BRPI0612217A2 - kit de diagnóstico para medida simultánea de antibióticos de classes diferentes, kit de diagnóstico para medida simultánea de analìtos correspondentes aos antibióticos de classes diferentes, kit de diagnóstico para medida simultánea de (beta)-lactamas, tetraciclinas e sulfamidas e método para implementar o kit de diagnóstico - Google Patents
kit de diagnóstico para medida simultánea de antibióticos de classes diferentes, kit de diagnóstico para medida simultánea de analìtos correspondentes aos antibióticos de classes diferentes, kit de diagnóstico para medida simultánea de (beta)-lactamas, tetraciclinas e sulfamidas e método para implementar o kit de diagnóstico Download PDFInfo
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Abstract
KIT DE DIAGNóSTICO PARA MEDIDA SIMULTáNEA DE ANTIBIóTICOS DE CLASSES DIFERENTES, KIT DE DIAGNóSTICO PARA MEDIDA SIMULTáNEA DE ANALìTICOS CORRESPONDENTES AOS ANTIBIóTICOS DE CLASSES DIFERENTES, KIT DE DIAGNóSTICO PARA MEDIDA SIMULTáNEA DE 13<225> LACTAMAS, TETRACICLINAS E SULFAMIDAS E MéTODO PARA IMPLEMENTAR O KIT DE DIAGNóSTICO. A invenção refere-se a um kit de diagnóstico para ensaios simultâneos de antibióticos de diferentes classes, caracterizado pelo fato de compreender uma mistura de reação única contendo, pelo menos, um primeiro receptor marcado, específico para reconhecimento de <225>lactamas, um segundo receptor marcado, identificando especificamente e competitivamente uma tetraciclina e um fragmento de ácido nucléico biotinilado, um anticorpo anti-sulfamida e um análogo de sulfamida marcado; e um sistema de recuperação na forma de um suporte sólido compreendendo uma membrana de nitrocelulose, na qual são fixados, em três zonas de testes separadas, respectivamente um antibiótico com núcleos <225>lactama, uma avidina e um anticorpo capaz de identificar especificamente o anticorpo anti-sulfamida, de modo que a intensidade marcada, detectada no sistema de recuperação, nas três zonas de testes resulta, independentemente, em um reconhecimento competitivo de cada antibiótico através de seu receptor marcado.
Description
"KIT DE DIAGNÓSTICO PARA MEDIDA SIMULTÂNEA DEANTIBIÓTICOS DE CLASSES DIFERENTES, KIT DE DIAGNÓSTICOPARA MEDIDA SIMULTÂNEA DE ANALITOS CORRESPONDENTES AOSANTIBIÓTICOS DE CLASSES DIFERENTES, KIT DE DIAGNÓSTICOPARA MEDIDA SIMULTÂNEA DE β-LACTAMAS, TETRACICLINAS ESULFAMIDAS E MÉTODO PARA IMPLEMENTAR O KIT DEDIAGNÓSTICO".
Campo da invenção
A presente invenção refere-se a um método para compor umacoleção de várias moléculas de reconhecimento biológico,as quais são capazes, especificamente, de detectar váriosanalitos distintos, com alta sensibilidade para reagir,simultaneamente, em uma mistura de reação simples e paradeterminar a classe de analitos aos quais cada um doscompostos detectados pertence, provendo que o princípiodo reconhecimento específico de uma determinada classe deanalitos não pode interferir com o princípio dereconhecimento específico de uma outra classe deanalitos.
A invenção também se refere a um kit de diagnósticoespecialmente construído para implementar o método.
Histórico da invenção
Um princípio fundamental que governa bem a prática demonitoramento e checagem da cadeia alimentar requer arealização de análises da checagem tanto quanto possívela partir da produção, de forma a ser capaz de identificare isolar o mais rápido possível os gêneros alimentíciossuspeitos de estarem contaminados.
Como regra geral, quando os testes de detecção,freqüentemente denominados "teste de varredura", sãorealizados, - uma amostra que foi detectada positivadurante uma primeira análise de cheque considerada defato positiva apenas quando submetida a um segundo teste,denominado "teste de confirmação". De outra forma, se umteste de varredura inicial der um resultado negativo,isto é suficiente e nenhuma análise adicional seránecessária para confirmar o resultado(1> novamente.Uma primeira conseqüência desta regra é que o primeirométodo de varredura deve ser capaz de dirigir a detecçãode um número máximo de compostos. 0 teste de detecção ouo teste de varredura ,deveria ser, assim, preferível elogicamente um "teste de múltiplos-analitos".
Uma segunda conseqüência desta regra é que é importantepara conhecer a classe à qual pertence o compostodescoberto em uma amostra positiva durante o teste devarredura, de modo a ser capaz de que seja possível semudar diretamente para o método de confirmação, que énormalmente muito específico, uma vez que é recomendávelque o composto relacionado seja isolado e identificado.Uma terceira conseqüência desta regra é que um teste devarredura não pode dar resultados do tipo "falso-negativo" uma vez que estes resultados irão então enganara análise neste estágio preliminar e não serãoconfirmados mais tarde.
Vários métodos para a detecção dos antibióticos sãoatualmente conhecidos:
- testes microbiológicos que medem o poder inibitório deuma amostra no crescimento de uma cepa bacteriana. Estetipo de teste requer um período relativamente longo deincubação (entre 3 e 16 horas), antes do resultado serobtido. Em geral, estes testes (Delvotestr SP, BRT Teste,Copan™, Eclipse™, Valio™) podem reconhecer,simultaneamente, várias classes de antibióticos desde queas cepas de bactérias usadas sejam, freqüentemente,sensíveis aos vários compostos de diferentes classes.Entretanto, este tipo de teste não permite identificarprecisamente a classe a qual o composto antibióticotestado pertence;
- para a detecção de moléculas, in viüro, os testestrabalham de acordo com o princípio da competição entre ocomposto procurado que está presente na amostra e umcompetidor marcado que foi deliberadamente introduzidodentro da amostra em um sítio de reconhecimento simplesque pode tanto ser um receptor ou um anticorpo. Em umaformulação do tipo ELISA (Ensaio Imunológico por Ligaçãocom Enzima) ou RIA (Radioimunoensaio)/RRA (Ensaioradioreceptor), o tempo requerido para uma análise é daordem de 2 a 6 horas. Alguns destes métodos, emparticular os métodos de laboratório RRA permite adetecção simultânea de vários compostos de diferentesclasses. Neste caso, entretanto, o método não permiteidentificar a classe à qual o composto que deu oresultado positivo pertence;
- os métodos físico-químicos mais complexos que permitemo isolamento e a identificação do composto procurado têmsido atualmente úteis, principalmente, os métodos nosquais um sistema de separação cromatográfica é combinadocom um sistema de detecção de espectrometria de massa(GC/MS ou LC/MS). Estes métodos requerem adaptarprocedimentos particulares para cada um dos compostosdistintos a serem identificados.
Algumas vezes, umcomposto único ou alguns dos compostos de uma mesmaclasse podem ser, simultaneamente, analisados algumasvezes todos os compostos de uma mesma classe podem serdetectados mas, isto nunca é possível com os compostos dediferentes classes. De fato, o princípio da separaçãocromatográfica é característico das propriedades físico-químicas de um determinado composto, esta propriedadefreqüentemente é diferente de uma classe para a outra. Nocaso onde o operador não conhece o tipo de composto a seridentificado, ele deve considerar os muitos métodosexistentes para as classes de compostos.
Em anos recentes, muitos métodos rápidos foramdesenvolvidos. Estes métodos, denominados "TestesRápidos", são utilizados para realizar testes devarredura rápidos em um grande número de amostras. Emgeral, estes métodos são usados no reconhecimento doscompostos procurados em relação às moléculas biológicasde acordo com o princípio de competição. Para fazer umaanálise rápida e fácil, estes tipos de testes trabalhamcom dispositivos membranosos com fluxo lateral(Tetrasensor™, SNAP®, Beta-Star™, ROSA). Estes testessão classificados de acordo com as várias classes deantibióticos, mas nenhum dos produtos conhecidosatualmente permite a detecção de compostos pertencentesàs diferentes classes em uma operação única.
