CN101230345A - 多启动子及其在基因表达中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多启动子和包含其的表达单元;其在调节基因的转录和表达中的用途;包含这类多启动子或表达单元的表达盒;包含这样的表达盒的载体;包含这类载体和/或表达单元的遗传修饰的微生物;和通过培养所述遗传修饰的微生物制备生物合成产物的方法。
Description
本申请是发明人于2005年12月21日递交的题为“多启动子及其在基因表达中的用途”的中国专利申请200580044422.8的分案申请。
技术领域
本发明涉及多启动子和包含其的表达单元;其在调节基因转录和表达中的用途;包含这类多启动子或表达单元的表达盒;包含这样的表达盒的载体;包含这类载体和/或表达盒的遗传修饰的微生物;以及通过培养所述遗传修饰的微生物制备生物合成产物的方法。
背景技术
多种生物合成产物是在细胞中通过天然代谢方法产生,并用于包括食品原料、化妆品、饲料、食品及医药的许多工业领域中。这些物质统称为精细化学品/蛋白质,其尤其包含有机酸、生蛋白氨基酸及非生蛋白氨基酸(proteinogenic and non-proteinogenic amino acid)、核苷酸及核苷、类脂及脂肪酸、二元醇、碳水化合物、芳香化合物、维生素及辅因子以及蛋白质和酶。在各种情况下通过培养为了产生和分泌大量目的物质而开发出的细菌菌株,非常方便地大规模生产这些物质。特别适于这一目的的生物为棒杆菌(coryneform bacteria),其为革兰氏阳性非病原菌。
已知可以通过棒杆菌菌株的发酵,尤其是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株的发酵来制备氨基酸。由于其重要性,在其生产方法的改良上进行了不懈的努力。该方法改良可与以下事宜相关:发酵技术的手段,例如搅拌与供氧;或营养培养基的组成,例如发酵中的糖浓度;或用于获得产物的处理,例如通过离子交换层析或喷雾干燥;或微生物自身的内在性能特性。
通过扩增个别基因并研究其对精细化学品/蛋白质的生产的作用,重组DNA技术已在产生精细化学品/蛋白质的棒杆菌菌株的改良中应用多年。
用于发展生产精细化学品或蛋白质的方法,或用于增加或提高已存在方法的生产率的其它方式包括增加或改变一种或多种基因的表达,和/或通过适合的多核苷酸序列影响mRNA的翻译。就此而言,影响可包括基因表达的增加、减少或其它因素,例如与时间相关的表达模式。
本领域的技术人员已知细菌调节序列的多种组分。对于以下结合位点已作出了区分:调节物结合位点,也称为操纵基因;RNA聚合酶全酶结合位点,也称为-35与-10区以及核糖体16S RNA结合位点,也称为核糖体结合位点或另称为Shine-Dalgarno序列。
如文献(E.coli和S.typhimurium,Neidhardt F.C.1995 ASM Press)所述,Shine-Dalgarno序列的多核苷酸序列的组成和碱基序列串以及存在于Shine-Dalgarno序列中的多核苷酸序列与起始密码子的距离均对翻译起始速率具有显著影响。
具有启动子活性的核酸序列可以多种方式影响mRNA的形成。其活性不依赖于生物的生理生长期的启动子称为组成型。其它启动子响应外部的化学及物理刺激,例如氧、代谢物、热、pH等。其它启动子显示出其活性在不同生长期的强依赖性。例如,文献中描述的在微生物的指数生长期或恰好在微生物生长的稳定期中显示特别显著活性的启动子的实例。根据代谢途径,启动子的两种特征可对精细化学品及蛋白质的生产率具有有益的作用。
已经可以从棒杆菌物种分离出那些用于增强或减弱基因表达的核苷酸序列。由于细胞内部和/或外部条件的作用,这些受调节的启动子可提高或降低基因转录的速率。在某些情况下,称为诱导物的特定因子的存在可刺激从启动子的转录速率。诱导物可直接或间接影响从启动子的转录。称为抑制物的另一类因子能够降低或抑制从启动子的转录。类似于诱导物,抑制物也可直接或间接地起作用。而热调节的启动子也是已知的。因此,例如,可通过将生长温度增至高于细胞的正常生长温度来增强或减弱这类启动子的转录水平。
至今已描述了少量源自谷氨酸棒杆菌的启动子。DE-A-44 40118中描述了源自谷氨酸棒杆菌的苹果酸合酶基因的启动子。该启动子被***到编码蛋白质的结构基因的上游。将这种构建体转化进入棒杆菌之后,该启动子下游结构基因的表达受到调节。一旦在培养基中添加相应的诱导物,就诱导结构基因的表达。
Reinscheid等人在Microbiology 145:503(1999)中描述了源自谷氨酸棒杆菌的pta-ack启动子与报道基因(氯霉素乙酰转移酶)之间的转录融合作用。包含这种转录融合作用的谷氨酸棒杆菌细胞在含有乙酸的培养基上生长时,呈现报道基因的增强表达。与此相比,在葡萄糖上生长的转化细胞未显示所述报道基因的增强表达。
Patek等人在Microbiology 142:1297(1996)中描述了能够增强报道基因在谷氨酸棒杆菌细胞中表达的某些源自谷氨酸棒杆菌的DNA序列。将这些序列在一起进行比较以便确定谷氨酸棒杆菌启动子的共有序列。
专利WO 02/40679中已经描述了可用于调节基因表达的其它源自谷氨酸棒杆菌的DNA序列。这些分离的多核苷酸为可用于增加或降低基因表达的源自谷氨酸棒杆菌的表达单元。该公布的专利还描述了重组质粒,在这些重组质粒上源自谷氨酸棒杆菌的所述表达单元与异源基因连接在一起。本文所描述的将源自谷氨酸棒杆菌的启动子与异源基因融合的方法,尤其可用于调节氨基酸生物合成的基因。
更早的、先前未公布的专利申请DE-A-103 59 594、DE-A-103 59 595、DE-A-103 59 660和DE-A-10 2004 035 065公开了源自谷氨酸棒杆菌的特异性单启动子。
发明简述
本发明基于提供更多调节性核酸序列的目标,特别是具有有利特性大的启动子构建体和/或表达单元,例如与最初启动子相比,增加的或改变的转录活性和/或翻译活性。
本发明的目标通过提供包含多启动子的表达单元而实现,其沿5’-3’方向包含下式I的序列构件:
5’-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3’(I)
其中
n为从0至10的整数,
Ax和Ay是相同或不同的,并且为化学键或连接区核酸序列;
P1、Px和Py编码相同或不同的启动子序列,其包含至少一个RNA聚合酶结合区,例如核心区;并且至少Py包含一个介导核糖体结合的3’-末端序列区。P1和个别的或所有的Px还可彼此独立地具有介导核糖体结合的这类序列区。
根据一个实施方案,P1、Px和Py衍生自相同或不同的真核或(特别是)原核生物。也可以使用人工启动子。
根据优选的实施方案,P1、Px和Py在各种情况下从35至500核苷酸残基,优选35至300核苷酸残基,更优选35至210核苷酸残基并且特别优选35至100核苷酸残基的连续序列衍生,该序列位于蛋白质的编码序列的5’上游,例如在所述生物基因组中涉及该生物的生物合成途径的蛋白质。
根据另一实施方案,表达单元的P1、Px和Py衍生自谷氨酸棒杆菌。
根据优选的实施方案,表达单元的P1、Px和Py彼此独立地选自在真核或原核生物,特别是在棒状杆菌(例如在棒杆菌属或短杆菌属之一,例如表3所列物种或菌株中)具有高丰度的蛋白质编码序列的启动子序列。
此外,可以从表1所列蛋白质的编码序列的启动子序列中选择单个或所有的这些启动子序列,并且其涉及生物的氨基酸生物合成。然而,就此而言,本发明表达单元的至少一个启动子应该具有如本文所定义的高丰度。
根据本发明的另一优选实施方案,表达单元的P1、Px和Py是彼此独立地选自图1所述核苷酸序列,或衍生自SEQ ID NO:1(pGRO)、SEQ IDNO:2(pEFTs)、SEQ ID NO:3(pEFTu)和SEQ ID NO:4(pSOD)(将在后对其具体解释)。
根据本发明的另一优选实施方案,表达单元的P1、Px和Py彼此独立地选自强启动子、组成型启动子或可调节的启动子。
在另一方面,本发明涉及表达盒,其沿5’-3’的方向包含下式II的序列构件:
5’-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-G-3’(II)
其中
n、Ax、Ay、P1、Px和Py如上定义,并且
G为至少一个编码核酸序列,其功能地或有效地连接于5’上游调节序列。
根据表达盒优选的实施方案,G选自
a)编码生蛋白氨基酸及非生蛋白氨基酸生物合成途径蛋白质的核酸,
b)编码核苷酸及核苷生物合成途径蛋白质的核酸,
c)编码有机酸生物合成途径蛋白质的核酸,
d)编码类脂及脂肪酸生物合成途径蛋白质的核酸,
e)编码二元醇生物合成途径蛋白质的核酸,
f)编码碳水化合物生物合成途径蛋白质的核酸,
g)编码芳香化合物生物合成途径蛋白质的核酸,
h)编码维生素生物合成途径蛋白质的核酸,
i)编码辅因子生物合成途径蛋白质的核酸,
j)编码酶生物合成途径蛋白质的核酸,和
k)编码中心代谢蛋白质的核酸。
根据表达盒的特别优选的实施方案,G选自氨基酸生物合成途径的蛋白质的编码核酸,所述氨基酸生物合成途径的蛋白质选自:天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysR1、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子载体(exporter carrier)、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苷磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白(efflux protein)、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1,6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶、四氢吡啶羧酸(tetrahydropicolinate)琥珀酰酶、琥珀酰氨基酮庚二酸氨基转移酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶、二氨基庚二酸差向异构酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、天冬氨酸转氨酶、苹果酸酶。
另一方面,本发明涉及包含至少一个上述表达盒的载体。
另一方面,本发明涉及用至少一个上述载体转化的遗传修饰的微生物或包含至少一个上述表达盒的载体(优选处于整合形式)的遗传修饰的微生物。
根据一个实施方案,遗传修饰的生物来自谷氨酸棒杆菌。
根据优选的实施方案,遗传修饰的生物来自棒杆菌属或短杆菌属的细菌。
另一方面,本发明涉及制备生物合成产品的方法,其包括培养任何上述遗传修饰的微生物和从培养物分离目的产物。
根据该方法的一个实施方案,该生物合成产物选自有机酸、蛋白质、核苷酸及核苷、生蛋白氨基酸及非生蛋白氨基酸、类脂及脂肪酸、二元醇、碳水化合物、芳香化合物、维生素及辅因子、酶及蛋白质。特别优选的生物合成产物是赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和海藻糖。
另一方面,本发明涉及本发明的表达单元在调节产物生物合成中的用途。
附图说明
图1:描述了四个启动子的特异性序列,其用于制备在示例的实施方案中所述的多启动子。显示了如下启动子的序列:pEFTu(图1A)、pGRO(图1B)、pEFTs(图1C)和pSOD(图1D)。每种启动子显示两条序列,其中更长的(上面的序列)表示包括核糖体结合位点(RBS)的全长启动子序列,以粗斜体打印。在本发明的多启动子构建体中特定启动子的3’末端排列情况下,给出在每一情况下使用较长核苷酸序列(包括RBS)的参考。3’末端启动子单元的5’上游启动子序列不包含任何RBS并且被用于在每一情况第二位置所示的截短的核酸序列(无RBS)。较短的启动子序列还可以缺少(如果适当)以大写字母和粗体显示的3’末端的部分序列。可能的“-10区”加下划线。
发明详述
I.通用定义:
“生物合成产物”意指为本发明的目的,在细胞中经由天然代谢过程(生物合成途径)产生的那些产物。它们被用于多种不同方面,特别是食品原料、化妆品、饲料、食物和药品工业。这些物质被总称为精细化学品/蛋白质,其特别包括有机酸、生蛋白氨基酸及非生蛋白氨基酸、核苷酸及核苷、类脂及脂肪酸、二元醇、碳水化合物、芳香化合物、维生素及辅因子、以及蛋白质和酶。
“启动子”、“带有启动子活性的核酸”或“启动子序列”意指根据本发明的核酸,其功能地连接于待转录的核酸并且其调节所述核酸的转录。
除非清楚地指明“单个启动子”,根据本发明并且依赖于本文,术语“启动子”还包括超过一条核酸序列的顺序安排(即“多启动子”),其每一序列当被功能地连接于待转录的核酸时,将能够调节后者的转录。
术语“单个启动子”相应地指单独的核酸序列,其能够调节待转录核酸的转录并且当将其功能地连接于待转录核酸时,能够调节后者的转录。
对于“多启动子”的情况,至少将两条相同或不同的核酸序列(其中每条当将其功能地连接于待转录的核酸时,能够调节后者的转录)(单个启动子)以这样的方式顺序连接,即从任选地所述核酸序列之一起始转录可以产生含有所述待转录核酸的转录物。就此而言,在每种情况下可以将更多的无启动子功能的序列(例如具有例如一个或多个限制性切割位点的接头)***两个单个启动子之间。任选地,在每种情况下两个单个启动子还可以直接地彼此相连。所述多启动子优选仅含有一个核糖体结合位点(RBS),特别在启动子的3’末端区。
“高丰度”蛋白质编码序列的启动子序列具体而言意指“强启动子”。如果打算使用多启动子增强基因,给出了以合适的方式组合这类强启动子的参考。强启动子调节基因的转录使后者比生物的大多数基因更频繁地被RNA聚合酶读取。在多数情况下,强启动子的存在使细胞中也存在大量的转录物。当所述转录物的百分数相对高于其它细胞转录物时,称其为“高丰度转录物”。在细菌中,转录物的量和编码的相应蛋白质量因而通常相关联,即在大部分时间“高丰度转录物”也产生“高丰度蛋白质”。以下,通过实例对能够经由蛋白质丰度鉴定“强启动子”的方法进行描述。方法操作的细节和更多的参考可以在例如Proteomics in Practice-A LaboratoryManual of Proteome Analysis(作者:R.Westermeier、T.Naven;出版商:Wiley-VCH Verlag GmbH,2002)中找到。破坏细菌细胞并通过2D凝胶电泳对细胞提取物的蛋白质分级。接着通过普通方法例如考马斯、银或荧光染料染色法对蛋白质染色。这里要避免蛋白质的过染,从而在其后能够量化单个的蛋白质点。随后扫描凝胶并在合适软件(如Melanie,AmershamBiosciences)的辅助下分析获得的图像。为此,首先鉴定全部可检测的点并确定该点体积。在初步估计中,所有点体积的总和对应于总蛋白质。接着可以在图像分析软件的辅助下选出具有特别大的点体积的点。例如,体积占据超过总的点体积0.1%的点可以被称为高丰度的。随即从凝胶切出含有显著高丰度蛋白质的点。通常随即对存在于凝胶切片中的蛋白质蛋白水解消化(例如使用胰蛋白酶)并且在例如MALDI-ToF MS(Matrix assistedlaser desorption ionization-Time of Flight Mass Spectrometry)的辅助下确定产生肽的摩尔质量。基于蛋白质的一些胰蛋白酶消化肽段的摩尔质量,可以随后在数据库搜索中鉴定相应的蛋白质。这特别是在如果待研究生物的基因组已被测序(例如谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌和许多其它细菌)时是可能的。基于所述蛋白质的鉴定可以接着确定编码所述蛋白质的ORF(开放阅读框)。在细菌中,调节所述基因的启动子通常紧接起始密码子的上游。因此,“强”启动子通常还存在于“高丰度”蛋白质的起始密码子上游约200核苷酸的区域。
出于本发明目的,“人工”启动子具体包括在原位没有转录活性而在另一序列环境中(例如,具体而言在本发明的表达单元或表达盒的环境中)具有转录活性的那些序列。
根据本发明,“启动子活性”意指由启动子在特定时间形成的RNA量,即转录速率。
根据本发明,“特异性”启动子活性意指对于每种启动子,由启动子在特定时间形成的RNA量。
对于(与野生型相比)基因的“受影响的”启动子活性或转录速率,从而,与野生型相比,影响在野生型的这一形式中不存在的RNA的形成。
对于(与野生型相比)基因的“改变”的启动子活性或转录速率,从而,与野生型相比,在特定时间形成的RNA量被改变。
在这一点上,“改变”优选意指增加或减少。
在这一点上,“功能的”或“有效的”连接意指,例如任何具有启动子活性的本发明的核酸和待转录的核酸序列以及(如果合适的)更多的调节元件(诸如,例如确保核酸转录的核酸序列,以及例如终止子)的顺序安排,从而使每一所述调节元件能够完成其在所述核酸序列转录中的功能。这并不必需化学意义上的直接连接。遗传控制序列,例如增强子序列也可以从更远的位置或甚至从其它DNA分子行使其对靶标序列的功能。给出参考的安排,其中待转录的核酸序列位于本发明的启动子序列之后(即,在其3’末端),使两条序列彼此共价地连接。在本文中,启动子序列和要转基因表达的核酸序列之间的距离优选少于200碱基对,特别优选少于100碱基对,尤其特别优选少于50碱基对。
本发明的“核糖体的结合位点”或“核糖体结合位点”(RBS)的序列(或称为Shine-Dalgarno序列)意指富含A/G的多核苷酸序列,其位于翻译起始密码子上游多至30碱基处。
根据本发明,“转录”意指从DNA模板开始,产生互补RNA分子的过程。这一过程涉及蛋白质,例如RNA聚合酶、“σ因子”和转录调节蛋白。合成的RNA接着用作翻译过程中的模板,其随后产生生物合成的有活性蛋白质。
根据本发明,启动子的“核心区”意指从约20至80,或30至60核苷酸的连续核酸序列,其包含至少一个可能的“-10区”。在本文中,对单个优选启动子序列的可能的-10区的实例进行了描述;具体比较图1。“-10区”也称为TATA盒或Pribnow-Schaller序列。使用的每个启动子应该包含这些可能的-10区(例如1、2、3、4或5)的至少一个。核心区位于RBS的5’上游并且可以是距离后者1至200或10至150或20至100个核苷酸残基。
根据本发明,“表达单元”意指具有表达活性的核酸,其包含如本文定义的多启动子,并且所述多启动子在功能的连接至待表达核酸或基因之后调节所述核酸或基因的表达(即转录和翻译)。在这一点,因此又称所述核酸序列为“调节的核酸序列”。除了多启动子构建体,可以存在其它调节元件,例如增强子。
根据本发明,“表达盒”意指功能地连接于待表达核酸或基因的表达单元。因此,与表达单元相比,表达盒不仅包含调节转录和翻译的核酸序列,还包含作为转录和翻译的结果被表达为蛋白质的核酸序列。
根据本发明,“表达活性”意指由表达盒或其表达单元在特定时间形成的蛋白质量,即表达速率。
根据本发明,“特异性表达活性”意指对于每一表达单元,由表达盒或其表达单元在特定时间形成的蛋白质量。
对于(与野生型相比)基因的“受影响的”表达活性或表达速率,从而,与野生型相比,影响在野生型的这一形式中不存在的蛋白质的形成。
对于(与野生型相比)基因的“改变的”表达活性或表达速率,从而,与野生型相比,在特定时间形成的蛋白质的量被改变。在这一点上,“改变”优选意指增加或减少的改变。这可以例如通过增加或减少内源表达单元的比活性(例如通过突变或通过刺激或抑制)而发生。还可以例如通过本发明的表达单元调节微生物中基因(与表达单元异源的基因)的表达而获得改变的表达活性或表达速率。
“形成的速率”(生物合成的活性蛋白质以其产生)是转录和翻译速率的结果。根据本发明,两种速率皆可受到影响并因而影响在微生物中产物/精细化学品的形成的速率。
根据本发明,术语“野生型”意指合适的起始微生物并且无需对应于天然产生的生物。
由本发明的内容决定。术语“微生物”可以意指起始微生物(野生型)或本发明的遗传修饰的微生物或两者。
对于改变或影响启动子活性或转录速率、改变或影响表达活性或表达速率以及对于增加生物合成产物含量的每一情况下,且特别是在不可能清楚地指定微生物或野生型的情况下,“野生型”优选意指“参照生物”。在优选的实施方案中,该“参照生物”是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032或通过特异性或非特异性突变从ATCC 13032衍生的微生物。
特别利用已经能够生产目的产物(精细化学品/蛋白质)的“起始微生物”。
根据本发明,如果不给出其它信息,“衍生的”序列(例如衍生的启动子序列)意指与起始序列具有至少80%或至少90%,具体地91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%同一性的序列。
两条核酸之间的“同一性”意指在每一情况下核酸全长范围核苷酸的同一性,具体地,在来自Informax(USA)的Vector NTI Suite 7.1软件的辅助下使用聚类方法(Higgins DG,Sharp PM.Fast and sensitive multiplesequence alignments on a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989Apr;5(2):151-1)通过比较计算同一性,设定参数如下:
多比对参数:
空位开放罚分 10
空位延伸罚分 10
空位分离罚分范围 8
空位分离罚分 关闭
比对延迟同一性%(%identity for alignment delay) 40
残基特异性空位 关闭
亲水残基空位 关闭
转换权重(Transition weighing) 0
Pairwise比对参数:
FAST算法 开
K字大小(K-tuple size) 1
空位罚分 3
窗口大小 5
最佳对角线值 5
“杂交”意指在严格条件下多核苷酸或寡核苷酸结合至基本互补序列的能力,而在这样的条件下非互补的配偶体之间不形成非特异性结合。为此目的,该序列应该优选为90-100%互补。可以将能够彼此特异性结合的互补序列的特性用于,例如Northern或Southern印迹技术或用于PCR或RT-PCR中的引物结合。
根据本发明,在严格条件下发生“杂交”。这种杂交条件在例如Sambrook,J.、Fritsch,E.F.、Maniatis,T.在:分子克隆(A LaboratoryManual),第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,9.31-9.57页,或在现代分子生物操作手册,John Wiley和Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中有描述。具体而言,严格的杂交条件意指:在42℃于溶液中孵育过夜,该溶液组成为50%甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20g/ml变性、剪切的鲑精DNA,继而在65℃用0.1×SSC洗滤膜。
“功能相当的片段”意指具有启动子活性片段的核酸序列,其与起始序列相比具有基本一致或改变的、更低或更高的特异性启动子活性。
“基本一致”意指特异性的启动子活性,其具有起始序列的特异性启动子活性的至少50%例如,至少60%、70%、80%、90%或至少95%。
II.表达单元、表达盒和其组分
a)表达单元
本发明尤其涉及提供包含多启动子的表达单元,其包含沿5’-3’方向的下式I的序列构件:
5’-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3’
其中
n为从0至10的整数,例如1、2、3、4、5或6;
Ax和Ay相同或不同的并且是化学键(特别是共价键),或化学地(特别是共价地)整合的接头核酸序列;
P1、Px和Py编码相同或不同的启动子序列,其包含至少一个RNA聚合酶结合区,例如核心区;和至少(例如仅Py)包含一个介导核糖体结合的3’末端序列区。
启动子序列P1、Px和Py可以来自生物的基因,其编码涉及所述生物的生物合成途径的蛋白质。这里的启动子序列位于所述生物基因组中特定蛋白质编码序列5’上游的从20至500个核苷酸残基,或从20至300个核苷酸残基,例如从20至210个核苷酸残基,和特别是从20至100或35至100个核苷酸残基。
启动子序列P1、Px和Py可以从其衍生的序列的实例是以下表1所列基因。
特定启动子序列的非限制性实例衍生自根据SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4以及图1的核酸序列,然而其并非意在限制。
就此而言,SEQ ID NO:1对应位于GroES陪伴蛋白(pGRO)编码区上游的序列,SEQ ID NO:2对应位于蛋白质延伸因子TS(pEFTs)编码区上游的序列,SEQ ID NO:3对应位于蛋白质延伸因子TU(pEFTu)编码区上游的序列,和SEQ ID NO:4对应位于超氧化物歧化酶(pSOD)编码区上游的序列,每一种都来自谷氨酸棒杆菌。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3和SEQ ID NO:4对应野生型的启动子序列。
根据本发明,“衍生的”序列意指与起始序列具有至少80%或至少90%,例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和特别是99%同一性的序列。这一同一性程度具体用于以上定义的特定启动子的“核心区”。这里,特定核心区之外的同一性程度可以更低并且可以在从0至80%,例如从10至80%、20至70%、30至60%或40至50%的范围中。
可用的核心区位于,例如
对于pGRO在从SEQ ID NO:1的位置50至80的范围;
