CN103105491B - 一种检测β-内酰胺类和四环素类抗生素的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测β-内酰胺类抗生素和四环素类抗生素的试剂盒及方法。试剂盒包括微孔条、微孔试剂、试纸和微孔塞，所述的微孔试剂为冻干的胶体金标记的头孢类和四环素类药物特异性抗体，所述头孢类药物特异性抗体可为头孢类药物单克隆抗体或头孢类药物多克隆抗体；所述四环素类药物特异性抗体可分为四环素类药物单克隆抗体或四环素类药物多克隆抗体；所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜、底板，依次连接组成，所述反应膜上包括两条检测线和一条质控线，两条检测线分别包被有头孢类药物-载体蛋白偶联物和四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物，质控线包被有抗抗体。用本发明试剂盒检测β-内酰胺类抗生素和四环素类抗生素的方法，简便、快速、直观、准确、便于携带、适用范围广、成本低、易推广使用。

Description

一种检测β-内酰胺类和四环素类抗生素的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种检测β-内酰胺类和四环素类抗生素的试剂盒及方法。

背景技术

抗生素是20世纪最重要的医学发现之一，对控制人类感染性疾病发挥了巨大作用。但是近年来由于滥用抗生素所导致的耐药病原菌的增加不仅使医疗费用增高，而且使感染性疾病的发病率及死亡率也相应增加。除此之外，抗生素广泛应用于农业与畜牧业也是造成耐药的不可忽略的原因。在乳业中常用β-内酰胺类、四环素类等抗生素药物作用畜类***炎、子宫炎等疾病的治疗，也有生产者在饲料中添加抗生素，以改善畜禽的饲料转化率。美国食品和药品监督管理局(FDA)的调查表明：不注意休药期、用药不合理或是使用违禁药物，是导致动物性食品中抗生素残留的主要原因。长期摄入含抗生素的食品，可造成药物积累，当达到一定浓度后，就会对人体的健康带来一系列负面影响，如产生过敏反应、破坏胃肠道菌群平衡和增强细菌耐药性等。更为重要的是，抗生素被过量食入健康人肠道，会破坏健康人的正常菌群环境，导致人体免疫力的降低，从而危害消费者的身体健康，同时也影响牛奶及乳制品的出口贸易。我国的原料乳中β-内酰胺类和四环素类抗生素残留严重，对其开展监控检测是我国乳品业发展中极为关注的问题。为使牛奶中抗生素问题得到有效监控，符合最大残留限量标准，奶牛场、乳制品厂、政府监督部门、出入境检测、大型食品流通领域等都在努力寻求准确可行的检测方法，许多大型化学试剂和仪器公司也致力于开发β-内酰胺类和四环素类抗生素残留检测的方法和仪器。

目前，牛奶及生鲜奶中β-内酰胺类和四环素类抗生素残留的检测方法依据不同的检测原理，大体可分为三大类：微生物受阻检测、理化检测法、免疫学分析法。微生物受阻检测方法，主要有抑菌圈试验、浑浊度试验、变色型检测金标试剂盒方法，该方法检测***低，但是灵敏度低、耗时长、耐药菌的存在容易导致误检；理化检测方法，是目前检测β-内酰胺类和四环素类抗生素的主要方法，有液相色谱法、色谱/质谱联用技术、气相色谱法等，精确度高，但其存在检测成本高、设备复杂、对检测人员的要求较高，检测耗时长等缺点，目前常用的免疫学分析法，主要为酶联免疫检测法和放射免疫分析法，需要的检测费用还是较高，不适合企业低成本的检测需要。

中国发明专利200810162588.5(CN101429241A)中公开了“青霉素与载体蛋白偶联产物和β-内酰胺类青霉素抗体制备的方法及用途”，该方法中的青霉素单克隆抗体制备的酶联免疫试剂盒仅能检测青霉素G、氨苄青霉素、羧苄青霉素三种β-内酰胺类抗生素，制备的胶体金试纸条检测灵敏度低，检测药物种类少。目前免疫分析领域缺乏能够同时检测β-内酰胺类和四环素类这两类抗生素的技术及其应用。因此，在实践中有必要建立一种敏感度高、操作简单、成本低、检测药物种类多、适合大规模推广的检测方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测β-内酰胺类和四环素类抗生素的试剂盒。