Considerando que isto seja razoável para se examinar epara se impor análises de varreduras primárias no setoragro-alimentício, o setor envolvido demandará uma análisemais completa possível, na qual identificaria,preferivelmente, um número máximo de compostos suspeitos.
Isto é de fato mais prático e mais econômico pararealizar um teste múltiplo apenas a partir de uma únicaamostra mais do que ter que realizar um teste específicopara cada composto específico. Esta prática requer umamaior divisão de tempo, manuseio da amostra e custo. Eleage como um freio no bom manuseio e no controle eficazdos produtos alimentícios.
Neste estágio, a eficácia na checagem é assim, muito maisrestrita, à perda dos testes de múltiplos-analitos quepermitiriam a detecção de todos os compostos de váriasclasses de analitos em uma única operação em menos do 10minutos, por exemplo.
Em particular, a indústria agro-alimentícia estáinteressada em um novo método que permitisse a análise decompostos pertencentes à, pelo menos, duas classesdiferentes de antibióticos em uma operação única.
O tipo de antibiótico que pode ser administrado aosanimais pode variar dependendo de, se a aplicação éterapêutica ou profilática, na espécie animal, no germepara atacar novamente, na prática veterinária, nalegislação em vigor, nos meios disponíveis ou mesmo naregião geográfica. No caso de alguns tratamentosespecíficos, uma mistura de medicamento é utilizada. Comouma regra geral, o praticante usa o produto antibióticoselecionado entre todos os compostos comercialmentedisponíveis, quando ele avalia quais são os maiseficazes.As classes principais de agentes antibióticos eantibióticos utilizados são: penicilinas ecefalosporinas, tetraciclinas, sulfamidas,aminoglicosídeos e aminociclitoles, macrolídeos,cloramfenicóis ou outros peptideos, inóforos,nitrofuranos, quinolonas, carbatos, etc.. Todas estasclasses cobrem uma faixa muito ampla de diferentescompostos químicos.
Deve ser entendido que algumas vezes o uso intensivo deantibióticos na medicina veterinária e na produçãoagrícola pode causar a emergência de cepas bacterianasque se tornam resistentes aos antibióticos. De modo asalvaguardar a saúde humana e para a legislação em campo,muitos países (União Européia, EUA, Canadá, etc..) têm umlimite de grupo máximo autorizado para os resíduos (MRLs- nível de resíduo máximo) de antibióticos nos produtosalimentícios(2> . Para uma extensão deste grupo de MRLs olimite está entre uma amostra positiva e uma negativa, ouseja, entre uma amostra rejeitada e uma amostraaceitável.
Em paralelo, a "Decisão da Comissão" de 12 de agosto de2 002, estabeleceu o limite mínimo requerido de realização(MRPLs) aplicável aos métodos analíticos a seremutilizados para examinar as amostras e definidos comocritério comum para a interpretação dos resultados(3> .
É entendido que uma técnica de análise apenas, na qualpossa ser demonstrado, com base em provas verificáveis,que ela é validada e tem uma proporção de erro conforme opadrão menor que 5% para o nível considerado, pode serutilizada para os propósitos de varredura em conformidadecom a Diretiva 96/23/EC.
Em 1995, uma média de um por cento de todas as amostrasanalisadas quanto ao seu conteúdo de antibiótico tiver umnível maior do que o MRL e apresentam um resultadopositivo. Quando estes resultados positivos foremconfirmados, os produtos mais freqüentemente envolvidosforam as penicilinas e tetracilinasl4).Estado da técnica
Um sistema para reconhecimento de moléculas detetraciclinas é descrito no pedido de patente No. WO-A-03/048770, intitulado: nMethod for performing in vitrodiagnosis using gene regulation mechanisms andcorresponding diagnostic Kit". Este método não permitedetectar qualquer outra molécula além das tetraciclinas.
Em uma formulação preferida, os reagentes compreendem umreceptor tetR, isolado a partir de uma E. coli com ummecanismo de controle genético para a resistência àstetraciclinas, um anticorpo capaz de reconhecer oreceptor e uma preparação de proteína A conjugada compartículas coloidais de ouro. Adicionalmente, o sistemade recuperação é um fragmento específico e biotinilado deDNA que pode ser fixado em uma molécula de avidina ligadaa uma membrana de nitrocelulose. Isto ocorre durante aincubação, na presença de uma amostra com a qual oreceptor e o fragmento de DNA interagem, apenas naausência da tetraciclina. Neste caso, o fragmento de DNAforma um complexo com o receptor e um sinal gerado pelapartícula coloidal de ouro ligada ao receptor aparece.
Por outro lado, o receptor que já reconheceu a moléculade tetraciclina não é capaz de se ligar ao fragmento deDNA e como resultado nenhum sinal aparece.
Um sistema para reconhecimento das β-lactamas é descritona patente WO-A-99/67416, entitulada: " Method fordetermining antibiotics with β-lactamas core in abiological liguid". De acordo com este método, não épossível detectar qualquer outra molécula além de β-lactamas. Em uma formulação preferida, os inventoresdescrevem por outro lado, um receptor isolado de Bacilluslicheniformis, purificado e quimicamente ligado àsmoléculas de biotina, às quais estão associados umapreparação de anticorpo anti-biotina conjugado com aspartículas coloidais de ouro e, de outra forma, umconjugado formado por uma cefalosporina ligada a umaimunoglobulina humano e fixada em uma membrana denitrocelulose. No caso onde a amostra não compreende a β-lactamas, o receptor se liga ao antibiótico fixado e umsinal produzido pela partícula de ouro ligada ao receptorda biotina por meio de um anticorpo anti-biotina ligadoao ouro é detectado. Por outro lado, se o receptor forinibido durante o período anterior de incubação, naamostra a ser testada, ele não é capaz de se ligar com oantibiótico fixado, e como resultado, nenhum sinalaparece.
Um sistema de reconhecimento rápido para a sulfamidatambém é conhecido como descrito por R. Verheijen etal.<5> e, intitulado: "Development of a one-step striptest for the detection of sulfadimidine residues". Estesistema usa um princípio similar àquele da detecçãoacima-mencionada para as β-lactamas. De uma maneira, umanticorpo específico para sulfadimidinas é conjugado comas partículas coloidais de ouro e, este é umasulf adimidina que é conjugada com uma ovalbumina e éfixada à membrana de nitrocelulose. Se a amostracompreende qualquer sulfadimidina reconhecida peloanticorpo, este último forma um complexo que é incapaz dese ligar, subseqüentemente, ao composto fixado e, comoresultado, não haverá ligação. Por outro lado, naausência de sulfadimidina na amostra, o anticorpoconjugado será capaz de reconhecer as sulfadimidinasfixadas e um sinal colorido ser aparente. Este artigo nãoindica a especificidade deste teste.
Todos os métodos e processos rápidos, com fluxo lateral,conhecidos até o presente, se aplicam apenas à detecçãode uma classe única de compostos e até o presente não hánenhum método para detecção, em uma operação única, detodos os compostos pertencentes à pelo menos duas classesdiferentes de antibióticos. A principal razão para isto éa incompatibilidade da técnica em conduzir, junto,independentemente e sem interferência de todos os agentesrequeridos para a detecção de cada uma das classes em umúnico processo. A segunda dificuldade consiste no caminhopara se conseguir a identificação da classe à qual ocomposto detectado pertence.
Para resumir, os sistemas rápidos conhecidos para adetecção de moléculas pequenas (MW < 1,000) trabalham deacordo com o princípio da competição que requerem o usode dois elementos particulares que são, por uma razão,uma molécula que pode reconhecer especificamente ocomposto a ser detectado, a referida molécula sendo,geralmente, um receptor bacteriano ou uma imunoglobulina(anticorpo) e, por outro, um competidor para o sítio dereconhecimento. Dependendo do método escolhido, um desteselementos é fixado a um suporte e o outro elemento émarcado. Em alguns casos (formato 1, ver abaixo), ele éuma molécula de reconhecimento que é marcada e um análogodo analíto que é fixado; em outros casos (formato 2, verabaixo), ele é um análogo do analíto que é marcado e umamolécula de reconhecimento que é ligada a uma fraçãoinsolúvel.