对于pEFTs在从SEQ ID NO:2的位置130至170的范围;
对于pEFTu在从SEQ ID NO:3的位置30至110的范围;
对于pSOD在从SEQ ID NO:4的位置50至100的范围。
本发明的表达单元具体含有两个或多个的具有启动子活性的核酸序列,
a)优选衍生自相同或不同的序列,所述序列选自SEQ.ID.NO.1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4;或其它具有相当或更高丰度基因的启动子序列;
b)具有(如果适当的)一个或多个通过对所述序列进行核苷酸的取代、***、倒置或缺失或添加而衍生的序列,该序列(特别是在核心区)与优选选自序列SEQ ID NO:1、2、3或4的序列或具有相当或更高丰度基因的其它启动子序列在核酸水平上具有至少80%的同一性,
c)或具有(如果适当的)代表在严格条件下与另一序列杂交的一个或多个的这些核酸序列,所述另一序列与SEQ ID NO:1、2、3或4的序列之一和/或与具有相当或更高丰度基因的其它启动子序列互补,
d)或具有(如果适当的)一个或多个的核酸序列,其代表a)、b)或c)中序列的“功能相当的片段”。
通过将来自数据库的核酸序列与上述SEQ ID NO:1、2、3或4的序列或根据图1的序列或其它具有相当或更高丰度基因的启动子序列比较同一性,可以(例如从多种基因组序列已知的生物中)容易地鉴定可用作本发明的多启动子组分的其它天然启动子。
通过以本身已知的方式应用杂交技术,从上述核酸序列开始,特别是从SEQ ID NO:1、2、3或4序列和/或从具有相当或更高丰度基因的启动子序列开始,可以从多种基因组序列未知的生物中容易地鉴定更多适合的天然启动子。
还可以通过技术人员已知的方法分离更多适合的天然启动子,如,例如在Cadenas等人(1991)Gene 98,117-121;Eikmanns等人(1991)Gene102,93-98.Patek等人(1996)Microbiology 142,1297-1309或Santamaria等人(1987)Gene 56,199-208所述。这通常涉及使用其中***了所研究基因组的基因组片段的“启动子探针”载体。接着,可以在提到的实验装置中通过测量下游报告基因(例如氯霉素乙酰转移酶)的活性测定单个片段的启动子活性。
因此,本发明还包括本文未列举名称的那些启动子的组合。这也应用于,例如在Patek等人(2003).J of Biotechnology 104,311-323;Vasicova等人(1999)J.Bacteriol 181,6188-6191)所述,已知的单个启动子的组合。
因此本发明还涉及用于参入本发明含有多启动子表达单元的具有启动子活性的核酸,其含有能够与SEQ ID NO:1、2、3或4的核酸序列或者与具有相当或更高丰度基因的启动子序列在严格条件下杂交的核酸序列。这一核酸序列包含至少10个,优选超过12、15、30、50或超过150个核苷酸。
可以从序列SEQ ID NO:1、2、3或4或根据图1和/或具有相当或更高丰度基因的启动子序列开始,通过人工变异和突变,例如通过添加、取代、***、倒置或缺失一个或多个单独或连续的核苷酸残基,容易地制备人工启动子序列,用于参入本发明的包含多启动子的表达单元(Patek等人(2003).J of Biotechnology 104,311-323;Vasicova等人(1999)J.bacteriol181,6188-6191和文中提到的参考文献)。
启动子序列Py的介导核糖体结合的3’末端序列区合适的实例是pGRO的RBS:GGAGGGA;pEFTs的RBS:AGGAGGA;pEFTu的RBS:AGGAGGA以及pSOD的RBS:GGAGGGA(也参见附图1)。理论上最佳RBS,即与谷氨酸棒杆菌16S rRNA的抗-Shine-Dalgarno序列100%互补的序列为:5’GAAAGGAGG 3’。例如通过人工变异和突变,例如通过核苷酸的取代、***、倒置、添加或缺失,或经由与数据库中启动子序列的同源性比对,可以容易地鉴定其它合适的RBS序列区。
本发明的包含多启动子表达单元的非限制性实例选自:
e)序列,其编码
PeftuPsod,来自SEQ ID NO:45中位置18至390;
PsodPeftu,来自SEQ ID NO:52中位置18至395;
PgroPsod,来自SEQ ID NO:55中位置18至369;
PgroPsodPefts,来自SEQ ID NO:59中位置11至538;
PeftuPsodPefts,来自SEQ ID NO:60中位置11至559;
或
f)通过核苷酸的取代、***、倒置、添加或缺失从根据e)的序列衍生而来的序列,并且其与所述起始序列相比在核酸水平具有至少80%或至少90%的同一性;或
g)在严格条件下与e)的互补序列杂交的核酸序列;或
h)上述序列e)、f)和g)的“功能相当的片段”。
根据实施方案d)和h),具体而言,“功能相当的片段”意指对于表达单元具有如/比起始序列基本相同或更高的特异性表达活性的片段。
“基本一致”意指特异性的表达活性,其具有起始序列的特异性表达活性的至少50%,优选60%,更优选70%,更优选80%,更优选90%,特别优选95%。
“片段”意指由实施方案a)至h)所述序列的部分序列。所述片段优选具有超过10,但是更优选超过12、15、30、50个,或特别优选超过150个起始序列的连续核苷酸。
本发明的表达单元可以优选包含一个或多个下列遗传元件:-10区、转录起始、增强子区和操纵基因区。
这些遗传元件优选是棒杆菌物种,特别是谷氨酸棒杆菌特异性的。
细菌启动子通常由三个RNA聚合酶识别位点组成,即-10区、-35区和UP元件。这些启动子元件在大肠杆菌中高度保守,但在谷氨酸棒杆菌中不是。对于-35区尤其如此。因此,后者通常可以仅仅从整体可信度不高的序列衍生。与包含了富含AT基因组的生物相比,-10区也具有较低的高度保守性。在这里,先前所述的共有序列为TGNGNTA(C/T)AATGG和GNTANAATNG(Patek等人(2003),J.of Biotechnology 104,311-323;Vasicova等人(1999)J.Bacteriol 181,6188-6191)。
众所周知的是,在具有中等或高GC含量的细菌(例如,谷氨酸棒杆菌)的共有序列中通常出现高变异性(Bourn和Babb,1995,Bashyam等人,1996)。这特别适用于-35区,因此其经常无法预测。这在例如Patek等人(2003).J of Biotechnology 104,325-334中有描述。
b)表达盒
本发明还涉及本发明的含有多启动子的表达单元,其功能的连接于可翻译的核酸序列。出于本发明的目的,这些能够表达基因的构建体也被称为表达盒。
就此而言,“功能的连接”意指,例如任何本发明的表达单元和要转基因表达的核酸序列、以及(如果合适)更多的调节元件(例如终止子)的顺序安排,从而使每一所述调节元件能够完成其在所述核酸序列的转基因表达中的功能。这并不必需化学意义上的直接连接。遗传控制序列,例如增强子序列还可以从更远的位置或甚至从其它DNA分子行使其对靶标序列的功能。给出参考的安排,其中要转基因表达的核酸序列位于本发明的表达单元序列之后(即,在3’末端),从而使两条序列彼此共价地连接。在本文中,表达单元序列与待转基因表达的核酸序列之间的距离优选少于200碱基对,特别优选少于100碱基对,最优选少于50碱基对。
本发明的包含多启动子的表达盒使能够获得与原始表达活性不同的表达活性,并因此能够精细调节目的基因的表达。
通过本发明的表达单元对微生物中基因表达的调节优选通过以下实现:
-向微生物的基因组引入一个或多个本发明的表达单元(如果合适,其具有改变的特异性表达活性),从而在引入的本发明的表达单元控制下表达一个或多个内源基因;或
-向微生物引入一个或多个核酸构建体,即表达盒,其包含本发明的表达单元(如果合适,具有改变的特异性表达活性)和功能地连接的一个或多个要表达的核酸。
在本发明的表达盒中,选择与要表达基因相关的表达单元的物理位置,从而使所述表达单元调节要表达基因的转录(优选还有翻译)并且因而能够形成一个或多个蛋白质。在这里,“使能够形成”包括组成型地增加所述形成、在特异条件下减弱或阻断所述形成和/或在特异条件下增加所述形成。在这里,“条件”包括:(1)向培养基加入组分,(2)从培养基移去组分,(3)用第二种组分代替培养基中的一组分,(4)增加培养基的温度,(5)降低培养基的温度,和(6)调节在其中维持培养基的大气条件,例如氧浓度或氮浓度。
c)通用信息
还可以通过本身已知的化学合成方式(例如通过双螺旋的各个重叠互补核酸构件的片段缩合)从核苷酸构件制备上述所有具有启动子活性的核酸和表达单元以及表达盒。例如,可以使用本身已知的phosphoamidite方法(Voet,Voet,第二版,Wiley Press New York,896-897页)进行寡核苷酸的化学合成。合成的寡核苷酸汇编和在DNA聚合酶的Klenow片段帮助下的空位补平以及连接反应还有通常的克隆操作描述于Sambrook等人(1989),Molecular cloning:A laboratory manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress。
本发明使用的方法和技术对于在微生物和重组DNA技术领域受到训练的技术人员是公知的。这样的技术和方法的实例是生长细菌细胞、将分离的DNA分子转运至宿主细胞以及分离、克隆以及测序分离的核酸分子等等方法和技术。这些方法在多项标准文献中有描述:Davis等人,BasicMethods In Molecular Biology(1986);J.H.Miller,Experiments inMolecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York(1972);J.H.Miller,A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1992);M.Singer和P.Berg,Genes & Genomes,University Science Books,Mill Valley,California(1991);J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989);P.B.Kaufmann等人,Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology andMedicine,CRC Press,Boca Raton,Florida(1995);Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology,B.R.Glick和J.E.Thompson编辑,CRC Press,Boca Raton,Florida(1993);还有P.F.Smith-Keary,MolecularGenetics of Escherichia coli,The Guilford Press,New York,NY(1989)。
本发明的全部核酸分子优选为分离的核酸分子形式。将“分离的”核酸分子从所述核酸的天然来源中存在的其它核酸分子中移出,并且可能必需另外的除去其它细胞材料或培养基(如果通过重组技术制备),或除去化学前体或其它化学制剂(如果化学合成)。
本发明还包括与明确描述的核苷酸序列或其片段互补的核酸分子。
也能够从本发明的核苷酸序列产生用于在其它细胞类型和微生物中鉴定和/或克隆同源序列的探针和引物。这一类的探针和引物通常包括核苷酸序列区,其在严格条件下杂交于本发明核酸序列的正义链或相应的反义链的至少约12个,优选至少约25个,例如约40、50或75个连续核苷酸。
本发明还包括这样的核酸序列(其包含“沉默突变”或与明确提到的序列相比,其特定来源或宿主生物的密码子使用发生改变),以及天然发生的变体(例如其剪接变体或等位变体)。
III.表达载体
本发明还涉及包含上述本发明的表达盒的表达载体。
载体对于技术人员是众所周知的,并且可以在例如“克隆载体”(Pouwels P.H.等人,编辑,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985)中找到。除了质粒之外,载体还意指技术人员已知的任何其它载体,例如噬菌体、转座子、IS元件、质粒、黏粒和线形或环形DNA。所述载体可以在宿主生物中自动复制或可以染色体地复制。
特别优选那些在棒杆菌中复制的质粒。许多已知的质粒载体,例如pZ1(Menkel等人,Applied and Environmental Microbiology(1989)64:549-554)、pEKEx1(Eikmanns等人,Gene 102:93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等人,Gene 107:69-74(1991))是基于隐蔽性质粒pHM1519、pBL1或pGA1。同样可以使用其它质粒载体,例如pCLiK5MCS(见实施例1)或基于pCG4(US-A 4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等人,FEMSMicrobiology Letters 66,119-124(1990))或pAG1(US-A 5,158,891)的那些质粒载体。
另外适用的还有那些质粒载体,在其帮助下可以通过整合进入染色体进行基因扩增过程,例如由Remscheid等人(Applied and EnvironmentalMicrobiology 60,126-132(1994))所述的对hom-thrB操纵子的复制和扩增。在这一方法中,将完整的基因克隆在可以在宿主(通常为大肠杆菌)中复制而不能在谷氨酸棒杆菌中复制的质粒载体。合适的载体的实例是pSUP301(Sirnon等人,Bio/Technology 1,784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(Schfer等人,Gene 145,69-73(1994);Bernard等人,Journal of MolecularBiology,234:534-541(1993))、pEM1(Schrumpf等人1991,Journal ofBacteriology 173:4510--4516)或pBGS8(Spratt等人,1986,Gene 41:337-342)。接着,通过转化将含有待扩增基因的质粒载体转移进入目的谷氨酸棒杆菌菌株。转化方法如在Thierbach等人(Applied Microbiology andBiotechnology 29,356-362(1988))、Dunican和Shivnan(Biotechnology 7,1067-1070(1989))以及Tauch等人(FEMS Microbiological Letters 123,343-347(1994))所述。
IV.基因和由此编码的蛋白质
可以通过本发明的表达单元调节基因在所述微生物中的转录,在微生物中改变或影响(与野生型相比)基因的转录速率和/或翻译速率,所述基因与所述表达单元是异源的。
这优选通过以下获得:
-向微生物基因组导入一个或多个本发明的具有启动子活性的核酸,从而在所述导入的具有启动子活性的核酸(如果合适,其具有改变的特异性启动子活性)控制下转录一个或多个内源基因;或
-向微生物导入一个或多个核酸构建体,其含有本发明的具有启动子活性的核酸和功能连接的一个或多个待转录的外源或内源核酸。
如果将一个或多个基因导入微生物的基因组使一个或多个导入的基因在本发明的核酸控制下转录,可能发生***使基因整合进入编码或非编码区。优选发生进入非编码区的***。
在这一点,可以染色体的***或染色体外的***核酸构建体。优选核酸构建体为染色体的***。“染色体的”整合是DNA片段***宿主细胞的染色体。
“内源的”意指这样的遗传信息,例如已经存在于野生型基因组的基因(如上定义)。
“外源的”意指这样的遗传信息,例如在野生型基因组中不存在的基因。如果外源的遗传信息,例如本发明的包含多启动子的表达单元被导入野生型菌株的基因组,由此产生遗传修饰的菌株,那么这一遗传信息相对于最初产生的遗传菌株及其子代是内源的,但是相对于不包含所述遗传信息的原始野生型菌株是外源的。
关于通过具有启动子活性的本发明核酸的转录调节,术语“基因”意指优选的核酸,其包含要转录的区域,即,例如调节翻译区、编码区和(如果合适)更多的调节元件,例如终止子。
关于通过本发明的表达单元的表达调节,术语“基因”意指优选的核酸,其包含编码区和(如果合适)更多的调节元件,例如终止子。
“编码区”意指编码蛋白质的核酸序列。
关于具有启动子活性的核酸和基因,“异源”意指所使用基因在野生型中的转录不受到具有启动子活性的本发明核酸调节,但是当产生了在野生型中不存在的新的功能连接,则产生在野生型中不存在的具有启动子活性的本发明核酸与特定基因的功能组合。
关于表达单元和基因,“异源”意指所使用基因在野生型中的表达不受到本发明表达单元的调节,但是当产生了在野生型中不存在的新的功能连接,则产生在野生型中不存在的本发明表达单元与特定基因的功能组合。
在本发明上述方法的优选的实施方案中,为了在微生物中改变或影响基因的转录速率和/或表达速率,从精细化学品生物合成途径蛋白质的编码核酸组成的组选择基因,如果合适,所述基因可能含有更多的调节元件。
在本发明上述方法的特别优选的实施方案中,为了在微生物中改变或影响基因的转录速率和/或表达速率,该基因选自:编码生蛋白氨基酸及非生蛋白氨基酸的生物合成途径蛋白质的核酸;编码核苷酸及核苷的生物合成途径蛋白质的核酸;编码有机酸的生物合成途径蛋白质的核酸;编码类脂及脂肪酸的生物合成途径蛋白质的核酸;编码二元醇的生物合成途径蛋白质的核酸;编码碳水化合物的生物合成途径蛋白质的核酸;编码芳香化合物的生物合成途径蛋白质的核酸;编码维生素的生物合成途径蛋白质的核酸;编码辅因子的生物合成途径蛋白质的核酸;编码酶的生物合成途径蛋白质的核酸;编码中心代谢的蛋白质的核酸,如果合适,所述基因可能含有更多的调节元件。
在特别优选的实施方案中,蛋白质选自氨基酸的生物合成途径,即:天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysR1、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子载体、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苷磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1,6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶、四氢吡啶羧酸琥珀酰酶、琥珀酰氨基酮庚二酸氨基转移酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶、二氨基庚二酸差向异构酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、天冬氨酸转氨酶和苹果酸酶。
优选的蛋白质和编码所述蛋白质的核酸分别是微生物来源的蛋白质序列和核酸序列,优选来自棒杆菌属或短杆菌属细菌,优选来自棒杆菌,特别优选来自谷氨酸棒杆菌。
蛋白质序列和氨基酸生物合成途径所述蛋白质的相应编码核酸序列的特别优选的实例、其参考的文献和其在参考文件中的名称列于表1:
表1
蛋白质 | 蛋白质的编码核酸 | 参考文献 | 参考文献中的SEQ.ID.NO. |
天冬氨酸激酶 | Ask或lysC | EP1108790 | DNA:281蛋白质:3781 |
天冬氨酸半醛脱氢酶 | asd | EP1108790 | DNA:331蛋白质:3831 |
二氢吡啶二羧酸合成酶 | dapA | WO 0100843 | DNA:55蛋白质:56 |
二氢吡啶二羧酸还原酶 | dapB | WO 0100843 | DNA:35蛋白质:36 |
内消旋-二氨基庚二酸D-脱氢酶 | ddh | EP1108790 | DNA:3494蛋白质:6944 |
二氨基吡啶羧酸脱羧酶 | lysA | EP1108790 | DNA:3451蛋白质:6951 |
赖氨酸输出子 | lysE | EP1108790 | DNA:3455蛋白质:6955 |
四氢吡啶羧酸琥珀酰酶 | dapD | EP1108790 | DNA:1229蛋白质:4729 |
琥珀酰氨基酮庚二酸氨基转移酶 | dapC | WO 0100843 | DNA:327蛋白质:328 |
琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶 | dapE | WO 0100843 | DNA:31蛋白质:32 |
二氨基庚二酸差向异构酶 | dapF | EP1108790 | DNA:2131蛋白质:5632 |
精氨酰-tRNA合成酶 | argS | EP1108790 | DNA:3450蛋白质:6950 |
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | zwf | WO 0100844 | DNA:243蛋白质:244 |
转酮酶 | RXA2739 | EP 1108790 | DNA:1740蛋白质:5240 |
转醛酶 | RXA2738 | WO 0100844 | DNA:245蛋白质:246 |
OpcA | opcA | WO 0100804 | DNA:79蛋白质:80 |
6-磷酸葡糖酸内酯酶 | RXA2735 | WO 0100844 | DNA:1蛋白质:2 |
6-磷酸葡糖酸脱氢酶 | EP1108790 | DNA:1605 |
蛋白质:5105 | |||
葡萄糖磷酸异构酶 | gpi | WO 0100844 | DNA:41蛋白质:42 |
苹果酸-醌氧化还原酶 | mqo | WO 0100844 | DNA:569蛋白质:570 |
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | gap | WO 0100844 | DNA:187蛋白质:188 |
3-磷酸甘油酸激酶 | pgk | WO 0100844 | DNA:69蛋白质:70 |
丙糖磷酸异构酶 | tpi | WO 0100844 | DNA:61蛋白质:62 |
1-磷酸果糖激酶1 | pfk1 | WO0100844 | DNA:55蛋白质:56 |
1-磷酸果糖激酶2 | pfk2 | WO0100844 | DNA:57蛋白质:58 |
6-磷酸果糖激酶1 | 6-pfk1 | EP 1108790 | DNA:1383蛋白质:4883 |
6-磷酸果糖激酶2 | 6-pfk2 | DE 10112992 | DNA:1蛋白质:2 |
果糖-1,6-二磷酸酶1 | fbr1 | EP1108790 | DNA:1136蛋白质:4636 |
丙酮酸氧化酶 | poxB | WO 0100844 | DNA:85蛋白质:86 |
磷酸甘油酸变位酶 | WO 0100844 | DNA:49蛋白质:50 | |
烯醇化酶 | eno | WO 0100844 | DNA:71蛋白质:72 |
丙酮酸激酶 | pykA | WO 0100844 | DNA:75蛋白质:76 |
丙酮酸激酶 | pykA | EP1108790 | DNA:3328蛋白质:6828 |
丙酮酸羧化酶 | pycA | EP1108790 | DNA:765蛋白质:4265 |
天冬氨酸转氨酶 | EP1108790 | DNA:3226蛋白质:4726DNA:3134蛋白质:6634DNA:2861蛋白质:6361DNA:911蛋白质:4411 | |
PEP-羧化酶 | pck | EP1108790 | DNA:3470蛋白质:6970 |
苹果酸酶 | malE | EP1108790 | DNA:3328蛋白质:6828 |
生物素连接酶 | birA | EP1108790 | DNA:786蛋白质:4286 |
高丝氨酸激酶 | thrB | WO 0100843 | DNA:173蛋白质:174 |
苏氨酸合酶 | thrC | WO 0100843 | DNA:175蛋白质:176 |
苏氨酸输出子载体 | thrE | WO 0251231 | DNA:41蛋白质:42 |
苏氨酸排出蛋白 | RXA2390 | WO 0100843 | DNA:7蛋白质:8 |
苏氨酸脱水酶 | ilvA | EP 1108790 | DNA:2328蛋白质:5828 |
高丝氨酸-O-乙酰转移酶 | metA | EP 1108790 | DNA:727蛋白质:4227 |
胱硫醚γ合酶 | metB | EP 1108790 | DNA:3491蛋白质:6991 |
胱硫醚β裂合酶 | metC | EP 1108790 | DNA:2535蛋白质:6035 |
辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶 | metH | EP 1108790 | DNA:1663蛋白质:5163 |
O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶 | metY | EP 1108790 | DNA:726蛋白质:4226 |
亚甲基四氢叶酸还原酶 | metF | EP 1108790 | DNA:2379蛋白质:5879 |
