CN110907436A - 一种牛奶致敏原的化学发光免疫检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种牛奶致敏原的化学发光免疫检测试剂盒及检测方法。一种牛奶致敏原的化学发光免疫检测试剂盒，包括：能够识别α‑乳白蛋白单克隆抗体和β‑乳球蛋白单克隆抗体的Protein G、能够特异性识别牛奶α‑乳白蛋白的α‑乳白蛋白单克隆抗体、能够特异性识别牛奶β‑乳球蛋白的β‑乳球蛋白单克隆抗体、α‑乳白蛋白、β‑乳球蛋白、化学发光底物液。该方法具有高特异性、高灵敏度、成本低廉、易于保存等优点，其制成的牛奶致敏原检测试剂盒，可用于定量检测牛奶致敏原α‑乳白蛋白和β‑乳球蛋白。

Description

一种牛奶致敏原的化学发光免疫检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及致敏原检测领域，具体涉及一种牛奶致敏原的化学发光免疫检测试剂盒，本发明还涉及使用上述试剂盒对应的检测方法。
背景技术
食物过敏是人类最为常见的健康问题。牛奶富含蛋白质及多种矿物质，俗称“白色血液”，是婴幼儿早期接触的第一个也是最常见的食物致敏原，在儿童中发病率大约为0.3％～7.5％。目前，美国、欧盟和新西兰等国家均要求对致敏食品进行致敏原标示，以提醒消费者，避免误食。因此，致敏原含量的检测是进行过敏食品的生产、评估和标示工作的基础和首要任务。α-乳白蛋白和β-乳球蛋白是引发牛奶过敏的主要致敏原之一。目前，牛奶致敏原的检测方法主要有ELISA、RT-PCR、LC-MS等技术。这些方法都需要高端仪器设备及专业人员操作，检测时间较长，操作较为复杂。由此，牛奶致敏原的检测方法有待改进。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛奶致敏原的化学发光免疫检测试剂盒，本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种牛奶致敏原的化学发光免疫检测方法。该方法具有高特异性、高灵敏度、成本低廉、易于保存等优点，其制成的牛奶致敏原检测试剂盒，可用于定量检测牛奶致敏原α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。
一种牛奶致敏原的化学发光免疫检测试剂盒，包括：能够识别α-乳白蛋白单克隆抗体和β-乳球蛋白单克隆抗体的Protein G、能够特异性识别牛奶α-乳白蛋白的α-乳白蛋白单克隆抗体、能够特异性识别牛奶β-乳球蛋白的β-乳球蛋白单克隆抗体、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、化学发光底物液；Protein G的浓度为15～20μg/mL；α-乳白蛋白单克隆抗体的浓度为1～1.5μg/mL；β-乳球蛋白单克隆抗体的浓度为1～1.5μg/mL；α-乳白蛋白、β-乳球蛋白浓度均为100μg/mL；化学发光底物液包括辣根过氧化酶HRP、p-溴苯酚和鲁米诺；所述辣根过氧化酶HRP浓度为20～25μmol/L，所述p-溴苯酚浓度为40～50mmol/L，所述鲁米诺的浓度为10～15mmol/L，pH为10～11。
所述Protein G与上述两个单克隆抗体的Fc片段特异性结合，使得Protein G-单克隆抗体可以特异性识别牛奶致敏原α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。
一种牛奶致敏原的化学发光免疫检测方法，其包括：
a、依次将Protein G和α-乳白蛋白单克隆抗体、β-乳球蛋白单克隆抗体结合在酶标板上，形成Protein G-单克隆抗体复合物；
b、配制系列浓度牛奶致敏原蛋白，加入酶标板，孵育，使Protein G-单克隆抗体特异性识别牛奶致敏原蛋白；
c、依次加入H2O2溶液和化学发光底物液，孵育，测定信号值。
所述步骤a中Protein G的浓度为18～20μg/mL。
所述步骤a中α-乳白蛋白单克隆抗体、β-乳球蛋白单克隆抗体的浓度为1.2～1.5μg/mL。
所述步骤c中反应时间为20～30min。
本发明的有益效果是：根据本发明的试剂盒，通过上述化学发光酶免疫测定法，相对于传统的ELISA具有抗干扰、灵敏性强、特异性强等优点，使得该试剂盒可特异性识别牛奶α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，且灵敏性高、特异性强、不易出现假阳性、成本低、设备要求低且检测周期短，广泛适用于牛奶致敏原的检测。上述化学发光酶免疫测定法是将化学发光和ELISA相结合的一种技术，与常规ELISA相比，具有更高的灵敏度和信噪比，且具有线性范围宽、分析方法更简便快速、特异性高、稳定性强等特点，有良好的应用前景。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明实施例α-乳白蛋白标准曲线拟合结果图。