A originalidade do sistema de detecção da tetraciclinaconduz ao fato de que o receptor compreende dois sítiosde reconhecimento interdependentes e, como resultado, ocompetidor não é um análogo do analíto procurado, mas, umfragmento de DNA capaz de se ligar a um segundo sítio dereconhecimento do mesmo receptor.
Em todos os métodos denominados "Testes rápidos", o exameé feito por comparação da intensidade do sinal obtido na"zona de teste", ou seja, no ponto onde o elemento derecuperação do receptor ativo está fixado, com aintensidade de um outro sinal que é obtido na "zona decontrole", ou seja, no ponto onde outros reagentes (ou oexcesso de reagentes) são recuperados. Em geral, quando aintensidade na "zona de teste" é mais marcada do que a da"zona controle", o resultado é negativo para o elementoprocurado.
Em todos os casos relacionados a medida das moléculas β-lactamas, a molécula de reconhecimento é obtida a partirda preparação de Bacillus e em todos os casos, estamolécula é marcada após a purificação. Para conseguiresta marcação, a superfície deve suportar modificaçãoquímica. Por exemplo, ela pode estar quimicamente ligadaa uma enzima, quando for o caso, com um receptor doBacillus stearothermophillus ligado as peroxidases (EP-A-0 593 112 e US-A-5,434,053, por Giest Brocades) ou a umabiotina, quando for o caso, com um receptor do Bacilluslicheniformis ligado a uma biotina (WO-A-99/67416 e US-A-6,524,804 por U.C.B. S.A.) ou mesmo com o receptor doBacillus stearothermophillus diretamente conjugado comuma coloidal de ouro (US-A-6,475,805 por Charm Inc.). Comexceção do método Tetrasensor™, é necessário modificarquimicamente a molécula de reconhecimento para obter umcomplexo colorido, e a partir dele em outros casosconhecidos atualmente. Como resultado, é necessáriopurificar ele e modificar alguns de seus substituintes desuperfície com o risco de modificar uma funcionalidademaior ou uma propriedade ou estabilidade.
Em outros casos atualmente conhecidos é, portanto,impossível, geralmente, trabalhar tanto com extratos crusnão-purifiçados quanto com receptores que não seriamquimicamente modificados.
Em adição, o tipo de marcador usado na medida da"tetraciclina" não é compatível com a medida da β-lactamas, uma vez que ele assegura que é umaimunoglobulina que é fixada à "zona de controle" em todosos casos relatados. No caso do documento WO-99/67416, eleé também uma imunoglobulina que age como a proteínaâncora de modo a fixar o competidor para a "zona deteste". 0 uso da proteína A como no medida datetraciclinas, seria inevitável causar uma marcação não-específica em um ou em ambas as linhas de capturasrequeridas para a detecção de β-lactamas.
Em uma outra pesquisa, onde é necessário lançar mão douso da combinação de avidina-biotina de modo a facilitara fixação ao suporte ou ao marcador, a combinaçãoavidina-biotina pode apenas ser utilizada em umdeterminado método para um reconhecimento específico. Aocontrário, se uma avidina formar um ponto de ancoragem,será possível a todas as moléculas biotiniladas seligarem por si mesmas a este ponto. Neste caso, não seráparticularmente possível contemplar um teste para adetecção comum de β-lactamas e de tetraciclinas que seriabaseada, por exemplo, na combinação de dois princípios demedida descritos no documento WO-A-99/67416 e nodocumento WO-A-03/048770. De fato, no primeiro caso, oreceptor é biotinilado e então marcado por meio de anti-biotina-ouro e no segundo caso, a avidina é fixada pararecuperar um fragmento biotinilado de DNA. A combinaçãodestes dois princípios conduziria, então, a um conflitoadicional entre os dois sistemas independentes usando ascombinações avidina-biotina. Em uma combinação de doissistemas existentes, o receptor biotinilado do sistema deβ-lactamas se ligaria a avidina requerida para recuperaro DNA do sistema de tetraciclina e como resultadocausaria um marcador não-específico independentemente donível de tetraciclina na amostra. Além disso, a presençado anti-biotina-ouro na fase móvel interferiria com o DNAbiotinilado prevenindo de se ligar à avidina requeridapara sua captura, o que conduziria ainda, a um outroconflito.
Em uma terceira pesquisa, a combinação de dois sistemasde reconhecimento independentes requereria um sistemaabsolutamente complexo para leitura e interpretação doresultado onde cada um dos marcadores tem que serpesquisado através de sua intensidade relativamente a umareferência interna. Seria, portanto, duas "bandas deteste" ("beta" e "tetra") e duas "bandas de controle".
Este conceito não faz a análise simples nem a análiseprática. No contexto da combinação de dois testes, seriamelhor pesquisar a intensidade de cada teste porcomparação com um outro teste. Neste referidoprocedimento, a "Zona de teste" para o analíto No. 1seria a zona "controle" para o analíto No. 2 e vice-versa. No caso onde as duas classes de analitosrelacionados estão presentes, ao mesmo tempo, em umamesma amostra, esta pesquisa não criaria nenhum ou quasenenhum sinal. Isto é raramente o caso, mas se eleocorrer, a adição de uma referência simples é recomendadana forma de uma linha de controle simples que permita seexaminar mais facilmente a intensidade relativa de ambosos sinais do teste de modo a evitar dificuldades deinterpretação no caso de dupla contaminação por β-lactamas e por tetraciclinas. Obviamente, esta linha decontrole simples seria necessária no caso onde mais doque dois testes foram combinados em um método único.
Em uma quarta pesquisa, os materiais escolhidosexpressamente e preferivelmente para formar o dispositivode régua de nível do kit de diagnóstico devem sercompatíveis para a análise simultânea de duas classes deanalitos. Ao contrário, em uma configuração preferida,descrita no documento WO 99/67416, o uso da membrana"Leukosorb®" é recombinada mas ele não é compatível coma pesquisa que nós recomendamos para o teste datetraciclina e não seria apropriado para uma medida demúltiplos-analítos. Adicionalmente, muito estranhamente,em uma formulação onde ambos os receptores estão marcadospor seus respectivos anticorpos, é impossível se obter umponto de corte nítido através da adição de β-lactamasquando os reagentes encontram a membrana "Leukosorb®"antes deles alcançarem o ponto de captura. Esta membrana,cuja eficiência foi demonstrada com a purificação doleite e para o uso em fluxo lateral, é a causa de sinaisde reconhecimento não-específicos quando o marcador foiconseguido por meio de anticorpos e do conjugado deproteína A com um coloidal de ouro.
Em um quinto aspecto, a escolha dos receptores envolvidosno reconhecimento de todos os compostos de cada uma dasclasses é importante. Esta escolha não é apenasdeterminada pela realização do reconhecimento doscompostos, mas também pelo critério de estabilidade,estrutura, reatividade do antígeno e composição doaminoácido, etc..
Como uma conclusão, baseada em métodos conhecidos, é umapriori impossível combinar junto, em um método único,pelo menos dois métodos independentes, por exemplo, parao reconhecimento por receptores para a β-lactama e atetraciclina, sem contemplar modificações maiorespermitindo combinar os elementos requeridos abrangendoaqueles dos sistemas para reconhecimento de um compostoque não interfira com o sistema para reconhecimento de umoutro composto.
Sumário da invenção
A presente invenção se refere à provisão de um novométodo de diagnóstico permitindo detectar,simultaneamente, uma (teoria ilimitada) combinação decompostos que podem pertencer, pelo menos, a duas classesdistintas de analitos e identificar a classe à qual umcomposto detectado pertence atualmente.
Em particular, a invenção se refere à demonstração natécnica e na prática de uma possibilidade de combinar emum método único pelo menos dois mecanismos de detecçãosem interferência entre o trabalho de um deles e otrabalho do outro mecanismo.
Um aspecto adicional da presente invenção é demonstrar apossibilidade técnica da medida de múltiplos analitos quepodem ser rapidamente conseguidos, por exemplo, em menosde 30 minutos e em um estágio de análise única por meiode uma amostra simples.