D-3-磷酸甘油酸脱氢酶 | serA | EP 1108790 | DNA:1415蛋白质:4915 |
磷酸丝氨酸磷酸酶1 | serB | WO 0100843 | DNA:153蛋白质:154 |
磷酸丝氨酸磷酸酶2 | serB | EP 1108790 | DNA:467蛋白质:3967 |
磷酸丝氨酸磷酸酶3 | serB | EP 1108790 | DNA:334蛋白质:3834 |
磷酸丝氨酸转氨酶 | serC | WO 0100843 | DNA:151蛋白质:152 |
丝氨酸乙酰转移酶 | cysE | WO 0100843 | DNA:243蛋白质:244 |
半胱氨酸合酶I | cysK | EP 1108790 | DNA:2817蛋白质:6317 |
半胱氨酸合酶II | CysM | EP 1108790 | DNA:2338蛋白质:5838 |
高丝氨酸脱氢酶 | hom | EP 1108790 | DNA:3452蛋白质:6952 |
非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶 | metE | WO 0100843 | DNA:755蛋白质:756 |
丝氨酸羟甲基转移酶 | glyA | WO 0100843 | DNA:143蛋白质:144 |
硫酸盐还原作用的蛋白质 | RXA247 | EP 1108790 | DNA:3089蛋白质:6589 |
硫酸盐还原作用的蛋白质 | RXA248 | EP 1108790 | DNA:3090蛋白质:6590 |
硫酸腺苷酰转移酶亚基1 | CysN | EP 1108790 | DNA:3092蛋白质:6592 |
硫酸腺苷酰转移酶亚基2 | CysD | EP 1108790 | DNA:3093蛋白质:6593 |
磷酸腺苷磷酰硫酸还原酶 | CysH | WO 02729029 | DNA:7蛋白质:8 |
铁氧还蛋白亚硫酸盐还原酶 | RXA073 | WO 0100842 | DNA:329蛋白质:330 |
铁氧还蛋白NADP还原酶 | RXA076 | WO 0100843 | DNA:79蛋白质:80 |
转录调节物LuxR | luxR | WO 0100842 | DNA:297蛋白质:298 |
转录调节物LysR1 | lysR1 | EP 1108790 | DNA:676蛋白质:4176 |
转录调节物LysR2 | lysR2 | EP 1108790 | DNA:3228蛋白质:6728 |
转录调节物LysR3 | lysR3 | EP 1108790 | DNA:2200蛋白质:5700 |
RXA00655调节物 | RXA655 | US2003162267.2 | DNA:1蛋白质:2 |
RXN02910调节物 | RXN2910 | US2003162267.2 | DNA:5蛋白质:6 |
根据本发明从以上列出的基因中选择要调节的靶基因G作为给出的参考。
来自氨基酸生物合成的另一特别优选的蛋白质序列,在每一情况下具有表1所示的此蛋白质的氨基酸序列,其中各个蛋白质在表2第2栏所示的这一氨基酸序列的至少一个氨基酸位置上具有与在表2中同一行的第3栏所示的各个氨基酸不同的生蛋白氨基酸。在另一优选的实施方案中,蛋白质在表2第2栏所示的该氨基酸序列的至少一个氨基酸位置上具有在表2中同一行的第4栏所示的氨基酸。表2中所示蛋白质是氨基酸生物合成途径中的突变蛋白质,其具有特别有利的特性并且因此特别适于通过本发明的启动子构建体表达相应的核酸和生产氨基酸。例如,突变T311I导致要求的反馈抑制被关闭。
可以通过常规方法制备以上表2所述的编码突变蛋白质的相应核酸。
制备突变蛋白质的编码核酸序列的合适的起始点是,例如谷氨酸棒杆菌菌株的基因组(其可以从美国模式培养和保藏所名称为ATCC13032下获得),或表1中涉及的核酸序列。为了将突变蛋白质氨基酸序列反向翻译为编码这些蛋白质的核酸序列,利用该核酸序列被导入的生物或在其中存在该核酸序列的生物的密码子使用是有利的。例如,对于谷氨酸棒杆菌,使用谷氨酸棒杆菌的密码子使用是有利的。可以以本身已知的方式从数据库或专利申请(其描述了目的生物的至少一个蛋白质和编码这一蛋白质的一个基因)确定特定生物的密码子使用。
表2中的信息应该理解如下:
在第1栏“名称”中,显示关于表1的每一序列的清楚的名称
在第2栏“氨基酸位置”,各个数字指来自表1的相应多肽序列的氨基酸位置。在“氨基酸位置”栏“26”相应地意指相应所示多肽序列的氨基酸位置26。位置编号在N末端从+1开始。
在第3栏“氨基酸野生型”,以单独的字母给出在表1序列的相应野生型菌株中在第2栏所示位置的氨基酸名称(以单字母密码表示)。
在第4栏“氨基酸突变体”,以单独的字母给出在相应的突变体菌株中在第2栏所示位置的氨基酸名称(以单字母密码表示)。
在第5栏“功能”,显示相应多肽序列的生理功能。
对于具有特定功能的突变蛋白质(第5栏)和特定的起始氨基酸序列(表1),第2、3和4栏描述了至少一个突变和一些序列的多重突变。这一多重突变经常指在以上每种情况中最接近的起始氨基酸序列(表1)。术语特定氨基酸序列的“至少一个氨基酸位置”优选意指所述这一氨基酸序列在第2、3和4栏的至少一个突变。
生蛋白氨基酸的单字母密码:
A 丙氨酸 I 异亮氨酸 Q 谷氨酰胺
C 半胱氨酸 K 赖氨酸 R 精氨酸
D 天冬氨酸 L 亮氨酸 S 丝氨酸
E 谷氨酸 M 甲硫氨酸 T 苏氨酸
F 苯丙氨酸 N 天冬酰胺 V 缬氨酸
G 甘氨酸 P 脯氨酸 W 色氨酸
H 组氨酸 Y 酪氨酸
表2
第1栏 | 第2栏 | 第3栏 | 第4栏 | 第5栏 |
名称 | 氨基酸位置 | 氨基酸野生型 | 氨基酸突变体 | 功能 |
ask | 317 | S | A | 天冬氨酸激酶 |
311 | T | I | ||
279 | A | T | ||
asd | 66 | D | G | 天冬氨酸-半醛脱氢酶 |
234 | R | H | ||
272 | D | E | ||
285 | K | E | ||
20 | L | F | ||
dapA | 2 | S | A | 二氢吡啶二羧酸合成酶 |
84 | K | N | ||
85 | L | V | ||
dapB | 91 | D | A | 二氢吡啶二羧酸还原酶 |
83 | D | N | ||
ddh | 174 | D | E | 内消旋-二氨基庚二酸D-脱氢酶 |
235 | F | L | ||
237 | S | A | ||
lysA | 265 | A | D | 二氨基吡啶羧酸脱羧酶 |
320 | D | N | ||
332 | I | V | ||
argS | 355 | G | D | 精氨酰-tRNA合成酶 |
156 | A | S | ||
513 | V | A | ||
540 | H | R | ||
zwf | 8 | S | T | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 |
150 | T | A | ||
321 | G | S | ||
gap | 264 | G | S | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 |
pycA | 7 | S | L | 丙酮酸羧化酶 |
153 | E | D | ||
182 | A | S | ||
206 | A | S | ||
227 | H | R | ||
455 | A | G | ||
458 | P | S | ||
639 | S | T | ||
1008 | R | H |
第1栏 | 第2栏 | 第3栏 | 第4栏 | 第5栏 |
1059 | S | P | ||
1120 | D | E | ||
pck | 162 | H | Y | PEP羧化酶 |
241 | G | D | ||
829 | T | R | ||
thrB | 103 | S | A | 高丝氨酸激酶 |
190 | T | A | ||
133 | A | V | ||
138 | P | S | ||
thrC | 69 | G | R | 苏氨酸合酶 |
478 | T | I | ||
RXA330 | 85 | I | M | 苏氨酸排出蛋白 |
161 | F | I | ||
195 | G | D | ||
hom | 104 | V | I | 高丝氨酸脱氢酶 |
116 | T | I | ||
148 | G | A | ||
59 | V | A | ||
270 | T | S | ||
345 | R | P | ||
268 | K | N | ||
61 | D | H | ||
72 | E | Q | ||
lysR1 | 80 | R | H | 转录调节物LysR1 |
lysR3 | 142 | R | W | 转录调节物LysR3 |
179 | A | T | ||
RXA2739 | 75 | N | D | 转酮酶 |
329 | A | T | ||
332 | A | T | ||
556 | V | I | ||
RXA2738 | 242 | K | M | 转醛酶 |
opcA | 107 | Y | H | OpcA |
219 | K | N | ||
233 | P | S | ||
261 | Y | H | ||
312 | S | F | ||
65 | G | R | 天冬氨酸-1-脱羧酶 | |
33 | G | S | 6-磷酸葡糖酸内酯酶 |
遗传修饰的微生物
通过技术人员公知的方法,例如缀合或电穿孔,将本发明的表达单元、上述基因以及上述核酸构建体或表达盒导入微生物,特别是棒杆菌中(例如Liebl等人(1989)FEMS Microbiology Letters 53,299-303)。
优选通过SacB方法选择整合的表达盒。SacB方法是技术人员公知的并且被描述于,例如Schfer A、Tauch A、Jger W、Kalinowski J、ThierbachG、Pühler A.Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derivedfrom the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19:selection of defineddeletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum,Gene.1994Jul 22;145(1):69-73和Blomfield IC、Vaughn V、Rest RF、Eisenstein BI.Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB geneand a temperature-sensitive pSC101 replicon;Mol Microbiol.1991Jun;5(6):1447-57。
给出根据本发明用作起始微生物的参考,那些微生物已经生产可变的目的产品(精细化学品/蛋白质)。
本发明因此还涉及遗传修饰的微生物,其包含本发明的表达盒或包含本发明的表达盒的载体。
本发明特别优选涉及遗传修饰的微生物,特别是棒杆菌,其包含载体,特别是穿梭载体或质粒载体,所述载体带有至少一个本发明的表达盒。
优选的微生物或遗传修饰的微生物是细菌、藻类、真菌或酵母。
具体而言,特别优选的微生物是棒杆菌。
优选的棒杆菌是棒杆菌属细菌,特别是谷氨酸棒杆菌菌种、乙酰谷氨酸棒杆菌菌种、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)菌种、热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)菌种、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)菌种和有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)菌种;或短杆菌属细菌,特别是黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)菌种、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)菌种及叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum)菌种。
特别优选的棒杆菌属与短杆菌属细菌选自:谷氨酸棒杆菌ATCC13032、乙酰谷氨酸棒杆菌ATCC 15806、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870、热产氨棒杆菌FERM BP-1539、栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965、有效棒杆菌DSM 44547、有效棒杆菌DSM 44548、有效棒杆菌DSM 44549、黄色短杆菌ATCC 14067、乳糖发酵短杆菌ATCC 13869、叉开短杆菌ATCC 14020、谷氨酸棒杆菌KFCC 10065及谷氨酸棒杆菌ATCC 21608,还有,例如通过传统突变和选择或通过定向突变从其衍生的菌株。
缩写KFCC意指韩国联邦菌物保藏中心(Korean Federation of CultureCollection),缩写ATCC意指美国模式培养和保藏所,缩写DSM意指德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikrorganismen)。
其它特别优选的棒杆菌属与短杆菌属细菌列于表3中:
细菌 | 保藏号 | ||||||||
属 | 种 | ATCC | FERM | NRRL | CECT | NCIMB | CBS | NCTC | DSMZ |
短杆菌属 | 产氨短杆菌(ammoniagenes) | 21054 | |||||||
短杆菌属 | 产氨短杆菌 | 19350 | |||||||
短杆菌属 | 产氨短杆菌 | 19351 | |||||||
短杆菌属 | 产氨短杆菌 | 19352 | |||||||
短杆菌属 | 产氨短杆菌 | 19353 | |||||||
短杆菌属 | 产氨短杆菌 | 19354 | |||||||
短杆菌属 | 产氨短杆菌 | 19355 | |||||||
短杆菌属 | 产氨短杆菌 | 19356 | |||||||
短杆菌属 | 产氨短杆菌 | 21055 | |||||||
短杆菌属 | 产氨短杆菌 | 21077 | |||||||
短杆菌属 | 产氨短杆菌 | 21553 | |||||||
短杆菌属 | 产氨短杆菌 | 21580 | |||||||
短杆菌属 | 产氨短杆菌 | 39101 | |||||||
短杆菌属 | 丁酸短杆菌(butanicum) | 21196 | |||||||
短杆菌属 | 叉开短杆菌(divaricatum) | 21792 | P928 | ||||||
短杆菌属 | 黄色短杆菌(flavum) | 21474 | |||||||
短杆菌属 | 黄色短杆菌 | 21129 | |||||||
短杆菌属 | 黄色短杆菌 | 21518 | |||||||
短杆菌属 | 黄色短杆菌 | B11474 | |||||||
短杆菌属 | 黄色短杆菌 | B11472 | |||||||
短杆菌属 | 黄色短杆菌 | 21127 | |||||||
短杆菌属 | 黄色短杆菌 | 21128 | |||||||
短杆菌属 | 黄色短杆菌 | 21427 | |||||||
短杆菌属 | 黄色短杆菌 | 21475 | |||||||
短杆菌属 | 黄色短杆菌 | 21517 |
短杆菌属 | 黄色短杆菌 | 21528 | |||||||
短杆菌属 | 黄色短杆菌 | 21529 | |||||||
短杆菌属 | 黄色短杆菌 | B11477 | |||||||
短杆菌属 | 黄色短杆菌 | B11478 | |||||||
短杆菌属 | 黄色短杆菌 | 21127 | |||||||
短杆菌属 | 黄色短杆菌 | B11474 | |||||||
短杆菌属 | 希氏短杆菌(healii) | 15527 | |||||||
短杆菌属 | 酮基谷氨酸短杆菌(ketoglutamicum) | 21004 | |||||||
短杆菌属 | 酮基谷氨酸短杆菌 | 21089 | |||||||
短杆菌属 | ketosoreductum | 21914 | |||||||
短杆菌属 | 乳糖发酵短杆菌(lactofermentum) | 70 | |||||||
短杆菌属 | 乳糖发酵短杆菌 | 74 | |||||||
短杆菌属 | 乳糖发酵短杆菌 | 77 | |||||||
短杆菌属 | 乳糖发酵短杆菌 | 21798 | |||||||
短杆菌属 | 乳糖发酵短杆菌 | 21799 | |||||||
短杆菌属 | 乳糖发酵短杆菌 | 21800 | |||||||
短杆菌属 | 乳糖发酵短杆菌 | 21801 | |||||||
短杆菌属 | 乳糖发酵短杆菌 | B11470 | |||||||
短杆菌属 | 乳糖发酵短杆菌 | B11471 | |||||||
短杆菌属 | 乳糖发酵短杆菌 | 21086 | |||||||
短杆菌属 | 乳糖发酵短杆菌 | 21420 | |||||||
短杆菌属 | 乳糖发酵短杆菌 | 21086 |
短杆菌属 | 乳糖发酵短杆菌 | 31269 | |||||||
短杆菌属 | 亚麻短杆菌(linens) | 9174 | |||||||
短杆菌属 | 亚麻短杆菌 | 19391 | |||||||
短杆菌属 | 亚麻短杆菌 | 8377 | |||||||
短杆菌属 | paraffinolyticum | 11160 | |||||||
短杆菌属 | 短杆菌属某种 | 717.73 | |||||||
短杆菌属 | 短杆菌属某种 | 717.73 | |||||||
短杆菌属 | 短杆菌属某种 | 14604 | |||||||
短杆菌属 | 短杆菌属某种 | 21860 | |||||||
短杆菌属 | 短杆菌属某种 | 21864 | |||||||
短杆菌属 | 短杆菌属某种 | 21865 | |||||||
短杆菌属 | 短杆菌属某种 | 21866 | |||||||
短杆菌属 | 短杆菌属某种 | 19240 | |||||||
棒杆菌属 | 嗜乙酰乙酸棒杆菌(acetoacidophilum) | 21476 | |||||||
棒杆菌属 | 嗜乙酰乙酸棒杆菌 | 13870 | |||||||
棒杆菌属 | 乙酰谷氨酸棒杆菌(acetoglutamicum) | B11473 | |||||||
棒杆菌属 | 乙酰谷氨酸棒杆菌 | B11475 | |||||||
棒杆菌属 | 乙酰谷氨酸棒杆菌 | 15806 | |||||||
棒杆菌属 | 乙酰谷氨酸棒杆菌 | 21491 | |||||||
棒杆菌属 | 乙酰谷氨酸棒杆菌 | 31270 | |||||||
棒杆菌属 | 嗜乙酰棒杆菌(acetophilum) | B3671 | |||||||
棒杆菌属 | 产氨短杆菌 | 6872 | 2399 | ||||||
棒杆菌属 | 产氨短杆菌 | 15511 | |||||||
棒杆菌属 | fujiokense | 21496 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌(glutamicum) | 14067 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 39137 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21254 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21255 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 31830 |
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 13032 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 14305 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 15455 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 13058 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 13059 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 13060 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21492 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21513 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21526 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21543 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 13287 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21851 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21253 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21514 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21516 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21299 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21300 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 39684 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21488 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21649 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21650 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 19223 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 13869 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21157 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21158 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21159 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21355 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 31808 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21674 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21562 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21563 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21564 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21565 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21566 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21567 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21568 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21569 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21570 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21571 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21572 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21573 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21579 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 19049 |
