MX2007007392A - Promotores multiples y el uso de los mismos para la expresion de genes. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona a promotores multiples y a unidades de expresion que los comprenden; al uso de los mismos para regular la transcripcion y expresion de genes; a casetes de expresion los cuales comprenden promotores multiples o unidades de expresion de este tipo; a vectores los cuales comprenden tales casetes de expresion; a microorganismos geneticamente modificados los cuales comprenden vectores y/o unidades de expresion de este tipo; y a procesos para preparar productos biosinteticos cultivando dichos microorganismos modificados.

Description

PROMOTORES MÚLTIPLES Y EL USO DE LOS MISMOS PARA LA EXPRESIÓN DE GENES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a promotores múltiples y a unidades de expresión que los comprenden; al uso de los mismos para regular la transcripción y expresión de los genes; a casetes de expresión los cuales comprenden promotores múltiples o unidades de expresión de esta clase; a vectores que comprenden tales casetes de expresión; a microorganismos genéticamente modificados que comprenden vectores y/o unidades de expresión de esta clase; y a procesos para preparar productos biosintéticos mediante el cultivo de dichos microorganismos genéticamente modificados. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Varios productos biosintéticos se producen en células vía procesos metabólicos naturales y se usan en muchas ramas de la industria, incluyendo comestibles, alimentos, cosméticos, alimentos, comidas e industrias farmacéuticas. Estas sustancias, las cuales de manera resumida se les llama como químicos/proteínas finas, comprenden, inter alia, ácidos orgánicos, tanto aminoácidos proteinogénicos como no proteinogénicos, nucleótidos o nucleósidos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, y también proteínas y enzimas. Ellos se producen de manera más conveniente a una gran escala mediante el crecimiento de cepas de células u otros microorganismos los cuales han sido desarrollados para producir y secretar grandes cantidades de la sustancia deseada en cada caso. Organismos particularmente convenientes para este propósito son la bacteria corineforme, la bacteria no patogénica Gram-positiva . Se sabe que los aminoácidos pueden prepararse por fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular, Corynebacterium glutamicum. Debido a la gran importancia, se ha llevado a cabo trabajo continuo en el mejoramiento de los procesos de producción. Los mejoramientos en los procesos pueden relacionarse a medidas de la técnica de fermentación tal como, por ejemplo, agitación y suministro de oxígeno, o a la composición del medio nutriente, tal como por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación, o al empleo para obtener el producto, por ejemplo, por cromatografía por intercambio iónico o también al secado por aspersión o a las propiedades de funcionamiento intrínsecas del microorganismo mismo. De manera similar, métodos de tecnología de ADN recombinante han sido empleaos por algunos años para mejorar las cepas de Corynebacterium que producen químicos/proteínas finas, amplificando los genes individuales y estudiando el efecto en la producción de químicos/proteínas finas. Otras formas de desarrollar un proceso para producir químicos o proteínas finas o de incrementar o mejorar la productividad de un proceso ya existente para preparar químicos o proteínas finas comprende incrementar o alterar la expresión de uno o más genes y/o influenciar la traducción de un ARNm a manera de secuencia de polinucleótidos convenientes. En este contexto, influenciar puede comprender incrementar, reducir o también otros parámetros de la expresión de los genes, tal como los patrones de expresión relacionados con el tiempo. Varios componentes de secuencias reguladoras bacterianas se conocen por el trabajador experto. Se hace una distinción entre los sitios de enlace de reguladores, también conocidos como operadores, los sitios de enlace de haloenzima de polimerasa de ARN, también conocidas como regiones -35 y -10 y el sitio de enlace 16S-ARN ribosómico, también conocido como sitio de enlace ribosómico (RBS) o también secuencia Shine-Dalgarno. La composición de la secuencia del polinucleótido de la secuencia Shine-Dalgarno y la secuencia de las bases, pero también la distancia de una secuencia de polinucleótido presente en la secuencia Shine-Dalgarno hasta el codón de inicio se describe en la literatura (E. coli and S. typhimurium, Neidhardt F.C 1995 ASM Press) como que tiene una influencia sustancial en la velocidad de iniciación de la traducción. Las secuencias de ácidos nucleicos que tienen actividad promotora pueden influenciar la formación de ARNm en diferentes formas. Los promotores cuyas actividades son independientes de la fase de crecimiento fisiológico del organismo son llamados constitutivos. Otros promotores en turno responden a químicos externos además de estímulos físicos, tales como, oxígeno, metabolitos, calor, pH, etc. Otros en turno presentan una fuerte dependencia de su actividad en diferentes fases de crecimiento. Ejemplos de promotores que presentan una actividad particularmente pronunciada durante la fase de crecimiento exponencial de microorganismos, o también exactamente en la fase estacionaria de crecimiento microbiano, se describen en la literatura. Ambas características de los promotores pueden tener una influencia benéfica en la productividad para la producción de químicos y proteínas finas, dependiendo de la trayectoria metabólica. Aquellas secuencias de nucleótidos que pueden utilizarse para incrementar o atenuar la expresión de los genes ya han sido aisladas en especies Corynebacterium. Estos promotores regulados pueden incrementar o reducir la velocidad a la cual se transcribe un gen, como una función de las condiciones internas y/o externas de la célula. En algunos casos, la presencia de un factor particular, conocido como inductor, puede estimular la velocidad de trascripción desde el promotor. Los inductores pueden influenciar la trascripción desde el promotor directamente o también indirectamente. Otra clase de factores, conocidos como supresores, es capaz de reducir o también de inhibir la trascripción desde el promotor. Tal como los inductores, los supresores pueden también actuar directamente o indirectamente. Sin embargo, los promotores térmicamente regulados también son conocidos. De esta manera, una elevación de la temperatura de crecimiento por arriba de la temperatura de crecimiento normal de la célula puede incrementar o también atenuar el nivel de trascripción de tales promotores. Un número pequeño de promotores de C. glutamicum han sido descritos hasta la fecha. El promotor del gen de malato sintasa de C. glutamicum se describe en DE-A-44 40 118. Este promotor se coloca corriente arriba de un gen estructural que codifica una proteína. Después de la transformación de una estructura tal en una bacteria corineforme, se regula la expresión del gen estructural corriente abajo del promotor. La expresión del gen estructural se induce tan pronto como un inductor correspondiente se agrega al medio. Reinscheid et al., Microbiology 145:503 (1999) ha descrito una fusión transcripcional entre el promotor pta-ack de C. glutamicum y un gen reportero (acetiltransferasa de cloramfenicol). Las células de C. glutamicum que contienen una fusión transcripcional tal, presentan una expresión aumentada del gen reportero cuando crece en medio de acetato. Mediante la comparación, las células transformadas que crecen en glucosa no muestran expresión incrementada para los promotores de C. glutamicum. Otras secuencias de ADN de C. glutamicum que pueden utilizarse para regular la expresión del gen se han descrito en WO 02/40679. Estos polinucleótidos aislados son unidades de expresión de Corynebacterium glutamicum, los cuales pueden utilizarse para incrementar o para reducir la expresión del gen. Esta publicación impresa describe además plásmidos recombinantes sobre los cuales dichas unidades de expresión de Corynebacterium glutamicum se asocian con genes heterólogos. El método descrito aquí, de fusión de un promotor de Corynebacterium glutamicum a un gen heterólogo, puede emplearse, inter alia , para regular los genes de biosíntesis de aminoácidos.

Las solicitudes de patentes no previamente publicadas, antiguas, DE-A-103 59 594, DE-A-103 59 595, DE-A-103 59 660 y DE-A-10 2004 035 065 divulgan promotores individuales especiales de C. glutamicum. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se basa en el objetivo de producir secuencias de ácidos nucleicos reguladores adicionales disponibles, en particular estructuras de promotores y/o unidades de expresión que tienen propiedades ventajosas, por ejemplo, actividad transcripcional incrementada o alterada y/o actividad de traducción, en comparación con el promotor de inicio . El objetivo se logra de acuerdo a la invención proporcionando una unidad de expresión que comprende un promotor múltiple, que comprende, en la dirección 5 '-3', un modulo de secuencia de la siguiente fórmula I : d'-Pi-í-Ax-Px-Jn-Ay-Py-S' (I) donde n es un entero de 0 a 10, Ax y Ay son idénticos o diferentes y son un enlace químico o una secuencia de ácido nucleico enlazadora; Pi, Px y Py codifican secuencias del promotor diferentes o idénticas que comprenden al menos una región de enlace de polimerasa de ARN tal como, la región del núcleo; y al menos Py comprende una sección de secuencia 3 '-terminal que media el enlace del ribosoma. Pi e individual o todo Px puede también tener, independientemente uno de otro, una sección de secuencia de esta clase, la cual media el enlace del ribosoma. De acuerdo a una modalidad, Pi, Px y Py se derivan de organismos eucarióticos idénticos o diferentes, en particular de procarióticos. También se pueden usar promotores artificiales . De acuerdo a una modalidad preferida, Pi, Px y Py son en cada caso derivados de una secuencia contigua de desde 35 a 500 residuos de nucleótidos, preferiblemente de 35 a 300 residuos de nucleótidos, más preferiblemente de 35 a 210 residuos de nucleótidos y de manera particularmente preferible de 35 a 100 residuos de nucleótidos, secuencia la cual se localiza en la posición 5' corriente arriba de la secuencia de codificación para una proteína, por ejemplo una proteína involucrada en una trayectoria biosintética del organismo, en el genoma de dicho organismo. De acuerdo a otra modalidad, ?>l t Px y Py de la unidad de expresión se derivan de una bacteria corineforme. De acuerdo a una modalidad preferida, Pi, Px y Py de la unidad de expresión son, independientemente uno del otro, seleccionados de entre las secuencias del promotor para la secuencia de codificación de una proteína con abundancia alta en un organismo eucariótico o procariótico, en particular en una bacteria corineforme, tal como por ejemplo, en uno del género Corynebacterium o Brevibacterium, por ejemplo una especie o una cepa de acuerdo a la lista en la tabla 3. Además, individualmente o todas estas secuencias de promotores pueden seleccionarse de entre secuencias de promotores para la secuencia de codificación de una proteína enlistada en la tabla 1, e involucrada en la biosíntesis de aminoácidos de un organismo. Al menos uno de los promotores de la unidad de expresión de acuerdo a la invención debe, sin embargo, en relación a esto, tener alta abundancia como se define aquí . De acuerdo a otra modalidad preferida, P1# Px y Py de la unidad de expresión son, independientemente uno del otro, seleccionados de entre las secuencias de nucleótidos representadas en la figura 1 o como se explicará más adelante con más detalle, se derivan de la SEC ID NO:l (pGRO) , SEC ID N0:2 (pEFTs) , SEC ID NO : 3 (pEFTu) y SEC ID NO : 4 (pSOD) . De acuerdo a otra modalidad, P1# Px y Py de la unidad de expresión, independientemente uno de otro, se seleccionan de entre promotores constitutivos o regulables, fuertes. En un aspecto más, la presente invención se refiere a un cásete de expresión, que comprende, en la dirección 5 '-3', un modulo de secuencia de la siguiente fórmula II: donde n, Ax, Ay, Pi, Px, y Py son los mismos que se definieron anteriormente, y G es al menos es una secuencia de ácido nucleico de codificación que es enlazada de manera funcional o de manera operativa a la secuencia reguladora corriente arriba 5'. De acuerdo a una modalidad preferida del cásete de expresión, G se selecciona de entre a) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, b) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de nucleótidos y nucleósidos, c) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de ácidos orgánicos, d) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de lípidos y ácidos grasos, e) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de dioles, f) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de carbohidratos, g) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de compuestos aromáticos, h) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de vitaminas, i) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de cofactores, j) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de enzimas, y k) ácidos nucleicos que codifican una proteína del metabolismo central. De acuerdo a una modalidad particularmente preferida del cásete de expresión, G se selecciona de entre ácidos nucleicos que codifican proteínas de la trayectoria biosintética de aminoácidos, seleccionados de entre cinasa de aspartato, deshidrogenasa de semialdehido de aspartato, deshidrogenasa de diaminopimelato, descarboxilasa de diaminopimelato, sintetasa de dihidrodipicolinato, reductasa de dihidrodipicolinato, deshidrogenasa de gliceraldehido-3-fosfato, cinasa de 3-fosfoglicerato, carboxilasa de piruvato, isomerasa de triosefosfato, regulador LuxR trascripcional, regulador LysRl trascripcional, regulador LysR2 trascripcional, oxidoreductasa de malato-quinona, deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato, deshidrogenasa de 6-fosfogluconato, transcetolasa, transaldolasa, O-acetiltransferasa de homoserina, gama-sintasa de cistationina, beta-liasa de cistationina, hidroximetiltransferasa de serina, sulfhidrilasa de O- acetilhomoserina, reductasa de metilenotetrahidrofolato, aminotransferasa de aminocerina, fosfatasa de fosfoserina, acetiltransferasa de serina, deshidrogenasa de homoserina, cinasa de homoserina, sintasa de treonina, portador exportador de treonina, deshidratasa de treonina, oxidasa de piruvato, exportador de lisina, ligasa de biotina, sintasa 1 de cisteina, sintasa II de cisteina, sintasa de metionina dependiente de la coenzima B-12, actividad de la sintasa de metionina independiente de la coenzima B-12, subunidades 1 y 2 de adeniltransferasa de sulfato, reductasa de fosfosulfato de fosfoadenosina, reductasa de sulfito de ferredoxina, reductasa de NADP de ferroxidina, deshidrogenasa de 3-fosfoglicerato, regulador de RXA00655, regulador de RXN2910, sintetasa de arginil-tARN, carboxilasa de fosfoenolpiruvato, proteína de emanación de treonina, hidroximetiltransferasa de serina, 1,6-biofosfatasa de fructosa, proteína de RXA077 de reducción de sulfato, proteína de RXA248 de reducción de sulfato, proteína de RXA247 de reducción de sulfato, proteína OpcA, 1-fosfofructocinasa y 6-fosfofructocinasa, succinilasa de tetrahidropicolinato, aminotransferasa de aminocetopimelato de succinilo, desuccinilasa de diaminopimelato de succinilo, epimerasa de diaminopimelato, deshidrogenasa de 6-fosfogluconato, isomerasa de fosfato de glucosa, mutasa de fosfoglicerato, enolasa, cinasa de piruvato, transaminasa de aspartato, enzima de malato. En un aspecto más, la presente invención se refiere a un vector que comprenden al menos uno de los casetes de expresión anteriormente mencionados. De acuerdo aún a otro aspecto, la presente invención se refiere a un microorganismo genéticamente modificado que se ha transformado con al menos uno de los vectores anteriormente mencionados o el cual comprende al menos uno de los casetes de expresión anteriormente mencionados, preferiblemente en una forma integrada . De acuerdo a una modalidad, el organismo genéticamente modificado se deriva de bacteria corineforme. De acuerdo a un aspecto más, la presente invención se refiere a un proceso para preparar un producto biosintético, que comprende cultivar cualquiera de los microorganismos genéticamente modificados, anteriormente mencionados, y aislar el producto del cultivo. De acuerdo a una modalidad del proceso, el producto biosintético se selecciona de entre ácidos orgánicos, proteínas, nucleótidos y nucleósidos, de ambos, aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, enzimas y proteínas. Productos biosintéticos muy particularmente preferidos son lisina, metionina, treonina y trehalosa. De acuerdo a un aspecto más, la presente invención se refiere al uso de una unidad de expresión de la invención para regular una biosíntesis de producto. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 describe secuencias específicas para cuatro promotores, que se utilizan para preparar los promotores múltiples descritos en las modalidades ejemplares. Se muestran las secuencias del promotor para pEFTu (Figura ÍA) , para el promotor pGRO (Figura IB) , para el promotor pEFTs (Figura 1C) y para el promotor pSOD (Figura ID) . Se indican dos secuencias para cada promotor, la mayor de las cuales (secuencia superior) en cada caso indica la secuencia del promotor completa que incluye el sitio de enlace ribosómico (RBS) , impreso en tipo negrilla y en cursiva. En el caso de un arreglo terminal -3' del promotor particular en la estructura del promotor múltiple de la invención, se da preferencia a usar en cada caso la secuencia del nucleótido mayor (incluyendo el RBS) . Las secuencias 5' del promotor corriente arriba de la unidad del promotor terminal -3' no comprende ningún RBS y se usan en la secuencia de ácido nucleico truncado indicado en cada caso en segunda posición (sin RBS) . Las secuencias del promotor más cortas pueden también carecer, sí es apropiado, de secuencias parciales terminales-3 ' indicadas en letras mayúsculas y de tipo de negrillas. Se subrayan "regiones -10'" potenciales. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I . Definiciones generales: Un "producto biosintético" quiere decir, para los propósitos de la invención aquellos que se producen vía procesos metabólicos naturales (trayectorias biosintéticas) en células. Ellos se utilizan en muchas formas diferentes, en particular, en los comestibles, alimentos, cosméticos, alimentos, comidas e industrias de farmacéuticos. Estas sustancias las cuales se les llama de manera resumida como químicos/proteínas finas comprenden, inter alia, ácidos orgánicos, ambos, aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, nucleótidos y nucleósidos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores y también proteínas y enzimas. Un "promotor" , un "ácido nucleico con actividad de promotor" o una "secuencia de promotor" se refieren, de acuerdo a la invención a un ácido nucleico que esta enlazado de manera funcional a un ácido nucleico a transcribirse y el cual regula la trascripción de dicho ácido nucleico. A menos que se refieran expresamente "promotores individuales" , el término "promotor" comprende de acuerdo a la invención y dependiendo del contexto también, el arreglo secuencial de más de una secuencia de ácido nucleico (es decir, promotores múltiples) cada uno de los cuales, cuando se enlazan de manera funcional a un ácido nucleico a transcribirse, debe ser capaz de regular la trascripción del último. De conformidad, el término "promotor individual" se refiere a una secuencia de ácido nucleico individual, la cual es capaz de regular la trascripción de un ácido nucleico a transcribirse y la cual, cuando se enlaza de manera funcional a un ácido nucleico a transcribirse, puede transcribir el último. En el caso de "promotores múltiples" al menos dos secuencias de ácidos nucleicos idénticas o diferentes cada una de las cuales debe, cuando se enlazan de manera funcional a un ácido nucleico a transcribirse, ser capaz de regular la trascripción de la última (promotores individuales) estando enlazados de manera secuencial en una manera en la que un inicio transcripcional desde opcionalmente una de dichas secuencias de ácidos nucleicos puede producir una transcripción que contiene dicho ácido nucleico a transcribirse. En relación a esto, esto es posible para otras secuencias sin función del promotor, por ejemplo un enlazador que tiene, por ejemplo, uno o más sitios de restricción de escisión, a insertarse entre, en cada caso, dos promotores individuales. Opcionalmente, en cada caso, dos promotores individuales pueden también enlazarse directamente uno con otro. Dichos promotores múltiples preferiblemente contienen únicamente un sitio de enlace ribosómico (RBS) , en particular en la región del término 3 " del promotor. Las secuencias del promotor para la secuencia de codificación de una proteína con "abundancia alta" significa en particular "promotores fuertes" . Si esto se intenta para emplear promotores múltiples para reforzar los genes, se da preferencia a combinar en una manera diferente tales promotores fuertes . Los promotores fuertes regulan la trascripción de genes tanto como para el último a ser más frecuentemente leído por la polimerasa de ARN como para la mayoría de los genes del organismo. En la mayoría de los casos, la presencia de un promotor fuerte resulta en una cantidad grande de transcripción que esta también presente en la célula. Cuando el porcentaje de dicha transcripción es más alta en comparación con la otra transcripción celular, ésta se refiere como una "transcripción abundante" . En la bacteria, la cantidad de transcripción y la cantidad de la proteína correspondiente codificada por medio de ésta usualmente se correlacionan, es decir, las "transcripciones abundantes" también resultan en "proteínas abundantes" la mayoría de las veces. Un método que permite identificar "promotores fuertes" vía la abundancia de las proteínas se describe más adelante a manera de ejemplo. Detalles del procedimiento metódico y referencias adicionales pueden encontrarse, por ejemplo, en Proteomics in Practice - A Laboratory Manual of Proteome Análisis (Autores: R. Westermeier, T. Naven; Publisher :Wiley-VCH Verlag GMBH, 2002) . Las células bacterianas se dividen y las proteínas del extracto celular se fraccionan por medio de electroforesis de gel 2D. Las proteínas se tiñen entonces por métodos comunes tales como, por ejemplo, teñido con tinta fluorescente o plata, Coomassie. El sobreteñido de la proteína se evita aquí para posibilitar que las manchas de la proteína individual se cuantifiquen después. Subsecuentemente, el gel se explora y la imagen obtenida se analiza con la ayuda de programas de computadora convenientes (por ejemplo, Melanie, de Amersham Biosciences) . Para este propósito, primero se identifican todas las manchas detectables y se determina el volumen de la mancha. La suma de todos los volúmenes de las manchas corresponde, en una primera aproximación, a la proteína total. Las manchas que tienen volúmenes de manchado particularmente grandes pueden entonces seleccionarse con la ayuda del programa de computadora de análisis de imagen. Por ejemplo, las manchas con volúmenes que ocupan más del 0.1% del volumen de manchado total puede ser referidas como abundantes .

Subsecuentemente, las manchas que contienen proteínas particularmente abundantes se extraen del gel. Normalmente, la proteína presente en la gel de sílice se digiere entonces de manera proteolitica (por ejemplo, con tripsina) y se determina la masa molar de los péptidos resultantes, por ejemplo con la ayuda de MALDI-ToF MS (Ionización de desorbción láser asistida por matriz - Espectrometría de masas de tiempo de vuelo) . Con base en la masa molar de algunos de los péptidos trípticos de la proteína, se puede entonces identificar la proteína correspondiente en los registros de las bases de datos. Esto es posible en particular sí el genoma del organismo a estudiarse ha sido secuenciado, como es el caso de la C. glutamicum, E. coli, y muchas otras bacterias. La ORF (estructura de lectura abierta) que codifica dicha proteína puede entonces determinarse con base en la identidad de dicha proteína. En las bacterias, los promotores que regulan dicho gen están usualmente localizados inmediatamente corriente arriba del codón de inicio. Por lo tanto, los promotores "fuertes" están frecuentemente también presentes en una región de aproximadamente 200 nucleótidos corriente arriba del codón de inicio de proteínas "abundantes" . Promotores "artificiales" para los propósitos de la invención comprenden en particular aquellas secuencias que no tienen actividad transcripcional in si tu y las cuales son transcripcionalmente activas en otro contexto de secuencia, tal como, en particular, en el contexto de una unidad de expresión o cásete de expresión de la invención. "Actividad del promotor" se refiere de acuerdo a la invención a la cantidad de ARN formado por el promotor en un tiempo particular, es decir, a la velocidad de transcripción.