本发明所提供的试剂盒包括微孔条、微孔试剂、微孔塞和试纸条，试纸条包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜，其依次连接；所述微孔试剂为冻干的头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物和四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物；头孢类药物特异性抗体可为头孢类药物单克隆抗体或头孢类药物多克隆抗体，四环素类药物特异性抗体可为四环素类药物单克隆抗体或四环素类药物多克隆抗体；反应膜上包被有两条检测线和一条质控线；当头孢类药物特异性抗体为头孢类药物单克隆抗体时，微孔试剂中包含头孢类单克隆抗体-胶体金标记物，β-内酰胺类药物检测线包被有头孢类药物-载体蛋白偶联物，质控线包被羊抗鼠抗抗体；当头孢类药物特异性抗体为头孢类药物多克隆抗体时，微孔试剂中包含头孢类药物多克隆抗体-胶体金标记物，β-内酰胺类药物检测线包被头孢类药物-载体蛋白偶联物，质控线包被羊抗兔抗抗体；当四环素类药物特异性抗体为四环素类药物单克隆抗体时，微孔试剂中包含四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物，四环素类药物检测线包被有四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物，质控线包被羊抗鼠抗抗体；当四环素类药物特异性抗体为四环素类药物多克隆抗体时，微孔试剂中包含四环素类药物多克隆抗体-胶体金标记物，四环素类药物检测线包被四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物，质控线包被羊抗兔抗抗体；四环素类药物半抗原是通过四环素与4-哌啶甲酸利用曼尼希反应，在四环素的酰胺的胺基上引入了N-甲基-4-哌啶甲酸基团所得到的衍生物，得到四环素类药物半抗原如式I所示：

(式I)

所述保护膜粘贴在样品吸收垫上的检测端，上面有MAX标记线。

所述的四环素类药物检测线靠近样品吸收垫一端，质控线靠近吸水垫一端，β-内酰胺类药物检测线在四环素类药物检测线和质控线之间。其中四环素类药物检测线用检测线(T)表示，β-内酰胺类药物检测线用检测线(B)表示，质控线用质控线(C)表示。以试纸条的样品吸收垫一端为始端，以试纸条的吸水垫一端为末端，质控线(C)距离反应膜与吸水垫始端相连的一端为5-8mm，检测线(B)距离质控线(C)4-6mm，检测线(T)距离检测线(B)4-6mm。

所述头孢类药物-载体蛋白偶联物是由头孢类药物与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述四环素类半抗原-载体蛋白偶联物是由式I化合物的四环素类药物半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物中的头孢类药物特异性抗体是以头孢类药物-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。

所述四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物中的四环素类药物特异性抗体是以四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。

所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；吸水垫为吸水纸；保护膜为PE材质保护膜。

本发明的另一个目的是提供了一种制备上述试剂盒的方法，其包括步骤：

1)在微孔条上制备冻干的头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物和四环素类特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂，并用微孔塞盖在微孔条上；

2)制备两条分别具有包被头孢类药物-载体蛋白偶联物和四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和一条包被抗抗体的质控线的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸条；

4)将1)和3)制备好的冻干有头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物和四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂、试纸条、微孔条以及微孔塞组装成试剂盒。

具体的说，步骤包括：

1、β-内酰胺类药物抗原的合成及其抗体的制备

1)将头孢类药物与载体蛋白偶联，形成头孢类药物-载体蛋白偶联物；

2)用头孢类药物-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌头孢类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株或用头孢类药物-载体蛋白免疫兔，得到头孢类药物多克隆抗体；

3)提取小鼠IgG或兔IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗体或羊抗兔抗抗体；

2、四环素类药物抗原合成及其抗体制备

1)取1.1-2.2g四环素、0.37-0.75g的4-哌啶甲酸和2-5ml37％甲醛在50-100ml乙醇的中混合，四环素的用量优选1.1g，4-哌啶甲酸的用量优选2ml，甲醛的用量优选2ml，乙醇的用量优选50ml，在60％微波强度下反应3-5min，反应时间优选为3min，除去溶剂后，反相柱层析分离，得到黄色固体，即为四环素类药物半抗原；

2)将四环素类药物半抗原与载体蛋白偶联，形成四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物；

3)用四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌四环素类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株或用四环素类药物半抗原-载体蛋白免疫兔，得到四环素类药物多克隆抗体；