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 19050 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 19051 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 19052 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 19053 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 19054 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 19055 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 19056 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 19057 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 19058 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 19059 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 19060 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 19185 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 13286 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21515 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21527 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21544 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21492 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | B8183 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | B8182 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | B12416 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | B12417 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | B12418 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | B11476 | |||||||
棒杆菌属 | 谷氨酸棒杆菌 | 21608 | |||||||
棒杆菌属 | 百合棒杆菌(lilium) | P973 | |||||||
棒杆菌属 | 嗜氮棒杆菌(nitrilophilus) | 21419 | 11594 | ||||||
棒杆菌属 | 棒杆菌属某种 | P4445 | |||||||
棒杆菌属 | 棒杆菌属某种 | P4446 | |||||||
棒杆菌属 | 棒杆菌属某种 | 31088 | |||||||
棒杆菌属 | 棒杆菌属某种 | 31089 | |||||||
棒杆菌属 | 棒杆菌属某种 | 31090 | |||||||
棒杆菌属 | 棒杆菌属某种 | 31090 | |||||||
棒杆菌属 | 棒杆菌属某种 | 31090 | |||||||
棒杆菌属 | 棒杆菌属某种 | 15954 | 20145 | ||||||
棒杆菌属 | 棒杆菌属某种 | 21857 | |||||||
棒杆菌属 | 棒杆菌属某种 | 21862 | |||||||
棒杆菌属 | 棒杆菌属某种 | 21863 |
这些缩写具有以下含义:
ATCC:美国模式培养和保藏所,Rockville,MD,美国
FERM:发酵研究所,Chiba,日本
NRRL:ARS保藏中心,北方地区研究所(Northern Regional ResearchLaboratory),Peoria,IL,美国
CECT:西班牙典型培养物保藏中心(Coleccion Espanola de CultivosTipo),Valencia,西班牙
NCIMB:国家工业和海洋微生物保藏有限公司,Aberdeen,英国
CBS:真菌菌种保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures),Baarn,荷兰
NCTC:国家典型培养物保藏中心,伦敦,英国
DSMZ:德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen),Brunswick,德国。
这里给出棒杆菌属细菌微生物,特别是已经能够产生L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和/或L-苏氨酸的那些的具体参考。这些特别是例如其中天冬氨酸激酶的编码基因(ask基因)被下调或反馈抑制已经被消除或降低的棒杆菌。例如,这样的细菌具有ask基因的突变,其导致反馈抑制的降低或消除,例如T311I突变。
本发明的表达单元使能够在本发明的上述遗传修饰的微生物中调节特异性生物合成产物的代谢途径。
为此目的,例如,通过影响或增加此生物合成途径基因的转录速率或表达速率来增强产生特异性生物合成产物的代谢途径,在所述代谢途径中,蛋白质量的增加导致目的生物合成途径的这些蛋白质的总活性增加,且因此额外导致向目的生物合成产物的代谢通量增加。
此外,可通过降低某分支的生物合成途径的基因转录速率或表达速率来减弱从特定生物合成产物分支的代谢途径,其中降低的蛋白质量导致非需要的目的生物合成途径的蛋白质总活性降低,且因此额外导致向目的生物合成产物的代谢通量增加。
本发明的遗传修饰的微生物能够产生,例如来自葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或来自甘油与乙醇的生物合成产物。
因此,本发明涉及通过培养本发明的遗传修饰的微生物来产生生物合成产物的方法。
由目的生物合成产物决定,必须增加或降低多种基因的转录速率或表达速率。通常,最好改变多个基因的转录速率或表达速率,即,增加基因组合的转录速率或表达速率和/或降低基因组合的转录速率或表达速率。
在本发明的遗传修饰的微生物中,至少一种基因的改变的(即增加的或降低的)转录速率或表达速率是归因于具有启动子活性的本发明的核酸或本发明的表达单元。
而且,在遗传修饰微生物中其它基因的额外改变的(即额外提高的或额外降低的)转录速率或表达速率可以(但不是必需)来自具有启动子活性的本发明的核酸或本发明的表达单元。
因此,本发明还涉及通过培养本发明的遗传修饰微生物来产生生物合成产物的方法。
V.本发明的应用领域
可以如下所述,在生物合成产物发酵生产的改良方法中特别有利地使用本发明的包含多启动子的表达单元、表达盒和载体。
本发明的包含多启动子的表达单元或包含其的表达盒具有特定优势,能够调节功能连接的结构基因的表达。
可以将本发明的包含多启动子的表达单元或包含其的表达盒用于在微生物中改变(即增加或降低)或影响基因的表达速率(与野生型相比)。这为增加表达速率、使研究基因的表达最大化提供了可能。另一方面,通过选择合适的表达单元,还能够以低于由不同表达单元可获得的最大强度,但是同时更适于表达微生物的量来生产表达产物。当表达产物浓度过高对表达微生物有害时,这是特别有利的。因此,特别是对于长期表达,通过在各个情况下选择具有不同表达强度的表达单元,从而使本发明的表达单元能够精细的调节表达至最佳值。
本发明的表达单元或包含所述表达单元的表达盒还可以在微生物,特别是棒杆菌菌种中,调节和增加多种生物合成产物(例如精细化学品、蛋白质,特别是氨基酸)的形成。
因此,本发明涉及本发明的包含多启动子的表达单元在调节产物生物合成中的用途。这里,将涉及产物生物合成调节蛋白质的基因置于这样的表达单元控制之下。所述产物生物合成依赖于所选择的包含多启动子的表达单元转录速率的影响。或者,可以在微生物中将涉及产物生物合成蛋白质的基因作为本发明的表达盒的组分表达,并且由此可以通过表达的蛋白质调节所述产物生物合成。如果多启动子的活性弱于内源启动子,还可以使用多启动子以减弱特定的不需要的生物合成途径。
还可以通过一个或多个组成所述多启动子的单个启动子的特异性突变来调节本发明包含多启动子表达单元的转录速率。可以通过替换RNA聚合酶全酶结合位点(对技术人员也称为-10区和-35区)的结合位点之中的核苷酸获得增加的或降低的启动子活性。还可以这样进一步地施加影响:通过核苷酸缺失或核苷酸***减少或延长在所述RNA聚合酶全酶结合位点之间的距离;此外,通过将调节蛋白质(技术人员称为阻遏蛋白或激活蛋白)的结合位点(技术人员也称为操纵基因)置于与RNA聚合酶全酶结合位点空间邻近的位置,使这些调节物在与启动子序列结合后减弱或增强RNA聚合酶全酶的结合和转录活性,或还使所述结合和转录活性受到新的调节影响。也可以通过突变本发明包含多启动子的表达单元之中单个启动子Py的介导核糖体结合的3’末端序列区影响翻译活性。
VI.生物合成产物和优选的生产方法
优选的根据本发明制备的生物合成产物为精细化学品。
术语“精细化学品”为技术人员所熟知并且包括由生物产生且用于多种工业领域中的化合物,所述工业领域例如(但不限于)医药业、农业、化妆品业、食品业及饲料业。这些化合物包括有机酸(例如乳酸、琥珀酸、酒石酸、衣康酸及二氨基庚二酸)、和生蛋白氨基酸及非生蛋白氨基酸、嘌呤碱及嘧啶碱、核苷及核苷酸(例如,Kuninaka,A.(1996)在Nucleotides andrelated compounds,第561-612页,Biotechnology第6卷,Rehm等人,编者,VCH:Weinheim中及其中出现的参考文献中所述的)、类脂、饱和与不饱和脂肪酸(例如花生四烯酸)、二元醇(例如丙二醇及丁二醇)、碳水化合物(例如透明质酸及海藻糖)、芳香化合物(例如芳香胺、香草醛及靛蓝)、维生素及辅因子(如Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry,第A27卷,“Vitamins”,第443-613页(1996)VCH:Weinheim及其中出现的参考文献中及Ong,A.S.、Niki,E.和Packer,L.(1995)“Nutrition,Lipids,Health and Disease”Proceedings of the UNESCO/Confederation ofScientific and Technological Associations in Malaysia and the Society forFree Radical Research-Asia,1994年9月1-3日于马来西亚槟城举行,AOCS Press(1995)中所述)、酶及所有其它化学品(由Gutcho(1983)在Chemicals by Fermentation,Noyes Data Corporation,ISBN:0818805086及其中提到的参考文献中所述)。
特别优选的生物合成产物选自:有机酸、蛋白质、核苷酸及核苷、生蛋白氨基酸及非生蛋白氨基酸、类脂及脂肪酸、二元醇、碳水化合物、芳香化合物、维生素及辅因子、酶及蛋白质。
优选的有机酸为乳酸、琥珀酸、酒石酸、衣康酸及二氨基庚二酸。
优选的核苷及核苷酸描述于,例如Kuninaka,A.(1996)Nucleotidesand related compounds,第561-612页,Biotechnology,第6卷,Rehm等人,编者,VCH:Weinheim及其中提到的参考文献中。
其它优选的生物合成产物是类脂、饱和及不饱和脂肪酸(例如花生四烯酸)、二元醇(例如丙二醇及丁二醇)、碳水化合物(例如透明质酸及海藻糖)、芳香化合物(例如芳香胺、香草醛及靛蓝)、维生素及辅因子(例如Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry,第A27卷,“Vitamins”,第443-613页(1996)VCH:Weinheim与其中出现的参考文献;以及Ong,A.S.、Niki,E.与Packer,L.(1995)“Nutrition,Lipids,Health and Disease”Proceedings ofthe UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations inMalaysia and the Society for Free Radical Research-Asia,1994年9月1-3日于马来西亚槟城举行,AOCS Press(1995))中所述)、酶、聚酮化合物(Cane等人(1998)Science 282:63-68)以及由Gutcho(1983)在Chemicals byFermentation,Noyes Data Corporation,ISBN:0818805086及其中提到的参考文献所述的所有其它化学品。
特别优选的生物合成产物为氨基酸,特别优选必需氨基酸,特别是L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸以及L-苏氨酸、L-高丝氨酸,尤其是L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和L-苏氨酸。例如赖氨酸、甲硫氨酸及苏氨酸的氨基酸在下文的各种情况下意指L及D型氨基酸二者,优选L型,即例如L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氨酸。
以下部分对特别优选的赖氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸的制备方法进行具体描述。
a)赖氨酸的制备
具体地,本发明涉及通过培养遗传修饰的微生物来生产赖氨酸的方法,与野生型相比,所述遗传修饰微生物的至少一种基因具有提高或受影响的速率,其中
-微生物中至少一种内源基因的表达活性受到本发明表达单元的调节,或
-微生物中至少一种基因的表达受到导入所述微生物中的包含所述基因的本发明表达盒的影响或被其改变。
这里这些基因具体选自:编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱氢酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱羧酶的核酸、编码二氢吡啶二羧酸合成酶的核酸、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码转录调节物LuxR的核酸、编码转录调节物LysR1的核酸、编码转录调节物LysR2的核酸、编码苹果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸、编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码赖氨酸输出子的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码精氨酰-tRNA合成酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码果糖-1,6-二磷酸酶的核酸、编码蛋白质OpcA的核酸、编码1-磷酸果糖激酶的核酸、编码6-磷酸果糖激酶的核酸、编码四氢吡啶羧酸琥珀酰酶的核酸、编码琥珀酰氨基酮庚二酸氨基转移酶的核酸、编码琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶的核酸、编码二氨基庚二酸差向异构酶的核酸、编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的核酸、编码葡萄糖磷酸异构酶的核酸、编码磷酸甘油酸变位酶的核酸、编码烯醇化酶的核酸、编码丙酮酸激酶的核酸、编码天冬氨酸转氨酶的核酸以及编码苹果酸酶的核酸。
上述制备赖氨酸方法的另一优选实施方案包含遗传修饰的微生物,其与野生型相比,额外具有至少一种增加的活性,该活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸半醛脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱羧酶活性、二氢吡啶二羧酸合成酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、转录调节物LuxR的活性、转录调节物LysR1的活性、转录调节物LysR2的活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性、转酮酶活性、转醛酶活性、赖氨酸输出子活性、精氨酰-tRNA合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、果糖-1,6-二磷酸酶活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、生物素连接酶活性以及四氢吡啶羧酸琥珀酰酶活性、琥珀酰氨基酮庚二酸氨基转移酶活性、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶活性、二氨基庚二酸差向异构酶活性、6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性、葡萄糖磷酸异构酶活性、磷酸甘油酸变位酶活性、烯醇化酶活性、丙酮酸激酶活性、天冬氨酸转氨酶活性及苹果酸酶活性。
上述制备赖氨酸方法的另一特别优选的实施方案包含遗传修饰微生物,其与野生型相比,额外具有至少一种降低的活性,该活性选自苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、高丝氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、苏氨酸输出子活性、苏氨酸排出蛋白活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性以及苏氨酸合酶活性。
b)甲硫氨酸的制备
本发明还涉及通过培养遗传修饰的微生物来制备甲硫氨酸的方法,所述遗传修饰的微生物与野生型相比,有至少一种基因的表达速率提高或受影响,其中
-微生物中至少一种内源基因的表达活性受到本发明的表达单元调节,或
-微生物中至少一种基因的表达受到导入所述微生物的本发明包含所述基因的表达单元的影响或被其改变。
其中这些基因具体选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸、编码高丝氨酸脱氢酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的核酸、编码胱硫醚γ合酶的核酸、编码胱硫醚β裂合酶的核酸、编码丝氨酸羟甲基转移酶的核酸、编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的核酸、编码亚甲基四氢叶酸还原酶的核酸、编码磷酸丝氨酸氨基转移酶的核酸、编码磷酸丝氨酸磷酸酶的核酸、编码丝氨酸乙酰转移酶的核酸、编码半胱氨酸合酶I活性的核酸、编码半胱氨酸合酶II活性的核酸、编码辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶的核酸、编码非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶的核酸、编码硫酸腺苷酰转移酶的核酸、编码磷酸腺苷磷酰硫酸还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白亚硫酸盐还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白NADPH-还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247的核酸、编码RXA0655调节物的核酸以及编码RXN2910调节物的核酸、编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、天冬氨酸转氨酶或苹果酸酶的核酸。
上述制备甲硫氨酸方法的另一优选实施方案包含遗传修饰微生物,其与野生型相比,额外具有至少一种增加的活性,该活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸半醛脱氢酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、胱硫醚γ合酶活性、胱硫醚β裂合酶活性、丝氨酸羟甲基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、亚甲基四氢叶酸还原酶活性、磷酸丝氨酸氨基转移酶活性、磷酸丝氨酸磷酸酶活性、丝氨酸乙酰转移酶活性、半胱氨酸合酶I活性、半胱氨酸合酶II活性、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、硫酸腺苷酰转移酶活性、磷酸腺苷磷酰硫酸还原酶活性、铁氧还蛋白亚硫酸盐还原酶活性、铁氧还蛋白NADPH-还原酶活性、铁氧还蛋白活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077的活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248的活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247的活性、RXA655调节物的活性以及RXN2910调节物的活性、6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性、葡萄糖磷酸异构酶活性、磷酸甘油酸变位酶活性、烯醇化酶活性、丙酮酸激酶活性、天冬氨酸转氨酶活性和苹果酸酶活性。
上述制备甲硫氨酸方法的另一特别优选的实施方案包含遗传修饰的微生物,其与野生型相比,额外具有至少一种降低的活性,该活性选自高丝氨酸激酶活性、苏氨酸脱水酶活性、苏氨酸合酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氢吡啶二羧酸合酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性及二氨基吡啶羧酸脱羧酶活性。
c)苏氨酸的制备
本发明还涉及通过培养遗传修饰的微生物来制备苏氨酸的方法,所述遗传修饰的微生物与野生型相比,有至少一种基因的表达速率提高或受影响,其中
-微生物中至少一种内源基因的表达活性受到本发明表达单元的调节,或
-微生物中至少一种基因的表达受到导入所述微生物的本发明包含所述基因的表达单元的影响或被其改变。
其中这些基因具体选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码高丝氨酸激酶的核酸、编码苏氨酸合酶的核酸、编码苏氨酸输出子载体的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码苹果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的核酸、编码赖氨酸输出子的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码苏氨酸排出蛋白的核酸、编码果糖-1,6-二磷酸酶的核酸、编码OpcA蛋白质的核酸、编码1-磷酸果糖激酶的核酸、编码6-磷酸果糖激酶的核酸及编码高丝氨酸脱氢酶的核酸,以及编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、天冬氨酸转氨酶和苹果酸酶的核酸。
上述制备苏氨酸方法的另一优选实施方案包含遗传修饰微生物,其与野生型相比,额外具有至少一种增加的活性,该活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸半醛脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、苏氨酸合酶活性、苏氨酸输出子载体活性、转醛酶活性、转酮酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、高丝氨酸激酶活性、生物素连接酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、苏氨酸排出蛋白活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、果糖-1,6-二磷酸酶活性、6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性和高丝氨酸脱氢酶活性、以及6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性、葡萄糖磷酸异构酶活性、磷酸甘油酸变位酶活性、烯醇化酶活性、丙酮酸激酶活性、天冬氨酸转氨酶活性和苹果酸酶活性。