Um aspecto adicional da invenção é prover um método e umkit de diagnóstico in vitro para a detecção simultânea ea medida de pelo menos duas classes de analitos.
Características dos elementos principais da invenção
Um primeiro aspecto da presente invenção, como relatadonas respectivas reivindicações 1, 3, 4 e 10, refere-se aum kit de diagnóstico para detecção específica esimultânea ou para a quantificação de pelo menos doisanalitos pertencentes a diferentes classes deantibióticos, designando, pelo menos duas classes de β-lactamas, tetraciclinas e sulfamidas, caracterizadas porcompreender, geralmente, por exemplo:
em um objetivo, uma mistura reativa única/simplespreferivelmente, na forma de uma solução ou de umliofilizado, compreendendo pelo menos duas moléculasdiferentes, cada uma delas capazes de reconhecer,respectivamente, simultânea e especificamente, umdeterminado analíto presente em uma amostra que podecompreender analítos pertencentes a referidas classesdiferentes de analítos;
- e em um outro objetivo, um sistema de recuperação naforma de um suporte sólido único ao qual estão ligados,em posições espaciais conhecidas e distintas, osrespectivos ligantes que são capazes de especificamente,seletiva e exclusivamente, recuperar cada uma dasreferidas moléculas biológicas compreendidas na referidamistura reativa de modo a identificar através dasposições do recuperado no referido suporte, o tipo declasse à qual cada um dos analítos presentes na amostrapertence.
Dependendo do caso, tanto o elemento fixado recuperadopode ser um análogo competidor quanto a substânciaprocurada e o receptor na solução são marcados ou oanálogo competidor na solução é marcado e o elementorecuperado fixado é o receptor. Os sistemas de misturaspodem também coexistir de acordo com a invenção.Configurações preferidas da invenção são descritas nasreivindicações secundárias 2, 5 e 9 e 11-12.
Um segundo aspecto da invenção, como na reivindicação 13,refere-se ao método para implementar um kit dediagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 12, caracterizado pelo fato de ter os estágios aseguir:
- uma mistura reativa acima-mencionada ser levada aocontato com uma amostra a ser identificada de modo aobter uma solução que é deixada em incubação a umatemperatura entre 3O0C e 5O0C durante 3 a 15 minutos;
- um suporte da régua de nível do sistema de recuperaçãoacima-mencionado é imerso na solução obtida e deixadopara incubar durante 3 a 15 minutos;
- o resultado na régua de nível é interpretado tantovisualmente quanto pelo olho nu ou por meio de um leitoróptico da régua de nível.
Nas configurações preferidas da presente invenção, érecomendado evitar, por um motivo, a purificação, e poroutro motivo, a modificação química do receptor, porexemplo, através do uso de anticorpos anti-receptores quesão marcados tanto diretamente com a partícula coloidalde ouro quanto, preferivelmente, com a proteína A ligadaà partícula coloidal de ouro. Por outro lado, no conceitoda detecção múltipla, a proteína A marcada com o coloidalde ouro agiria como um marcador genérico para todos osanticorpos introduzidos dentro da solução.
De modo a preservar a funcionalidade máxima dosreceptores e dos anticorpos utilizados na presenteinvenção, um princípio adotado é aquele onde, nenhumamodificação química ocorre. Como resultado, a presenteinvenção usa receptores bacterianos em seu estado maisnatural possível. Estes receptores são marcados por meiodos anticorpos que por si próprio são identificados pelaproteína A conjugada com a partícula coloidal de ouro.
Nestes casos é, portanto, exclusivamente a proteínamarcada que irá se ligar ao ouro e não as moléculassensíveis ao reconhecimento dos analitos relacionados.
Nesta pesquisa, todos os grupos funcionais das moléculasde reconhecimento sensíveis são assim preservados. Estavantagem é explorada completamente quando o objetivo éexplorar a atividade dos receptores cujo mecanismo dereconhecimento depende de determinadas cadeias laterais,tais como os resíduos de lisina, por exemplo. Isto é maisimportante que, quando uma modificação química ocorre, emmuitos casos relatados, a modificação envolve os resíduosNH3+ nas cadeias laterais da lisina. Como uma conclusão,a ligação química com a lisina pode causar a deterioraçãodas lisinas do sítio ativo e, desse modo, tomar apreparação parcialmente inativa.
A marcação meio dos anticorpos teve a flexibilidade deuma marcação não-fixada. De fato, a marcação químicaimplica em uma ligação covalente irreversível enquanto aligação dos anticorpos é reversível e submetida a umequilíbrio que pode ser transferido dependendo das forçasque agindo nele. Uma outra vantagem é a de ser capaz deajustar o estágio de marcação em uma segunda etapa. Defato, em uma segunda formulação da presente invenção, eleocorre após a fase de reconhecimento do analíto peloreceptor, se o analíto livre da amostra ou o analítofixado for o recuperado, aquele que o anticorpo reconhececomo receptor.
Por várias razões de custo ou estabilidade,e tambémdevido a integração perfeita dentro de um teste demúltiplos analitos, a presente invenção recomenda o usopreferido de um receptor de β-lactamas isolado deStaphylococcus aureus(6>.
Ao contrário, como foi originado a partir de muitas cepasbacterianas eficazes com relação a sua capacidade emcombater os antibióticos e as β-lactamas em particular,este receptor usado in vitro demonstrou habilidadeexcepcional no reconhecimento de todos os compostos β-lactamas, ambos para penicilinas e para cefalosporinas(ver referência(6> e os resultados mostrados no exemplo) .
Uma outra vantagem deste receptor é ter um pontoisoelétrico alcalino (pi). Isto oferece a oportunidade deser capaz de verificar, facilmente, a pureza dele apartir de um extrato cru de células de modo a obter osanticorpos a partir delas.
Em adição, nossa escolha também foi determinada pelaobservação de uma resposta imune muito boa em coelhos quesão muito específicos e não causam qualquer resposta não-específica com o resto de todos os reagentes envolvidosna medida dos múltiplos analitos.De acordo com a presente invenção, um método foiformulado com sucesso, no qual foi possível combinar emuma operação única/simples todos os elementos requeridospara a detecção comum de vários compostos de diferentesclasses, através de um uso totalmente diferente dosmecanismos de reconhecimento.
A presente invenção oferece a vantagem de propor,adicionalmente, a formulação para um teste de múltiplos-analítos seguro e econômico. Sem dúvida, ele não énecessariamente puro para os receptores nem para aspreparações dos anticorpos, o qual é mais para osreceptores que não são quimicamente modificados, o quepreservaria, completamente, sua reatividade eestabilidade.
Breve descrição das figuras
A figura 1 mostra, esquematicamente, um exemplo doposicionamento dos elementos recuperados de acordo com ainvenção em um suporte de nitrocelulose sólido, no casoda medida simultânea de apenas dois antibióticos, em umazona de controle fixada também sendo provida.
A figura 2 mostra, esquematicamente, um exemplo doposicionamento dos elementos recuperados de acordo com ainvenção em um suporte de nitrocelulose sólido no caso damedida simultânea de tetraciclinas, β-lactamas, esulfamidas, em uma zona de controle fixada também sendoprovida.
Descrição das configurações preferidas da invenção
Considerações preliminares:
Como mencionado no estado da técnica, um teste decompetição contemplado de acordo com a presente invençãopode, em particular, ocorrer em duas formas diferentes.
No primeiro caso (formato 1), os receptores sãoconjugados com partículas coloidais de ouro e com ocomposto competidor, análogo da substância procurada,agem como elementos de recuperação por serem fixados noponto de captura específico. No segundo caso (formato 2),o compostos competidores, os análogos da substânciaprocurada, são conjugados com as partículas coloidais deouro e os receptores agem como elementos de recuperaçãopor serem fixados no ponto de captura específico. Emdeterminados casos, a detecção dos múltiplos-analítos, umsistema misturado (formatos 1 e 2 presentes) também épossível.
Exemplo No.1: Medida simultânea de tetraciclinas e β-lactamas através de receptores específicos (formato 1para ambas as detecções) .
0 método usa uma mistura reativa compreendendo ambos, osrespectivos receptores de β-lactamas e as tetraciclinasbem com seus reagentes e um elemento de recuperação aoqual os ligantes específicos destes receptores sãofixados nos pontos precisos e distintos.