4)提取小鼠IgG或兔IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗体或羊抗兔抗抗体；

3、用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

4、将制备的头孢类药物特异性抗体和四环素类药物特异性抗体分别加入到制备的胶体金中，得到头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物和四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

5、将头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物和四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂冻干在微孔条中后，将微孔条上盖上微孔塞；

6、将样品吸收垫用含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0.5％(体积百分含量))、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，在37℃下烘干2h；

7、在底板上按顺序贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜；

8、将制备好的微孔试剂、试纸条、微孔条和微孔塞组装成试剂盒，2-8℃条件下保存12个月。

本发明的另一个目的提供了一种牛奶样本中β-内酰胺类和四环素类抗生素残留的检测方法。

用本发明上述任一所述试剂盒进行检测。

本发明试剂盒的检测原理：将待检牛奶样本滴加于包含有微孔试剂的微孔条中，混匀后，孵育5min，将标有MAX标记线端向下，***包含有孵育后的微孔试剂微孔条中，待检样品液与微孔中的金标抗体结合后一起向反应膜扩散；若待检样品液中β-内酰胺类或四环素类抗生素的含量高，则扩散过程中待测样品液中的β-内酰胺类或四环素类抗生素可与金标抗体相结合，进而完全封闭金标抗体上β-内酰胺类抗生素或四环素类抗生素的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上头孢类药物-载体蛋白偶联物结合或反应膜上的四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物的结合，相对应的β-内酰胺类抗生素检测线或四环素类抗生素检测线不能显色，而抗抗体则可与头孢类金标抗体或四环素类金标抗体结合，质控线显色；若待检样品液中β-内酰胺类抗生素或四环素类抗生素的含量低或者无，则对应的头孢类金标抗体或四环素类金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭，进而头孢类金标抗体会与反应膜上头孢类药物-载体蛋白偶联抗原结合或四环素类金标抗体会与反应膜上四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联抗原结合，对应的β-内酰胺类药物检测线显色或四环素类检测线显色，同时抗抗体也可与头孢类金标抗体或四环素类金标抗体结合，质控线显色；如果质控线不显色，则试纸条失效。

阴性：质控线(C)和检测线(B)和检测线(T)都显示出红色条带，判为阴性，用“-”表示。其中检测线(B)表示β-内酰胺类药物检测线，检测线(T)表示四环素类药物检测线。

β-内酰胺类药物呈阳性：质控线(C)和检测线(T)显示出红色条带，而检测线(B)不显色，判为阳性，用“+”表示。

四环素类药物呈阳性：质控线(C)和检测线(B)显示出红色条带，而检测线(T)不显色，判为阳性，用“+”表示。

β-内酰胺类和四环素类药物均呈阳性：质控线(C)显示出红色条带，检测线(T)和检测线(B)均不显色，判为阳性，用“+”表示。

无效：当质控线(C)不显示红色条带，则无论检测线(T)和检测线(B)是否出现红色条带，试纸条均失效。

本发明试剂盒可检测β-内酰胺类药物包括：青霉素G、萘夫西林、氨苄青霉素、头孢哌酮、阿莫西林、头孢曲松、苯唑青霉素、头孢噻呋、邻青霉素、头孢洛宁、双青霉素、头孢喹肟；可检测四环素类药物包括：四环素、土霉素、强力霉素、氯四环素。

本发明的试剂盒具有如下有益效果：

1、灵敏度高：传统的试纸卡均具有固定试纸条的卡壳固定装置，卡壳固定装置紧紧地将试纸条固定其中，在对样品检测时，由于卡壳与试纸条结合的比较紧密，致使检测样品溶液不能够充分渗透到样品吸收垫一段，并在试纸条上进行层析的速度十分缓慢，导致检测样品中的药物不能够与检测线上包被的包被原充分接触，致使试纸卡的灵敏度下降。本发明试剂盒比传统试纸卡的检测灵敏度高，由于本发明试剂盒的试纸条为裸条状，无需壳体紧固装置，检测样品可以直接接触试纸条的样品吸收垫一端，并且样品在试纸条上的层析速度比较快，使样品中的待检药物能够充分的与检测线上包被的包被原结合，从而提高了试纸条的检测灵敏度。β-内酰胺类和四环素类抗生素检测试剂盒以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。其中的头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物和四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂条中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。因此，本发明试剂盒具有较高的特异性和灵敏度。本试剂盒对β-内酰胺类药物检测灵敏度分别为：青霉素G2μg/L、氨苄青霉素3μg/L、阿莫西林4μg/L、苯唑青霉素6μg/L、邻青霉素6μg/L、双青霉素6μg/L、萘夫西林20μg/L、头孢喹肟20μg/L、头孢哌酮40μg/L、头孢曲松50μg/L、头孢噻呋90μg/L、头孢洛宁10μg/L；对四环素类药物检测灵敏度为：四环素、土霉素、强力霉素、氯四环素分别为80μg/L。