上述制备苏氨酸方法的另一特别优选的实施方案包含遗传修饰微生物,其与野生型相比,额外具有至少一种降低的活性,该活性选自苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、丝氨酸羟甲基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氢吡啶二羧酸合成酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性、赖氨酸输出子活性、乙酰乳酸合酶活性、乙酮醇-酸还原异构酶活性、支链氨基转移酶活性、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、二羟基-酸脱水酶活性以及二氨基吡啶羧酸脱羧酶活性。
d)制备本发明生物产品的更多信息
可以(但非必需)通过本发明的表达单元或本发明的表达盒引起至少一种上述活性的额外增加或降低。
术语蛋白质的“活性”在酶的情况下意指相应蛋白质的酶活性,且在其它蛋白质(如结构蛋白或转运蛋白)的情况下意指蛋白质的生理活性。
酶通常能将底物转化为产物,或催化该转化步骤。因此,酶的“活性”意指在特定时间内由酶转化的底物量,或形成的产物量。
因此,当与野生型相比活性增加时,在特定时间内由酶转化的底物量或所形成的产物量与野生型相比增加。
例如,就本文中所述的所有活性而言,“活性”的增加总计为“野生型活性”的至少1-5%,例如“野生型活性”的至少20%、至少50%、至少100%、至少300%、或至少500%、或至少600%。
因此,当与野生型相比活性降低时,在特定时间内由酶转化的底物量或形成的产物量与野生型相比减少。
降低的活性优选意指基于多种细胞生物学机制,在微生物中部分或基本完全的抑制或阻断该酶功能。
活性的降低包含酶的数量减少直至基本上完全丧失(即,缺乏相应活性的可检测性或缺乏该酶的免疫可检测性)。与野生型相比,微生物中活性优选降低至少5%,例如至少20%、至少50%、或约100%。“降低”也特别意指完全丧失相应活性。
通过已知的方法,例如酶测定可测量遗传修饰的微生物及野生型中特定酶的活性,并由此可以测量酶活性的增加或降低。
可以以多种方式额外增加活性,例如通过关闭在表达及蛋白质水平上的抑制性调节机制,或通过增加(与野生型相比)编码上述蛋白质的核酸的基因表达。
同样地,可以以多种方式增加(与野生型相比)编码上述蛋白质的核酸的基因表达,例如通过激活物诱导基因,或如上所述,通过增加启动子活性或增加表达活性或通过将一个或多个基因拷贝导入微生物。
根据本发明,增加蛋白质编码核酸的基因表达也意指对微生物固有内源蛋白质的表达的操纵。如上所述,这可通过例如改变基因的启动子序列、导入用于调节性控制基因的本发明的表达单元和改变导入的本发明的表达单元来实现。例如,可通过缺失或***DNA序列来进行这样的改变,其导致基因表达速率增加。
如上所述,通过施加外源刺激来改变内源蛋白质的表达是可能的。这可以通过特定的生理条件,即通过外源物质的使用而进行。
本领域的技术人员可借助于更多的不同操作(单独或组合地)实现基因表达的增加。因此,例如可以增加合适基因的拷贝数,或突变启动子及调节区或位于结构基因上游的核糖体结合位点。另外,可以通过诱导型启动子增加发酵生产过程中的表达。延长mRNA存在时间的操作同样增加表达。通过阻止酶蛋白质的降解同样也可增强酶活性。基因或基因构建体可以以不同拷贝数存在于质粒中,或在染色体中整合并扩增。或者,也可通过改变培养基的组成及对培养物的管理来获得相关基因的过表达。
技术人员可尤其在Martin等人(Biotechnology 5,137-146(1987))、Guerrero等人(Gene 138,35-41(1994))、Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6,428-430(1988))、Eikmanns等人(Gene 102,93-98(1991))、在EP-A 0472869、US-A 4,601,893、在Schwarzer和Pühler(Biotechnology 9,84-87(1991))、Reinscheid等人(Applied andEnvironmental Microbiology 60,126-132(1994))、LaBarre等人(Journal ofBacteriology 175,1001-1007(1993))、在WO 96/15246、在Malumbres等人(Gene 134,15-24(1993))、在JP-A-10-229891、在Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58,191-195(1998))、Makrides(Microbiological Reviews 60:512-538(1996))及众所周知的遗传与分子生物学教科书中发现对此的指导。
此外,除了基因的表达或增强作用,消除不需要的副反应对产生生物合成产物,尤其是L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氨酸是额外有利的(Nakayama:“Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms”,Overproduction of Microbial Products,Krumphanzl,Sikyta,Vanek(编者),Academic Press,London,英国,1982)。
在优选的实施方案中,通过将至少一种编码相应蛋白质的核酸导入微生物中来增加编码上述蛋白质之一的核酸的基因表达。核酸的导入可在染色体上或染色体外发生,即通过增加染色体上的拷贝数和/或增加在宿主微生物中复制的质粒的基因拷贝。
核酸的导入(例如,以包含该核酸的本发明的表达盒形式)优选在染色体上发生,特别是通过上述SacB方法进行。原则上,为此目的,可能使用编码上述蛋白质之一的任何基因。
在包含内含子的真核来源的基因组核酸序列情况下,若宿主微生物不能表达相应蛋白质或不能使其表达相应蛋白质,优选使用已经处理过的核酸序列,例如相应的cDNA。
相应基因的实例列于表1和表2中。
优选通过以下方法中的至少一种降低微生物中的上述活性:
●导入至少一种诱导共抑制的有义核糖核酸序列或确保其表达的表达盒
●导入至少一种针对相应基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子或蛋白质结合因子或确保其表达的表达盒
●导入至少一种引起RNA降解的病毒核酸序列或确保其表达的表达盒
●导入至少一种产生功能丧失的构建体,所述功能缺失是例如通过在基因中产生***、缺失、倒置或突变产生基因的终止密码子或阅读框移位。可能并优选通过同源重组使靶向***片段进入目的靶基因中,或导入针对靶基因的序列特异性核酸酶来产生敲除突变体。
●导入具有降低的启动子活性的启动子或导入具有降低的表达活性的表达单元。
●导入减少有义RNA(mRNA)翻译的反义RNA。
本领域的技术人员知道在本发明的范畴内还可使用其它方法来降低其活性或功能。例如,导入蛋白质的显性失活变体或确保其表达的表达盒也是有利的。
此外,可以使用这些方法中的每一种引起蛋白质量、mRNA量和/或蛋白质活性的降低。也可以想到将这些方法组合使用。其它方法是本领域的技术人员已知的,其可以包括阻止或抑制蛋白质加工、蛋白质或其mRNA转运、抑制染色体附着、抑制RNA剪接、诱导降解RNA的酶和/或抑制翻译延伸或终止。
VII.微生物培养及产物分离
在制备生物合成产物的本发明方法中,优选在培养遗传修饰的微生物步骤之后从微生物和/或发酵肉汤中分离生物合成产物。这些步骤可以同时发生和/或优选在培养步骤之后进行。
可以连续或间断地以分批法(分批培养)或补料分批法或重复补料分批法培养本发明的遗传修饰的微生物,产生生物合成产物,特别是L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氨酸。已知培养方法的概述可在Chemiel(Bioprozeβtechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(GustavFischer Verlag,Stuttgart,1991))的教科书或在Storhas(Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen(Vieweg Verlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))的教科书中发现。
使用的培养基必须以适当地方式满足各个菌株的要求。在“Manual ofMethods for General Bacteriology”of the American Society forBacteriology(Washington D.C.美国,1981)手册中描述了用于多种微生物的培养基。
根据本发明,这些可使用的培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。
优选的碳源为例如单糖、二糖或多糖的糖。非常好的碳源的实例为葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。也可以经由例如糖蜜的复合物或糖精制中的其它副产物将糖加入培养基中。添加多种碳源的混合物也是有益的。其它可能的碳源为油和脂肪,例如大豆油、葵花子油、花生油及椰子脂肪;脂肪酸,例如棕榈酸、硬脂酸或亚油酸;醇,例如甘油、甲醇或乙醇以及有机酸,例如乙酸或乳酸。
氮源通常为有机或无机氮化合物或含有这些化合物的物质。氮源的实例包括氨气或例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵的铵盐、硝酸盐、尿素、氨基酸或例如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏及其它物质的复合氮源。氮源可单独使用或作为混合物使用。
可存在于培养基中的无机盐化合物包含钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜及铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。
为了制备精细化学品,尤其是甲硫氨酸,可能使用以下物质作为硫源:无机化合物,例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物,以及有机硫化合物,例如硫醇及某硫醇(thiol)。
可以使用以下物质作为磷源:磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。
为了保持溶液中的金属离子,可将螯合剂添加到培养基中。特别适合的螯合剂包括二羟基酚类(dihydroxyphenol),例如儿茶酚或原儿茶酸盐,或有机酸,例如柠檬酸。
根据本发明,使用的发酵培养基通常也包含例如维生素或生长促进剂的其它生长因子,其包括,例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸及吡哆醇。生长因子及盐通常来自例如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等培养基的复合成份。也可将合适的前体添加至培养基中。培养基中化合物的精确组成很大程度上视具体实验而定,且将由各具体状况分别确定。优化的培养基的信息获自教科书“Applied Microbiol.Physiology,A PracticalApproach”(编者为P.M.Rhodes,P.F. Stanbury,IRL Press(1997)第53-73页,ISBN 0199635773)。也可从例如Standard 1(Merck)或BHI(脑心浸出液,DIFCO)等商业供应商购买生长培养基。
将培养基的所有成分通过加热(在1.5巴和121℃,20分钟)或无菌过滤灭菌。可将成分一起灭菌或视需要分开灭菌。所有培养基成分可在培养开始即存在或任选连续或分批加入。
培养物的温度通常在15℃与45℃之间,优选在25℃至40℃,且在实验过程中可保持恒定或变化。培养基的pH值应处于5至8.5的范围内,优选为7.0左右。在培养期间可通过添加例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水的碱性化合物或例如磷酸或硫酸的酸性化合物来控制培养需要的pH值。可通过使用例如脂肪酸聚乙二醇酯的防泡剂来控制泡沫的形成。可通过向培养基中添加具有选择作用的合适物质,例如抗生素来维持质粒的稳定性。通过向培养基中导入氧或含氧的气体混合物(例如周围的空气)来维持需氧条件。培养物的温度通常为20℃至45℃。持续培养直至目的产物的形成达到最大。通常在10小时至160小时内达到该目标。
以这一方式获得的发酵肉汤的干物质含量通常为7.5至25%(以重量计)。
此外,最好还至少在发酵末期进行糖限制(sugar limitation),但具体地,在超过发酵时间的至少30%时进行。这意指在此期间发酵培养基中可利用的糖浓度保持在0至3g/l,或是降低的。
根据目的生物合成产物及生物合成副产物的物理/化学特性,以本身已知方式从发酵肉汤和/或微生物中分离生物合成产物。
例如,可接着进一步处理发酵肉汤。视需要而定,可通过分离方法(例如离心、过滤、倾析或这些方法的组合)从发酵肉汤中全部或部分地移出生物质或将其全部保留于其中。
接着可用已知方法,例如借助于旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜式蒸发器浓缩发酵肉汤通过逆渗透或纳米过滤来浓缩发酵肉汤。然后通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾制粒或其它方法来处理该浓缩的发酵肉汤。
另外,也可以进一步纯化生物合成产物,尤其是L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氨酸。为此目的,在除去生物质之后,使用适合的树脂对含有产物的肉汤进行层析,目的产物或杂质被全部或部分地保留于层析树脂上。若需要,则可使用相同或不同的层析树脂重复进行这些层析步骤。本领域的技术人员精通于选择适合的层析树脂及其最有效的使用方法。可通过过滤或超滤来浓缩纯化的产物,并保存于产物稳定性最大的温度。
生物合成产物可以各种形式产生,例如以其盐或酯的形式。
可用现有技术测定分离的化合物的特性及纯度。这些现有技术包括高效液相层析法(HPLC)、光谱法、染色法、薄层层析法、NIRS、酶测定或微生物测定。这些分析方法概述于:Patek等人(1994)Appl.Environ.Microbiol.60:133-140;Malakhova等人(1996)Biotekhnologiya 1127-32及Schmidt等人(1998)Bioprocess Engineer.19:67-70.Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry(1996)第A27卷,VCH:Weinheim,第89-90页、第521-540页、第540-547页、第559-566页、575-581页及第581-587页;Michal,G(1999)Biochemical Pathways:An Atlas of Biochemistryand Molecular Biology,John Wiley and Sons;Fallon,A.等人(1987)Applications of HPLC in Biochemistry in:Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology,第17卷中。
现通过以下非限定性实施例更详细地描述本发明:
具体实施方式
实施例1:
载体pCLiK5MCS的制备
首先,使用寡核苷酸引物SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6,通过聚合酶链式反应(PCR)来扩增载体pBR322的氨苄青霉素(ampicillin)抗性及复制起点。
SEQ ID NO:5
5’-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3’
SEQ ID NO:6
5’-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3’
除了pBR322的互补序列外,寡核苷酸引物SEQ ID NO:5沿5’-3’方向含有限制性内切核酸酶Sma I、BamH I、Nhe I及Asc I的酶切位点,寡核苷酸引物SEQ ID NO:6沿5’-3’方向含有限制性内切核酸酶Xba I、XhoI、Not I及Dra I的酶切位点。通过例如Innis等人(PCR Protocols.A Guideto Methods and Applications,Academic Press(1990))的标准方法,用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene,La Jolla,美国)进行PCR反应。根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Gel Band PurificationKit)(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化得到的约2.1kb大小的DNA片段。根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)将该DNA片段的平末端连接在一起,且通过如Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
根据产品说明书使用Qiaprep离心式小量制备试剂盒(Qiaprep Spinmniprep Kit)(Qiagen,Hilden,德国)分离单个克隆的质粒DNA,且通过限制性内切酶消化来检查。以该方式得到的质粒命名为pCLiK1。
从作为PCR反应模板的质粒pWLT1(Liebl等人,1992)开始,使用寡核苷酸引物SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8扩增卡那霉素抗性盒。
SEQ ID NO:7:
5’-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGC GGA-3’
SEQ ID NO:8
5’-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3’
除了与pWLT1互补的序列外,寡核苷酸引物SEQ ID NO:7沿5’-3’方向含有限制性内切核酸酶Xba I、Sma I、BamH I、Nhe I的酶切位点,寡核苷酸引物SEQ ID NO:8沿5’-3’方向含有限制性内切核酸酶Asc I及Nhe I的酶切位点。通过例如Innis等人(PCR Protocols.A Guide to Methodsand Applications,Academic Press(1990))的标准方法,用PfuTurbo聚合酶(Stratagene,La Jolla,美国)进行PCR反应。根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化得到的约1.3kb大小的DNA片段。根据产品说明书以限制性内切核酸酶Xba I及Asc I(New England Biolabs,Beverly,美国)切割DNA片段,且随后使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)再次纯化。同样地,以限制性内切核酸酶Xba I及Asc I切割载体pCLiK1,且根据产品说明书用碱性磷酸酶(I(Roche Diagnostics,Mannheim))去磷酸化。在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳之后,根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)分离线性化的载体(约2.1kb)。根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)将该载体片段与经切割的PCR片段连接,且通过如Sambrook等人(Molecular Cloning.A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有氨苄青霉素(50μg/ml)及卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
根据产品说明书使用Qiaprep离心式小量制备试剂盒(Qiagen,Hilden,德国)分离单个克隆的质粒DNA,且通过限制性内切酶消化来检查。以该方式得到的质粒命名为pCLiK2。
以限制性内切核酸酶Dra I(New England Biolabs,Beverly,美国)切割载体pCLiK2。在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳之后,根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)分离约2.3kb大小的载体片段。根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)重新连接该载体片段,且通过如Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
根据产品说明书使用Qiaprep离心式小量制备试剂盒(Qiagen,Hilden,德国)分离单个克隆的质粒DNA,且通过限制性内切酶消化来检查。以该方式得到的质粒命名为pCLiK3。
从作为PCR反应模板的质粒pWLQ2(Liebl等人,1992)开始,使用寡核苷酸引物SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10扩增pHM1519复制起点。
SEQ ID NO:9:
5’-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3’
SEQ ID NO:10:
5’-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3’
除了与pWLQ2互补的序列外,寡核苷酸引物SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10含有限制性内切核酸酶NotI的酶切位点。通过例如Innis等人(PCRProtocols.A Guide to Methods and Applications,Academic Press(1990))的标准方法,用PfuTurbo聚合酶(Stratagene,La Jolla,美国)进行PCR反应。根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)纯化得到的约2.7kb大小的DNA片段。根据产品说明书以限制性内切核酸酶NotI(New England Biolabs,Beverly,美国)切割该DNA片段,且以GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)再次进行纯化。同样地,以限制性内切核酸酶Not I切割载体pCLiK3,且根据产品说明书用碱性磷酸酶(I(Roche Diagnostics,Mannheim))去磷酸化。在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳之后,根据产品说明书以GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)分离线性化的载体(约2.3kb)。根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)将该载体片段与经切割的PCR片段连接,且通过如Sambrook等人(Molecular Cloning.A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
根据产品说明书使用Qiaprep离心式小量制备试剂盒(Qiagen,Hilden,德国)分离单个克隆的质粒DNA,且通过限制性内切酶消化来检查。以该方式得到的质粒命名为pCLiK5。
为了通过“多克隆位点”(MCS)延伸pCLiK5,将两条合成的基本互补的寡核苷酸SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:12混合,一起加热至95℃,接着缓慢冷却从而得到双链DNA片段,所述寡核苷酸SEQ ID NO:11与SEQ IDNO:12含有限制性内切核酸酶Swa I、Xho I、AatI、Apa I、Asp718、Mlu I、Nde I、Spe I、EcoRV、Sal I、Cla I、BamH I、Xba I及Sma I的酶切位点。