Preparação da mistura reativa:
Para a detecção de β-lactamas, a mistura reativacompreende o receptor específico para reconhecimento deβ-lactamas, seus anticorpos específicos e uma preparaçãoda proteína A conjugada com o coloidal de ouro. Para adetecção das tetraciclinas, a mistura reativa compreendeo receptor das tetraciclinas, seu anticorpo específico,um fragmento específico do DNA conjugado com a biotina euma preparação da proteína A conjugada com o coloidal deouro.
O receptor de β-lactama é obtido pelo método descrito porGolemi-Kotra et al. , 161 . 0 receptor não purificado éfiltrado em uma membrana Millex HV (Millipore, Inc. USA),antes que ele seja armazenado a 4 0C e na presença deglicerol a 50% v/v. 0 receptor de tetraciclina é obtidopelo método descrito no pedido de patente internacionalNo. WO-A-03/04877 0.
Ambas as preparações de anticorpos são obtidas pelométodo descrito em Kachab et al.,<7). Estas preparações deanticorpos foram obtidas por injeção de uma preparação dereceptor purificado até a homogeneidade da proteína deacordo com Golemi-Kotra et al.,(6) para o receptor de β-lactama e de acordo com o pedido de patente WO-A-03/048770 para o receptor da tetraciclinas. Ambas aspreparações de anticorpos são, preferivelmente, usadasnão-purifiçadas, o que significa que ela é um soro nãopurificado que é diretamente adicionado à misturareativa. De acordo com uma segunda configuração dainvenção, os anticorpos específicos do tipo policlonal oumonoclonal são purificados através de métodos conhecidosaos técnicos do assunto e, então diretamente ouindiretamente ligados às partículas coloidais de ouro deacordo com o método de Frens18'.
O fragmento de DNA foi obtido da Eurogentec S.A.,Bélgica, de acordo com a seqüência e a preparaçãodescrita no pedido de patente WO-A-03/048770. Neste casopreciso, o fragmento de DNA não é fixado no ponto decaptura em uma membrana de nitrocelulose, mas é assimdiretamente incorporado dentro da mistura reativa. Estefragmento será recuperado in texto por meio de suasextremidades biotiniladas na avidina fixada no ponto decaptura (ver abaixo).
Todos os reagentes requeridos são introduzidos semqualquer modificação química ou substituição de modo apreservar todas as propriedades da reatividade e daestabilidade. Estas moléculas podem ser purificadas ounão-purificadas, as quais têm um benefício econômicoóbvio.
No exemplo preciso, a mistura reativa compreende:
5 partes do receptor de β-lactama (RSA) em umaconcentração de 3 60 nM;
- 5 partes do receptor de tetraciclina (TetR) em umaconcentração de 4,2 μΜ;
- 1 parte de soro anti-RSA diluído 4x em um tampão deNaPi 50 IriM, NaCl 150 mM, pH 7,8;
- 1 parte do soro anti-TetR diluído 4x em um tampão deNaPi 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,8;
- 1 parte do ácido nucléico em uma concentração de 25 μΜem NaCl 960 mM;
- 15 partes da proteína Α-ouro de 40 nm em uma densidadeóptica (OD) = 10 a 520 nm;
- 22 partes de tampão Hepes 120 mM, pH 8, BSA 2%, Dextran 1%, sacarose 5%.
Esta mistura é também preparada como requerido ouliofilizada por 20 horas.
Sistema de Recuperação
O sistema de recuperação compreende uma membrana denitrocelulose na qual são fixados, em pontos distintos,os elementos capazes de formar um complexo com asmoléculas de reconhecimento da mistura reativa. Esteselementos são:
- para o sinal "beta" (para β-lâctama), um antibiótico,preferivelmente, do tipo penicilina ou cefalosporina,fixado a uma molécula sem nenhuma reatividade particularpara a proteína A, biotina ou com a avidina. Em umaconfiguração preferida da presente invenção, umaampicilina fixada a uma β-lactoglobulina é usada;
- para o sinal "tetra" (para tetraciclina), uma avidinacapaz de reconhecer um fragmento de DNA com uma moléculade biotina em uma extremidade. Uma avidina de clara deovo é, preferivelmente, utilizada.
As zonas de captura "beta" e "tetra" podem ser,sucessivamente, posicionadas uma antes da outra ou vice-versa sem qualquer preferência particular, de modo queelas sejam arranjadas de forma espacial distintas, mas emlocalizações conhecidas. De fato, esta posição distintaque permitirá o tipo de antibiótico presente na soluçãoem análise a ser identificada. Se ambos os sistemas decaptura forem posicionados no mesmo ponto, suas medidasnão serão afetadas, mas não será possível determinar qualo tipo de composto que está atualmente presente.Preparação de β-lactoglobulina conjugada com ampicilina:β-lactoglobulina é escolhida por ser uma proteína doleite que compreende muitos resíduos de lisina (10%) e aestrutura tridimensional indica que muitas lisinas têmsua extremidade NH2 cobrindo o outro lado da proteína(Pubmed, "Structure", IGXA).100 mg de β-lactoglobulina e 15 mg de 2-iminotiolana sãoincubadas em um tampão de NaPi 100 mM, pH 8,5 em umvolume reativo de 4 ml por 60 minutos a 25°C. A mistura éentão depositada em uma coluna PDlO (AmershamBiosciences, UK) previamente equilibrada em PBS pH 7,EDTA 5 mM e eluída neste mesmo tampão. As frações deproteína são recolhidas por métodos bem conhecidos.
Adicionalmente, 2 ml de DMSO compreendendo 100 mg de SICCsão incubados com 2 ml de uma solução de 5 mg/ml deampicilina sódica em um tampão de NaPi 25 mM, pH 8,durante 60 minutos a 25°C antes de serem incubados empresença de 50 mg de uma solução de proteína durante 4horas a 4°C. Posteriormente, a solução é dialisada duasvezes por 6 horas com 100 volumes de um tampão de NaPi 25mM, pH 7,5.
Preparação de uma solução de avidina neutralizada:
Uma solução de 5 mg/ml de avidina de clara de ovo,disponível na Pierce, Inc., EUA, é preparada em um tampãode NaPi 50 mM, pH 7,5.
Preparação de uma solução controle de BSA-ouro:
A presente invenção recomenda o uso de uma linha decontrole da intensidade constante e visível antes e apóso desenvolvimento do teste. Esta linha é,preferivelmente, de uma cor similar àquela cordesenvolvida na "linha de teste" e é sintetizada como aseguir.
Para uma preparação de 27 ml de um coloidal de ouro 40nm, obtido pelo método de Frens18' e com uma densidadeóptica de OD íambda max 3, são adicionados 3 ml de umasolução de BSA (Sigma) a 10% em um tampão de borato deIOmM, pH 6,5. A mistura é incubada durante 60 minutos a2 0°C antes de ser centrifugada durante 45 minutos a10,000 rpm em um rotor SS34 (Sorvall) . 0 resíduo é entãorecuperado em um tampão de NaPi 50 mM, NaCl 150 mM demodo a obter um OOiamh^ max de 45. A solução que serádepositada na membrana de nitrocelulose é,adicionalmente, diluída 15 vezes neste mesmo tampão parase obter um OD final de 3.
Técnica Imunocromatográfica:
A técnica imunocromatográfica é conhecida e descrita naliteratura (nDeveloping Immunochromatographic TestStrips: A short Guide", Milliporer Lit. No. TB500,Printed in USA, 11/96, 96-204). Na presente invenção, aspreparações obtidas acima foram depositadas em posiçõesprecisas e distintas em uma membrana de nitrocelulose e,preferivelmente, sucessivamente uma atrás da outra comreferência à direção de migração do líquido. A membranade nitrocelulose é então trazida para contato em umaextremidade com uma membrana, por exemplo, do tipo 142,disponibilizada pela Ahlstrom, Inc., USA ou do tipo GFDVAdisponível na Whatman, UK, mas não do tipo Leukosorb® ,disponível na Pall, UK, e na outra extremidade porqualquer papel absorvente do tipo, por exemplo, 17CHR,disponível na Whatman, UK.