图2为根据本发明实施例β-乳球蛋白标准曲线拟合结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以***其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1
牛奶致敏原检测试剂盒的制备：
将Protein G、α-乳白蛋白单克隆抗体、β-乳球蛋白单克隆抗体、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、化学发光底物液，获得检测试剂盒。其中，Protein G为重组链球菌蛋白G，浓度为1mg/mL；α-乳白蛋白单克隆抗体浓度为1mg/mL；β-乳球蛋白单克隆抗体浓度为1mg/mL；α-乳白蛋白浓度为100μg/mL；β-乳球蛋白浓度为100μg/mL；化学发光底物液包括浓度为20μmol/L的辣根过氧化酶HRP、浓度为40mmol/L的p-溴苯酚和浓度为10mmol/L的鲁米诺，pH为10。
该检测试剂盒使用时，首先将Protein G用pH为8.6,浓度为10mmol/L的PBS缓冲液稀释至15μg/mL，100μL/well加入96孔板中，4℃过夜；充分洗涤后，将1％BSA(w/v)200μL/well加入96孔板中，25℃放置1h，以封闭非特异性结合位点；充分洗涤后，将α-乳白蛋白单克隆抗体或β-乳球蛋白单克隆抗体用pH为7.0,浓度为10mmol/L的PBS缓冲液稀释至1μg/mL，100μL/well加入96孔板中，25℃放置2h；充分洗涤后，将待测样品100μL/well加入96孔板中，25℃放置1h；充分洗涤后，依次加入100μL/well H2O2溶液和化学发光底物液，25℃反应20min后，测定化学发光信号。在一定的浓度范围内，随着样品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量增多，化学发光信号将增加，通过与标准曲线比对，即可达到定量化检测α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的目的。
实施例2
α-乳白蛋白的标准曲线：
采用pH为7.0，浓度为10mmol/L的PBS缓冲液精密配制α-乳白蛋白为不同浓度如1、5、10、20、30、50ng/mL，采用本发明所述试剂盒检测α-乳白蛋白，以α-乳白蛋白浓度为横坐标，以化学发光信号为纵坐标，绘制标准曲线。结果如图1所示，回归方程为
Figure BDA0002302827930000041
R2＝0.9931。
实施例3
β-乳球蛋白的标准曲线：
采用pH为7.0，浓度为10mmol/L的PBS缓冲液精密配制β-乳球蛋白为不同浓度如1、5、10、20、30、50ng/mL，采用本发明所述试剂盒检测β-乳球蛋白，以β-乳球蛋白浓度为横坐标，以化学发光信号为纵坐标，绘制标准曲线。结果如图2所示，回归方程为
Figure BDA0002302827930000051
R2＝0.9964。
实施例4
奶粉中α-乳白蛋白的检测：
(1)称取0.1g奶粉，与1mL pH为7.0，浓度为10mmol/L的PBS缓冲液混合，60℃下搅拌1小时，使奶粉充分溶解，然后以10000r/min，4℃离心15min，取上清液，分装保存于-80℃，应避免反复冻融。
(2)将提取的牛奶蛋白浸液通过ANX Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，用0.1～0.4M NaCl溶液进行线性洗脱，收集洗脱产物，PBS透析后得到牛奶的杂蛋白混合液。
(3)取1mL牛奶的杂蛋白混合液，分别加入不同量的α-乳白蛋白，使其浓度为5、10、20、50ng/mL，每个浓度6个平行样，进行样品检测和回收率测定。检测结果如表1所示，在5～50ng/mL浓度添加范围内，回收率在91％～99％，表明该方法可以用于实际样品中α-乳白蛋白的检测。
表1人工添加样品检测结果(n＝6)
Figure BDA0002302827930000052
实施例5
奶粉中β-乳球蛋白的检测：
(1)称取0.1g奶粉，与1mL pH为7.0，浓度为10mmol/L的PBS缓冲液混合，60℃下搅拌1小时，使奶粉充分溶解，然后以10000r/min，4℃离心15min，取上清液，分装保存于-80℃，应避免反复冻融。