SEQ ID NO:11:
5’-TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATATGACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAACAATTGGGATCCTCTAGACCCGGGATTTAAAT-3’
SEQ ID NO:12:
5’-GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAGCATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCGGGCCCGACGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT-3’
以限制性内切核酸酶Xho I及BamH I(New England Biolabs,Beverly,美国)切割载体pCLiK5,并根据产品说明书用碱性磷酸酶(I(RocheDiagnostics,Mannheim))去磷酸化。在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳之后,根据产品说明书以GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)分离线性化的载体(约5.0kb)。根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)将载体片段与合成的双链DNA片段连接,且通过如Sambrook等人(Moleeular Cloning.ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
根据产品说明书使用Qiaprep离心式小量制备试剂盒(Qiagen,Hilden,德国)分离单个克隆的质粒DNA,且通过限制性内切酶消化来检查。以该方式得到的质粒命名为pCLiK5MCS。
根据Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy ofSciences美国74:5463-5467的描述进行测序反应。通过ABI Prism 377(PEApplied Biosystems,Weiterstadt)对测序反应进行分级和评估。
将得到的质粒pCLiK5MCS列为SEQ ID NO:13。
实施例2:
质粒PmetA metA的制备
根据Tauch等人(1995)Plasmid 33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 140:1817-1828制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032染色体DNA。通过如Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications,Academic Press所述标准方法以聚合酶链式反应(PCR)扩增包括非编码5’区的metA基因,该PCR反应使用寡核苷酸引物SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15,以染色体DNA作为模板并且使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)。
SEQ ID NO:14
5‘-GCGCGGTACCTAGACTCACCCCAGTGCT-3‘
和
SEQ ID NO:15
5‘-CTCTACTAGTTTAGATGTAGAACTCGATGT-3‘
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化得到的约1.3kb大小的DNA片段。接着以限制性内切核酸酶Asp718和Spe I(Roche Diagnostics,Mannheim)切割,且使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化DNA片段。
以限制性内切核酸酶Asp718和Spe I切割载体pClik5MCS SEQ IDNO:13,并且在电泳分级之后,使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒分离出5kb片段。
根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)将载体片段与PCR片段连接,且通过如Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
通过多种方法及使用Quiagen的材料制备质粒DNA。根据Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences美国74:5463-5467的描述进行测序反应。通过ABI Prism 377(PE AppliedBiosystems,Weiterstadt)对测序反应进行分级和评估。
将产生的质粒pCLiK5MCS PmetA metA列为SEQ ID NO:16。
实施例3:
质粒pCLiK5MCS Psod metA的制备
根据Tauch等人(1995)Plasmid 33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 140:1817-1828制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032染色体DNA。通过如Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications,Academic Press所述标准方法以聚合酶链式反应(PCR)扩增从超氧化物歧化酶(Psod)的非编码5’区(表达单元区)起约200碱基对的DNA片段,该PCR反应使用寡核苷酸引物SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18,以染色体DNA作为模板并且使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)。
SEQ ID NO:17
5‘-GAGACTCGAGAGCTGCCAATTATTCCGGG-3‘
和
SEQ ID NO:18
5‘-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGGGTAAAAAATCCTTTCG-3‘
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化得到的DNA片段。
以PmetA metA SEQ ID NO:16质粒作为PCR反应模板开始,使用寡核苷酸引物SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20部分的扩增metA。
SEQ ID NO:19
5‘-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3‘
和
SEQ ID NO:20
5‘-CTGGGTACATTGCGGCCC-3‘
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化得到的约470碱基对大小的DNA片段。
在下一步的PCR反应中将以上获得的两个片段一起用作模板。在PCR反应期间,寡核苷酸引物SEQ ID NO:18引入的metA同源序列使两个片段彼此相连,并且通过所用的聚合酶使其延伸得到连续的DNA链。
修改标准方法,从而仅在第2次循环的开始向反应混合物加入使用的寡核苷酸引物SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:20。
根据产品说明书使用GFXTMpCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化得到的约675碱基对大小的扩增的DNA片段。接着以限制性内切核酸酶Xho I和Nco I(Roche Diagnostics,Mannheim)切割,且通过凝胶电泳分离。随后使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)从琼脂糖纯化出约620碱基对的DNA片段。
以限制性内切核酸酶Nco I和Spe I(Roche Diagnostics,Mannheim)切割PmetA metA SEQ ID NO:16质粒。在凝胶电泳分离之后,使用GFXTMpCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒从琼脂糖纯化约0.7kb的metA片段。
以限制性内切核酸酶Xho I和Spe I(Roche Diagnostics,Mannheim)切割pClik5MCS SEQ ID NO:13载体,且在凝胶电泳分离之后,使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒分离出5kb片段。
根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)将载体片段与PCR片段以及metA片段连接在一起,且通过如Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
通过多种方法及使用Quiagen的材料制备质粒DNA。根据Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences美国74:5463-5467的描述进行测序反应。通过ABI Prism 377(PE AppliedBiosystems,Weiterstadt)对测序反应进行分级和评估。
将得到的质粒pCLiK5MCS PSODmetA列为SEQ ID NO:21。
实施例4:
质粒pCLiK5MCS P EF-TU metA的制备
根据Tauch等人(1995)Plasmid 33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 140:1817-1828制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032染色体DNA。通过如Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications,Academic Press所述标准方法以聚合酶链式反应(PCR)扩增从超氧化物歧化酶(Psod)的非编码5’区(启动子区)起约200碱基对的DNA片段,该PCR反应使用寡核苷酸引物SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23,以染色体DNA作为模板并且使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)。
SEQ ID NO:22
5‘-GAGACTCGAGGGCCGTTACCCTGCGAATG-3‘
和
SEQ ID NO:23
5‘-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATTGTATGTCCTCCTGGAC-3‘
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化得到的DNA片段。
以PmetA metA SEQ ID NO:16质粒作为PCR反应模板起始,使用寡核苷酸引物SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25,部分扩增metA。
SEQ ID NO:24
5‘-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3‘
和
SEQ ID NO:25
5‘-CTGGGTACATTGCGGCCC-3‘
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化得到的约470碱基对的DNA片段
在下一步的PCR反应中将以上获得的两个片段一起用作模板。在PCR反应期间,寡核苷酸引物SEQ ID NO:18引入的metA同源序列使两个片段彼此相连,并且通过所用的聚合酶使其延伸得到连续的DNA链。修改标准方法,从而仅在第2次循环的开始向反应混合物加入使用的寡核苷酸引物SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:25。
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化约675碱基对大小的扩增的DNA片段。接着以限制性内切核酸酶Xho I和Nco I(Roche Diagnostics,Mannheim)切割,且通过凝胶电泳分离。随后使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)从琼脂糖纯化出约620碱基对的DNA片段。
以限制性内切核酸酶Nco I和Spe I(Roche Diagnostics,Mannheim)切割PmetA metA SEQ ID NO:16质粒。在凝胶电泳分离之后,使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒从琼脂糖纯化出约0.7kb的metA片段。
以限制性内切核酸酶Xho I和Spe I(Roche Diagnostics,Mannheim)切割载体pClik5MCS SEQ ID NO:13,且在凝胶电泳分离之后,使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒分离出5kb片段。
根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)将载体片段与PCR片段以及metA片段连接,且通过如Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
通过多种方法及使用Quiagen的材料制备质粒DNA。根据Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences美国74:5463-5467的描述进行测序反应。通过ABI Prism 377(PE AppliedBiosystems,Weiterstadt)对测序反应进行分级和评估。
将得到的质粒pCLiK5MCS P EFTUmetA列为SEQ ID NO:26。
实施例5:
质粒pCLiK5MCS Pgro metA的制备
根据Tauch等人(1995)Plasmid 33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 140:1817-1828制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032染色体DNA。通过如Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications,Academic Press所述标准方法,以聚合酶链式反应(PCR)扩增从GroES基因(Pgro)的非编码5’区(启动子区)起约200碱基对的DNA片段,该PCR反应使用寡核苷酸引物SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28,以染色体DNA作为模板并且使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)。
SEQ ID NO:27
5‘-GAGACTCGAGCGGCTTAAAGTTTGGCTGCC-3‘
SEQ ID NO:28
5‘-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGATGAATCCCTCCATGAG-3‘
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化得到的DNA片段。
以PmetA metA质粒作为PCR反应模板起始,使用寡核苷酸引物SEQID NO:29和SEQ ID NO:30部分扩增metA。
SEQ ID NO:29
5‘-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3‘
SEQ ID NO:30
5‘-CTGGGTACATTGCGGCCC-3‘
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化得到的约470碱基对的DNA片段
在下一步的PCR反应中将以上获得的两个片段一起用作模板。在PCR反应期间,寡核苷酸引物SEQ ID NO:28引入的metA同源序列使两个片段彼此相连,并且通过所用的聚合酶使其延伸得到连续的DNA链。修改标准方法,从而仅在第2次循环的开始向反应混合物加入使用的寡核苷酸引物SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:30。
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化约675碱基对大小的扩增的DNA片段。接着以限制性内切核酸酶Xho I和Nco I(Roche Diagnostics,Mannheim)切割,且通过凝胶电泳分离。随后使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)从琼脂糖纯化出约620碱基对的DNA片段。
以限制性内切核酸酶Nco I和Spe I(Roche Diagnostics,Mannheim)切割质粒PmetA metA SEQ ID NO:16。在凝胶电泳分离之后,使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒从琼脂糖纯化出约0.7kb的metA片段。
以限制性内切核酸酶Xho I和Spe I(Roche Diagnostics,Mannheim)切割载体pClik5MCS SEQ ID NO:13,且在凝胶电泳分离之后,使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒分离出5kb片段。
根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)将载体片段与PCR片段以及metA片段连接,且通过如Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
通过多种方法及使用Quiagen的材料制备质粒DNA。根据Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences美国74:5463-5467的描述进行测序反应。通过ABI Prism 377(PE AppliedBiosystems,Weiterstadt)对测序反应进行分级和评估。
将得到的质粒pCLiK5MCS Pgro metA列为SEQ ID NO:31。
实施例6
制备质粒P EF-TS metA
如Tauch等人(1995)Plasmid 33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 140:1817-1828所述,制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA。使用寡核苷酸引物BK 1849(SEQ ID NO:32)及BK 1862(SEQID NO:33),染色体DNA作为模板并且使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene),通过Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications,Academic Press描述的标准方法以聚合酶链式反应(PCR)扩增编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的MetaA基因。
BK 1849(SEQ ID NO:32)
5‘-GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG-3‘
和
BK 1862(SEQ ID NO:33)
5‘-ATGCCCACCCTCGCGCC-3‘
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化得到的约1134bp大小的DNA片段。
使用寡核苷酸引物Haf 26(SEQ ID NO:34)及Haf 27(SEQ ID NO:35),染色体DNA作为模板并且使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene),通过Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications,Academic Press描述的标准方法以聚合酶链式反应(PCR)扩增延伸因子TS编码基因的非编码5’区(表达单元区)约200个碱基对的DNA片段。
Haf26(SEQ ID NO:34)
5‘-GAGAGGATCCCCCCCACGACAATGGAAC-3‘
和
Haf 27(SEQ ID NO:35)
5‘-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATTACGGGGCGATCCTCCTTATG-3‘
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化得到的约195bp大小的DNA片段。
引物Haf 27和BK 1862包含重叠序列,且彼此的5’末端是同源的。
使用以上得到的PCR产物作为另一轮PCR的模板,其中使用引物BK1849(SEQ ID NO:32)和Haf 26(SEQ ID NO:34)。
使用这个方法,扩增相应于期望大小1329bp的DNA片段。然后,经由限制性切割位点BamH I和SalI将该P EF-TS/metA融合克隆入载体pClik 5a MCS(SEQ ID NO:13)。
根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)将载体片段与PCR片段连接在一起,且通过Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
通过多种方法及使用Quiagen的材料制备质粒DNA。如Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences美国74:5463-5467的描述进行测序反应。使用ABI prism 377(PE AppliedBiosystems,Weiterstadt)对测序反应进行分级及评估。
将得到的质粒命名为pClik 5a MCS P EF-TS metA(SEQ ID NO:36)。
实施例7:
质粒P EF-Tu pSOD metA(H473)的制备
如Tauch等人(1995)Plasmid 33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 140:1817-1828所述,制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA。使用寡核苷酸引物BK 1753(SEQ ID NO:37)及BK 1754(SEQID NO:38),染色体DNA作为模板并且使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene),通过Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications,Academic Press描述的标准方法以聚合酶链式反应(PCR)扩增GroEL终止子。
BK 1753(SEQ ID NO:37)
GGATCTAGAGTTCTGTGAAAAACACCGTG
BK 1754(SEQ ID NO:38)
GCGACTAGTGCCCCACAAATAAAAAACAC
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化得到的约77bp大小的DNA片段,用限制性内切核酸酶Xba I和Bcu I切割并且再次纯化。
根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)将线性化的载体与PCR片段连接在一起,且通过Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
通过多种方法及使用Quiagen的材料制备质粒DNA。如Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences 美国74:5463-5467的描述进行测序反应。使用ABI prism 377(PE AppliedBiosystems,Weiterstadt)对测序反应进行分级及评估。
将得到的质粒命名为H247(SEQ ID NO:39)。