Actividad del promotor "especifica" se refiere de acuerdo a la invención a la cantidad de ARN formado por el promotor en un tiempo particular, por cada promotor. En el caso de una actividad del promotor "provocada" o velocidad de transcripción con respecto a un gen, en comparación con el tipo nativo, así, en comparación con el tipo nativo, se provoca la formación de un ARN que no esta presente en esta forma en el tipo nativo. En el caso de una actividad del promotor "alterada" o velocidad de transcripción con respecto a un gen, en comparación con el tipo nativo, así, en comparación con el tipo nativo, se altera la cantidad de ARN formada en un tiempo particular. "Alterada" en relación a esto quiere decir preferiblemente incrementada o reducida. Un enlace "funcional" u "operativo" con relación a esto se refiere a, por ejemplo, el arreglo secuencial de cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención, los cuales tienen actividad de promotor y una secuencia de ácido nucleico a transcribirse y, sí es apropiado, elementos reguladores adicionales tales como, por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos las cuales aseguran la transcripción de los ácidos nucleicos, además de un terminador, por ejemplo, tantos como para cada uno de dichos elementos reguladores para ser capaces de cumplir su función en la transcripción de dicha secuencia de ácidos nucleicos. Esto no requiere necesariamente un enlace directo en el sentido químico. Secuencias de control genéticas tales como, por ejemplo, secuencias reforzadoras pueden ejercer su función en la secuencia objetivo también desde posiciones más distantes o aún desde otras moléculas de ADN. Se da preferencia a arreglos en los que la secuencia del ácido nucleico a transcribirse se posiciona detrás de la (es decir, en el extremo 3' de) la secuencia del promotor de la invención, de manera que las dos secuencias están conectadas de manera covalente una con otra. La distancia entre la secuencia del promotor y la secuencia del ácido nucleico a expresarse de manera transgénica es aquí preferiblemente de menos de 200 pares de bases, preferiblemente de manera particular de menos de 100 pares de bases, muy preferiblemente de manera particular de menos de 50 pares de bases. La secuencia de un "sitio de enlace ribosómico" o "sitio de enlace de ribosoma" (RBS) (o llamado como secuencia Shine- Dalgarno) de acuerdo con la presente invención se refiere a secuencias de polinucleótidos ricas en A/G que se hasta 30 bases corriente arriba del codón de inicio de traducción. "Transcripción" se refiere de acuerdo a la invención, al proceso al cual, iniciando desde un plantilla de ADN, produce una molécula de ARN complementaria. Este proceso involucra proteínas tales como la polimerasa de ARN, "factores sigma" y proteínas reguladoras transcripcionales. Entonces, el ARN sirve como plantilla en el proceso de traducción que resulta entonces en la proteína biosintéticamente activa. Una "región núcleo" de un promotor quiere decir de acuerdo a la invención, una secuencia de ácido nucleico contigua de desde aproximadamente 20 a 80, o 30 a 60, nucleótidos, la cual comprende al menos una "región -10" potencial. Aquí se describen ejemplos de regiones -10 potenciales para secuencias del promotor preferidas individuales: comparar la Figura 1 en particular. Las "regiones -10" también son llamadas como zonas TATA o secuencias Pribnow-Schaller . Cada promotor usado debe comprender al menos una de estas regiones -10 potenciales, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5. La región núcleo se localiza 5' corriente arriba del RBS y puede estar a una distancia de la última de desde 1 a 200 o 10 a 150 o 20 a 100 residuos de nucleótidos .

Una "unidad de expresión" se refiere, de acuerdo a la invención, a un ácido nucleico que tiene actividad de expresión, que comprende un promotor múltiple como se definió aquí y el cual, después de la unión funcional a un ácido nucleico o un gen a expresarse, regula la expresión, es decir, la transcripción o la traducción, de dicho ácido nucleico o dicho gen. En relación con esto, por lo tanto, dicha secuencia del ácido nucleico también es referida como una "secuencia de ácido nucleico reguladora" . Además de la estructura del promotor múltiple, pueden estar presentes otros elementos reguladores tales como, reforzadores, por ejemplo. Un "cásete de expresión" se refiere, de acuerdo a la invención, a una unidad de expresión que esta enlazada de manera funcional al ácido nucleico a expresarse o al gen a expresarse. En contraste a una unidad de expresión, un cásete de expresión comprende de esta manera no únicamente secuencias de ácidos nucleicos que regulan la transcripción y traducción sino también las secuencias de ácidos nucleicos las cuales se van a expresar como proteína como resultado de la transcripción y traducción. "Actividad de expresión" se refiere, de acuerdo a la invención, a la cantidad de proteína formada por el cásete de expresión o su unidad de expresión en un tiempo particular, es decir, la velocidad de expresión.

"Actividad de expresión especifica" se refiere de acuerdo a la invención a la cantidad de proteína formada por el cásete de expresión o su unidad de expresión en un tiempo particular, por cada unidad de expresión. En el caso de una "actividad de expresión provocada" o velocidad de expresión con respecto a un gen, en comparación con el tipo nativo, así, en comparación con el tipo nativo, se provoca la formación de una proteína que no ha estado presente en esta forma en el tipo nativo. En el caso de una actividad de expresión "alterada" o velocidad de expresión con respecto a un gen, en comparación con el tipo nativo, así que, en comparación con el tipo nativo, se altera la cantidad de proteína formada en un tiempo particular. Con relación a esto, "alterada" quiere decir preferiblemente incrementada o reducida. Esto puede tener lugar, por ejemplo, incrementando o reduciendo la actividad especifica de la unidad de expresión endógena, por ejemplo a manera de mutación o a manera de estimulación o inhibición. La actividad de expresión alterada o velocidad de expresión puede lograrse además, por ejemplo, mediante la regulación de la expresión de los genes en el microorganismo por unidades de expresión de la invención, siendo los genes heterólogos con respecto a las unidades de expresión.

La "velocidad de formación" a la cual se produce una proteína biosintéticamente activa es un producto de las velocidades de transcripción y traducción. Ambas velocidades pueden ser influenciadas de acuerdo a la invención y de esta manera influenciar la velocidad de formación de los productos/químicos finos en un microorganismo. El término "de tipo nativo" se refiere de acuerdo a la invención al microorganismo de inicio apropiado y no necesariamente necesita corresponder a un organismo que se encuentra de manera natural. Dependiendo del contexto, el término "microorganismo" puede referirse al microorganismo de inicio (de tipo nativo) o a un microorganismo genéticamente modificado de la invención o a ambos . Preferiblemente y en particular en casos donde no es posible designar al microorganismo o tipo nativo inequívocamente, "de tipo nativo" para alterar o provocar la actividad del promotor o la velocidad de trascripción, para alterar o provocar la actividad de expresión o la velocidad de expresión y para incrementar el contenido de producto biosintético en cada caso se refiere a un "organismo de referencia" . En una modalidad preferida, este "organismo de referencia" es Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 o un microorganismo derivado del ATCC 13032 por mutación específica o no específica. Se hace uso en particular de "microorganismos de inicio" los cuales son capaces ya de producir el producto deseado (químico fino/proteína) . Una secuencia "derivada", por ejemplo una secuencia del promotor derivada, se refiere de acuerdo a la invención, sí no se da otra información, a una secuencia cuya identidad con la secuencia de inicio es de al menos 80%, o al menos 90%, en particular 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99%. "Identidad" entre dos ácidos nucleicos, se refiere a la identidad de los nucleótidos sobre la longitud total del ácido nucleico en cada caso, en particular la identidad calculada por la comparación con la ayuda del programa de computadora Vector NTI Suite 7.1 de Informax (USA), aplicando en método Clustal (Higgins DG, Sharp PM. Fast and Sensitive múltiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Abril; 5(2):151-1), estableciendo los siguientes parámetros : Parámetro de alineamiento múltiple: Penalidad por abertura de posición de nucleótidos faltantes Penalidad por extensión de posición de nucleótidos faltantes Rango de penalidad por separación de posición de nucleótidos faltantes 8 Penalidad por separación de posición de nucleótidos faltantes inactivo % de identidad por retraso de alineamiento 40 Posiciones de nucleótidos faltantes específicos residuales inactivo Posición de nucleótidos faltantes del residuo hidrofílico inactivo Ponderación de transición 0 Parámetro de alineamiento en parejas: Algoritmo FAST activo Tamaño K-tupie 1 Penalidad por posición de nucleótidos faltantes 3 Tamaño de ventana 3 Número de diagonales buenas 5 "Hibridizar" se refiere a la capacidad de un poli- u oligonucleótido de enlazar bajo condiciones severas a una secuencia virtualmente complementaria, mientras que no se forman enlaces no específicos entre parejas no complementarias bajo estas condiciones. Para este propósito, las secuencias deben ser preferiblemente 90-100% complementarias. La propiedad de las secuencias complementarias de ser capaces de enlazar de manera específica uno a otra se utiliza, por ejemplo en la Técnica de Manchado Septentrional o meridional o para unión de cebador en PCR o RT-PCR. De acuerdo a la invención, la "hibridación" tiene lugar bajo condiciones severas. Las condiciones de la hibridación de este tipo se describen, por ejemplo, en Sambrook, J. , Fritsch, E.F., Maniatis, T., en: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, paginas 9.31-9.57 o en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N,Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Condiciones de hibridación severas quiere decir en particular: Incubación a 42 °C durante la noche en una solución que consiste de formamida al 50%, 5 x SSC (750 mM de NaCl , 75 mM de citrato de trisodio) , 50 mM de fosfato de sodio (pH de 7.6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 g/ml de ADN de esperma de salmón cizallado, desnaturalizado, seguido del lavado de los filtros con 0.1 x SSC a 65 °C. Un "fragmento funcionalmente equivalente" se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que tienen fragmentos de actividad del promotor las cuales tienen esencialmente la misma o una alterada actividad del promotor especifica, inferior o mayor que la secuencia de inicio. "Esencialmente idéntica" se refiere a una actividad del promotor especifica la cual tiene al menos 50%, tal como, por ejemplo, al menos 60%, 70%, 80%, 90%, o al menos 95% de la actividad del promotor específica de la secuencia de inicio.

II. Unidades de expresión, casetes de expresión y componentes de los mismos a) Unidades de expresión La presente invención se refiere, ínter alia, a proporcionar una unidad de expresión que comprende promotores múltiples, que comprende, en la dirección 5 '-3', un módulo de secuencia de la siguiente fórmula I : 5'-P?-(-A?-P?-)a-Ay-Py-3' donde n es un entero de 0 a 10, tal como por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6; Ax y Ay son idénticos o diferentes y son un enlace químico, covalente en particular, o una secuencia de ácido nucleico enlazador químicamente integrado, en particular integrado de manera covalente; Pi, Px y Py codifican secuencias del promotor idénticas o diferentes las cuales comprenden al menos una región de unión de la polimerasa de ARN tal como, por ejemplo, una región núcleo; y al menos, por ejemplo únicamente, Py comprende una sección de secuencia 3' terminal que media el enlace del ribosoma .

Las secuencias del promotor Pi, Px y Py pueden derivarse de genes de organismos, los cuales codifican proteínas involucradas en una trayectoria biosintética de dicho organismo. Las secuencias del promotor aquí, se colocan de 20 a 500 residuos de nucleótidos, o de 20 a 300 residuos de nucleótidos, por ejemplo de 20 a 210 residuos de nucleótidos y en particular de 20 a 100 o 35 a 100 residuos de nucleótidos, 5' corriente arriba de la secuencia de codificación de la proteína particular en el genoma de dicho organismo. Ejemplos de secuencias a partir de las cuales se pueden derivar las secuencias del promotor Pi, Px y Py son los genes enlistados en la Tabla 1 más adelante. Ejemplos no limitantes de secuencias del promotor especiales se derivan de las secuencias del ácido nucleico de acuerdo a la SEC ID NO:l, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3 y SEC ID NO: 4 y la Figura 1, sin que se limite a las mismas, sin embargo . Con relación a esto, la SEC ID NO : 1 corresponde a la secuencia situada corriente arriba de la región de codificación del GroES Chaperonin (pGRO) , la SEC ID NO : 2 corresponde a la secuencia situada corriente arriba de la región de codificación del factor TS de elongación de la proteína (pEFTs) , la SEC ID NO : 3 corresponde a la secuencia situada corriente arriba de la región de codificación del factor TU de elongación de la proteína (pEFTu) y la SEC ID NO: 4 corresponde a la secuencia situada corriente arriba de la región de codificación de la dismutasa de superóxido (pSOD) , en cada caso de Corynebacterium glutamicum. Las SEC ID N0:1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3 y SEC ID NO : 4 corresponden a las secuencias del promotor del tipo nativo. Una secuencia "derivada" se refiere de acuerdo a la invención a una secuencia la cual es al menos 80% o al menos 90%, tal como 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, y en particular 99%, idéntica a la secuencia de inicio. Este grado de identidad aplica en particular a la "región núcleo" anteriormente definida del promotor particular. El grado de identidad fuera de la región núcleo particular puede ser inferior aquí y puede estar en el rango de 0 a 80%, tal como, por ejemplo, 10 a 80%, 20 a 70%, 30 a 60%, o 40 a 50%. Regiones núcleo que se pueden utilizar se sitúan, por ejemplo: para pGRO en el rango de la posición 50 a 80 de la SEC ID NO : 1 ; para pEFTs en el rango de la posición 130 a 170 de la SEC ID NO : 2 ; para pEFTu en el rango de la posición 30 a 110 de la SEC ID NO : 3 ; para pSOD en el rango de la posición 50 a 100 de la SEC ID NO:4. Las unidades de expresión de la invención contienen en particular: dos o más secuencias de ácidos nucleicos que tienen actividad de promotor . a) preferiblemente derivada de secuencias idénticas o diferentes seleccionadas de entre la SEC ID. NO. 1, SEC ID. NO. 2, SEC ID. NO. 3, y SEC ID. NO. 4; u otras secuencias de promotor para genes con abundancia comparable o superior. b) con, sí es apropiado, una o más de dichas secuencias representando una secuencia derivada por sustitución, inserción, inversión o eliminación o adición de nucleótidos, secuencia la cual es, en particular en la región núcleo, al menos 80% idéntica en el nivel del ácido nucleico a una secuencia preferiblemente seleccionada de entre la SEC ID NO : 1 , 2, 3 o 4 u otras secuencias promotor para genes con abundancia comparable superior. c) o con, sí es apropiado, una o más de estas secuencias de ácidos nucleicos presentando hibridación bajo condiciones severas con una secuencia que es complementaria a una de las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo a la SEC ID N0:1, 2, 3 o 4 y/o a otras secuencias de promotor para genes con abundancia comparable o superior, d) o con, sí es apropiado, una o más de estas secuencias de ácidos nucleicos presentando "fragmentos funcionalmente equivalentes" de las secuencias bajo a) , b) o c) . Otros promotores los cuales se pueden utilizar como un componente de un promotor múltiple de la invención pueden fácilmente identificarse, por ejemplo, a partir de varios mecanismos cuya secuencia genómica es conocida, comparando las identidades de las secuencias de ácidos nucleicos de bases de datos con las secuencias SEC ID NO: 1, 2, 3 o 4 anteriormente descritas o de acuerdo a la Figura l o a otras secuencias de promotor para genes con abundancia comparable o superior. Otros promotores naturales convenientes pueden fácilmente identificarse a partir de varios microorganismos cuya secuencia genómica no se conoce, aplicando técnicas de hibridación conocidas per se, iniciando desde las secuencias de ácidos nucleicos anteriormente descritos, en particular iniciando desde la secuencia SEC ID NO: 1, 2, 3 o 4 y/o desde secuencias promotor para genes con abundancia comparable o superior. Otros promotores naturales convenientes pueden también aislarse por métodos conocidos por el trabajador experto, como están descritos en Cadenas et al (1991) Gene 98, 117-121; Eikmanns et al, (1991) Gene 102, 93-98.; Patek et al (1996) Microbiology 142, 1297-1309 o Santamaría et al (1987) Gene 56, 199-208. Esto usualmente involucra usar vectores de "sonda promotora" en los que se insertan fragmentos genómicos del genoma en cuestión. La actividad de promotor de un fragmento individual puede entonces determinarse en la estructuración experimental mencionada midiendo la actividad de un gen reportero corriente abajo, por ejemplo, la acetiltransferasa de cloramfenicol . Por lo tanto, la invención también comprende la combinación de aquellos promotores los cuales no se encuentran enlistados aquí por el nombre. Esto también aplica a la combinación de promotores individuales ya conocidos, como los descritos, por ejemplo, en Patek et al (2003) . J of Biotechnology 104, 311-323; Vasicova et al. (1999) J. Bacteriol 181, 6188-6191) . Por lo tanto, la invención también se refiere a ácidos nucleicos que tienen actividad de promotor por incorporación en una unidad de expresión que comprende promotores múltiples de la invención, dichos ácidos nucleicos que tienen actividad de promotor comprenden una secuencia de ácido nucleico que hibridiza con las secuencias de ácido nucleico SEC ID NO: 1, 2, 3 o 4 o con secuencias promotor para genes con abundancia comparable o superior bajo condiciones severas. Esta secuencia de ácido nucleico comprende al menos 10, preferiblemente más de 12, 15, 30 o 50 o más de 150 nucleótidos. Secuencias promotoras artificiales por incorporación en una unidad de expresión que comprende promotores múltiples de la invención pueden fácilmente prepararse iniciando desde la secuencia SEC ID NO: 1, 2, 3 o 4 o de acuerdo a la Figura 1 y/o las secuencias promotor para genes con abundancia comparable o superior por vía de variación artificial y mutación, por ejemplo mediante adición, sustitución, inserción, inversión o eliminación de uno o más residuos de nucleótidos individuales o contiguos. (Patek et al (2003) . J of Biotechnology 104, 311-323; Vasicova et al. (1999) J. bacterial 181, 6188-6191 y referencias mencionadas aquí). Ejemplos convenientes de secciones de secuencias 3'-terminal que media el enlace del ribosoma de una secuencia promotor Py son el RBS de pGRO: GGAGGGA; el RBS de pEFTs : AGGAGGA; el RBS de pPFTu: AGGAGGA; y el RBS de pSOD : GGAGGGA (cf . también Figura 1, adjunta) . El RBS teóricamente óptimo, es decir, la secuencia la cual es 100% complementaria a la secuencia anti-Shine-Dalgarno en el ARNr 16S de C. glutamicum, es 5' GAAAGGAGG 3'. Otras secciones de secuencias del RBS convenientes pueden fácilmente identificarse, por ejemplo, mediante variación artificial y mutación, por ejemplo mediante sustitución, inserción, inversión, adición o eliminación de nucleótidos o vía comparaciones homologa con secuencias promotor en bases de datos . Ejemplos no limitantes de unidades de expresión que comprenden promotores múltiples de la invención se seleccionan de entre : e) secuencias que codifican PeftuPsod, de posición 18 a 390 en la SEC ID NO: 45; Psodpeftu, de posición 18 a 395 en la SEC ID NO: 52; PgroPsod, de posición 18 a 369 en la SEC ID NO: 55; PgroPsodPefts, de posición 11 a 538 en la SEC ID NO: 59; PeftuPsodPefts; de posición 11 a 559 en la SEC ID NO: 60; o f) secuencias que se derivan de secuencias de acuerdo a e) mediante sustitución, inserción, inversión, adición, o eliminación de nucleótidos y que, en comparación con dicha secuencia de inicio, son al menos 80% o al menos 90% idénticas al nivel del ácido nucleico; o g) secuencias de ácidos nucleicos que hibridizan con una secuencia complementaria a e) bajo condiciones severas; o h) "fragmentos funcionalmente equivalentes" de las secuencias anteriormente mencionadas en e) , f) y g) . Un "fragmento funcionalmente equivalente", en particular de acuerdo a las modalidades d) y h) se refiere a, fragmentos de unidades de expresión, los cuales tienen esencialmente la misma o una actividad de expresión especifica superior como/que la secuencia de inicio. "Esencialmente idéntica" se refiere a una actividad de expresión específica que tiene al menos 50%, preferiblemente 60%, más preferiblemente 70%, más preferiblemente 80%, más preferiblemente 90%, particularmente de manera preferible 95%, de la actividad de expresión especifica de la secuencia de inicio . "Fragmentos" se refiere a secuencias parciales de las secuencias descritas por la modalidad a) a h) . Dichos fragmentos tienen preferiblemente más de 10, pero preferiblemente más de 12, 15, 30, 50, o particularmente de manera preferible más de 150 nucleótidos contiguos de la secuencia de inicio. Las unidades de expresión de la invención pueden preferiblemente comprender uno o más de los siguientes elementos genéticos: una región -10, un inicio de transcripción, una región de reforzador y una región de operador. Estos elementos genéticos son preferiblemente específicos para las especies corinebacteria, especialmente para Corynebacterium glutamicum. Los promotores bacterianos normalmente consisten de tres sitios de reconocimiento de la polimerasa de ARN, principalmente la región -10, la región -35 y el elemento UP. Estos elementos promotores son altamente conservados en E.coli pero no en C. glutamicum. Esto aplica especialmente a la región -35. El último puede por lo tanto, derivarse de la secuencia únicamente en ocasiones no confiables, si es que se deriva. La región -10, así mismo, es altamente menos conservada que en organismos que comprenden genomas ricos en AT. Secuencias de acuerdo general las cuales se han descrito previamente aquí, son TGNGNTA (C/T) AATGG y GNTANAATNG (Patek et al (2003), J. of Biotechnology 104, 311-323; Vasicova et al. (1999) J. Bacterial 181, 6188-6191) . Es bien conocido que una alta variabilidad generalmente ocurre en las secuencias de acuerdo general de bacterias que tienen un contenido de GC moderado o alto (tal como, por ejemplo, C. Glutamicum) (Bourn and Babb, 1995., Bashyam et al, 1996) . Esto aplica en particular a la región -35 la cual por lo tanto frecuentemente no puede ser pronosticada. b) Casetes de expresión La invención se refiere además a las unidades de expresión que comprenden promotores múltiples de la invención, enlazadas de manera funcional a una secuencia de ácido nucleico que se puede traducir. Estas estructuras que son capaces de expresar genes son, para los propósitos de la invención, también llamadas como casetes de expresión.

