性抗体-胶体金标记物、磺胺类特异性抗体-胶体金标记物和四环素特异性抗体-胶体金标记物的结合垫3时，如果样品中含有β-内酰胺类抗生素、四环素类抗生素和磺胺类抗生素的一种或几种时，抗生素就会和结合垫3上相应的特异性抗体-胶体金标记物相结合，进而封闭特异性抗体-胶体金标记物上的相应抗生素的抗原结合点，特异性抗体-胶体金标记物不能与相应的检测线上的抗原结合，胶体金不能聚集显色，因此相应的检测线不显色或显色较质控线浅。如果样品中不含有这3类抗生素，结合垫3上相应的特异性抗体-胶体金标记物就能与相应的检测线上的抗原结合，因此相应的检测线显色较质控线深或与质控线一样。同时羊抗鼠IgG为抗抗体，因此不论特异性抗体-胶体金标记物是否与抗原结合均可与特异性抗体-胶体金标记物结合，因此质控线显色；如果质控线不显色，则试纸条失效。

实施例3：试纸条的灵敏度和特异性检验

3.1灵敏度检测

将β-内酰胺类抗生素和磺胺类抗生素分别用pH为7.4的0.2mol/L的磷酸盐缓冲液稀释成不同浓度，然后用本发明的试纸条进行检测，将不同浓度的抗生素滴加到试纸条的样品垫2。结果表明，本试纸条对β-内酰胺类抗生素、头孢类抗生素和磺胺类抗生素的检测灵敏度分别为：青霉素G4μg/L，氨苄青霉素4μg/L，阿莫西林4μg/L，苯唑青霉素30μg/L，邻青霉素30μg/L，双青霉素30μg/L，萘夫西林30μg/L，头孢喹诺20μg/L，头孢乙腈125μg/L，头孢洛宁20μg/L，头孢唑啉50μg/L，头孢哌酮50μg/L，头孢吡硫60μg/L，头孢噻夫100μg/L，头孢氨苄100μg/L，磺胺多辛100μg/L，磺胺嘧啶100μg/L，磺胺甲恶唑100μg/L，磺胺地托辛100μg/L，磺胺二甲嘧啶100μg/L，磺胺苯沙明100μg/L，磺胺间甲氧嘧啶100μg/L，磺胺甲氧基哒嗪100μg/L，磺胺喹噁啉100μg/L，磺胺氯100μg/L，磺胺甲氧二嗪100μg/L，磺胺异恶唑100μg/L。

3.2特异性检测

将牛奶中常检的其他药物(氟喹诺酮类、克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、群勃龙醋酸酯、氯霉素类、大环内酯类、氨基糖苷类)用pH为7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释，然后用发明的试纸条进行检测，结果显示氟喹诺酮类、克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、群勃龙醋酸酯、氯霉素类、大环内酯类、氨基糖苷类抗生素在500μg/L浓度时，试纸条的三条检测线均为阴性，可以得出本试纸条未对这些药物发生交叉反应。

本发明的试纸条具有以下有益效果：本发明的试纸条检测快速，仅需要5-10min；携带方便；灵敏度高；操作简便，不需要对样品进行处理，也不需要单独准备特异性抗体-胶体金标记物，直接将样品滴加或将试纸条***样品即可一次对3类抗生素进行检测；可工业化生产；生产成本低。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗生素检测试纸条，其特征在于：包括底板，所述底板上依次粘贴有样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，所述反应膜上设有包被有β-内酰胺抗原的检测线B、包被有四环素抗原的检测线T、包被有磺胺类抗原的检测线S和包被有羊抗鼠IgG的质控线C，所述结合垫上包被有β-内酰胺特异性抗体-胶体金标记物、磺胺类特异性抗体-胶体金标记物和四环素特异性抗体-胶体金标记物。

2.根据权利要求1所述的抗生素检测试纸条，其特征在于：所述反应膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有检测线S、检测线T、检测线B和质控线C。

3.根据权利要求1所述的抗生素检测试纸条，其特征在于：所述底板为PVC底板。

4.根据权利要求1所述的抗生素检测试纸条，其特征在于：所述反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

5.根据权利要求1所述的抗生素检测试纸条，其特征在于：所述β-内酰胺抗原、四环素抗原和磺胺类抗原分别为β-内酰胺类抗生素-载体蛋白、四环素类抗生素-载体蛋白和磺胺类抗原抗生素-载体蛋白。

6.根据权利要求5所述的抗生素检测试纸条，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白的一种。

7.根据权利要求1所述的抗生素检测试纸条，其特征在于：所述样品垫上还设有MAX标记线。

8.根据权利要求1所述的抗生素检测试纸条，其特征在于：所述样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫依次搭接粘贴到所述底板上。

9.一种制备权利要求1～8任一项所述的试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；

2)制备含有β-内酰胺特异性抗体-胶体金标记物、四环素特异性抗体-胶体金标记物和磺胺类特异性抗体-胶体金标记物这3种胶体金标抗体的混合物；

3)结合垫的包被：将步骤2)制备的3种胶体金标抗体混合物包被到所述结合垫上，包被后干燥；

4)反应膜的包被：将羊抗鼠IgG、β-内酰胺抗原，四环素抗原和磺胺类抗原包被到反应膜上，分别制得质控线C、检测线B、检测线T和检测线S，包被后干燥；

5)试纸条的组装：在所述底板上依次粘贴样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫。

10.权利要求1～8任一项所述的抗生素检测试纸条在牛奶抗生素检测中的应用。