用限制性内切核酸酶Bcu I和SalI处理该质粒并且根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化。
使用寡核苷酸引物BK 1848(SEQ ID NO:40)及BK 1849(SEQ ID NO:41),质粒pClik5MCS Psod metA(SEQ ID NO:21)作为模板并且使用PfuTurbo聚合酶(Stratagene),通过Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guideto Methods and APPlications,Academic Press描述的标准方法进行PCR。扩增片段的预期长度为约1350bp,并且根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化得到的片段,用限制性内切核酸酶Bcu I和SalI切割并且再次纯化。
根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)将这一片段与H247质粒连接,且通过Sambrook等人(MolecularCloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,LaJolla,美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
通过多种方法及使用Quiagen的材料制备质粒DNA。如Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences美国74:5463-5467的描述进行测序反应。使用ABI prism 377(PE AppliedBiosystems,Weiterstadt)对测序反应进行分级及评估。
将得到的质粒命名为pGA4(H344),并列为SEQ ID NO:42。
SEQ ID NO:40(BK 1848)
GAGAACTAGTAGCTGCCAATTATTCCGGG
SEQ ID NO:41(BK 1849)
GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG
用限制性内切核酸酶Xho I和Bcu I切割质粒pG A4(SEQ ID NO:42)并且根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化。
H473的构建
如Tauch等人(1995)Plasmid 33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 140:1817-1828所述,制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA。使用寡核苷酸引物BK 1695(SEQ ID NO:43)及Haf16(SEQ IDNO:44),染色体DNA作为模板并且使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene),通过Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications,Academic Press描述的标准方法以聚合酶链式反应(PCR)扩增EF Tu基因(Peftu)非编码5’区(表达单元区)的约182个碱基对的DNA片段。
SEQ ID NO:43(BK1695)
GAGACTCGAGGGCCGTTACCCTGCGAATG
SEQ ID NO:44(Haf16)
GAGAACTAGTGTGGCTACGACTTTCGCAGC
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化得到的约200bp的DNA片段,用限制性内切核酸酶Xho I和Bcu I切割并且再次纯化。
根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)连接此片段与pG A4(H344)质粒(Xho I和Bcu I切割位点),且通过Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
将得到的质粒命名为pClik5MCS PeftuPsod metA(H473)。将其列为SEQ ID NO:45。其包括(从5’到3’方向)Peftu启动子、Psod表达单元和紧接其下游的metA开放阅读框。
实施例8:
质粒PsodPeftu metA(H505)的制备
如Tauch等人(1995)Plasmid 33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 140:1817-1828所述,制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA。使用寡核苷酸引物SEQ ID NO:46(Haf64)及SEQ ID NO:47(Haf65),以染色体DNA作为模板并且使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene),通过Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications,Academic Press描述的标准方法以聚合酶链式反应(PCR)扩增EF Tu基因(Peftu)非编码5’区(表达单元区)的约200个碱基对的DNA片段。
SEQ ID NO:46(Haf64)
GAGAACTAGTGGCCGTTACCCTGCGAATG
SEQ ID NO:47(Haf65)
GCGCGAGGGTGGGCATTGTATGTCCTCCTGGACTTC
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化得到的约200bp的DNA片段。
在第二轮PCR中,使用寡核苷酸引物BK1862(SEQ ID NO:48)及BK1849(SEQ ID NO:49),以H344(SEQ ID NO:42)质粒作为模板,通过Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications,Academic Press描述的标准方法扩增metA开放阅读框。根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化得到的约1140bp片段。
SEQ ID NO:48(BK1862)
ATGCCCACCCTCGCGCC
SEQ ID NO:49(BK1849)
GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG
在下一步的PCR反应中将以上获得的两个片段一起用作模板。在PCR反应期间,用寡核苷酸引物Haf 65SEQ ID NO:47引入的metA同源序列使两个片段彼此相连,并且通过所用的聚合酶使其延伸得到连续的DNA链。修改标准方法,从而仅在第2次循环的开始向反应混合物加入使用的寡核苷酸引物Haf64和BK1849(SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:49)。
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化扩增的约1350碱基对的DNA片段。接着以限制性内切核酸酶Bcu I和SalI(Roche Diagnostics,Mannheim)切割,且通过凝胶电泳分离。随后使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)从琼脂糖纯化出约1340碱基对的DNA片段。这一片段包括融合至metA ORF的Peftu表达单元(=Peftu-metA片段)。
使用寡核苷酸引物BK 1697(SEQ ID NO:50)和Haf17(SEQ ID NO:51),染色体DNA作为模板并且使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene),通过Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications,Academic Press描述的标准方法以聚合酶链式反应(PCR)扩增SOD基因(Psod)非编码5’区(表达单元区)的DNA片段(总长度:193bp,其中173个为pSOD)。
SEQ ID NO:50(BK 1697)
GAGACTCGAGAGCTGCCAATTATTCCGGG
SEQ ID NO:51(Haf 17)
GAGAACTAGTTAGGTTTCCGCACCGAGC
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化扩增的DNA片段。接着以限制性内切核酸酶Xho I和Bcu I(RocheDiagnostics,Mannheim)切割,且通过凝胶电泳分离。随后使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)从琼脂糖纯化出约180碱基对的DNA片段(=Psod片段)。
用限制性内切核酸酶Xho I和SalI(Roche Diagnostics,Mannheim)切割(H344)pG A4 SEQ ID NO:42质粒并且通过凝胶电泳分离。接着,使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化线性化的载体。
根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)将线性化的载体与两个片段(Peftu-metA片段和Psod片段)连接,且通过Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
通过多种方法及使用Quiagen的材料制备质粒DNA。如Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences美国74:5463-5467的描述进行测序反应。使用ABI prism 377(PE AppliedBiosystems,Weiterstadt)对测序反应进行分级及评估。
将得到的质粒命名为pClik5MCS PsodPeftu metA,列为SEQ ID NO:52。
实施例9:
质粒pClik5MCS Pgro Psod metA(H472)的制备
如Tauch等人(1995)Plasmid 33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 140:1817-1828所述,制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA。使用寡核苷酸引物SEQ ID NO:53(BK1701)及SEQ ID NO:54(Haf18),以染色体DNA作为模板并且使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene),通过Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications,Academic Press描述的标准方法以聚合酶链式反应(PCR)扩增约175个核苷酸的DNA片段。其包括GRO EL基因(Pgro)非编码5’区(表达单元区)的155个碱基对和分别在5’和3’末端的一个限制性内切酶切割位点(分别为Xho I和Bcu I)。
SEQ ID NO:53(BK1701)
GAGACTCGAGCGGCTTAAAGTTTGGCTGCC
SEQ ID NO:54(Haf018)
GAGAACTAGTATTTTGTGTGTGCCGGTTGTG
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化获得的约175bp DNA片段。接着以限制性内切核酸酶Xho I和Bcu I(Roche Diagnostics,Mannheim)切割,且使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化DNA片段。
用限制性内切核酸酶Xho I和Bcu I(Roche Diagnostics,Mannheim)切割H344(SEQ ID NO:42)质粒并且在电泳分离之后,使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)分离约6.4kb的片段。
根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)将PCR产物与切开的H344质粒连接,且通过Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
通过多种方法及使用Quiagen的材料制备质粒DNA。如Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences美国74:5463-5467的描述进行测序反应。
通过ABI prism 377(PE Applied Biosystems,Weiterstadt)对测序反应进行分级及评估。
产生的质粒包括Pgro启动子紧接着一个Psod表达单元和metA ORF。
将其命名为pCLiK5MCS PgroPsod metA(H472),列为SEQ ID NO:55。
实施例10:
质粒PgroPsod Pefts metA(H501)的制备
使用寡核苷酸引物BK 1782(SEQ ID NO:56)和Haf63(SEQ ID NO:57),质粒pCLiK5MCS Pgro Psod metA(SEQ ID NO:55(H472))作为模板,通过Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications,Academic Press描述的标准方法进行PCR。扩增的片段包括约474个碱基对和在3’末端带有Acc65I切割位点的Pgro-Psod盒。根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化获得的DNA片段。接着以限制性内切核酸酶Xho I和Acc65I切割,且使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化DNA片段(333碱基对)。
SEQ ID NO:56(BK1782)
TCGAGAGATTGGATTCTTAC
SEQ ID NO:57(Haf63)
TCTCGGTACCCCGCACCGAGCATATACATC
质粒H479(SEQ ID NO:58)包括融合于metA ORF的Pefts表达单元盒。使用限制性内切核酸酶Xho I和Acc65I切割(紧接Pefts的上游),且在电泳分离之后,使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒分离出约6.4kb的片段。
接着,根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)将其与PCR片段(Pgro-Psod盒)连接,且通过Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
通过多种方法及使用Quiagen的材料制备质粒DNA。如Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences美国74:5463-5467的描述进行测序反应。通过ABI prism 377(PE AppliedBiosystems,Weiterstadt)对测序反应进行分级及评估。
产生的质粒包括融合于metA ORF的3个启动子,Pgro、Psod和PEF-Ts。
将其命名为pCLiK5MCS Pgro Psod Pefts metA(H501),列为SEQ IDNO:59。
实施例11:
质粒Peftu Psod Pefts metA(H502)的制备
使用寡核苷酸引物BK 1782(SEQ ID NO:56)和Haf63(SEQ ID NO:57),质粒pCLiK5MCS Peftu Psod(SEQ ID NO:45(H473))作为模板,通过Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications,Academic Press描述的标准方法进行PCR。扩增的片段包括约495个碱基对和在3’末端带有Acc65I切割位点的Peftu-Psod盒。根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化获得的DNA片段。接着以限制性内切核酸酶Xho I和Acc65I切割,且使用GFXTMCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化DNA片段(354碱基对)。
SEQ ID NO:56(BK1782)
TCGAGAGATTGGATTCTTAC
SEQ ID NO:57(Haf63)
TCTCGGTACCCCGCACCGAGCATATACATC
质粒H479(SEQ ID NO:58)包括融合于metA ORF的Pefts表达单元。使用限制性内切核酸酶Xho I和Acc65I切割(紧接Pefts的上游),且在电泳分离之后,使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒分离出约6.4kb的片段。
接着,根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)将其与PCR片段(Peftu-Psod盒)连接,且通过Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
通过多种方法及使用Quiagen的材料制备质粒DNA。如Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences美国74:5463-5467的描述进行测序反应。通过ABI prism 377(PE AppliedBiosystems,Weiterstadt)对测序反应进行分级及评估。
产生的质粒包括融合于metA ORF的3个调节序列,Peftu、Psod和PEF-Ts。将其命名为pCLiK5MCS Peftu Psod Pefts metA(H502),列为SEQID NO:60。
实施例12
MetA活性的测量
根据(Liebl等人(1989)FEMS Microbiology Letters 53:299-303)描述的方法,在每种情况下用质粒pClik5 MCS、pClik MCS Psod metA、pClikMCS Peftu metA、pClik5 MCS Pefts metA、pClik5 MCS Peftu Psod metA、pClik5 MCS Psod Peftu metA、pClik5 MCS Pgro Psod meta、pClik5 MCSPgro Psod Pefts metA、pClik5 MCS Peftu Psod Pefts metA转化谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13032。将转化混合物涂布在另外含有20mg/l卡那霉素的CM平板上来筛选含有质粒的细胞。挑取且分离得到的卡那霉素抗性克隆。
在30℃下将含有任何所述质粒构建体的谷氨酸棒杆菌菌株在MMA培养基(40g/l蔗糖、20g/l(NH4)2SO4、1g/l KH2PO4、1g/l K2HPO4、0.25g/lMgSO4×7H2O、54g Aces、1ml CaCl2(10g/l)、1ml原儿茶酸盐(300mg/10ml)、1ml微量元素溶液(10g/l FeSO4×7H2O、10g/l MnSO4×H2O、2g/lZnSO4×7H2O、0.2g/l CuSO4、0.02g/l NiCl2×6H2O)、100μg/l维生素B12、0.3mg/l硫胺素、1mM亮氨酸、1mg/l吡哆醛HCl、1ml生物素(100mg/l),pH 7.0)中于30℃培养过夜。在4℃下离心移取细胞,接着用冷的Tris-HCl缓冲液(0.1%,pH 8.0)洗涤两次。重新离心之后,将细胞溶解在冷的Tris-HCl缓冲液(0.1%,pH 8.0)中,并将OD600调节至160。为了使细胞破裂,将1ml该细胞悬浮液转移至2ml的Hybaid Ribolyser管中,且在HybaidRibolyser中以6.0的旋转设定值裂解三次,每次30秒。通过4℃下在Eppendorf离心机中15,000转/分钟离心30分钟使裂解产物澄清,且将上清液转移至新的Eppendorf杯中。根据Bradford,M.M.(1976)Anal.Biochem.72:248-254中所述,测定蛋白质的含量。
以如下方式测定MetA的酶活性。1ml反应混合物含有100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)、5mM MgCl2、100μM乙酰辅酶A、5mM L-高丝氨酸、500μM DTNB(Ellman’s试剂)及细胞提取物。通过加入相应的蛋白质裂解液开始检测,并在室温下孵育。接着在412nm处记录动力学10分钟。
这些结果显示于表1a中。
表1a
菌株 | 内部构建体名称 | 比活性 |
ATCC 13032 pClik5MCS | H356(metZ) | 3.1 |
ATCC 13032 pCLiK5MCS Psod metA | H144 | 1308.7 |
ATCC 13032 pCLiK5MCS Peftu metA | H146 | 1233.0 |
ATCC 13032 pCLiK5MCS Pefts metA | H479 | 2339.0 |
ATCC 13032 pCLiK5MCS Peftu Psod metA | H473 | 2308.1 |
ATCC 13032 pCLiK5MCS Psod Peftu metA | H505 | 2061.9 |
ATCC 13032 pCLiK5MCS Pgro Psod metA | H472 | 1501.6 |
ATCC 13032 pCLiK5MCS Pgro Psod Pefts metA | H501 | 1773.4 |
ATCC 13032 pCLiK5MCS Peftu Psod Pefts metA | H502 | 2262.2 |
可以通过使用多种启动子/表达单元的组合来调节MetA的活性。
实施例13:
质粒pCIS lysC的构建
为了产生生产赖氨酸的菌株,在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中进行lysC野生型基因的等位替代。这涉及lysC基因上的核苷酸替代,使产生的蛋白质中位置311的苏氨酸被异亮氨酸代替。根据产品说明书,使用寡核苷酸引物SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62以PfuTurbo PCR***(Stratagene美国)扩增lysC。
SEQ ID NO:61
5‘-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3‘
SEQ ID NO:62
5‘-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3‘
如Tauch等人(1995)Plasmid 33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 140:1817-1828所述,制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA。扩增的片段在其侧翼5’端有Sal I限制酶切割位点和在3’端有Mlu I限制酶切割位点。在克隆之前,用这两种限制性内切核酸酶消化扩增的片段,并且使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)纯化。
经由SalI和Mlu I限制酶切割将获得的多核苷酸克隆入pCLIK5MCS整合的SacB,以下称为pCIS(SEQ ID NO:63),且转化进入大肠杆菌XL-1 blue。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。分离质粒,且通过测序确定期望的核苷酸序列。通过多种方法及使用Quiagen的材料制备质粒DNA。根据Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences美国74:5463-5467的描述进行测序反应。通过ABI Prism 377(PE AppliedBiosystems,Weiterstadt)对测序反应进行分级和评估。将得到的质粒pCISlysC列为SEQ ID NO:64。
实施例14:
谷氨酸棒杆菌lysC基因的诱变
根据产品说明书,使用Quick-Change Kit(Stratagene/美国)进行谷氨酸棒杆菌lysC基因的定向诱变。在质粒pCIS lysC,SEQ ID NO:64中进行诱变。为了借助Quick-Change方法(Stratagene)用311位的异亮氨酸替代311位的苏氨酸,合成下列寡核苷酸引物:
SEQ ID NO:65
5‘-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG-3‘