Un "enlace funcional" quiere decir con relación a esto, por ejemplo, el arreglo secuencial de cualquiera de las unidades de expresión de la invención y una secuencia de ácido nucleico a expresarse de manera transgénica y, sí es apropiado, a otros elementos reguladores tal como un terminador, por ejemplo, a fin de que cada uno de dichos elementos reguladores sea capaz de cumplir una función en la expresión transgénica de dicha secuencia del ácido nucleico. Esto no requiere necesariamente un enlace directo en el sentido químico. Las secuencias de control genético tales como, por ejemplo, secuencias reforzadoras pueden ejercer su función en la secuencia objetivo también desde posiciones más distantes o aún desde otras moléculas de DNA. Se da preferencia a arreglos en los cuales la secuencia de ácido nucleico a expresarse de manera transgénica se posiciona detrás de (es decir, en el extremo 3' de) la secuencia de la unidad de expresión de la invención, de manera que las dos secuencias se conectan de manera covalente una con otra. La distancia entre la secuencia de la unidad de expresión y la secuencia del ácido nucleico a expresarse de manera transgénica es aquí preferiblemente de menos de 200 pares de base, preferiblemente de manera particular de menos de 100 pares de base, preferiblemente de manera muy particular de menos de 50 pares de base.

Los casetes de expresión que comprenden promotores múltiples de la invención hacen posible lograr una actividad de expresión que es diferente en comparación con la actividad de expresión original y de esta manera regulan de manera fina la expresión del gen deseado. La regulación de la expresión del gen en el microorganismo por las unidades de expresión de la invención se logra preferiblemente introduciendo una o más unidades de expresión de la invención, sí es apropiado con actividad de expresión alterada, en el genoma del microorganismo de manera que uno o más genes endógenos se expresan bajo el control de las unidades de expresión introducidas de la invención; o introduciendo una o más estructuras de ácidos nucleicos comprendiendo una unidad de expresión de la invención, sí es apropiado con actividad de expresión específica alterada, y, enlazadas de manera funcional, uno o más ácidos nucleicos a expresarse, es decir, un cásete de expresión en el microorganismo. En los casetes de expresión de la invención, la posición física de la unidad de expresión con relación al gen a ser expresado se elige de modo que para dicha unidad de expresión regule la transcripción, y preferiblemente también la traducción, del gen a expresarse y de esta manera posibilitar la formación de una o más proteínas. "Posibilitar la formación" aquí incluye incrementar de manera constitutiva dicha formación, atenuar o bloquear dicha formación bajo condiciones especificas y/o incrementar dicha formación bajo condiciones especificas. Las "condiciones" comprenden aquí, (1) agregar un componente al medio de cultivo, (2) retirar un componente del medio de cultivo, (3) remplazar un componente en el medio de cultivo con un segundo componente, (4) incrementar la temperatura del medio de cultivo, (5) reducir la temperatura del medio de cultivo y (6) regular las condiciones atmosféricas tales como, por ejemplo, la concentración de oxígeno o la concentración de nitrógeno, en la que se mantiene el medio de cultivo. c) Información general: Todos los ácido nucleicos anteriormente mencionados que tienen actividad de promotor y unidades de expresión y casetes de expresión pueden prepararse además en una manera conocida per se, mediante síntesis química de los bloques de construcción de nucleótidos, por ejemplo mediante condensación fragmentada de los bloques de construcción de ácidos nucleicos complementarios superpuestos individuales de la doble hélice. La síntesis química de los oligonucleótidos puede llevarse a cabo, por ejemplo, en una manera conocida per se, usando el método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2a Edición, Wiley Press New Cork, pp . 896-897) . El montaje de los oligonucleótidos y el relleno de huecos con la ayuda del fragmento Klenow de la polimerasa de ADN y las reacciones de ligación y además, los procesos de clonación generales se describen en Sambrook et al, (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Los métodos y técnicas utilizadas por las presentes invenciones son conocidos por el trabajador experto adiestrado en las técnicas de ADN microbiológico y recombinante. Los métodos y técnicas para el crecimiento de células bacterianas, el transporte de moléculas de ADN aislado en la célula huésped y el asilamiento, clonación y secuenciación de moléculas de ácidos nucleicos aislados, etc., son ejemplos de tales técnicas y métodos . Estos métodos se describen en muchos artículos de la literatura estándar: Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) ; J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Cork (1972) ; J. H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1992) ; M. Singer and P. Berg, Genes & Genomes, University Science Books, Mili Valley, California (1991); J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) ; P.B. Kaufmann et al., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Ratón, Florida (1995) ; Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B.R. Glick and J.E. Thompson, eds., CRC Press, Boca Ratón, Florida (1993); y P.F. S ith-Keary, Molecular Genetics of Escherichia coli, The Guilford Press, New York, NY (1989) . Todas las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención están preferiblemente en la forma de una molécula de ácido nucleico aislado. Una molécula de ácido nucleico "aislada" se retira de otras moléculas de ácidos nucleicos presentes en la fuente natural de dicho ácido nucleico y puede adicionalmente ser esencialmente libre de otra matera celular o medio de cultivo si se prepara por técnicas recombinantes, o libre de precursores químicos u otros químicos, si se sintetiza químicamente. La invención comprende además las moléculas de ácidos nucleicos complementarias a las secuencias de nucleótidos específicamente descritos, o una sección de los mismos. Las secuencias de nucleótidos de la invención también permiten que se generen las sondas y los cebadores, las cuales pueden utilizarse para identificar y/o clonar secuencias homologas en otros tipos de células y microorganismos. Las sondas y los cebadores de esta clase usualmente comprenden una región de la secuencia de nucleótido la cual, bajo condiciones severas, hibridiza a al menos aproximadamente 12, preferiblemente al menos aproximadamente 25, tal como, por ejemplo, aproximadamente 40, 50 o 75, nucleótidos continuos de una hebra de sentido de una secuencia de ácido nucleico de la invención o de una hebra de antisentido correspondiente. La invención también comprende aquellas secuencias de ácidos nucleicos que comprenden "mutaciones silenciosas" o las cuales han sido alteradas en comparación con una secuencia específicamente mencionada de acuerdo al uso de codón de una fuente especial u organismo huésped, además de variantes que ocurren de manera natural, por ejemplo variantes de empalme o variantes alélicas, de las mismas. III. Vectores de expresión La invención también se refiere a vectores de expresión que comprenden un cásete de expresión anteriormente descrito de la invención. Los vectores son bien conocidos por el trabajador experto y pueden encontrarse, por ejemplo, en "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., eds., Elsevier, Ámsterdam-New Cork-Oxford, 1985) . Aparte de los plásmidos, vectores también se refiere a cualesquier otros vectores conocido por el trabajador experto, tal como, por ejemplo, fagos, transposones, elementos IS, plásmidos, cósmidos, y ADN lineal o circular. Dichos vectores pueden replicarse de manera autónoma en el organismo huésped o pueden replicarse cromosómicamente . Plásmidos preferidos son preferiblemente de manera particular aquellos que se replican en bacterias corineformes . Numerosos vectores de plásmidos conocidos tales como, por ejemplo, el pZl (Menkel et al., Applied and Enviromental Microbiology (1989) 64: 549-554), el pEKExl (Eikmanns et al., Gene 102: 93:98 (1991)) o el pHS2-l (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991) ) se basan en los plásmidos crípticos pHM1519, pBLl o pGAl . Otros vectores de plásmidos tales como, por ejemplo, el pCLiK5MCS (vea Ejemplo 1) o aquellos basados en el pCG4 (US-A 4,489,160) o pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)) o el pAGl (US-A 5,158,891) pueden utilizarse en la misma forma. Además, también son convenientes aquellos vectores de plásmidos con la ayuda de los cuales puede aplicarse el proceso de amplificación del gen mediante integración en el cromosoma, como se ha descrito, por ejemplo, por Remscheid et al. (Applied and Enviromental Microbiology 60, 126-132 (1994)) para la duplicación y amplificación del operon hom-thrB. En este método, se clona el gen completo en un vector de plásmido que puede replicarse en un huésped (típicamente E. coli) pero no en C. glutamicum. Ejemplos de vectores convenientes son el pSUP301 (Sirnon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), el pKldmob o pK19mob (Sch fer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), BeARNrd et al., JouARNl of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), el pEMl (Schrumpf et al., 1991, JouARNl of Bacteriologyl73 : 4510-4516) o el pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342) . El vector de plásmido que contiene el gen a amplificarse se transfiere subsecuentemente por transformación en la cepa de C. glutamicum deseada. Los métodos de transformación se describen, por ejemplo, en Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1998)), Dunican and Shivnan (Biotechnology 7, 1067-1070 (1989)) y Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994) ) . IV. - Genes y proteínas codificadas por los mismos La velocidad de transcripción y/o la velocidad de traducción de genes en microorganismos, en comparación con el tipo nativo pueden alterarse " o provocarse regulando la transcripción de genes en dicho microorganismo mediante unidades de expresión de la invención, dichos genes son heterólogos con respecto a dichas unidades de expresión. Esto preferiblemente se logra introduciendo uno o más ácidos nucleicos de la invención que tienen actividad de promotor en el genoma del microorganismo de manera que uno o más genes endógenos se transcriben bajo el control de dicho ácido nucleico que tiene actividad de promotor, sí es apropiado que tiene una actividad de promotor especifica alterada, o introduciendo una o más estructuras o constructos de ácidos nucleicos que contienen un ácido nucleico de la invención que tiene actividad de promotor y, que esta funcionalmente enlazada a, uno o más ácidos nucleicos exogenos endógenos a transcribirse, en el microorganismo . Sí uno o más genes se introducen en el genoma de un microorganismo de manera que uno o más genes introducidos se transcriben bajo el control de los ácidos nucleicos de la invención, la inserción puede tener lugar para que el gen o los genes se integren en las regiones de codificación o de no codificación. La inserción preferiblemente tiene lugar en las regiones de no codificación. Con respecto a esto, las estructuras de ácidos nucleicos pueden insertarse de manera cromosómica o de manera extracromosómica . Las estructuras de ácidos nucleicos se insertan preferiblemente de manera cromosómica. Una integración "cromosómica" es la inserción de un fragmento de /ADN en el cromosoma de una célula huésped.

"Endógeno" se refiere a la información genética tal como, por ejemplo, la cual ya esta presente en el genoma del tipo nativo (como se definió anteriormente) . "Exógeno" se refiere a la información genética tal como, por ejemplo, a genes, los cuales no están presentes en el genoma de tipo nativo. Sí la información genética exógena, por ejemplo la unidades de expresión gue comprenden promotores múltiples de la invención, se introduce en el genoma de una cepa de tipo nativo, generando por medio de esto una cepa genéticamente modificada, entonces esta información genética es endógena en una comparación de la cepa genética inicialmente generada con su descendencia, pero exógena en una comparación con la cepa de tipo nativo original la cual no comprende dicha información genética. El termino "genes" con respecto a la regulación de la transcripción por los ácidos nucleicos de la invención que tienen actividad de promotor se refiere preferiblemente a los ácidos nucleicos que comprenden una región a transcribirse, es decir, por ejemplo, una región que regula la traducción, una región de codificación y sí es apropiado, otros elementos reguladores tales como, por ejemplo, un terminador. El termino "genes" con respecto a la regulación de expresión mediante las unidades de expresión de la invención se refiere preferiblemente a ácidos nucleicos que comprenden una región de codificación y, sí es apropiado, otros elementos reguladores tales como, por ejemplo, un terminador. Una "región de codificación" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína. "Heterologos" con respecto a ácidos nucleicos que tienen actividad de promotor y a genes, se refiere a que los genes usados no se transcriben en el tipo nativo con regulación de los ácidos nucleicos de la invención que tienen actividad de promotor, sino que se produce un nuevo enlace funcional el cual no se encuentra presente en el tipo nativo, y la combinación funcional de ácido nucleico de la invención que tiene actividad de promotor y el gene especifico no ocurre en el tipo nativo. "Heterologos" con respecto a unidades de expresión y a genes se refiere a que los genes usados no se expresan en el tipo nativo con regulación de las unidades de expresión de la invención, sino que se produce un nuevo enlace funcional el cual no ocurre en el tipo nativo, y la combinación funcional de la unidad de expresión de la invención y el gen especifico no ocurren en el tipo nativo. En una modalidad preferida del proceso de la invención anteriormente descrito para alterar o provocar la velocidad de transcripción y/o la velocidad de expresión de genes en microorganismos, los genes se seleccionan del grupo que consiste de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de químicos finos, siendo posible para dichos genes contener otros elementos reguladores, sí es apropiado . En una modalidad particularmente preferida de los procesos de la invención anteriormente descritos para alterar o provocar la velocidad de transcripción y/o la velocidad de expresión de genes en microorganismos, los genes se seleccionan de entre: ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de aminoácidos proteinogénicos y no proteinogenicos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de nucleótidos y nucleósidos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de lípidos y ácidos grasos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de dioles, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de carbohidratos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de compuestos aromáticos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de vitaminas, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de cofactores y ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de enzimas, ácidos nucleicos que codifican una proteína del metabolismo central, siendo posible para los genes contener otros elementos reguladores, sí es apropiado. En una modalidad particularmente preferida, las proteínas se seleccionan de la trayectoria biosintética de aminoácidos, a saber: aspartato cinasa, aspartato semialdehido deshidrogenasa, diaminopimelato deshidrogenasa, diaminopimelato decarboxilasa, dihidropicolinato sintetasa, dihidropicolinato reductasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, 3-fosfoglicerato cinasa, piruvato carboxilasa, triosefosfato isomerasa, regulador LuxR transcripcional, regulador LysRl transcripcional, regulador LysR2 transcripcional, malato-quinona oxidoreductasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, 6-fosfogluconato deshidrogenasa, transcetolasa, transaldolasa, homoserina O-acetiltransferasa, cistationina gama-sintasa, cistationina beta-liasa, serina hidroximetiltransferasa, 0-acetilhomoserina sulfhidrilasa, metilenotetrahidrofolato reductasa, fosfoserina aminotransferasa, fosfoserina fosfatasa, serina acetiltransferasa, homoserina deshidrogenasa, homoserina cinasa, treonina sintasa, portador exportador de treonina, treonina deshidratasa, piruvato oxidasa, exportador de lisina, biotin ligasa, cisteína sintasa I, cisteína sintasa II, metionina sintasa dependiente de la coenzima B-12, actividad de la metionina sintasa independiente de la coenzima B-12, subunidades 1 y 2 de sulfato adenililtransferasa, fosfoadenosina fosfosulfato reductasa, ferredoxin sulfito reductasa, ferredoxin NADP reductasa, 3-fosfoglicerato deshidrogenasa, regulador RXA00655, regulador RXN2910, arginil-ARNt sintetasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, proteína de emisión de treonina, serina hidroximetiltransferasa, fructosa 1 , 6-bifosfatasa, proteína de reducción de sulfato RXA077, proteína de reducción de sulfato RXA248, proteína de reducción de sulfato RXAA247, proteína OpcA, 1-fosfofructocinasa, 6-fosfofructocinasa, tetrahidropicolinato succinilasa, succinil aminoceptopimelato aminotransferasa, succinil diaminopimelato desuccinilasa, diaminopimelato epimerasa, 6-fosfogluconato deshidrogenasa, glucosa-fosfato isomerosa, fosfoglicerato mutasa, enolasa, piruvato cinasa, aspartato transaminasa, y enzima de malato. Proteínas preferidas y ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas son secuencias de proteínas y, respectivamente, secuencias de ácidos nucleicos de origen microbiano, preferiblemente de las bacterias del genero Corynebacterium o Brevibacterium, preferiblemente de bacterias corineformes, particularmente preferibles de Corynebacterium glutamicum.

Ejemplos de secuencias de proteínas particularmente preferidas y de secuencias de ácidos nucleicos correspondientes que codifican dichas proteínas de la trayectoria biosintética de aminoácidos, el documento que refiere a estas, y la designación de las mismas en el documento de la referencia se enlistan en la tabla 1: Tabla 1 Serina hidroximetil glyA O ADN: 143 transferasa 0100843 Prot. : 144 Proteína en RXA247 EP ADN: 3089 reducción de sulfato 1108790 Prot. : 6589 Protema en RXA248 EP ADN: 3090 reducción de sulfato 1108790 Prot: 6590 Subunidad 1 de CysN EP ADN; 3092 sulfato de 1108790 Proí . :6592 adenililtransferasa Subunidad 2 de CysD EP ADN: 3093 sulfato de 1108790 Prot. : 6593 adenililtransferasa Fosfoadenosina CysH WO ADN: 7 Prot fosfosulfato 02729029 reductasa Ferredoxin sulfito RXA073 O ADN: 329 reductasa 0100842 Prot. : 330 Ferredoxin NADP RXA076 WO ADN: 79 reductasa 0100843 Prot. : 80 Regulador LuxR luxR WO ADN: 297 transcripcional 0100842 Proteína: 298 Regulador LysRl lysRl EP ADN: 676 Proteína: 4 transcripcional 1108790 176 Se da preferencia a seleccionar el gen G objetivo a regular según la invención de los genes enlistados arriba. Otras secuencias de proteínas particularmente preferidas de la trayectoria biosinética de los aminoácidos tienen en cada caso la secuencia del aminoácido indicada en la tabla 1 para esta proteína, donde la proteína respectiva tiene, en al menos una de las posiciones del aminoácido indicada en la tabla 2, columna 2 para esta secuencia del aminoácido, un aminoácido proteinogénico diferente del aminoácido indicado en la tabla 2, columna 3 en la misma línea. En una modalidad preferida las proteínas tienen, en al menos una de las posiciones del aminoácido indicadas en la tabla 2, columna 2 para la secuencia del aminoácido, el aminoácido indicado en la tabla 2, columna 4 en la misma línea. Las proteínas indicadas en la tabla 2 son proteínas mutadas de la trayectoria biosintética de los aminoácidos, que tienen propiedades particularmente ventajosas y son por lo tanto particularmente convenientes para expresar los ácidos nucleicos correspondientes a través de una estructura promotor de la invención y para la producción de aminoácidos. Por ejemplo, la mutación T3111 conduce a la inhibición de la retroalimentación de lo que se pide sea inactivado. Los ácidos nucleicos correspondientes que codifican una proteína mutada descrita arriba de la tabla 2, se puede preparar por métodos convencionales. Un punto de partida conveniente para preparar las secuencias del ácido nucleico que codifican una proteína mutada es, por ejemplo, el genoma de una cepa de Corynebacterium glutamicum la cual se puede obtener de la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC) bajo la designación ATCC 13032, o de las secuencias del ácido nucleico mencionadas en la Tabla 1. Para la retro-traducción de la secuencia del aminoácido de las proteínas mutadas en las secuencias del ácido nucleico que codifican estas proteínas, es ventajoso utilizar el tratamiento con codón del organismo en el cual se introducirá la secuencia del ácido nucleico o en el cual esta presente la secuencia del ácido nucleico. Por ejemplo, es ventajoso utilizar el tratamiento con codón de Corynebacterium glutamicum para Corynebacterium glutamicum. El tratamiento con codón del organismo particular se puede comprobar de una forma conocida per se a partir de bases de datos o de solicitudes de patente que describen al menos una proteína y un gene el cual codifica esta proteína desde el organismo deseado. La información en la Tabla 2 debe entenderse de la siguiente manera: En la columna 1 "identificación" se indica una designación inequívoca para cada secuencia en relación a la Tabla 1. En la columna 2 "AA-POS", el número respectivo se refiere a la posición del aminoácido de la secuencia del polipéptido correspondiente de la tabla 1. Un "26", en la columna "AA-POS" significa por consiguiente la posición 26 del aminoácido de la secuencia del polipéptido correspondientemente indicada. La numeración de la posición empieza en +1 en el término N. En la columna 3 "tipo nativo AA" la letra respectiva señala el aminoácido -representado en código de una letra- en la posición indicada en la columna 2, en la cepa de tipo nativo correspondiente de la secuencia de la tabla 1. En la columna 4 "mutante AA" , la letra respectiva señala el aminoácido - representado en código de una letra - en la posición indicada en la columna 2, en la cepa mutante correspondiente . En la columna 5 "función" se indica la función fisiológica de la secuencia del polipéptido correspondiente. Para una proteína mutada con una función particular (columna 5) y una secuencia del aminoácido inicial particular (tabla 1), las columnas 2, 3 y 4 describen al menos una mutación, y una pluralidad de mutaciones para algunas secuencias. Esta pluralidad de mutaciones refiere siempre a la secuencia del aminoácido inicial más cercana anterior en cada caso (tabla 1) . El término "al menos una de las posiciones del aminoácido" de una secuencia del aminoácido particular significa preferiblemente al menos una de las mutaciones descritas para esta secuencia del aminoácido en las columnas 2, 3 y 4. Código de una letra para aminoácidos proteinogénicos: A alanina I isoleucina Q glutamina C cisteina K li s ina R arginina D aspartato L leucina S serina E glutamato M metionina T t reonina F fenilalanina N asparagina V valina G glicina P prol ina W triptofan H histidina Y tiros ina Tabla 2 Microorganismos genéticamente modificados Las unidades de expresión de la de la invención, los genes anteriormente descritos y las estructuras del ácido nucleico o los casetes de expresión anteriormente descritos se introducen en el microorganismo, en particular en la bacteria corineforme, por métodos conocidos por el trabajador experto, tal como la conjugación o electroporación (por ejemplo, Liebl et al (1989) FEMS Microbiology Letters 53, 299-303) . Los casetes de expresión integrados se seleccionan preferiblemente por el método SacB. El método SacB es conocido por el trabajador experto y se describe, por ejemplo, en Scháfer A, Tauch A. Jáger W, Kalinowski J, Thierbach G, Pühler A. ; Small mobilizable rnulti -purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum, Gene. 1994 Jul 22 : 145 (1) ; 69-73 and Blomfield IC, Vaughn V, Rest RF, Eisenstein Bl . ; Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSClOl replicón; Mol Microbiol. 1991 Jun; 5 (6) :1447-57. De acuerdo a la invención, se da preferencia a usar como microorganismos de inicio aquellos producen ya el producto variable deseado (químico fino/proteína) . La invención por lo tanto también se relaciona a un microorganismo genéticamente modificado el cual comprende un cásete de expresión de la invención o de un vector que comprende el cásete de expresión de la invención. La presente invención se relaciona particularmente de manera preferible a microorganismos genéticamente modificados, en particular bacterias corineformes, las cuales comprenden un vector, en particular un vector bifuncional o vector de plásmido, las cuales portan al menos un cásete de expresión de la invención. Microorganismos preferidos o microorganismos genéticamente modificados son las bacterias, algas, hongos o levaduras. Microorganismos particularmente preferidos son, particularmente, las bacterias corineformes . Bacterias corinoformes preferidas son bacterias del género Corynebacterium, particularmente de las especies Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium termoaminogenes , Corynebacterium melassecola y Corynebacterium efficiens o del género Brevibacterium, particularmente de las especies Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum y Brevibacterium divaricatum. Bacterias particularmente preferidas de los géneros Corynebacterium y Brevibacterium se seleccionan del grupo que consiste de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium efficiens DSM 44547, Corynebacterium efficiens DSM 44548. Corynebacterium efficiens DSM 44549, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, Corynebacterium glutamicum KFCC10065 y Corynebacterium glutamicum ATCC 21608 y también cepas derivadas de las mismas, por ejemplo por mutación clásica y selección o por mutación dirigida. La abreviación KFCC se refiere a la Federación Coreana de Colección de Cultivos, la abreviación ATCC se refiere a la Colección de Cultivos Tipo Americano, y la abreviación DSM (o DSMZ) se refiere a la Colección Alemana de Microorganismos (Deutsche Sammiung von Mikroorganismen and Zellkulturen) . Bacterias particularmente preferidas adicionales del género Corynebacterium y Brevibacterium se enlistan en la tabla 3 : Tabla 3 Las abreviaturas tienen el siguiente significado: ATCC: American Type Culture Collection, Rockwille, MD, EUA FERM: Fermentation Research Institute, Chiba, Japón NRRL: ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, Peoría, IL, EUA CECT: Colección Española de Cultivos Tipo, Valencia, España NCIMB: National Collection of industrial and Marine Bacteria Ltd. , Aberdeen, UK CBS; Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, NL NCTC: National Collection of Type Cultures, London, UK DSMZ: Deutsche Sammiung von Mikroorganismen and Zellkulturen, Braunschweig, Alemania. Aquí se da preferencia particular a los microorganismos de las bacterias del género Corynebacterium, en particular aquellas que ya son capaces de producir L-lisina, L-metionina y/o L-treonina. Estas son particularmente corine-bacterias en las que, por ejemplo, el gen que codifica una aspartato cinasa (gen ask) se desreguló o se ha eliminado o reducido la inhibición de retroalimentación. Por ejemplo, tal bacteria tiene una mutación en el gen ask, lo cual da lugar a una reducción o a una eliminación de la inhibición de retroalimentación tal como, por ejemplo, la mutación T3111. Las unidades de expresión de la invención permiten regular las trayectorias metabólicas a productos biosintéticos específicos en los microorganismos genéticamente modificados anteriormente descritos de la invención. Para este propósito, por ejemplo, las trayectorias metabólicas que resultan en un producto biosintético específico se mejoran provocando o aumentando la velocidad de transcripción o la velocidad de expresión de los genes de esta trayectoria biosintética en la que la cantidad creciente de proteína resulta en una actividad total incrementada de estas proteínas de la trayectoria biosintética deseada y así en un flujo metabólico mejorado hacia el producto biosintético deseado . Además, las trayectorias metabólicas que divergen de un producto biosintético específico pueden ser atenuadas reduciendo la velocidad de transcripción o la velocidad de expresión de genes de esta trayectoria biosintética divergente en la que la cantidad reducida de proteína resulta en una actividad total reducida de estas proteínas de la trayectoria biosintética no deseada y así adicíonalmente en un flujo metabólico mejorado hacia el producto biosintético deseado. Los microorganismos genéticamente modificados de la invención son capaces, por ejemplo, de producir productos biosintéticos a partir de glucosa, sucrosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón, celulosa o de glicerol y de etanol.