2.操作简便快速：对于以往的试纸卡检测原料奶必须要将原料奶加入稀释液进行稀释才能够点样检测，原因是由于固定试纸条的塑料壳体紧紧地把试纸条固定在壳体内，而原料奶比较粘稠，所以直接将原料奶在试纸卡的加样孔进行点样检测的话，由于壳体与试纸条结合紧密以及奶液粘稠所致，原料奶样品无法完全渗透到样品吸收垫和结合物释放垫中，并且在试纸条上的层析速度比较缓慢，以至于无法检测，故要将原料奶加入稀释液进行稀释后方可检测。使用本发明试剂盒检测时无需任何其它试剂，检测原料奶时，也不需要对原料奶进行稀释，原因由于本发明试剂盒中的试纸条为裸条状，即无需用壳体对其进行固定，只要将待检样品溶液直接滴加于冻干有头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物和四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔中，混匀后，孵育5min，再将试纸条标有MAX线标记端向下，***孵育后的微孔试剂中，试纸条可以与样品溶液充分接触，5min后观察结果。对于牛奶样品的检测，本发明试剂盒比传统试纸卡检测时间短，由于本发明试剂盒无需对样品进行稀释，可直接对样品进行检测。

本发明试剂盒敏感度高、检测药物种类多、成本低、操作简单、便于携带、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的头孢类药物单克隆抗体和四环素类药物单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性；将金标抗体冻干在微孔条中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。本发明试剂盒能够同时检测β-内酰胺类和四环素类两类抗生素，实现了一个试纸条对多类抗生素的检测，满足了市场上对β-内酰胺类和四环素类抗生素同时检测的需求。用本发明试剂盒检测β-内酰胺类抗生素和四环素类抗生素的方法，简便、快速、直观、准确，适用范围广，成本低，易推广使用。

附图说明

图1冻干有金标抗体的微孔条图。

图2微孔塞俯视图。

图3微孔塞剖面结构示意图。

图4试纸条剖面结构示意图。

图5试纸条的俯视图。

图6四环素类药物半抗原合成路线图。

图7试纸条检测方法示意图。

图8试纸条检测结果判定图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、检测β-内酰胺类和四环素类抗生素的试剂盒的构成

一、冻干有金标抗体的微孔条

所述微孔条中装有微孔试剂，其中1为微孔条，2为冻干的头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物和四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

所述包含有微孔试剂的微孔条上具有微孔塞3(图2和图3)；

所述微孔条中冻干的头孢类类药物单克隆抗体-胶体金标记物和四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物的冻干量为0.20-0.25μg/ml；四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物的冻干量为0.30-0.40μg/ml。

二、试纸条(图4和图5)

所述试纸条是由底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜组成；

所述样品吸收垫4、反应膜5、吸水垫6和保护膜7依次按顺序黏贴在所述底板8上，样品吸收垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；

保护膜7覆盖在样品吸收垫上的检测端，在检测端保护膜上应有MAX字样。

所述反应膜上有两条检测线分别为检测线(T)9-1和检测线(B)9-2以及一条质控线(C)10，两条检测线和一条质控线均为与所述试纸条的长相垂直的条带状，两条检测线位于近于有MAX标记线的保护膜的一侧，质控线(C)位于远离有MAX标记的保护膜的一侧。质控线(C)距离反应膜的末端与吸水垫相连的一端为5-8mm，检测线(B)距离质控线(C)4-6mm，检测线(T)距离检测线(B)4-6mm。检测线(T)包被有四环素类半抗原-载体蛋白偶联物(四环素类药物半抗原-卵清白蛋白)，检测线(B)包被有头孢类药物-载体蛋白偶联物(头孢类药物-牛血清白蛋白的偶联物)，质控线(C)包被有羊抗鼠抗抗体。