(2)将提取的牛奶蛋白浸液通过ANX Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，用0.1～0.4M NaCl溶液进行线性洗脱，收集洗脱产物，PBS透析后得到牛奶的杂蛋白混合液。
(3)取1mL牛奶的杂蛋白混合液，分别加入不同量的β-乳球蛋白，使其浓度为5、10、20、50ng/mL，每个浓度6个平行样，进行样品检测和回收率测定。检测结果如表2所示，在5～50ng/mL浓度添加范围内，回收率在93％～103％，表明该方法可以用于实际样品中β-乳球蛋白的检测。
表2人工添加样品检测结果(n＝6)
Figure BDA0002302827930000061
综上，本发明通过Protein G-单克隆抗体特异性结合样品中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，采用化学发光酶免疫测定法检测不同样品中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，再根据α-乳白蛋白和β-乳球蛋白浓度-化学发光信号变化曲线换算待测样品中牛奶致敏原中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的浓度，达到定量检测的水平。利用本发明所得试剂盒检测的方法操作简便，实验室人员稍加培训即可操作，检测灵敏度高，结果判定不受主观因素影响，储存简单，可以定量、定性确定食品中牛奶致敏原α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量，具备极高的推广价值。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (6)

1.一种牛奶致敏原的化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：包括：能够识别α-乳白蛋白单克隆抗体和β-乳球蛋白单克隆抗体的Protein G、能够特异性识别牛奶α-乳白蛋白的α-乳白蛋白单克隆抗体、能够特异性识别牛奶β-乳球蛋白的β-乳球蛋白单克隆抗体、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、化学发光底物液；Protein G的浓度为15～20μg/mL；α-乳白蛋白单克隆抗体的浓度为1～1.5μg/mL；β-乳球蛋白单克隆抗体的浓度为1～1.5μg/mL；α-乳白蛋白、β-乳球蛋白浓度均为100μg/mL；化学发光底物液包括辣根过氧化酶HRP、p-溴苯酚和鲁米诺；所述辣根过氧化酶HRP浓度为20～25μmol/L，所述p-溴苯酚浓度为40～50mmol/L，所述鲁米诺的浓度为10～15mmol/L，pH为10～11。
2.根据权利要求1中所述的一种牛奶致敏原的化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述Protein G与上述两个单克隆抗体的Fc片段特异性结合，使得Protein G-单克隆抗体可以特异性识别牛奶致敏原α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。
3.使用权利要求1中所述的一种牛奶致敏原的化学发光免疫检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：其特征在于：
a、依次将Protein G和α-乳白蛋白单克隆抗体、β-乳球蛋白单克隆抗体结合在酶标板上，形成Protein G-单克隆抗体复合物；
b、配制系列浓度牛奶致敏原蛋白，加入酶标板，孵育，使Protein G-单克隆抗体特异性识别牛奶致敏原蛋白；
c、依次加入H2O2溶液和化学发光底物液，孵育，测定信号值。
4.根据权利要求3中所述的一种牛奶致敏原的化学发光免疫检测方法，其特征在于：所述步骤a中Protein G的浓度为18～20μg/mL。
5.根据权利要求3中所述的一种牛奶致敏原的化学发光免疫检测方法，其特征在于：所述步骤a中α-乳白蛋白单克隆抗体、β-乳球蛋白单克隆抗体的浓度为1.2～1.5μg/mL。
6.根据权利要求3中所述的一种牛奶致敏原的化学发光免疫检测方法，其特征在于：所述步骤c中反应时间为20～30min。
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200324

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