La invención, por lo tanto, se relaciona con un proceso para producir productos biosintéticos cultivando microorganismos genéticamente modificados de la invención. Dependiendo del producto biosintético deseado, la velocidad de transcripción o la velocidad de expresión de varios genes debe aumentarse o reducirse. Es generalmente ventajoso alterar la velocidad de transcripción o la velocidad de expresión de una pluralidad de genes, es decir, aumentar la velocidad de transcripción o la velocidad de expresión de una combinación de genes y/o reducir la velocidad de transcripción o la velocidad de expresión de una combinación de genes. En los microorganismos genéticamente modificados de la invención, al menos una alterada, es decir, velocidad de transcripción o velocidad de expresión incrementada o reducida, de un gen se puede atribuir a un ácido nucleico de la invención que tiene actividad de promotor o a una unidad de expresión de la invención. Además, adicionalmente alterada, es decir, las velocidades de transcripción o las velocidades de expresión adicionalmente aumentadas o adicionalmente reducidas, de otros genes en el microorganismo genéticamente modificado puede, pero no necesariamente, derivar de ácidos nucleicos de la invención que tienen actividad de promotor o de las unidades de expresión de la invención.

La invención, por lo tanto, se relaciona además a un proceso para producir productos biosintéticos cultivando microorganismos genéticamente modificados de la invención. V. Campos del aplicación de la invención Las unidades de expresión que comprenden promotores múltiples, los casetes de expresión y los vectores de la invención pueden, por ejemplo utilizarse particularmente de manera ventajosa en procesos mejorados para la producción por fermentación de productos biosintéticos como se describe más adelante. Las unidades de expresión que comprenden promotores múltiples de la invención o los casetes de expresión que los comprenden, tienen la ventaja particular de permitir una modulación de la expresión del gen estructural enlazado funcionalmente. Las unidades de expresión de la invención o casetes de expresión que los comprenden se pueden utilizar para alterar, es decir, aumentar o reducir, o para provocar la velocidad de expresión de genes en microorganismos, en comparación con los de tipo nativo. Esto proporciona la posibilidad, en el caso de un aumento en la velocidad de expresión, de maximizar la expresión del gene en cuestión. Eligiendo una unidad de expresión conveniente, sin embargo, la expresión puede estar también en una fuerza la cual esta por debajo de la máxima obtenible por una unidad de expresión diferente, pero la cual al mismo tiempo libera el producto de expresión en una cantidad más compatible para el microorganismo de expresión. Esto es particularmente ventajoso si las concentraciones del producto de expresión las cuales son demasiado altas son tóxicas para el microorganismo de expresión. A manera de selección de entre unidades de expresión con fuerza diferente de expresión en cada caso, las unidades de expresión de la invención permiten así a la expresión regularse a un valor óptimo, particularmente para la expresión a largo plazo. Las unidades de expresión de la invención o los casetes de expresión que comprenden dichas unidades de expresión pueden también utilizarse para regular y mejorar la formación de varios productos biosintéticos tales como, por ejemplo, químicos finos, proteínas, particularmente aminoácidos, en microorganismos, particularmente en la especie Corynebacterium. La invención por lo tanto se relaciona al uso de una unidad de expresión que comprende promotores múltiples para regular una biosíntesis de producto. Aquí, el gen de una proteína implicada en la regulación de una biosíntesis de producto se pone bajo control de una unidad de expresión tal. Dicha biosíntesis de producto se influencia dependiendo de la velocidad de transcripción de la unidad de expresión seleccionada que comprende promotores múltiples. Alternativamente, el gen de una proteína implicada en la regulación de una biosíntesis de producto se puede expresar como componente de un cásete de expresión de la invención en un microorganismo y dicha biosíntesis de producto se puede regular por la proteína expresada de tal modo. Sí la actividad de un promotor múltiple es más débil que aquella del promotor endógeno, puede emplearse también un promotor múltiple para atenuar las trayectorias biosintéticas específicamente no deseadas. La velocidad de transcripción de una unidad de expresión que comprende promotores múltiples de la invención se puede además regular por mutación específica de unos o más promotores individuales los cuales constituyen dicho promotor múltiple. Una actividad de promotor creciente o reducida puede lograrse substituyendo los nucleótidos en el sitio de enlace de los sitios de enlace de la holoenzima de la polimerasa de ARN (conocidos por el trabajador experto también como región -10 y región -35) . Además se puede ejercer una influencia reduciendo o ampliando la distancia entre los sitios de enlace de la holoenzima de la polimerasa de ARN descritos por eliminaciones de nucleótidos o inserciones de nucleótidos; además, poniendo sitios de enlace (también conocidos por el trabajador experto como operadores) para proteínas reguladoras (conocidas como represores y activadores por el trabajador experto) en proximidad espacial a los sitios de enlace de la holoenzima de la polimerasa de ARN, de modo que estos reguladores, después de enlazar a una secuencia promotor, atenúa o realza la actividad de enlace y transcripcional de la holoenzima de la polimerasa de ARN o también somete dicha actividad de enlace y transcripcional a una nueva influencia reguladora. La actividad traduccional puede también ser influenciada por mutación de la sección de secuencia 3'-terminal que media el enlace del ribosoma de un promotor Py individual dentro de la unidad de expresión que comprende promotores múltiples de la invención. VI . Productos biosintéticos y procesos de producción preferidos Productos biosíntéticos preferidos preparados de acuerdo a la invención son productos químicos finos. El término "químico fino" es familiar para el trabajador experto e incluye los compuestos que se producen por un organismo y son utilizados en varias ramas de la industria, tal como, por ejemplo, pero sin restringirse a, la industria farmacéutica, la agricultura, cosméticos, alimentos e industrias de la alimentación. Estos compuestos comprenden ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido láctico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido itacónico y ácido diaminopimélico y aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, bases de purina y bases de pirimidina, nucleósidos y nucleótidos (como se describe por ejemplo en Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp. 561-612, in Biotechnology vol. 6, Rehm et al., editors, VCH: Weinheim y las referencias presentadas aquí) , lípidos, ácidos grasos saturados y no saturados (por ejemplo, ácido araquidónico), dioles (por ejemplo, propanodiol y butanodiol) , carbohidratos (por ejemplo, ácido hialuronico y trehalosa) , compuestos aromáticos (por ejemplo, aminas aromáticas, vainillina y añil) , vitaminas y cofactores (según lo descrito en Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, "Vitamins", pp . 443-613 (1996) VCH: Weinheim y las referencias presentes aquí; y Ong, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) "Nutrition, Lípids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, held on Sept. 1-3, 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)), enzimas y otros químicos descritos por Gutcho (1983) en Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 y las referencias indicadas aquí . Productos biosintéticos particularmente preferidos se seleccionan del grupo de ácidos orgánicos, proteínas, nucleótidos y nucleósidos, aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, enzimas y proteínas. Ácidos orgánicos preferidos son ácido láctico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido itacónico y ácido diaminopimélico . Los nucleósidos y nucleótidos preferidos se describen por ejemplo en Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp . 561-612, en Biotechnology, vol. 6, Rehm et al., editors VCH: Weinheim y referencias presentes aquí. Los productos biosintéticos preferidos son adicionalmente lípidos, ácidos grasos saturados y no saturados tal como, por ejemplo, el ácido araquidónico, dioles tales como, por ejemplo, propanodiol y butanodiol, carbohidratos tales como, por ejemplo, el ácido hialuronico y trehalosa, compuestos aromáticos tales como, por ejemplo, aminas aromáticas, vainillina y añil, vitaminas y cofactores según lo descrito por ejemplo en Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, "Vitamins", pp . 443-613 (1996) VCH: Weinheim y las referencias presentes aquí; y Ong, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) "Nutrition, Lípids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, realizada el 1-3 de septiembre, 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)), enzimas, policétidos (Cañe et al., (1998) Science 282: 63-68) y otros químicos descritos por Gutcho (1983) en Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 y las referencias indicadas aquí. Los productos biosintéticos particularmente preferidos son los aminoácidos, preferiblemente de manera particular aminoácidos esenciales, en particular, L-glicina, L-alanina, L-leucina, L-metionina, L-fenilalanina, L-triptófano, L-lisina, L-glutamina, ácido L-glutámico, L-serina, L-prolina, L-valina, L-isoleucina, L-cisteina, L-tirosina, L-histidina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico y L-treonina, L-homoserina, especialmente L-lisina, L-metionina y L-treonina. Un aminoácido tal como, por ejemplo, lisina, metionina y treonina se refiere de aquí en adelante en cada caso a la forma L y D del aminoácido, preferiblemente la forma L, es decir, por ejemplo L-lisina, L-metionina y L-treonina. Las secciones siguientes describen preparaciones particularmente preferidas de lisina, de metionina y de treonina con más detalle, a) Preparación de lisina La invención se relaciona particularmente con un proceso para producir lisina cultivando microorganismos genéticamente modificados con velocidad de expresión aumentada o provocada de un gen en comparación con el de tipo nativo, donde - la actividad de expresión en el microorganismo de al menos un gen endógeno se regula por una unidad de expresión de la invención, o - la expresión de al menos un gen en el microorganismo se provoca o altera introduciendo en dicho microorganismo un cásete de expresión de la invención que comprende dicho gen. Los genes se seleccionan aquí en particular de entre ácidos nucleicos que codifican un aspartato cinasa, ácidos nucleicos que codifican un aspartato semialdehido dehidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican un diaminopimelato deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican un diaminopimelato descarboxilasa, ácidos nucleicos que codifican un dihidrodipicolinato sintetasa, ácidos nucleicos que codifican un dihidrodipicolinato reductasa, ácidos nucleicos que codifican una gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican una 3-fosfoglicerato cinasa, ácidos nucleicos que codifican una piruvato carboxilasa, ácidos nucleicos que codifican una triosefosfato isomerasa, ácidos nucleicos que codifican un regulador LuxR transcripcional, ácidos nucleicos que codifican un regulador LisRl transcripcional, ácidos nucleicos que codifican un regulador LisR2 transcripcional, ácidos nucleicos que codifican un malato quinona oxidoreductasa, ácidos nucleicos que codifican una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican una 6-fosfogluconato deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican una trancetolasa, ácidos nucleicos que codifican una transaldolasa, ácidos nucleicos que codifican un exportador de lisina, ácidos nucleicos que codifican una biotin ligasa, ácidos nucleicos que codifican un arginil-ARNt sintetasa, ácidos nucleicos que codifican una fosfoenolpiruvato carboxilasa, ácidos nucleicos que codifican una fructosa-1, 6-bifosfatasa, ácidos nucleicos que codifican un proteína OpcA, ácidos nucleicos que codifican una 1-fosfofructocinasa, ácidos nucleicos que codifican una 6-fosfofructocinasa, ácidos nucleicos que codifican una tetrahidropicolinato succinilasa, ácidos nucleicos que codifican una succinil aminocetopimelato aminotransferasa, ácidos nucleicos que codifican una succinil diaminopimelato desuccinilasa, ácidos nucleicos que codifican una diaminopimelato epimerasa, ácidos nucleicos que codifican una 6-fosfogluconato deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican una glucosa fosfato isomerasa, ácidos nucleicos que codifican una fosfoglicerato mutasa, ácidos nucleicos que codifican una enolasa, ácidos nucleicos que codifican una piruvato cinasa, ácidos nucleicos que codifican una aspartato transaminasa y ácidos nucleicos que codifican una enzima de malato . Una modalidad preferida adicional del proceso descrito anteriormente para preparar lisina comprende los microorganismos genéticamente modificados, comparados con los tipo nativo que tienen adicionalmente una actividad incrementada de al menos una de las actividades seleccionadas de entre actividad de aspartato cinasa, actividad de aspartato semialdehido deshidrogenasa, actividad de diaminopimelato deshidrogenasa, actividad de diaminopimelato descarboxilasa, actividad de dihidropicolinato sintetasa, actividad de dihidropicolinato reductasa, actividad de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, actividad de 3-fosfoglicerato cinasa, actividad de piruvato carboxilasa, actividad de triosefosfato isomerasa, actividad del regulador LuxR transcripcional, actividad del regulador LisRl transcripcional, actividad de regulador LisR2 transcripcional, actividad de malato-quinona oxidoreductasa, actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, actividad de 6-fosfogluconato deshidrogenasa, actividad de transcetolasa, actividad de transaldolasa, actividad del exportador de lisina, actividad de arginil-ARNt sintetasa, actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa, actividad de fructosa 1 , 6-bifosfatasa, actividad de la proteína OpcA, actividad de la 1-fosfofructocinasa, actividad de la 6-fosfofructocinasa, actividad de biotin ligasa, y actividad de tetrahidropicolinato succinilasa, actividad de succinil aminocetopimelato aminotransferasa, actividad de succinil diaminopimelato desuccinilasa, actividad de diaminopimelato epimerasa, actividad de 6-fosfogluconato deshidrogenasa, actividad de glucosa fosfato isomerasa, actividad de fosfoglicerato mutasa, actividad de enolasa, actividad de piruvato cinasa, actividad de aspartato transaminasa y actividad de enzima de malato. Una modalidad particularmente preferida adicional del proceso descrito anteriormente para preparar lisina comprende los microorganismos genéticamente modificados que tienen, en comparación con el tipo nativo, adicionalmente una actividad reducida, de al menos una de las actividades seleccionadas del grupo actividad de treonina deshidratasa, actividad de homoserina O-acetiltransferasa, actividad de 0-acetilhomoserina sulfhidrilasa, actividad de fosfoenolpiruvato carboxicinasa, actividad de piruvato oxidasa, actividad de homoserina cinasa, actividad de homoserina dehidrogenasa, actividad del exportador de treonina, actividad de proteína de emanación de treonina, actividad de asparaginasa, actividad de aspartato descarboxilasa y actividad de treonina sintasa. b) Preparación de metionina La invención se refiere además a un proceso para preparar metionina cultivando microorganismos genéticamente modificados con velocidad de expresión incrementada o provocada de al menos un gen en comparación con el tipo nativo, donde la actividad de expresión en el microorganismo de al menos un gen endógeno se regula por una unidad de expresión de la invención, o la expresión de al menos un gen en el microorganismo se provoca o altera introduciendo en dicho microorganismo una unidad de expresión de la invención que comprende dicho gen. Los genes se seleccionan aquí en particular de ácidos nucleicos que codifican una aspartato cinasa, ácidos nucleicos que codifican un aspartato semialdehido deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican un homoserina deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican un gliceraldehido-3 -fosfato deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican un 3-fosfoglicerato cinasa, ácidos nucleicos que codifican un piruvato carboxilasa, ácidos nucleicos que codifican un triosefosfato isomerasa, ácidos nucleicos que codifican un homoserina O-acetiltransferasa, ácidos nucleicos que codifican una cistationina gamma-sintasa, ácidos nucleicos que codifican una cistationina beta-liasa, ácidos nucleicos que codifican una serina hidroximetiltransferasa, ácidos nucleicos que codifican una O-acetilhomoserina sulfhidrilasa, ácidos nucleicos que codifican una metilenotetrahidrofolato reductasa, ácidos nucleicos que codifican una fosfoserina aminotransferasa, ácidos nucleicos que codifican una fosfoserina fosfatasa, ácidos nucleicos que codifican una serina acetiltransferasa, ácidos nucleicos que codifican una actividad de cisteina cintasa I, ácidos nucleicos que codifican una actividad de cisteina sintasa II, ácidos nucleicos que codifican una actividad de metionina sintasa dependiente de la coenzima B-12, ácidos nucleicos que codifican una actividad de metionina sintasa independiente de la coenzima B-12, ácidos nucleicos que codifican una actividad de un sulfato adeniltransferasa, ácidos nucleicos que codifican una actividad de una fosfoadenosina fosfosulfato reductasa, ácidos nucleicos que codifican una actividad de una ferredoxin sulfito reductasa, ácidos nucleicos que codifican un actividad de ferredoxin NADPH reductasa, ácidos nucleicos que codifican un actividad de ferredoxin, ácidos nucleicos que codifican un proteína de reducción RXA077 de sulfato, ácidos nucleicos que codifican un proteína de reducción RXA248 de sulfato, ácidos nucleicos que codifican un proteína de reducción RXA247 de sulfato, ácidos nucleicos que codifican un regulador RXA655 y ácidos nucleicos que codifican un regulador RXN2910, ácidos nucleicos que codifican una 6-fosfogluconato deshidrogenasa, glucosa fosfato isomerasa, fosfoglicerato mutasa, enolasa, piruvato cinasa, aspartato transaminasa o enzima de malato. Una modalidad preferida adicional del proceso descrito anteriormente para preparar metionina comprende los microorganismos genéticamente modificados que tienen, en comparación con el tipo nativo, adicionalmente una actividad incrementada de al menos una de las actividades seleccionadas del grupo de aspartato cinasa, actividad de aspartato semialdehido deshidrogenasa, actividad de homoserina deshidrogenasa, actividad de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, actividad de 3-fosfoglicerato cinasa, actividad de piruvato carboxilasa, actividad de triosefosfato isomerasa, actividad de homoserina O-acetiltransferasa, actividad de cistationina gamma-sintasa, actividad de cistationina beta-liasa, actividad de serina hidroximetiltransferasa, actividad de O-acetilhomoserina sulfhidrilasa, actividad de metilenotetrahidrofolato reductasa, actividad de fosfoserina aminotransferasa, actividad de fosfoserina fosfatasa, actividad de serina acetiltransferasa, actividad de cisterna cintasa I, actividad de cisterna sintasa II, actividad de metionina sintasa dependiente de la coenzima B-12, actividad de metionina sintasa independiente de la coenzima B-12, actividad de sulfato adeniltransferasa, actividad de fosfoadenosina fosfosulfato reductasa, actividad de ferredoxin sulfito reductasa, actividad de ferredoxin NADPH reductasa, actividad de ferredoxin, actividad de una proteína de reducción RXA077 de sulfato, actividad de una proteína de reducción RXA248 de sulfato, actividad de una proteína de reducción RXA247 de sulfato, actividad de un regulador RXA655 y actividad de un regulador RXN2910, actividad de un 6-fosfogluconato deshidrogenasa, actividad de una glucosa fosfato isomerasa, actividad de un fosfoglicerato mutasa, actividad de una enolasa, actividad de un piruvato cinasa, actividad de un aspartato transaminasa y actividad de la enzima de malato. Una modalidad particularmente preferida adicional del método descrito anteriormente para preparar metionina comprende los microorganismos genéticamente modificados que tienen, en comparación con el tipo nativo, adicionalmente una actividad reducida, de al menos una de las actividades seleccionadas del grupo de actividad de homoserina cinasa, actividad de treonina deshidratasa, actividad de treonina sintasa, actividad de meso-diaminopimelato D-deshidrogenasa, actividad de fosfoenolpiruvato carboxicinasa, actividad de piruvato oxidasa, actividad de dihidrodipicolinato sintasa, actividad de dihidropicolinato reductasa y actividad de diaminopicolinato descarboxilasa . c) Preparación de treonina La invención se refiere además a un proceso para preparar treonina cultivando microorganismos genéticamente modificados con velocidad de expresión incrementada o provocada de al menos un gen en comparación con el tipo nativo, donde la actividad de expresión en el microorganismo de al menos un gen endógeno se regula por una unidad de expresión de la invención, o la expresión de al menos un gen en el microorganismo se provoca o altera introduciendo en dicho microorganismo una unidad de expresión de la invención que comprende dicho gen. Los genes se seleccionan aquí en particular de ácidos nucleicos que codifican un aspartato cinasa, ácidos nucleicos que codifican un aspartato semialdehido deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican un gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican un 3-fosfoglicerato cinasa, ácidos nucleicos que codifican un piruvato carboxilasa, ácidos nucleicos que codifican un triosefosfato isomerasa, ácidos nucleicos que codifican una homoserina O-acetiltransferasa, ácidos nucleicos que codifican una treonina sintasa, ácidos nucleicos que codifican un portador exportador de treonina, ácidos nucleicos que codifican un glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican una transaldolasa, ácidos nucleicos que codifican una transcetolasa, ácidos nucleicos que codifican un malato quinona oxidoreductasa, ácidos nucleicos que codifican un 6-fosfogluconato deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican un exportador de lisina, ácidos nucleicos que codifican un biotin ligasa, ácidos nucleicos que codifican un fosfoenolpiruvato carboxilasa, ácidos nucleicos que codifican una proteína de emanación de treonina, ácidos nucleicos que codifican una fructosa-1 , 6-bisfofatasa, ácidos nucleicos que codifican una proteína OpcA, ácidos nucleicos que codifican un 1-fosfofructocinasa, ácidos nucleicos que codifican una 6-fosfofructocinasa, y ácidos nucleicos que codifican una homoserina deshidrogenasa, y ácidos nucleicos que codifican un 6-fosfogluconato deshidrogenasa, glucosa fosfato isomerasa, fosfoglicerato mutasa, enolasa, piruvato cinasa, aspartato transaminasa y enzima de malato. Una modalidad preferida adicional del proceso descrito anteriormente para preparar treonina comprende los microorganismos genéticamente modificados que tienen, en comparación con el tipo nativo, adicionalmente una actividad incrementada, de al menos una de las actividades seleccionadas del grupo de : Actividad de aspartato cinasa, actividad de aspartato semialdehido deshidrogenasa, actividad de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, actividad de 3-fosfoglicerato cinasa, actividad de piruvato carboxilasa, actividad de triosefosfato isomerasa, actividad de treonina sintasa, actividad de un portador exportador de treonina, actividad de transaldolasa, actividad de transcetolasa, actividad de glucosa-6-fosfato dehidrogenasa, actividad de malato quinona oxidoreductasa, actividad de homoserina cinasa, actividad de biotin ligasa, actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa, actividad de proteína de emanación de treonina, actividad de proteína OpcA, actividad de 1-fosfofructocinasa, actividad de 6-fosfofructocinasa, actividad de fructosa-1, 6-bisfosfatasa, 6-fosfogluconato deshidrogenasa, actividad de homoserina deshidrogenasa, y actividad de un 6-fosfogluconato deshidrogenasa, actividad de una glucosa fosfato isomerasa, actividad de un fosfoglicerato mutasa, actividad de una enolasa, actividad de un piruvato cinasa, actividad de un aspartato transaminasa y actividad de la enzima de malato. Una modalidad particularmente preferida adicional del proceso descrito anteriormente para preparar treonina comprende los microorganismos genéticamente modificados que tienen, en comparación con el tipo nativo, adicionalmente una actividad reducida de al menos una de las actividades seleccionadas del grupo de actividad de treonina hidratasa, actividad de homoserina O-acetiltransferasa, actividad de serina hidroximetiltransferasa, actividad de O-acetilhomoserina sulfidrilasa, actividad de meso-diaminopimelato D-dehidrogenasa, actividad de fosfoenolpiruvato carboxicinasa, actividad de piruvato oxidasa, actividad de dihidropicolinato sintetasa, actividad de dihidropicolinato reductasa, actividad de asparaginasa, actividad de aspartato descarboxilasa, actividad de exportador de lisina, actividad de lactato sintasa, actividad de ácido cetol reductoisomerasa, actividad de la aminotransferasa de cadena ramificada, actividad de metionina sintasa dependiente de la coenzima B-12, actividad de metionina sintasa independiente de la coenzima B-12, actividad de ácido dihidroxi dehidratasa y actividad de diaminopicolinato descarboxilasa. d) Información adicional sobre preparación de bioproductos de acuerdo a la invención. Estas actividades incrementadas o reducidas adicionales de al menos una de las actividades descritas anteriormente pueden, aunque no necesariamente, provocarse por una unidad de expresión de la invención o por un cásete de expresión de la invención. El termino "actividad" de una proteína se refiere en el caso de enzimas a la actividad enximática de la proteína correspondiente, y en el caso de otras proteínas, por ejemplo proteínas estructurales o de transporte, a la actividad fisiológica de las proteínas. Las enzimas son ordinariamente capaces de convertir un sustrato en un producto o de catalizar éste paso de conversión. De conformidad, la "actividad" de una enzima se refiere a la cantidad de sustrato convertido por la enzima, o a la cantidad de producto formado, en un tiempo particular. De esta manera, donde se incrementa una actividad en comparación con la del tipo nativo, la cantidad del sustrato convertido por la enzima, o la cantidad de producto formado, en un tiempo particular se incrementa en comparación con la del tipo nativo. Este incremento en la "actividad", por ejemplo, cantidades, para todas las actividades descritas anteriormente y de aquí en adelante, a al menos 1 a 5%, tal como por ejemplo, al menos 20%, al menos 50%, al menos 100%, al menos 300%, o al menos 500%, o al menos 600% de la "actividad del tipo nativo" . De esta manera, donde se reduce una actividad en comparación con la del tipo nativo, se reduce la cantidad de sustrato convertido por la enzima, o la cantidad de producto formado, en un tiempo particular en comparación con la del tipo nativo.