Deposição dos elementos de recuperação no suporte denitrocelulose:
É o posicionamento dos elementos de recuperação que irápermitir a identificação do tipo de contaminaçãoencontrado na amostra. As soluções são depositadas pormeio de um "distribuidor" Biodot (UK) do tipo Quanti-3000em uma proporção de fluxo de 1μΐ*/οη.
No caso de uma detecção para dois parâmetros, aspreparações de β-lactoglobulina e de avidina serãodepositadas em cada um dos lados da linha controle. Porexemplo, a β-lactoglobulina conjugada já preparada serádepositada abaixo da linha de controle e a solução deavidina neutralizada será depositada acima da linha decontrole (Figura 1). Como resultado, a presença decompostos β-lactama será caracterizada pela ausência demarcadores para β-lactoglobulina, ou seja, na linha deteste localizada abaixo da linha de controle, e napresença dos compostos de tetraciclina será caracterizadapela ausência de marcadores na linha de teste acima dalinha de controle. No caso onde ambos os compostos estãopresentes em quantidades suficientes, nenhum dos doissinais será aparente em qualquer um dos lados da linha decontrole (ver figura 1).
Medida simultânea de β-lactamas e tetraciclinas em umaamostra de leite:
200 μl; de leite frio são incubados a 50°C em presença de50 μl, dos reagentes preparados e/ou liofilizados comoacima. Após 3 minutos de incubação a 5 0°C, o elementorecuperado acima-descrito é imerso na solução. Ainterpretação final é feita após 3 minutos de incubaçãopor meio de um leitor óptico da régua de nível disponívelna Matest (Alemanha).
Os resultados estão representados na Tabela 1. 0 métodopermite considerar como positivo uma amostra de leite com4 ppb de ampicilina e/ou 75 ppb de tetraciclina.A tabela 2 representa os limites de detecção obtidos pelométodo da presente solução para os vários compostos dasβ-lactamas e das tetraciclinas mencionadas. Como umaregra geral, quando a proporção das intensidades do sinalde teste relacionado relativo ao sinal controle é menorque ou igual a 1, a amostra é considerada positiva para oparâmetro (composto) relacionado.
<table>table see original document page 23</column></row><table><table>table see original document page 24</column></row><table>
Tabela 1: Unidades e proporções da intensidade medida nospontos de captura.
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Tabela 2: Limite de Detecção
Exemplo No. 2:
Medida Simultânea de tetraciclinas, β-lactamas esulfamidas (formato 1 para as três detecções):
Nesta configuração preferida, em adição a ambos osreceptores tetraciclina e β-lactamas, este métodoincorporou um anticorpo específica para o reconhecimentode sulfadimetoxinas.
Preparação da mistura reativa:
Um anticorpo anti-sulfadimetoxina também é adicionado àmistura acima mencionada de acordo com a preparação aseguir:
5 partes do receptor de β-lactama (RSA) em umaconcentração de 3 60 nM;
5 partes do receptor de tetraciclina (TetR) em umaconcentração de 4,2 μΜ;
- 1 parte de soro anti-RSA diluído 4x em um tampão deNaPi 50 rriM, NaCl 150 mM, pH 7,8;- 1 parte do soro anti-TetR diluído 4χ no mesmo tampão;
- 1 parte do anti-sulfadimetoxina diluído 2x neste mesmotampão;
- 1 parte do ácido nucléico em uma concentração de 50 μΜ;
- 2 0 partes da proteína Α-ouro de 40 nm em uma OD = 10 a52 0 nm;
- 16 partes de tampão Hepes 12 0 iriM, pH 8, BSA 2%, Dextran1%, sacarose 5%.
Esta mistura é preparada da forma como requerida ouliofilizada por 20 horas.
Sistema de recuperação:
O sistema de recuperação é similar àquele do exemplo 1,no qual uma quarta linha específica para a recuperaçãodas moléculas do anticorpo anti-sulfadimetoxina éincorporado (3â linha' de teste). As outras zonas decaptura são idênticas, mas posicionadas diferentemente,como na figura 2.
Preparação de um BSA conjugado com uma sulfadimetoxina:A preparação é conseguida através do procedimentodescrito por Dixon-Holland e Katz(9). 100 mg desulfadimetoxina e 200 mg de BSA solubilizado em 25 ml deuma mistura, compreendendo duas partes de um tampão defosfato de 50 mM, pH 7,2 e 1 parte de dioxana, sãoincubados em presença de 12 0 mL de 25% de glutaraldeídoagitado por 3 horas a 25°. A solução é então dialisadapor 6 dias a 40C contra 100 volumes de um tampão de NaPi50 mM, pH 7,2 com uma mudança do tampão a cada 12 horas.
Deposição dos elementos recuperados no suporte denitrocelulose:
No caso de uma detecção de três parâmetros, as linhas decaptura são posicionadas em localizações precisas edistintas em uma membrana de nitrocelulose e,preferivelmente, sucessivamente uma após a outra comreferência à direção de migração do líquido. De acordocom uma configuração preferida, as zonas de captura paraβ-lactama, tetraciclina e sulfadimetoxina e a zonacontrole estão posicionadas em um primeiro, segundo,terceiro e finalmente, quarto nível, respectivamente, comreferência à direção de migração do líquido (figura 2).Uma zona de controle única serve como uma referência paraos três marcadores. Uma formulação diferente, similaràquela do exemplo precedente, seria incorporada às duaszonas controle, ou seja, uma zona de controle dentro decada zona de teste.
Como uma regra geral, deveria ser observado que, deacordo com a presente invenção, as linhas de teste e aslinhas de controle não têm, necessariamente, que serposicionadas na mesma ordem, relativamente à direção demigração do líquido. Assim, o kit trabalha igualmente bemse a ordem observada for "beta" - "tetra" ou "tetra" -"beta", "beta" - "sulfa" ou "sulfa" - "beta" (ver exemploabaixo), "beta" - "tetra" ou "sulfa" ou "sulfa" - "tetra"- "beta", etc..
Medida simultânea de β-lactamas, tetraciclinas esulfadimetoxinas em uma amostra de leite:
200 μl. de leite frio são incubados a 50° em presença de50 μl dos reagentes preparados e/ou liofilizados comoacima. Após 3 minutos de incubação a 500C, o elemento derecuperação acima-mencionado é imerso na solução. Ainterpretação final é feita após 3 minutos de incubaçãopor meio de um leitor óptico da régua de nível disponívelna Matest (Alemanha).
Os resultados estão representados na tabela 3. 0 métodopermite considerar como positivo a amostra de leite com 4ppb em ampicilina e/ou 75 ppb em tetraciclina e 100 ppbem sulfadimetoxina.
A tabela 4 resume os limites de detecção obtidos pelométodo de acordo com a presente invenção para os várioscompostos de β-lactama, tetraciclinas, e sulfadimetoxinamencionados. Como uma regra geral, se a proporção daintensidade do sinal de teste relacionado, relativa aosinal de controle for menor que ou igual a 1, a amostra éconsiderada como positiva para o parâmetro (composto)relacionado.<table>table see original document page 27</column></row><table>
Tabela 3: Proporções das intensidades medidas
A: ampicilina; T: Tetraciclinas; S: sulfamida, C:controle.
Antibiótico Limite de detecção da concentração (ppb) Proporção teste/controleBenzilpenicilina 2 0,4Ampicilina 4 0,4Amoxicilina 4 0,4Cloxaciclina 10 0,5Cefapirina 8 0,3Ceftiofur 10 0,5Tetraciclina 75 0,8Oxitetraciclina 50 0,9clortetraciclina 50 0,7Doxiciclina 20 0,6Sulfadimetoxina 100 0,8
Tabela 4: Limite de Detecção
5 Exemplo 3:
Medida simultânea de β-lactamas e sulfamidas (formato 1para β-lactamas e formato 2 para sulfamidas).Preparação da mistura reativa:A mistura reativa compreende:10-5 partes do receptor de β-lactama (RSA) em umaconcentração de 360 nM;- 10 partes de um anticorpo anti-RSA monoclonal ligado àpartícula coloidal de ouro (OD =10 em 520 nm);
- 1 parte de anti-sulfadimetoxina diluída e biotiniladaem NaPi 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,8;
- 10 partes de uma diluição de BSA-sulfadimetoxina-ourode 40 nm;
- 24 partes de tampão Hepes 120 mM, pH 8, BSA 2%, Dextran 1%, sacarose 5%.