底板为PVC底板；样品吸收垫为吸滤纸；吸水垫为吸水纸；反应膜为硝酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。

将上述试纸条与微孔试剂、微孔条以及微孔塞组装成试剂盒，在2～8℃的环境中储存，有效期12个月。

实施例2、实施例1中所述试剂盒的制备方法

一、试剂盒的制备

该试剂盒的制备方法主要包括如下步骤：

1)在微孔条中制备冻干的头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物和四环素类单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，并用微孔塞盖在微孔条上。

2)制备具有包被头孢类药物-载体蛋白偶联物的检测线(B)、包被四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线(T)和包被羊抗鼠抗抗体的质控线(C)的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸条；

4)将1)和3)制备好的冻干有头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物和四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂、试纸条、微孔条以及微孔塞组装成试剂盒。

下面分步详细叙述：

(一)各部件的制备

1、抗原的制备

1)、头孢类药物-载体蛋白偶联物的合成与鉴定

头孢类药物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。

a.免疫原的制备-头孢类药物与卵清白蛋白偶联物合成

取头孢匹林的钠盐40mg，用1.5ml双蒸水溶解，得到(I)液；取碳化二亚胺(EDC)40mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)60mg用0.5ml水溶解得到(II)液；在搅拌状态下将(II)加入(I)中，反应1h，得到(III)液；取卵清白蛋白(OVA)60mg用8ml水溶解，得到(IV)液；将(IV)加入(III)中，室温搅拌反应24h得到免疫原，用0.02mol/LPBS透析3天，分装、冻存。

b.包被原的制备-头孢类药物与牛血清白蛋白偶联物合成

取头孢匹林的钠盐40mg，用1.5ml双蒸水溶解，得到(I)液；取EDC40mg和NHS60mg用0.5ml水溶解得到(II)液；在搅拌状态下将(II)加入(I)中，反应1h，得到(III)液；取牛血清白蛋白100mg用8ml水溶解，得到(IV)液；将(IV)加入(III)中，室温搅拌反应24h分别得到包被原，用0.02mol/LPBS透析3天，分装、冻存。

c.头孢类药物-载体偶联物的鉴定

将载体蛋白、头孢类药物、头孢类药物-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/LpH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200-800nm范围内扫描，得到载体蛋白、头孢类药物、头孢类药物-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明头孢类药物与载体蛋白偶联成功。

2)、四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定

a.四环素类药物半抗原合成(图6)

取1.1g四环素、0.37g4-哌啶甲酸和2ml37％甲醛在50ml乙醇的溶液中混合，利用曼尼希反应在60％微波强度下反应3min，在四环素的酰胺的胺基上引入了N-甲基-4-哌啶甲酸基团，除去溶剂后，反相柱层析分离，得到黄色固体，即为四环素半抗原，分子结构如下：

(式I)

b.免疫原的制备-四环素类药物半抗原与BSA偶联物合成

取10mg式I化合物的四环素类药物半抗原用1ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解得到I溶液，冷却至10℃，取氯甲酸异丁酯10μl加入I溶液中，10℃搅拌反应30min得到II溶液。取40mgBSA用3ml50mmol/L的Na₂CO₃溶解并与II溶液于10℃反应4h，然后4℃过夜。用0.01mol/LPBS在4℃下透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，分装，于-20℃保存备用。

c.包被原的制备-四环素类药物半抗原与OVA偶联物合成

取18mg式I化合物的四环素类药物半抗原溶解于2mlDMF中，得到I溶液，取25mgEDC用0.2ml水充分溶解后加入I溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液II溶液。称取OVA36mg，使之充分溶解在8mlPBS(pH7.2)中，将II溶液逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/LPBS在4℃下透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于-20℃保存备用。

d、四环素类药物半抗原-载体偶联物的鉴定

将载体蛋白、四环素类药物半抗原、四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/LpH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200-800nm范围内扫描，得到载体蛋白、四环素类药物半抗原、四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明四环素类药物半抗原与载体蛋白偶联成功。