Una actividad reducida preferiblemente quiere decir la supresión o bloqueo parcial o sustancialmente total, en base a varios mecanismos biológicos celulares, de la funcionalidad de esta enzima en un microorganismo. Una reducción en la actividad comprende un decremento cuantitativo en una enzima hasta la ausencia sustancialmente total de la enzima (es decir, falta de detectabilidad de la actividad correspondiente o falta de detectabilidad inmunológica de la enzima) . La actividad en el microorganismo preferiblemente se reduce, en comparación con la del tipo nativo, por al menos 5%, tal como por al menos 20%, por al menos 50% o aproximadamente 100%. "Reducción" se refiere también en particular a la ausencia total de la actividad correspondiente . La actividad de enzimas particular en microorganismos genéticamente modificados y en la del tipo nativo, y de esta manera el incremento o reducción en la actividad enzimática, puede medirse por métodos conocidos tal como por ejemplo, ensayos de enzimas. Un incremento adicional de actividades pueden tener lugar en varias formas, por ejemplo desconectar el mecanismo regulador inhibitorio en el nivel de expresión o de la proteína o incrementando la expresión del gen de ácidos nucleicos que codifican las proteínas descritas anteriormente en comparación con la del tipo nativo. Aumentar la expresión del gen de ácidos nucleicos que codifican las proteínas descritas anteriormente en comparación con al del tipo nativo puede de manera similar tener lugar en varias formas, por ejemplo, induciendo el gen mediante activadores o, como se describió anteriormente, incrementando la actividad de promotor o incrementando la actividad de expresión o introduciendo una o más copias del gen en el microorganismo. Aumentar la expresión del gen de un ácido nucleico que codifica una proteína también se refiere de acuerdo a la invención a la manipulación de la expresión de las proteínas endógenas intrínsecas al microorganismo. Esto puede lograrse por ejemplo, como se describió anteriormente, alterando las secuencias de promotor de los genes, introduciendo una unidad de expresión de la invención para el control regulador de los genes y alterando las unidades de expresión introducidas de la invención. Una alteración tal, la cual resulta en una velocidad de expresión incrementada, puede tener lugar por ejemplo por eliminación o inserción de secuencias de ADN. Es posible, como se describió anteriormente, alterar la expresión de las proteínas endógenas aplicando estimulo exógeno. Esto puede tener lugar a través de condiciones fisiológicas particulares, es decir, a través de la aplicación de sustancias externas. El trabajador experto puede recurrir a otros procedimientos diferentes, de manera individual o en combinación, para lograr un incremento en la expresión del gen. De esta manera, por ejemplo, el número de copias de los genes apropiados puede incrementarse o el promotor y la región reguladora o el sitio de enlace ribosómico localizado corriente arriba del gen estructural puede mutarse. Adicionalmente es posible incrementar la expresión durante la producción fermentativa a través de promotores inducibles. Los procedimientos para prolongar el tiempo de vida del ARNm mejoran de manera similar la expresión. La actividad enzimática se refuerza asimismo también previniendo la degradación de la proteína de la enzima. Los genes o las estructuras del gen pueden estar presentes en plásmidos con variación del número de copias o integrados y amplificados en el cromosoma. También es posible como una alternativa realizar sobreexpresión de los genes relevantes alterando la composición del medio y mediante el control del cultivo. El trabajador experto puede encontrar guía aquí, inter alia, en Martin et al., (Biotechnology 5, 137-146 (1987)), en Guerrero et al., (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), en Eikmanns et al., (Gene 102, 93-98 (1991)), en EP-A 0472869, en US-A 4,601,893, en Schwarzer and Pühler (Biotechnology 9, 84-87 (1991), en Reinscheid et al., (Applied and Enviromental Microbiology 60, 126-132 (1994), en LaBarre et al., (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en WO 96/15246, en Malumbres et al., (Gene 134, 15-24 (1993)), en JP-A-10-229891 , en Jensen and Hammer (Biotechnology Reviews 60: 512-538 (1996) y en libros de texto bien conocidos de genética y biología molecular) . Adicionalmente puede ser ventajoso para la producción de productos biosintéticos, especialmente L-lisina, L-metionina y L-treonina, junto con la expresión o intensificación de un gen, eliminar reacciones laterales no deseadas (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", en: Overproduction of microbial products, Krumphanzí, Sikita, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982) . En una modalidad preferida, la expresión del gen de un ácido nucleico que codifica una de las proteínas descritas anteriormente, se incrementa introduciendo al menos un ácido nucleico que codifica una proteína correspondiente en el microorganismo. La introducción del ácido nucleico puede tener lugar de manera cromosómica o de manera extracromosómica, es decir, a través de incrementar el número de copias en el cromosoma y/o una copia del gen sobre un plásmido que se replica en el microorganismo huésped. La introducción del ácido nucleico, por ejemplo en la forma de un cásete de expresión de la invención que comprende el ácido nucleico, preferiblemente tiene lugar de manera cromosómica, en particular por el método SacB descrito anteriormente. Es posible en principio usar para este propósito cualquier gen que codifica una de las proteínas descritas anteriormente. En el caso de secuencias de ácidos nucleicos genómicos de fuentes eucarióticas las cuales comprenden intrones, sí el microorganismo huésped es incapaz o no puede ser hecho capaz de expresar las proteínas correspondientes se prefiere usar secuencias de ácidos nucleicos las cuales ya han sido procesadas, tal como las ADNcs correspondientes. Ejemplos de los genes correspondientes se enlistan en la Tabla 1 y 2. Las actividades descritas anteriormente en microorganismos preferiblemente se reducen mediante al menos uno de los siguientes métodos: • la introducción de al menos un sentido de secuencia de ácido ribonucleico para inducir la cosupresión o de un cásete de expresión que asegura la expresión del mismo • la introducción de al menos un factor de enlace de ADN o de proteína contra un gen correspondiente, un ARN o una proteína o de un cásete de expresión que asegura la expresión del mismo • la introducción de al menos una secuencia de ácido nucleico viral la cual provoca degradación de ARN o de un cásete de expresión que asegura la expresión del mismo • la introducción de al menos una estructura para producir una pérdida de función, tal como, por ejemplo, la generación de codones de paro o cambios en la estructura de lectura, de un gen, por ejemplo produciendo una inserción, eliminación, inversión o mutación en un gen. Es posible y preferido generar mutante con alelo nulo enfocando la inserción en el gen objetivo deseado a través de la recombinación homologa o de la introducción de nucleasas de secuencias especificas contra el gen objetivo . • la introducción de un promotor con actividad de promotor reducida o de una unidad de expresión con actividad de expresión reducida. • introducción de un ARN de antisentido que reduce la traslación del ARN de sentido (ARNm) .

El trabajador experto es consiente que pueden emplearse también otros procesos dentro del alcance de la presente invención para reducir su actividad o función. Por ejemplo, también puede ser ventajosa la introducción de una variante negativa dominante de una proteína o de un cásete de expresión que asegura la expresión de la misma. Además, es posible para cada uno de estos procesos individuales realizar una reducción en la cantidad de proteína, la cantidad de ARNm y/o la actividad de una proteína. También es concebible un uso combinado. Otros métodos son conocidos por el trabajador experto y pueden comprender impedir o suprimir el procesamiento de la proteína, del transporte de la proteína o su ARNm, la inhibición de la unión del ribosoma, la inhibición de la unión del ARN, la inducción de una enzima que degrada el ARN y/o la inhibición de la elongación de la traslación o la terminación. VII. Cultivo de microorganismos y aislamiento de productos En el proceso de la invención para preparar productos biosintéticos, la etapa de cultivo de los microorganismos genéticamente modificados es preferiblemente seguida por un aislamiento los productos biosintéticos de los microorganismos y/o del caldo de fermentación. Estas etapas pueden tener lugar al mismo tiempo y/o preferiblemente después de la etapa de cultivo.

Los microorganismos genéticamente modificados de la invención pueden cultivarse para producir productos biosintéticos, en particular L-lisina, L-metionina, L-treonina, de manera continua o de manera discontinua en un proceso por lotes (cultivo por lote) o en los procesos de alimentación por lotes o de alimentación por lotes repetidos.

Un resumen de métodos de cultivo conocidos se encuentra en el libro de texto por Chemiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) ) o en el libro de texto por Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) ) . El medio de cultivo a usarse debe satisfacer en una manera conveniente las demandas de las cepas respectivas. Existen descripciones de medios de cultivo para varios microorganismos en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Este medio el cual puede emplearse de acuerdo a la invención usualmente comprende una o más fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas y/o elementos de trazas. Fuentes de carbono preferidas son los azucares tales como los mono, di o polisacáridos. Ejemplos de fuentes de carbono muy buenas son la glucosa, fructosa, mañosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, lactosa, maltosa, sucrosa, rafinosa, almidón o celulosa. Los azucares pueden también ponerse en el medio vía compuestos complejos tales como las melazas u otros subproductos de la refinación de los azucares. También puede ser ventajoso agregar mezclas de varias fuentes de carbono. Otras posibles fuentes de carbono son los aceites y las grasas tales como, por ejemplo, aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y grasa de coco, ácidos grasos tales como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico o ácido linoleico, alcoholes tales como, por ejemplo, glicerol, metanol o etanol y ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético y ácido láctico. Las fuentes de nitrógeno son usualmente compuestos de nitrógeno orgánicos e inorgánicos o materiales que contienen estos compuestos. Ejemplos de fuentes de nitrógeno comprenden gas de amonio o sales de amonio tal como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio o nitrato de amonio, nitratos, urea, aminoácidos o fuentes de nitrógeno de complejos tales como licor de infusión de maíz, harina de soya, proteína de soya, extracto de levadura, extracto de carne y otros. Las fuentes de nitrógeno pueden usarse de manera individual o como mezclas.

Los compuestos de sales inorgánicas los cuales pueden estar presentes en el medio comprenden las sales de cloruro, fosfóricas, o de sulfato de calcio, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, zinc, cobre y hierro. Para preparar químicos finos, especialmente metionina, es posible utilizar como fuentes de azufre compuestos inorgánicos tales como, por ejemplo, sulfatos, sulfitos, ditionitos, tetrationatos, tiosulfatos, sulfuro, pero también compuestos de azufre orgánicos tales como mercaptanos y tioles. Es posible usar como fuente de fósforo ácido fosfórico, dihidrogenfosfato de potasio o hidrogenfosfato de dipotasio o las sales que contienen sodio correspondientes. Pueden agregarse agentes formadores de quelatos al medio para mantener los iones metálicos en solución. Agentes formadores de quelatos particularmente convenientes comprenden dihidroxifenoles tales como catecol o protocatecuate o ácidos orgánicos tal como el ácido cítrico. El medio de fermentación empleado de acuerdo a la invención normalmente también comprende otros factores de crecimiento tales como vitaminas o promotores de crecimiento, los cuales incluyen por ejemplo, biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotinico, pantotenato y piridoxina. Los factores de crecimiento y las sales frecuentemente se derivan de componentes complejos del medio, tal como extracto de levadura, melaza, licor de infusión de maíz, y los similares. También pueden agregarse precursores convenientes al medio de cultivo. La composición exacta de los compuestos en el medio depende en gran medida en el experimento particular y se decidirá de manera individual para cada caso específico. Información sobre la optimización del medio se puede obtener del manual "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (editores P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19963577 3) . El medio de crecimiento también puede comprarse de proveedores comerciales, tales como el Standard 1 (Merck) o BHI (Brain Herat infusión, DIFCO) y similares. Todos los componentes del medio se esterilizan ya sea con calor (20 min a 1.5 bar y 121 °C) o mediante esterilización por filtración. Los componentes pueden esterilizarse ya sea juntos o sí es necesario de manera separada. Todos los componentes del medio pueden estar presentes al inicio del cultivo u opcionalmente pueden agregarse de manera continua o a manera de lotes . La temperatura del lote esta normalmente entre 15 °C y 45°C, preferiblemente a 25°C a 40°C y puede mantenerse constante o cambiar durante el experimento. El pH del medio debe estar en el rango de 5 a 8.5, preferiblemente alrededor de 7.0. El pH para el cultivo puede controlarse durante el cultivo agregando compuestos básicos tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amonio o amonio acuoso o compuestos ácidos tales como ácido fosforito o ácido sulfúrico. El desarrollo de espuma puede controlarse empleando antiespumantes tales como, por ejemplo, esteres de poliglicol de ácido graso. La estabilidad de los plásmidos puede mantenerse agregando sustancias convenientes al medio con una acción selectiva, tal como, por ejemplo, antibióticos. Las condiciones aeróbicas se mantienen introduciendo oxígeno o mezclas de gas que contienen oxígeno tal como, por ejemplo, aire ambiente en el cultivo. La temperatura del cultivo es normalmente 20 °C a 45 °C. El cultivo se continúa hasta que la formación del producto deseado se encuentra al máximo. Este objetivo normalmente se alcanza dentro de 10 horas a 160 horas. El contenido de materia seca de los caldos de fermentación obtenidos en esta manera es normalmente de 7.5 a 25% en peso. Adicionalmente también es ventajoso realizar la fermentación con límite de azúcar al menos al final, pero en particular en al menos 30% del tiempo de fermentación. Esto quiere decir que la concentración de azúcar utilizable en el medio de fermentación se mantiene en 0 a 3 g/1, o se reduce, durante este tiempo.

Los productos biosintéticos se aislan del caldo de fermentación y/o de los microorganismos en una manera conocida per se de acuerdo con las propiedades físicas/químicas del producto biosintético requerido y de los subproductos biosintéticos. El caldo de fermentación puede entonces procesarse por ejemplo. Dependiendo del requerimiento, la biomasa puede retirarse totalmente o parcialmente del caldo de fermentación por métodos de separación tales como, por ejemplo, centrifugación, filtración, decantación o una combinación de estos métodos, o dejarse completamente en este. El caldo de fermentación puede entonces espesarse o concentrarse por métodos conocidos tales como, por ejemplo, con la ayuda de un evaporador rotatorio, evaporador de película delgada, evaporador de película de relleno, por osmosis inversa o por nanofiltración. Este caldo de fermentación concentrado puede entonces emplearse por secado por congelamiento, secado por aspersión, granulación por aspersión o por otros procesos. Sin embargo, también es posible purificar los productos biosintéticos, especialmente la L-lisina, L-metionina y la L-treonina. Para este propósito, el caldo que contiene el producto se somete, después de la eliminación de la biomasa, a una cromatografía usando una resina conveniente, con el producto deseado o las impurezas que se retienen de manera total o de manera parcial en la resina de la cromatografía. Estas etapas cromatograficas pueden repetirse sí se requiere, usando la misma o diferentes resinas de cromatografía. El trabajador experto es hábil en la selección de resinas de cromatografía convenientes y sus usos más efectivos. El producto purificado puede concentrarse por filtración o ultrafiltración y almacenarse a una temperatura a la cual la estabilidad del producto es un máximo. Los productos biosintéticos pueden resultar en varias formas, por ejemplo en la forma de sus sales o esteres. La identidad y pureza del compuesto (s) aislado puede determinarse por técnicas del arte previo. Estas comprenden cromatografía líquida de alta presión (HPLC) , métodos espectroscópicos, métodos de teñido, cromatografía de capa delgada, NIRS, ensayos de enzima o ensayos microbiológicos . Estos métodos analíticos se resumen en: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; y Schmidt et al. (1988) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp 521-540, pp 540-547, pp . 559-556, 575-581 and pp 581-587; Michael, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallón, A et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17. La invención se describe ahora en más detalle por medio de los siguientes ejemplos no limitantes: Ejemplo 1: Preparación del vector pCLiK5MCS Primero la resistencia a la ampicilina y el origen de replicación del vector pBR322 se amplificaron con la ayuda de la reacción de la cadena de la polimerasa (PCR) usando los cebadores oligoclucleotidos de SEC NO: 5 y SEC ID: 6. SEC NO: 5: 5 ' -CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3 " SEC NO : 6 : 5 ' -TCTAGACTCGAGCGGCCCCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3 ' Aparte de las secuencias complementarias para el pBR322, el sebador de oligonucleotido de SEC ID NO: 5 comprende, en la dirección 5 '-3', los sitios de escisión para la endonucleasa de restricción Smal, BamHL, Nhel, y Ascl, y el sebador de oligonucleotido de SEC ID NO: 6 comprende, en la dirección 5 '-3', los sitios de escisión para la endonucleasa de restricción Xbal, Xhol, Notl y Dral. La reacción PCR se lleva acabo mediante un método estándar tal como el Innis et al. (PCR protocols. A Guide to methods and Applications, Academic press 1990) usando la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene, la Jolla, USA) . El fragmento de ADN obtenido, cuyo tamaño es aproximadamente de 2.1 kb, se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. (Amersham Pharmacia, Freidburg, Germany) de acuerdo a la información del fabricante. Los extremos romos del fragmento de ADN se ligan uno a otro usando el Kit de ligación de ADN Rápido (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) de acuerdo a la información del fabricante y la mezcla de ligación se transforma de acuerdo a los métodos estándar tal como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Manual Laboratory, Cold Spring Harbor, 1989) in competent E Coli XL-lBlue (Stratagena la Jolla, USA) . La selección para las células que hospedan el plásmido se logra colocando en placas ampicilina (50 ug/ml) que contienen LB Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) . El ADN plásmido de un clon individual se aisla usando el Kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Germany) de acuerdo a la información del fabricante y se verifica vía digestiones de restricción. El plásmido obtenido de esta forma se denota pCLiKl. Iniciando desde el plásmido pWLTl (Liebl et al., 1992) como plantilla para una reacción PCR, un cásete de resistencia de kanamicin se amplfica usando los cebadores de oligonucletidos SEC ID N:7 y SEC ID NO : 8.