Esta mistura é preparada da forma como requerida ouliofilizada por 20 horas.
Biotinilação dos anticorpos anti-sulfadimetoxina825 μL de uma solução compreendendo 5mg/ml do anticorpoanti-sulfadimetoxina dialisada em um tampão de carbonato100 mM, pH 9,2 são incubados em presença de 165 μΐ; de umasolução de biotina-LC-NHS em 1,5 mg/ml (disponível naPerbio, Inc.) durante 2 horas em 25°C protegido da luz. Areação é bloqueada por adição de 10 μl. de uma solução deum tampão Tris IM pH 8 durante 20 minutos antes dadiálise 2x durante 10 horas contra um tampão de NaPi 50mM, NaCl 150 mM, pH 7,8.
Preparação de um BSA-sulfadimetoxina conjugado com umapartícula de ouro:
A preparação de BSA-sulfadimetoxina descrita no exemploNo. 2 é usada para fixar as partículas coloidais de outroem um protocolo similar àquele descrito no exemplo 1 parapreparar a solução controle de BSA-ouro.
O sistema de recuperação:
O sistema de recuperação é idêntico àquele do exemplo 1.Entretanto, no presente caso, é o anticorpo anti-sulfamida biotinilado que será recuperado na avidinafixada no segundo ponto de captura acima da zona decontrole.
Medida simultânea de β-lactamas e sulfadimetoxinas em umaamostra de leite:
200 μl do outro frio são incubados durante 15 minutos a30°C em presença de 50 μΐ- dos reagentes preparados acima.Após esta primeira incubação, o elemento recuperado acimadescrito é imerso na solução. A interpretação final éfeita após uma segunda incubação de 15 minutos. Osresultados estão representados na tabela 5.
<table>table see original document page 29</column></row><table>
Tabela 5: Proporção das intensidades medidas(*> B: β-lactamas; S: sulfamida; C: controle
Exemplo No. 4:
Medida simultânea de tetraciclinas e sulfamidas (formato2 para ambas as detecções).
Preparação da mistura reativa
A mistura reativa compreende:
- 5 partes do receptor de tetraciclina (TetR) em umaconcentração de 4,2 μΜ;
- 1 partes de um anticorpo anti-TetR monoclonal diluídoem um tampão de NaPi 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,8;
- 1 parte do anticorpo de coelho anti-sulfamida diluídaneste mesmo tampão;
- 10 partes de uma diluição de BSA-sulfadimetoxina-ourode 40 nm;
1 parte de ácido nucléico biotinilado em umaconcentração de 50 μΜ;
- 10 partes de um anticorpo anti-biotina-ouro de 40 nm emOD = 10 em 520 nm;
- 22 partes de tampão Hepes 120 mM, pH 8, BSA 2%, Dextran1%, sacarose 5%.Esta mistura é preparada da forma como requerida ouliofilizada por 20 horas.
O sistema de recuperação
O sistema de recuperação é similar àquele do exemplo 1.
Entretanto, no presente caso, ele é um anticorpo anti-camundongo que forma o primeiro ponto de captura onde oanticorpo anti-TetR monoclonal será recuperado e ele é umanticorpo anti-coelho de galinha que forma o segundoponto de captura onde o anticorpo anti-sulfamida serárecuperado.
Medida simultânea de tetraciclinas e sulfamidas em umaamostra de carne
30 ml de um tampão de NaPi 50 mM, pH 8 é adicionado a 10g do músculo do porco e a mistura é misturada com ummisturador do tipo MiniMix (Interscience, F) por 2minutos. A solução, colhida em um tubo de Eppendorf, éentão centrifugado durante 1 minuto a 6,000 rpm pararecuperar o sobrenadante dele. 200 μΐι do sobrenadante sãoincubados durante 15 minutos a 25°C em presença de 50 μΐ;dos reagentes preparados acima. Após esta primeiraincubação, o elemento recuperado acima-mencionado éimerso na solução. A interpretação final é feita após umasegunda incubação de 15 minutos. Os resultados estãorepresentados na tabela 6.
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Tabela 6: Proporções das intensidades medidasr) Τ: tetraciclina; S: sulfamida; C: controle
Exemplo 5:
Medida simultânea de β-lactamas, tetraciclinas esulfamidas (formato 1 para β-lactamas/tetraciclinas eformato 2 para sulfamidas)
Preparação da mistura reativa:
A mistura reativa compreende:
5 partes do receptor de β-lactama (RSA) em umaconcentração de 360 nM;
- 1 parte do anticorpo de camundongo anti-RSA monoclonaldiluído em um tampão de NaPi 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,8;
5 partes do receptor de tetraciclina (TetR) em umaconcentração de 4,2 μΜ;
1 parte do anticorpo de camundongo anti-TetRmonoclonal diluído em um tampão de NaPi 50 mM, NaCl 150mM, pH 7,8;
1 parte do ácido nucléico biotinilado em umaconcentração de 5 0 μΜ;
1 parte do anticorpo de coelho anti-sulfamidapoliclonal diluído em um tampão de NaPi 50 mM, NaCl 150mM, pH 7,8;
- 7 partes de uma diluição de BSA-sulfadimetoxina-ouro de40 nm;
13 partes de um anticorpo anti-camundongo ligado àpartícula coloidal ouro de 40 nm em uma OD = 10 a 520 nm;
- 16 partes de tampão Hepes 12 0 mM, pH 8, BSA 2%, Dextran1%, sacarose 5%.
Esta mistura é preparada da forma como requerida ouliofilizada por 20 horas.
Em um segundo método preferido, ambos os anticorpos anti-RSA e anti-TetR monoclonais são diretamente conjugadoscom as partículas coloidais de ouro.
O sistema de recuperação
O sistema de recuperação é similar àquele do exemplo 1.
Entretanto, no presente caso, ele é lactoglobulina-ampicilina que forma o primeiro ponto de captura onde oreceptor RSA será recuperado, ele é avidina no segundoponto de captura onde o receptor TetR será recuperado eele é um anticorpo anti-coelho de galinha que forma oterceiro ponto de captura onde o anticorpo anti-sulfamidade coelho será recuperado.
Medida simultânea de β-lactamas, tetraciclinas esulfamidas em uma amostra de leite
200 μl; de leite frio são incubados por 15 minutos a 30°Cem presença de 50 μΐ; dos reagentes acima preparados. Apósesta primeira incubação, o elemento recuperado acimadescrito é imerso na solução. A interpretação final éfeita após uma segunda incubação de 15 minutos. Osresultados estão representados na tabela 7 abaixo.
<table>table see original document page 32</column></row><table>
Tabela 7: Proporção das intensidades medidas
(*) B: β-lactama; T: tetraciclinas; S: sulfamida; C:controle.
Referências:
(1)Council Directive 96/23/CE datado de Abril 29, 1996,"On measures to monitor certain substances and residuesthereof in Iive animais and animal products" andabrogating Directives 85/358/CEE, e 86/469/CEE eDecisions 89/187/CEE e 91/664/CEE;
(2) Council Regulation (EEC) No. 2377/90 datada de Junho26, 1990, nLaying down a Community procedure for theestablishment of maximum residue limits for veterinarymedicinal products in foodstuffs of animal origin";
(3) Off. J. Eur. Comm., 2002, L221/8 - 2002/657/CE;
(4) Hisao Oka, "Chemical Analysis for Antibiotics Used inAgriculture", by AOAC INTERNATIONAL, 1995, ISBN 0-935584-57-9;
(5) Ron Verheijen et al. , "Analyst 123", (1998), 2437-2441;
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Claims (13)
1. Kit de diagnóstico para medida simultânea deantibióticos de classes diferentes, pelo menos uma β-lactama e uma tetraciclina, caracterizado pelo fato decompreender:em um objetivo, uma mistura reativa simplescompreendendo pelo menos um primeiro receptor específicopara o reconhecimento de β-Iactamas, um segundo receptorpara reconhecer especificamente e competitivamente umatetraciclina e um fragmento biotinilado do ácidonucléico, ambos os receptores sendo, preferivelmentemarcados por partículas coloidais de ouro, tantodiretamente quanto indiretamente por meio de um anticorpoou de um anticorpo em associação com a proteína A;- e em um outro objetivo, um sistema de recuperação naforma de um suporte sólido compreendendo uma membrananitrocelulose na qual são ligadas em duas seçõesconhecidas e distintas, denominadas zonas de teste, umantibiótico com um núcleo β-lactama e uma avidína,respectivamente ou vice-versa; e- de tal maneira que a intensidade do marcador detectadano sistema de recuperação em ambas as zonas de teste,resulte, independentemente, a partir do reconhecimentocompetitivo de cada antibiótico por seu receptor marcado.