2、头孢类药物和四环素类药物的单克隆抗体的制备

(1)制备单抗

a.动物免疫

将步骤1得到的两种免疫原分别注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

b.细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选分别得到稳定分泌头孢类药物单克隆抗体的头孢类药物单克隆杂交瘤细胞株和分泌四环素类药物单克隆抗体的四环素类药物单克隆杂交瘤细胞株。

c.细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

d.单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。

3、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

4、单克隆抗体-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备

用双蒸去离子水将1％氯金酸(购于sigma公司，产品目录号T09041)稀释成0.01％(质量百分含量)，置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每100ml0.01％氯金酸加入2.5ml1％柠檬酸三钠(购于广州化学试剂厂，产品目录号BG11-AR-01KG)，继续搅拌加热反应至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

(2)单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.0，按100-150μg抗体/ml胶体金的标准向胶体金溶液中分别加入上述头孢类药物单克隆抗体和四环素类单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10％BSA至BSA在胶体金溶液中的终浓度为1％(体积百分含量)，静置30min。12000rpm、4℃离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，得到的头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物溶液和四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物溶液的浓度分别为50μg单抗/ml溶液，置4℃备用。

复溶缓冲液：含酪蛋白、吐温-80的0.02mol/L、pH7.2的磷酸盐溶液，其中酪蛋白在复溶缓冲液中的终浓度为0.05％-0.1％(体积百分含量)，吐温-80在复溶缓冲液中的终浓度为0.05％-0.15％(质量百分含量)。

5、单克隆抗体-胶体金标记物微孔试剂冻干到微孔条中

向微孔条中加入50μl头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物和50μl四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，冷阱温度为-70℃条件下，预冻4h后，再冻干14h，即可取出，得到的微孔条中冻干有头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物和四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂。头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物的冻干量为0.20-0.25μg/ml；四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物的冻干量为0.30-0.40μg/ml。

6、样品吸收垫的准备

将样品吸收垫置于含BSA(BSA在缓冲液中的终浓度为0.5％(体积百分含量))、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘2h备用。

7、反应膜的制备

包被过程：用磷酸缓冲液将头孢类药物-牛血清白蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(B)包被量为1.0μg/cm²；用磷酸缓冲液将四环素类药物半抗原-牛血清白蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T)，包被量为1.5μg/cm²；用0.01mol/L、pH7.4PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200μg/ml，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C)，包被量为1.0μg/cm²。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

(二)各部件的组装

1、试纸条的组装

将所述样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次按顺序黏贴在所述底板上；样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；在组装好试纸条的吸收垫一端黏贴保护膜。

2、试剂盒组装

将上述步骤1得到试纸条、微孔试剂、微孔条及微孔塞组装成试剂盒，在2～8℃的环境中储存，有效期12个月。

二、试剂盒的灵敏度和特异性检验

本发明试剂盒可检测β-内酰胺类药物包括：青霉素G、萘夫西林、氨苄青霉素、头孢哌酮、阿莫西林、头孢曲松、苯唑青霉素、头孢噻呋、邻青霉素、头孢洛宁、双青霉素、头孢喹肟；可检测四环素类药物包括：四环素、土霉素、强力霉素、氯四环素。

(一)灵敏度试验

将β-内酰胺类药物：青霉素G、萘夫西林、氨苄青霉素、头孢哌酮、阿莫西林、头孢曲松、苯唑青霉素、头孢噻呋、邻青霉素、头孢洛宁、双青霉素、头孢喹肟以及四环素类药物：四环素、土霉素、强力霉素、氯四环素标准品(购自德国Dr和中国兽医药品监察所)稀释成如下不同浓度：1、2、4μg/L青霉素G；1.5、3、6μg/L氨苄青霉素；2、4、8μg/L阿莫西林；3、6、12μg/L苯唑青霉素、邻青霉素、双青霉素；10、20、40μg/L萘夫西林、头孢喹肟；20、40、80μg/L头孢哌酮；25、50、100μg/L头孢曲松；45、90、180μg/L头孢噻呋；5、10、20μg/L头孢洛宁；40、80、160μg/L四环素、土霉素、强力霉素、氯四环素。所用的稀释液为pH为7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。