SEC ID NO: 7 5 'GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3 ' SEC ID NO: 8. 5 'GAGAGGCCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3 ' Aparte de las secuencias complementarias para pWLTl, el sebador de oligonucleotido SEC ID NO: 7 comprende, en la dirección 5 '-3', los sitios de escisión para las endonuclesas de restricción Xbal, BamHl, Nhel, y el sebador de oligonucleotido de SEC ID NO: 8 comprende, en la dirección 5'-3', los sitios de escisión para las endonucleasas de restricción Ascl y Nhel. La reacción PCR se lleva acabo mediante el método estándar tal como Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Appications, Academia Press 1990) , usando la polimerasa Pfu Turbo (Stratagena La Jolla, USA) : El fragmento de ADN obtenido, cuyo tamaño es aproximadamente de 1.3 kb, se purifica usando El Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. El fragmento de ADN se corta mediante las endonucleasas de restricción Xbal y AscI (New England Biolabs, Beverly, USA) y nuevamente se purifica subsecuentemente usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. El vector pCLiKl se corta de manera similar por las endonucleasas de restricción Xbal y AscI y se defosforila mediante fosfatasa alcalina (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) de acuerdo a la información del fabricante. Después de la electroforesis en un gel de agarosa de fuerza de 0.8%, el vector linearizado (aprox 2.1 kb) se aisla usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. Este fragmento del vector se liga con el fragmento PCR cortado con ayuda del Kit de ligación de ADN Rápido (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante, y la mezcla de ligación se transforma mediante métodos estándar como se describe en Sambrook et al. (Molecular Clonning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989), into competent E. Coli XL-lBlue (Stratagen La Jolla, USA) . La selección para las células que hospedan el plásmido se logra mediante colocando en placas agar LB que contiene ampicilina (50 ug/ml) y kanamicina (20um/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190). El ADN plásmido de un clon individual se aisla usando el Kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Germany) de acuerdo a la información del fabricante y se verifica via digestiones de restricción. El plásmido obtenido de esta manera se denota pCLiK2.

El vector pCLiK2 se corta mediante la endonucleasa de restricción Dral (New England Biolabs, Beverly, USA) Después de la electroforesis en un gel de agarosa de fuerza de 0.8%, un fragmento del vector de aproximadamente 2.3kb se aisla con el Kit de Purificación de PCR; ADSN y Banda de Gel, GFX™. (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. Este fragmento del vector se vuelve a ligar con la ayuda del Kit de Ligación de ADN Rápido (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante, y la mezcla de ligación se transforma mediante métodos estándar como se describen en Sambrook et al . (Molecular Cloning A Laboratiry Manual, Cold Spring Harbor (1989)), into competent E. Coli XL-lBlue (Stratagene, La Jolla, USA). La selección para las células que hospedan el plásmido se logra colocando en placas agar LB que contiene kanamicina (20um/ml) (lennox, 1955, Virology, 1:190). El ADN del plásmido de un clon individual se aisla usando el Kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Germany) de acuerdo a la información del fabricante y se verificaron vía las digestiones de restricción. El plásmido obtenido de esta manera se denota pCLiK3. Iniciando desde el plásmido pWLQ2 (Liebl et al., 1992) como plantilla para una reacción PCR, el origen del pHM1519 de replicación se amplifica usando los sebadores de oligonucleotidos de SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10. SEC ID NO: 9: 5 ' -GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3 ' SEC ID NO: 10. 5 ' -GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3 ' A parte de las secuencias complementarias para pWLQ2 , los sebadores de oligonucleotidos de SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10 comprenden los sitios de escisión para la endonucleasa de restricción Notl. La reacción PCR se lleva acabo mediante el método estándar tal como Innis et al. (PCR Protocols A guide to Methods and Aplications, Academia Press 1990) , usando la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene, La Jolla, USA) El fragmento de ADN obtenido cuyo tamaño es aproximadamente de 2.7 kb, se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. El fragmento de ADN se corta mediante la endonucleasa de restricción Notl (New England Biolabs, Beverly, USA) y subsecuentemente purificada usando nuevamente el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. El vector pCLiK3 se corta de manera similar mediante la endonucleasa de restricción Notl y se desfosforila mediante fosfatasa álcali (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante. Después de la electroforesis en un gel de agarosa de fuerza de 0.8%, el vector linearizado (aprox 2.3 kb) se aisla usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ PCR (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. Este fragmento del vector se liga con el fragmento PCR de corte con la ayuda del Kit de Ligación de ADN Rápido (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante y la mezcla de ligación se transforma por métodos estándar como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning A Laboratiry Manual, Cold Spring Harbor (1989)), into competent E. Coli XL-lBlue (Stratagene, La Jolla, USA) . La selección para las células que hospedan el plásmido se realizan colocando en placas Agar LB que contienen kanamicina (20um/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190) . El ADN del plásmido de un clon individual se aisla usando el Kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Germany) de acuerdo a la información del fabricante y se verifica vía digestiones de restricción. El plásmido obtenido de esta manera se denota pCLiK5. Para extender el pCLik5 mediante un "sitio de clonación múltiple" (MCS) , los dos oligonucleotidos esencialmente complementarios, sintéticos, SEC ID NO: 11 SEC ID NO: 12, los cuales comprenden los sitios de escisión para los endonucleosas de restricción Swal, Xhol, Aatl, Apal Asp718, Miul, Bedel, Spel, EcoRV, Salí, Clal, BamHl, Xbal y Smal se combinan calentándolos juntos hasta- 95°C seguido de un enfriamiento lento para dar un fragmento de ADN de doble ramificación. SEC ID NO: 11 5 ' -TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATATGACTAG TTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAACAATTGGGATCCT CTAGACCCGGGATTTAAAT-3 ' SEC ID NO: 12 5 ' -GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAGCATCG ATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCGGGCCCGACGTCA GGCCTCTCGAGATTTAAAT-3 ' El vector pCLik5 se corta mediante las endonucleasas de restricción Xhol y BamHl (New England Biolabs, Beverly, USA) y se defosforila por fosfatasa álcali (I (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante. Después de la electroforesis en un gel de agarosa de fuerza de 0.8%, el vector linearizado (aprox 5.0 kb) se aisla con el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. Este fragmento del vector se liga con el fragmento de ADN de doble ramificación sintético la ayuda del Kit de Ligación de ADN Rápido (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante y la mezcla de ligación se transforma por métodos estándar como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)), into competent E. Coli XL-lBlue (Stratagene, La Jolla, USA) . La selección para las células que hospedan el plásmido se logra colocando en placas agar LB que contiene kanamicina (20um/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190). El ADN del plásmido de un clon individual se aisla usando el Kit Qiaprep Spi Miniprep (Qiagen, Hilden, Germany) de acuerdo a la información del fabricante y se verifica vía digestiones de restricción. El plásmido obtenido de esta manera se denota pCLiK5MCS. Las reacciones de secuencia se llevan acabo de acuerdo a Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencia se fraccionan y evalúan por medio de ABI Prism 377 (PE applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania). El plásmido resultante, pCLi5MCS, se lista como SEC ID NO: 13. Ejemplo 2 : Preparación del Plásmido PmetA metA El ADN cromosómico ATCC 13032 de C. glutamicum se prepara de acuerdo a Tauch et al (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Usando los cebadores de oligonucleotidos de SEC ID NO: 14 y SEC ID NO: 15, el ADN cromosómico como plantilla y la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene), el gene metA, incluyendo la región 5' no codificada, se amplifican con la ayuda de la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) por métodos estándar como se describen en Inns et al. (1990) (Protocolos PCR. A Guide to Methods and Aplications, Academic Press.). SEC ID NO: 14 5 ' -GCGCGGTACCTAGACTCACCCCAGTGCT-3 ' y SEC ID NO: 15 5 ' -CTCTACTAGTTTAGATGTAGAACTCGATGT-3 ' El fragmento de ADN de aproximadamente 1.3 kb obtenido se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. Este subsecuentemente es escinde mediante las enzimas de restricción Asp 718 y Spel (Roche Diagnostics, Manheim) , y el fragmento de ADN se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. El vector pCIiK5MCS SEC ID NO: 13 se corta mediante las enzimas de restricción Asp718 y Spel, y un fragmento de 5kb se aisla, después fraccionación electroforética, usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. El fragmento del vector se liga junto con el fragmento de PCR con la ayuda del Kit de Ligación de ADN Rápido (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo con la información del fabricante, y la mezcla de ligación se transforma mediante métodos estándar como se describen en Sambrook et al .

(Molecular Cloning. A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), into competent E. Coli XL-lBlue (Stratagene, La Jolla, USA) . La selección para las células que hospedan el plásmido se logra colocando sobre placas agar LB que contiene kanamicina (20ug/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

El ADN del plásmido se prepara por métodos y con materiales de Qiagen. Las reacciones de secuencia se llevan acabo de acuerdo al Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencias se fraccionan y evalúan por medio de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) . El plásmido resultante, pCLiKSMCS Pmeta, se lista como SEC ID NO 16. Ej emplo 3 : Preparación del plásmido pCLidMCS Psod metA El ADN cromosómico ATCC 13032 de C. glutamicum se prepara de acuerdo a Tauch et al (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Usando los cebadores de oligonucleotidos de SEC ID NO: 17 y SEC ID NO: 18, el ADN cromosómico como plantilla y la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) , un fragmento de ADN de aproximadamente 200 pares de base de la región 5' no codificante (región de la unidad de expresión) de dismutasa de superoxido (Psod) se amplifican con ayuda de la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) por métodos estándar tal como Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Aplications, Academic Press. SEC ID NO: 17 5 ' -GAGACTCGAGAGCTGCCAATTATTCCGGG-3 ' y SEC ID NO: 18 5 ' -CCTGAGGCGCGAGGGTGGGCATGGGTAAAAAATCCTTTCG-3 ' El fragmento de ADN que se obtiene se purifica usando el Kit de Purificación PCR, ADN y de Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante . Iniciando desde el plásmido PmetA metA SEC ID NO: 16 como plantilla para una reacción PCR, el metA se amplifica parcialmente usando los cebadores de oligonucleotidos de SEC ID NO: 19 y SEC ID NO: 20 SEC ID NO: 19 5 ' -CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3 ' y SEC ID NO: 20 5 ' -CTGGGTACATTGCGGCCC-3 ' El fragmento de ADN que se obtiene de aproximadamente 470 pares de base se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. Los dos fragmentos obtenidos anteriormente se usan juntos como plantilla en una reacción PCR más. En el curso de la reacción PCR, las secuencias de metA homologas introducidas con el cebador de oligonucleotido de SEC ID NO: 18 causan que los dos fragmentos se sujetan uno al otro y se extienden mediante la polimerasa usada para dar una rama de ADN continua. El método estándar se modifica en que los cebadores de oligonucleotidos usados, SEC ID NO: 17 y SEC ID NO: 20, son únicamente adicionados a la mezcla de la reacción al inicio del segundo ciclo. El fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 675 pares de base se purifica usando usando el Kit Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™, de acuerdo a la información del fabricante. Se escinde subsecuentemente por las enzimas de restricción Xhol y Ncol (Roche Diagnostics, Manheim) y se fracciona mediante electroforesis en gel. El fragmento de ADN de aproximadamente 620 pares de base se purifica entonces de la agarosa, usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg). El plásmido PmetA metA de SEC ID NO: 16 se escindió mediante las enzimas de restricción Ncol y Spel (Rochel Diagnostics, Mannheim) . Posteriormente del fraccionamiento por electroforesis en gel, un fragmento de metA de aproximadamente 0.7 kb se purifica de la agarosa, usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. El vector pClik5MCS de SEC ID NO: 13 se corta mediante las enzimas de restricción Xhol y Spel (Roche Diagnostics, Mannheim) , y un fragmento de 5 kb se aisla, después de la fraccionación electroforética, usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. El fragmento del vector se liga junto con el fragmento PCR y el fragmento metA con la ayuda del Kit Ligación de ADN Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante, y la mezcla de ligación se transforma mediante métodos estándar como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning A Laboratiry Manual, Cold Spring Harbor (1989)), into competent E. Coli XL-lBlue .(Stratagene, La Jolla, USA). La selección para las células que hospedan el plásmido se logra colocando en placas agar LB que contiene kanamicina (20ug/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

El ADN plásmido se prepara por métodos y con materiales de Qiagen. Las secuencias de las reacciones se llevan a cabo de acuerdo al Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencias se fraccionan y evalúan por medio de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) . El plásmido obtenido, pCLiK5MCS PSODmetA se enlista como SEC ID NO: 21. Ejemplo 4: Preparación del plásmido pCLiK5MCS P EF-TU metA El ADN cromosómico ATCC 13032 de C. glutamicum se prepara de acuerdo a Tauch et al (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Usando los cebadores de oligonucleotidos de SEC ID NO: 22 y SEC ID NO: 23, el ADN cromosómico como plantilla y la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) , un fragmento de ADN de aproximadamente 200 pares de base de la región 5' no codificante (región promotora) de dismutasa de superoxido (Psod) se amplifican con ayuda de la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) por métodos estándar tal como Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Aplications, Academic Press. SEC ID NO: 22 5 " -GAGACTCGAGGGCCGTTACCCTGCGAATG-3 ' y SEC ID NO: 23 CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATTGTATGTCCTCCTGGAC-3 ' El fragmento de ADN obtenido se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freidburg) de acuerdo a la información del fabricante . Iniciando desde el plásmido de SEC ID NO: 16 PmetA metA como plantilla para una reacción PCR, el metA es parcialmente amplificado usado los cebadores de oligonucleotidos de SEC ID NO: 24 y SEC ID NO: 25. SEC ID NO: 24 5 ' -CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3 ' y SEC ID NO: 25 5'-CTGGGTACATTGCGGCCC-3' El fragmento de ADN que se obtiene de aproximadamente 470 pares de base se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™, de acuerdo a la información del fabricante . Los dos fragmentos obtenidos anteriormente se usan juntos como plantilla en una reacción PCR más. En el curso de la reacción de PCR, las secuencias metA homologas introducidas con el cebador de oligonucleotido de SEC ID NO: 18 causa que los dos fragmentos se sujeten uno al otro y se extiendan por la polimerasa usada para dar una hebra de ADN continua. El método estándar se modifica en lo que los cebadores de oligonucleotidos usados, SEC ID NO: 22 y SEC ID NO: 25 son únicamente adicionados a la mezcla de rección al inicio del segundo ciclo. El fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 675 pares de base se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™, de acuerdo a la información del fabricante. Subsecuentemente este se escindió mediante las enzimas de restricción Xhol y Ncol (Rochel Diagnostics, Mannheim) y se fracciona por electroforesis en gel . El fragmento de ADN de aproximadamente 620 pares de base se purifica entonces de la agarosa, usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. (Amersham Pharmacia, Freiburg) . El plásmido PmetA metA de SEC ID NO: 16 se escindió con las enzimas de restricción Ncol y Spel (Roche Diagnostics, Mannheim) . Después del fraccionamiento por electroforesis en gel, un fragmento metA de aproximadamente 0.7 kb se purifica de la agarosa usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. El fragmento del vector se liga junto con el fragmento PCR y el fragmento metA con la ayuda del Kit de Ligación de ADN Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante, y la mezcla de ligación se transforma mediante métodos estándar como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning A Laboratiry Manual, Cold Spring Harbor (1989)), into competent E. Coli XL-lBlue (Stratagene, La Jolla, USA) . La selección para las células que hospedan el plásmido se logra colocando placas en agar LB que contienen kanamicina (20ug/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190) . El ADN del plásmido se prepara por métodos y con materiales de Qiagen. Las reacciones de secuencia se llevan acabo de acuerdo al Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencias se fraccionan y evalúan por medio de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) . El plásmido obtenido, pCLiK5MCS P_EFTUmetA, se lista como SEC ID NO: 26. Ejemplo 5: Preparación del plásmido pCLiK5MCS Pgro metA El ADN cromosómico ATCC 13032 de C. glutamicum se prepara de acuerdo a Tauch et al (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Usando los cebadores de oligonucleotidos de SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28, el ADN cromosómico como plantilla y la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) , un fragmento de ADN de aproximadamente 200 pares de base de la región 5' no codificante (región promotora) del gen GroES (Pgro) se amplifica con ayuda de la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) por métodos estándar tal como Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Aplications, Academia Press. SEC ID NO: 27 5 ' -GAGACTCGAGCGGCTTAAAGTTTGGCTGCC-3 ' SEC ID NO: 28 5 ' -CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGATGAATCCCTCCATGAG-3 ' El fragmento de ADN obtenido se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante . Iniciando desde el plásmido PmetA metA como plantilla para una reacción PCR, el metA es parcialmente amplificado usando los cebadores de oligonucleotidos de SEC ID NO: 29 y SEC ID NO: 30. SEC ID NO: 29 5 ' -CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3 ' SEC ID NO: 30 5 ' -CTGGGTACATTGCGGCCC-3 ' El fragmento de ADN obtenido de aproximadamente 470 pares de base se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ de acuerdo a la información del fabricante. Los dos fragmentos obtenidos anteriormente se usan juntos como plantilla en una reacción de PCR más. En el curso de la reacción PCR, las secuencias homologas metA introducidas con el cebador oligonucleotido de SEC ID NO: 28 causa que los dos fragmentos se sujeten uno al otro y se extiendan mediante la polimerasa usada para dar una rama de ADN continua. El método estándar se modifica en lo que los cebadores de oligonucleotidos usados, SEC ID NO: 22 y SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 30 son únicamente adicionados a la mezcla de reacción al inicio del segundo ciclo. El fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 675 pares de base se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ de acuerdo a la información del fabricante. Este se escindió subsecuentemente por las enzimas de restricción Xhol y Ncol (Rochel Diagnostics, Mannheim) y se fracciona por eletroforesis en gel. El fragmento de ADN de aproximadamente 620 pares de base se purificda entonces de la agarosa, usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacy, Freiburg). El plásmido PmetA metA SEC ID NO: 16 se escindió mediante las enzimas de restricción Xhol y Spel (Roche Diagnostics, Mannheim) . Después del fraccionamiento by gel electrophoresis, un fragmento de metA de aproximadamente 0.7 kb se purifica de la agarosa usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. El vector pClik5MCS SEC ID NO: 13 se corta mediante las enzimas de restricción Xhol y Spel (Roche Diagnostics, Mannheim) y un fragmento de 5 kb se aisla, dspués de fraccionación electroforética, usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. El fragmento del vector se liga junto con el fragmento PCR y el fragmento metA con la ayuda del Kit de Ligación de ADN Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante, y la mezcla de ligación se transforma mediante métodos estándar como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning A Laboratiry Manual, Cold Spring Harbor (1989)), into competent E. Coli XL-lBlue (Stratagene, La Jolla, USA) . La selección para las células que hospedan el plásmido se logra colocando placas en agar LB que contienen kanamicina (20ug/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190) . El ADN plásmido se prepara por métodos y con materiales de Qiagen. Las reacciones de secuencia se llevan acabo de acuerdo al Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencias se fraccionan y evalúan por medios de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) . El plásmido obtenido, pCLiK5MCS Pgro metA, se lista como SEC ID NO: 31. Ejemplo 6: Preparación del plásmido P EF-TS metA El ADN cromosómico ATCC 13032 de C. glutamicum se prepara de acuerdo a Tauch et al (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Usando los cebadores de oligonucleotidos BK 1849 (SEC ID NO: 32) y BK 1862 (SEC ID NO: 33), el ADN cromosómico como plantilla y la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) , el gen MetaA el cual codifica la homoserina O-acetiltransferasa se amplifica con la ayuda de la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) por métodos estándar tal como Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Aplications, Academic Press. BK 1849 (SEC ID NO: 32) 5 ' -GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG-3 ' y BK1862 (SEC ID NO: 33) 5 ' -ATGCCCACCCTCGCGCC-3 ' El fragmento de ADN de aproximadamente 1134 bp obtenido se purifica usando el kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. Usando los cebadores de oligonucleotidos Haf 26 (SEC ID NO: 34) y Haf 27 (SEC ID NO: 35) , el ADN cromosómico como plantilla y la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) , un fragmento de ADN de aproximadamente 200 pares de base de la región 5 no codificada (región de la unidad de expresión) del gen que codifica el factor de elongación TS se amplifica con la ayuda de la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) por métodos estándar tal como en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Aplications, Academic Press. Haf 26 (SEC ID NO: 34) 5 ' -GAGAGGATCCCCCCACGACAATGGAAC-3 ' y Haf 27 (SEC ID NO: 35) 5 ' -CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATTACGGGGCGATCCTCCTTATG-3 ' El fragmento de ADN obtenido de aproximadamente 195 bp se purifica usando el kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. Los cebadores Haf 27 y BK 1862 comprenden una secuencia superpuesta y sus extremos 5' son homólogos uno con otro.

Los productos PCR obtenidos anteriormente se usan como plantillas para otro PCR el cual hace uso de los cebadores BK1849 (SEC ID NO: 32) y Haf 26 (SEC ID NO: 34) . Usando esta aproximación, se amplifica un fragmento de ADN el cual corresponde al tamaño esperado de 1329 bp . Esta fusión P EF-TS/metA se clona entonces vía los sitios de escisión de restricción Bamhl y Salí en el vector pClic 5a MCS (SEQ ID NO: 13) . El fragmento del vector se liga junto con el fragmento PCR y el fragmento metA con la ayuda del kit de Ligación de ADN Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante, y la mezcla de ligación se transforma por métodos estándar como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)), into competent E. Coli XL-lBlue (Stratagene, La Jolla, USA) . La selección para las células que hospedan el plásmido se logra colocando placas en agar LB que contiene kanamicina (20 µg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190). El ADN plásmido se prepara por métodos y con materiales de Qiagen. Las reacciones de secuencia se llevan acabo de acuerdo a Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencias se fraccionan y evalúan por medios de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) .

El plásmido resultante es referido como el pCLik 5a MCS P EF-TS metA (SEC ID NO: 36) . Ejemplo 7: Preparación del plásmido PEF-Tu pSOD metA (H473) El ADN cromosómico ATCC 13032 de C. glutamicum se prepara de acuerdo a Tauch et al (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Usando los cebadores de oligonucleotidos BK1753 (SEC ID NO: 37 y BK 1754 (SEC ID NO: 38) , el ADN cromosómico como plantilla y la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) , el terminador GroEL se amplificado con ayuda de la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) por métodos estándar tal como los descritos en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Aplications, Academic Press . BK 1753 (SEC ID NO: 37) GGATCTAGAGTTCTGTGAAAAACACCGTG BK 1754 (SEC ID NO: 38) GCGAC TAGTGCCCCACAAATAAAAAACAC El fragmento de ADN obtenido de aproximadamente 77 bp se purifica usando el kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante, se corta mediante las enzimas de restricción Xba I y Bcu I y se purifica una vez más.