SEQ ID NO:66
5‘-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG-3‘
在Quick-Change反应中使用这些寡核苷酸引物产生在lysC基因SEQID NO:67的位置932(从C至T)核苷酸的替代。在转化进入大肠杆菌XL1-blue以及质粒制备之后,通过测序反应确定lysC基因中产生的氨基酸替代(苏氨酸311异亮氨酸(thr311ile))。将该质粒命名为pCIS lysCthr311ile,列为SEQ ID NO:68。
通过如Liebl等人(1989)FEMS Microbiology Letters 53:299-303所述电穿孔方法,将pCIS lysC thr311ile质粒转化进入谷氨酸棒杆菌ATCC13032。对操作方法的修改如在DE 10046870所述。如Sambrook等人(1989),Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor所述,通过标准方法使用Southern印迹和杂交法检测单个转化体lysC基因座的染色体排列。这确保转化体在lysC基因座具有通过同源重组整合的转化质粒。使这样的克隆在不含任何抗生素的培养基中生长过夜之后,将细胞涂布在蔗糖CM-琼脂培养基(10%蔗糖、10g/l葡萄糖、2.5g/l NaCl、2g/l尿素、10g/l细菌用蛋白胨(Difco)、10g/l酵母提取物、22.0g/L琼脂(Difco))并于30℃孵育24小时。
由于在pCIS lysC thr311ile载体中存在的sacB基因将蔗糖转化为毒性产物,仅其中通过野生型lysC基因和突变的lysC thr311ile基因之间的第二次同源重组使sacB基因缺失的那些克隆可以生长。在同源重组中,野生型基因或突变基因都可能与sacB基因一起缺失。如果将sacB基因与野生型基因一起除去,产生的是突变的转化体。
挑出生长的克隆并检测对卡那霉素敏感的表型。带有sacB基因缺失的克隆必然同时呈现卡那霉素敏感的生长行为。在摇瓶中检测这样的对卡那霉素敏感克隆的赖氨酸生产力(见实施例19)。未处理的谷氨酸棒杆菌ATCC13032生长用作对照。选出与对照相比具有增加的赖氨酸产量的克隆,重新获得染色体DNA,且通过PCR反应扩增lysC基因的相应区域并测序。将具有赖氨酸合成增加的特性且在lysC位置932具有检测到的突变的这类克隆命名为ATCC13032lysCfbr。
实施例15:
质粒pCIS Peftu ddh的制备
如Tauch等人(1995)Plasmid 33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 140:1817-1828所述,从谷氨酸棒杆菌ATCC 13032制备染色体DNA。使用寡核苷酸引物SEQID NO:69(Old38)及SEQ ID NO:70(Old 39),以染色体DNA作为模板并且使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene),通过Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications,Academic Press描述的标准方法以聚合酶链式反应(PCR)扩增EFTu基因(Peftu)的非编码5’区(表达单元区)约200个碱基对的DNA片段。
SEQ ID NO:69(Old38)
ACATCCATGGTGGCCGTTACCCTGCGAAT
SEQ ID NO:70(Old 39)
TGTATGTCCTCCTGGACTTC
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化获得的约200bp的DNA片段。
在第二轮PCR中,使用寡核苷酸引物Old40(SEQ ID NO:71)及SEQID NO:72(Old 37),以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032染色体DNA作为模板,通过Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications,Academic Press描述的标准方法扩增ddh的开放阅读框。根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化获得的约1017bp的片段。
Old40(SEQ ID NO:71)
GAAGTCCAGGAGGACATACAArGACCAACATCCGCGTAGC
Old 37(SEQ ID NO:72)
GAAACCACACTGTTTCCTTGC
在进一步的PCR反应中,将以上获得的两条片段一起用作模板。在PCR反应中,寡核苷酸引物Old40 SEQ ID NO:71引入的Peftu同源序列使两个片段彼此相连,并且通过所用的聚合酶使其延伸得到连续的DNA链。修改标准方法,从而仅在第2次循环的开始向反应混合物加入使用的寡核苷酸引物Old37和Old 38(SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:69)。
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化得到的约1207碱基对大小的扩增的DNA片段。接着以限制性内切核酸酶和Nco I和Xho I(Roche Diagnostics,Mannheim)切割,且通过凝胶电泳分离。随后使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)从琼脂糖纯化出约1174碱基对的DNA片段。此片段包括与ddh ORF融合的Peftu表达单元(=Peftu-ddh片段)。
使用寡核苷酸引物Old 32(SEQ ID NO:73)及Old 33(SEQ ID NO:74),以染色体DNA作为模板且使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene),通过Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications,Academic Press描述的标准方法使用聚合酶链式反应(PCR)扩增ddh基因非编码5’区的DNA片段。
SEQ ID 73(Old32)
ATCAACGCGTCGACACCACATCATCAATCAC
SEQ ID 74(Old33)
ATCACCATGGGTTCTTGTAATCCTCCAAAATTG
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化扩增的DNA片段。接着以限制性内切核酸酶Mlu I和Nco I(RocheDiagnostics,Mannheim)切割,且通过凝胶电泳分离。随后使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)从琼脂糖纯化约720碱基对的DNA片段(=5’ddh片段)。
以限制性内切核酸酶Mlu I和Xho I(Roche Diagnostics,Mannheim)切割质粒pCIS(SEQ ID NO:63),且通过凝胶电泳分离。接着,使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)从琼脂糖纯化线性化的载体。
根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Manhheim)将线性化的载体与两个片段(Peftu-ddh片段和5’ddh片段)连接,且通过如Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
通过多种方法及使用Quiagen的材料制备质粒DNA。根据Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences 美国74:5463-5467的描述进行测序反应。通过ABI Prism 377(PE AppliedBiosystems,Weiterstadt)对测序反应进行分级和评估。
将产生的质粒pCIS Peftu ddh列为SEQ ID NO:75。
实施例16:
pCIS PeftuPsod ddh的制备
如Tauch等人(1995)Plasmid 33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 140:1817-1828所述,制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA。使用寡核苷酸引物SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77,以染色体DNA作为模板并且使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene),通过Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications,AcademicPress描述的标准方法以聚合酶链式反应(PCR)扩增ddh基因5,区的约677个碱基对的DNA片段。
SEQ ID NO:76(CK461)
CCTGACGTCGCAATATAGGCAGCTGAATC
SEQ ID NO:77(CK466)
GCCCAATTGGTTCTTGTAATCCTCCAAAA
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化获得的DNA片段。接着以限制性内切核酸酶Aat II和Mun I(Roche Diagnostics,Mannheim)切割,且通过凝胶电泳分离。随后使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)从琼脂糖纯化约661碱基对的DNA片段。产生的片段包括ddh ORF的5’区。
使用寡核苷酸引物SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79,以P EF-TupSOD metA(H473)(SEQ ID 45)质粒作为PCR反应的模板起始,扩增PeftuPsod盒。
SEQ ID NO:78(CK426)
CGCCAATTGTCGAGGGCCGTTACCCT
SEQ ID NO:79(CK463)
GCTACGCGGATGTTGGTCATGGGTAAAAAATCCTTTCGTA
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)纯化获得的约378个碱基对的DNA片段。
接着在PCR中扩增ddh ORF。为此目的,根据Tauch等人(1995)Plasmid 33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 140:1817-1828制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032染色体DNA。使用寡核苷酸引物SEQ IDNO:80(CK464)及SEQ ID NO:81(CK467),以染色体DNA作为模板并且使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene),通过Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications,Academic Press描述的标准方法以聚合酶链式反应(PCR)扩增约992个碱基对的DNA片段(ddh ORF)。根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化扩增的DNA片段。
SEQ ID NO:80(CK464)
TACGAAAGGATTTTTTACCCATGACCAACATCCGCGTAGC
SEQ ID NO:81(CK467)
AGACCCGGGTTAGACGTCGCGTGCGATCA
在进一步的PCR反应中,将以上获得的两条片段(PeftuPsod盒和ddhORF)一起用作模板。在PCR反应期间,寡核苷酸引物SEQ ID NO:80(CK464)引入的Psod同源序列使两个片段彼此相连,并且通过所用的聚合酶使其延伸得到连续的DNA链。修改标准方法,使仅在第2次循环的开始向反应混合物加入使用的寡核苷酸引物SEQ ID NO:79(CK426)和SEQID NO:81(CK467)。
根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化得到的约1359碱基对的扩增的DNA片段。
接着以限制性内切核酸酶和Mun I和Sma I(Roche Diagnostics,Mannheim)对其切割,且通过凝胶电泳分离。随后使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)从琼脂糖纯化约1359碱基对的DNA片段。
产生的片段包括(从5’至3’)Peftu启动子、Psod表达单元和紧接其下游的ddh开放阅读框(PeftuPsod ddh)。
以限制性内切核酸酶Aat II及Sma I切割载体pCIS,并且根据产品说明书用碱性磷酸酶(Roche Diagnostics,Mannheim)去磷酸化。在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳之后,根据产品说明书使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia,Freiburg)分离线性化的载体(约4.2kb)。根据产品说明书使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)将该载体片段与两条经切割的PCR片段(5’ddh和Peftu Psod ddh)连接,且通过如Sambrook等人(Molecular Cloning.ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene,La Jolla,美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上来筛选含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。
根据产品说明书使用Qiaprep离心式小量制备试剂盒(Qiagen,Hilden,德国)分离单个克隆的质粒DNA,且通过限制性内切酶消化来检查。对两个正确的质粒进行测序。根据Sanger等人(1977)Proceedings of theNational Academy of Sciences美国74:5463-5467的描述进行测序反应。通过ABI Prism 377(PE Applied Biosystems,Weiterstadt)对测序反应进行分级和评估。产生的质粒pClik Peftu Psod ddh适用于通过两个连续的重组事件与ddh ORF上游PeftuPsod盒染色体整合。
将pCIS PeftuPsod ddh质粒列为SEQ ID NO:82。
实施例17:
产生菌株ATCC13032 lysCfbr Peftu ddh和ATCC13032 lysCfbrPeftuPsod ddh
根据Liebl等人(1989)FEMS Microbiology Letters 53:299-303所述,使用质粒pCIS Peftu ddh和pCIS PeftuPsod ddh两者之一与质粒pTc15AcglM一起转化大肠杆菌菌株Mn522细胞(Stratagene,Amsterdam,TheNetherlands)。质粒pTc1 5AcglM能够按照谷氨酸棒杆菌甲基化的方式使DNA甲基化(DE 10046870)。这一甲基化增加了pCIS Peftu ddh和pCISPeftuPsod ddh质粒在谷氨酸棒杆菌细胞中的稳定性。接着通过标准方法从Mn522细胞分离质粒DNA,并使用电穿孔将其导入上述谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13032 ask(fbr)。所述电穿孔和继之在含有卡那霉素(25μg/mD的CM平板上的筛选产生多个转接合子。为了筛选应该切开载体的第二次重组事件,使所述转接合子在不含卡那霉素的CM培养基生长过夜并接着在含有10%蔗糖的CM平板上涂板筛选。在pCIS载体上存在的sacB基因编码果聚糖蔗糖酶,并且在蔗糖生长时产生果聚糖的合成。由于果聚糖对谷氨酸棒杆菌有害,仅由于第二次重组步骤而丢失了整合质粒的谷氨酸棒杆菌细胞在含有蔗糖的培养基上生长(Jger等人,Journal of Bacteriology 174(1992)5462-5466)。检查100个蔗糖抗性克隆的卡那霉素敏感性。在测试的多个克隆中,除了检测对蔗糖的抗性,也检测对卡那霉素的敏感性(其为能够通过载体序列的目的切割而预期的)。使用聚合酶链式反应(PCR)来检查是否也发生Peftu或PeftuPsod表达单元的目的整合。为此,使用牙签从琼脂平板移取特定克隆,并悬浮于100μl的水中,在95℃煮沸10分钟。将在每种情况下获得的10μl溶液作为PCR的模板。使用与导入的表达单元和ddh基因同源的寡核苷酸引物。PCR条件选择如下:初始变性:于95℃5分钟;于95℃变性30秒、55℃杂交30秒、72℃扩增2分钟,进行30个循环;最后于72℃延伸5分钟。选择的寡核苷酸在含有初始菌株DNA的反应混合物中不产生任何PCR产物。仅其中Peftu或PeftuPsod表达单元作为第二次重组结果在紧接ddh基因的5’整合的克隆有预期的条带。还可以通过Southern印迹分析(通过例如Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,(1989)所述的标准方法)确定测试为阳性的克隆的成功整合。这里对每一产生的菌株使用限制性核酸内切酶进行2种不同的水解,该水解能够清楚地区分初始菌株(ATCC13032 ask(fbr))和目的菌株。此外,使用与卡那霉素抗性基因同源的探针来确认获得的菌株在染色体上没有任何卡那霉素基因这一事实。
由此产生下列菌株:
ATCC13032 lysCfbr Peftu ddh
ATCC13032 lysCfbr PeftuPsod ddh
所有这些菌株包含解除反馈调节的ask基因并因此产生赖氨酸。它们仅由控制ddh基因转录的调节单元而彼此不同。
实施例18:
双启动子产生的ddh增加对赖氨酸产量的影响。
为了研究通过双启动子使ddh基因增加的影响,测试下列菌株的赖氨酸产量:
ATCC13032 lysCfbr
ATCC13032 lysCfbr Peftu ddh
ATCC13032 lysCfbr Peftu Psod ddh
为此目的,使菌株在CM平板(10.0g/L D-葡萄糖、2.5g/L NaCl、2.0g/L尿素、10.0g/L细菌用蛋白胨(Difco)、5.0g/L酵母提取物(Difco)、5.0g/L牛肉膏(Difco)、22.0g/L琼脂(Difco),高压灭菌(20min,121℃))于30℃生长3天。接着,从平板刮下细胞并重悬于盐水中。对于主要的培养物,在100ml锥形瓶中用细胞悬液对10ml的培养基I和0.5g高压灭菌的CaCO3(Riedel de Haen)接种至OD600为1.5,并且在Infors AJ118(Infors,Bottmingen,Switzerland)以220转/分钟孵育40小时。接着,测定分泌到培养基的赖氨酸的浓度。
培养基I:
40g/l 蔗糖
60g/l 糖蜜(基于100%蔗糖含量)
10g/l (NH4)2SO4
0.4g/l MgSO4×7H2O
0.6g/l KH2PO4
0.3mg/l 硫胺素×HCl
1mg/l 生物素(从1mg/ml母液配制,该母液经过滤除菌并用NH4OH调节至pH 8.0)
2mg/l FeSO4
2mg/l MnSO4
用NH4OH调节至pH7.8,高压灭菌(121℃,20min)。
此外,取维生素B12(羟钴氨素,Sigma Chemicals)母液(200μg/ml,经过滤除菌)加至终浓度为100μg/l。
根据在Agilent 1100系列LC***HPLC上的Agilent,通过高压液相层析测定氨基酸浓度。用带有邻苯二醛的保护柱衍生化方法对形成的氨基酸定量,且在Hypersil氨基酸柱(Agilent)分离氨基酸混合物。
研究结果描述于下表。
菌株 | 相对赖氨酸浓度(%) |
ATCC13032 lysCfbr | 100 |
ATCC13032 lysCfdr Peftu ddh | 102.9 |
ATCC13032 lysCfdr PeftuPsod ddh | 106.9 |
序列表
Claims (18)
1.包含多启动子的表达单元,其沿5’-3’方向包含下式I的序列构件:
5’-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3’ (I)
其中
n为从0至10的整数,
Ax和Ay是相同或不同的,且为化学键或连接区核酸序列;
P1、Px和Py编码相同或不同的启动子序列,其包含至少一个RNA聚合酶结合区;且至少Py包含介导核糖体结合的3’-末端序列区。
2.根据权利要求1的表达单元,其中P1、Px和Py在每一情况下衍生自相同或不同的真核或原核生物或为人工启动子序列。
3.根据权利要求2的表达单元,其中P1、Px和Py在每一情况下衍生自35至500个核苷酸残基的连续序列,该序列位于生物基因组中蛋白质编码序列的5’上游。
4.根据权利要求2或3的表达单元,其中该生物是棒杆菌。
5.根据前述权利要求的任一项的表达单元,其中P1、Px和Py彼此独立地选自生物中高丰度蛋白质编码序列的启动子序列。
6.根据前述权利要求的任一项的表达单元,其中P1、Px和Py彼此独立地选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
7.根据前述权利要求的任一项的表达单元,其中启动子选自强启动子、组成型启动子或可调节的启动子。
8.表达盒,其沿5’-3’方向包括下式II的序列构件:
5’-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-G-3’ (II)
其中
n、Ax、Ay、P1、Px和Py定义如上,且G为至少一个功能地连接于5’上游调节序列的编码核酸序列。
9.根据权利要求8的表达盒,其中G选自
a)编码生蛋白氨基酸及非生蛋白氨基酸生物合成途径的蛋白质的核酸,
b)编码核苷酸及核苷生物合成途径的蛋白质的核酸,
c)编码有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸,
d)编码类脂及脂肪酸生物合成途径的蛋白质的核酸,
e)编码二元醇生物合成途径的蛋白质的核酸,
f)编码碳水化合物生物合成途径的蛋白质的核酸,
g)编码芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸,
h)编码维生素生物合成途径的蛋白质的核酸,
i)编码辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸,和
j)编码酶生物合成途径的蛋白质的核酸,
k)编码中心代谢的蛋白质的核酸。
10.根据权利要求9a)的表达盒,其中编码氨基酸生物合成途径的蛋白质的核酸选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysR1、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子载体、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苷磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1,6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶、6-磷酸果糖激酶、四氢吡啶羧酸琥珀酰酶、琥珀酰氨基酮庚二酸氨基转移酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶、二氨基庚二酸差向异构酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、天冬氨酸转氨酶和苹果酸酶。
11.包含至少一个根据权利要求8至10的任一项的表达盒的载体。
12.遗传修饰的微生物,其经由至少一个根据权利要求11的载体转化,或包含至少一个根据权利要求8至10的任一项的表达盒。
13.根据权利要求12的遗传修饰的微生物,其衍生自棒杆菌。
14.根据权利要求13的遗传修饰的微生物,其衍生自棒杆菌属或短杆菌属的细菌。
15.根据权利要求12至14的任一项的遗传修饰的微生物,其包含至少一个处于整合形式的表达盒。
16.制备生物合成产物的方法,其包括培养根据权利要求12至15的任一项的遗传修饰的微生物和从培养物分离目的产物。
17.根据权利要求16的方法,其中该生物合成产物选自有机酸、蛋白质、核苷酸及核苷、生蛋白氨基酸及非生蛋白氨基酸、类脂及脂肪酸、二元醇、碳水化合物、芳香化合物、维生素及辅因子、酶及蛋白质。
18.根据权利要求1至7的任一项的表达单元在调节产物生物合成中的用途。
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