用试剂盒进行检测。每次向包含有金标抗体微孔试剂的微孔条中滴加200μl样品，混匀，孵育5min后，将试纸条***检测，结果为：滴试β-内酰胺类药物：1μg/L青霉素G；1.5μg/L氨苄青霉素；2μg/L阿莫西林；3μg/L苯唑青霉素、邻青霉素、双青霉素；10μg/L萘夫西林、头孢喹肟；20μg/L头孢哌酮；25μg/L头孢曲松；45μg/L头孢噻呋；5μg/L头孢洛宁；四环素类药物：40μg/L四环素、土霉素、强力霉素、氯四环素时，试纸条上显示出肉眼可见的三条红色条线，呈阴性；当滴试2、4μg/L青霉素G；3、6μg/L氨苄青霉素；4、8μg/L阿莫西林；6、12μg/L苯唑青霉素、邻青霉素、双青霉素；20、40μg/L萘夫西林、头孢喹肟；40、80μg/L头孢哌酮；50、100μg/L头孢曲松；90、180μg/L头孢噻呋；10、20μg/L头孢洛宁时，试纸条质控线显色，检测线(B)不显色，呈阳性；当滴视四环素类药物：80、160μg/L四环素、土霉素、强力霉素、氯四环素时，试纸条质控线显色，检测线(T)不显色，呈阳性；表明，本试剂盒对β-内酰胺类药物检测灵敏度分别为：青霉素G2μg/L、氨苄青霉素3μg/L、阿莫西林4μg/L、苯唑青霉素6μg/L、邻青霉素6μg/L、双青霉素6μg/L、萘夫西林20μg/L、头孢喹肟20μg/L、头孢哌酮40μg/L、头孢曲松50μg/L、头孢噻呋90μg/L、头孢洛宁10μg/L。本试剂盒对四环素类检测灵敏度为：四环素、土霉素、强力霉素、氯四环素分别为80μg/L。

(二)特异性试验

特异性常用交叉反应率表示，是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。本试剂盒对β-内酰胺类药物：青霉素G、氨苄青霉素、阿莫西林、苯唑青霉素、邻青霉素、双青霉素、萘夫西林、头孢喹肟、头孢哌酮、头孢曲松、头孢洛宁、头孢噻呋检测灵敏度分别为2μg/L、3μg/L、4μg/L、6μg/L、6μg/L、6μg/L、20μg/L、20μg/L、40μg/L、50μg/L、10μg/L、90μg/L；本试剂盒对四环素类：四环素、土霉素、强力霉素、氯四环素检测灵敏度分别为80μg/L。将牛奶中常检的其他药物(克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、三聚氰胺、群勃龙醋酸酯、磺胺类、氯霉素类、大环内酯类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类)用pH为7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释。用实施例1中所述的试剂盒进行检测，结果显示克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、三聚氰胺、群勃龙醋酸酯、磺胺类药物、氯霉素类药物、大环内酯类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类药物在500μg/L浓度时，试纸条一条质控线和两条检测线均显色，可以得出本试剂盒未对这些药物发生交叉反应。

实施例3、试纸条的应用

一、用实施例1中所述试剂盒检测牛奶中β-内酰胺类抗生素和四环素类抗生素

本发明的试剂盒可以检测牛奶样品。一般的检测方法如下：

1、检测方法

将盖在微孔条上的微孔塞揭掉，向包含有微孔试剂的微孔条中滴加需检测的样品溶液，得到微孔试剂和样品溶液的混合溶液11，混匀后，孵育5min，将试纸条12有MAX线标记端朝下***微孔条中，在5min内观看结果，如图7所示。

2、检测结果判定

β-内酰胺类抗生素或(和)四环素类药物在样品中浓度高于或等于试剂盒最低检测限时，胶体金抗体与β-内酰胺类抗生素或(和)四环素类抗生素结合，从而在检测区内因为竞争反应不会与头孢类药物偶联物或(和)四环素类偶联物结合而不出现红色检测线(B)或(和)检测线(T)，呈阳性。当β-内酰胺类抗生素或(和)四环素类药物在样品中浓度低于试剂盒最低检测限时，在检测过程中由于缺少抗体抗原竞争反应，检测线(B)或(和)检测线(T)以及质控线(C)将会呈现红色条状带。如图8所示。