El vector pClik5MCS (SEC ID NO: 13) se linealiza por la enzima de restricción Xbal y se purifica usando el kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. El vector linealizado se liga junto con el fragmento PCR con la ayuda del kit de Ligación de ADN Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante, y la mezcla de ligación se transforma por métodos estándar como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)), into competent E. Coli XL-lBlue (Stratagene, La Jolla, USA) . La selección para las células que hospedan el plásmido se logra colocando placas en agar LB que contiene kanamicina (20 µg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190). El ADN del plásmido se prepara por métodos y con materiales de Quiagen. Las reacciones de secuencia se llevan a cabo de acuerdo a Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencia se fraccionan y evalúan por medio de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstad) El plásmido resultante es referido como H247 (SEC ID NO: 39) Este plásmido se trata con las enzimas de restricción Bcul y Salí y se purifica usando el kit Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. Un pPCR que usa los oligonucleotidos BK 1848 (SEC ID NO: 40) y BK 1849 (SEC ID N0:41), el plásmido pClik5MCS Psod metA (SEC ID NO: 21) como plantilla y la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) se lleva a cabo por métodos estándar como se describen en Innis et al. (1990) (A Guide to Methods and Applications, Academic Press.). El fragmento amplificado tiene una longitud esperada de aproximadamente 1350 bp y se purifica usando el kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante, se corta por las enzimas de restricción Bcul y Salí y se purifica una vez más. Este fragmento se liga con el plásmido H247 (sitios de escisión Bcul y Salí) con la ayuda del kit de Ligación de ADN Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante, y la mezcla de ligación se transforma por métodos estándar como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)), into competent E. Coli XL-lBlue (Stratagene, La Jolla, USA) . La selección para las células que hospedan el plásmido se logra colocando placas en agar LB que contiene kanamicina (20 µg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190). El ADN plásmido se prepara por métodos y con materiales de Qiagen. Las reacciones de secuencia se llevan acabo de acuerdo a Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencia se fraccionan y evalúan por medio de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt). El plásmido resultante es referido como pG A4 (H344) y es listado bajo SEC ID NO: 42. SEC ID NO: 40 (BK 1848) GAGAACTAGTAGCTGCCAATTATTCCGGG SEC ID NO: 41 (BK 1849) GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG El plásmido pG A4 (SEC ID NO: 42) se corta por las enzimas de restricción Xhol y Bcul y se purifica usando el kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante . Construcción del H473 : El ADN cromosómico ATCC 13032 de C. glutamicum se prepara de acuerdo a Tauch et al (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Usando los cebadores de oligonucleotidos BK 1695 (SEC ID NO: 43) y Hafl6 (SEC ID NO: 44), el ADN cromosómico como plantilla y la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) , un fragmento de ADN de aproximadamente 182 pares de base de la región 5 " de no codificación (región de la unidad de expresión) del gen EF Tu (Peftu) se amplifica con ayuda de la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) por métodos estándar como se describe en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Aplications, Academic Press. SEC ID NO: 43 (BK1695) GAGACTCGAGGGCCGTTACCCTGCGAATG SEC ID NO: 44 (Haf 16) GAGAACTAGTGTGGCTACGACTTTCGCAGC El fragmento de ADN obtenido de aproximadamente 200 bp se purifica usando el kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante, se corta por las enzimas de restricción Xho I y Bcu I y se purifica una vez más. Este fragmento se liga con el plásmido pG A4 (H344) (sitios de escisión Xhol y Bcul) con la ayuda del kit de Ligación de ADN Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante, y la mezcla de ligación se transforma por métodos estándar como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)), into competent E. Coli XL-lBlue (Stratagene, La Jolla, USA) . La selección para las células que hospedan el plásmido se logra colocando placas en agar LB que contiene kanamicina (20µg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

El plásmido obtenido se refiere como pCIik5MCS Peftu Psod metA (H473) . Éste se lista bajo SEC ID NO: 45. Este comprende un promotor Peftu (desde 5' a 3'), una unidad de expresión Psod e inmediatamente corriente debajo de la misma la estructura de lectura abierta metA. Ejemplo: 8 Preparación del plásmido PsodPeftu metA (H505) El ADN cromosómico ATCC 13032 de C. glutamicum se prepara de acuerdo a Tauch et al (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Usando los cebadores de oligonucleotidos de SEC ID NO: 46 (Haf64) y SEC ID NO: 47 (Haf65) , el ADN cromosómico como plantilla y la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) , un fragmento de ADN de aproximadamente 200 pares de base de la región 5' de no codificación (región de la unidad de expresión) del gen EF Tu (Peftu) se amplifica con ayuda de la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) por métodos estándar como se describe en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press . SEC ID NO: 46 (Haf64) GAGAACTAGTGGCCGTTACCCTGCGAATG SEC ID NO: 47 (Haf65) GCGCGAGGGTGGGCATTGTATGTCCTCCTGGACTTC El fragmento de ADN obtenido de aproximadamente 200 bp se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. En un segundo PCR, usando los cebadores de oligonucleotidos BK1862 (SEC ID NO: 48) y BK 1849 (SEC ID NO: 49) y el plásmido H344 (SEQ ID NO: 42) como plantilla la estructura de lectura abierta metA se amplifica por métodos estándar como se describe en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. El fragmento obtenido de aproximadamente 1140 bp se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg), de acuerdo a la información del fabricante. SEC ID NO: 48 (BK1862) ATGCCCACCCTCGCGCC SEC ID NO: 49 (BK 1849) GTGTGTCGACTTAGATGTTAGAACTCGATGTAG Los dos fragmentos obtenidos anteriormente se usan juntos como una plantilla en una reacción PCR más. En el curso de la reacción PCR, las secuencias homologas metA introducidas con el cebador de oligonucleotido Haf 65 SEC ID NO: 47 provoca que los dos fragmentos se unan uno al otro y se extiendan por la polimerasa usada para dar una hebra de ADN continua. El método estándar se modifica en que el cebador de oligonucleotido usado, Haf 64 y BK 1849 SEC ID NO: 46 y SEC ID NO: 49 se agregan únicamente a la mezcla de la reacción al inicio del segundo ciclo. El fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 1350 pares de base se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. Este subsecuentemente se escindió por las enzimas de restricción Bcu I y Salí (Roche Diagnostics, Mannheim) y se fracciona mediante electroforesis en gel . El fragmento de ADN de aproximadamente 1340 pares de base se purifica entonces de la agarosa usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) . Este fragmento comprende la unidad de expresión Petfu fusionada a el metA ORF (= fragmento Petfu-metA) . Usando los cebadores de oligonucleotidos BK 1697 (SEC ID NO: 50) y Hafl7 (SEC ID NO: 51), el ADN cromosómico como plantilla y la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) , un fragmento de ADN (longitud total: 193 bp, 173 del mismo siendo pSOD) de la región 5 " de no codificación (región de la unidad de expresión) del gen SOD (Psod) se amplificado con ayuda de la reacción de la cadena de la polimerasa (PCR) por métodos estándar como se describe en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press . SEC ID NO: 50 (BK 1697) GAGACTCGAGAGCTGCCAATTATTCCGGG SEC ID NO: 51 (Haf, 17) GAGAACTAGTTAGGTTTCCGCACCGAGC El fragmento de ADN amplificado se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. Este subsecuentemente se escindió por las enzimas de restricción Xhol y Bcul (Roche Diagnostics, Mannheim) y se fracciona mediante electroforesis en gel . El fragmento de ADN de aproximadamente 180 pares de base se purifica entonces de la agarosa usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) (= fragmento Psod) . El plásmido (H344) pG A4 SEC ID NO: 42 es escindió por las enzimas de restricción Xhol y Salí (Roche Diagnostics, Mannheim) y se fracciona mediante electroforesis en gel. El vector linealizado se purificado entonces de la agarosa usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) .

El vector linealizado se liga con los dos fragmentos (el fragmento Petfu-metA y el fragmento Psod) con la ayuda del kit de Ligación de ADN Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante, y la mezcla de ligación se transforma por métodos estándar como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)), into competent E. Coli XL-lBlue (Stratagene, La Jolla, USA) . La selección para las células que hospedan el plásmido se logra colocando placas en agar LB que contiene kanamicina (20 µg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190) . El ADN del plásmido se prepara por métodos y con materiales de Qiagen. Las reacciones de secuencia se llevan acabo de acuerdo a Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencia se fraccionan y evalúan por medio de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) . El plásmido resultante, pClik5MCS Psod Peftu metA, es lista como SEC ID NO: 52 Ej emplo 9 : Preparación del plásmido pClik5MCS Psgro Psod metA (H472) El ADN cromosómico ATCC 13032 de C. glutamicum se prepara de acuerdo a Tauch et al (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Usando los cebadores de oligonucleotidos de SEC ID NO: 53 (BK 1701) y SEC ID NO: 54 (Haf 18) , el ADN cromosómico como plantilla y la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) , un fragmento de ADN de de aproximadamente 175 nucleótidos se amplifica con ayuda de la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) por métodos estándar como se describe en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Aplications, Academic Press. Este comprende 155 pares de base de la región 5' de no codificación (región de la unidad de expresión) del gen GRO EL (Pgro) y un sitio de escisión de restricción en cada uno de los extremos 5 'y 3' (Xhol y Bcul, respectivamente) . SEC ID NO:53 (BK 1701) GAGACTCGAGCGGCTTAAATTTGGCTGCC . SEC ID NO: 54 (Haf 018) GAGAACTAGTATTTTGTGTGTGCCGGTTGTG El fragmento de ADN obtenido de aproximadamente 175 bp se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. Este subsecuentemente se escindió por las enzimas de restricción Xhol y Bcul (Roche Diagnostics, Mannheim) , y el fragmento de ADN se purificada usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. El plásmido H344 (SEC ID NO: 42) se corta mediante las enzimas de restricción Xhol y Bcul, y un fragmento de aproximadamente 6.4 kb se aisla, posteriormente del fraccionamiento electroforético electroforica, usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. El producto PCR y el plásmido H344 abierto por corte se ligan con la ayuda del kit de Ligación de ADN Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante, y la mezcla de ligación se transforma por métodos estándar como se describe en Sambrook et al . (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)), into competent E. Coli XL-lBlue (Stratagene, La Jolla, USA) . La selección para las células que hospedan el plásmido se logra colocando placas en agar LB que contiene kanamicina (20 µg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190). El ADN del plásmido se prepara por métodos y con materiales de Qiagen. Las reacciones de secuencia se llevan acabo de acuerdo a Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencia se fraccionan y evalúan por medios de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) . El plásmido resultante comprende un promotor Pgro inmediatamente seguido por una unidad de expresión Psod y el metA ORF. Este se lista como pCLiK5MCS PgroPsod metA (H472) bajo SEC ID NO: 55 Ejemplo 10: Preparación del plásmido PgroPsod Pefts metA (H501) Una PCR que usa los cebadores de oligonucleotidos BK1782 (SEC ID NO: 56) y Haf63 (SEC ID NO: 57) y el plásmido pClik5MCS Pgro Psod metA (SEC ID NO: 55 (H472)) como plantilla se lleva acabo por métodos estándar como se describe en Innis et al. PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. El fragmento amplficado comprende aproximadamente 474 pares de base y un cásete Pgro-Psod con un sitio de escisión del Acc651 el extremo 3'. El fragmento de ADN obtenido se purifica usando el Kit de Purificación de Banda de Gel y ADN, PCR, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) . Este subsecuentemente se escinde por las enzimas de restricción Xhol y Acc651, y el fragmento de ADN (333 pares de base) se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. SEC ID NO: 56 (BK 1782) TCGAGAGATTGGATTCTTAC SEC ID NO: 57 (Haf 63) TCTCGGTACCCCGCACCGAGCATATACATC El plásmido H479 (SEC ID NO: 58) comprende la unidad de expresión Pefts fusionada a la metA ORF. Este se corta (directamente corriente arriba de la pefts) mediante las enzimas de restricción Xhol y Acc651, y un fragmento de aproximadamente 6.4 kb se aisla, después de fraccionamiento electroforético, usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. Este entonces se liga con el fragmento PCR (cásete Pgro-Psod) con la ayuda del kit de Ligación de ADN Rápido (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante, y la mezcla de ligación se transforma por métodos estándar como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)), into competent E. Coli XL-lBlue (Stratagene, La Jolla, USA) . La selección para las células que hospedan el plásmido se logra colocando placas en agar LB que contiene kanamicina (20 µg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190). El ADN del plásmido se prepara por métodos y con materiales de Qiagen. Las reacciones de secuencia se llevan acabo de acuerdo a Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencias se fraccionan y evalúan por medios de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) . El plásmido resultante comprende los 3 promotores, Pgro, Psod y P EF-Ts, fusionados al metA ORF. Este es listado como pCLiK5MCS Pgro Psod Pefts metA (H501) bajo SEC ID NO: 59. Ejemplo 11: Preparación del plásmido Peftu Psod Pefts metA (H502) Un PCR que usa los cebadores de oligonucleotidos BK1782 (SEC ID NO: 56) y Haf63 (SEC ID NO: 57) y el plásmido PClik5MCS Peftu Psod (SEC ID NO: 55 (H472)) como plantilla se lleva acabo por métodos estándar como se describe en Innis et al. PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. El fragmento amplificado comprende aproximadamente 495 pares de base y un cásete Peftu-Psod con un sitio de escisión Acc651 al extremo 3'. El fragmento de ADN obtenido se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. Este subsecuentemente se escindió por las enzimas de restricción Xhol y Acc651, y el fragmento de ADN (354 pares de base) se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. SEC ID NO: 56 (BK 1782) TCGAGAGATTGGATTCTTAC SEC ID NO: 57 (Haf 63) TCTCGGTACCCCGCACCGAGCATATACATC El plásmido H479 (SEC ID NO: 58) comprende la unidad de expresión Pefts fusionada al metA ORF. Este se corta (directamente corriente arriba de Pefts) por las enzimas de restricción Xhol y Acc651, y un fragmento de aproximadamente 6.4 kb se aisla, después del fraccionamiento electroforético, usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™. Este es posteriormente ligado con el fragmento PCR (cásete Peftu-Psod) con la ayuda del kit de Ligación de ADN Rápido (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante, y la mezcla de ligación se transforma por métodos estándar como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)), into competent E. Coli XL-lBlue (Stratagene, La Jolla, USA) . La selección para las células que hospedan el plásmido se logra colocando placas en agar LB que contienen kanamicina (20 µg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190). El ADN del plásmido se prepara por métodos y con materiales de Qiagen. Las reacciones de secuencia se llevan acabo de acuerdo a Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencias se fraccionan y evalúan por medio de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) . El plásmido resultante comprende las 3 secuencias reguladoras, Peftu, Psod y P EF-Ts, fusionadas al metA ORF.

Este se lista como pCLiK5MCS Peftu Psod Pefts metA (H501) bajo SEC ID NO: 60. Ejemplo 12: Medición de las actividades de metA La cepa ATCC13032 de Corynebacterium Glutamicum se transforma en cada caso con los plasmidos pClik5MCS, pClik MCS Psod metA, pClik MCS Peftu metA, pClik5 MCS Pefts metA, pClik5 MCS Peftu Psod metA, pClik5 MCS Psod Peftu metA, pClik5 MCS Pgro Psod meta, pClik5 MCS Pgro Psod Pefts metA, pClik5 MCS Peftu Psod Pefts metA de acuerdo al método descrito (Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303). La mezcla de transformación se coloca en placas o placas CM las cuales contienen adicionalmente 20 mg/l de kanamicina para lograr la selección de las células que contienen los plásmidos. Los clones resistentes al Kan obtenidos se recolectaron y se diluyeron. Las cepas de C. glutamicum que comprenden cualquiera de dichas estructuras de plásmidos crecen en medio de MMA ( (40 g/1 de sucrosa, 20 g/1 (NH4)2S04, 1 g/1 KH2P04, 1 g/1 K2HP04, 0.25 g/MgS04 x 7 H20, 54 g de Aces, 1 ml de CaCl2 (10 g/1), 1 ml de protocatecuate (300 mg/10 ml) , 1 ml de solución de elemtnos de trazas (10 g/1 FeS04 x H20, 10 g/1 MnS04 x H20, 2 g/1 ZnS04 x 7 H20, 0.2 g/1 CuS04, 0.02 g/1 NiCl2 x 6 H20) , 100 µg/1 de vitamina Bi2 , 0.3 mg/l de tiamina, 1 mM de leucina, 1 mg/l de HCl piridoxal, 1 ml de biotina (100 mg/l), pH 7.0) a 30 C durante la noche. Las células se remueven por centrifugación a 4 °C y se enjuagan dos veces con amortiguador Tris-HCl frió (0.1%, pH 8.0). Después de otra centrifugación, las células se llevan en amortiguador Tris-HCl frió (0.1%, pH 0.8) y el OD60o se ajusta a 160. Las células se rompieron transfiriendo 1 ml de esta suspensión celular a tubo de 2-ml Hybad Ribolyser y se lisaron tres veces 30 s en cada caso en un Hybad Ribolyser, con el conjunto de rotación en 6.0. El lisado se clarifica por centrifugación en una centrifuga Eppendorf a 15 000 rpm y 4 °C por 30 minutos, y el sobrenadante se transfiere a un nuevo vaso Eppendorf. El contenido de proteína se determina de acuerdo a Bradford, M.M.. (1976) Anal. Biochem. 72:248-254. La actividad enzimática del Met A se lleva acabo de la siguiente manera. Las mezclas de reacción de lml contienen 100 mM de amortiguador de fosfato de potasio (pH 7.5), 5 mM de MgCl2, 100 µM de acetil-CoA, 5 mM de L-homoserina, 500 µM de DTNB (reactivo de Ellmants) y extracto celular. El ensayo inicia agregando el lisado de proteina relevante y se incuba a temperatura ambiente. Las cinéticas se registran entonces a 412 nm por 10 min. Los resultados son describen en la Tabla la.