2. Kit de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o antibiótico com um núcleo β-lactama e avidina ligado à membrana nitrocelulósica seruma penicilina ou uma cefalosporina respectivamente,preferivelmente, uma ampicilina fixada a uma β-lactoglobulina e uma avidina de clara do ovo.
3. Kit de diagnóstico para medida simultânea deantibióticos de classes diferentes, pelo menos uma β-lactama e uma sulfamida, caracterizado pelo fato decompreender:em um objetivo, uma mistura reativa simplescompreendendo pelo menos um primeiro receptor específicopara reconhecimento de β-lactamas, marcado direta ouindiretamente, por partículas coloidais de ouro, umanticorpo anti-sulfamida biotinilado e um análogo de umasulfamida marcada tanto direta quanto indiretamente comcolóide dourado;- e em um outro objetivo, um sistema de recuperação naforma de um suporte sólido compreendendo uma membrananitrocelulose na qual são ligadas em duas seçõesconhecidas e distintas, denominadas zonas de teste, umantibiótico com um núcleo β-lactama e uma avidina,respectivamente ou vice-versa;- de tal maneira que a intensidade do marcador detectadano sistema de recuperação em ambas as zonas de teste,resultando, independentemente, do reconhecimentocompetitivo de cada antibiótico.
4. Kit de diagnóstico para medida simultaneamente deanalítos correspondentes aos antibióticos de classesdiferentes, pelo menos tetraciclinas e sulfamidas,caracterizado pelo fato de compreender:em um objetivo, uma mistura reativa simplescompreendendo pelo menos um receptor especificamente ecompetitivamente reconhece uma tetraciclina e umfragmento biotinilado do ácido nucléico, dito receptorsendo preferivelmente marcado por partículas coloidais deouro, tanto diretamente quanto indiretamente por meio deum anticorpo, bem como um anticorpo anti-sulfamida e umanálogo de uma sulfamida marcada tanto direta quantodiretamente, preferivelmente com um coloidal dourado; e- e em um outro objetivo, um sistema de recuperação naforma de um suporte sólido compreendendo uma membrananitrocelulósica a qual é ligada em duas seções conhecidase distintas, denominadas zonas de teste, um anticorpoespecificamente marcado tanto pelo receptor detetraciclina quanto por um anticorpo específico doreceptor de tetraciclina e um anticorpo especificamentealvo para o anticorpo anti-sulfamida, respectivamente ouvice-versa;
5. Kit de diagnóstico, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de oanticorpo anti-receptor específico adicionado à misturade reação serem anticorpos monoclonal ou policlonal,modificados ou não-modifiçados quimicamente ou porrecombinação, purificado ou não-purifiçado, ligado ounão-ligado, diretamente ou indiretamente às partículasmarcadas, preferivelmente partículas coloidais de ouro.
6. Kit de diagnóstico, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de amembrana nitrocelulósica depositada em um suporte commedição de profundidade estar em contato com uma primeiraextremidade com uma membrana e em uma segunda extremidadecom um papel absorvente e ter ambas as zonas de teste,uma após a outra na direção de migração do líquido, umazona de controle, separando, possivelmente as duas zonasde teste.
7. Kit de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de a zona de controle serobservada por meio de qualquer preparação de proteínamarcada, preferivelmente, por partículas coloidais deouro e, ainda, pref erivelmente, por meio de uma soro-albumina bovina ou BSA ligado às partículas coloidais deouro.
8. Kit de diagnóstico para medida simultânea de β-lactamas, tetraciclinas e sulfamidas, de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de amistura reativa também compreender um anticorpoespecífica para o reconhecimento de sulfamidas emarcadas, preferivelmente, direta ou indiretamente pelaspartículas coloidais de ouro, e pelo fato de o sistema derecuperação também compreender a preparação da proteínaconjugada com sulfamidas, fixadas na membrananitrocelulósica.
9. Kit de diagnóstico para medida simultânea da β-lactamas, tetraciclinas e sulfamidas, de acordo com areivindicação 8, caracterizado pelo fato de a membrananitrocelulósica depositada em um suporte com medição deprofundidade estar em contato em uma primeira extremidadecom uma membrana e em uma segunda extremidade com umpapel absorvente e tem três zonas de testes distintas euma zona controle, arranjada sucessivamente uma após aoutra na direção de migração do líquido, ou duas zonascontroles, cada uma alternativamente arranjada entre duaszonas de teste.
10. Kit de diagnóstico para medida simultânea de analítoscorrespondentes aos antibióticos de classes diferentes,pelo menos β-lactamas, tetraciclinas e sulfamidas,caracterizado pelo fato de compreender:em um objetivo, uma mistura reativa simplescompreendendo pelo menos um primeiro receptor específicopara o reconhecimento de β-lactamas, um segundo receptorque reconhecer especificamente e competitivamente umatetraciclina e um fragmento biotinilado do ácidonucléico, ambos os receptores sendo, preferivelmente,marcados por partículas coloidais de ouro, tanto diretaquanto indiretamente por meio de um anticorpo ou de umanticorpo em associação com a proteína A, bem como umanticorpo anti-sulfamida e um análogo de uma sulfamidalivre marcada tanto direta quanto indiretamente comcoloidal dourada;- e em um outro objetivo, um sistema de recuperação naforma de um suporte sólido compreendendo uma membrananitrocelulósica para a qual são ligadas em duas seçõesconhecidas e distintas, um antibiótico com um núcleo β-lactama, uma avidina e um anticorpo alvo para o anticorpoant i-sulfamida, respectivamente;- de tal maneira que a intensidade do marcador detectadano sistema de recuperação em ambas as três zonas deteste, resultam, independentemente, no reconhecimentocompetitivo de cada antibiótico.
11. Kit de diagnóstico, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de aamostra ser essencialmente líquida e ser obtida a partirdo leite, mel, carne, ovos, ou líquidos biológicos.
12. Kit de diagnóstico, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato deos receptores utilizados para medida da β-lactamas outetraciclinas serem receptores BlaR e TetRrespectivamente isolados de classes conhecidas demicroorganismos, preferivelmente, de Staphylococcusaureus para BlaR e a partir do plasmídeo pSClOl de E.coli 600 para TetR, respectivamente.
13. Método para implementar o kit de diagnóstico,definido em qualquer uma das reivindicações precedentes,caracterizado pelo fato de compreender os estágios aseguir:a mistura reativa acima-mencionada ser trazida emcontato com uma amostra a ser classificada de modo aobter uma solução que é deixada para incubar em umatemperatura entre 30°C e 50°C durante 3 a 15 minutos;- um suporte com medição de profundidade do sistema derecuperação acima mencionado imerso na solução obtida edeixado para incubar durante 3 a 15 minutos; e- o resultando do suporte com medição de profundidade serinterpretado também visualmente a olho nu ou através deum leitor óptico de profundidade.
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 13/04/2006, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO |
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| B21F | Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time |
Free format text: REFERENTE A 18A ANUIDADE. |
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| B24J | Lapse because of non-payment of annual fees (definitively: art 78 iv lpi, resolution 113/2013 art. 12) |
Free format text: EM VIRTUDE DA EXTINCAO PUBLICADA NA RPI 2770 DE 06-02-2024 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDA A EXTINCAO DA PATENTE E SEUS CERTIFICADOS, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013. |