阴性：质控线(C)和检测线(B)和检测线(T)都显示出红色条带，判为阴性，用“-”表示。如图8a所示。

β-内酰胺类药物呈阳性：质控线(C)和检测线(T)显示出红色条带，而检测线(B)不显色，判为阳性，用“+”表示。如图8b所示。

四环素类药物呈阳性：质控线(C)和检测线(B)显示出红色条带，而检测线(T)不显色，判为阳性，用“+”表示。如图8c所示。

β-内酰胺类和四环素类药物均呈阳性：质控线(C)显示出红色条带，检测线(T)和检测线(B)均不显色，判为阳性，用“+”表示。如图8d所示。

无效：当质控线(C)不显示红色条带，则无论检测线(T)和检测线(B)是否出现红色条带，试纸条均失效。如图8e1、8e2、8e3、8e4所示。

下面具体举例：

1、假阳性率测定

取经过LC-MS/MS确证的阴性牛奶样品50份，编号为1#-50#，将样品用本发明试纸条进行检测，计算其假阳性率。

结果：在50份阴性牛奶样品测定中，试纸条检测结果为全部阴性，本发明试纸条假阳性率为0。

2、假阴性率测定

取经LC-MS/MS确证的阴性牛奶样品160份，分别按规定的检测限浓度添加青霉素G、氨苄青霉素、阿莫西林、苯唑青霉素、邻青霉素、双青霉素、萘夫西林、头孢喹肟、头孢哌酮、头孢曲松、头孢洛宁、头孢噻呋、四环素、土霉素、强力霉素、氯四环素药物，每种药物添加各10份样品，将样品用本发明试纸条进行检测，计算其假阴性率。

结果：在160份阳性牛奶样品的测定中，试纸条检测出的阴性样品为0份，假阴性率为0。本发明的检测β-内酰胺类抗生素和四环素类抗生素的试剂盒可以同时对β-内酰胺类和四环素类抗生素残留进行快速检测。

Claims (10)

1.一种检测β-内酰胺类和四环素类抗生素的试剂盒，其特征在于包括试纸条、微孔条、微孔试剂和微孔塞，所述试纸条包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板，所述反应膜上有两条检测线和一条质控线，两条检测线分别包被有头孢类药物-载体蛋白偶联物和四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物，质控线包被有抗抗体，所述微孔试剂为冻干的头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物和四环素类特异性抗体-胶体金标记物，所述四环素类药物半抗原是通过四环素与4-哌啶甲酸利用曼尼希反应，在四环素的酰胺的胺基上引入了N-甲基-4-哌啶甲酸基团所得到的衍生物，制备步骤为：

取1.1g四环素、0.37g4-哌啶甲酸和2ml37％甲醛在50ml乙醇的溶液中混合，利用曼尼希反应在60％微波强度下反应3min，在四环素的酰胺的胺基上引入了N-甲基-4-哌啶甲酸基团，除去溶剂后，反相柱层析分离，得到黄色固体，即为四环素半抗原，分子结构如式Ⅰ：

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试纸条由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次黏贴在底板上组成，所述微孔条上具有微孔塞。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述保护膜粘贴在试纸条的样品吸收垫上，为检测端，上面有MAX标记线。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的四环素类药物检测线靠近样品吸收垫一端，质控线靠近吸水垫一端，β-内酰胺类药物检测线在四环素类药物检测线和质控线之间。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述头孢类药物-载体蛋白偶联物由头孢类药物与载体蛋白偶联得到，所述四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物由式I化合物的四环素类药物半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物中的头孢类药物特异性抗体是以头孢类药物-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述头孢类药物特异性抗体为头孢类药物单克隆抗体或头孢类药物多克隆抗体；四环素类特异性抗体-胶体金标记物中的四环素类药物特异性抗体是以四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述四环素类药物特异性抗体为四环素类药物单克隆抗体或四环素类药物多克隆抗体。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述微孔条底部含有冻干的头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物和四环素类特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述微孔塞能够紧密地塞在微孔条中。

9.一种制备权利要求1-8任一项所述的试剂盒的方法，其包括步骤：

1)分别制备冻干有头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物和四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

2)分别制备具有包被头孢类药物-载体蛋白偶联物和包被有四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物的两条检测线和包被抗抗体的质控线的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、保护膜、吸水垫、底板组装成试纸条；

4)将1)和3)制备好的冻干有头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物和四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂、微孔条、微孔塞和试纸条组装成试剂盒。

10.一种同时检测牛奶样品中β-内酰胺类抗生素和四环素类抗生素残留的检测方法，其特征在于直接将试纸条***包含有检测样品溶液和微孔试剂的混合溶液的微孔中进行检测，其包括步骤：

1)用权利要求1-8任一项所述的试剂盒进行检测；

2)分析检测结果。