Tabla la Es posible modular la actividad del MetA usando las varias combinaciones de unidades promotoras /de expresión. Ejemplo 13: Construcción del plásmido pCIS lysC Para generar una cepa que produce lisina, se lleva a cabo una substitución alélica del gen de tipo nativo lysC en ATCC13032 Corynebacterium glutamicum. Esto involucra una substitución de nucleótido en el gen lysC de manera que el aminoácido Thr en la posición 311 se reemplaza por un lie en la proteína resultante. Iniciando del ADN cromosómico del ATCC13032 como plantilla para una reacción PCR, el lysc se amplifica con la ayuda de los Sistemas PCR Pfu-Turbo (Stratagene USA) usando los cebadores de oligonucleotidos de SEC ID NO: 61 y SEC ID NO: 62, de acuerdo a la información del fabricante . SEC ID NO: 61 5 ' -GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3 ' SEC ID NO: 62 5 ' -CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3 " El ADN cromosómico ATCC 13032 de C. glutamicum se prepara de acuerdo a Tauch et al (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. El fragmento amplificado se flanquea por un corte de restricción Salí en su extremo 5' y por un corte de restricción Mlul en su extremo 3'. Antes de la clonación, el fragmento amplificado se digiere por estas dos enzimas de restricción y se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) . El polinucleotido obtenido se clona via los cortes de restricción Salí y Mlul en pCLIK5 MCS integrative SacB, referido de aquí en adelante como pCIS (SEC ID NO: 63), y se transforma en azul de E. Coli XL-1. La selección de las células que hospedan el plásmido se logra colocando placas en agar LB que contiene kanamicina (20 µg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190) . El plásmido se aisla y la secuencia de nucleótido esperada se confirma mediante secuenciación. El ADN plásmido se prepara por métodos y con materiales de Quiagen. Las reacciones de secuencia se llevan acabo de acuerdo a Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencia se fraccionan y evalúan por medio de ABI Prism 377 (PE Applied Byosistems, Weiterstadt) . El plásmido obtenido, pCIS lysC, se lista como SEC ID NO: 64. Ejemplo 14: Mutagenesis del gen lysC de C. glutamicum La mutagenesis dirigida del gen lysC de C. glutamicum se lleva acabo usando el kit de Cambio Rápido (Stratagene/USA) de acuerdo a la información del fabricante. La mutagenesis se lleva acabo en el plásmido lysC pCIS, SEC ID NO: 64. Para remplazar el thr 311 con el ile 311 con la ayuda del método de Cambio Rápido o Quick-Change (Stratagene) , se sintetizan los siguientes cebadores de oligonucleotidos: SEC ID NO: 65 5 ' -CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG-3 ' SEC ID NO: 66 5 ' -CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCCGGTGGTGCCG-3 " El uso de estos cebadores de oligonucleotidos en la reacción de Cambio Rápido resulta en una substitución del nucleótido en la posición 932 (desde C hasta T) en el gen lysC SEC ID NO: 67. La substitución del aminoácido resultante, Thr31111e, en el gen lysC se confirma por una reacción de secuenciación, después de la transformación en azul de E.Coli XL-1 y la preparación de plásmido. El plásmido se denota pCIS lysC thr311ile y se lista como SEC ID NO: 68. El plásmido pCiS lysC thr311 se transforma en ATCC13032 de C. glutamicum por medio de electroporación como se describe en Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303. Las modificaciones del protocolo se describen en DE 10046870. El arreglo cromosómico del sitio del lysC de transformantes individuales se verifican por métodos estándar a través del manchado Southern e hibridación, como se describe en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor. Esto asegura que los transformantes tienen integrado el plásmido transformado al sitio del lysC a manera de recombinación homologa. Después del crecimiento de colonias en media que no contiene ningún antibiótico durante la noche, las células se colocan sobre placas en un medio de agar CM de sucrosa (sucrosa al 10%, 10 g/1 de glucosa; 2.5 g/1 NaCl; 2 g/1 de urea, 10 g/1 Bacto peptone (Difco) ; 10 g/1 de extracto de levadura, 22.0 g/1 de Agar (Difco)) y se incuban a 30°C por 24 hrs. Puesto que el gen sacB presente en el vector pCIS LysC thr311ile convierte la sucrosa en un producto toxico, solamente aquellas colonias pueden crecer en cual el gen sacB se ha eliminado por una segundo paso de recombinación homologo entre el gen lysC de tipo nativo y el gen thr311 lysC mutado. Esto es posible durante la recombinación homologa, por el gen de tipo nativo o el gen mutado a eliminarse junto con el gen sacB. Si el gen sacB se remueve junto con el gen de tipo nativo, el resultado es un transformante mutado. El crecimiento de las colonias se recoge y se prueba para un fenotipo sensible a la kanamicina. Los clones con el gen sacB eliminado deben, al mismo tiempo, presentar comportamiento de crecimiento sensitivo a la kanamicina. Tales clones sensitivos a la Kan se prueban en un frasco agitador para su productividad de lisina. (vea Ejemplo 19) . El ATCC13032 de C. glutamicum crece en comparación al no tratado. Se seleccionan los clones que tienen producción de lisina incrementada, el ADN cromosómico se recupera y la región correspondiente del gen lysC se amplifica mediante una reacción PCR y una secuencia. Un clon de este tipo, el cual tiene la propiedad de síntesis de lisina incrementada y una mutación detectada en el lysC en la posición 932, se denota ATCC13032 lysCfbr. Ejemplo 15: Preparación del plásmido pCIS Pesftu ddh El ADN cromosómico ATCC 13032 de C. glutamicum se prepara de acuerdo a Tauch et al (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Usando los cebadores de oligonucleotidos de SEC ID NO: 69 (Oíd 38) y SEC ID NO: 70 (Oíd 39) , el ADN cromosómico como plantilla y la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) , un fragmento de ADN de aproximadamente 200 pares de base de la región 5' de no codificación (región de la unidad de expresión) del gen EFTu (Peftu) se amplifica con ayuda de la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) por métodos estándar como se describe en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Aplications, Academic Press. SEC ID NO: 69 (Oíd 38) ACATCCATGGTGGCCGTTACCCTGCGAAT SEC ID NO: 70 (Oíd 39) TGTATGTCCTCCTGGACTTC El fragmento de ADN obtenido de aproximadamente 200 bp se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. En un segunda PCR, usando los cebadores de oligonucleotidos Oíd 40 (SEC ID NO: 71) y SEC ID NO: 72 (01d37) y el ADN cromosómico ATCC 13032 de C. glutamicum como plantilla, la estructura de lectura abierta ddh se amplifica por métodos estándar como se describe en Innis et al. (1990) (A Guide to Methods and Applications, Academic Press.). El fragmento obtenido de aproximadamente 1017 bp se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante . Oíd 40 (SEC ID NO: 71) GAAGTCCAGGAGGACATACAATGACCAACATCCGCGTAGC Oíd 37 (SEC ID NO: 72) GAAACCACACTGTTTCCTTGC Los dos fragmentos obtenidos anteriormente se usan como plantilla en una reacción PCR más. En el curso de la reacción PCR, las secuencias de Peftu homologas introducidas con el cebador de oligonucleotido Oíd SEC ID NO: 71 provoca que los dos fragmentos se unan uno al otro y se extiendan por medio de la polimerasa usada para dar una rama de ADN continua. El método estándar se modifica en que el cebador de oligonucleotido usado, Haf 64 y BK 1849 (SEC ID NO: 72 y SEC ID NO: 69 se agregan únicamente a la mezcla de reacción al inicio del segundo ciclo. El fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 1207 pares de base se purifica usando el Kit de Purificación de Banda de Gel y ADN, PCR, GFX™ de acuerdo a la información del fabricante. Este subsecuentemente se escindió por las enzimas de restricción Ncol y Xholl (Roche Diagnostics, Mannheim) , y se fracciona por de electroforesis en gel. El fragmento de ADN de aproximadamente 1174 pares de base se purifica entonces a partir de la agarosa, usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg). Este fragmento comprende la unidad de expresión Peftu fusionada al ddh ORF (=fragmento Peftu-ddh) . Usando los cebadores de olígonucleotidos Oíd 32 (SEC ID NO: 73) y Oíd 33 (SEC ID NO: 74), el ADN cromosómico como plantilla y la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) , un fragmento de ADN de la región 5' de no codificación del gen ddh se amplifica con ayuda de la reacción de la cadena de la polimerasa (PCR) por métodos estándar como se describe en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. SEC ID 73 (Oíd 32) ATCAACGCGTCGACACCACATCATCAATCAC SEC ID NO: 74 (0ld33) ATCACCATGGGTTCTTGTAATCCTCCAAAATTG El fragmento de ADN amplificado se purifica usando el Kit de Purificación de Banda de Gel y ADN, PCR, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. Este subsecuentemente se escindió por las enzimas de restricción Mlul y Ncol (Roche Diagnostics, Mannheim) , y se fracciona mediante electroforesis en gel. El fragmento de ADN de aproximadamente 720 bp se purifica entonces a partir de la agarosa, usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) (= fragmento ddh). El plásmido pCIS (SEC ID NO: 63) se escindió mediante las enzimas de restricción Mlul y Xhol (Roche Diagnostics, Mannheim), y se fracciona mediante electroforesis en gel. El vector linealizado se purifica entonces de la agarosa, usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) . El vector linealizado se liga con los dos fragmentos (el fragmento Peftu-ddh y el fragmento ddh 5') con la ayuda del kit de Ligación de ADN Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante, y la mezcla de ligación se transforma por métodos estándar como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)), into competent E. Coli XL-lBlue (Stratagene, La Jolla, USA) . La selección de las células que hospedan el plásmido se logra colocando placas en agar LB que contiene kanamicina (20 µg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190) . El ADN del plásmido se prepara por métodos y con materiales de Qiagen. Las reacciones de secuencia se llevan acabo de acuerdo a Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencia se fraccionan y evalúan por medio de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) . El plásmido resultante pCIS Peftu ddh, se lista como SEC ID NO: 75. Ejemplo 16: Preparación del pCIS PeftuPsod ddh El ADN cromosómico ATCC 13032 de C. glutamicum se prepara de acuerdo a Tauch et al (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Usando los cebadores de oligonucleotidos de SEC ID NO: 76 y SEC ID NO: 77, el ADN cromosómico como plantilla y la polimersa Pfu Turbo (Stratagene) , un fragmento de ADN de aproximadamente 677 pares de base de la región 5' del gen ddh se amplifica con ayuda de la reacción de cadena de polimerasa (PCR) por métodos estándar como se describe en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (5' fragmento ddh 5") . SEC ID NO: 76 (CK461) CCTGACGTCGCAATATAGGCAGCTGAATC SEC ID NO: 77 (CK466) GCCCAATTGGTTCTTGTAATCCTCCAAAA El fragmento de ADN amplificado se purifica usando el Kit de Purificación de Banda de Gel y ADN, PCR, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. Este subsecuentemente se escindió por las enzimas de restricción Aatll y Munl (Roche Diagnostics, Mannheim) , y se fracciona mediante electroforesis en gel . El fragmento de ADN de aproximadamente 661 pares de base se purifica entonces de la agarosa, usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) . El fragmento resultante comprende la región 5 'del ddh ORF. Iniciando desde el plásmido P EF-Tu pSOD metA (H473) (SEC ID NO: 45) como plantilla para una reacción PCR, un cásete PeftuPsod se amplifica usando los cebadores de oligonucleotidos de SEC ID NO: 78 y SEC ID NO: 79. SEC ID NO: 78 (CK426) CGCCAATTGTCGAGGGCCGTTACCCT SEC ID NO: 79 (CK463) CGTACGCGGATGTTGGTCATGGGTAAAAAATCCTTTCGTA El fragmento de ADN obtenido de aproximadamente 378 pares de base se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ de acuerdo a la información del fabricante . El ddh ORF se amplifica en una PCR subsecuente. Para este propósito el ADN cromosómico ATCC 13032 de C. glutamicum se prepara de acuerdo a Tauch et al (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Usando los cebadores de oligonucleotidos de SEC ID NO: 80 (CK464) y SEC ID NO: 81 (CK467), el ADN cromosómico como plantilla y la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) , un fragmento de ADN de aproximadamente 992 pares de base (ddh ORF) se amplifica con ayuda de la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) de acuerdo a métodos estándar como se describe en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. El fragmento de ADN amplificado se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ de acuerdo a la información del fabricante. SEC ID NO: 80 (CK464) TACGAAAGGATTTTTTACCCATGACCAACATCCGCGTAGC SEC ID NO: 84 (CK467) AGACCCGGGTTAGACGTCGCGTGCGATCA Los dos fragmentos obtenidos anteriormente (cásete Peftu Psod y ddh ORF) se usan como plantilla en una reacción PCR más. En el curso de la reacción PCR, las secuencias Psod homologas introducidas con el cebador de oligonucleotido SEC ID NO: 80 (CK464) provoca que los dos fragmentos se unan uno al otro y se extiendan por medio de la polimerasa usada para dar una rama de ADN continua. El método estándar se modifica en que el cebador de oligonucleotido usado, SEC ID NO: 79 (CK426) y SEC ID NO: 81 (CK 467), se agregan únicamente a la mezcla de reacción al inicio del segundo ciclo.

El fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 1359 pares de base se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ de acuerdo a la información del fabricante . Este subsecuentemente se escindió por las enzimas de restricción Munl y Smal (Roche Diagnostics, Mannheim) , y se fracciona por electroforesis en gel . El fragmento de ADN de aproximadamente 1359 pares de base se purifica entonces de la agarosa, usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) . El fragmento resultante comprende (de 5' a 3') un promotor Peftu, una unidad de expesión Psod e, inmediatamente corriente abajo del mismo, la estructura de lectura abierta ddh (PeftuPsod ddh) . El vector pCIS se corta mediante las endonucleasas de restricción Aatll y Smal y se desfosforila por fosfatasa álcali (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante. Después de la electroforesis en un gel de agarosa de fuerza de 0.8%, el vector linealizado (aproximadamente 4.2 kb) se aisla usando el Kit de Purificación de PCR, ADN y Banda de Gel, GFX™ (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acuerdo a la información del fabricante. Este fragmento del vector se liga con los dos fragmentos de la PCR de corte (5 'ddh y PeftuPsod ddh) con la ayuda del kit de ligación Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acuerdo a la información del fabricante y la mezcla de ligación se transforma por métodos estándar como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)), into competent E. Coli XL-lBlue (Stratagene, La Jolla, USA) . La selección de las células que hospedan el plásmido se logra colocando placas en agar LB que contiene kanamicina (20 µg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190) . El ADN plásmido de clones individuales se aisla usando el kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Germany) de acuerdo a la información del fabricante y se verifica vía digestiones de restricción. Los dos plásmidos correctos son secuenciados. Las reacciones de secuencia se llevan acabo de acuerdo a Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencia se fraccionan y evalúan por medio de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) : El plásmido resultante, pClik Peftu Psod ddh, es conveniente para integrar el cásete Peftu Psod de manera cromosómica corriente arriba del ddh ORF con la ayuda de dos eventos de recombinación sucesivos. El plásmido pCIS PeftuPsod ddh se lista como SEC ID NO: 82. Ejemplo 17: Generación de las cepas ATCC13032 lysCfbr Peftu ddh y ATCC13032 lysCfbr PesftuPsod ddh. Las células de la cepa Mn522 de E. Coli (Stratagene, Ámsterdam, The Netherlands) se transforman con cualquiera de los plásmidos pCIS Peftu ddh y pCIS PeftuPsod ddh y con el plásmido pTcl5AcgIM de acuerdo a Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303. El plásmido pTcl5AcgIM permite que el ADN sea metilado de acuerdo al patrón de metilación de Corynebacterium glutamicum (DE 10046870) . Esta metilación incrementa la estabilidad de los plásmidos pCIS Peftu ddh y pCIS Peftu Psod ddh en las células de C. glutamicum. El ADN plásmido subsecuentemente se aisla de las células Mn522 por métodos estándar y se introduce con la ayuda de electroporación en la cepa ATCC 13032 ask (fbr) de C. glutamicum descrita anteriormente. Dicha electroporación y la selección subsecuente en las placas CM que contienen kanamicina (25 ug/ml) producen una pluralidad de transconjugantes. Para seleccionar el segundo evento de recombinación el cual debe cortar al vector, dichos transconjugantes crecen en medio CM sin kanamicina durante la noche y subsecuentemente se colocan en placas en placas CM que contienen sucrosa al 10% para la selección. El gen sacB presente en el vector pCIS codifica la enzima levan sucrasa y, con crecimiento sucrosa, lleva a la síntesis de levan.

Dado que el levan es toxico para el C. glutamicum, únicamente las células de C. glutamicum las cuales han perdido el plásmido de integración debido al segundo paso de recombinación crecen en medio que contiene sucrosa (Jáger et al., Journal, of Bacteriology 174 (1992) 5462-5466). 100 clones resistentes a la sucrosa se verifican por su sensibilidad a la kanamicina. En una pluralidad de clones probados, también se detecto una sensibilidad a la kanamicina, además de resistencia a la sucrosa la cual se espera con la escisión deseada de las secuencias del vector. La reacción de la cadena de polimerasa (PCR) se utiliza para verificar que la integración deseada de la unidad de expresión PeftuPsod o Peftu haya ocurrido. Para este fin, los clones particulares se retiran de la placa de agar usando un palillo y se suspenden en 100 µl de H20 y y se ponen a hervir a 95 °C por 10 minutos. 10 µl de la solución obtenida se usan en cada caso como plantilla en la PCR. Los cebadores usados son oligonucleotidos los cuales son homólogos a la unidad de expresión que se introduce y al gen ddh. Las condiciones de la PCR se eligen de las siguientes forma: desnaturalización inicial: 5 min a 95°C; desnaturalización: 30 s a 95°C; hibridación: 30 s a 55°C; amplificación: 2 min a 72°C; 30 ciclos: extensión final: 5 min a 72 °C. En la mezcla de la reacción que contiene al 7ADN de la cepa de inicio, la selección de oligonucleotidos no produce ningún producto de la PCR. Únicamente se espera una banda para los clones en los cuales las unidades de expresión Peftu y PeftuPsod han sido integradas en la posición 5' inmediatamente del gen ddh como un resultado de la segunda recombinación. La integración exitosa a través de los clones positivos probados aquí se confirmo también además a través de Análisis de Manchado Southern (por métodos estándar como los descritos, por ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual Cold Spring Harbor, (1989) . Aquí, se llevan a cabo dos hidrólisis diferentes con enzimas de restricción, para cada cepa generada, los cuales permitirán a la cepa de inicio (ATCC13032 ask (fbr) ) y a la cepa deseada distinguirse de manera inequívoca. El hecho de que las cepas obtenidas no tienen ningún gen de kanamicina en el cromosoma se confirmo además con la ayuda de una sonda la cual es homologa al gen resistente a la kanamicina. De tal modo, se generaron las siguientes cepas: ATCC13032 lysCfbr Peftu ddh ATCC13032 lysCfbr Peftu Psod ddh Todas estas cepas comprenden un gen ask de retroalimentación. desregulado y por lo tanto producen lisina. Ellas difieren una de la otra únicamente por la unidad reguladora que controla la transcripción del gen ddh.

Ejemplo 18: Efecto del reforzamiento del ddh mediante un promotor doble en la producción de lisina. Para estudiar el efecto del reforzamiento del gen ddh con la ayuda de un promotor doble, se probaron las siguientes cepas para la producción de lisina. ATCC13032 lysCfbr ATCC13032 lysCfbr Peftu ddh ATCC13032 lysCfbr Peftu Psod ddh Para este propósito, las cepas crecen en placas con CM (10.0 g/L de D-glucosa, 2.5 g/L de NaCl , 2.0 g/L de urea, 10 g/L de Bacto Peptone (Difco), 5.0 g/L de extracto de levadura (Difco) 5.0 g/L de extracto de carne (Difco), 22.0 g/L de Agar (Difco), se sometió a autoclave (20 min, 121°C)) a 30°C por tres días. Las células entonces se retiran de la placa y se suspenden nuevamente en solución salina. Para el cultivo principal, se inoculan 10 ml de medio I y 0.5 g de CaC03 se sometió a autoclave (Riedel de Haen) con la suspensión celular a un OD60o de 1.5 en un matraz Erlenmeyer de 100 ml y se incuban en an infors AJÍ18 (Infors, Bottmingen, Zwitzerland) a 220 rpm por 40 h. Esto es acompañado por la determinación de la concentración de la lisina secretada en el medio. Medio I : 40 g/1 Sucrosa 60 g/1 Melazas (en base al 100% de contenido de azúcar) 10 g/1 (NH4)2S04 0.4 g/1 MgS04 x 7H20 0.6 g/1 KH2P04 0.3 mg/l Tiamina *HC1 1 mg/l Biotina (de una solución madre de 1 mg/ml la cual ha sido esterilizada por filtración y ajustada a un pH de 8.0 con NH4OH 2 mg/l FeS04 2 mg/l MnS04 Ajustado a un pH de 7.8 con NH4OH, se sometió a autoclave (121°C, 20 min) Adicionalmente, se agrega vitamina B12 (hidroxicobalamina, Sigma Chemicals) de una solución madre (200 µg/ml, esterilizada por filtración) hasta una concentración final de 100 µg/1. La concentración de aminoácido se determina por medio de cromatografía liquida de alta presión de acuerdo a Agilent en un Sistema de HPLC LC de 1100 Series Agilent. Una derivación de la columna de resguardo con orto-ftalaldehído permite la cuantificación de los aminoácidos formados, y la mezcla de aminoácido se fracciona en una columan AA Hypersil (Agilent) .

El resultado del estudio se describe en la siguiente tabla.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES 1. Una unidad de expresión recombinante que comprende un promotor múltiple, caracterizada porque comprende, en la dirección 5 '-3', un modulo de secuencia de la siguiente fórmula I : 5'-P?-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3' (I) donde n es un entero de 0 a 10, Ax y Ay son idénticos o diferentes y son un enlace químico o una secuencia de ácido nucleico del enlazador; Pi, Px y P codifican secuencias del promotor idénticas o diferentes de la misma o de diferentes bacterias corineformes, los cuales que comprenden al menos una sección de enlace de polimerasa de ARN; y al menos Py comprende una sección de secuencia 3 '-terminal que media el enlace del ribosoma.
2. 2. La unidad de expresión de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizada porque Plf Px y Py se derivan en cada caso de una secuencia contigua de desde 35 a 500 residuos de nucleótidos, los cuales se localizan en la posición 5 " corriente arriba de la secuencia de codificación de una proteína en el genoma del organismo.
3. 3. La unidad de expresión de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque Pi, Px y Py son de manera independiente uno de otro, seleccionados de entre secuencias promotoras para la secuencia de codificación de una proteína con abundancia alta en un organismo. 4. La unidad de expresión de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque Pi, Px y Py se seleccionan independientemente uno de otro de entre la SEC ID NO: 1, SEC ID NO : 2 , SEC ID NO : 3 y SEC ID NO :
4. 4.
5. 5. La unidad de expresión de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque los promotores se seleccionan de entre promotores fuertes, constitutivos o regulables.
6. 6. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende, en la dirección 5 '-3', un modulo de secuencia de la siguiente fórmula II: 5'-P!-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-G-3' (II) donde n, AX; Ay, Pi, Px, y Py son iguales que los mismos que se definieron anteriormente, y G es al menos una secuencia de ácido nucleico de codificación, que se enlaza de manera funcional a la secuencia reguladora en la posición 5' corriente arriba.
7. 7. El cásete de expresión de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizado porque G se selecciona de entre a) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, b) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de nucleótidos y nucleósidos, c) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de ácidos orgánicos, d) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de lípidos y ácidos grasos e) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de dioles f) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de carbohidratos, g) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de compuestos aromáticos, h) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de vitaminas, i) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de cofactores, y j) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la trayectoria biosintética de enzimas, k) ácidos nucleicos que codifican una proteína del metabolismo central.
8. 8. El cásete de expresión de acuerdo a la reivindicación 7a) , caracterizado porque los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de la trayectoria biosintética de aminoácidos, se seleccionan de entre cinasa de aspartato, dehidrogenasa de semialdehido de aspartato, deshidrogenasa de diaminopimelato, descarboxilasa de diaminopimelato, sintetasa de dihidrodipicolinato, reductasa de dihidrodipicolinato, deshidrogenasa de gliceraldehido-3-fosfato, cinasa de 3-fosfoglicerato, carboxilasa de piruvato, isomerasa de triosefosfato, regulador LuxR trascripcional, regulador LysRl trascripcional, regulador LysR2 trascripcional, oxidoreductasa de malato-quinona, deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato, deshidrogenasa de 6-fosfogluconato, transcetolasa, transaldolasa, O-acetiltransferasa de homoserina, gamma-sintasa de cistationina, beta-liasa de cistationina, hidroximetiltransferasa de serina, sulfhidrilasa de 0-acetilhomoserina, reductasa de metilenotetrahidrofolato, aminotransferasa de aminocerina, fosfatasa de fosfoserina, acetíltransferasa de serina, deshidrogenasa de homoserina, cinasa de homoserina, sintasa de treonina, portador exportador de treonina, deshidratasa de treonina, oxidasa de piruvato, exportador de lisina, ligasa de biotina, sintasa 1 de cisteina, sintasa II de cisteina, sintasa de metionina dependiente de la coenzima B-12, actividad de la sintasa de metionina independiente de la coenzima B-12, subunidades 1 y 2 de adeniltransferasa de sulfato, reductasa de fosfosulfato de fosfoadenosina, reductasa de sulfito de ferredoxin, reductasa de NADP de ferroxidin, deshidrogenasa de 3 -fosfoglicerato, regulador de RXA00655, regulador de RXN2910, sintetasa de arginil-ARNt , carboxilasa de fosfoenolpiruvato, proteína de emanación de treonina, hidroximetiltransferasa de serina, 1,6-biofosfatasa de fructosa, proteína de RXA077 de reducción de sulfato, proteína de RXA248 de reducción de sulfato, proteína de RXA247 de reducción de sulfato, proteína OpcA, 1-fosfofructocinasa, 6-fosfofructocinasa, succinilasa de tetrahidropicolinato, aminotransferasa de aminocetopimelato de succinilo, desuccinilasa de diaminopimelato de succinilo, epimerasa de diaminopimelato, deshidrogenasa de 6-fosfogluconato, isomerasa de fosfato de glucosa, mutasa de fosfoglicerato, enolasa, cinasa de piruvato, transaminasa de aspartato, enzima de malato.
9. 9. Un vector caracterizado porque comprende al menos un cásete de expresión de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.
10. 10. Un microorganismo genéticamente modificado, caracterizado porque está transformado con al menos un vector de acuerdo a la reivindicación 9, o porque comprende un cásete de expresión de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.
11. 11. El microorganismo genéticamente modificado de acuerdo a la reivindicación 10, derivado de bacterias corineformes .
12. 12. El microorganismo genéticamente modificado de acuerdo a la reivindicación 11, derivado de bacterias del género Corynebacterium o Brevibacterium.
13. 13. El microorganismo genéticamente modificado de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 10 o 12, caracterizado porque comprende al menos un cásete de expresión en una forma integrada .
14. 14. Un proceso para preparar un producto biosintético, el cual está caracterizado porque comprende cultivar un microorganismo genéticamente modificado de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 y aislar el producto deseado del cultivo.
15. 15. El proceso de acuerdo a la reivindicación 14, caracterizado porque el producto biosintético se selecciona de entre ácidos orgánicos, proteínas, nucleótidos y nucleósidos, aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, enzimas y proteínas.
16. 16. El uso de una unidad de expresión de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para regular una biosíntesis de producto. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a promotores múltiples y a unidades de expresión que los comprenden; al uso de los mismos para regular la transcripción y expresión de genes; a casetes de expresión los cuales comprenden promotores múltiples o unidades de expresión de este tipo; a vectores los cuales comprenden tales casetes de expresión; a microorganismos genéticamente modificados los cuales comprenden vectores y/o unidades de expresión de este tipo; y a procesos para preparar productos biosintéticos cultivando dichos microorganismos modificados.